WO1992016653A1 - Non-radioactive dna sequencing method - Google Patents
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- C12Q1/6869—Methods for sequencing
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- Familial hypercholesterolemia gene concerned: the LD-receptor gene (Lo-density-Lipoprotein receptor).
- the coding region for human p53 is isolated and the four regions of hot spots defined above are amplified using the PCR method and primers located on either side of regions A, B, C and D.
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Abstract
Description
PROCEDE DE SEQUENÇAGE NON RADIOACTIF D'ADNPROCESS Sequén G AGE NO RADIOACTIVE DNA
L'invention concerne un procédé de séquençage non radioactif d'ADN, utile notamment, dans le séquençage direct des gènes pour le diagnostic des maladies génétiques. Elle s'applique en particulier à l'étude des prédispositions aux maladies cardiovascuiaires, aux troubles du métabolisme et en cancérologie.The invention relates to a non-radioactive DNA sequencing method, useful in particular in the direct sequencing of genes for the diagnosis of genetic diseases. It applies in particular to the study of predispositions to cardiovascular diseases, metabolic disorders and oncology.
La deuxième moitié des années 1980 a été marquée, en génétique humaine, par la possibilité d'accéder à certaines techniques moléculaires extrêmement sophistiquées. Ces techniques permettent l'analyse moléculaire d'un certain nombre de gènes dont la moindre modification (mutation) est responsable de maladies génétiques graves telles que la mucoviscidose et la myopathie ainsi que l'étude de génomes viraux directement impliqués dans certains cancers notamment ies papillomasvirus de type HPV 16, 18, 33 impliqués dans les cancers du coi de l'utérus. Ces techniques ouvrent aussi la voie à la recherche non seulement de gènes de prédisposition à certaines maladies auto-immunes tels que le lupus érythémateux disséminé, et la sclérose en plaques, les maladies cardiaques, les tumeurs transmises héréditairement notamment dans le cas de Rb ou gène du rétinoblastome, bientôt dans celui de la polypose rectocolique, de l'anémie de Fanconi et de l'ataxie télangiectasie mais également de gènes de prédisposition au développement de cancers divers (familles à cancers) tels que les oncogenes ou les anti-oncogènes modifiés (oncogenes ras, myc, bcl2..., anti-oncogènes Rb et p53 essentiellement). Ainsi, l'enjeu diagnostique des années 90 est fondé sur la technologie moléculaire qui permettra l'étude et le dépistage des maladies génétiques, des virus engendrant des maladies graves (papillomavirus, virus du sida, de l'hépatite B), par exemple des prédispositions à certaines formes de maladies cardiaques, nerveuses et des prédispositions à certains cancers.The second half of the 1980s was marked, in human genetics, by the possibility of accessing certain extremely sophisticated molecular techniques. These techniques allow the molecular analysis of a certain number of genes whose slightest modification (mutation) is responsible for serious genetic diseases such as cystic fibrosis and myopathy as well as the study of viral genomes directly involved in certain cancers, notably papillomas virus HPV type 16, 18, 33 involved in cervical cancer. These techniques also open the way to the search not only for genes predisposing to certain autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus, and multiple sclerosis, heart diseases, hereditary tumors, especially in the case of Rb or gene. retinoblastoma, soon in that of rectocolic polyposis, Fanconi anemia and ataxia telangiectasia but also genes predisposing to the development of various cancers (cancer families) such as oncogenes or modified anti-oncogenes ( ras oncogenes, myc, bcl2 ..., anti-oncogenes Rb and p53 essentially). Thus, the diagnostic issue of the 1990s is based on molecular technology which will allow the study and screening of genetic diseases, viruses causing serious diseases (papillomavirus, AIDS virus, hepatitis B), for example predispositions to certain forms of cardiac, nervous diseases and predispositions to certain cancers.
L'une des étapes préliminaire et indispensable à l'étude d'un gène est la détermination de sa séquence, cette étape permettant de définir la structure du gène, ses particularités ainsi que ies homologies éventuelles avec d'autres gènes. Différentes méthodologies de séquençageOne of the preliminary and essential stages in the study of a gene is the determination of its sequence, this stage making it possible to define the structure of the gene, its particularities as well as possible homologies with other genes. Different sequencing methodologies
FEUILLE DE REMPLACEMENT ont été mises au point. La plus simple, la méthode de Sanger, consiste à faire synthétiser par une polymérase le brin complémentaire au brin que l'on désire séquencer. L'élongation est réalisée en utilisant les quatre désoxynucléotides usuels dont l'un est radioactif ( P ou S), en combinaison avec un didéoxynucléotide spécifique, ddNTP, dont l'absence de groupement hydroxyle en 3' aura comme conséquence l'arrêt de l'élonga¬ tion. La taille du fragment au nucléotide près, permet de déterminer la position du ddNTP dans la chaîne en élongation, et donc la position de la base complémentaire du brin que l'on séquence.REPLACEMENT SHEET have been developed. The simplest, the Sanger method, consists in synthesizing by a polymerase the strand complementary to the strand which one wishes to sequence. The elongation is carried out using the four usual deoxynucleotides, one of which is radioactive (P or S), in combination with a specific dideoxynucleotide, ddNTP, whose absence of hydroxyl group at 3 ′ will result in stopping the 'elonga¬ tion. The size of the fragment to the nearest nucleotide makes it possible to determine the position of ddNTP in the elongated chain, and therefore the position of the base complementary to the strand which is sequenced.
10 L'autre méthode, la méthode de Maxam et Gilbert, est elle aussi basée sur l'obtention de fragments, dont la taille permet de définir la position d'une des quatre bases. Des fragments d'ADN simples ou doubles brins, marqués radioactivement à l'une de leurs extrémités sont clivés partiellement et spécifiquement au niveau d'une des bases dans quatre 15 tampons reactionnels différents. Après séparation des fragments selon leur taille, sur gel de polyacrylamide dénaturant, la lecture de la séquence peut se faire directement sur le gel.10 The other method, the Maxam and Gilbert method, is also based on obtaining fragments, the size of which makes it possible to define the position of one of the four bases. Simple DNA fragments or double-stranded, radioactively labeled at one of their ends are partially cleaved specifically at one of the bases 15 in four different reaction buffers. After separation of the fragments according to their size, on a denaturing polyacrylamide gel, the sequence can be read directly on the gel.
La caractéristique commune de ces procédés au moins à leur début, était d'avoir recours à la radioactivité afin de révéler la séquence.The common feature of these processes at least in their early days was to use radioactivity to reveal the sequence.
20 Or il est certain que le développement de ces technologies implique qu'elles soient fiables, rapides, peu coûteuses, mais qu'elles soient surtout indépendantes de la radioactivité afin que son utilisation soit accessible à tous les centres spécialisés.20 It is certain that the development of these technologies implies that they are reliable, rapid, inexpensive, but that they are above all independent of radioactivity so that its use is accessible to all specialized centers.
L'un des buts de la présente invention est de proposer un procédé de e~> séquençage non radioactif.One of the aims of the present invention is to propose a process for e ~ > non-radioactive sequencing.
Un autre but de la présente invention est de procurer un procédé de séquençage pour le diagnostic des maladies génétiques dans lesquelles les mutations du gène en cause varient d'un individu à l'autre. Un autre but de l'invention est de procurer un tel procédé de 0 séquençage qui soit facilement mis en oeuvre et facilement automatisé. Un autre but de l'invention est de procurer un tel procédé pouvant être utilisé plus particulièrement pour la détection des prédisAnother object of the present invention is to provide a sequencing method for the diagnosis of genetic diseases in which the mutations of the gene in question vary from one individual to another. Another object of the invention is to provide such a sequencing method which is easily implemented and easily automated. Another object of the invention is to provide such a method which can be used more particularly for the detection of predictions.
5 positions aux maladies cardiovasculaires, aux troubles du métabolisme et en cancérologie.5 positions in cardiovascular disease, metabolic disorders and oncology.
Dans le cas de maladies associées à une mutation ponctuelle apparaissant avec une fréquence élevée, comme dans le cas de la mucoviscidose, il est possible de prévoir une sonde à DNA correspondant à cette portion mutée et ainsi mettre en évidence la présence ou l'absence de ladite mutation.In the case of diseases associated with a point mutation appearing with a high frequency, as in the case of cystic fibrosis, it is possible to provide a DNA probe corresponding to this mutated portion and thus highlight the presence or absence of said mutation.
Lorsque les mutations peuvent être nombreuses, il n'est pas possible de prévoir autant de sondes que de mutations possibles.When mutations can be numerous, it is not possible to provide as many probes as possible mutations.
Ainsi dans le cas des phénomènes tumoraux associés aux gènes de la p53, il existe actuellement près de 30 mutations ponctuelles différentes qui ont été décrites (à partir de 25 tumeurs) ; encore cette liste de mutation ne peut être considérée comme exhaustive.Thus, in the case of tumor phenomena associated with the p53 genes, there are currently nearly 30 different point mutations which have been described (from 25 tumors); yet this list of changes cannot be considered exhaustive.
En tout état de cause, l'utilisation de plus de 30 sondes spécifiques n'est pas envisageable.In any event, the use of more than 30 specific probes cannot be envisaged.
Toutefois, dans ce type de pathologie, si la présence d'une mutation donnée peut avoir une valeur pronostique on pourra alors envisager une nouvelle génération d'outils anti-tumoraux (oligonucleotides anti-sens, anticorps spécifiques d'épitopes caractéristiques de formes mutées par exemple), et la mise en place de cartographie des tumeurs qui, à côté des descriptions des anatomopathologistes classiques, permettront de définir un traitement individualisé.However, in this type of pathology, if the presence of a given mutation can have a prognostic value, we can then consider a new generation of anti-tumor tools (anti-sense oligonucleotides, antibodies specific for epitopes characteristic of forms mutated by example), and the establishment of tumor mapping which, alongside the descriptions of classic pathologists, will make it possible to define an individualized treatment.
C'est l'un des buts de la présente invention de permettre, grâce à un procédé de mini séquençage non radioactif des parties du gène comportant des régions "hot spots", de mettre à la disposition du praticien des moyens de diagnostic permettant d'envisager la prévention et le traitement de ce type de maladie.It is one of the aims of the present invention to make it possible, by means of a non-radioactive mini sequencing process of the parts of the gene comprising "hot spot" regions, to make available to the practitioner diagnostic means making it possible to consider prevention and treatment of this type of disease.
La présente invention concerne un procédé de séquençage d'un fragment d'ADN caractérisé en ce que : a) on isole au moins un fragment d'ADN contenant la zone à sequencer b) on effectue le séquençage direct de ladite zone sans utiliser de composés radioactifsThe present invention relates to a method of sequencing a DNA fragment characterized in that: a) at least one DNA fragment containing the zone to be sequenced is isolated b) direct sequencing of said zone is carried out without using compounds radioactive
FEUILLE DE REMPLACEMENT c) on fait migrer les fragments obtenus par séquençage sur un support d) on révèle ies fragments d'ADN après migration sur le support ou sur un support de transfert en les mettant en présence d'un composant ayant une affinité pour l'ADN et qui comporte un élément marqueur détectable et e) les ADN détectés sont lus pour- déterminer la séquence du fragment d'ADNREPLACEMENT SHEET c) the fragments obtained by sequencing are migrated on a support d) the DNA fragments are revealed after migration on the support or on a transfer support by putting them in the presence of a component having an affinity for DNA and which has a detectable marker element and e) the DNAs detected are read to determine the sequence of the DNA fragment
Ce procédé est plus particulièrement utilisable pour le mini séquençage de parties de gène comprises entre 50 et 100 nucléotides. Ces zones variables génétiquement peuvent comporter des mutations impor¬ tantes.This method is more particularly usable for mini sequencing of gene parts of between 50 and 100 nucleotides. These genetically variable zones can include significant mutations.
L'isolement d'au moins un fragment d'ADN pourra être effectué par une méthode quelconque, notamment à l'aide des méthodes utilisées lors de séquençages traditionnels, mais on préférera utiliser la méthode PCR qui permet d'amplifier la séquence intéressante en utilisant des amorces consensuelles situées de part et d'autre de ladite séquence variable.The isolation of at least one DNA fragment can be carried out by any method, in particular using the methods used during traditional sequencing, but it is preferable to use the PCR method which makes it possible to amplify the sequence of interest by using consensus primers located on either side of said variable sequence.
Le séquençage des produits d'amplification peut être réalisé par l'une quelconque des méthodes de séquençage connues et rappelé précédemment, ainsi que par leur différentes variantes et adaptations.The sequencing of the amplification products can be carried out by any of the known sequencing methods mentioned above, as well as by their different variants and adaptations.
Pour l'essentiel, ces techniques de séquençage conduisent à des fragments d'ADN de masses moléculaires diverses dont une des extrémités est connue, la masse moléculaire permettant d'attribuer une position au nucléotide d'extrémité.Essentially, these sequencing techniques lead to DNA fragments of various molecular masses one of whose ends is known, the molecular mass making it possible to assign a position to the end nucleotide.
Le produit de séquençage est ensuite déposé sur un support sur lequel on le fait migrer, notamment par électrophorèse. Cette technologie est connue, le gel est en général un gel de poiyacrylamide utilisé dans des conditions dénaturantes pour permettre une séparation totale et reproduc¬ tible des fragments.The sequencing product is then deposited on a support on which it is migrated, in particular by electrophoresis. This technology is known, the gel is generally a polyacrylamide gel used under denaturing conditions to allow total and reproducible separation of the fragments.
Suivant la nature du composant utilisé par la suite pour la détection du fragment d'ADN, il peut être nécessaire de prévoir, un transfert du gel de migration sur un support de transfert notamment une membrane ou même des supports moins réactifs.Depending on the nature of the component subsequently used for the detection of the DNA fragment, it may be necessary to provide for a transfer of the migration gel onto a transfer support, in particular a membrane or even less reactive supports.
FEUILLE DE REMPLACEMENT En effet, le composant assurant en quelque sorte la révélation de l'ADN peut être amené à réagir sur le gel de migration.REPLACEMENT SHEET Indeed, the component ensuring in a way the revelation of DNA can be caused to react on the migration gel.
Les membranes utilisées pour ce type de transfert sont connues il peut s'agir notamment de membranes, en polyamide (nylon), dérivé de cellulose, (nitro-cellulose), ou membranes notamment minérales. Leurs caractéristiques devront bien entendu être adaptées au processus mis en oeuvre.The membranes used for this type of transfer are known, they may especially be membranes, made of polyamide (nylon), cellulose derivative, (nitro-cellulose), or in particular mineral membranes. Their characteristics will of course have to be adapted to the process implemented.
L'un des procédés utilisables pour le transfert sur la membrane, est un électro-transfert, qui est un procédé décrit notamment dans le brevet US W 52 901.One of the methods which can be used for transfer to the membrane is an electro-transfer, which is a method described in particular in US patent W 52,901.
L'étape d consiste à mettre ies fragments d'ADN ayant migres en présence d'un composant ayant une affinité pour l'ADN et qui comporte un élément marqueur détectable, ceci afin de permettre la détection ultérieure des fragments. L'un des éléments caractéristiques de la présente invention est le fait que ce composant présente une affinité pour l'ADN quelle que soit la séquence en cause, c'est-à-dire qu'il ne s'agit pas d'une sonde donc d'un fragment d'ADN complémentaire de la séquence en cause, ou d'un composant reconnaissant des structures d'ADN naturel particulières.Step d consists in putting the DNA fragments having migrated in the presence of a component having an affinity for DNA and which comprises a detectable marker element, this in order to allow the subsequent detection of the fragments. One of the characteristic elements of the present invention is the fact that this component has an affinity for DNA whatever the sequence in question, that is to say that it is not a probe therefore a DNA fragment complementary to the sequence in question, or a component recognizing particular natural DNA structures.
Ce type de composant est choisi par exemple parmi les aminés, les métaux, les protéines histones. Parmi ces composés, il faut citer notamment les poiyamines tels que la polylysine ou la polyarginine, la protamine, et les poiyamines biogénétiques : spermine, spermidine par exemple.This type of component is chosen for example from amines, metals, histone proteins. Among these compounds, mention should be made in particular of poiyamines such as polylysine or polyarginine, protamine, and biogenetic poiyamines: spermine, spermidine for example.
Parmi les métaux il faut citer par exemple l'argent, le mercure et l'or.Examples of metals include silver, mercury and gold.
On peut aussi prévoir lors du séquençage d'utiliser pour la production des fragments de séquençage des éléments non naturels ; ainsi des analogues de nuciéotides et utiliser pour la détection des substances spécifiques pour ces éléments non naturels de l'ADN utilisés dans le séquençage par exemple des anticorps spécifiques.Provision may also be made during sequencing to use unnatural elements for the sequencing fragments; thus analogues of nucleotides and use for the detection of substances specific for these unnatural elements of DNA used in the sequencing for example of specific antibodies.
FEUILLE DE REMPLACEMENT Parmi les nucléotides non naturels, il faut citer les dérivés sulfurés qui sont détectables par des anticorps, les dérivés iodés qui sont détectables par des protéines avides d'iode telles que la thyrogiobuline et que l'on peut marquer directement par la phosphatase alcaline ; enfin des .dérivés mercurés qui sont détectés par les métaux s'amalgamant avec le mercure.REPLACEMENT SHEET Among the non-natural nucleotides, mention should be made of the sulfur derivatives which are detectable by antibodies, the iodine derivatives which are detectable by proteins avid for iodine such as thyrogiobulin and which can be labeled directly with alkaline phosphatase; finally . mercury derivatives which are detected by metals amalgamating with mercury.
Ce composant ayant une affinité pour l'ADN comporte un élément marqueur détectable, c'est-à-dire que l'on peut détecter visuelle¬ ment ou bien à l'aide d'un appareil analyseur. 1 Ce marqueur détectable peut être partie intégrante du composant ou bien être conjugué avec un élément marqueur tels que enzyme, fluorochrome ou métal, tel que l'or colloïdal. Cette conjuguaison peut être effectuée par voie chimique, notamment par l'intermédiaire de liaisons a ides covalentes ou bien par des liaisons de type avidine biotine par exemple.This component having an affinity for DNA comprises a detectable marker element, that is to say that it can be detected visually or using an analyzer apparatus. 1 This detectable marker can be an integral part of the component or else be conjugated with a marker element such as an enzyme, fluorochrome or metal, such as colloidal gold. This conjugation can be carried out chemically, in particular by means of covalent ides bonds or else by avidin biotin type bonds for example.
Le signal de détection généré par l'élément en cause, peut être obtenu directement ou par l'intermédiaire d'un substrat, par exemple dans le cas de l'enzyme par l'intermédiaire d'un substrat coloré.The detection signal generated by the element in question can be obtained directly or through a substrate, for example in the case of the enzyme through a colored substrate.
Ainsi, parmi les enzymes utilisées, il faut citer notamment les phosphatases alcalines, la galactosidase, la peroxydase ; en présence d'un substrat incolore approprié, ces enzymes le transforme en produit coloré qui précipite in situ.Thus, among the enzymes used, there should be mentioned in particular alkaline phosphatases, galactosidase, peroxidase; in the presence of a suitable colorless substrate, these enzymes transform it into a colored product which precipitates in situ.
Les bandes ainsi révélées peuvent être lues par tout moyen approprié visuellement, ou par l'intermédiaire d'un analyseur de bande,The tapes thus revealed can be read by any suitable means visually, or by means of a tape analyzer,
-> c _, c'est-à-dire lu par "scanner" et analyse par ordinateur.-> c _, that is to say read by "scanner" and analysis by computer.
Cette technique de mini-séquençage direct non-radioactif des régions 'hot-spots" des gènes est une véritable innovation. D'une part elle doit mettre le séquençage à la portée de tous les laboratoires non agréés pour la radioactivité, d'autre part elle donne un accès direct à l'informa- tion génétique sans risque de faux-negatifs ou de faux-positifs et sans problèmes de bruit de fond, troubles rencontrés parfois avec les sondes nucléiques. Ceci, alors que les appareils de séquençage automatiqueThis technique of direct non-radioactive mini-sequencing of the hot-spot regions of genes is a real innovation. On the one hand, it must make sequencing available to all laboratories not approved for radioactivity, on the other hand it gives direct access to genetic information without the risk of false negatives or false positives and without background noise problems, problems sometimes encountered with nucleic probes. This, while automatic sequencing devices
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FEUILLE DE REMPLACEMENT proposés actuellement sont encore à l'état de prototypes (manipulations difficiles et résultats pas toujours fidèlement reproductibles), et que leur coût très élevé les rend inaccessibles à la très grande majorité des laboratoires.REPLACEMENT SHEET currently offered are still in prototype form (difficult handling and results not always faithfully reproducible), and their very high cost makes them inaccessible to the vast majority of laboratories.
Ce procédé, selon l'invention, est déclinable à tous les systèmes pour lesquels une analyse génétique est indispensable : ces situations (très grand nombre de mutations pour un gène donné dans une pathologie donnée) sont hélas les plus fréquemment rencontrées en pathologie humaine. Parmi les applications possibles de cette technique, le dépistage des prédispositions génétiques aux maladies métaboliques permettant un traitement précoce de la maladie est une application de choix. Elle permet d'envisager une attitude préventive : hygiène de vie, surveillance, régime et/ou thérapeutique : prétraitement ou traitement médicamenteux. Parmi les maladies de ce type détectable par cette technique il faut citer :This method, according to the invention, is applicable to all systems for which a genetic analysis is essential: these situations (very large number of mutations for a given gene in a given pathology) are unfortunately the most frequently encountered in human pathology. Among the possible applications of this technique, screening for genetic predispositions to metabolic diseases allowing early treatment of the disease is an application of choice. It makes it possible to envisage a preventive attitude: lifestyle, monitoring, diet and / or therapy: pretreatment or drug treatment. Among the diseases of this type detectable by this technique should be mentioned:
L'hypercholestérolémie familiale (gène concerné : le gène du récepteur au LDL (Lo -density-Lipoprotein receptor).Familial hypercholesterolemia (gene concerned: the LD-receptor gene (Lo-density-Lipoprotein receptor).
Les dyslipoprotéinémies (gène concerné : les gènes de l'apolipoprotéine E, C2 et C l).Dyslipoproteinemias (gene concerned: the genes of apolipoprotein E, C2 and C l).
Les pathoiogies précoces des artères coronaires (gène concerné : les gènes de l'apolipoprotéine Al, C3 et M).Early pathologies of the coronary arteries (gene concerned: the genes of the apolipoprotein A1, C3 and M).
L'exemple ci-après est destiné à mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.The example below is intended to demonstrate other advantages and characteristics of the present invention.
Exemple 1Example 1
Actuellement près de 30 mutations ponctuelles différentes ont été décrites pour le gène de la p53 comme cela a été indiqué précédem¬ ment (à partir d'environ 25 tumeurs).Currently, nearly 30 different point mutations have been described for the p53 gene as indicated above (from approximately 25 tumors).
Ces mutations sont somatiques car, lorsque l'on analyse le gène de la p53 dans un tissu sain il n'est pas muté.These mutations are somatic because, when the p53 gene is analyzed in healthy tissue, it is not mutated.
L'ensemble des mutations ponctuelles décrites dans le gène de la p53 est localisé dans la région centrale.All of the point mutations described in the p53 gene are located in the central region.
FEUILLE De REi PLA i Ce gène est constitué de 11 exons qui s'étendent sur 20 kilobases. La région codante correspond à 1179 paires de bases : la p53 humaine est donc composée de 393 acides aminés. Toutes les mutations sont concentrées entre les codons 120 et 309, affectant donc systématique¬ ment un des cinq domaines conservés au cours de l'évolution. Ces mutations, activant le pouvoir oncogène de la p53, se répartissent en quatre "hot spots" (points chauds) définis schématiquement par quatre régions : les régions A (codons 132-143), B (codons 174-179), C (codons 236-248), D (codons 272-281).REi PLA SHEET i This gene is made up of 11 exons that span 20 kilobases. The coding region corresponds to 1179 base pairs: human p53 is therefore composed of 393 amino acids. All the mutations are concentrated between codons 120 and 309, thus systematically affecting one of the five domains conserved during evolution. These mutations, activating the oncogenic power of p53, are divided into four "hot spots" defined schematically by four regions: regions A (codons 132-143), B (codons 174-179), C (codons 236-248), D (codons 272-281).
Au vu de ces données, il est clair que la technique la plus adaptée pour identifier rapidement une mutation à partir d'une biopsie ou d'un tissu sain est la technique de séquençage décrite précédemment.In view of these data, it is clear that the most suitable technique for rapidly identifying a mutation from a biopsy or from healthy tissue is the sequencing technique described above.
Pour ce faire, à partir d'un prélèvement biologique et par des méthodes qui sont connues, on isole la région codante pour la p53 humaine et l'on amplifie les quatre régions de points chauds définis précédemment en utilisant la méthode PCR et des amorces situées de part et d'autre des régions A,B,C et D.To do this, from a biological sample and by known methods, the coding region for human p53 is isolated and the four regions of hot spots defined above are amplified using the PCR method and primers located on either side of regions A, B, C and D.
Chacun des mélanges d'amplification obtenu est ensuite séquence avec des nucléotides non radioactifs déposés sur un gel de polyacrylamide dénaturant et soumis à une électrophorèse dans des conditions habituelles de séquençage.Each of the amplification mixtures obtained is then sequenced with non-radioactive nucleotides deposited on a denaturing polyacrylamide gel and subjected to electrophoresis under usual sequencing conditions.
Ensuite, le gel d'électrophorèse est électro-transféré sur une membrane en nylon.Then, the electrophoresis gel is electro-transferred onto a nylon membrane.
C'est cette membrane en nylon qui sera révélée pour lecture de la séquence.It is this nylon membrane that will be revealed for reading the sequence.
Cette membrane après séchage, est saturée pendant environ 30 minutes par immersion dans une solution propre à bloquer les sites non spécifiques de la membrane, c'est-à-dire les sites de la membrane qui ne sont pas déjà occupés par les acides nucléiques.This membrane, after drying, is saturated for approximately 30 minutes by immersion in a solution capable of blocking the non-specific sites of the membrane, that is to say the sites of the membrane which are not already occupied by the nucleic acids.
Cette solution de saturation est par exemple une solution de protéines de lait à 250 milligrammes de BSA par millilitre (sérum albumine bovine) à 25 milligrammes par millilitre, de Tween à 0,3 % dansThis saturation solution is for example a solution of milk proteins with 250 milligrams of BSA per milliliter (bovine serum albumin) at 25 milligrams per milliliter, of Tween at 0.3% in
FEUILLE DE REMPLACEMENT un tampon 50 mM Tris-HCl pH8, EDTA 1 mM, NaCl 25 m (tampon TEN). La membrane est ensuite mise en contact d'une solution de protamine couplée à des molécules de phosphatase alcaline par l'intermédiaire d'une liaison chimique.REPLACEMENT SHEET 50 mM Tris-HCl pH8 buffer, 1 mM EDTA, 25 m NaCl (TEN buffer). The membrane is then brought into contact with a protamine solution coupled to alkaline phosphatase molecules via a chemical bond.
Cette incubation s'effectue pendant environ 15 minutes à la température ambiante. La protamine-phosphatase alcaline est diluée dans la solution bloquante décrite précédemment. La membrane est ensuite lavée avec une solution de Brij à 0,3 %, 0,5 M NaCl (2 millilitres par centimètre carré).This incubation is carried out for approximately 15 minutes at room temperature. The alkaline protamine phosphatase is diluted in the blocking solution described above. The membrane is then washed with a 0.3% Brij solution, 0.5 M NaCl (2 milliliters per square centimeter).
Enfin, la détection est réalisée par l'utilisation d'un système colorimétrique. Le procédé colorimétrique, en lui-même connu, utilise la transformation du napthtoi-phosphate en naphtol par la phosphatase alcaline. Le naphtol peut alors se combiner à un certain composé, tel que celui connu sous la dénomination- Fast-Red, et ainsi transformer un substrat incolore et soluble en un produit coloré et insoluble qui précipite in situ. Il est possible d'utiliser d'autres systèmes colorimétriques comme celui utilisant le BCIP (5-bromo- -chloro-3-indoiyl-phosphate) et le NBT (nitro-bleu de tétrazolium).Finally, the detection is carried out by the use of a colorimetric system. The colorimetric process, itself known, uses the transformation of naphthoi-phosphate into naphthol by alkaline phosphatase. Naphthal can then combine with a certain compound, such as that known under the name Fast-Red, and thus transform a colorless and soluble substrate into a colored and insoluble product which precipitates in situ. It is possible to use other colorimetric systems such as the one using BCIP (5-bromo-chloro-3-indoiyl phosphate) and NBT (nitro-blue tetrazolium).
La lecture s'effectue de visu directement ou bien après "scannérisation" et analyse par ordinateur.Reading is carried out visually directly or after "scanning" and analysis by computer.
Cette lecture peut immédiatement donner pour chacun des points chauds de la p53 son identification par comparaison avec les mutations décrites.This reading can immediately give its identification for each of the p53 hotspots by comparison with the mutations described.
Le développement de la technique de séquençage froid, appliqué à la p53, permet d'affiner le diagnostic à un niveau moléculaire et même, dans certains cas, de pronostiquer le devenir des maladies cancéreuses et de procéder à l'étude et au dépistage de nombreuses maladies génétiques. De tels outils moléculaires devront orienter ou renforcer les résultats donnés par les anatomopathologistes en apportant, pour la première fois dans de tels diagnostics, une analyse génétique moléculaire particulièrement fine.The development of the cold sequencing technique, applied to p53, makes it possible to refine the diagnosis at a molecular level and even, in certain cases, to predict the outcome of cancerous diseases and to carry out the study and screening of numerous genetic diseases. Such molecular tools should orient or reinforce the results given by pathologists by providing, for the first time in such diagnoses, a particularly fine molecular genetic analysis.
FEUILLE DE REMPLACEMENT REPLACEMENT SHEET
Claims
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| EP0610615A1 (en) * | 1993-02-10 | 1994-08-17 | Promega Corporation | Non-radioactive DNA sequencing |
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| FR2606155A1 (en) * | 1986-11-05 | 1988-05-06 | Pasteur Institut | IMMUNOLOGICAL REAGENT FOR DETERMINING THE SEQUENCE OF A NUCLEIC ACID, PREPARATION METHOD THEREOF, AND IMMUNOLOGICAL METHOD FOR DETERMINING THE SEQUENCE OF A NUCLEIC ACID USING THE REAGENT |
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Family Cites Families (1)
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|---|---|---|---|---|
| JPH01231898A (en) * | 1988-03-11 | 1989-09-18 | Eiken Kagaku Kk | Measurement of nucleic acid sequence and solid carrier used for said measurement |
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1992
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- 1992-03-13 WO PCT/FR1992/000232 patent/WO1992016653A1/en not_active Ceased
Patent Citations (2)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0668928A1 (en) | 1995-08-30 |
| FR2673953B1 (en) | 1995-12-15 |
| FR2673953A1 (en) | 1992-09-18 |
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