WO1993002067A1

WO1993002067A1 - Antitumor compound nsc-lsc1 and production thereof

Info

Publication number: WO1993002067A1
Application number: PCT/JP1992/000917
Authority: WO
Inventors: Koji Saito; Hiroaki Ohashi; Makoto Tahara; Tetsuo Sakamoto; Masaaki Hibi
Original assignee: Nippon Steel Corp
Current assignee: Nippon Steel Corp
Priority date: 1991-07-17
Filing date: 1992-07-17
Publication date: 1993-02-04
Anticipated expiration: 1994-01-17
Also published as: EP0555485A1; CA2092705C; KR930702323A; EP0555485A4; CA2092705A1

Description

明細書抗腫癟活性化合物 N S C - L S C 1及びその製造方法技術分野

本発明は、新規なタキソール（ T a X 0 1 ) の類緣体に属する抗腫瘍活性化合物 N S C - L S C 1及びその製造方法に関する。当該化合物はタキソールと同様に毒性が低く、かつ強い抗腫瘍活性を有する。背景技術

植物起源の抗腫瘍活性を有する化合物は、数多く知られており、そしてそれらの一部は抗腫瘍剤として現に利用されており、腫瘍治療の重要な手段のひとつとなっている。

植物起源の抗腫瘍活性を有する化合物は、一般に、人体に対して強い毒性を示すものが多く、医薬品として認可されている化合物についても、人体に対する毒性が、使用に当たつての大きな制約になっている。かかる状況下で、毒性が低く且つヒトの腫癟に対してより強い抗腫瘍活性を有する化合物としてタクサン系のジテルペンであるタキソールが注目を集めている。このタキソールはィチイ科 (Taxaceae) のィチイ属 (Taxus)に属するタイへィョウイチイ (Taxus brevifolia ΝϋΤΤ.)の樹皮から抽出されたものが抗腫瘍剤として臨床試験に供されている（例えば、 David G. I.Kingston, Pharmac. Ther. Vol.52, PP1〜34, 1991 ) が、最近になってその植物体の特定組織を用いる組織培養によるタキソールの生産も報告されている（例えば、米国特許第 5 , 019 , 504号明細書参照）しかしながら、多様性を示す悪性腫瘍、特に癌の有効な化学療法に寄与するには、多様な抗腫瘍活性を有する化合物の提供が望まれるであろう。

従って、本発明の目的は、毒性が低く且つヒトの腫瘍に対して特異な抗腫瘍活性を有することが期待される新規な抗腫瘍活性化合物を開発するとともに、その安定供給を実現するための製造方法を提供することにある。発明の開示

本発明者らもィチイ科 ( Taxaceae ) に属する植物中に舍まれる抗腫瘍活性化合物に着目し、鋭意研究してきたところ、タイへィョウイチイ ( Taxus brev i f o l i a UTT . ) のカルスから強い抗腫瘍活性を示すが、明らかにタキソールと異なる立体構造を有する新規化合物を単離することに成功した。また、この化合物は、タイへィョウイチイの胚乳を用いる組織培養によって容易に誘導 · 増殖するカルスから効率よく生産できることが確認された。こうして、本発明の新規化合物は安定供給も可能となった。

従って、本発明によれば、下記の理化学的特性により特定される新規抗腫瘍活性化合物が提供される。

① 形状：白色粉状。

② 分子量： F A Β型質量スぺクトル（ N B Aマトリックス）にて測定 · m/ e = 8 5 4 ( M H + ) 。

③ 元素分析（実測値）：炭素 6 6. 1 % 水素 6. 0 %

酸素 2 6. 3 % 窒素 1 . 6 %

④ 分子式： C ₄₇H _{s l} N 0₁₄

⑤ 比旋光度：〔 ar〕 "=一 4 9. 7 °

( c = 0. 3 6 ; メタノール）

⑥ 融点： 2 1 3 — 2 1 6

⑦ 溶解性：水に難溶、メタノールに易溶

⑧ プロトン核磁気共鳴スぺクトル（ — N M R )

( 4 0 0 MHz ；重水素化クロ口ホルム；化学シフト、 ppm ；カップリング定数、 Hz) ：

1.145(s, 3H) ； 1.242(s, 3H) ；

1.687 (s, 3H) ； 1.798 (s, 3H) ；

1.82(broad s, 1H) 1.88(broad s， 1H)

2.238 (s, 3H) ； 2.35(m, 2H) ；

2.385 (s, 3H) ； 2.55(m, 2H) ；

3.56(broad, 1H)； 3.79(d) j=6.8₎ 1H)

4.18(d, j=7.4, 1H) 4.31(d, j=8.3, 1H)

4.4(m, 1H) ； 4.79(d, j=2.4, 1H)

4.95(dd, 1.8および 7.2 1H) ；

5.67(d, j=7.3, 1H) ；

5.79(dd, j=2.5および 8, 1H) ；

6.23(t, j = 8.5, 1H) ； 6.272 (s, 1H)

6.99(d, j=8.8, 1H) ； 7.39(m, 4H)

7.48(111, 5H) ； 7..49(m, 4H) 7.73(d, j=7.5, 1H) ； 8.13(d, j=8.3, 1H) 。

上記理化学的特性のうち、例えば、 ' Η— NM Rスぺクトラムによれば、 3. 5 6 ppm のビークがブロードで、 4. 7 9 ppm のビークとの相関が喪失しており、下記推定構造式で示すように、本発明の化合物は少なくとも 2 ' 位水酸基の結合様式がタキソールと異なる構造異性体であることが明らかである。

本発明者らは、この化合物を抗腫瘍活性化合物 N S C— L S C-1 (以下「N S C— L S C 1 」と略記する）と命名した本発明はまた、 N S C— L S C 1 の製造方法であって、タィヘイョウイチイの胚乳から誘導したカルスを培養し、その培養物から該 N S C - L S C 1を採取する工程を舍んでなる方法も提供する。発明を実施するための最良の形態

前述の理化学的特性で特定される N S C— L S C 1 の推定構造式は、次の¹³ C核磁気共鳴スぺクトル（ ¹³ C— N M R ) によっても支持される。

¹³ C - N M R ( 4 0 0 MHz 、重水素化クロ口ホルム、化学

シフト、 ppnu ：

9.58 72.2 167.11

14.85 72.43 167.77

20.85 73.21 170.38

21.84 74.97 171.27

22.63 75.59 172.76

26.89 76.54 203.65

35.63 77.63

35.72 79.08

43.22 81.19

45.65 84.43

55.06 125〜135

58.65 131.25

本発明で提供される N S C— L S C 1 は、マウス及びヒトの移植癌細胞に対する強い増殖阻害活性を示す一方、それらの動物に対して毒性が低いことから、癌の化学療法分野での使用が期待される有望な化合物といえる。

P 3 8 8 (マウス白血病細胞）及び K B細胞（ヒト偏平上皮癌細胞）に対する増殖阻害活性値（ I C ₅。）について、東京大学応用微生物研究所で試験した結果を表 1 に示す。なお、 I C₅。値は、対照群の細胞増殖率を 5 0 %抑制する薬物濃度として示す。（参考までに、アメリカ合衆国国立衛生研究所に属する国立瘙研究所が実施している新規物質に対する抗腫瘍性効果判定試験においては、 K B細胞の I C₅。値は、合成物で 4 0 0 O ng/mL以下、天然物で 2 0 0 0 O ngZmL以下となる物質を有効な抗腫瘍性物質としている。）

表 1 ： N S C — L S C 1 のマウス及び

ヒト瘙細胞の増殖に対する阻害活性試験細胞 I C₅。

(ng/ niL )

P 3 8 8 3. 3

K B細胞 1 9 これらの結果から、 N S C— L S C 1がヒトの腫瘍細胞に対して極めて強い抗腫瘍活性を示すことが分かる。

本発明の N S C— L S C 1 は、以下に説明する本発明の方法によつて有利に製造することができる。

すなわち、本発明によれば、タイへィョウイチイ (Taxus brevifolia NUTT.) に由来する組織の培養による化合物 N S C - L S C 1 の生産方法であつて、

a ) 生きた胚乳由来の組織を調製する工程、

b ) 工程 a ) で得られた組織を力ルスの誘導に適する栄養培地で培養してカルスを誘導する工程、

c ) 工程 b ) で得られたカルスをカルスの増殖に適する栄養培地で培養する工程、. ならびに d ) 工程 c ) で得られた培養物から N S C— L S C 1 を採取する工程、

を含んでなる N S C— L S C 1 の生産方法、が提供される。生きた胚乳由来の組織の調製は、タイへィョウイチイから採取した種子を Ί 0 %ェタノールと次亜塩素酸ナトリウム水溶液を用いて滅菌し、次いでその材料を無菌的に切開し、胚乳を切り出して寒天またはゲルライト ⑧ （gel lan gum, Merc k & Co. Inc. , ) で固めた下記のカルスの誘導に適する培地に植え付ける工程が挙げられる。

次に、上述の工程で得られる生きた組織がカルスの誘導に適する栄養培地で培養され、さらに誘導されたカルスがその増殖に適する栄養培地で培養される。かかる栄養培地に用いる基本的な成分としては、水；無機要素、例えば、窒素（ァンモニゥム塩、硝酸塩）、リン、カリウム、カルシウム、マグネシゥムおよびィォゥなど；糖、例えばショ糖、ダルコ一ス、フルクトースおよびマルトースなど；微量無機要素；ビタミンおよびアミノ酸などの有機物；ココナッツミルクのような天然物質；ならびに場合により、寒天、ゲルライト ®、アルギン酸およびァガロースが挙げられる。本発明の基本培地として用いる具体的な組成を示すものとしては、シユンク一ヒルデブランド（Schenk & Hildebrandt) 培地（以下、「 S H培地」と称する）、ムラシゲースクーグ（ Murash i ge & Skoog)培地（以下、「 M S培地」と称する）、ガンボルダ (Gamborg)' の B 5培地、ホワイト（White) 培地、ニッチ

(Ni tsch & Nitsch) 培 ift、ナガタータケべ（Naga ta & Take'be) 培地およびゥッディ ' プラント（Woody Plant) 培地が挙げられる。これらの基本培地に、さらに植物ホルモンとして、オーキシン (auxin) 例ば、 1 — naphthaleneacetic acid (以下、「NAA」と称する）、 indole— 3 —acetic acid (以下、「 I A A」と称する）、 indole— 3 — butyric acid (以下、「 I B A j と称する）および 2 , 4 -dichlorophen oxyacetic acid (以下、「 2 , 4 — D」と称する）など；サィ卜カイニン（cy tokinin ) 、例えば、 benzyladenine (以下、 1 B A j と称 3 る ) 、 kinetin, zeatin および 6 — fur fury — laminopurineなど ί gibberel 1 in (以下、 ^r GA」と称する）例えば、 GA, および G A₃ など、が適宜添加される。

就中、本発明によるカルスの誘導に適する栄養培地としては、上記基本培地にオーキシンとサイトカイニンとジべレリン類とを加えた培地、より具体的には基本培地として S H培地を用い、それにサイトカイニンとして B Aを、そしてジべレリン類として G A₃ を加えた培地、あるいはオーキシンとして N AAを、そしてサイトカイニンとしてキネチンを加えた培地が好ましい。一方、カルスの増殖に適する培地としては、上記基本培地にサイトカイニンとオーキシンとを加えた培地、より具体的には基本培地として S H培地を用い、それにサイトカイニンとしてキネチンを、そしてオーキシンとして N A Aまたは 2 , 4 — Dを加えた培地が好ましい。かかる培地は、適当な酸またはアルカリを用いて PH 5〜 7、好ましくは pH5. 5 〜 6. 0 に調節される。

これらの培地を用いる上記培養は、それぞれ 1 5〜 2 5 ての範囲内の温度で、光の照射または無照射の条件下で行うことができる。特に、カルスの増殖を目的とする培養は、液体培地を用いて振盪培養機で行うのが好ましい。

こうして得られる培養物からの N S C— L S C 1 の抽出は自体既知の組織培養物から各種アル力ロイド類の単離、精製方法に準じて行うことができる。なお、「培養物」の語は培養細胞および細胞の塊（カルス）、ならびにそれらの懸濁物 (特に、液体培地を用いる場合）を包舍する意味で用いている。限定されるものでないが、かかる培養物からの N S C— L S C 1 の抽出は一般に、カルスを分離し、乾燥し、粉砕し. 次いで、得られた粉末から適当な有機溶媒で抽出し、必要により有機相を水性溶液で洗净し、乾燥した後、溶媒留去して行うことができる。抽出された N S C— L S C 1 は、必要により、各種ク口マトグラフィ一処理、再結晶などにより精製できる。抽出に用いることができる有機溶媒としては、塩化メチレン、ジクロロヱタンなどの塩素化炭化水素類、メタノール、エタノールおよびィソプロビルアルコールなどのァルコール類、ならびにこれらの混合物を挙げることができる。次に、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例

タイへィョウイチイ (Taxus brevifolia NUTT.、アメリカ合衆国オレゴン州フィッシュレーク自生の榭）の仮種皮を取り除いた冷蔵種子を Ί 0 %W/Wエタノール水溶液に一分間浸漬後、有効塩素濃度 1 %次亜塩素酸ナトリゥム水溶液に 2 0分間浸漬して滅菌した後、滅菌水で 3回水洗した。その後. 硬い外種皮と膜状の内種皮をメスとピンセットを用いて除去した後、胚と胚乳を分離した。

このようにして準備した胚乳を、植物ホルモンであるベンジルアデニン（ B A ) とジベレリンの一種である GA 3の両者を添加し、 PHを 5 . 8に調整した S H培地（ 0 . 2 5 %ゲルライトを加えて固体培地としたもの）に植え付けた。培地に添加した B A及び G A 3の濃度は、それぞれ、 1 または 5 または 1 0 ragZ 1及び 0または 1または 1 0または 1 0 0 mg ノ 1 であった。それらを 2 0度または 2 5度の温度条件で、照明下（ 1 6時間日長）で培養したところ、約 2ヶ月後に力ルスが誘導された。

この様にして胚乳から誘導したカルスをナフタレン酢酸 ( N A A ) とキネチンを添加し、 PHを 5. 8 に調整した S H 培地（液体培地）に綞代した。培地に添加した N A A及びキネチンの濃度は、それぞれ 5 mgZ 1及び 0または 0. 1 または 0. 5 mg/ 1 であった。培地の量は、容量 1 0 0 mlの三角フラスコ当り 4 0 mlであり、振盪培養器を用いて 1 0 0 rpm の速度で振盪培養した。培養温度は 2 0度、光条件は暗黒とした。

4週間後、カルスの増殖を調べたところ、 N AAのみを 5 mg/ 1 の濃度となるように添加した培地で、上記液体培地に植付けたカルスに対して約 5倍の増殖率が得られた。更に K A Aのみを 5 mg/ 1 の濃度となるように添加した培地について、温度条件を 2 0度または 2 5度、光条件を暗黒または照明下（ 1 6時間日長）として 4週間培養した結果、いずれの組合せでもカルスの増殖が観察されたが、特に 2 0度、暗黒下で培養した場合、優れた結果が得られた。また、ォ一キシン類として NAAの代わりに 2 , 4 — Dを用いた場合、 N A Aを用いた場合とほぼ同様の増殖が観察された。

このようにして増殖したカルスを回収し、風乾した。乾燥重 3 0 gのカルスを乳鉢を用いて十分ホモジナイズした後、メタノールと塩化メチレンの 1 ： 1 の混合液 5 0 0 mlを加え、坂口フラスコを利用して室温にて、 1 6時間の振盪 · 抽出を行なった。この操作を 3回操り返した後、減圧濃縮し、 1. 0 3 gの褐色物質を得た。これを塩化メチレンと水の 1 ： 1 の混合液 5 0 0 mlで分配を行い、塩化メチレンの層を回収した。その操作を数回繰り返し、再び滅圧濃縮し、 5 3 O mgの褐色物質を得た。得られた化合物をメタノールに溶解し、高速液体ク口マトグラフィー〔カラム： D y n a m a x (商標） 6 0 A S μ m C 1 8 4. 6關 * 2 5 0關（米国 Rain in Instrument Company Inc.製）移動相組成：メタノールと水とァセトニトリルが 2 0 ： 4 1 ： 3 9 ) により、分画した。

この分画のうち、活性を有するとみられる分画を滅圧濃縮した。この操作を繰り返し、 1 1 mgの白色粉状物質を得た。これをメタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィー〔カラム： D y n a m a x 6 0 A S m C ι 8 —

h e n y l . 6 mm * 2 5 0 mm 、米国 Rainin Instrument Company Inc.製）、移動相組成：メタノールと水とァセト二トリルが 2 0 : 4 5 : 3 5、検出光波長： 2 2 7 nm〕で、力ラム保持時間に対する検出光波長の吸収を調べたところ、一つのビークのみ観察されたので、極めて純度の高い化合物を得たことがわかった。

この純度の高い化合物は、前述のような理化学的性状及び抗腫瘍性を示した。産業上の利用可能性

本発明の N S C - L S C 1 は、低毒性で強い抗腫瘍性活性を示し、また Taxus brevifolia の胚を用いる組織培養により安定に N S C— L S C 1 を供給できるので、本発明は医薬品製造業で利用できる。

Claims

請求の範囲

1. 理化学的特性

① 形状：由色粉状；

② 分子量： m/ e = 8 5 4 (MH+ ) 、 F AB型質量スベクトル（N B Aマトリツスス）にて測定；

③ 元素分析（実測値）：炭素 6 6. 1 % 水素 6. 0 % 酸素 2 6. 3 % 窒素 1 . 6 %

④ 分子式： C₄₇H₅₁N 0₁₄ ；

⑤ 比旋光度：〔 α〕 "=— 4 9. Ί。 ( c = 0. 3 6 ;

メタノール）；

⑥ 融点： 2 1 3 — 2 1 6 ；

⑦ 溶解性：水に難溶、メタノールに易溶及び

⑧ ¹ H— N M R ( 4 0 0 MHz ； C D C 1 ₃ ppm)

1.145(s, 3H) ； 1.242(s， 3H) ；

1.687 (s, 3H) ； 1.798 (s, 3H) ；

1.82(broad s, 1H) ； 1.88(broad s, 1H)

2.238(s， 3H) ； 2.35(m, 2H) ；

2.385(s, 3H) ； 2.55(m, 2H) ；

3.56(broad 1H) ； 3.79(d, j = 6.8, 1H)

4.18(d, j=7.4, 1H) 4.31(d, j=8.3, 1H)

4.4(m, 1H) ； 4.79(d) 2.4, 1H)

4.95(dd, 』=1.8ぉょび7.2 1H) ；

5.67(d, j=7.3, 1H) ；

5.79(dd, j = 2.5および 8, ΓΗ.)

6.23(t, j = 8.5, 1H) ； 6.272(s, 1H) ；

6.99(d, j=8.8, 1H) ； 7.39(m, 4H) ；

7. 8cm, 5H) ； 7.49(m, 4H) ；

7.73(d, j=7.5, 1H) ； 8.13(d, j=8.3, 1H)

によって特定されるタキソール類緣化合物 N S C - L S C 1 2. タイへィョウイチイ (Taxus brevifolia NUTT.) に由来する組織の培養による請求の範囲第 1項記載の化合物 N S C - L S C 1 の製造方法であって、

a ) 生きた胚乳由来の組織を調製する工程、

b ) 工程 a ) で得られた組織をカルスの誘導に適する栄養培地で培養してカルスを誘 IIする工程、

c ) 工程 b) で得られたカルスをカルスの増殖に適する栄養培地で培養する工程、ならびに

d ) 工程 c ) で得られた培養物から N S C— L S C 1を採取する工程、

を舍んでなる N S C— L S C 1 の製造方法。