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WO1992013950A2 - SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR DES REGIONS VARIABLES DE CHAINES β DES RECEPTEURS DES LYMPHOCYTES T HUMAINS, SEGMENTS PEPTIDIQUES CORRESPONDANTS ET LES APPLICATIONS DIAGNOSTIQUES ET THERAPEUTIQUES - Google Patents

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR DES REGIONS VARIABLES DE CHAINES β DES RECEPTEURS DES LYMPHOCYTES T HUMAINS, SEGMENTS PEPTIDIQUES CORRESPONDANTS ET LES APPLICATIONS DIAGNOSTIQUES ET THERAPEUTIQUES Download PDF

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WO1992013950A2
WO1992013950A2 PCT/FR1992/000130 FR9200130W WO9213950A2 WO 1992013950 A2 WO1992013950 A2 WO 1992013950A2 FR 9200130 W FR9200130 W FR 9200130W WO 9213950 A2 WO9213950 A2 WO 9213950A2
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seq
leu
ser
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Thierry Hercend
Frédéric Triebel
Sergio Roman-Roman
Laurent Ferradini
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Sanofi Aventis France
Original Assignee
Roussel Uclaf SA
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Priority claimed from FR9104523A external-priority patent/FR2675155A1/fr
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Priority to AU15445/92A priority patent/AU660306B2/en
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • nucleotides By the expression “and the sequences which differ from it by one or more nucleotides”, we include alleles which have up to 8 nucleotides of difference, but most often 1 or 2 nucleotides of difference, or which can differ by deletion or the addition of one or two codons.
  • the subject of the present invention is also the peptides encoded by nucleotide sequences according to the invention as well as the alleles and the derivatives thereof which have the same function.
  • V ⁇ sequences of the invention appear in the list of sequences under SEQ ID N "2 to 19.
  • SEQ ID N 3 to 5 correspond to 3 new sub-families while the SEQ ID No. 2 and 6 to 19 correspond to
  • the present invention also aims to provide specific oligonucleotides of the different V ⁇ subfamilies, which can be used as primers for the amplification of DNA. corresponding to these different V ⁇ subfamilies, with a view for example to a study of the expression of certain V ⁇ subfamilies in a patient and finally to a diagnosis of immune disorders, as indicated above.
  • the polymerization agent is a DNA polymerase, in particular Taq polymerase.
  • the amplification cycle is repeated 25 to 4 times.
  • the anti-T receptor specificity of the monoclonal antibodies was analyzed according to the following criteria:
  • the PBLs recognized respectively by the RO-73 and JU-74 monoclonal antibodies were purified from a normal donor using a positive selection process using magnetic beads (Dynabeads, Dynal). Briefly, 1 to 4 ⁇ 10 9 PBLs were labeled with one or other of the above purified monoclonal antibodies and incubated with the ready-to-use Dynabeads M-450 beads covered with goat serum anti-mouse IgG, in the proportion of 3 beads for a labeled cell. The positive cells were then separated using a magnet.
  • TITLE OF THE INVENTION Nucleotide sequences coding for variable regions of the ⁇ chains of human T lymphocyte receptors, corresponding peptide segments and diagnostic and therapeutic applications.
  • GAG AAA CTC TCT ATA AAT GAA AGT GTG CCA AGT CGC TTC TCA CCT GAA 287 Glu Lys Leu Ser Ile Asn Glu Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Pro Glu

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Abstract

La présente invention concerne de nouvelles séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes β des récepteurs des lymphocytes T humains, les segments peptidiques correspondants et les applications diagnostiques et thérapeutiques.

Description

Sécfuences nucléotidicrues codant pour des régions variables de chaînes β des récepteurs des lymphocytes T humains . seσments peptidiσues correspondants et les applications diagnostiques et thérapeutiques.
La présente invention concerne de nouvelles séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes β des récepteurs des cellules T, les segments peptidiques correspondants et les applications diagnostiques et thérapeutiques.
Il est connu que les récepteurs reconnaissant les antigènes à la surface des lymphocytes T matures (désignés ci-après récepteurs des cellules T) possèdent une structure ayant une certaine analogie avec celles des immunoglobulines. Ainsi, ils comprennent des structures hétérodimériques comportant des chaînes glycoprotéiques _ et β ou des chaînes glycoprotéiques γ et S (voir Meuer et al. (1), Moingeon et al. (2), Brenner et al. (3), Bank et al. (4)).
Le répertoire des récepteurs des cellules T doit pouvoir faire face à l'immense diversité des déterminants antigéniques. Ceci est obtenu par recombinaison génétique des différents segments discontinus des gènes qui codent pour les différentes régions structurales des récepteurs des cellules T. Ainsi, les gènes comprennent des segments V (segments variables), éventuellement des segments D (segments de diversité), des segments J (segments de jonction) et des segments C (segments constants). Pendant la différenciation des cellules T, des gènes spécifiques sont créés par recombinaison des segments V, D et J pour les locus β et δ et des segments V et J pour les locus α et β . Ces combinaisons spécifiques ainsi que l'appariement des deux chaînes créent la diversité combinatoire. Cette diversité est fortement amplifiée par deux mécanismes supplémentaires, à savoir la réunion imprécise des segments V-D-J ou V-J et l'addition de nucléotides correspondant à la région N (Davis et al. (5)).
On connaît déjà un certain nombre de segments géniques V. Ces segments ont été groupés en sous-familles en fonction de la similarité des séquences. Par définition, les segments qui présentent plus de 75 % de similarité dans la séquence nucléo- tidique ont été considérés comme des membres de la même sous famille (Crews et al. 6)). Actuellement, on connaît environ 60 segments géniques Vβ distincts (Wilson et al. (7), Robinson (8), Leider et al. (9), Reynolds (10), Li et al. (11)) qui ont été classés en 20 sous-familles dont 7 avec un seul membre (voir Wilson et al. déjà cité).
On a par ailleurs décrit récemment dans WO 90/06758 des anticorps monoclonaux dirigés contre des segments spécifiques des parties variables des récepteurs des cellules T, notamment des chaînes β et. S . Ces anticorps monoclonaux sont utiles non seulement comme outils de diagnostic mais également comme outils thérapeutiques, par exemple vis-à-vis de l'arthrite rhumatoïde.
On a également décrit l'utilisation de peptides synthéti- ques correspondant à des régions variables des chaînes α ou β dans le traitement des maladies auto-immunes (27 et 28).
Il est par ailleurs connu qu'il existe des variations d'un individu à un autre dans l'expression des différents segments variables du récepteur T chez l'homme (27 et 28).
La présente invention vise à enrichir le répertoire des segments géniques codant pour des régions variables des chaînes β des récepteurs des cellules T en fournissant de nouveaux segments géniques Vβ appartenant à des nouvelles sous familles ou appartenant à des sous-familles dont on connaît déjà au moins un membre.
La présente invention a ainsi pour objet des séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes β des récepteurs des lymphocytes T humains, correspondant à des ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vβ correspondant à l'une des séquences SEQ ID Nº 2 à 19, et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides.
La présente invention a plus particulièrement pour objet des séquences codant pour des régions variables des chaînes β des récepteurs des lymphocytes T humains, correspondant à des ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vβ correspondant à l'une des séquences SEQ ID Nº 2 à 5, et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides.
Par l'expression "et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides", on englobe les allèles qui présentent jusqu'à 8 nucléotides de différence, mais le plus souvent 1 ou 2 nucléotides de différence, ou qui peuvent différer par la délétion ou l'addition d'un ou deux codons.
La présente invention a également plus particulièrement pour objet :
- des séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes β des récepteurs des lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vβ correspondant à l'une des séquences
SEQ ID Nº 2 à 5, et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides,
- des séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes β des récepteurs des lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à l'une des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vβ correspondant à l'une des séquences SEQ ID Nº 6 à 15, les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides et les fragments de celles-ci, notamment les fragments des séquences qui correspondent à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vβ correspondant à l'une des séquences
1 à 155 de SEQ ID N° 8
1 à 125 de SEQ ID N° 9
l à 111 de SEQ ID N° 10,
et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides,
- des séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes β des récepteurs des lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vβ correspondant à l'une des séquences
1 à 195 de SEQ ID N° 16
1 à 99 de SEQ ID N° 17 1 à 113 de SEQ ID Nº 18
1 à 186 de SEQ ID Nº 19,
et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.
Par l'expression "séquences nucléotidiques correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques", on désigne aussi bien les séquences complètes que des fragments de ces séquences, y compris des fragments courts qui trouvent des applications en tant que sondes (géné- ralement comportant au moins 10 nucléotides) ou en tant qu'amorce (comportant généralement au moins 15 nucléotides). La présente invention englobe d'une manière générale l'ensemble des nouveaux oligonucléotides qui sont des fragments des séquences Vβ selon l'invention.
Quant aux séquences qui diffèrent par un ou deux nucléo- tides, elles correspondent à des variations que l'on a observé expérimentalement lors de la détermination de la séquence nucléotidique de plusieurs ADNc.
La présente invention a également pour objet les peptides codés par des séquences nucléotidiques selon l'invention ainsi que les allèles et les dérivés de ceux-ci qui possèdent la même fonction.
D'une manière générale, la présente invention englobe les peptides constitués par ou comprenant une séquence peptidique codée par les séquences nucléotidiques selon l'invention ainsi que les fragments de ces peptides. Elle englobe également les peptides qui diffèrent de ceux-ci d'un ou plusieurs
aminoacides et qui possèdent la même fonction. Ces peptides peuvent correspondre à des modifications telles que celles connues avec les mutéines ou à des variations allèliques. Il a en effet été montré en particulier que certains segments géniques codant pour des régions variables de chaînes du récepteur T chez l'homme étaient soumis à un phénomène de polymorphisme génétique appelé variation allèlique (29). La présente invention englobe les peptides provenant de ce
phénomène.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont été obtenues selon les étapes suivantes :
- isolement des ARN de lymphocytes périphériques d'un individu ;
- obtention de l'ADN complémentaire à l'aide de reverse transcriptase et d'une amorce A spécifique de la région Cβ (SEQ ID Nº 20) ;
- amplification génique (par Anchored Polymérase Chain Reaction ou A-PCR) à l'aide d'une ADN polymérase, d'une amor poly C (SEQ ID Nº 21) et d'une amorce B spécifique de la région Cβ (SEQ ID Nº 22) ;
- nouvelle amplification par A-PCR à l'aide de ADN poly mérase et d'une amorce C spécifique de la région Cβ (SEQ ID Nº
23) ;
- insertion dans un vecteur plasmidique ;
- transformation d'un hôte bactérien avec le vecteur recombinant ;
- criblage des colonies bactériennes recombinantes avec un oligonucléotide D spécifique de Cβ (SEQ ID Nβ 24) marqué ;
- extraction des plasmides des colonies positives,
- et séquençage des fragments d'ADN contenant la région Cβ .
La présente invention peut être reproduite notamment par amplification génique bispécifique (polymérase chain reaction ou PCR) en partant de lymphocytes périphériques exprimant les ARNm incluant les segments β variables ou jonctionnels correspondant aux séquences ID Nº 2 à 19 de l'invention ou alternativement en appliquant cette technique de PCR à de l'ADN génomique de toute cellule somatique d'un individu pris au hasard. L'invention peut aussi bien être reproduite en préparant les séquences géniques ci-dessus par synthèse chimique d'oligonucléotides.
Les peptides selon l'invention peuvent être obtenus par synthèse peptidique classique. Ils peuvent être également obtenus par application des techniques connues de génie génétique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour un peptide selon l'invention dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide et la transformation de cellules avec ce vecteur d'expression.
La présente invention a donc également pour objet des plasmides et des vecteurs d'expression comprenant une séquence d'ADN codant pour un peptide selon l'invention ainsi que hôtes transformés avec ce vecteur.
La présente invention a également pour objet des anticorps et notamment des anticorps monoclonaux, dirigés contre un déterminant antigénique appartenant à ou comprenant un peptide selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par toute les techniques qui permettent la production de molécules d'anticorps à partir de culture de lignée cellulaire. Ces techniques comprennent les différentes techniques utilisant des hybridomes.
La production d'anticorps peut être obtenue chez l'animal par immunisation des animaux par injection des peptides ou des fragments selon l'invention, qu'ils soient naturels, recombinants ou synthétiques, éventuellement après couplage à un agent immunogène tel que l'anatoxine tétanique, ou encore par injection de lymphocytes T humains exprimant les séquences correspondantes à leur surface, y compris des cellules recombinantes transfectées avec les séquences codantes correspondantes.
La présente invention a également pour objet des hybridomes produisant des anticorps monoclonaux dirigés contre les polypeptides selon l'invention.
La présente invention englobe également les fragments et les dérivés d'anticorps monoclonaux selon l'invention qui sont réactifs avec des régions variables définies des récepteurs des cellules T. Ces fragments sont notamment les fragments F(ab')2 qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la pepsine, les fragments Fab' qui peuvent être obtenus par réduction des ponts disulfure des fragments F(ab')2 et les fragments Fab qui peuvent être obtenus par clivage enzymatique des molécules d'anticorps avec la papaïne en présence d'un agent réducteur. Les fragments peuvent être également obtenus par génie génétique.
Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont par
exemple des anticorps ou des fragments de ces anticorps
auxquels sont liés des marqueurs tel qu'un radioisotope. Les dérivés d'anticorps monoclonaux sont également des anticorps ou des fragments de ces anticorps auxquels sont liées des molécules thérapeutiquement actives, notamment des composés cytotoxiques.
Les produits de l'invention trouvent plusieurs types d'application dans le domaine du diagnostic et dans le domain de la thérapeutique.
1 - Les applications dans le domaine du diagnostic
Les oligonucléotides contenus dans les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisés pour constituer des sondes de détection (généralement au moins 10 nucléo- tides) capables de s'hybrider à une région variable d'une chaîne β ou des amorces pour l'amplification d'ADN (comportant généralement au moins 15 nucléotides et de préférence au moins 17 nucléotides) capables de se lier à une séquence à amplifier.
Les oligonucléotides trouvent ainsi une application dans le diagnostic des désordres immunitaires en détectant la présence de séquences d'acides nucléiques homologues d'un gène codant pour des régions variables de chaînes β des récepteurs des cellules T dans l'ARNm d'un échantillon d'un patient.
Différentes méthodes peuvent être utilisées pour établir un lien entre l'expression des gènes des cellules T et une maladie. Ces méthodes comprennent :
a - la production et l'analyse de banques d'expressions d'ADNc obtenu à partir de cellules T liées à la maladie pour déterminer la fréquence de gènes dominants ;
b - l'analyse d'échantillons d'ADN génomique par Southern blot pour déterminer s'il existe des polymorphismes génétiques ou des réarrangements des gènes codant pour les récepteurs des cellules T ;
c - l'analyse d'échantillons par obtention d'ADNc, amplification par PCR et hybridation avec des sondes marquées ;
d - l'hybridation in situ de cellules T sans culture préalable des cellules T.
Les amorces trouvent une application dans des réactions de PCR dans une méthode telle que celle définie sous c.
Les anticorps monoclonaux, les fragments ou les dérivés de ces anticorps selon l'invention peuvent être utilisés pour étudier des réponses immunitaires de type T, par exemple dans le domaine des maladies auto-immunes de la cancérologie, de l'allergie, de la transplantation et des maladies infectieuses. En particulier, le répertoire des différents segments variables β du récepteur T peut être étudié, qu'il s'agisse de cellules T du sang ou des tissus. D'une manière générale, les techniques utilisées peuvent être des méthodes in vitro ou in vivo.
Dans les méthodes in vitro, les échantillons utilisés peuvent être des échantillons de fluides corporels ou des échantillons de tissus. Les techniques utilisées peuvent inclure notamment la cytofluorimétrie de flux pour analyser les lymphocytes T du sang ou des marquages par immunopéroxydase sur coupe anatomopatho-logique pour étudier les lymphocytes infiltrant les tissus.
Dans les méthodes in vivo, les anticorps, leurs fragments ou leurs dérivés sont administrés par les voies habituelles, par exemple par la voie intraveineuse, et l'on détecte les liaisons immunospécifiques. Ceci peut être obtenu par exemple dans le cas où l'on utilise un anticorps marqué par un radioisotope.
2 - Les applications dans le domaine thérapeutique
Les oligonucléotides contenus dans les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisés en thérapeutique comme oligonucléotides antisens. On sait en effet qu'il est possible in vitro d'inhiber l'expression d'un gène transcrit dans des lymphocytes humains en incubant ces lymphocytes avec un olignoculéotide antisens spécifique du gène en question (30). Ces oligonucléotides antisens comprennent généralement au moins 10 et de préférence au moins 16 nucléotides. Ces oligonucléotides antisens peuvent être notamment les séquences inversées et complémentées correspondant aux 20 nucléotides en amont du site d'inititation de la traduction (ATG). L'intérêt d'une utilisation in vitro d'oligonucléotides antisens spécifique d'un segment génique Vβ est d'abolir (ou de diminuer fortement) l'expression d'un récepteur T comprenant ce segment Vβ et donc d'obtenir un phénomène de délétion clonale au niveau de la réactivité spécifique des lymphocytes T. Les oligonucléotides antisens peuvent non seulement être utilisés in vitro sur des lymphocytes T humains qui sont ensuite réinjectés, mais également in vivo par injection locale ou systémique de préférence après modification pour augmenter la stabilité in vivo et la pénétration à l'intérieur des lymphocytes de ces oligonucléotides.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être utilisés pour moduler le système immunitaire. C'est ainsi que les anticorps peuvent être administrés pour bloquer l'interaction des cellules T effectrices avec leur antigène spécifique. On peut également administrer des anticorps anti-récepteurs T liés par exemple à une molécule cytotoxique ou à un radioisotope de façon à obtenir une délétion clonale, grâce à la fixation spécifique sur une chaîne β d'un récepteur de cellule T. Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être utilisés en thérapeutique à des concentrations faiblement mitogéniques de façon à activer de façon spécifique certains sous-ensembles de cellules T ou peuvent être utilisés à des concentrations beaucoup plus élevées pour se fixer aux récepteurs concernés et ainsi marquer ces sous-ensembles en vue de leur élimination par le système réticulo-endothélial. Un critère important pour le traitement d'une maladie est l'aptitude à moduler des sous-ensembles de cellules T liées à une maladie. La nature exacte de cette modulation thérapeutique, savoir bloquer ou supprimer un sous-ensemble particulier de cellules T ou au contraire stimuler et activer un
sous-ensemble particulier, dépendra de la maladie en question et du sous-ensemble spécifique de cellules T concerné.
Ce type de traitement présente un avantage par rapport aux traitements actuels utilisant des anticorps tels que le traitement par des anticorps anti CD3 chez des patients ayant subi une transplantation rénale et ayant un problème de rejet étant donné que grâce à l'invention il n'y aura pas de modulation de la totalité de la population des cellules T mais seulement du sous-ensemble de cellules T exprimant la sous-famille β particulière de récepteurs de cellules T.
Par ailleurs, la réponse des cellules T étant souvent oligoclonale, il convient généralement d'utiliser en thérapeu- tique des "cocktails" de plusieurs anticorps.
On peut en outre utiliser les anticorps anti Vβ pour sélectionner in vitro des lymphocytes T, par exemple par passage sur une colonne contenant des billes portant l'anticorps. Cette séparation de certains lymphocytes T peut être utilisée en vue d'une mise en culture de ces lymphocytes avant de les réinjecter au patient.
En outre, on peut utiliser en thérapeutique tout ou partie des séquences peptidiques selon l'invention,
c'est-à-dire les séquences peptidiques codées par les
séquences nucléotidiques selon l'invention ou les fragments de ces séquences (comprenant généralement au moins 8 à 10 amino- acides). Ces séquences ou fragments administrés à l'homme ou à l'animal, peuvent agir en tant que leurre, c'est-à-dire qu'ils vont se fixer sur l'épitope porté par l'antigène néfaste et empêcher la réaction des cellules T normales avec l'antigène, en empêchant ainsi le développement d'une maladie agressive contre les déterminants du soi. Ils peuvent aussi être utilisés en tant qu'immunogènes dans la fabrication de vaccins (éventuellement après couplage à des porteurs protéiques).
On décrira ci-après plus en détail la présente invention, en se reportant aux Fig. annexées sur lesquelles :
- les Fig. 1 à 6 donnent en alignement à la fois des séquences Vβ connues et des séquences partielles des nouvelles séquences selon l'invention (SEQ ID Nº 6 à 19), notées IGRa 08 à IGRa 20 appartenent à des sous-familles Vβ connues. Sur ces Figures, la numérotation des nucléotides commence au codon ATG d'initiation (qui est souligné). Les points indiquent les nucléotides identiques. Les séquences qui sont supposées être des séquences leader sont surlignées.
- La Fig. 7 donne les analyses par Southern blot de l'ADN génomique traité par une enzyme de restriction en utilisant des sondes spécifiques des sous-familles Vβ . Les enzymes de restriction utilisées sont EcoR I (colonne R), Hind III
(colonne H) et BamH I (colonne B). Sur cette Figure, les triangles marquent les positions des fragments d'ADN
s'hybridant de façon spécifique avec Cβ .
- La Fig. 8 représente la détection par autoradiographie des transcrits amplifiés des chaînes β du TCR exprimé par les lymphocytes périphériques d'un individu sain, et du contrôle β-actine co-amplifié.
- La Fig. 9 représente l'analyse par cytofluorimétrie de la réactivité de l'anticorps monoclonal RO-73 respectivement vis-à-vis du clone immunisant 3025 (9A), du clone 12410 (9B) et des lymphocytes circulants (9C).
La réactivité-témoin des anticorps NKTa ou OKT3 est donnée respectivement pour chaque type de cellule.
Le nombre de cellules comptées (échelle linéaire) est donné en fonction de l'intensité de la fluorescence (échelle logarithmique).
- La Fig. 10 représente l'analyse par cytofluorimétrie de la réactivité de l'anticorps monoclonal JU-74 (Fig. 10A, 10B, 10C : mêmes conditions que pour les Fig. 9A, 9B, 9C).
- La Fig. 11 représente l'analyse par cytofluorimétrie de la comodulation avec la molécule CD3 de la structure TCR du clone 3025 reconnue par l'anticorps monoclonal R0-73 respectivement en absence (Fig. 11A) ou en présence d'anticorps anti-CD3 (Fig. 11B).
La comodulation-témoin est donnée respectivement avec le anticorps monoclonaux NKTa, OKT3 et anti-CD2.
- La Fig. 12 représente l'analyse par cytofluo-rimétrie de la comodulation avec la molécule CD3 de la structure TCR du clone 3025 reconnue par l'anticorps monoclonal JU-73, respectivement en absence (Fig. 12A) ou en présence d'anticorps anti-CD3 (Fig. 12B).
- La Fig. 13 représente la détection par autoradiographie des transcrits amplifiés des chaînes a (Fig. 13A) et des chaînes β (Fig. 13B) du TCR exprimé par les cellules RO-73+. I - Obtention de l'ADNc et amplification par PCR
On a utilisé comme source d'ARN des lymphocytes périphériques d'un individu. L'ARN total a été préparé selon la méthode à l'isothiocyanate de guanidinium et au chlorure de césium (Chirgwin (12)) ou selon la méthode en une seule étape par extraction avec de l'isothiocyanate de guanidinium, du phénol et du chloroforme (Chomczynski (13)).
Le premier brin d'ADNc a été synthétisé dans un volume final de 50 microlitres à une température de 42º C pendant 1 heure en utilisant 5 microgrammes d'ARN total, la reverse transcriptase et une amorce A spécifique de la région Cβ constituée par la séquence 5'-TATCTGGAGTCA TTGAGGGCGGGC (SEQ ID Nº 20). Ce matériau a été ensuite purifié par extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l'acétate d'ammonium. Après sélection d'une fraction 0,45/1 kb sur gel d'agarose, on a réalisé l'addition d'une extrémité dG sur l'hétéro duplex ARN/ADNc dans un tampon d'addition COCl2 avec 14 unités de terminal désoxynucléotidyl transferase (Tdt) pendant 30 mn à 37° C. La réaction a été stoppée par maintien à 70º C pendant 10 mn. NaOH 1N (1/3 de volume) a été ajouté et l'échantillon a été mis à incuber à 50° C pendant 1 heure pour hydrolyser l'ARN puis a été neutralisé avec du Tris HCl 2M pH 8 et HCl 1N. Après extraction par un mélange phénol/ chloroforme le premier brin d'ADNc à extrémité G a été précipité avec de l'éthanol et soumis à une amplification en utilisant la technique PCR (Polymérase Chain Reaction décrite par Saiki et al. (14)) dans un volume final de 100 microlitres contenant 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-Ci pH 8.3, 1,5 mM de MgCl2, 0,1 %
(poids/ volume) de gélatine, 200 micromoles de dNTP, 2,5 unités de Taq polymérase et 100 picomoles de deux amorces. Les deux amorces utilisées sont, d'une part, une amorce poly-C (5'-GCATGCGCGCGGCC GCGGAGG-14C) (SEQ ID Nº 21) décrite par Loh et al. (15) ainsi qu'une amorce B spécifique de la région Cβ (5'-TGTGGCCAGGCATGCCAGTGTGGCC) (SEQ ID Nº 22).
On effectue 25 cycles d'amplification suivis par une période de 15 mn d'élongation finale à 72º C. Chaque cycle comprend une étape de dénaturâtion à 92° C pendant 1 minute, une étape d'hybridation à 55° C pendant 2 mn et une période d'élongation à 72° C pendant 4 mn. Les produits amplifiés sont ensuite précipités par de l'éthanol, remis en suspension dans de l'acétate de sodium 30 mM pH5, NaCl 50 mM, ZnCl2 1 mM, glycérol 5 % en volume, et 1/10 de ce matériau est purifié en fonction de la taille sur un gel d'agarose à bas point de fusion 1 %.
Une seconde phase d'amplification est ensuite réalisée directement sur approximativement 10 % de la bande contenant l'agarose en suivant les mêmes conditions que précédemment, sauf qu'on utilise comme amorce C spécifique de la région Cβ l'amorce 5'-GGTGTGGGAGAA TTCTGCTTCTGA (SEQ ID Nº 23). Le mélange de réaction est ensuite précipité par l'éthanol et remis en suspension dans 60 μl HUO.
II - Clonage et séguençage des ADNc
1/3 du produit de la seconde amplification est mis à digérer avec Sac II, séparé sur gel d'agarose 1 % et purifié par adsorption sur des billes de verre. Le matériau est inséré dans le vecteur Bluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, U.S.A.) et les recombinants obtenus sont utilisés pour transformer des souches XLl-bleu de E. Coli (Stratagene). Après dépôt en présence de X-gal et IPTG, on fait un test sur les colonies blanches en utilisant une technique "dot blot" et comme sonde un troisième oligonucléotide spécifique de la région Cβ
(5'-TCTGCTTCT GATGGCTCAA) (SEQ ID N° 24) marqué au 32 P. On extrait l'ADN plasmidique des colonies positives et on
séquence sur les deux brins par le procédé par terminaison de chaîne didésoxy (Sanger et al. (16)) avec de la Sequenase 2,0 (United States Biochemicals, Cleveland, Etats-Unis) en suivant les recommandations du fournisseur.
Les séquences obtenues ont été comparées aux séquences publiées Vβ en utilisant la méthode développée par Lipman et Pearson (17). Les codons de départ présumés ont été identifiés en recherchant la présence de la séquence consensus Kozak pour les sites d'initiation des traductions dans les cellules eucaryotes (Kozak (18)). La présence de séquences leader hydrophobes du côté N-terminal a été décelée par analyse de l'hydrophobicité selon la méthode décrite par Kyte (19). III - Analyse par Southern blot
L'ADN a été extrait de la lignée cellulaire érythroleucé mique humaine K562 et mis à digérer avec l'une des enzymes de restriction suivantes : Eco RI, BamH I ou Hind III. L'ADN (15 microgrammes) a été soumis à une électrophorèse sur agarose 0,7 % et a été transféré sur des membranes de Nylon comme décrit par Triebel et al. (20). Les hybridations ont été réalisées à 65° C avec 6 × SSC, 0,5 % de SDS, 5 × Denhardt's et 100 microgrammes d'ADN de sperme de saumon dénaturé pendan 16 heures. Les membranes ont été lavées à 65° C avec 2 × SSC, 0,2 % de SDS.
On a utilisé comme sondes Vβ spécifiques des sondes obtenues par amplification d'ADNc V-J-C en utilisant comme amorce l'amorce poly-C et l'amorce C. Les sondes ont été purifiées sur gel d'agarose 1 %. Des sondes d'ADN marquées au 32P ont été préparées à partir des fragments purifiés sur agarose par la méthode de Feinberg (21). IV - Résultats
En utilisant la méthode A-PCR, 350 ADNc qui hybrident avec la sonde Cβ ont été clones, puis séquences. Parmi ceux-ci, 226 ADNc correspondent à des régions variables V-J-Cβ uniques.
Les séquences Vβ de L'invention figurent dans la liste des séquences sous les SEQ ID N" 2 à 19. Les séquences SEQ ID N" 3 à 5 correspondent à 3 sous familles nouvelles tandis que les séquences SEQ ID N° 2 et 6 à 19 correspondent à de
nouveaux membres de sous-familles Vβ connues ou à des extensions de segments Vβ connus.
Sous-famille Vβ w21 (SEQ ID Nº 2)
Cette sous-famille a été identifiée par le clone IGR b02 (SEQ ID N° 2).
Cette séquence présente pour la partie codante une homologie d'environ 85 % avec la séquence HSTCRB23 (Wilson et al. (41)). Sous-famille Vβ w22 (SEQ ID N' 3)
Le segment SEQ ID Nº 3 a été défini comme séquence consensus à partir de 23 clones distincts d'ADNc. On a observ en position 322 un C au lieu d'un T et en position 350 un A a lieu d'un G.
Sous-famille Vβ w23 (SEQ ID M' 4)
Le segment ID H' 4 a été défini comme séquence consensus à partir de 4 clones distincts. On a observé en position 154 un G au lieu d'un A et en position 160 un A au lieu d'un G. I présente une homologie de 75,7 % avec la séquence VB12A1 (Leiden déjà cité) mais présente une homologie inférieure à 75 % avec les autres membres de la sous-famille Vβ 5 (représentés sur la Fig. 1). Il ne fait donc pas partie de la sous- famille Vβ 5.
Sous-famille Vβ W24 (SEQ ID Nº 5)
Le segment SEQ ID Nº 5 a été défini à partir de 2 clones distincts d'ADNc.
Les analyses par Southern blot d'ADN de lignée germinale soumis à une digestion par les endonucléases, en utilisant des sondes V-J-Cβ comprenant des fragments Vβ correspondant aux sous-familles Vβ w21 à Vβ w24 ont été réalisées dans des conditions d'hybridation de "faible stringence" pour identifier le nombre de segments géniques Vβ appartenant à chaque famille et pour caractériser des fragments de restriction d'ADN portant ces segments géniques Vβ . Des résultats représentatifs sont reportés sur la Figure 7.
Ces analyses sont compatibles avec la présence dans les cellules érythroleucémiques K 562 d'au moins trois segments géniques pour la sous-famille V w21, deux pour la
sous-famille Vβ w23 et un pour les sous-familles Vβ w22 et Vβ W24.
Les tailles des fragments de restriction de l'ADN germinal sont les suivantes :
Vβ W21 : ECOR I 1,7-, 3- et 6,5 kb, Hind III 2,5-, 7,2-, 11,7-, 14- et 18 kb, BamH I 5,5-, 16,5- et 23 kb; Vβ W22 ; EcoR I 2,8 kb, Hind III 8,8 kb, BamH I 5,3 kb;
Vβ W23 : EcoR I 3,2- et 4,4 kb, Hind III 7,4-, 15,5- et 16,5 kb, BamH I 2,5- et 5,7 kb ;
Vβ w24 : EcoR I 8 kb, Hind III 20 kb et 7,3 kb, BamH I 11,- et 22 kb.
Sous-famille Vβ 5 (Fig. 1) :
SEQ ID N° 6 et 7 (IGR b06 et IGR b07)
Ces séquences présentent une homologie respectivement de 79 à 86 I et de 76 à 70 1 avec les 4 segments précédemment connus VB12A1 (Leiden déjà cité), HBP51 (Kimura (23)), PH24 (Tillinghast déjà cité) et PL25 (Concannon (24)) et représentent de nouveaux membres.
SEQ ID N° 8 et 9 (IGR b08 et IGR b09)
Ces séquences correspondent à des extensions du côté 5º des clones VB12A1 et PL25 respectivement. Pour SEQ ID Nº 8 deux substitutions de nucléotides sont observées par rapport à VB12A1.
Sous-famille Vβ 6 (Fig. 2) :
SEQ ID N° 10 (IGR b11)
Cette séquence correspond à une extension du côté 5' du clone HBP25 (Kimura, déjà cité).
SEQ ID N° 11 (IGR bl2)
Cette séquence qui représente un nouveau membre présente une homologie des nucléotides de 94 % avec PH 16 (Tillinghast, déjà cité), GPPA (Li, déjà cité) et HT45 (Kimura (25)).
Sous-famille Vβ 12 (Fig. 3) : SEQ ID N° 12 (IGR b13)
Cette séquence qui représente un nouveau membre correspond à plus de 85 % d'homologie avec les séquences PH27
(Tillinghast, déjà cité) et PL42 (Concannon, déjà cité). Sous-famille Vβ 13 (Fig. 4) :
SEQ ID N° 13, 14 et 15 (IGR bl4 , IGR bl5 et IGR b16) Les séquences SEQ ID N" 13 et 14 qui représentent de nouveaux membres présentent une homologie respectivement de 78 à 91 % et de 77 à 79 % avec les autres séquences connues
HBVP34 (Kimura (23)) et CEM (Duby (26)).
La séquence SEQ ID Nº 15 présente une homologie de 94 % avec HBVP34. Il est à noter que la séquence SEQ ID N° 15 présente un intron (représenté en caractères minuscules) dans la région leader. La séquence SEQ ID N° 15 est une séquence consensus. On a observé en position 231 un C au lieu d'un T et en position 259 un A au lieu d'un G.
Sous-famille Vβ 7 (Fig. 5) :
SEQ ID N° 16 et 17 (IGR b17 et IGR b18)
Ces séquences présentent une forte homologie avec la séquence PL4.19 tronquée (Concannon, déjà cité) et la prolongent du côté 5' jusqu'au signal de début de la traduction.
SEQ ID N° 18 (IGR b19)
Cette séquence prolonge la séquence PL4.9 (Concannon, déjà cité) du côté 5' jusqu'au signal de début de la
traduction.
Sous-famille Vβ 9 (Fig. 6) : SEQ ID Nº 19 (IGR b20)
Cette séquence prolonge la séquence PL2.6 (Concannon, déjà cité) du côté 5'. On observe une différence entre les deux séquences aux positions 98 et 100 correspondant à des aminoacides différents.
La présente invention vise également à fournir des oligonucléotides spécifiques des différentes sous-familles Vβ, qui sont utilisables comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à ces différentes sous-familles Vβ , en vue par exemple d'une étude de l'expression de certaines sous-familles Vβ chez un patient et finalement d'un diagnostic des désordres inmmunitaires, comme indiqué plus haut.
L'expression prédominante de certaines sous-familles de Vβ a déjà été étudiée à l'aide d'une gamme incomplète d'oligonucléotides.
Ainsi, Sottini et al. (33) ont mis en évidence à l'aide d'une gamme d*oligonucléotides une expression prédominante de certains Vβ chez des patients atteints d'arthrite rhumatoïde.
De même, Choi Y. et al (32) ont mis en évidence à l'aide d'une gamme d'oligonucléotides la stimulation de lymphocytes T par des toxines de Staphylococcus aureus par l' intermédiaire de Vβ spécifiques.
La présente invention vise à fournir une gamme complète d*oligonucléotides permettant l'étude à la fois des
sous-familles Vβ connues et des nouvelles sous- familles Vβ de l'invention et qui soient tout-à-fait spécifiques de chaque sous-famille. Les oligonucléotides ont donc été choisis et synthétisés dans ce but et au besoin des modifications de un ou deux nucléotides ont été introduites par rapport aux
séquences naturelles pour réduire les réactivités croisées entre sous-familles.
La présente invention a ainsi également pour objet des oligonucléotides, utilisables comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à des régions variables de chaînes β des récepteurs de cellules T, choisis parmi les séquences SEQ ID N° 25 à 48.
La présente invention a également pour objet l'utilisa- tion, comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à des régions variables de chaînes des récepteurs des cellules T, d'oligonucléotides choisis parmi les séquences SEQ ID N° 25 à 48.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection de séquences nucléotidiques codant pour des segments Vβ des récepteurs T ou d'ADNc correspondant aux produits de transcription de celles-ci, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : a) l'amplification de l'ADN avec au moins une paire d'amorces formée par l'un des oligonucléotides définis ci-dessus et un oligonucléotide appartenant au segment Cβ , et
b) la détection des séquences amplifiées avec une sonde Cβ .
L'oligonucléotide appartenant un segment Cβ utilisé pour l'amplification peut être notamment choisi parmi les séquences SEQ ID N° 49 et 50.
Pour contrôler l'efficacité de l'amplification, on opère avantageusement en présence d'une paire d'amorces contrôle et on détecte la séquence contrôle correspondante amplifiée à l'aide d'une sonde contrôle correspondante.
Cette paire d'amorces contrôle peut correspondre à deux segments Cα, par exemple les amorces CαE et CαJ correspondant aux séquences SEQ ID N° 55 et 56. On utilise alors une sonde de détection Cα (correspondant par exemple à la séquence SEQ ID Nº 57). Mais cette paire d'amorces est avantageusement constituée par deux amorces appartenant à la β-actine, notamment celles correspondant aux séquences SEQ ID N° 52 et 53. O utilise alors une sonde de détection correspondant à une séquence de la 0-actine, telle la séquence SEQ ID N° 54.
La présente invention a également pour objet un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé précédemment défini, qui comprend :
a) au moins un oligonucléotide choisi parmi les séquences SEQ ID N° 25 à 48,
b) une amorce Cβ,
c) une sonde Cβ .
Un tel kit contient avantageusement en outre :
d) une paire d'amorces contrôle,
e) une sonde contrôle.
Ce kit peut notamment comprendre :
a) l'ensemble des 24 oligonucléotides correspondant aux séquences SEQ ID N° 25 à 48,
b) une amorce Cβ choisie parmi les séquences correspondant au séquences SEQ ID 49 et 50,
c) une paire d'amorces contrôle pour la /3-actine ayant une séquence correspondant respectivement aux séquences SEQ ID N° 52 et 53, d) une sonde Cβ correspondant à la séquence SEQ ID Nº 51, e) une sonde contrôle pour la β-actine correspondant à la séquence SEQ ID N° 54.
Dans l'information donnée dans la liste des séquences pour les séquences 25 à 54, les séquences SEQ ID N° 25 à 45 correspondent à des séquences appartenant à des clones des sous-familles connues Vβ 1 à Vβ 20 (accessibles dans la base de données EMBL) ou à des séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides. Les séquences SEQ ID Nº 45, 46, 47 et 48 correspondent à des séquences appartenant à des clones de nouvelles sous-familles de l'invention, correspondent à des sous-familles dénommées provisoirement Vβ w21, Vβ w22, Vβ w23 et Vβ w24 (w indiquant que la désignation est dans l'attente d'une désignation définitive).
Les séquences SEQ ID N° 49 et 50 sont deux exemples d'oligonucléotides Cβ qui peuvent être utilisés comme amorces pour l'amplification.
La séquence SEQ ID N° 51 est la séquence d'une sonde Cβ qui peut être utilisée pour la détection des ADN amplifiés.
Enfin, les séquences SEQ ID N° 52, 53 et 54 sont respectivement les séquences d'une paire d' oligonucléotides appartenant à la séquence de la 0-actine qui peuvent être utilisés pour le contrôle de l'amplification et la séquence d'une sonde pour détecter les ADN amplifiés correspondants.
Dans la liste des séquences la position indiquée est la position de l'extrémité 5' à compter du site d'initiation prédictif de la traduction ATG. Dans le cas où les séquences sont incomplètes (région 5' inconnue), la position (marquée avec un astérisque) est donnée par rapport au premier nucléotide de la séquence. Les nucléotides soulignés correspondent aux mésappariements introduits par rapport à la séquence naturelle.
Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un synthétiseur d'ADN automatisé Applied Biosystems 381 A en utilisant la méthode au β-cyanoéthylphosphoramidite (Sinha N. et al.
(34)) et en suivant le protocole recommandé par le fabricant. Les oligonucléotides ont été détritylés dans l'appareil, clivés du support et déprotégés par l'ammoniac (à 60° C pendant 5 heures). Les produits bruts ont été purifiés par chromatographie haute pression en phase inversée sur une colonne de μ-bondapak C18 en utilisant un gradient d'acétonitrile (9 à 15 %) dans un tampon acétate de triéthylammonium 0,01 M à pH 5,5.
L'amplification effectuée en utilisant les amorces selon l'invention peut être notamment la technique d'amplification par PCR (Polymérase Chain Reaction) telle que décrite par Saiki et al. (14) et brevets US-A-4 683 195, 4 683 202,
4 889 818.
Pour la PCR, on peut utiliser un ADN double brin que l'o dénature ou un ADNc obtenu à partir d'ARN à l'aide de réverse transcriptase comme mentionné plus haut.
L'agent de polymérisation est une ADN polymérase, notamment la Taq polymérase.
Généralement, le cycle d'amplification est répété 25 à 4 fois.
Les sondes que l'on utilise pour la détection des
séquences amplifiées peuvent être obtenues par marquage d' oligonucléotides avec un isotope radioactif, ce qui conduit à une détection par autoradiographie, ou par couplage avec un enzyme telle que la peroxydase (système ECL Amersham), la phosphatase alcaline ou la β-galactosidase (système Tropix Ozyme), ce qui conduit à une détection par chimioluminescence.
L'exemple suivant illustre la mise en oeuvre du procédé de détection selon l'invention.
Les lymphocytes périphériques d'un individu sain ont été préparés par centrifugation sur un gradient de densité. L'ARN total a été extrait selon la méthode en une seule étape par extraction avec de l'isothiocyanate de guanidium, du phénol e du chloroforme (Chomczynski, 13). L'ADN complémentaire a été synthétisé dans un volume final de 20 μl à 42° C durant 1 heure en utilisant 1 à 5 μg d'ARN total, la réverse transcrip tase et l'amorce Cβ B (1,25 M).
Le matériel obtenu a ensuite été chauffé à 95° C durant 3 minutes avant d'être soumis à une amplification selon la technique PCR en utilisant en parallèle chacune des amorces Vβ spécifiques correspondant aux séquences SEQ ID Nº 25 à 48 et l'amorce Cβ B spécifique de la région Cβ (SEQ ID N° 50). Cette amplification a été réalisée dans un volume final de 10 μl par tube contenant 50 mM de KCl, 10 mM de tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM de MgCl2 0,1 % (poids/ volume) de gélatine, 200 M de dNTP, 0,25 unités de Taq polymérase et 0,25 M de chaque amorce. Dans chaque tube, une amplification contrôle a été réalisée à partir de 25 mM d'un fragment d'ADN de β-actine de 877 paires de bases préparé par PCR et des amorces Act 1 et Act 2 (SEQ ID N° 52 et 53) spécifiques de l'actine. 30 cycles d'amplification ont été effectués suivis d'une étape d'élongation finale de 5 minutes à 72° C. Chaque cycle comprenait une étape de dénaturation à 94° C pendant 1 minute, une étape d'hybridation à 65° C pendant 1 minute et une période d'élongation à 72° C pendant 1 minute.
Les produits obtenus ont été séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2 %, transférés sur des membranes de nylon dans un tampon alcalin et hybrides simultanément avec les sondes oligonucléotides CβC (SEQ ID N° 51) et Act 3 (SEQ ID N° 54) marquées au 32P par l'enzyme polynucléotidyl T4 kinase. L'hybridation a été réalisée à 42° C pendant 16 heures dans un tampon contenant 6 × SSC, 0,5 % SDS, 5 × Denhart's, 0,05 % PO4H2Na et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon
dénaturé. Les membranes ont ensuite été lavées avec du 6 × SSC, 20mM PO4H2Na, deux fois à température ambiante pendant 5 minutes et une fois à 50° C pendant 30 minutes puis autoradiographiées.
Les résultats obtenus sont indiqués sur la figure 8.
Le contrôle d'actine (bande de 877 paires de bases) permet de vérifier l'amplification dans tous les puits. Il apparaît en-dessous de cette bande un signal spécifique dont la taille correspond à la taille des fragments amplifiés corespondants, chaque fragment ayant une longueur correspondant à la distance entre l'emplacement de l'oligonucléotide spécifique Vβ et l'amorce Cβ .
Chez l'individu testé, la Figure 8 met en
évidence l'expression préférentielle de certains segments géniques définis par rapport à d'autres. Par exemple, les sous-familles Vβ 1 et 2 sont plus représentées que les autres sous-familles.
Exemple de préparation d'anticorps monoclonaux anti Vβ13 anticorps monoclonaux RO-73 et JU-74
1) Cellules immunisantes
Le clone T 3025 (Moebius et al. (35)) a été cultivé en milieu complet comprenant du DMEM (Seromed), 8 % de sérum humain AB, de l'IL-2 et du TCGF comme décrit par Hercend et al. (36). Des restimulations périodiques ont été effectuées sur cellules allogéniques en présence d'IL-2. Les ARN messagers codant pour le récepteur T exprimés par ces cellules on été séquences par la technique d'A-PCR et représentent des réarrangements des segments géniques VαlO (séquence HAP58, Yoshikai et al. (37)) et Vβ13 (séquence IGRb16=SEQ ID N° 15 indiquée ci-dessus).
2) Immunisation des souris
Des souris Biozzi de 6 semaines (Institut Curie, Paris, France) ont été immunisées avec les cellules T entières du clone 3025. Après une première injection intrapéritonéale de × 106 cellules en adjuvant complet de Freund, les souris ont reçu trois injections intrapérito-néales de 5 × 106 cellules en adjuvant incomplet de Freund à trois semaines d'intervalle Deux semaines après la dernière injection intrapéritonéale, les souris ont reçu 2 × 106 cellules viables en injection intraveineuse. Les souris ont été sacrifiées trois jours plus tard et la rate a été prélevée. 3) Fusion
La fusion des cellules spléniques avec le myélome non sécrétant NS-1 a été menée selon la méthode de Kohler et Milstein (38). Les cellules NS-1 (Kohler et Milstein (39)) on été cultivées en milieu comprenant du DMEM (Seromed), de la 8 azaguanine (Sigma, Saint Louis, MI), 10 % de sérum de cheval (Seromed, lot n° 5Z04), de la pénicilline et de la streptomycine (Eurobio), de la glutamine (Seromed, 200 mM) et du pyruvate de sodium (Gibco, 100 mM). Les spénocytes ont été fusionnés avec les cellules NS-1 par le polyéthylène-glycol (PEG 1000, Merck) avec un rapport de 4 cellules spleniques pour une cellule de myélome. Après l fusion, les cellules ont été cultivées à 3 × 106 cellules par ml en plaques de 96 puits (Nunc) dans un milieu de sélection HAT contenant du DMEM, 10 % de sérum de cheval, 10 % de sérum de veau foetal (Seromed, lot n° 219195), de l'aminoptérine (Gibco), de l'hypoxanthine et de la thymidine (Gibco), de la pénicilline et de la streptomycine, de la glutamine, du pyruvate de sodium et du NCTC 109 (Eurobio). Du milieu frais a ét ajouté dans les puits 2 jours (50 μl par puits) et 9 jours après la fusion (100 μl par puits). La culture a été réalisée à 37° C, dans un incubateur contenant 10 % de CO2. 4) Criblage des hybridomes
Le surnageant des hybridomes obtenus a été récolté 15 jours après la fusion et testé pour sa réacti-vité avec la cellule immunisante par immunofluorescence indirecte et analyse en cytométrie de flux. En bref, les cellules T3025 ont été incubées à 4° C pendant 30 minutes avec le surnageant d'hybridome (100 μl pour 300 000 cellules), lavées et marquées avec un anticorps de chèvre anti-immunoglobulines de souris conjugué à la fluoresceine (Coulter Electronics, Hialeah, FL). Les cellules ont ensuite été analysées par cytofluorométrie (Coulter Profile). Comme le montrent les figures 9A et 10A, les surnageants des hybridomes R0-73 et JU-74 permettent le marquage de 100 % des cellules du clone immunisant 3025. Un anticorps anti-CD3 (OKT3 Ortho-Co) et l'anticorps anti-clonotype NKTa (IgG1, Hercend et al. (40)) servaient respectivement de contrôles positif et négatif dans cette expérience.
5) Spécificité anti-récepteur T
La spécificité anti-récepteur T des anticorps monoclonaux a été analysée selon les critères suivants :
1 - les anticorps doivent reconnaître le clone T 3025 immunisant mais pas un clone T portant un récepteur des cellules T (TCR) différent, par exemple le clone 12410
(Moebius et al., (35), TCR exprimé : Va3/Vβ17 ) . 2 - Les anticorps doivent réagir avec un faible pourcentage de lymphocytes circulants (PBL).
3 - La structure de surface reconnue par les anticorps sur la cellule immunisante doit co-moduler avec la molécule CD3 lors de l'incubation des cellules en présence d'anticorps anti-CD3 (Meuer et al. (1)).
Comme le montrent les figures 9 et 10, les surnageants des hybridomes RO-73 et JU-74 réagissent avec 100 % des cellules du clone 3025 immunisant (Fig. 9A et 10A), moins de % des cellules du clone 12410 (Fig. 9B et 10B) et 1 à 3 % des PBL (Fig. 9C et 10C).
Pour les expériences de co-modulation, les cellules du clone 3025 (106 cellules par ml) ont été incubées en milieu seul ou en présence d'anticorps anti-CD3 (OKT3) dans des plaques de culture de 24 puits. Après 24 heures d'incubation, les cellules ont été récoltées et marquées avec le surnageant d'hybridome RO-73 ou JU-74, l'anticorps monoclonal anti-CD3 ou un anticorps monoclonal contrôle anti-CD2 (Coultronics Co.) puis analysées par cytofluorimétrie. Comme le montrent les Figures 11 et 12, l'analyse par cytofluorimétrie des cellules incubées en présence d'anticorps monoclonal anti-CD3 (Fig. 11B et 12B) montre une diminution de l'intensité de fluorescence pour l'anticorps monoclonal anti-CD3 ainsi que pour RO-73 et JU-74, alors que l'intensité du marquage avec l'anticorps monoclonal anti-CD2 augmente par comparaison à l'intensité obtenue respectivement en absence d'anticorps anti-CD3 (Fig. 11A et Fig. 11B). Ces résultats indiquent que la molécule reconnue par les anticorps RO-73 et JU-74 co-module avec la molécule CD3 à la surface des cellules du clone T 3025.
6) Isolement d'un sous-clone
Les cellules des hybridomes initiaux, respectivement RO-73 et JU-74, ont été réparties en plaques de culture à raison de 0,5 cellule par puits en milieu HAT complet, sur des cellules spleniques syngeniques irradiées. 3 sous-clones ont été sélectionnés pour chacun des hybridomes RO-73 et JU-74. Ces cellules produisent des anticorps monoclonaux dont la réactivité est identique à celle des hybridomes initiaux (résultats non montrés).
Les sous-clones ont été cultivés en milieu non sélectif contenant du DMEM, 10 % de sérum de veau foetal, 10 % de sérum de cheval, de l'hypoxanthine, de la thymidine, de la pénicilline et de la streptomycine, de la glutamine, du pyruvate de sodium et du NCTC 109.
Les cellules d'hybridomes ou de sous-clones ont été congelées dans du sérum de veau foetal contenant 10 % de diméthyl-suifoxyde (DMSO, Merck) et conservées dans l'azote liquide.
7) Isotypage des anticorps monoclonaux
Les isotypes ont été déterminés par immunodiffusion sur support solide en utilisant un kit "INNO-LIA mouse mAb
isotyping" (Innogenetics) pour la détermination des isotypes d'immunoglobulines dans les surnageants de culture. RO-73 et JU-74 sont des immunoglobulines de souris d' isotype IgGl, kappa. 8) Purification des anticorps monoclonaux
Des ascites ont été produites dans des souris nudes. Le liquide d'ascite obtenu a été filtré sur coton pour éliminer la fibrine et précipité par le sulfate de sodium (18 %). Le culot obtenu a été mis en suspension dans du tampon PBS, dilué 1/3 dans du tampon (NaCl 4,5 M, glycine 2,25 M, pH 8,8) et chargé sur une colonne de Protéine A-Sepharose 4 Fast Flow équilibrée dans le tampon de charge (NaCl 3M, glycine 1,5 M, pH 8,8). Un pic majoritaire d'immunoglobulines a été élue à pH 6 en utilisant des tampons d'élution successifs de pH décroissant. Ce pic majoritaire a été purifié sur colonne échangeuse d'ions (Q Sepharose Fast Flow) en tampon Tris 50 mM, pH 8 et élue par un gradient de NaCl.
La pureté de la préparation a été vérifiée par électrophorèse dans un système PHAST (Pharmacia LKB, Uppsala, Suède) et les immunoglobulines purifiées ont été testées en immunofluorescence indirecte sur la cellule 3025, comme indiqué précédemment.
A titre d'exemple, pour 30 ml d'ascite de l'hybridome RO- 73, on obtient après purification sur Protéine A et Q
Sepharose Fast Flow, 32 mg d'immunoglobulines purifiées.
9) Pourcentage de PBL reconnus par les anticorps monoclonaux
Les pourcentages de lymphocytes circulants reconnus respectivement par les anticorps monoclonaux RO-73 et JU-74 ont été déterminés pour 10 donneurs sains différents. Les résultats sont montrés dans le Tableau 1. L'anticorps monocl nal JU-74 reconnaît moins de 0,5 % à 2,1 % des PBL (moyenne 1,08 %) et l'anticorps monoclonal RO-73 reconnaît de 0,5 % à 2,2 % des PBL selon les individus (moyenne 1,09 %). Pour un individu donné, les anticorps monoclonaux RO-73 et JU-74 reconnaissent respectivement environ les mêmes pourcentages lymphocytes circulants.
Figure imgf000029_0001
10) Purification des PBL reconnus par les anticorps monoclonaux
Les PBL reconnus respectivement par les anticorps monoclonaux RO-73 et JU-74 ont été purifiés à partir d'un donneur normal en utilisant un procédé de sélection positive par des billes magnétiques (Dynabeads, Dynal). En bref, 1 à 4 × 109 PBL ont été marqués par l'un ou l'autre des anticorps monoclo- naux purifiés ci-dessus et incubés avec les billes Dynabeads M-450 prêtes à l'emploi recouvertes par un sérum de chèvre anti-IgG de souris, dans la proportion de 3 billes pour une cellule marquée. Les cellules positives ont ensuite été séparées grâce à un aimant. Après plusieurs lavages, les cellules ont été incubées avec un excès d'immunoglobulines de chèvre anti-IgG de souris ("Detach-a-beads", Dynatech) pour détacher les billes magnétiques puis directement analysées en cytométrie de flux après marquage par l'anticorps monoclonal RO-73 ou l'anticorps monoclonal JU-74, respectivement.
Les cellules positives sélectionnées ont été cultivées e microplaque en présence d'IL-2 sur des cellules allogéniques irradiées puis à nouveau purifiées par les billes magnétiques après environ une semaine de culture afin d'obtenir une prépa- ration d'une pureté supérieure à 95 %.
Pour l'anticorps monoclonal JU-74, 8 × 106 cellules positives à 96 % de pureté ont été obtenues, après une culture d'une semaine, à partir de 1 × 109 PBL d'un donneur sain contenant initialement 1,7 % de cellules JU-74+.
Pour l'anticorps monoclonal RO-73, 9 × 106 cellules positives à 98 % de pureté ont été obtenues, après 10 jours de culture, à partir de 1,2 × 109 PBL d'un donneur sain contenant initialement 2,4 % de cellules RO-73+.
A partir des cellules RO-73+ et JU-74+ purifiées ainsi sélectionnées, des lignées cellulaires ont été respectivement établies; chaque lignée est reconnue à 100 % par les deux anticorps monoclonaux, ce qui montre que les deux anticorps monoclonaux reconnaissent les mêmes cellules dans le sang périphérique. 11) Analyse des transcrits du TCR exprimés dans les PBL reconnus par RO-73 et JU-74 par les techniques de PCR
a) Méthode d'analyse des transcrits β
La gamme des oligonucléotides spécifiques des segments de type Vβ1 à Vβ24 décrite ci-dessus (SEQ ID Nº 25 à Nº 48) a été utilisée comme amorces spécifiques pour analyser les transcrits β du TCR exprimés dans les cellules RO-73+ et JU- 74+. La procédure employée est identique à celle décrite dans l'exemple ci-dessus pour les lymphocytes périphériques d'un individu sain. En bref, après préparation de l'ARN selon la méthode de Chomczynski (13), l'ADN complémentaire a été synthétisé en utilisant la réverse transcriptase et l'amorce Cβ (SEQ ID Nº 50). Le matériel obtenu a été soumis à 30 cycles d'amplification selon la technique PCR en utilisant en parallèle chacune des amorces Vβ spécifiques correspondant aux séquences SEQ ID N° 25 à 48 et l'amorce Cβ B spécifique de la région Cβ (SEQ ID Nº 50) comme décrit précédemment.
Les produits amplifiés obtenus ont été séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2 %, transférés sur des membranes de nylon et hybrides avec la sonde oligonucléotidique Cβ C (SEQ ID Nº 51) marquée au 32P. Les membranes ont ensuite été lavées comme décrit ci-dessus puis autoradiographiées.
Le séquençage des transcrits de la chaîne β des TCR a ét réalisé en suivant la méthode de clonage et de séquençage décrite précédemment pour l'ADNc. Par exemple, le matériel amplifié par l'oligonucléotide spécifique de la sous-famille Vβl3 (SEQ ID Nº 37) a été digéré par l'enzyme SacII et purifi par électrophorèse sur gel d'agarose. Le matériel obtenu a ét introduit dans le vecteur pBS SK+ [comme décrit plus haut pou la technique d'A-PCR] et utilisé pour transfecter les bactéries E. Coli XL-1-blue. Les colonies transformées obtenues on été testées par hybridation en dot-blot en utilisant la sonde oligonucléotidique Cβ C (SEQ ID N° 51) marquée au 32P. L'ADN plasmidique a été séquence comme décrit précédemment. b) Méthode d'analyse des transcrits α
Une méthodologie semblable à celle décrite pour les transcrits β a été appliquée à l'analyse des transcrits de la chaîne α du TCR en utilisant comme amorces spécifiques une gamme d'oligonucléotides spécifiques des segments Va de type Val à Vα29 et des oligonucléotides spécifiques de la région constante Cα (oligonucléotide Cα B pour la synthèse de l'ADN complémentaire et l'amplification par PCR et oligonucléotide Cα C pour la sonde de détection). Les séquences de ces oligonucléotides sont indiquées dans le Tableau 2.
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
c) Résultats
La Figure 13 montre les résultats obtenus pour l'analyse des transcrits des chaînes α (Fig. 13 A) et des chaînes β (Fig. 13B) du TCR exprimés par les cellules RO-73+ reconnues par l'anticorps monoclonal RO-73. On constate que de nombreux segments Va différents sont exprimés dans ces cellules (Figur 13A). Par contre, seul l'oligonucléotide spécifique des séquences de la sous-famille Vβ13 permet une amplification de l'ADNc (Figure 13B).
Des résultats identiques ont été obtenus pour les
transcrits β du TCR exprimés dans les cellules JU-74+ reconnues par l'anticorps monoclonal JU-74 (résultats non montrés).
De plus, les transcrits β qui correspondent à la sous-famille Vβ13 exprimés par les cellules JU-74+ ont été
séquences à partir des cellules isolées précédemment afin de déterminer, parmi les 5 membres connus ou nouveaux de la sous-famille Vβ13 (Figure 4), ceux dont les produits sont reconnus par l'anticorps monoclonal JU-74. Le tableau 3 montre les résultats obtenus après analyse de ces séquences. Les huit séquences différentes de Vβ13 obtenues correspondent toutes à un réarrangement du segment génique nouveau V/313 IGRbl6 (SEQ ID Nº 15) avec des segments J et des régions N différents.
Figure imgf000035_0001
L'ensemble de ces résultats montre que les anticorps monoclonaux RO-73 et JU-74 sont spécifiques des produits de segments géniques appartenant à la sous-famille V/313.
Plus précisément, les anticorps monoclonaux JU-74 et RO-73 ont la même spécificité et reconnaissent exclusivement le produit du segment génique nouveau V/313 IGRbl6 de l'invention (SEQ ID N° 15 indiquée ci-dessus).
Les lignées cellulaires hybridomes suivantes ont été déposées auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM - Institut Pasteur) : JU-74 et RO-73 le 12 février 1992 sous les numéros 1-1173 et 1-1172 .
REFERENCES :
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40. Hercend, T. et al., J. Exp. Med., 158., 1983, 1547.
41. Wilson, R.K. et al., Immunogenetics, 1990, 32, 406.
LISTE DES SEQUENCES
INFORMATION GENERALE
(1) DEMANDEUR : Société dite ROUSSEL UCLAF
(2) TITRE DE L'INVENTION : Séquences nucléotidiques codant pour des régions variables des chaînes β des récepteurs des lymphocytes T humains, segments peptidiques correspondants et les applications diagnostiques et thérapeutiques.
(3) NOMBRE DE SEQUENCES : 56
III - INFORMATION POUR SEQ ID Nº 2
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 387 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 02
SEQUENCE V/3 W21
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGTGACCCTG ATCTGGCAAA GCTTCCATCC TGCCCTGACC CTGCC ATG 48
MET
1
GGT ACC AGG CTC CTC TGC CGG GTG GCC TTC TGT CTC CTG GTG GAA GAA 96 Gly Thr Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Leu Leu Val Glu Glu
5 10 15
CTC ATA GAA GCT GGA GTG GTT CAG TCT CCC AGA TAT AAG ATT ATA GAG 144 Leu Ile Glu Ala Gly Val Val Gln Ser Pro Arg Tyr Lys Ile Ile Glu
20 25 30
AAA AAG CAG CCT GTG GCT TTT TGG TGC AAT CCT ATT TCT GGC CAC AAT 192 Lys Lys Gln Pro Val Ala Phe Trp Cys Asn Pro Ile Ser Gly His Asn
35 40 45
ACC CTT TAC TGG TAC CGG CAG AAC TTG GGA CAG GGC CCG GAG CTT CTG 240 Thr Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Asn Leu Gly Gln Gly Pro Glu Leu Leu 50 55 60 65
ATT CGA TAT GAG AAT GAG GAA GCA GTA GAC GAT TCA CAG TTG CCT AAG 288 Ile Arg Tyr Glu Asn Glu Glu Ala Val Asp Asp Ser Gln Leu Pro Lys
70 75 80
GAT CGA TTT TCT GCA GAG AGG CTC AAA GGA GTA GAC TCC ACT CTC AAG 336 Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Leu Lys Gly Val Asp Ser Thr Leu Lys
85 90 95
ATC CAG CCT GCA GAG CTT GGG GAC TCG GCC GTG TAT CTC TGT GCC AGC 384 Ile Gln Pro Al_ Glu Leu Gly Asp ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
AGC 387 Ser IV - INFORMATION POUR SEQ ID Nº 3
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 395 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
SEQUENCE CONSENSUS
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES NOM DE L'ADN : IGR b 03
SEQUENCE Vβ w22
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
ACASGACCAG ATGCCTGAGC TAGGAAAGGC CTCATTCCTG CTGTGATC 48
CTGCC ATG GAT ACC TGG CTC GTA TGC TGG GCA ATT TTT AGT CTC TTG 95
Met Asp Thr Trp Leu Val Cys Trp Ala Ile Phe So r Lou Lou 1 5 10
AAA GCA GGA CTC ACA GAA CCT GAA GTC ACC CAG ACT CCC AGC CAT CAG 143 Lys Ala Gly Leu Thr Glu Pro Glu Val Thr Gln Thr Pro Ser His Gln 15 20 25 30
GTC ACA CAG ATG GGA CAG GAA GTG ATC TTG CGC TGT GTC CCC ATC TCT 191 Val Thr Gln Met Gly Gln Glu Val île Leu Arg Cys Val Pro Ile Ser
35 40 45
AAT CAC TTA TAC TTC TAT TGG TAC AGA CAA ATC TTG GGG CAG AAA GTC 239 Asn His Leu Tyr Phe Tyr Trp Tyr Arg Gln Ile Leu Gly Gln Lys Val
50 55 60
GAG TTT CTG GTT TCC TTT TAT AAT AAT GAA ATC TCA GAG AAG TCT GAA 287 Glu Phe Leu Val Ser Phe Tyr Asn Asn Glu Ile Ser Glu Lys Ser Glu
65 70 75
ATA TTC GAT GAT CAA TTC TCA GTT GAA AGG CCT GAT GGA TCA AAT TTC 335 Ile Phe Asp Asp Gln Phe Ser Val Glu Arg Pro Asp Gly Ser Asn Phe
80 85 90
ACT CTG AAG ATC CGG TCC ACA AAG CTG GAG GAC TCA GCC ATG TAC TTC 383 Thr Leu Lys Ile Arg ser Thr Lys Leu Glu Asp Ser Ala Met Tyr Phe 95 100 105 110
TGT GCC AGC AGT 395
Cys Ala Ser Ser V - INFORMATION POUR SEQ ID N° 4
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 329 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
SEQUENCE CONSENSUS ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES NOM DE L'ADN : IGR b 04
SEQUENCE V/3 w23
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGCTCCTCTG CCATGTC ATG CTT TGT CTC CTG GGA GCA GCT TCA GTG 47
Met Leu Cys Leu Leu Gly Ala Gly Ser Val
1 5 10
GCT GCT GGA GTC ATC CAG TCC CCA AGA CAT CTG ATC AAA GAA AAG AGG 95 Ala Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Leu Ile Lys Glu Lys Arg
15 20 25
GAA ACA GCC ACT CTG AAA TGC TAT CCT ATC CCT AGA CAC GAC ACT GTC 143 Glu Thr Ala Thr Leu Lys Cys Tyr Pro Ile Pro Arg His Asp Thr Val
30 35 40
TAC TGG TAC CAG CAG GGT CCA GGT CAG GAC CCC CAG TTC CTC ATT TCG 191 Tyr Trp Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Asp Pro Gln Phe Leu Ilo Ser
45 50 05
TTT TAT GAA AAG ATG CAG AGC GAT AAA GGA AGC ATC CCT GAT CGA TTC 239 Phe Tyr Glu Lys Met Gln Ser Asp Lys Gly Ser Ile Pro Asp Arg Phe
60 65 70
TCA GCT CAA CAG TTC AGT GAC TAT CAT TCT GAA CTG AAC ATG AGC TCC 287 Ser Ala Gln Gln Phe Ser Asp Tyr His Ser Glu Leu Asn Met Ser Ser 75 80 85 90
TTG GAG CTG GGG GAC TCA GCC CTG TAC TTC TGT GCC AGC AGC 329 Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser
95 100 VI - INFORMATION POUR SEQ ID N° 5
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 366 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L ' ADN : IGR b 05
SEQUENCE Vβ W24
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
ATTCCTGTAT GGGGTGGTAT TCCTGCC ATG GGT CCT GGG CTT CTC CAC 48
Met Gly Pro Gly Leu Leu His 1 S
TGG ATG GCC CTT TGT CTC CTT GGA ACA GGT CAT GGG GAT GCC ATG GTC 96
Trp Met Ala Leu, Cys Leu Leu Gly Thr Gly His Gly Asp Ala Met Val
10 15 20
ATC CAG AAC CCA AGA TAC CAG GTT ACC CAG TTT GGA AAG CCA GTG ACC 144 Ile Gln Asn Pro Arg Tyr Gln Val Thr Gln Phe Gly Lys Pro Val Thr
25 30 35
CTG AGT TGT TCT CAG ACT TTG AAC CAT AAC GTC ATG TAC TGG TAC CAG 192 Leu Ser Cys Ser Gln Thr Leu Asn His Asn Val Met Tyr Trp Tyr Gln 40 45 50 55
CAG AAG TCA AGT CAG GCC CCA AAG CTG CTG TTC CAC TAC TAT GAC AAA 240 Gln Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu Leu Phe His Tyr Tyr Asp Lys
60 65 70
GAT TTT AAC AAT GAA GCA GAC ACC CCT GAT AAC TTC CAA TCC AGG AGG 288 Asp Phe Asn Asn Glu Ala Asp Thr Pro Asp Asn Phe Gln Ser Arg Arg
75 80 85
CCG AAC ACT TCT TTC TGC TTT CTT GAC ATC CGC TCA CCA GGC CTG GGG 336
Pro Asn Thr Ser Phe cys Phe Leu Asp Ha Arg Ser Pro Gly Lau Gly
90 95 100
GAC GCA GCC ATG TAC CTG TGT GCC ACC AGC 366
Asp Ala Ala Met Tyr Leu Cys Ala Thr Ser
105 HO VII - INFORMATION POUR SEQ ID N' 6
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 238 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L 'ADN : IGR b 06
SEQUENCE V/3 5
A GGA CAG CAA GCG ACT CTG AGA TGC TCT CCT ATC TCT GGG CAC ACC 46
Gly Gln Gln Ala Thr Leu Arg Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Thr 1 5 10 15
AGT GTG TAC TGG TAC CAA CAG GCC CTG GGT CTG GGC CTC CAG CTC CTC 94
Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Leu Gly Leu Gln Leu Leu
20 25 30
CTT TGG TAT GAC GAG GGT GAA GAG AGA AAC AGA CGA AAC TTC CCT CCT 142 Leu Trp Tyr Aso Glu Gly Glu Glu Arg Asn Arg Gly Asn Phe Pro Pro
35 40 45 AGA TTT TCA GGT CGC CAG TTC CCT AAT TAT AGC TCT CAG CTG AAT GTG 190 Arg Phe Ser Gly Arg Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn Val
50 55 60
AAC GCC TTG GAG CTG GAG GAC TCG GCC CTG TAT CTC TGT GCC AGC AGC 238 Asn Ala Leu Glu Leu Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser
65 65 70
VIII - INFORMATION POUR SEQ ID N° 7
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 192 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 07
SEQUENCE Vβ 5
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
ACT GTG TCC TGG TAC CAA CAG GCC CTG GGT CAG GGG CCC CAG TTT ATC 48
Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile
1 5 10 15
TTT CAG TAT TAT AGG GAG GAA GAG AAT GGC AGA GGA AAC TCC CCT CCT 96
Phe Gln Tyr Tyr Arg Glu Glu Glu Asn Gly Arg Gly Asn Ser Pro Pro
20 25 30
AGA TTC TCA GGT CTC CAG TTC CCT AAT TAT AGC TCT GAG CTG AAT GTG 144 Arg Phe Ser Gly Lou Gln Phe Pro Asn Tyr Sor ser Glu Lou Asπ Val
35 40 45
AAC GCC TTG GAG CTG GAC GAC TCG GCC CTG TAT CTC TGT GCC AGC AGC 192 Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser
50 55 60
IX - INFORMATION POUR SEQ ID Nº 8
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 371 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 08
SEQUENCE Vβ 5
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
GAACTCACTG GGTTCTTCCC CACGAGUACC AACCCCTGAA TCAGCTGCAC 50
TGCTGCCTGC CCCACTGTGC C ATG GGC CCT GGG CTC CTC TGC TGG 95
Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp 1 5
GTG CTG CTT TGT CTC CTG GGA GCA GGC CCA GTG GAC GCT GGA GTC ACC 143 Val Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala Gly Pro Val Asp Ala Gly Val Thr
10 15 20
CAA AGT CCC ACA CAC CTG ATC AAA ACG AGA GGA CAG CAA GTG ACT CTG 191 Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu 25 30 35 40
AGA TGC TCT CCT ATC TCT GAG CAC AAG AGT GTG TCC TGG TAC CAA CAG 239 Arg Cys Ser Prc Ile Ser Glu His Lys Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln
45 50 55
GTC CTG GGT CAG GGG CCC CAG TTT ATC TTT CAG TAT TAT GAG AAA GAA 287 Val Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Lys Glu
60 65 70
GAG AGA GGA AGA GGA AAC TTC CCT GAT CGA TTC TCA GCT CGC CAG TTC 335 Glu Arg Gly Arg Gly Asn Phe Pro Asp Arg Phe Ser Ala Arg Gln Phe
75 80 85
CCT AAC TAT AGC TCT GAG CTG AAT GTG AAC GCC TTG TTG CTG GGG GAC 383 Pro Asn Tyr Ser Sur Glu Leu Asn Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp
90 95 100
TCG GCC CTG TAT CTC TGT GCC AGC AGC 410
Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser
105 110 X - INFORMATION POUR SEQ ID Nº 9
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 380 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 09
SEQUENCE Vβ 5
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AAGCCCTGAA TCAGATGCAG TGCTTCCTGTC CCTCTGTGCC ATG GGC 47
Met Gly
1
CCC GGG CTC CTC TGC TGG GCA CTG CTT TGT CTC CTG GGA GCA GGC TTA 95 Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala Gly Leu
5 10 15
GTG GAC GCT GCA CTC ACC CAA AGT CCC ACA CAC CTG ATC AAA ACG AGA 143 Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Lou Ile Lys Thr Arg
20 25 30
GGA CAG CAA GTG ACT CTG AGA TGC TCT CCT AAG TCT GGG CAT GAC ACT 191 Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His Asp Thr
35 40 45
GTG TCC TGG TAC CAA CAG GCC CTG GGT CAG GGG CCC CAG TTT ATC TTT 239 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile Phe 50 55 60 65
CAG TAT TAT GAG GAG GAA GAG AGA CAG AGA GGC AAC TTC CCT GAT CGA 287 Gln Tyr Tyr G1M Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro Asp Arg
70 75 80
TTC TCA GGT CAC CAG TTC CCT AAC TAT AGC TCT GAG CTG AAT GTG AAC 335 Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn Val Asn
85 90 95
GCC TTG TTG CTG GGG GAC TCG GCC CTC TAT CTC TGT GCC AGC AGC 380 Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser
100 105 110 I - INFORMATION POUR SEQ ID N° 10
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 351 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L ' ADN : IGR b 11
SEQUENCE Vβ 6
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
GACCCTGCC ATG GGC ACC AGT CTC CTA TGC TGG GTG GTC CTG GGT TTC 48
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Val Val Leu Gly Phe
1 5 10
CTA GGG ACA GAT CAC ACA GGT GCT GGA GTC TCC CAG TCT CCC AGG TAC 96 Leu Gly Thr Asp His Thr Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Arg Tyr
15 20 25
AAA GTC ACA AAG AGG GGA CAG GAT GTA GCT CTC AGG TGT GAT CCA ATC 144 Gln Val Thr Lys Arg Gly Gln Asp Val Ala Leu Arg Cys Asp Pro Ile
30 35 40 45
TCG GGT CAT GTA TCC CTT TAT TGG TAC CGA CAG GCC CTG GGG CAG GGC 192 Ser Gly His Val Ser Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Leu Gly Gln Gly
50 55 60
CCA GAG TTT CTG ACT TAC TTC AAT TAT GAA GCC CAA CAA GAC AAA TCA 240 Pro Glu Phe Leu Thr Tyr Phe Asn Tyr Glu Ala Gln Gln Asp Lys Ser
65 70 75
GGG CTG CCC AAT GAT CGG TTC TCT GCA GAG AGG CCT GAG GGA TCC ATC 288 Gly Leu Pro Asn Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Pro Glu Gly Ser Ile
80 85 90
TCC ACT CTG ACG ATC CAG CGC ACA GAG CAG CGG GAC TCG GCC ATG TAT 336 Ser Thr Leu Thr Ile Gln Arg Thr Glu Gln Arg Asp Ser Ala Met Tyr
95 100 105
CGC TGT GCC AGC AGC 351
Arg Cys Ala Ser Ser
110 II - INFORMATION POUR SEQ ID N' 11
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 238 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L 'ADN : IGR b 12
SEQUENCE Vβ 6
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
A AAG GAT GTA GAG CTC AGG TGT GAT CCA ATT TCA GGT CAT ACT GCC 46 Lys Asp Val Glu Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His Thr Ala 1 5 10 15
CTT TAC TGG TAC CGA CAG AGC CTG GGG CAG GGC CTG GAG TTT TTA ATT 94 Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ser Leu Gly Gln Gly Leu Glu Phe Leu Ila
20 25 30
TAC TTC CAA GGC AAC AGT GCA CCA GAC AAA TCA GGG CTG CCC AAC GAT 142 Tyr Phe Gln Gly Asn Ser Ala Pro Asp Lys Ser Gly Leu Pro Asn Asp
35 40 45
CGG TTC TTT GCA GTC AGG CCT GAG GGA TCC GTC TCT ACT CTG AGG ATC 190 Arg Phe Phe Ala Val Arg Pro Glu Gly Ser Val Ser Thr Leu Arg Ile
50 55 60
CAG CGC ACA GAO CGG GGG GAC TCA GCC GTG TAT CTC TGT GCC AGC AGC 238 Gln Arg Thr Glu Arg Gly Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser
65 70 75
XIII - INFORMATION POUR SEQ ID N º 12
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 294 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L ' ADN : IGR b 13
SEQUENCE Vβ 12
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
TCA GGA CAC AGG GAT GCT GAA ATC ACC CAG AGC CCA AGA CAC AAG ATC 48
Ser Gly His Arg Asp Ala Glu Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Lys Ile 1 5 10 15
ACA GAG ACA GCA AGG CAG GTG ACC TTG GCG TGT CAC CAG ACT TGG AAC 96
Thr Glu Thr Gl y Arg Gln Val Thr Leu Ala Cys His Gln Thr Trp Asn
20 25 30
CAC AAC AAT ATG TTC TGG TAT CGA CAA GAC CTG CCA CAT GGG CTG AGG 144 His Asn Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly His Gly Leu Arg .
35 40 45
CTG ATC CAT TAC TCA TAT GGT GTT CAA GAC ACT AAC AAA GGA GAA GTC 192 Leu Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Gln Asp Thr Asn Lys Gly Glu Val
50 55 60
TCA GAT GGC TAC AGT GTC TCT AGA TCA AAC ACA GAG GAC CTC CCC CTC 240 Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ser Asn Thr Glu Asp Leu Pro Leu 65 70 75 80
ACT CTG GAG TCT GCT GCC TCC TCC CAG ACA TCT GTA TAT TTC TGC GCC 288 Thr Leu Glu Ser Ala Ala Ser Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
AGC AGT 294
Ser Ser XIV - INFORMATION POUR SEQ ID Nº 13
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 369 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L 'ADN : IGR b 14
SEQUENCE V/3 13
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGAAGACCCC TCCATCCTGT AGCACCTGCC ATG AGC ATC GGG CTC CTG 48
Met Ser Ile Gly Leu Leu 1 5
TGC TGT GTG GCC TTT TCT CTC CTG TGG GCA AGT CCA GTG AAT GCT GGT 96 Cys Cys Val Ala Phe Sor LoU Lou Trp Ala Sor Pro VaL Ann Aln Gly
10 15 20
GTC ACT CAG ACC CCA AAA TTC CAG GTC CTG AAG ACA GGA CAG AGC ATG 144
Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr Gly Gln Ser Met
25 30 35
ACA CTG CAG TGT GCC CAG GAT ATG AAC CAT AAC TCC ATG TAC TGG TAT 192 Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Asn Sor Met Tyr Trp Tyr
40 45 50
CGA CAA GAC CCA GGC ATG GGA CTG AGG CTG ATT TAT TAC TCA GCT TCT 240 Arg Gln Aep Pro Gly Met Gly I_su Arg Lou Ile Tyr Tyr Ser Ala Sor 55 60 ûϋ 70
GAG GGT ACC ACT GAC AAA GGA GAA GTC CCC AAT GGC TAC AAT GTC TCC 288 Glu Gly Thr Thr Asp Lys Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser
75 80 85
AGA TTA AAC AAA CGG GAG TTC TCG CTC AGG CTG GAG TCG GCT GCT CCC 336 Arg Leu Asn Lys Arg Glu Phe Ser Leu Arg Leu Glu Ser Ala Ala Pro
90 95 100
TCC CAG ACA Td GTG TAC TTC TGT GCC AGC ACC 369
Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Thr
105 HO XV - INFORMATION POUR SEQ ID N º 14
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 356 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L ' ADN : IGR b 15
SEQUENCE Vβ 13
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
TGCTTGTAGC ATCTGCC ATG AGA ATC AGG CTC CTG TGC TGT GTG GCC 47
Met Arg Ile Arg Leu lou Cys Cys Val Ala 1 5 10
TTT TCT CTC CTG TGG GCA GGT CCA GTG ATT GCT GGG ATC ACC CAG GCA 95
Phe Ser Leu Leu Trp Ala Gly Pro Val Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala
15 20 25
CCA ACA TCT CAG ATC CTG GCA GCA GGA CGG CGC ATG ACA CTG AGA TGT 143 Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys
30 35 40
ACC CAG GAT ATG AGA CAT AAT GCC ATG TAC TGG TAT AGA CAA GAT CTA 191 Thr Gln Asp Met Arg His Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu
45 50 55
GGA CTG GGG CTA AGG CTC ATC CAT TAT TCA AAT ACT GCA GGT ACC ACT 239 Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr
60 65 70
GGC AAA GGA GAA GTC CCT GAT GGT TAT AGT GTC TCC AGA GCA AAC ACA 287 Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr Ser Va l Sor Arg Ala Asn Thr 75 80 85 90
GAT GAT TTC CCC CTC ACG TTG GCG TCT GCT GTA CCC TCT CAG ACA TCT 335
Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser
95 100 105
GTG TAC TTC TGT GCC AGC AGT 356
Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser
110 XVI - INFORMATION POUR SEQ ID N° 15
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 345 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
SEQUENCE CONSENSUS ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES NOM DE L'ADN : IGR b 16
SEQUENCE Vβ
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AAGGCCCAGC CCCTTTCCAT TGGGGCTGCA GCATCAGCTG TTTCCTTCTC 50
TGCAGGT CCA GTG AAT GCT GGT GTC ACT CAG ACC CCA AAA TTC CGC 96
Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Arg 1 5 10
ATC CTG AAG ATA GGA CAG AGC ATG ACA CTG CAG TGT GCC CAG GAT ATG 144 Ile Leu Lys Ile Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met
15 20 25
AAC CAT AAC TAC ATG TAC TGG TAT CGA CAA GAC CCA CGC ATC CCC CTG 192
Asn His Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu 30 35 40 45
AAG CTG ATT TAT TAT TCA GTT GGT GCT GGT ATC ACT GAT AAA GCA GAA 240 Lys Leu Ile Tyr Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Lys Gly Glu
50 55 60
GTC CCG AAT GGC TAC AAC GTC TCC AGA TCA ACC ACA GAG GAT TTC CCG 288 Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro
65 70 75
CTC AGG CTG GAG TTG GCT GCT CCC TCC CAG ACA TCT GTG TAC TTC TGT 336 Leu Arg Leu Glu Leu Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser val Tyr Phe cys
80 85 90
GCC AGC AGT 345
Ala Ser Ser
95 XVII - INFORMATION POUR SEQ ID N° 16
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 450 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L ' ADN : IGR b 17
SEQUENCE Vβ 7
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
TGGAGCAGTG ACATCACAGG AAAAACCACC AACCAAGGCC 40
AAGGAGACCA GAGCCCAGCA CCTCACCCAG AGGACCCCAG TCAGAGGCCC CATCTCAGAC 100
CCGAGGC'AG C ATG GGC TGC AGG CTG CTC TGC TGT GCG GTT CTC 144
Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu 1 5 10
TGT CTC CTG GGA GCG GTC CCC ATG GAA ACG GGA GTT ACG CAG ACA CCA 192 Cys Leu Leu Gly Ala Val Pro Met Glu Thr Gly Val Thr Gln Thr Pro
15 20 25
AGA CAC CTG GTC ATG GGA ATG ACA AAT AAG AAG TCT TTG AAA TGT GAA 240 Arg His Leu Val Met Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu
30 35 40
CAA CAT CTG GGG CAT AAC GCT ATG TAT TGG TAC AAG CAA AGT GCT AAG 288 Gln His Leu Gly His Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Ser Ala Lys
45 50 55
AAG CCA CTG GAG CTC ATG TTT GTC TAC AAC TTT AAA GAA CAG ACT GAA 336 Lys Pro Leu Glu Leu Met Phe Val Tyr Asn Phe Lys Glu Gln Thr Glu 60 65 70 75
AAC AAC AGT GTG CCA AGT CGC TTC TCA CCT GAA TGC CCC AAC AGC TCT 384 Asn Asn Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser
80 85 90
CAC TTA TGC CTT CAC CTA CAC ACC CTG CAG CCA GAA GAC TCG GCC CTG 432 His Leu Cys Leu His Leu His Thr Leu Gln Pro Glu Asp Ser ^Ala Led
95 100 105
TAT CTC TGT GCC AGC ACC 450
Tyr Leu Cys Ala ser Thr
110 XVIII - INFORMATION POUR SEQ ID N° 17
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 354 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L ' ADN : IGR b 18
SEQUENCE Vβ 7
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGACCCGAGG CTAGC ATG GGC TGC AGG CTG CTC TGC TCT GCG GTT CTC 48
Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Ser Ala Val Leu 1 5 10
TGT CTC CTG GGA GCG GTC CCC ATG GAA ACG GGA GTT ACG CAG ACA CCA 96
Cys Leu Leu Gly Ala Val Pro Met Glu Thr Gly Val Thr Gln Thr Pro
15 20 25
AGA CAC CTG GTC ATG GGA ATG ACA AAT AAG AAG TCT TTG AAA TGT GAA 144 Arg His Leu Val Met Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu
30 35 40
CAA CAT CTG GGT CAT AAC GCT ATG TAT TGG TAC AAG CAA AGT GCT AAG 192 Gln His Leu Gly His Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Ser Ala Lys
45 50 55
AAG CCA CTG GAG CTC ATG TTT GTC TAC AGT CTT GAA GAA CGG GTT GAA 240 Lys Pro Leu Glu Leu Met Phe Val Tyr Ser Leu Glu Glu Arg Val Glu 60 65 70 75
AAC AAC AGT GTG CCA AGT CGC TTC TCA CCT GAA TGC CCC AAC AGC TCT 288 Asn Asn Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser
80 85 90
CAC TTA TCC CTT CAC CTA CAC ACC CTG CAG CCA GAA GAC TCG GCC CTG 336 His Leu Ser Leu His Leu His Thr Leu Gln Pro Glu Asp ser Ala Leu
95 100 105
TAT CTC TGC GCC AGC AGC 354
Tyr Leu Cys Ala Ser Ser
110 IX - INFORMATION POUR SEQ ID N° 18
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 368 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains CARACTERISTIQUES
NOM DE L'ADN : IGR b 19
SEQUENCE V/3 7
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
AGAGGCCCCA TCTCAGACCC GAGGCTAGC ATG GGC TGC AGG CTG CTC 47
Met Gly Cys Arg Leu Leu 1 5
TGC TGT GCG GTT CTC TGT CTC CTG GGA GCA GTT CCC ATA GAC ACT GAA 95 Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala Val Pro Ile Asp Thr Glu
10 15 20
GTT ACC CAG ACA CCA AAA CAC CTG GTC ATG GGA ATG ACA AAT AAG AAG 143 Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Val Met Gly Met Thr Asn Lys Lys
25 30 35
TCT TTG AAA TGT GAA CAA CAT ATG GGG CAC AGG GCT ATG TAT TGG TAC 191 Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Met Gly His Arg Ala Met Tyr Trp Tyr
40 45 50
AAG CAG AAA GCT AAG AAG CCA CCG GAG CTC ATG TTT GTC TAC AGC TAT 239 Lys Gln Lys Ala Lys Lys Pro Pro Glu Leu Met Phe Val Tyr Ser Tyr 55 60 65 70
GAG AAA CTC TCT ATA AAT GAA AGT GTG CCA AGT CGC TTC TCA CCT GAA 287 Glu Lys Leu Ser Ile Asn Glu Ser Val Pro Ser Arg Phe Ser Pro Glu
75 80 85"
TGC CCC AAC AGC TCT CTC TTA AAC CTT CAC CTA CAC GCC CTG CAG CCA 335 Cys Pro Asn Ser Ser Leu Leu Asn Leu His Leu His Ala Leu Gln Pro
90 95 100
GAA GAC TCA GCC CTG TAT CTC TGC GCC AGC AGC 368
Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser
105 110 XX - INFORMATION POUR SEQ ID N° 19
CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES
TYPE : nucléotide et sa protéine corres- pondante
LONGUEUR : 432 paires de bases
NOMBRE DE BRINS : simple
CONFIGURATION : linéaire
TYPE DE MOLECULE : ADNc pour ARNm
ORIGINE
ORGANISME : humain
LIGNEE CELLULAIRE : lymphocytes T humains
CARACTERISTIQUES
NOM DE L 'ADN : IGR b 20
SEQUENCE Vβ 9
DESCRIPTION DE LA SEQUENCE
ACCTCTCAAC GGCAGTGAAA CCACAGCCTA GTCCTCTCAC 40
CACTGCAGAC CAGAATCCTG CCCTGGGCCT TGCCTCGTCT CCCTCACTCT GCC ATG 96
MET
1
GGC TGC AGG CTC CTC TGC TGT GTG GTC TTC TGC CTC CTC CAA GCA GGT 144 Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Val Val Phe Cys Lou Lou Gln Ala Gly
5 10 15
CCC TTG GAC ACA GCT GTT TCC CAG ACT CCA AAA TAC CTG GTC ACA CAG 192 Pro Leu Asp Thr Ala Val Ser Gln Thr Pro Lyn Tyr Lou Val Thr Gln
20 25 30
ATG GGA AAC GAC AAG TCC ATT AAA TGT GAA CAA AAT CTG GGC CAT GAT 240 Met Gly Asn Asp Lys Ser Ile Lys Cys Glu Gln Asn Leu Gly His Asp
35 40 45
ACT ATG TAT TGG TAT AAA CAG GAC TCT AAG AAA TTT CTG AAG ATA ATG 288 Thr Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Asp Ser Lys Lys Phe Leu Lys Ile Met 50 55 60 65
TTT AGC TAC AAT AAT AAG GAG CTC ATT ATA AAT GAA ACA GTT CCA AAT 336 Phe Ser Tyr Asn Asn Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Thr Val Pro Asn
70 75 80
CGC TTC TCA CCT AAA TCT CCA GAC AAA GCT CAC TTA AAT CTT CAC ATC 384 Arg Phe Ser Pro Lys Ser Pro Asp Lys Ala His Leu Asn Leu His Ile
85 90 95
AAT TCC CTG GAG CTT GGT GAC TCT GCT GTG TAT TTC TGT GCC AGC AGC 432 Asn Ser Leu Glu Leu Gly Asp ser Ala Val Tyr Phe cys Ala Ser Ser
100 105 110 XXI - INFORMATION POUR SEQ ID N° 20 à 24 OLIGONUCLEOTIDES
SEQ ID N° 20 5'-TATCTGGAGTCATTGAGGGCGGGC SEQ ID N° 21 5'-GCATGCGCGCGGCCGCGGAGG-14C
SEQ ID N° 22 5'-TGTGGCCAGGCATGCCAGTGTGGCC
SEQ ID N° 23 5'-GGTGTGGGAGAATTCTGCTTCTGA
SEQ ID N° 24 5'-TCTGCTTCTGATGGCTCAA.
Figure imgf000058_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes β des récepteurs des lymphocytes T humains, correspondant à des ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vβ correspondant à l'une des séquences SEQ ID Nº 2 à 19,
et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides.
2. Séquences selon la revendication 1 codant pour des régions variables des chaînes β des récepteurs des lymphocytes T humains, correspondant à des ADNc comprenant des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vβ correspondant à l'une des séquences SEQ ID Nº 2 à 5,
et les séquences qui en diffèrent par un ou plusieurs nucléotides.
3. Séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes β des récepteurs des lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments Vβ correspondant à l'une des séquences SEQ ID N° 2 à 5,
et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.
4. Séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes β des récepteurs des lymphocytes T humains correspondant à des ADNc correspondant à l'une des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments V/3 correspondant à l'une des séquences SEQ ID Nº 6 à 15, les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides et les fragments de celles-ci.
5. Séquences nucléotidiques selon la revendication 4 dans laquelle les fragments des séquences correspondent à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments V β correspondant à l'une des séquences
1 à 155 de SEQ ID N° 8
l à 125 de SEQ ID N° 9
1 à 111 de SEQ ID N° 10
et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.
6. Séquences nucléotidiques codant pour des régions variables de chaînes des récepteurs des lymphocytes T humain correspondant à des ADNc correspondant à tout ou partie des séquences nucléotidiques choisies parmi l'un quelconque des segments V/3 correspondant à l'une des séquences
l à 195 de SEQ ID N° 16
l à 99 de SEQ ID N° 17
1 à 113 de SEQ ID N° 18
1 à 186 de SEQ ID N° 19
et les séquences qui en diffèrent par un ou deux nucléotides.
7. Peptides codés par l'une quelconque des séquences nucléotidiques telles que définies à l'une quelconque des revendications 1 à 6, ainsi que les allèles et les dérivés de ceux-ci qui possèdent la même fonction.
8. Vecteurs d'expression comprenant une séquence d'ADN codant pour l'un des peptides tel que défini à la revendication 7.
9. Hôtes transformés avec un vecteur selon la revendication 8.
10. Anticorps dirigés contre un déterminant antigénique d'un des peptides définis à la revendication 7.
11. Anticorps selon la revendication 10 qui est un anticorps monoclonal ou un fragment de celui-ci.
12. Fragment Fab, Fab1 ou F(ab')2 d'un anticorps monoclonal selon la revendication 11 et dérivés de celui-ci.
13. Dérivés d'un anticorps monoclonal ou d'un fragment de celui-ci selon la revendication 11 ou
12 auxquels sont liés un marqueur détectable et/ou au moins une molécule thérapeutique.
14. Hybridomes produisant un anticorps selon la revendication 11.
15. Composition de diagnostic comprenant un ou plusieurs anticorps monoclonaux, fragments ou dérivés de ceux-ci tels que définis à l'une quelconque des revendications 11 à 13.
16. Composition thérapeutique comprenant un ou plusieurs anticorps monoclonaux, fragments ou dérivés de ceux-ci tels que définis à l'une des revendications 11 à 13.
17. Composition selon la revendication 16 comprenant des dérivés contenant une molécule cytotoxique ou un radioisotope.
18. Composition thérapeutique comprenant au moins l'un des peptides définis à la revendication 7.
19. Composition thérapeutique comprenant des oligonucléo tides antisens correspondant à l'une quelconque des séquences d'un segment Vβ telles que définies à l'une quelconque des revendications 3 à 6.
20. Utilisation, en tant qu'amorces pour l'amplification d'ADN, de séquences nucléotidiques d'environ au moins 17 nucléotides comprises dans l'une quelconque des séquences d'u segment Vβ telles que définies à l'une quelconque des revendications 3 à 6.
21. Utilisation, en tant que sonde de détection, de séquences nucléotidiques d'environ au moins 10 nucléotides comprises dans l'une quelconque des séquences d'un segment Vβ telles que définies à l'une quelconque des revendications 3 à 6.
22. Oligonucléotides, utilisables comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à des régions variables de chaînes β des récepteurs de cellules T, choisis parmi les séquences SEQ ID N° 25 à 48.
23. Utilisation, comme amorces pour l'amplification d'ADN correspondant à des régions variables de chaînes des
récepteurs des cellules T, d'oligonucléotides selon la
revendication 22.
24. Utilisation selon la revendication 23, d' oligonucléotides choisis parmi les séquences SEQ ID N° 45, 46, 47 et 48.
25. Procédé de détection de séquences nucléotidiques codant pour des segments V/3 des récepteurs T ou d'ADNc correspondant aux produits de transcription de celles-ci, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend :
a) l'amplification de l'ADN avec au moins une paire d'amorces formée par l'un des oligonucléotides selon la revendication 22 et un oligonucléotide appartenant au segment Cβ , et
b) la détection des séquences amplifiées avec une sonde Cβ .
26. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'on effectue l'amplification en présence d'une paire d'amorces contrôle et la détection à l'aide d•une sonde contrôle.
27. Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il comprend : a) au moins un oligonucléotide selon la revendication 22,
b) une amorce Cβ,
c) une sonde Cβ .
28. Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il comprend : a) au moins un oligonucléotide selon la revendication 22, b) une amorce Cβ ,
c) une paire d'amorces contrôle,
d) une sonde Cβ ,
e) une sonde contrôle.
29. Kit selon la revendication 28 ou la revendication 29, comprenant :
a) l'ensemble des 24 oligonucléotides selon la revendication 22,
b) une amorce Cβ choisie parmi les séquences correspondant aux séquences SEQ ID 49 et 50,
c) une paire d'amorces contrôle pour la β-actine ayant une séquence correspondant respectivement aux séquences SEQ ID N° 52 et 53,
d) une sonde Cβ correspondant à la séquence SEQ ID N° 51, e) une sonde contrôle pour la β-actine correspondant à la séquence SEQ ID N° 54.
30. Hybridomes RO-73 et JU-74 produisant des anticorps monoclonaux anti V/313 déposés à la CNCM le 12 février 1992 sous les n°s I-1172 et I-1173.
31. Anticorps monoclonaux anti Vβ13 produit par les hybridomes selon la revendication 30.
PCT/FR1992/000130 1991-02-12 1992-02-12 SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR DES REGIONS VARIABLES DE CHAINES β DES RECEPTEURS DES LYMPHOCYTES T HUMAINS, SEGMENTS PEPTIDIQUES CORRESPONDANTS ET LES APPLICATIONS DIAGNOSTIQUES ET THERAPEUTIQUES Ceased WO1992013950A2 (fr)

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