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WO1992007062A1 - Reacteur bio-catalyse, et procede de traitement correspondant, applicables notamment a la transformation malolactique du vin - Google Patents

Reacteur bio-catalyse, et procede de traitement correspondant, applicables notamment a la transformation malolactique du vin Download PDF

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WO1992007062A1
WO1992007062A1 PCT/FR1991/000802 FR9100802W WO9207062A1 WO 1992007062 A1 WO1992007062 A1 WO 1992007062A1 FR 9100802 W FR9100802 W FR 9100802W WO 9207062 A1 WO9207062 A1 WO 9207062A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzymatic
circuit
enzyme
membrane
substrate
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR1991/000802
Other languages
English (en)
Inventor
Bernadette Festaz Furet
Jean-Claude Healy
Canh Tran-Minh
Hervé VAILLANT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
FONDATION RHONE-ALPES FUTUR
Original Assignee
FONDATION RHONE-ALPES FUTUR
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by FONDATION RHONE-ALPES FUTUR filed Critical FONDATION RHONE-ALPES FUTUR
Publication of WO1992007062A1 publication Critical patent/WO1992007062A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12H—PASTEURISATION, STERILISATION, PRESERVATION, PURIFICATION, CLARIFICATION OR AGEING OF ALCOHOLIC BEVERAGES; METHODS FOR ALTERING THE ALCOHOL CONTENT OF FERMENTED SOLUTIONS OR ALCOHOLIC BEVERAGES
    • C12H1/00—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages
    • C12H1/003—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages by a biochemical process
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
    • C12G1/02—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation
    • C12G1/0203—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation by microbiological or enzymatic treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/18—Apparatus specially designed for the use of free, immobilized or carrier-bound enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/18—External loop; Means for reintroduction of fermented biomass or liquid percolate

Definitions

  • Bio-catalyzed reactor and corresponding treatment process, applicable in particular to the malolactic transformation of wine
  • the present invention relates to a reactor for the treatment of a material, by the biocatalysed chemical transformation of a substrate contained in the material to be treated, as well as a method for carrying out this treatment, which can be implemented in particular by this reactor.
  • chemical transformation of a substrate is meant any reaction, in one or more stages, leading to the formation of at least one product different from the substrate, the substrate being a molecule in solution or in suspension in the material to be treated, which can be a synthetic, biological medium, such as a body fluid, or food.
  • Such a chemical transformation can be carried out both to obtain, after isolation or simple evaporation of the solvent, only the transformation product from a substrate, as well as to obtain the transformation product in admixture with the treated material.
  • biocatalysed chemical transformation any chemical reaction activated by a biological catalyst, that is to say an enzyme.
  • a certain number of enzymes need cofactors and / or coenzymes to exert their catalytic action; also generally speaking of chemical transformation catalyzed by an “enzymatic system", the latter comprising the enzyme or enzymes specific to this transformation, and the necessary cofactors, and coenzymes.
  • the present invention relates more particularly to a reactor for the treatment of a material comprising a substrate as defined above, comprising an enclosure and at least one semipermeable membrane disposed in this enclosure, separating the latter into at least two compartments, one said primary, and the other said secondary, two circuits associated with said enclosure, respectively incorporating said primary compartment and said secondary compartment, one of said circuits called enzymatic being assigned to the retention of the "enzymatic system", with circulation of a medium liquid in said circuit, and the other of said said treatment circuits being assigned to the circulation of the material to be treated, the transfer of the substrate at least, from one compartment to the other, being effected by diffusion through the membrane.
  • Organs, (1984) 8, 161-166 describe a reactor and a process implemented by this reactor, for treating blood.
  • This treatment is a detoxification which consists of the biocatalysed chemical transformation of toxic phenolic substrates, of the blood into glucuronylated products.
  • the specific "enzymatic system" of this chemical transformation includes uridine-5'-phosphate-glucuronyltransferase called UDP-glucuronyltransferase, and its coenzyme, 5'-diphosphoglucuronic acid (UDPGA).
  • This reactor comprises an enclosure and a tubular membrane disposed in this enclosure, in the form of a plurality of hollow fibers, of polypropylene material, separating in said enclosure two primary and secondary compartments, respectively, outside the hollow fibers, and inside the hollow fibers.
  • the external primary circuit is assigned to the circulation of the "enzymatic system", in an aqueous medium
  • the internal secondary circuit is assigned to the circulation of the material to be treated, namely the blood.
  • the semi-permeable membrane is previously treated with a lipid phase, which fills the pores of said membrane, so as to obtain a selective passage of the hydrophobic molecules through the membrane, from the treatment circuit to the enzymatic circuit and from the enzymatic circuit to the circuit. treatment.
  • the toxic phenolic substrate in the blood is hydrophobic. It diffuses, from the treatment circuit to the enzymatic circuit, through the membrane, undergoes its chemical transformation, namely a glucuronidation catalyzed by the "enzymatic system", to lead to a glucuronide.
  • the glucuronide formed is hydrophilic, and therefore remains in the enzymatic circuit.
  • Such a reactor therefore makes it possible to carry out the extracorporeal detoxification of the blood, by transformation of the toxic substrate in the form of glucuronylated products, the latter being separated and eliminated from the treated blood.
  • Such a reactor has the advantage of being able to keep the "enzymatic system", namely the enzyme and the coenzyme, in free circulation in the enzymatic circuit, without risk of diffusion through the membrane, since they are hydrophilic molecules and , therefore, to benefit from a high yield for biocatalysed chemical transformation.
  • the reactor comprises a semi-permeable tubular membrane, made of polyamide material, defining an internal compartment belonging to the circuit for processing the raw material, namely ethanol, and on the internal wall of which the enzyme is grafted on the one hand. and on the other hand the coenzyme.
  • the coenzyme is indirectly grafted onto the membrane, by means of a flexible molecular arm or chain, allowing it to access the active center of the enzyme, during chemical transformation.
  • This reactor makes it possible to carry out a catalytic chemical transformation of a substrate, and to recover the product obtained with a high yield, and without step of isolating the product, from the fraction of the "enzymatic system".
  • the same internal circuit brings together the "enzymatic system", the substrate to be transformed and the transformation product, and, under these conditions, the enzyme can be rapidly inhibited by the transformation product.
  • the latter often turns out to be an inhibitor of the enzyme by remaining linked to it, and thus masking its active site.
  • Such a reactor therefore presents a risk of inactivation of the enzyme or of considerable reduction of the enzymatic activity, because of the transformation products, but also of the inhibitors present in the material to be treated, next to the substrate.
  • Such a reactor can also work at a pH, namely that of the material to be treated, very different from the optimum pH zone for the catalytic activity of the "enzymatic system", which can considerably slow down the chemical transformation of the substrate.
  • the latter By applying an overpressure in the compartment where the substrate circulates, the latter is entrained towards the enzymatic compartment, where it is transformed, while the contaminants of the substrate do not pass through the membrane.
  • the object of the present invention is to remedy the drawbacks described above.
  • a first object of the present invention relates to a reactor or treatment process, with semi-permeable membrane and "enzymatic system", making it possible to treat any raw material, incorporating an appropriate substrate, without the hydrophilic / hydrophobic, lipophilic / substrate lipophobes and chemical transformation product.
  • a second object of the present invention relates to a reactor or treatment process, of the type defined above, making it possible, during the chemical transformation, to reintegrate the product or products into the treated material.
  • a third object of the present invention also relates to a reactor as defined above, allowing optimum activity of the "enzymatic system”.
  • the semi-permeable membrane does not have any more specific hydrophilic / hydrophobic or lipophilic / lipophobic character with respect to the substrate than with respect to the transformation product, and allows a transfer of the latter at least, in opposite direction to the transfer of the substrate; in other words, with a membrane according to the invention the diffusion through the latter is essentially subject to the laws of dialysis.
  • the enzyme or coenzyme of the "enzymatic system” can be grafted chemically, directly or indirectly, on the membrane, on the face of the latter, in relation to the enzymatic circuit.
  • the enzyme and / or the coenzyme of the "enzymatic system” can remain free in the liquid medium of the enzymatic circuit.
  • the present invention also relates to a process for the continuous treatment of a material comprising a substrate which can be chemically transformed into at least one product, comprising: - have in an enzyme circuit an "enzymatic system" for catalysis of said chemical transformation of the substrate, comprising at least one enzyme and one coenzyme,
  • the invention finds a very particular application in the treatment of edible juices containing malic acid, in particular a wine or cider having undergone alcoholic fermentation, and corresponding to the later stage of malolactic fermentation.
  • edible juice any material or substance of vegetable origin which can be consumed or ingested in the liquid state, comprising malic acid to be transformed into lactic acid; This definition notably highlights wines, ciders, aperitifs, sweet wines and other drinks of the same type.
  • This treatment of edible juices, and of wine in particular, consists in chemically transforming, by decarboxylation, the malic acid contained in wine into lactic acid. This chemical transformation is catalyzed by the following "enzymatic system":
  • a malolactic enzyme nicotinamide-adenine-dinucleotide (NAD), and metal ions type Mn, Co, Mg, Zn, Ni.
  • NAD nicotinamide-adenine-dinucleotide
  • the interest of this malolactic stage lies in the deacidification and in the gustatory improvement of the wine which results from it, and as long as it did not take place, the wine cannot be bottled. At present, it takes place spontaneously, under the influence of the bacterial flora naturally present in wine, at the end of alcoholic fermentation, the bacteria responsible for malolactic fermentation being the lactic acid bacteria in wine, namely Leuconostoc, Pediococcus and Lactobacillus.
  • the present invention can be applied to fermentation, or more exactly to the malolactic transformation of wine or cider, in the following manner:
  • the "enzymatic system” comprises a malolactic enzyme, obtained and purified from a culture of Leuconostoc oenos bacteria or other lactic acid bacteria, in general, and NAD (nicotinamide-adenine-dinucleotide) as coenzyme, or a derivative of NAD,
  • the pH of the liquid medium in the enzymatic circuit is adjusted to a value situated in the pH activity zone of optimum activity of the "enzymatic system",
  • the enzymatic circuit and the treatment circuit are arranged co-current.
  • the present invention then provides a decisive solution to the problems specifically posed by malolactic fermentation, and not resolved to date by more or less complex systems, with immobilized bacteria.
  • the invention firstly provides a bio-catalyzed reactor, in the sense of a continuous treatment system in which the wine enters with malic acid, and leaves with lactic acid.
  • the invention then provides a natural malolactic treatment, that is to say without the addition of specific chemical products or additives, which preserves the biochemical integrity of the wine.
  • the reactor according to the invention makes it possible to continuously process a wine which has undergone alcoholic fermentation, comprising malic acid to be chemically transformed into lactic acid.
  • This reactor generally comprises:
  • a circuit 14 called treatment assigned to the circulation of the wine to be treated, incorporating the primary compartment 6 outside the fibers hollow 3, previously defined; outside the enclosure 1, this circuit includes an exchanger 1 5 allowing the wine to be brought to an optimum treatment temperature, and a filter 16 at the inlet of the reactor, allowing if necessary to filter the wine to be treated; it will also be observed that the treatment circuit 14 and the enzymatic circuit 8 are co-current with each other, so as to more easily maintain a substantially zero transmembrane pressure, between the enzymatic circuit and the circuit of treatment.
  • the "enzymatic system" selected for the malolactic transformation consists of a malolactic enzyme, obtained and purified from a culture of Leuconostoc oenos bacteria, and NAD (nicotinamide-adenine-dinucleotide).
  • This system can be chemically grafted onto the membrane 2, and more precisely onto the inner face of the hollow fibers 3, in relation to the enzymatic circuit 8.
  • This grafting is obtained in the traditional way, by appropriate chemical treatments of the polymeric material of the fibers 3, as described in the following document: MA MAZID and KJ LAIDLER, Biotechnol. Bioeng. (1982) 24, 2087-2097, the content of which is incorporated into the present description, as necessary.
  • a derivative of the coenzyme NAD namely N 6 [(6-aminohexyl) carbamoylmethyl] - NAD is fixed on the internal face of the hollow fibers 3, in the presence of 1-cyclohexyl-3 (2-morpholinoethyl) -carbodiimide metho-p-toluene sulfonate (CMC), and thus comprises a flexible arm allowing access of the enzyme by the coenzyme.
  • CMC 1-cyclohexyl-3 (2-morpholinoethyl) -carbodiimide metho-p-toluene sulfonate
  • the semi-permeable membrane has no hydrophilic / hydrophobic and lipophilic / lipophobic character more specific vis-à-vis malic acid than vis-à-vis lactic acid, so that the passage of the substrate to be transformed (malic acid) from the outside to the inside of the hollow fibers 3, and the passage of the reaction product (lactic acid) from the inside to the outside of the hollow fibers 3, is essentially governed by the traditional laws of dialysis.
  • this has a diffusion coefficient of the substrate to be transformed, and a diffusion coefficient of the transformation product, through the membrane, substantially of the same order, and at least equal. at 10 -7 cm 2 / s.
  • the cut-off threshold of this membrane is sufficient for the retention of the malolactic enzyme whose PM is around 132,000 according to P. NAOURI, P.
  • the reactor described above makes it possible to continuously process a wine introduced through the inlet 17 of the reactor, and discharged in the treated state through the outlet 18 of the same reactor.
  • This process generally consists of:
  • the enzymatic circuit incorporates the primary compartment external to the hollow fibers 3, whereby an enzyme and / or a coenzyme of the "enzymatic system" described above, is grafted or not on the external surface of the hollow fibers; and the treatment circuit incorporates the internal secondary compartment with hollow fibers 3,
  • the semi-permeable membrane 3 is flat, and arranged from one end to another of the enclosure 1, so as to delimit in the latter two flattened compartments, in place of the tubular compartments described above.
  • the enzyme of the "enzymatic system” is dissolved or suspended in the liquid medium of the enzymatic circuit, and the coenzyme of the same system is grafted on the enzyme itself,
  • the coenzyme is grafted onto a flexible arm, itself grafted onto the membrane, while the enzyme is dissolved or suspended in the liquid medium of the enzymatic circuit.
  • the enzyme and / or coenzyme are free in the liquid medium of the enzymatic circuit.
  • This reaction is catalyzed by the malolactic enzyme present in certain lactic acid bacteria in wine, of the genera Le ⁇ conostoc, Lactobacillus, and Pediococcus.
  • a partially purified malolactic enzyme is obtained from the bacterium Leuconostoc oenos, according to the following general scheme:
  • a partially purified enzyme is thus obtained, the molecular weight of which can be estimated at approximately 130,000 Daltons, used for the rest of the experiments.
  • the enclosure 1 with hollow fibers 3 constitutes a semi-permeable membrane module having the following characteristics:
  • each fiber 215 ⁇ m - length of each fiber: 115 mm
  • the various products circulate continuously and in a closed circuit, inside the reactor, at a flow rate of 10 ml / h, except for rinses for which the products circulate in open circuit, at a flow rate of 200 ml / h
  • the reactor efficiency is firstly tested with a material to be treated, of the synthetic medium type, comprising the substrate to be transformed, and the manganese cofactor, according to the following composition:
  • This medium circulates in the treatment circuit (14) with a flow of
  • Phosphate buffer pH 6 circulates in the enzymatic circuit of the reactor at a flow rate of 8 ml / h.
  • NAD was chemically grafted onto the hollow polyamide fibers, according to the grafting technique described by Mazid and Laidler; under these conditions, only the enzyme (300 units) circulates freely in the enzymatic circuit, where it is retained.
  • This reactor is then tested under the preceding conditions, directly with wine at pH 3 and containing 13 mM of malic acid. We thus obtain a consumption of 25% of the available malic acid, converted with a yield of 60% into lactic acid, for a flow rate of 2.8 ml / h in the treatment circuit.
  • a reactor comprising a flat semi-permeable membrane, delimiting a treatment compartment and an enzymatic compartment in which the malolactic enzyme and the NAD circulate freely.
  • the membrane is cellulosic and its cutoff threshold is
  • the pH of this wine is regulated to pH 6.

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Abstract

Réacteur pour le traitement en continu d'une matière comportant un substrat transformable chimiquement en au moins un produit, et procédé pouvant être mis en oeuvre par ce réacteur. Le réacteur comprend une enceinte (1) et au moins une membrane semi-perméable (2) disposée dans l'enceinte (1), séparant cette dernière en au moins deux compartiments, l'un dit primaire (6) et l'autre dit secondaire (7), ladite membrane (2) comprenant un matériau greffable chimiquement, deux circuits associés à ladite enceinte, incorporant respectivement undit compartiment primaire et undit compartiment secondaire, l'un des circuits (8) dit enzymatique étant affecté à la rétention d'un "système enzymatique" de catalyse de la transformation chimique du substrat, comprenant au moins un enzyme et un coenzyme, avec circulation d'un milieu liquide dans ledit circuit, et l'autre des circuits (14) dit de traitement étant affecté à la circulation de la matière à traiter. La membrane semi-perméable (2) est électriquement neutre vis-à-vis du substrat et du produit, permettant leur transfert respectif d'un compartiment à l'autre. Réacteur et procédé notamment mis en oeuvre pour la fermentation malolactique de jus alimentaire tel que le vin et le cidre.

Description

Réacteur bio-catalysé, et procédé de traitement correspondant, applicables notamment à la transformation malolactique du vin
La présente invention concerne un réacteur pour le traitement d'une matière, par la transformation chimique biocatalysée d'un substrat contenu dans la matière à traiter, ainsi qu'un procédé pour réaliser ce traitement, pouvant être mis en oeuvre notamment par ce réacteur.
Par transformation chimique d'un substrat, on entend toute réaction, en une ou plusieurs étapes, conduisant à la formation d'au moins un produit différent du substrat, le substrat étant une molécule en solution ou en suspension dans la matière à traiter, qui peut être un milieu synthétique, biologique, tel qu'un fluide corporel, ou alimentaire.
Une telle transformation chimique peut aussi bien être conduite pour obtenir, après isolement ou simple évaporation du solvant, seulement le produit de transformation d'un substrat, que pour obtenir le produit de transformation en mélange avec la matière traitée.
Par transformation chimique biocatalysée, on entend toute réaction chimique activée par un catalyseur biologique, c'est-à-dire un enzyme. Un certain nombre d'enzymes ont besoin de cofacteurs et/ou de coenzymes, pour exercer leur action cataly tique; aussi de manière générale on parlera de transformation chimique catalysée par un "système enzymatique", ce dernier comportant l'enzyme ou les enzymes spécifiques de cette transformation, et les cofacteurs nécessaires, et les coenzymes.
La présente invention concerne plus particulièrement un réacteur pour le traitement d'une matière comportant un substrat tel que défini précédemment, comprenant une enceinte et au moins une membrane semiperméable disposée dans cette enceinte, séparant cette dernière en au moins deux compartiments, l'un dit primaire, et l'autre dit secondaire, deux circuits associés à ladite enceinte, incorporant respectivement undit compartiment primaire et undit compartiment secondaire, l'un desdits circuits dit enzymatique étant affecté à la rétention du "système enzymatique", avec circulation d'un milieu liquide dans ledit circuit, et l'autre desdits circuits dit de traitement étant affecté à la circulation de la matière à traiter, le transfert du substrat au moins, d'un compartiment à l'autre, s'effectuant par diffusion au travers de la membrane.
Les travaux de G. BRUNNER et F. TEGTMEIER publiés dans Artificial
Organs, (1984) 8, 161-166 décrivent un réacteur et un procédé mis en oeuvre par ce réacteur, pour traiter du sang. Ce traitement est une détoxification qui consiste en la transformation chimique biocatalysée des substrats toxiques de type phénolique, du sang en produits glucuronylés. Le "système enzymatique" spécifique de cette transformation chimique comprend l'uridine- 5'-phosphate-glucuronyltransférase dite UDP-glucuronyltransférase, et son coenzyme, l'acide 5'-diphosphoglucuronique (UDPGA). Ce réacteur comprend une enceinte et une membrane tubulaire disposée dans cette enceinte, sous la forme d'une pluralité de fibres creuses, en matériau polypropylène, séparant dans ladite enceinte deux compartiments primaire et secondaire, respectivement, à l'extérieur des fibres creuses, et à l'intérieur des fibres creuses. Le circuit primaire extérieur est affecté à la circulation du "système enzymatique", en milieu aqueux, le circuit secondaire intérieur est affecté à la circulation de la matière à traiter, à savoir le sang. La membrane semi-perméable est préalablement traitée par une phase lipidique, qui emplit les pores de ladite membrane, de manière à obtenir un passage sélectif des molécules hydrophobes au travers de la membrane, du circuit de traitement au circuit enzymatique et du circuit enzymatique au circuit de 'traitement. Le substrat phénolique toxique contenu dans le sang est hydrophobe. Il diffuse, du circuit de traitement au circuit enzymatique, au travers de la membrane, subit sa transformation chimique, à savoir une glucuronidation catalysée par le "système enzymatique", pour conduire à un glucuronide. Le glucuronide formé est hydrophile, et par conséquent demeure dans le circuit enzymatique.
Un tel réacteur permet donc de réaliser la détoxification extra-corporelle du sang, par transformation du substrat toxique sous forme de produits glucuronylés, ces derniers étant séparés et éliminés du sang traité.
Un tel réacteur présente l'avantage de pouvoir conserver le "système enzymatique", à savoir l'enzyme et le coenzyme, en libre circulation dans le circuit enzymatique, sans risque de diffusion au travers de la membrane, puisque ce sont des molécules hydrophiles et, par conséquent, de bénéficier d'un rendement élevé pour la transformation chimique biocatalysée.
Cependant, la diffusion au travers de la membrane de ce réacteur est liée à la solubilité des molécules dans la phase lipidique imprégnant la membrane, et l'emploi d'un tel réacteur apparaît limité à des matières particulières.
D'autre part, il ne permet pas de réaliser la transformation chimique biocatalysée de substrats hydrophiles ou lipophobes, et, dans le cas où le substrat est hydrophobe, il ne permet pas de récupérer par passage en sens inverse dans la membrane semi-perméable le produit de transformation dans la matière traitée, si ledit produit est hydrophile.
Les travaux de M. A. MAZID et de K.J. LAIDLER, publiés dans Biotechnology and Bioengineering (1982) 24, 2087-2097, concernent aussi la transformation chimique d'un substrat, catalysée par un "système enzymatique", dans un réacteur, et plus particulièrement la déshydrogénation de l'éthanol en acétaldéhyde, catalysée par l'alcool-déshydrogénase de levure, et son coenzyme, le nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD).
Le réacteur comprend une membrane semi-perméable tubulaire, en matériau polyamide, définissant un compartiment intérieur appartenant au circuit de traitement de la matière première, à savoir l'éthanol, et sur la paroi interne de laquelle sont greffés d'une part l'enzyme et d'autre part le coenzyme. Le coenzyme est indirectement greffé sur la membrane, au moyen d'un bras ou chaine moléculaire flexible, lui permettant d'accéder au centre actif de l'enzyme, au cours de la transformation chimique.
Le circuit intérieur de la membrane tubulaire est ainsi affecté, et au
"système enzymatique" fixé sur ladite membrane, et à la circulation de la matière à traiter, qui est dans ce cas le substrat lui-même, à savoir l'éthanol. Le produit de transformation est recueilli à la sortie du tube.
Ce réacteur permet de réaliser une transformation chimique cataly tique d'un substrat, et de récupérer le produit obtenu avec un rendement élevé, et sans étape d'isolement du produit, de la fraction du "système enzymatique".
Cependant, le même circuit intérieur met en présence le "système enzymatique", le substrat à transformer et le produit de transformation, et, dans ces conditions, l'enzyme peut être rapidement inhibé par le produit de transformation. Ce dernier s'avère souvent être un inhibiteur de l'enzyme en y restant lié, et en masquant ainsi son site actif.
Un tel réacteur présente donc un risque d'inactivation de l'enzyme ou de diminution considérable de l'activité enzymatique, à cause des produits de transformation, mais aussi des inhibiteurs présents dans la matière à traiter, à côté du substrat. Un tel réacteur peut aussi travailler à un pH, à savoir celui de la matière à traiter, bien différent de la zone de pH optimum pour l'activité catalytique du "système enzymatique", ce qui peut ralentir considérablement la transformation chimique du substrat.
Les travaux de S.T. MATSON et J.A. QUINN publiés dans Annals of the New York Academy of Science (1986) 469, 152-165, concernent la transformation chimique biocatalysée d'un substrat dans un réacteur, ce dernier comprenant une membrane, un compartiment affecté à la circulation de la matière à traiter et un compartiment affecté au système enzymatique fixé sur la membrane.
Par application d'une surpression dans le compartiment où circule le substrat, ce dernier est entrainé vers le compartiment enzymatique, où il est transformé, alors que les contaminants du substrat ne traversent pas la membrane.
La présente invention a pour objet de remédier aux inconvénients exposés précédemment.
Un premier but de la présente invention concerne un réacteur ou procédé de traitement, avec membrane semi-perméable et "système enzymatique", permettant de traiter toute matière première, incorporant un substrat approprié, sans qu'interviennent les propriétés hydrophiles/hydrophobes, lipophiles/lipophobes du substrat et du produit de transformation chimique.
Un second but de la présente invention concerne un réacteur ou procédé de traitement, du type défini précédemment, permettant lors de la transformation chimique de réintégrer le ou les produits dans la matière traitée.
Un troisième but de la présente invention concerne aussi un réacteur tel que défini précédemment, permettant une activité optimum du "système enzymatique".
Tous ces buts peuvent être atteints par la ou les caractéristiques techniques définies ci-après, considérées isolément ou en combinaison :
1) La membrane semi-perméable ne présente aucun caractère hydrophile/hydrophobe ou lipophile/lipophobe plus spécifique vis-à-vis du substrat, que vis-à-vis du produit de transformation, et permet un transfert de ce dernier au moins, en sens inverse iu transfert du substrat ; en d'autres termes, avec une membrane selon l'invention la diffusion au travers de cette dernière est essentiellement soumise aux lois de la dialyse.
2) L'enzyme ou le coenzyme du "système enzymatique" peut être greffé chimiquement, directement ou indirectement, sur la membrane, sur la face de cette dernière, en relation avec le circuit enzymatique.
Egalement selon l'invention, l'enzyme et/ou le coenzyme du "système enzymatique" peuvent rester libres dans le milieu liquide du circuit enzymatique.
La présente invention concerne également un procédé pour le traitement en continu d'une matière comportant un substrat transformable chimiquement en au moins un produit, consistant à : - disposer dans un circuit dit enzymatique un "système enzymatique" de catalyse de ladite transformation chimique du susbstrat, comprenant au moins un enzyme et un coenzyme,
- établir dans ledit circuit enzymatique la circulation d'un milieu liquide,
- établir une circulation, dans un circuit dit de traitement, de la matière à traiter,
- séparer localement ces deux circuits par une membrane semi-perméable, permettant à la fois la diffusion au travers de ladite membrane dudit substrat, du circuit de traitement au circuit enzymatique, et la diffusion dudit produit du circuit enzymatique au circuit de traitement,
L'invention trouve une application toute particulière dans le traitement de jus alimentaires contenant de l'acide malique, notamment un vin ou du cidre ayant subi la fermentation alcoolique, et correspondant à l'étape postérieure de fermentation malolactique.
Par "jus alimentaire", on entend toute matière ou substance d'origine végétale pouvant être consommée ou ingérée à l'état liquide, comportant de l'acide malique à transformer en acide lactique ; ressortent notamment de cette définition les vins, cidres, apéritifs, vins doux et autres boissons du même type.
Ce traitement des jus alimentaires, et du vin en particulier, consiste à transformer chimiquement par décarboxylation, l'acide malique contenu dans le vin en acide lactique. Cette transformation chimique est catalysée par le "système enzymatique" suivant :
- un enzyme malolactique, nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD), et ions métalliques type Mn, Co, Mg, Zn, Ni.
L'intérêt de cette étape malolactique tient à la désacidification et à l'amélioration gustative du vin qui en résulte, et tant qu'elle n'a pas eu lieu, le vin ne peut être mis en bouteille. A l'heure actuelle, elle se déroule de manière spontanée, sous l'influence de la flore bactérienne présente naturellement dans le vin, à la fin de la fermentation alcoolique, les bactéries responsables de la fermentation malolactique étant les bactéries lactiques du vin, à savoir Leuconostoc, Pediococcus et Lactobacillus.
Les procédés couramment utilisés pour favoriser la croissance bactérienne, consistent à modérer le sulfitage de la vendange, à contrôler la température ou à effectuer une désacidification chimique. Cependant, le déclenchement de la fermentation malolactique reste toujours aléatoire et, depuis une décennie, il se développe des procédés d 'immobilisation de bactéries lactiques.
L'application de tels procédés à la fermentation malolactique soulève des problèmes liés aux risques de contamination des bactéries, liés à une perte rapide de l'activité malolactique des bactéries, et liés aux risques de relarguage de produits indésirables dans le vin.
La présente invention, telle que définie précédemment, peut être appliquée à la fermentation, ou plus exactement à la transformation malolactique du vin ou du cidre, de la manière suivante :
- le "système enzymatique" comprend un enzyme malolactique, obtenu et purifié à partir d'une culture de bactéries Leuconostoc oenos ou d'autres bactéries lactiques, en général, et du NAD (nicotinamide-adénine-dinucléotide) à titre de coenzyme, ou un dérivé du NAD,
- le milieu liquide du circuit enzymatique est obtenu à partir du vin traité,
- le pH du milieu liquide dans le circuit enzymatique est ajusté à une valeur située dans la zone de pH d'activité optimum du "système enzymatique",
- la pression transmembranaire entre le circuit enzymatique et le circuit de traitement est substantiellement nulle,
- on contrôle la température des deux circuits à une valeur optimum pour l'activité du "système enzymatique",
- le circuit enzymatique et le circuit de traitement sont disposés à co-courant.
La présente invention apporte alors une solution déterminante aux problèmes spécifiquement posés par la fermentation malolactique, et non résolus à ce jour par des systèmes plus ou moins complexes, à bactéries immobilisées.
L'invention apporte tout d'abord un réacteur bio-catalysé, au sens d'un système de traitement continu dans lequel le vin entre avec de l'acide malique, et sort avec de l'acide lactique.
L'invention apporte ensuite un traitement malolactique naturel, c'est- à-dire sans adjonction de produits ou additifs chimiques particuliers, ce qui préserve l'intégrité biochimique du vin.
On peut observer qu'à ce jour, si le "système enzymatique" malolactique a été décrit dans la littérature, il n'a jamais été envisagé de le fixer sur un support, par exemple une membrane ; cf : P. CUENAT et J.C. VILLETTAZ, Revue Suisse Vitic. Arboric. Hortic, (1984) 16 (3) 145-151, et P. CHAGNAUD Thèse (1989), Université de Montpellier,
d'une part en raison de son pH d'activité optimum, de l'ordre de 6, très éloigné de celui du vin, en général de l'ordre de 3,3, et d'autre part en raison de l'instabilité du NAD en milieu acide.
La présente invention est maintenant décrite dans le cadre de la transformation malolactique du vin, et par référence au dessin annexé, représentant selon la figure 1, de manière schématique, un réacteur conforme à l'invention.
Le réacteur selon l'invention permet de traiter en continu un vin ayant subi la fermentation alcoolique, comportant de l'acide malique à transformer chimiquement en acide lactique.
Ce réacteur comprend de manière générale :
- une enceinte 1, formée par un tube cylindrique fermé à ses deux extrémités
- une membrane semi-perméable 2 disposée dans ladite enceinte, formée par une multiplicité de fibres creuses 3, ayant chacune une forme tubulaire ; les fibres 3 s'étendent en parallèle, d'une extrémité à l'autre de l'enceinte 1, d'un distributeur 4 à un collecteur 5 ; ces fibres délimitent donc dans l'enceinte 1, un compartiment primaire 6, délimité à l'extérieur des fibres 3 par le tube 1, et un compartiment secondaire 7 intérieur aux fibres 3, communiquant à une extrémité avec le distributeur 4, et à l'autre extrémité avec le collecteur 5 ; le matériau constitutif des fibres creuses 3, et donc de la membrane semi-perméable est un polymère greffable chimiquement, par exemple un polyamide
- un circuit 8 associé à l'enceinte 1, dit enzymatique, incorporant le compartiment secondaire 7 intérieur aux fibres 3, pour la rétention du "système enzymatique" de catalyse défini ci-après ; à l'extérieur de l'enceinte 1, ce circuit comprend un conduit 9 reliant le collecteur 5 au distributeur 4, par l'intermédiaire d'un pot de dégazage 10, lui-même comportant un orifice 11 de dégazage et une résistance 12 de chauffage, et par l'intermédiaire d'une pompe 13 ; ce circuit enzymatique permet une circulation d'un milieu liquide, constitué au démarrage du réacteur par une fraction prélevée sur le vin traité, dont le pH a été amené à une valeur optimum, par exemple aux environs de 6
- un circuit 14 dit de traitement, affecté à la circulation du vin à traiter, incorporant le compartiment primaire 6 extérieur aux fibres creuses 3, défini précédemment ; à l'extérieur de l'enceinte 1, ce circuit comporte un échangeur 1 5 permettant de porter le vin à une température optimum de traitement, et un filtre 16 à l'entrée du réacteur, permettant si nécessaire de filtrer le vin à traitrer ; on observera par ailleurs que le circuit de traitement 14 et le circuit enzymatique 8 sont à co-courant l'un de l'autre, de manière à maintenir plus facilement une pression transmembra- naire substantiellement nulle, entre le circuit enzymatique et le circuit de traitement.
Le "système enzymatique" retenu pour la transformation malolactique consiste en un enzyme malolactique, obtenu et purifié à partir d'une culture de bactéries Leuconostoc oenos, et du NAD (nicotinamide-adénine-dinucléotide).
Ce système peut être greffé chimiquement, sur la membrane 2, et plus précisément sur la face intérieure des fibres creuses 3, en relation avec le circuit enzymatique 8. Ce greffage est obtenu de manière traditionnelle, par des traitements chimiques appropriés du matériau polymère des fibres 3, tels que décrits dans le document suivant : M.A. MAZID et K.J. LAIDLER, Biotechnol. Bioeng. (1982) 24, 2087-2097, dont le contenu est incorporé à la présente description, en tant que de besoin. Selon cette technique antérieure, un dérivé du coenzyme NAD, à savoir le N6[ (6-aminohexyl)carbamoylméthyl] - NAD est fixé sur la face interne des fibres creuses 3, en présence du 1-cyclohexyl-3(2-morpholinoéthyl)-carbodiimide métho-p-toluène sulfonate (CMC), et comprend ainsi un bras flexible permettant l'accès de l'enzyme par le coenzyme.
Par ailleurs, comme déjà dit plus haut, la membrane semi-perméable ne présente aucun caractère hydrophile/hydrophobe et lipophile/lipophobe plus spécifique vis-à-vis de l'acide malique que vis-à-vis de l'acide lactique, de telle sorte que le passage du substrat à transformer (acide malique) de l'extérieur à l'intérieur des fibres creuses 3, et le passage du produit de réaction (acide lactique) de l'intérieur vers l'extérieur des fibres creuses 3, est régi pour l'essentiel par les lois traditionnelles de la dialyse.
S'agissant de la membrane constitutive des fibres creuses 3, celle-ci présente un coefficient de diffusion du substrat à transformer, et un coefficient de diffusion du produit de transformation, au travers de la membrane, sensiblement du même ordre, et au moins égaux à 10-7 cm2/s. Le seuil de coupure de cette membrane est suffisant pour la rétention de l'enzyme malolactique dont le PM est de l'ordre de 132 000 selon P. NAOURI, P.
CHAGNAUD, A. ARNAUD et P. GALZY, J. Basic Microbiol. (1990) 30, 577-52,5.
Le réacteur décrit précédemment permet de traiter en continu un vin introduit par l'entrée 17 du réacteur, et évacué à l'état traité par la sortie 18 du même réacteur. Ce procédé consiste de manière générale à :
- disposer dans le circuit enzymatique 8 le "système enzymatique" identifié précédemment,
- établir dans ce circuit 8 la circulation d'un milieu liquide, à savoir une fraction prélevée sur le vin traité, dont le pH a été amené à une valeur optimum, par exemple aux environs de 6,
- établir une circulation du vin à traiter dans le circuit de traitement 14,
- séparer localement ces deux circuits par la membrane semi-perméable 2, permettant au travers des fibres 3, d'une part la diffusion de l'acide malique, de l'extérieur vers l'intérieur, et d'autre part la diffusion de l'acide lactique, en sens inverse, de l'intérieur vers l'extérieur des fibres 3.
Le mode d'exécution décrit précédemment peut être modifié selon les variantes suivantes :
- le circuit enzymatique incorpore le compartiment primaire extérieur aux fibres creuses 3, moyennant quoi un enzyme et/ou un coenzyme du "système enzymatique" décrit précédemment, est greffé ou non sur la surface externe des fibres creuses ; et le circuit de traitement incorpore le compartiment secondaire intérieur aux fibres creuses 3,
- la membrane semi-perméable 3 est plane, et disposée d'une extrémité à une autre de l'enceinte 1, de manière à délimiter dans cette dernière deux compartiments aplatis, en lieu et place des compartiments tubulaires décrits précédemment.
- seul l'enzyme du "système enzymatique" est greffé sur la membrane 3, et alors le coenzyme du même système est greffé sur un polymère, dissous ou en suspension dans le milieu liquide du circuit enzymatique, et de taille macromoléculaire supérieure au seuil de coupure de la membrane 3,
- l'enzyme du "système enzymatique" est dissous ou en suspension dans le milieu liquide du circuit enzymatique, et le coenzyme du même système est greffé sur l'enzyme lui-même,
- le coenzyme est greffé sur un bras flexible, lui-même greffé sur la membrane, alors que l'enzyme est dissous ou en suspension dans le milieu liquide du circuit enzymatique. - l'enzyme et/ou le coenzyme sont libres dans le milieu liquide du circuit enzymatique.
La présente invention est maintenant décrite au plan expérimental par référence à la transformation malolactique du vin selon le schéma réactionnel suivant :
COOH-CH2-CHOH-COOH CH3-CHOH-COOH
Acide L-malique Acide L-lactique
Figure imgf000012_0001
Cette réaction est catalysée par l'enzyme malolactique présent dans certaines bactéries lactiques du vin, des genres Leυconostoc, Lactobacillus, et Pediococcus.
EXEMPLE 1
Un enzyme malolactique partiellement purifié est obtenu à partir de la bactérie Leuconostoc oenos, selon le schéma général suivant :
1) Culture bactérienne de Leuconostoc oenos, selon le protocole décrit par F. RADLER et K. BROHL (1984), The metabolism of several carboxylic acids by lactic acid bacteria, Z. Lebensm. Unters Forsch. 179, 228-231, publication dont le contenu est incorporé à la présente description, en tant que de besoin.
2) Après récolte des bactéries, obtention et purification par chromatographie sur gel de l'enzyme, selon le protocole décrit par Lonvaud-Funel A. et Stasser de Saad A.M., 1982, Purification and properties of a malolactic enzyme from a strain of Leuconostoc meseteroîdes isolated from grapes, Appl. Environ. Microbiol., 43(2), 357-361, publication dont le contenu est incorporé à la présente description, en tant que de besoin.
On obtient ainsi un enzyme partiellement purifié, dont le poids moléculaire peut être évalue environ à 130 000 Daltons, utilisé pour la suite des expériences.
On utilise ensuite un réacteur tel que décrit précédemment par référence à la Figure 1, dont l'enceinte 1 avec des fibres creuses 3 constitue un module de membrane semi-perméable présentant les caractéristiques suivantes :
- 2 100 fibres creuses de polyamide représentant une surface totale de
0,16 m2
- diamètre interne de chaque fibre : 215 μm - longueur de chaque fibre : 115 mm
- volume interne du module : 8,8 ml
- volume externe du module : 20 ml
A l'intérieur des fibres creuses, 300 unités de l'enzyme partiellement purifié tel qu'obtenu précédemment et du NAD ont été fixés sur les fibres de polyamide, respectivement selon la méthode schématisée ci-après.
Cette technique de fixation a été décrite par Mazid M. A., Laidler K.J., Kinetics of yeast alcohol dehydrogenase and its coenzyme coimmobilized in a tubular flow reactor, Biotechnol. Bioeng, (1982) 24, 2087-2097, dont le contenu est incorporé à la présente invention en tant que de besoin.
-CO- NH-(CH2)n-CO-NH-(CH2)n-CO -NH-
POLYAMIDE
. CO-NH
Figure imgf000013_0010
Figure imgf000013_0009
H+/H2O Hydrolyse
partielle
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0008
Figure imgf000013_0007
N6[(6-aminohexyl)-carbamoylméthyl]-NAD 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl) NH2-(CH2)6-NH-CO-CH2-NAD carbodiimide métho-p-toiuène sulfonate
Figure imgf000013_0002
CMC
CO-NH-(CH2)6-NH-CO-CH2-NAD
Figure imgf000013_0012
Figure imgf000013_0006
CHO-(CH2)3-CHO Glutaraldéhyde CO-NH-(CH2)6-NH-CO-CH2-NAD
Figure imgf000013_0003
CHO-(CH2)3-CH- N
Figure imgf000013_0005
Enzyme -NH 2
Figure imgf000013_0004
CO-NH-(CH2)6-NH-CO-CH2-NAD
Figure imgf000013_0011
E-N=CH-(CH2)3-CH-N Après une hydrolyse acide des brins de polyamide, qui libère des fonctions COO- et NH3 +, on fixe sur la fonction COO- un dérivé du NAD : le N6[(6-aminohexyl)carbamoylmethyl]NAD, en présence de CMC. Puis par l'intermédiaire du glutaraidéhyde, on fixe l'enzyme sur les fonctions aminé libres.
A cette fin, on utilise le mode opératoire suivant :
- pour chaque étape, les différents produits circulent en continu et en circuit fermé, à l'intérieur du réacteur, à un débit de 10 ml/h, sauf pour les rinçages pour lesquels les produits circulent en circuit ouvert, à un débit de 200 ml/h
- hydrolyse HCL 2N, 23h
- rinçage à l'eau distillée, 1h
- 50 mg de dérivé NAD + 290 mg de CMC dans 17 ml d'eau distillée, pH 5, 21 h
- rinçage à l'eau distillée, 1h
- glutaraidéhyde 12,5 % dans du tampon borate 0,2 M, pH 8,5, 2h
- rinçage en tampon phosphate 0,1 M, pH 6, 20 mn
- enzyme malolactique : 15 ml correspondant à 300 unités au total, 90h à 4°C
- rinçage en tampon phosphate 0,1 M, pH 6, 17h à 4°C, à un débit de 10 ml/h
Avec le réacteur tel qu'obtenu précédemment, et conforme à la figure 1, on procède alors au plan d'expérience suivant.
L'efficacité du réacteur est tout d'abord testée avec une matière à traiter, du type milieu synthétique, comportant le substrat à transformer, et le cofacteur manganèse, selon la composition suivante :
- acide L-malique
- MnCl2
- tampon phosphate pH 6 : 0,05 M
Ce milieu circule dans le circuit de traitement (14) avec un débit de
1,9 ml/h. Du tampon phosphate pH 6 circule dans le circuit enzymatique du réacteur à un débit de 8 ml/h.
En collectant différentes fractions à la sortie du réacteur, et en procédant à un dosage en acide malique et en acide lactique sur les fractions recueillies, on constate que :
- il existe une bonne correspondance entre la quantité d'acide malique disparu et la quantité d'acide lactique apparu, le second se situant en dessous du premier, sans doute en raison de la rétention de l'acide lactique dans le réacteur, ce qui tend à inhiber la réaction,
- le rendement en acide lactique apparu par rapport à l'acide malique disparu, s'établit en moyenne à 60 %.
L'efficacité du réacteur est ensuite testée avec du vin, à savoir du Gaillac blanc, n'ayant pas subi la fermentation malolactique, contenant
11 mM d'acide malique, et dont le pH est de 3. Ce vin circule dans le circuit de traitement du réacteur. Une partie du même vin est prélevée pour le circuit enzymatique, et amenée à pH 6 avec de la soude.
Toujours avec la même méthode expérimentale que précédemment, on constate que :
- la consommation d'acide malique est d'environ 10 % et reste stable,
- cependant, l'acide lactique obtenu a tendance à rester à l'intérieur du réacteur.
EXEMPLE 2
On a ensuite utilisé un réacteur selon Fig. 1, mais dont seulement le
NAD a été greffé chimiquement sur les fibres creuses en polyamide, selon la technique de greffage décrite par Mazid et Laidler ; dans ces conditions, seul l'enzyme (300 unités) circule librement dans le circuit enzymatique, où il est retenu.
Ce réacteur est ensuite expérimenté dans les conditions précédentes, directement avec du vin à pH 3 et contenant 13 mM d'acide malique. On obtient ainsi une consommation de 25 % de l'acide malique disponible, converti avec un rendement de 60 % en acide lactique, pour un débit de 2,8 ml/h dans le circuit de traitement.
Cette expérience met en évidence l'amélioration de l'efficacité du réacteur, quand l'enzyme circule librement dans le circuit enzymatique.
EXEMPLE 3
On utilise un réacteur comprenant une membrane semi-perméable plane, délimitant un compartiment de traitement et un compartiment enzymatique dans lequel circulent librement l'enzyme malolactique et le NAD.
La membrane utilisée présente les caractéristiques suivantes :
- la membrane est cellulosique et son seuil de coupure est de
10 000 Daltons
- longueur de la membrane :12 cm
- largeur de la membrane : 7 cm
soit une surface de 84 cm2 - volume du compartiment enzymatique : 4 ml
- volume du compartiment matière à traiter : 4 ml.
Du vin (pH 3,3), contenant 8 mM d'acide malique, circule dans le circuit de traitement à un débit de 24 ml/h. On constate que le pH du vin traité demeure stable pendant tout le traitement, à - 0,1 unité pH.
Un volume de 20 ml de ce même vin ajusté à pH 6 par de la soude, contenant en solution 5 U/ml d'enzyme malolactique, obtenu tel que décrit précédemment, et 0,45 mM de NAD, recircule dans le circuit enzymatique à un débit de 12 ml/h. Le pH de ce vin est régulé à pH 6.
Avec la même méthode expérimentale que précédemment, on constate que :
- 9 % de l'acide malique est consommé
- il est transformé à 100 % en acide lactique dont 70 % est restitué au vin et 30 % reste dans le circuit enzymatique.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Réacteur pour le traitement en continu d'une matière comportant un substrat transformable chimiquement en au moins un produit, comprenant une enceinte (1) et au moins une membrane (3) semi-perméable disposée dans ladite enceinte, séparant cette dernière en au moins deux compartiments (6,7), l'un dit primaire et l'autre dit secondaire, deux circuits (8) (14,18) associés à ladite enceinte, incorporant respectivement undit compartiment primaire et undit compartiment secondaire, l'un (8) des circuits dit enzymatique étant affecté à la rétention d'un "système enzymatique" de catalyse de la transformation chimique du substrat, comprenant au moins un enzyme et un coenzyme, avec circulation d'un milieu liquide dans ledit circuit, et l'autre (14,18) des circuits dit de traitement étant affecté à la circulation de la matière à traiter, le transfert du substrat au moins, d'un compartiment à l'autre, s'effectuant par diffusion au travers de la membrane, caractérisé en ce que la membrane semi-perméable ne présente aucun caractère hydrophile/hydrophobe et/ou lipophile/lipophobe plus spécifique vis-à-vis du substrat que vis-à-vis du produit, en permettant également un transfert du produit au moins, en sens inverse du transfert du substrat.
2 - Réacteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que la membrane semi-perméable présente un coefficient de diffusion du substrat, et un coefficient de diffusion du produit, sensiblement du même ordre.
3 - Réacteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que les coefficients de diffusion du substrat et du produit respectivement, au travers de la membrane semi-perméabie sont au moins égaux à 10-7 cm2/s.
4 - Réacteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que le seuil de coupure de la membrane semi-perméable est inférieur au poids moléculaire de l'enzyme du système enzymatique.
5 - Réacteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins l'enzyme ou le coenzyme du "système enzymatique" est greffé chimiquement, directement ou indirectement, sur la membrane, sur la face de cette dernière en relation avec le circuit enzymatique.
6 - Réacteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'enzyme du "système enzymatique" est greffé sur la membrane, et le coenzyme du "système enzymatique" est greffé sur un polymère dissous ou en suspension dans le milieu liquide du circuit enzymatique, et de taille macromoléculaire supérieure au seuil de coupure de la membrane.
7 - Réacteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'enzyme du "système enzymatique" est dissous ou en suspension dans le milieu liquide du circuit enzymatique, et le coenzyme dudit "système enzymatique" est greffé chimiquement sur la membrane.
8 - Réacteur selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'enzyme du "système enzymatique" est dissous ou en suspension dans le milieu liquide du circuit enzymatique, et le coenzyme dudit "système enzymatique" est greffé sur l'enzyme lui-même.
9 - Réacteur selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que le coenzyme est greffé sur un bras flexible, lui-même greffé sur la membrane ou sur l'enzyme lui-même.
10 - Réacteur selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme ou le coefficient du système enzymatique est libre dans le milieu liquide du circuit enzymatique.
11 - Réacteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est affecté à la transformation malolactique de jus alimentaires contenant de l'acide malique, le "système enzymatique" comprenant un enzyme malolactique purifié à partir d'une culture de
Bactéries Leuconostoc oenos ou d'autres bactéries lactiques, et le coenzyme du nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD), ou un dérivé.
12 - Réacteur selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est affecté à la transformation malolactique d'un vin ayant subi la fermentation alcoolique.
13 - Réacteur selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est affecté à la transformation malolactique de cidre ayant subi la fermentation alcoolique.
14 - Réacteur selon les revendications 9 et 11, caractérisé en ce qu'un dérivé du NAD, à savoir le N6 [(6-aminohexyl)carbamoylméthyl]-NAD est greffé sur la membrane en présence de 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl)- carbodiimide métho-p-toluène sulfonate (CMC).
15 - Procédé pour le traitement en continu d'une matière comportant un substrat transformable chimiquement en au moins un produit, consistant à :
- disposer dans un circuit dit enzymatique un "système enzymatique" de catalyse de ladite transformation chimique du substrat, comprenant au moins un enzyme et un coenzyme,
- établir dans ledit circuit enzymatique la circulation d'un milieu liquide, - établir une circulation dans un circuit dit de traitement, de la matière à traiter,
caractérisé en ce qu 'on sépare localement ces deux circuits par une membrane semi-perméable, permettant à la fois la diffusion au travers de ladite membrane dudit substrat, du circuit de traitement au circuit enzymatique et la diffusion dudit produit obtenu, du circuit enzymatique au circuit de traitement.
16 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le milieu liquide est obtenu par prélèvement sur la matière à traiter.
17 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on ajuste le pH du milieu liquide aqueux du circuit enzymatique à une valeur située dans la zone de pH d'activité optimum du "système enzymatique".
18 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la pression transmembranaire entre le circuit enzymatique et le circuit de traitement est substantiellement nulle.
19 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on contrôle la température des deux circuits.
20 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le circuit enzymatique et le circuit de traitement sont à co-courant.
21 - Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'on traite un jus alimentaire contenant de l'acide malique, l'enzyme du "système enzymatique" étant un enzyme malolactique, et le coenzyme, le nicotinamide- adénine-dinucléotide (NAD).
22 - Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'on traite un vin ou un cidre ayant subi la fermentation alcoolique.
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