WO1993009805A1

WO1993009805A1 - Composition lipidique polaire d'origine vegetale

Info

Publication number: WO1993009805A1
Application number: PCT/FR1992/001048
Authority: WO
Inventors: Pierre Gossioux
Original assignee: Laboratoires Inocosm
Current assignee: Laboratoires Inocosm
Priority date: 1991-11-15
Filing date: 1992-11-12
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 1994-05-15
Also published as: FR2683721A1; EP0619741A1; AU3162293A; CA2123585A1; JPH07508496A; FR2683721B1

Abstract

Composition lipidique polaire d'origine végétale permettant de véhiculer un agent actif et/ou de le faire pénétrer dans une cellule cible, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une émulsion aqueuse injectable, intra-articulaire, topique ou ingérable d'un mélange lipidique polaire riche en phospholipides, en glycolipides et en céramides, ayant une composition essentiellement identique à celle des constituants lipidiques polaires des cytomembranes lipidiques des cellules et obtenu à partir d'un composé végétal tel que de la farine de céréales ou un extrait tel que du son ou des lipides extraits de céréales par des solvants chlorés.

Description

COMPOSITION LIPIDIQUE POLAIRE D'ORIGINE VEGETALE

La présente invention concerne une composition lipidique polaire d'origine végétale permettant de véhiculer un agent actif et/ou de le faire pénétrer dans une cellule cible.

Pour des raisons d'ordre écologique, on cherche actuellement à protéger au maximum les animaux et à éviter autant que possible de les utiliser au niveau du laboratoire : cette tendance actuelle, encouragée par les diverses ligues pour la protection des bêtes, fait que les produits d'origine animale sont de plus en plus mal acceptés.

Indépendamment de ces préoccupations d'ordre philosophique, le développement des produits provenant du règne animal pourrait se trouver freiné dans l'avenir : en effet, ces dernières années, on a vu apparaître dans le règne animal, et en particulier chez les ruminants, des virus de type prion qui attaquent le cerveau et les tissus nerveux et sont responsables d'atteintes neurologiques extrêment graves.

Or, il n'est pas exclu que de tels virus soient susceptibles de se propager chez les humains ; on craint que leur développement puisse avoir des conséquences dramatiques.

Compte tenu de cette incertitude, il existe actuellement un préjugé à l' encontre des produits provenant du règne animal.

Il est en particulier à noter que certains produits extraits des tissus nerveux d'origine bovine ont, d'ores et déjà, été interdits par la Pharmacie Centrale des Hôpitaux de Paris.

Cette contrainte nouvelle est source de difficultés liées au fait que les produits d'origine animale se trouvent déjà dans un état partiellement ou totalement synthétisés, tandis que l'utilisation de produits végétaux exige toujours des manipulations complémentaires pouvant s'avérer longues et coûteuses,

Compte tenu de ce contexte, les chercheurs exerçant dans des domaines tels que la dermatologie ou la pharmacologie tentent de plus en plus à utiliser des produits provenant du règne végétal ou des produits d'origine marine en remplacement des produits animaux, et ce, malgré les difficultés accrues ainsi rencontrées.

Ces recherches ont abouti, conformément au document WO-A-92 00 182, à la mise au point d'un procédé nouveau permettant d'obtenir - à partir d'un composé végétal tel que de la farine de céréale ou un extrait tel que du son, ou encore des lipides extraits de céréale par des solvants chlorés - un mélange lipidique riche en phospholipides, glycolipides et ceramides, et en particulier, un mélange lipidique de base ayant la composition pondérale suivante :

- Céramides 90 %

- Lécithines 5 %

- Galactolipides 5 %. Il a déjà été proposé d'utiliser ce mélange lipidique de base dans des domaines tels que la cosmétologie ou la dermatologie.

On a maintenant découvert, conformément à l'invention, que le mélange lipidique de base d'origine exclusivement végétale susmentionné peut avoir de nombreuses et importantes autres applications, en particulier dans le domaine de la pharmacologie.

Les biologistes savent, depuis déjà de nombreuses années, que toutes les cellules du règne animal sont entourées de membranes plasmiques qui constituent des barrières à perméabilité sélective ; ces cytomembranes dont la texture est largement constante, sont essentiellement constituées par une double couche continue de molécules lipidiques disposées parallèlement entre-elles et réunies par leurs groupes hydrophobes, dans laquelle diverses protéines membranaires sont encastrées.

Différents constituants entrent dans la composition de ces doubles couches lipidiques de la membrane plasmique et, notamment, des huiles non polaires, ou des constituants polaires dont il existe trois classes principales :

- les phospholipides tels que la lécithine,

- les glycolopides ou galactolipides,

- les ceramides, les sphingolipides et les glycosphingolipides.

Chaque type de cellule a une composition en constituants lipidiques polaires qui lui est particulière, et les spécialistes ont pu établir des gammes de compositions propres à chaque type de cellule.

Le tableau ci-dessous donne à titre d'exemple les compositions lipidiques approximatives de différentes membranes cellulaires.

Les chercheurs ont pu prouver que les constituants polaires des cytomembranes lipidiques ont un rôle déterminant sur la perméabilité cellulaire et donc influent sur les possibilités de pénétration des agents actifs à l'intérieur des cellules.

Or, conformément à l'invention, on s'est rendu compte que le mélange lipidique de base susmentionné a une composition largement identique à celle des constituants lipidiques polaires entrant dans la composition des doubles couches lipidiques des membranes plasmiques, et, que, à partir de ce mélange de base, il est possible de fabriquer, par fractionnements successifs, un mélange lipidique "second" dont la composition est identique à celle qui est propre à un type donné de cellules.

L'idée à la base de l'invention est d'utiliser cette identité pour fabriquer, à partir du mélange lipidique polaire de base, une composition dans laquelle on reconstitue la formule lipidique des cytomembranes lipidiques pour véhiculer un agent actif ou faciliter sa pénétration dans une cellule cible.

A cet effet, l'invention se rapporte à une composition lipidique polaire d'origine végétale caractérisée en ce qu'elle est constituée par une emulsion aqueuse injectable, intra-articulaire, topique ou ingérable d'un mélange lipidique polaire riche en phospholipides, en glycolipides et en ceramides, ayant une composition essentiellement identique à celle des constituants lipidiques polaires des cytomembranes lipidiques des cellules et obtenu à partir d'un composé végétal tel que de la farine de céréales ou un extrait tel que du son ou des lipides extraits de céréales par des solvants chlorés.

Cette composition, qui peut être pharmaceutique, cosmétique ou encore diététique peut revêtir des formes variées sans pour cela sortir du cadre de l'invention et, dans certains cas, la composition peut même constituer l'agent actif proprement dit.

A titre d'exemple, il est connu qu'un excès de cholestérol peut provoquer le dépôt, sur la paroi interne des artères, d'une plaque d'athérome constituée par un mélange de cellules chargées de graisse et de cristaux de cholestérol. La réaction de la paroi en regard de la plaque d'athérome est variable : elle commence par une sclérose (athérosclérose) et est suivie de calcifications (médiacalcose). Il peut s'ensuivre des thromboses (coagulation du sang dans l'artère) et des anévrismes (distention de la paroi).

Or, on a déjà pu mettre en évidence que les mélanges lipidiques polaires conformes à l'invention et en particulier les céramides sont des émulsifiants du cholestérol : l'injection dans le circuit sanguin d'un patient dont les artères sont porteuses de nombreuses plaques d'athérome d'une composition, conforme à l'invention peut permettre de faciliter l'élimination de ces dépôts ; ce mélange lipidique va en effet extraire le cholestérol puis faciliter son évacuation dans le circuit sanguin.

Plus précisément, pour obtenir la composition réellement mise en oeuvre conformément à l'invention, on utilise la notion de HLB ou "Hyrophile-Lipophile Balance" qui correspond à un classement des émulsifiants selon leur hydrophilie ou leur lipophilie. Une HLB faible (3 à 5) caractérise une emulsion à phase continue huileuse, une HLB plus élevée (10 à 12) une emulsion à phase continue aqueuse et au-delà une solubilisation.

Or, à partir de cette notion, on a développé de nombreuses méthodes tant théoriques qu'expérimenta- les pour déterminer dans chaque cas particulier la composition d'un système de tensio-actifs donnant l' emulsion la plus fine et donc le couplage optimum de plusieurs tensio-actifs.

Selon l'invention, pour déterminer in vitro la composition optimale pour l'émulsification du cholestérol, on a utilisé un processus expérimental basé sur la recherche par mesure de la conductivité de la quantité d'eau provoquant l'inversion de phase d'une emulsion.

On a ainsi obtenu un HLB de 8 à 10. Conformément à une variante particulièrement avantageuse de l'invention, l'émulsion a une composition essentiellement identique à celle des cytomembranes lipidiques d'une cellule cible et renferme un agent actif enrobé dans une gaine du mélange lipidique.

Une telle composition peut, à titre d'exemple, renfermer un agent d'hydratation associé, le cas échéant, à des additifs tels que des vitamines

A ou E et enrobé dans une gaine ayant une composition identique à celle des cytomembranes lipidiques des cellules de l'épiderme et en particulier du stratum corneum ; les agents d'hydratation présents dans ces compositions peuvent être des agents humectants ou hygroscopiques liposolubles tels que par exemple la lanoline, des acides gras polyinsaturés notamment la vitamine F, l'acide linoléique, l'acide gammalinolénique ou l'acide eicosapentaenoique ou encore des agents hydrosolubles tels que la glycérine, les mucopolysaccharides, les dérivés d'allantoïne, les acides aminés, l'urée, le sodium, le potassium.

Dans de telles compositions, qui peuvent être utilisées pour la lutte contre le vieillissement ou le traitement des brûlés, le mélange lipidique polaire agit en fait à deux niveaux : il améliore la perméabilité membranaire vis-à-vis de l'agent actif, mais, parallèlement contribue lui-même à l'hydratation des cellules ; on a, en effet, récemment pu mettre en évidence le rôle dans les mécanismes d'hydratation de la peau des phospholipides et surtout des céramides qui sont susceptibles de contribuer à une meilleure rétention de l'eau, de restructurer l'épiderme et notamment le ciment intercornéocytaire et d'améliorer la résistance de la peau aux agressions extérieures.

La composition conforme à l'invention peut également revêtir la forme d'une composition médicamenteuse destinée à diverses classes thérapeutiques et dont l'agent actif peut revêtir des formes variées et notamment être choisi dans le groupe formé par les antibiotiques, les anti-inflammatoires, les cortidoïdes, les antiviraux, les anticancéreux et les médicaments des pathologies cardiovasculaires.

A titre d'exemple, on peut plus précisément citer la possibilité de véhiculer les agents actifs suivants :

Grâce au choix d'un mélange lipidique polaire dont la composition correspond à celle des cytomembranes lipidiques des cellules cibles que l'on désire traiter, il est ainsi possible d'injecter l'agent actif directement sur le site voulu où il va "attaquer" sélectivement les cellules cibles permettant ainsi, pour un effet et un rendement améliorés, de diminuer sa concentration et donc d'éviter autant que possible les effets secondaires.

Les exemples susmentionnés ne sont, bien entendu, pas limitatifs et on peut envisager de nombreuses autres applications de l'invention, consistant notamment à faire rentrer un élément tel que du sodium dans une cellule déficiente.

Dans tous les cas, la gaine lipidique polaire constitue, grâce à sa composition sélective, un vecteur permettant d'améliorer la perméabilité de la cellule cible pour le produit actif.

Il est également possible, selon une autre caractéristique de l'invention, d'incorporer dans la composition, en tant qu'agent actif, non pas un composé à proprement parler "traitant" mais une substance toxique sélective pour un agent pathogène, notamment un virus, une bactérie ou un champignon.

Dans ce cas particulier, la gaine lipidique polaire fait office de "leurre" pour piéger l'agent pathogène et faciliter son élimination.

On peut utiliser cet aspect de l'invention pour la lutte contre le sida en enrobant de l'AZT dans une gaine lipidique polaire dont la composition correspond à celle des cytomembranes lipidiques des leucocytes : le virus du sida peut en effet reconnaître les lipides constitutifs de la gaine qui correspondent à sa voie de pénétration normale dans les cellules et venir ainsi en contact avec l'AZT de façon à favoriser sa destruction.

Le système lipidique polaire du présent brevet peut être également utilisé comme véhicule de composants de vaccins nécessaires au renforcement de l'immunité humorale et cellulaire.

Les caractéristiques de la composition lipidique polaire qui fait l'objet de l'invention seront détaillées dans les exemples ci-dessous :

EXEMPLE 1 :

On a fabriqué une composition cosmétique ayant la formule pondérale suivante :

Vitamine E acétate 0,5 % Lécithine hydrogénée 0,5 %

Céramides 0,5 %

Vitamine A 0,1 %

(1000 000 Ui/g)

Conservateurs + Eau. Cette composition s'est avérée très stable et à un toucher particulier qui plaît aux utilisatrices.

EXEMPLE 2 :

Compte rendu d'un test réalisé dans les

Laboratoires de la Faculté de Pharmacie de Chatenay Malabry (France) dans le but de vérifier l'activité d'un mélange lipidique polaire conforme à l'invention sur la protection par les corticoïdes contre une attaque radicalaire.

Le principe de ce test consiste à soumettre des hématies isolées de leur plasma à une agression de type oxydatif dans des conditions contrôlées et standardisées de façon à leur permettre de mettre en jeu tout leur équipement enzymatique et moléculaire pour résister à cette agression jusqu'à modification de la membrane cellulaire et éclatement et lyse de la cellule.

Plus précisément, différentes préparations contenant des hématies ont été soumises à une attaque par des radicaux libres organiques produits par décomposition thermale d'un composé azoté soluble dans l'eau particulier : le chlorhydrate de 2,2'-azo-bis-2 amidinopropane (100 mM), sous atmosphère d'air à 37ºC. On a ainsi pu produire une quantité connue et constante de radicaux peroxydés.

A intervalle régulier dans le temps, on a prélevé, dans la préparation, un petit volume de surnageant et on a analysé son contenu en hémoglobine par spectrophotométrie (λ = 540 nm ou 405 nm).

La résistance de la population d'hématies de chacune des préparations testées a alors été exprimée par le temps de demi-lyse, c'est-à-dire le temps de libération de 50 % du contenu en hémoglobine.

Pour réaliser ce test, on a choisi des hématies humaines isolées préalablement lavées et remises en suspension dans de l'hematocrite (à 11 %) ; ces cellules présentent, en effet, l'avantage d'avoir une demi-vie relativement courte (environ 110 jours) et de posséder tout l'équipement moléculaire et enzymatique de la protection anti-radicaux libres, ce qui leur permet d'être représentatives des autres cellules de l'organisme.

Pour réaliser ce test, on a préalablement préparé les compositions suivantes conformes à l'invention :

Composition A

Vitamine E acétate 2 %

Lécithine hydrogénée 1 %

Céramides 1 %

Vitamine A acide 0,05 %

Conservateurs + Eau.

Composition B

Vitamine E acétate 2 %

Lécithine hydrogénée 1 % Céramides 1 %

Dexamethasone 0,02 % Conservateurs + Eau.

On a ensuite fabriqué les cinq préparations tests suivantes :

1 : Hématies

2 : Hématies + Composition A (1/10)

3 : Hématies + Composition B (1/10)

4 : Hématies + Betneval (marque déposée)

(1/10)

5 : Hématies + Effederm (marque déposée)

(1/10). Le Betneval et l'Effederm correspondent à des médicaments du commerce renfermant respectivement de la dexaméthasone et de la vitamine A acide à des concentrations similaires à celles des compositions A et B conformes à l'invention.

Le tableau ci-dessus donne les temps de demi-lyse T50 exprimés en minute obtenus pour chacune des préparations testées :

Ces résultats montrent que l'addition des deux produits du commerce ne protège que très faiblement la durée de vie des hématies soumises à un "stress" radicalaire, tandis que les deux compositions conformes à l'invention qui ont été testées ont permis d'obtenir une protection de beaucoup supérieure.

EXEMPLE 3 :

Compte rendu d'un test réalisé au Laboratoire du Tissu Conjonctif du CNRS de Créteil (France) dans le but de vérifier l'activité d'un mélange lipidique polaire conforme à l'invention sur l'inhibition d'une enzyme particulière, l'élastase leucocytaire humaine (ELH) qui présente la propriété de détruire l'élastine et donc de provoquer un vieillissement cellulaire et d'altérer également les parois artérielles. L'activité du mélange conforme à l'invention a été comparée à celle de l'acide oléique, substance de référence.

Le principe de ce test consiste à mesurer l'inhibition de l'activité enzymatique par différentes préparations testées en suivant la cinétique à 410 nm de la dégradation d'un substrat S correspondant essentiellement à l'élastine le : Me-O-Suc-Ala₂-Pro- Val-pNa (N-Méthoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-Nitroanilide). Dans ce test, on mesure, dans le temps, l'évolution de la concentration en p-Nitroaniline qui se trouve libérée sous l'effet de l'activité de l'enzyme ELH sur le substrat S. Pour réaliser ces tests, on a utilisé en tant que tampons de réaction T :

- soit le tris-HCl 0,1 M + 0,01 % de triton X-100 à pH 8,

- soit le tris-HCL 0,1 M à pH 8.

De manière générale, on a pu observer une meilleure inhibition dans le tris-HCL, mais une activité enzymatique plus faible que dans le tampon tris-HCL + 0,01 % de triton X-100.

Dans le cadre de cet exemple :

- la figure 1 représente l'activité anti-élastasique de l'acide oléique de référence,

- la figure 2 représente l'activité anti-élastasique de la préparation A,

- la figure 3 représente l'activité anti-élastasique de la préparation B,

- la figure 4 représente l'activité anti-élastasique de la préparation C,

- la figure 5 représente l'activité anti-élastasique de la préparation D.

Plus précisément :

Pour chacune des sustances testées, on a préparé les cuves 1 à 5 dont la composition est répertoriées dans le tableau ci-après :

On a ensuite agité chacune des cuves pendant 30 mn à 37ºC de manière à laisser à l'enzyme le temps d'agir sur son substrat.

On a ensuite effectué la lecture à 410 nm de la concentration en p-nitro-aniline et reporté les résultats obtenus sur des courbes 1 à 5 qui correspondent aux cuves de même numérotation. Les courbes numérotées 1 correspondent à la référence tandis que les courbes 2 et 3 représentent les cinétiques en l'absence de préparations testées et les courbes 4 et 5 en présence de ces préparations.

Sur chacune de ces courbes, on a reporté, en abcisse, le temps en minutes et, en ordonnée, la déviation optique DO lue à 410 nm.

Les préparations testées ont été les suivantes :

- Préparation A : Céramide 1 % + lécithine hydrogénée

1 %

- Préparation B : Céramide 1 % + lécithine hydrogénée

1 % + Vitamine E acétate 2 %

- Préparation C : Céramide 1 % + lécithine hydrogénée

1 % + Vitamine E acétate 2 % + Vitamine A acide 0,05 %

- Préparation D : Céramide 1 % + lécithine hydrogénée

1 % + Vitamine E acétate 2 % + Dexamethazone 0,02 %.

Pour l'acide oléique de référence, on a procédé de manière quelque peu différente vu que l'on a utilisé sept cuves de mesure à partir desquelles on a établi, à chaque fois, les courbes correspondant au suivi de la cinétique de la libération de p-nitroaniline. Les courbes 1 à 3 correspondent respectivement, comme pour les préparations conformes à l'invention, à la courbe de référence et aux cinétiques en l'absence d'acide oléique. Les courbes 4 et 5 correspondent à une concentration en acide oléique égale à 0,1 μg/ml tandis que les courbes 6 et 7 correspondent à une concentration en acide oléique de 1 μg/ml.

Les courbes correspondant à l'acide oléique de référence ainsi qu'aux préparations A à D sont jointes en annexe.

Sur chacune d'entre-elles, on a mesuré le pourcentage d'inhibition de l'activité anti-élastasique de chacune des différentes préparation au bout de 10 mn et on a trouvé les résultats suivants : Acide oléique de référence à 0,1 μg/ml : 36 %

Acide oléique de référence à 1 μg/ml : 84 %

Préparation A : 45 %

Préparation B : 24 %

Préparation C : 29 %

Préparation D : 51 %.

Ces résultats permettent de prouver clairement l'activité anti-élastasique des compositions conformes à l'invention et, en particulier, des céramides.

Cette activité n'avait jusqu'à présent jamais été démontrée.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S

1°) Composition lipidique polaire d'origine végétale permettant de véhiculer un agent actif et/ou de le faire pénétrer dans une cellule cible, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une emulsion aqueuse injectable, intra-articulaire, topique ou ingérable d'un mélange lipidique polaire riche en phospholipides, en glycolipides et en ceramides, ayant une composition essentiellement identique à celle des constituants lipidiques polaires des cytomembranes lipidiques des cellules et obtenu à partir d'un composé végétal tel que de la farine de céréales ou un extrait tel que du son ou des lipides extraits de céréales par des solvants chlorés.

2º) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le mélange lipidique constitue l'agent actif.

3º) Composition selon la revendication 2, destinée à faciliter l'élimination des plaques d'athérome, caractérisée en ce qu'elle renferme, en tant qu'agent actif, un mélange lipidique dont le HLB est essentiellement compris entre 8 et 10.

4°) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'émulsion a une composition essentiellement identique à celle des cytomembranes lipidiques d'une cellule cible et renferme un agent actif enrobé dans une gaine du mélange lipidique.

5º) Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'agent actif est un agent d'hydratation associé, le cas échéant, à des additifs tels que des vitamines A ou E.

6º) Composition médicamenteuse selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'agent actif est choisi dans le groupe formé par les antibiotiques, les anti-inflammatoires, les corticoïdes, les antiviraux, les anticancéreux et les médicaments des pathologies cardiovasculaires.

7º) Composition médicamenteuse selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'agent actif est une substance toxique sélective pour un agent pathogène notamment un virus, une bactérie ou un champignon.

8º) Composition médicamenteuse selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'agent actif est l'AZT.

9º) Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, plus spécialement destinée au domaine de l'immuno allergologie, caractérisée en ce que l'allergène est véhiculé par le système glycolipidique pour stimuler la défense immunitaire.

10º) Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle constitue un système vecteur de composants de vaccins pour renforcer l'immunité humorale et cellulaire.