WO1992006377A1

WO1992006377A1 - Method and kit for immunoassay of propeptide of osteocalcin and proosteocalcin

Info

Publication number: WO1992006377A1
Application number: PCT/JP1991/001330
Authority: WO
Inventors: Kenji Hosoda; Hitomi Honda; Takaharu Kubota; Tadakatsu Nakamoto
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1990-10-04
Filing date: 1991-10-03
Publication date: 1992-04-16
Anticipated expiration: 1993-04-04
Also published as: CA2070433A1; JPH05232109A; EP0504423A1; EP0504423A4

Description

明細書発明の名称

ォステオカルシンのプロべプチド、プロォステオカルシンを免疫学的に測定するための方法およびキット

発明の詳細な説明

産業上の利用分野

本発明は、検査試料中のォステオカルシンのプロべプチドまたはプロォステオカルシン或いはその両者を免疫学的に測定する方法およびそのためのキットに関する。さらに詳しくは本発明は検査試料中のォステオカルシンのプロぺプチドまたはプロォステオカルシンを選択的に且つ高感度で測定するための方法およびキッ卜に関し、さらに検査試料中のォステオカルシンのプロべプチドおよびプロォステオカルシンの合計量を測定するための方法およびキッ卜に関する。

本明細書において、下記用語はそれぞれについて説明された意味として定義されるものとする。

( a ) ォステオカルシンのプロペプチド：

骨芽細胞内においてォステオカルシンのァミノ酸配列のァミノ末端側（5 ' 側）に位置するプロペプチド配列（ヒトォステオ力ルシンの場合は 2 6個のァミノ酸配列よりなる）

( b ) プロォステオカルシン：

前記プロべプチドおよびォステオカルシンより構成されるアミノ酸配列（ヒトォステオカルシンの場合は、プロペプチドに基づく 2 6個のァミノ酸配列およびォステオカルシンに基づく 4 9個のアミノ酸配列より構成される）

( C ) ォステオカルシン：

ォステオカルシンのァミノ酸配列（ヒトォステオカルシンの場合は 4 9個のァミノ酸配列よりなる）

( d ) プレブロォステオカルシン：

プレペプチド、プロペプチドおよびォステオカルシンより構成されるアミノ酸配列（前記プロォステオカルシンのァミノ末端側 ( 5 ' 側）にプレペプチドが結合したアミノ酸配列；ヒトプレブロォステオカルシンの場合は、プレぺプチドに基づく 2 3個のァミノ酸配列、プロペプチドに基づく 2 6個のアミノ酸配列およびォステオカルシンに基づく 4 9個のァミノ酸配列より構成される）従来の技術

ォステオカルシン（別名、 bone gla protein ( B G P ) ) は、骨のビタミン K依存性のカルシウム結合性タンパクである。その分子量は 5 , 8 0 0であり 4 9のアミノ酸残基により構成されている。このタンパクは、ォステオブラスト（骨芽球）から産生され、骨の非コラーゲンタンパクの構成成分の約 2 0 %を占めている。このタンパクにはァ一 carbox yglutamic acid residues があり、ノヽィドロキシァノヽ。タイトと強いァフィニティがあり、それゆえに骨マトリックス形成に重要な役割を有しているものと推定されている。

このォステオカルシンは、ニヮトリと牛の骨から見出されたのが最初であるが（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3925 (1975) 、同 73， 14 47 (1976) ) その他、人を含めて（J. B. 255, 8685 (1980) ) 種々の動物の骨から見出されており、その構造の類似性が言われている。ォステオカルシンは、骨芽細胞内では、 ①分泌機能を有するプレぺプチド配列、 ②ァ— carboxylase との結合部位であるプロペプチド配列、および③ G 1 a蛋白である成熱ォステオカルシン配列のこの順序からなる 3つの部分から構成される m _ R N Aの構造を有する。 m— R N Aは、リボゾームにおいて、ォステオカルシン前駆体であるプレブロォステオカルシン蛋白によまれ、プレペプチド配列が切断された後、ォステオ力ルシン前駆体であるプロォステオカルシンは、ゴルジ体において y -ca rboxylase と、プロペプチド部分において結合し、 G l a化された後、ぺプチダーゼにより、プロぺプチドとォステオカルシンが切りはなされ、プロぺプチドは細胞内で分解され、ォステオカルシンが主として分泌されるものと考えられている。

このォステオカルシンのプロペプチド配列に関しては、 A. J. Celeste らがプレブロォステオカルシンの c D N A配列、アミノ酸配列（EMBO J. ^ 1885-1890 (1986) ) を報告している。

発明が解決しょうとする課題

1 9 9 0年 7月 2 0曰に開催された日本骨代謝学会において、笠井らはォステオカルシンのプロぺプチドを、固定抗原を用いた競合法により測定する方法を発表しているが、そのプロぺブチドの測定値は成人が高くしかも年令と正の相関を示している。しかしこの発表された測定結果は、一般に骨形成能は年令と共に低下することを考え合せると、この—" 一力一（プロペプチド）が骨形成能を示すという推測と矛盾しているこの矛盾が発生する理由として、その測定系が不完全なものであるこがあげられる。その不完全な理由の 1つは使用した抗体の特異性が低いこと、他の理由の 1つは使用した測定系の特異性が低いことが考えられる。

上記プロぺプチドの測定系において、競合法を用いている理由としては、このような小べプチド蛋白（アミノ酸 2 6ケ、分子量約 3 , 0 0 0 ) はサンドイッチ法で測定するには余りにも測定対象物質が小さすぎて大きな抗体（分子量約 1 5万）を使用してサンドイッチ法により測定するのは一般的に困難であると予想したからと思われる。

従来、骨形成の状態の指標となりうるォステオカルシンのプロぺプチドの、特異性、定量性および再現性の高い免疫学的測定法は未だ提供されていない。またォステオカルシンのプロぺプチドのみならずプロォステオカルシンの免疫学的な高感度の測定法についても同様に提供されていない。

一般に検査試料中のォステオカルシンのプロべプチド或いはプロォステオカルシンは極めて僅かな量であり（例えばプロぺプチドは約 2 0〜約 3 0 ng) 、それらの量を特異的且つ定量的に測定するには、極めて感度の優れた測定系を必要とする。

そこで本発明の第 1の目的は、検査試料中のォステオカルシンのプロぺプチドを、サンドイッチ法による免疫学的な測定手段で特異的に測定するための方法並びにキットを提供することにある。

本発明の第 2の目的は、検査試料中のプロォステオカルシンを、サンドイッチ法による免疫学的な測定手段で、特異的に測定するための方法並びにキットを提供することにある。

本発明の第 3の目的は、検査試料中のォステオカルシンのプロぺプチドおよびプロォステオカルシンの合計量を、競合法による免疫学的な測定手段で、特異的に測定するための方法並びにキットを提供することにある。

本発明の他の目的は、前記した免疫学的な測定結果に基づいて、骨形成の状態の診断法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記した免疫学的な測定手段において、定量性および再現性の優れた、高感度の測定方法並びにキットを提供すごめる。

本発明のさらに他の目的は、前記種々の測定方法に使用されるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、以下の説明より一層明らかとなるであろフ ⁰

課題を解決するための手段

本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的および利点は、基本的に下記方法 I、方法 π、および方法 Iffによって達成されることが見出された。また本発明によればこれら方法に対応する、それぞれのキッ卜が提供される。

方法 I ：

検査試料中のォステオカルシンのプロべプチドをサンドイッチ法により免疫学的に測定する方法において、不溶性担体に結合した抗体（第 1 抗体）及び標識化した抗体（第 2抗体）としてォステオカルシンのプロぺプチドを特異的認識する抗体を使用することを特徴とする方法。

この方法 Iによれば、検査試料中のォステオカルシンのプロべプチドを特異的に測定でき、プロォステオカルシンは認識されず測定されないことが特徴である。

かくしてこの方法によれば、小さいペプチドであるォステオカルシンのプロべプチド（ヒト .プロぺプチドの場合は 2 6個のァミノ酸配列を有する）が抗体、殊に同じポリクローナル抗体を使用して高感度で測定しうることおよびプロォステオカルシンを認識しないで測定されることは全く驚くべきことである。この方法 Iにおいてこのプロォステオカルシンはその分子中にプロペプチド配列が含有されているにも拘らず、プロォステオカルシンは認識されなかった。ォステオカルシンのプロぺプチドが特異的に測定される理由は明確でないが、恐らくプロォステオ力ルシン中のォステオカルシンが 2抗体を用いたサンドイッチの形成を阻害しているためと思われる。

この方法 Iは、ォステオカルシンのプロペプチドが特異的に且つ高感度で測定できるので、そのプロべプチドの濃度を調べることによって骨形成の状態を診断することが可能となる。

方法 n ：

検査試料中のプロォステオカルシンをサンドイッチ法により免疫学的に測定する方法において、不溶性担体に結合した抗体（第 1抗体）及び標識化した抗体（第 2抗体）のいずれか一方の抗体がォステオカルシンのプロぺプチドを特異的に認識する抗体であり、他方の抗体がォステオカルシンを特異的に認識する抗体であることを特徴とする方法。

この方法 πによれば、検査試料中のプロォステオカルシンを特異的に測定できる。この方法 Πによればォステオカルシンのプロべプチドは測定されない。

方法 ΙΠ：

検査試料中のォステオカルシンのプロぺプチド及びプロォステオカルシンの合計量を競合法により免疫学的に測定する方法において、不溶性担体に結合する抗体として、ォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識する抗体を使用することを特徴とする方法。

この方法 mによれば、検査試料中のォステオカルシンのプロべプチドおよびプロォステオカルシンの合計量が測定される。つまり検査試料中のォステオカルシンの全プロぺプチド量が測定される。

また本発明によれば、上記方法 I、方法 πおよび方法 mに使用される下記抗体が提供される。

( i ) ヒト，ォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識するポリクロ一ナル抗体。

( ϋ ) ヒト ·ォステオカルシンのプロぺプチドのァミノ酸配列における

1 4位から 2 6位までの配列を特異的に認識するポリクローナル抗体 ο

( m ) ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドのァミノ酸配列における

1位〜 1 3位までの配列を特異的に認識するポリクローナル抗体。 (ή ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドのァミノ酸配列における 1 4位〜 2 6位を特異的に認識するモノクロ一ナル抗体。

このモノクローナル抗体は、後述するハイプリドーマ 3 F 9または 4 Ε 1 2から産生されるものを使用することができる。

次に前記方法 I、方法 πおよび方法 mにおいて使用されるォステオ力ルシンのプロべプチドを特異的に認識する抗体の調製法について説明する。具体的には、ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識する抗体について説明するが、ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチド以外、すなわちヒト以外のラット、マウス或いは犬のォステオカルシンのプロべプチドについても同様の方法で抗体を調製することができる。 1) ヒト ·ォステオカルシンのプロぺプチドの合成（抗原の作成）合成については AB I社ペプチド合成機を用いて下記式 [I] で表わされるヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドを合成した。

H₂N— L y s -P r o-S e r -G l y - A 1 a-G l u-S e r- S e r -L y s -A 1 a-Ph e-Va 1 - S e r - L y s - C 1 n - G 1 u-G 1 y-S e r一 G l u - V a 1 -V a 1 -Ly s -A r g- P r o-A r g-A r g-COOH ··· [I]

以下、このべプチドの名称を "0 s t p r o— 26" と略称する。

2) 免疫原の作成

0 s t p r o— 26の免疫源との作成は、以下の 3通りが考えられる。 ① P VPなどの合成高分子との物理化学的混合、 ②キャリア蛋白（KL H又は BSA等）との化学結合、 ③リポソ一ム、菌体等の particle との結合（吸着又は化学結合）がある。

3) 免疫方法（抗体の作成）

上記にて調製した免疫源を動物（羊、山羊、兎、ラット、マウス、トリ、等）に免疫する。免疫はフロイント完全アジエバントゃ、フロイント不完全アジュバント、 A 1 (0H)₃ 等があげられる。抗体価上昇後、抗体を含んだ血清を採取し、抗体を精製する。かくしてヒト ·ォステオカルシンのプロペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体（以下この抗体を "a p— 26" と略称することがある）。

また上記 1) 〜3) と同様にして、ヒト，ォステオカルシンのプロべプチドの N末端 13残基（H₂N—Ly s— P r o— S e r—G l y— A 1 a-G l u-S e r-S e r-Ly s -A l a-Ph e-V a 1 - S e r-) および C末端 13残基（Ly s— G i n— G l u— G l y— S e r - G 1 u - V a 1 - V a 1 -Ly s-Ar g-P r o-Ar g- A r g-CC OH) のそれぞれを合成し、これらに対するポリクローナル抗体を得た。上記 N末端 13残基のぺプチドに対するポリクローナル抗体を "a pN— 13" と略称し、また C末端 13残基のぺプチドに対するポリクローナル抗体を "apC— 13" と略称する。

さらに、前記ヒト ·ォステオカルンのプロぺプチドの C末端 13残基のペプチド（14位〜 26位のアミノ酸配列）に対するモノクローナル抗体はケラーおよびミルシュタイン (Keller and Milstein) の方法に準じて調製された。すなわち C末端 13残基のぺプチドの KLHコンジュゲートを BalbZC mouse に免疫し、抗体産生クローンとしてハイプリドーマ 3 F 9および 4 E 12を選別した。これらが産生する抗体は、いずれも I g G 1であった。これらのモノクローナル抗体をそれぞれ "M-3 F 9" および "M— 4E12" と略称する。

以下本発明における免疫学的な測定方法およびそのためのキットについてさらに具体的に説明する。

前記した方法 I、方法 Πおよび方法 ΠΙにおいて、測定に使用される検査試料としては、ォステオカルシンのプロペプチド、プロォステオカルシン或いはこれらの両方を含有しているかまたは含有していることが予測される試料であればよく、例えばヒト或いは動物の体液であるが、一般には体液たとえば血清、血漿、尿または骨由来の組織たとえば骨芽細胞、骨細胞の培養液或いは培養層そのものであるのが好ましい。特に血清が最もよく利用される。さらに遺伝子組み換え技術によって得られた前記プロべプチド、プロォステオカルシンを含有する培養液或いはその処理物であってもよい。前記方法 Iにおいて、不溶性担体に結合した抗体（第 1抗体）および標識化した抗体（第 2抗体）として、ォステオカルシンのプロペプチドを特異的に認識する抗体が使用される。この場合（i)該第 1抗体および該第 2抗体がいずれもォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体（a p— 26) であるか、（ii)

該第 1抗体及び該第 2抗体のいずれか一方がォステオカルシンのプロペプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体（ap— 26) であり、他方が、ォステオカルシンのプロべプチドのァミノ酸配列の 14位から 26位を特異的に認識するポリクローナル抗体（apC— 13) またはモノクローナル抗体であるのが好ましい。

—方前記方法 Πにおいて、第 1抗体または第 2抗体のいずれかの抗体として使用されるォステオカルシンのプロぺプチドを特異的に認識する抗体としては、ポリクローナル抗体（ap— 26、 a pN— 13または a p C- 13) を使用するのが好ましく、特に a p— 26または a p C 一 13が好ましい。この方法 Πにおいて使用されるォステオカルシンを特異的に認識する抗体としてはポリクローナル抗体であるか或いはォステオカルシンの N末端 20個のアミノ酸配列領域または C末端の 14個のァミノ酸配列領域を特異的に認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるのが好ましい。後者の 2つのポリクローナル抗体は PCT出願（PC TZJ P90 00155) の実施例 1および 2に記載された方法によって調製することができる。

前記方法 Iおよび方法 πは、通常サンドイッチ法と称される免疫学的な測定方法であり、第 1抗体および第 2抗体として前述した抗体を選択する以外、それ自体公知の方法を使用することができる。例えば「酵素免疫測定法」 [第 2版、石川栄治他著、医学書院（1 9 8 2 ) ] に記載されている方法が挙げられる。

以下、検査試料中に含まれる抗原が、ヒト ·ォステオカルシンのプロペプチドである場合（方法 I ) について説明するが、方法 Πについても方法自体は同様であるので詳細は省略する。

サンドイッチ法による免疫学的な測定法では、ヒト ·ォステオカルシンのプロペプチドに対する一方の抗体（第 1抗体）を適当な不溶性担体 (例えばプラスチック容器）に固定化する（以下これを "固相抗体" という）。ついで必要な場合には不溶性担体と測定しょうとする試薬又は検査試料との非特異的結合を避けるために適当な物質（例えば牛血清ァルブミン）で不溶性担体の表面を被覆する。

このようにして得られた第 1抗体が固定化された不溶性担体を検査試料と一定時間及び温度で接触させ反応させる。この間に固相抗体（第 1 抗体）と検査試料中のヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドを含む抗原が結合する。ついで適当な洗浄液で洗った後、適当な標識物質（例えば酵素）で標識したヒト ·ォステオカルシンのプロぺプチドに対する他方の抗体（第 2抗体）の溶液（例えば水溶液）を、不溶性担体における固相抗体に結合したヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドと一定時間及び温度で接触させて、第 2抗体と反応させる。これを適当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上の固相抗体とヒト ·ォステオカルシンのプロぺプチドを介して結合して存在する第 2抗体に標識された標識物質の量を測定する。

なお上記反応は、固相抗体、標識抗体及びヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドを含有する検査試料を同時に混合し、一定時間及び温度でこれら三者を同時に接触させて反応させることもできる。

かくしてその値から検査試料中のヒト ·ォステオカルシンのプロぺプチドの量を算出することができる。

また方法 Πの競合法においては、不溶性担体における固相抗体または何らかの方法（例えば 2次抗体、架橋剤などの使用）より不溶化させうる抗体を用いて、抗原であるプロペプチドをラベル標識し、検査試料中のプロペプチドと競合させる方法を行なうことができる。 '

なお、本発明において、純品のプロペプチドをヒト血清検体に加えた際、異常高値の回収率が得られる場合があった（400〜 800%) 。この理由を検討すると、プロべプチドと血清タンパクとの強い相互作用がこの結果をもたらすことが判明した。すなわち、より認識されやすい構成に変化するものと思われる。そのため、標準物質に動物血清を 2〜 30%の範囲で加えることも、定量性の高いヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドの測定法とするために好ましい態様である。

本発明のサンドイッチ法（方法 Iおよび方法 Π) においては抗体としては I gGに限らずペプシンで消化して得られた F(a b')₂ や、 F(a b')₂ を還元して得られた F a b'、あるいは抗体をパパインで消化して得られた F a bなどの、抗原に結合する抗体フラグメントを固相抗体、また、これらに標識物質を結合させて得られる標識抗体として使用することができる。例えば、標識抗体としては F(ab')₂ が好ましい。

本発明のヒト ·ォステオカルシンのプロぺプチドの免疫学的な測定方法等に使用される不溶性担体としては、例えばポリスチレン、ポリェチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、弗素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分子、その他紙、ガラス、金属、ァガロース及びこれらの組合せなどを例示することができる。

また不溶性担体の形状としては、例えばトレィ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管などの種々の形状であることができる。本発明者らの研究によれば、本発明による前記した検査試料中のヒト · ォステオカルシンのプロべプチドの測定方法において、不溶性担体としてその表面が鏡面化された平滑性のものを使用すると粗面の担体に比べて該担体に対する検査試料中のタンパクあるいは標識抗体などの非特異的吸着反応が抑制され測定感度が向上しかつ安定性も増すことがわかつ従来、免疫学的な測定法において測定感度を高めるために、不溶性担体としては、一般的にはむしろその表面を研磨して粗面化し、表面積を多くしたものが使用されていた。しかしながら、ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドの如き検査試料中に極く微量しか含まれていない場合には表面の平滑性が増えるに従って、非特異的吸着が抑えられ、測定感度が増加するのである。

かくて不溶性担体は、その表面の中心線平均粗さ（R a ) が 1 . 5 m 以下の鏡面化された平滑表面を有するものが有利である。

中心線平均粗さ（R a ) は、粗さ曲線からその中心線の方向に測定長さリットルの部分を抜取り、この抜取り部分の中心線を X軸、縦倍率の方向を Y軸とし、粗さ曲線を y = f ( X ) で表わしたとき、次式で与えられる R aの値をミク口ン単位で表わした値を意味する。 1 , £

R a = —— I f ( x ) I d x

n ^J o この中心線平均粗さ（R a) については、 J I S B0601— 19 82 (日本）、 ANS I B46.1-1979 (USA) 及び R 46 8-1966 (I SO) に説明されている。

なお以下の本発明の実施例では、不溶性担体は東京精密（株）製の表面粗さ計サ一フコムを用いて表面粗さを測定した。

前記平滑な表面を有する不溶性担体の材質及び形状は特に制限されず、前記に説明したものが示される。特に好ましい例としてはポリスチレンビーズが挙げられる。

また、第 2抗体（標識抗体）の標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等を使用するのが有利である。酵素としては、ペルォキシダ一ゼ（HRP) 、アルカリフォスファターゼ、 /S— D—ガラクトシダーゼ、蛍光物質としてはフルォレツセインイソチオシァネ一ト、フィコピリプロテイン等、発光物質としてはイソルシノール、ルシゲニン等、そして放射性物質としては ¹²⁵ I、 ¹³¹ I、 ¹⁴C、 ³H等を用いることができるが、これらは例示したものに限らず、免疫学的測定法に使用し得るものであれば、他のものでも使用できる。

標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いられる。

酵素としてペルォキシダーゼを用いる場合には、基質として H₂0₂を用い、発色剤として 2， 2 '—アジノジ一 [3—ェチルベンズチアゾリンスルホン酸] アンモニゥム塩（ABTS) 、 5—ァミノサリチル酸、 0 一フエ二レンジァミン、 4一ァミノアンチピリン、 3， 3', 5， 5'—テトラメチルベンジジン等、酵素にアル力リフォスファターゼを用いる場合は基質として 0—二トロフエニルフォスフエ一ト等、酵素に — D— ガラクトシダ一ゼを用いる場合は基質としてフルォレセインージー（；5 — D—ガラクトビラノシド）、 4—メチルゥンベリフェリル一 3— D— ガラクトビラノシド等を用いることができる。

前記した方法 Iおよび方法 Πの免疫学的な測定方法のために使用されるキットは、前記した第 1抗体（固相抗体）および第 2抗体（標識抗体）の組合せを基本として構成される。

かくしてォステオカルシンのプロべプチドまたはプロォステオカルシンの免疫学的な測定のためのキットは

(a) 固相抗体（第 1抗体）

(b) 標識抗体（第 2抗体）

(c) 溶解剤、

(d) 洗浄剤

(e) 標準物質および

(f ) 酵素で標識化された標識抗体を使用する場合には、酵素活性を測定するための基質及び反応停止剤、

を組合せてなり、前記（a) の第 1抗体及び（b) の第 2抗体は、前述した方法 Iおよび方法 Πのそれぞれから選択される。

また本発明による前記免疫学的測定用のキットにおいて（c) 溶解剤としては、免疫学的測定に通常使用されるものであればよく、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などを含んだ PHが 6.0〜 8.0の範囲のものが好適な例として示される。さらに（d) 洗浄剤としては、同様に免疫学的測定に一般的に使用されているものがそのまま使用される。その例としては、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液及びこれらの混合液が挙げられる。これらの洗浄剤にはさらにトリトン X 1 0 0、 T w e e n 2 0または B r i g 3 5の如き非イオン系界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリゥムの如きイオン系界面活性剤を加えられてもよい。

本発明の方法 mによれば、検査試料中のォステオカルシンのプロぺプチドおよびプロォステオカルシンの合計量が高感度で測定される。この方法 ΠΙは、通常競合法と称される方法であり、方法自体は公知である。本発明の方法 fflで使用される抗体はォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識する抗体であり、前記方法 Iおよび方法 Πで説明したものを使用することができる。具体的な好ましい抗体としてはポリクローナル抗体（a p— 2 6 ) またはォステオカルシンのプロペプチドのァミノ酸配列 1位〜 1 3位を特異的に認識するポリクローナル抗体（a p N— 1 3 ) である。

この方法 ΠΙにおいて、抗体を標識化する際に使用される標識物質としては、前記した方法 Iおよび方法 nで説明したものが同じように使用される。

ォステオカルシンのプロべプチドおよびプロォステオカルシンは、いずれもヒトまたは動物種によってそのアミノ酸配列は必ずしも同じではない。従って本発明の前記方法 I、方法 IIおよび方法 fflは、それらのためのキットを含めて、検査しょうとするヒトまたは動物種によって、使用する抗体が選択される。すなわち、検査すべきヒトまたは動物種のそれぞれに対応したォステオカルシンのプロべプチドおよびプロォステオカルシンに特異的な抗体が使用される。具体的にはヒトの検査試料にはヒトのプロべプチドまたはヒ卜のプロォステオカルシンに対する抗体が使用される。本発明の免疫学的な測定は、ヒトまたは動物（特にラット、マウスまたは犬）に対して有利に適用される。

本発明者らの研究によれば、本発明によ免疫測定法において、標準物質中に動物血清、特にゥマの血清を添加すると、一層測定感度が向上することが認められた。また、本発明の免疫測定法において免疫反応を常温以下、好ましくは約 15° 以下、特に約 10て以下の温度で行なうとより好ましい結果が得られることがわかった。

以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例中の％は重量％を意味する。

実施例 1

抗体の取得；

(1)抗原の作成

(ァ）ヒト，ォステオカルシンのプロペプチドの合成

前記式 [I] に示す、ヒト，ォステオカルシンのプロペプチドを合成した。合成については、 ΑΒ Ι社、ペプチド合成機を用いた。ペプチドの名称を P r oOs t— 26とした。

(ィ）抗原（P r oOs t— 26) とキャリア蛋白との結合体の作成キーホールリンぺットへキシァニン（KLH) をキャリア蛋白とし、 KLHと P r oOs t - 26および水溶性カルボジィミドを用いた KL H-P r oO s t— 26結合体を作成した。 3時間反応後、透析し得られた生成物を抗原として用いた。

(2) 抗体の作成

KLH-P r o 0 s t - 26結合体をフロイント完全アジュバン卜によりェマルジヨンを作成し、家兎を 2週間おきに免疫した。 2回目以降は、フロイント不完全アジュバントを用いた。抗体価の上昇を確認し、全採血を行ない抗血清を E yらの方法（P. L. Ey et al， Immunochemist ry, 15, 429, 436 (1978) ) により精製した。すなわち、 0.1Mリン酸緩衝液（PH8.0) で平衡化したプロテイン A—セファロースカラム (ゲル容量 5 ) に、抗血清を流し、洗浄後 0.1Mクェン酸ナトリウム（PH3. 0) 緩衝液を用いて、カラムから I gGを精製して抗 P r 00 s t -26抗体を得た。

実施例 2

サンドイッチ法 E I Aによるヒト ·ォステオカルシンのプロぺプチドの測定；

(1) 抗体固定化ビーズの調製

鏡面のポリスチレン製ビーズ（直径 6mm) をよく洗浄してから、実施例 1で得た抗 P r o 0 s t— 26抗体の 2 の濃度を有する P B

S溶液中に 4での温度で 1昼夜放置した後、 PB Sで洗浄し、 1%牛血清アルブミン（B SA) の PBS溶液中に、 4°Cの温度で 1昼夜放置してボストコ一ティング処理をして、抗 P r 00 s t— 26抗体固定化ビーズを得た。

(2) HRP標識抗体の調製

抗 P r oO s t— 26抗体の 2.0 の P B S溶液 1 に、 1 M の^酸緩衝液（PH4.2) 100/ίβと、 40 /^のペプシンを 20«βの同緩衝液に溶解して加え、 37°C、 4時間反応させた。

反応終了後、 P B Sにて平衡化したセフアデックス G 25カラム 2cmx 45 cm) を用いて分離し F ( a b ' ) ₂ を採取した。 F(a b')₂ の 1 mg/mS. 0.01Mリン酸 0.15M Na C l (_PH 7.4 ) 溶液に、 MB S 1

チルホルムアミド溶液を添加し、 25 °Cの温度で 30分間反応させた。次いでセラデックス G— 25を充填したカラムを用い、 0.1Mリン酸緩衝液（0.1M PB) (pH6.0) でゲル濾過を行い、マレイミド化抗体と未反応 MB Sとを分離した。一方、 HRPの 1 OmgZr^の 0.1M PB (_PH6.5) 溶液 2η>βに S 一ァセチルメルカプト無水コハク酸の 6

ジメチルホルムアミド溶液 12 を加え、 25 °Cで 2時間反応させた。

次に 0.1Mトリス一塩酸緩衝液（PH7.0) を 800^、 0.1M E DTA 160 、 1Mヒドロキシルァミン 1.6>^を加え、 0°Cで 4分間反応させた。その後、反応液をコロジオンバッグに入れ、 0.1M P B (pH6.0) 、 5mM E D T A含有溶液を用いて、 4°Cで 3日間透析し、チオール化 HRPを得た。

次に、マレイミド化抗体 2mgとチオール化 HRP 4mgとを混合し、コロジオンバッグを用いて氷冷下に 4〜1 Omg/ の蛋白濃度になるまで濃縮し、 15〜20°Cで一夜放置した。その液を、ウルトロゲル Ac A44 (LKB社）を充填したカラムでゲル濾過し、 HRP標識抗 P r oO s t—26抗体 F(ab')₂ を得た。同様にして HRP標識抗 P r oOs t— 26抗体 I gGも得た。

(3) サンドイッチ E I A測定系

(1)で調製した抗？ r oO s t— 26抗体 F(a b')₂ 固定化ビーズ 1個と、精製したヒ卜 ·ォステオカルシンのプロべプチド（標準物質）を 0〜2 OngZm の範囲で含有する 1 %B S A含有 0.05M TBS (PH8.0) 200«δと（2) で作成した HRP標識抗体の 1%Β S A 含有 0.05M TBS (PH8.0) 溶液 20 とを、各試験管に添加して、 4 °Cの温度で 16時間インキュベートした。次に試験管内の溶液を吸引除去した後、 0. 05M TB S (PH8. 0) で洗浄してから、 3, 3', 5, 5'—テトラメチルベンジジン塩酸塩 0. 0 2%及び11₂0₂ 2. 5mMを含有する 0.1Mリン酸 Zクェン酸緩衝液（PH4.3) を 0.4 ずつ各試験管に加え、 2 5°Cの温度で 3 0分間反応させた後、反応停止剤として 1 N硫酸水溶液をずつ加えて酵素反応を停止させた。次いで、この溶液を分光光度計を用いて 45 Onmの波長における吸収強度を測定した。これを標準物質濃度 0〜 20 ngZm こ対応してプロットした検量線を図 1に示した。この結果から、本発明の測定方法を用いれば

で精度よく測定可能であることがわかる。

また、 111 ?標識抗？ 1" 008 t— 26抗体 F(a b')₂ と同 I gG を各々用いて測定系を構成し、標準物質濃度 [0〜6ngZn>幻に対応してプロットすることにより NZS比を算出した。結果を表 1に示した。

実施例 3

患者検体中のプロべプチドを測定するにあたって、本発明の方法が定量的な測定系であるか否かを検討するために、標準物質（合成プロぺプチド）の血清添加回収試験を行った。その結果を表 2に示す。その結果、回収率が 400〜800%と非常に大きな結果となった。その理由として、標準物質に用いている合成プロペプチドの assay buffer 内の構造と、実際のヒト血清中のプロペプチドの構造が異なることが示唆され、同時に、そのプロペプチドは、ヒト血清の何らかの成分と interaction により抗体に認識されやすい構造になることが推定される。そこで、標準物質の中に、交叉反応性のある物質を含まない血清を加えることにより、回収率が 8 0〜1 2 0 %と大巾に改善された結果を得た。その結果を表 3に示す。

表 2 ( a )

検体 1 正常成人

表 2 ( b )

検体 2 正常小児検体検体添加量実測値回収量回収率

希釈 (ng/ mi) (ng/m^) (ng/m^) (ng/m^) (¾)

0. 185 1. 300 1. 010 546

X 4 0. 290

0. 830 3. 850 3. 560 429

0. 185 1. 220 1. 070 578

8 0. 150

0. 830 4. 900 4. 750 572

0. 185 0. 980 0. 901 487

X 16 0. 079

0. 830 4. 900 4. 821 581 表 3 ( a )

検体 1 正常成人

表 3 (b )

検体 2 正常小児

実施例 4

患者検体中のヒト ·ォステオカルシンのプロぺプチドの測定；実施例 2の測定方法により、各種患者血液検体（小児、成人）を測定した。結果を図 2に示した。図のごとく、小児の骨形成不全、甲状腺機能亢進症、思春期早発症にて高値を示し、糖尿病、原因不明の低身長の —部および軟骨異栄養症で低値を示した。

なお、健常成人においては、高値の検体は認められなかった。

実施例 5

ヒト ·ォステオカルシンの N末端 20残基に対する抗体（C 1 0 n— 12F) (PCT/J P 90Z00155号を参照のこと）を固相化したものと、実施例 2において作成した HRP標識抗 0 s t P r o-26 抗体（F(a b')₂ ) を用いて実施例 2の方法に準じてサンドイッチ法による免疫学的測定を行った。

この際、標準物質としては、特願平 2— 159909号に記載された方法に従って作成した形質転換体 XL 1— B l u e F [pKOC 28] により得られた融合蛋白を用いた。その結果得られた検量線を図 3に示す。

図 3から高感度な測定系が得られたことが判る。

実施例 6

モノクローナル抗体の調製

ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチド C末端 13残基のぺプチドを合成し、このペプチドの KLHコンジュゲートを作成し、このコンジュゲートを Balb/X mouse に免疫した。ケラーおよびミルシュタインの方法に従って、抗体産生クローンとしてハイプリドーマ 3 F 9および 4 E 12を得た。これらハイプリドーマが産生するモノクローナル抗体をそれぞれ M— 3 F 9および M— 4E 12と称する。これらモノクローナル抗体のサブクラスはいずれも I gG lであった。

測定系の調製固相抗体として M— 3 F 9または M— 4 E 12を使用し、また標識抗体として実施例 1の（2) で得られたポリクローナル抗体を使用し、実施例 2に記載した方法で測定系を調製した。この測定系を用いて実施例 2の（3) に記載した方法と同様にしてヒト ·ォステオカルシンのプロペプチドを測定した。その結果を図 4に示す。この図 4からモノクロ一ナル抗体とポリクローナル抗体の組合せによっても高感度でヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドを測定できることが理解できる。'

実施例 7

ポリクローナル抗体の調製

ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドの C末端 13残基（p C— 1 3) を合成し、実施例 1記載と同様の方法に従って、ポリクロ一ナル抗体（a p C— 13) を得た。

測定系の調製

実施例 2の方法と同様にして下記 2種の測定系を調製した。

固相抗体標識抗体

(i) a p-26 a p-26

(ii) a p C- 13 a p -26

a p— 26抗体は実施例 1のものを使用した。

これら測定系を使用して、実施例 2の（3) に記載した方法と同様にしてヒト 'ォステオカルシンのプロべプチドを測定した。その結果を図 5に示す。この図 5からも本発明の方法によれば、高感度でヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドが測定できることがわかる。

実施例 8

実施例 1の（2) で得られた抗体（ap— 26) を I ¹²⁵を用いて放射能標識した。その比較性は 153万 cpm zgであった。標識抗体 1万 cpmと、ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドまたはプロォステオ力ノレシンを、濃度 0.012、 0.05、 0.2、 0.8、 3.2ng _m 加え 1時間、 37°Cでィンキュベートしたその後反応液を抗体 a p— 26の固定した固相に反応させた（1時間、 37°C) 。 PBSにて 3回洗浄後、固相 a p— 26に結合した I ¹²⁵標識 a p— 26量をカウントした。その結果を図 6に示す。

図 6において、プロォステオカルシンの濃度は、プロペプチドの量に換算した値である。図 6の縦軸は BZBo (B oは加えた I ¹²⁵標識 a p— 26全量； Bは、プロべプチドまたはプロォステオカルシンを加えたときに、固相に結合した I ¹²⁵標識 ap— 26量である。）である。この図 6より、プロぺプチドとプロォステオカルシン同等に認識されていることがわかる。

実施例 9

固相抗体として、抗体 a p— 26を固定化したものを用いた。実施例 3 (B) (1) で調製した、抗体 a p— 26固定化ビーズ 1個と、精製したヒト ·ォステオカルシンを 0〜2 OngZ の範囲で含有する 1%B S A含有 0.05M TBS (pH8.0) 200 ^と、 PCT出願（PC T/J P 90/00155) の実施例 1に記載されたポリクローナル抗体（N20) 、実施例 2に記載されたポリクローナル抗体（C 7) を H RPで標識した抗体の 1%B S A含有 0.05M TBS (PH8.0) 溶液 20 とをそれぞれの試験管に添加して 4 °Cで 16時間ィンキュベ一トした。

次に試験管内の溶液を吸引除去した後、 0.05M TBS (pH8.0) で洗浄してから、 3， 3 ', 5， 5'—テトラメチルベンジン塩酸塩 0.02 ΜΗ₂Ο₂ 2.5 mMを含有する 0.1Mリン酸クェン酸緩衝液（pH4. 3) を 0. ずつ各試験管に加え、 37°Cの温度で 30分間反応させた後、反応停止剤として 1 N硫酸水溶液をずつ加えて酵素反応を停止させた。次いで、この溶液を分光光度計を用いて 45 Onmの波長における吸収強度を測定し、結果を図 7に示す。

図 7の結果は、本発明によりプロォステオカルシンが高感度で測定しうることを示している。この図 7の結果により、 ap— 26と aOC— C 7の抗体の組合せが、 a p— 26と aOC— N20.の抗体の組合せよりも良好な感度を示すことがわかる。

実施例 10 (測定系の特異性の検討）

(a) ；ヒト ·ォステオカルシンのプロペプチド特異性

(b) ；ヒト ·ォステオカルシンのプロォステオカルシン特異性実施例 2のプロべプチド測定系および実施例 9のプロォステオカルシン測定系の方法に準じ、それぞれの測定系の特異性を調べた。その結果を図 8に示した。すなわち（a) では、ヒト ·ォステオカルシンのプロぺプチド 0— 50, 000 n /m , プロォステオカルシン 0— 5 OngZ

！ ^で測定したところ、プロペプチド特異性があることが判明した。一方

(b) ではヒト ·ォステオカルシンのプロべプチド 0— 50, 000ng Zm 、プロォステオカルシン 0— 5ngZn ^で測定したところプロォステォカルシンのみドース依存性があり、プロォステオカルシン特異性があることが判明した。

実施例 11 (ヒト骨芽細胞からのヒト ·ォステオカルシン分泌モニタリング）腰原らの骨芽細胞 [BBRC, 145, 651〜657 (1987) ] を用い、 96穴にて培養を行ない、培養上清中ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチド（P— OC) および完全ヒト ·ォステオカルシン（ I一 OC) の分泌（24日）の経時変化を調べた。培養は 10-⁹M 1.25 (OH)₂D₃の存在下に行なわれた。その結果を図 9に示した。この図 9から培養後 5曰目からプロペプチド（P— OC) の分泌レベルはほぼ —定値以上を示すにもかかわらず、完全ヒト 'ォステオカルシン（I一 OC) は消失し、この結果から、プロペプチドが骨芽細胞の機能を良好に反映していることが示された。

一方、培養開始からの細胞層中のカルシウム（Ca) 、リン（P) および完全ヒト ·ォステオカルシンの蓄積をモニターした結果を図 10に示した。この図 10は、培養開始 11日目までに完全ヒト ·ォステオ力ルシンの急激な上昇を示している。このことは図 9の完全ヒ卜 ·ォステォカルシンの減少が細胞層の蓄積に起因していることを明らかに示している。

これらのことから、プロペプチドは、ォステオカルシンよりも効果的な骨芽細胞の活性を反映する可能性が示されていることがわかる。

実施例 12

成長ホルモン欠損小児に、成長ホルモン（GH) を投与した前後の小児の血中のヒト ·ォステオカルシンのプロべプチド（P— 0 C) を測定した。その測定は実施例 2の方法に従って行なった。その結果を図 11 および図 12に示した。図 11は成長ホルモン（GH) 投与前の結果であり、プロペプチドの量は小児の身長の伸び（cmZ年）と非常に良い相関があることを示している。一方、図 1 2は成長ホルモン（G H) 投与後におけるプロペプチドの量の比（投与前のプロペプチド Z投与後のプロペプチド）を縦軸に、また身長の伸びの比（投与前の伸び Z投与後の伸び）を横軸にプロットしたところ、正の相関を示していることがわかる。

このことから、成長ホルモン投与後のプロペプチドの上昇の割合が、投与後の身長の伸びの割合と正の関係であることがわかる。これらの結果から、本発明のプロペプチドの測定法は、小児の骨形成の状態を明確に示しうるマーカーの測定法を提供することができることが示された。実施例 1 3 (癌骨転位のモニタリング）

2人の癌骨転移患者（aおよび b ) を抗癌剤により治療し、治療開始後、治療経過に伴ない、その患者の血清中のヒト ·ォステオカルシンのプロペプチド（P— O C ) 値を、実施例 2の方法で測定した。その結果を図 1 3に示した。図 1 3は患者（a ) および（b ) のいずれも治療開始後プロォステオカルシンの上昇が認められており、この例におけるプロォステオカルシンの上昇の理由は明確ではないが、恐らく骨転移の治療により、骨近傍の骨芽細胞の癌細胞の侵潤が抗癌剤治療によって防止され、その結果、骨芽細胞の機能が回復し、それ故血中のプロペプチドの産生が上昇したものと思われる。このことから本発明方法は抗癌剤の骨転移治療の効果判定に有用であることが示された。

実施例 1 4 (ラットのォステオカルシンのプロペプチドの測定）下記ァミノ酸配列を有するラッ卜のォステオカルシンのプロべプチド (The EHBO Journal Vol. 5 No. 8、 1 8 8 5一 1 8 9 0、 1 9 8 6 ) を合成した。

H₂N Lys-Pro-Ser-Asp-Ser-Glu-Ser-Asp-Lys-Ala-Phe-Met-Ser- Lys_Gln- Glu- Gly-Ser- Lys-Val- Val-Asn-Arg- Leu-Arg- Arg-COOH このプロペプチドを実施例 1 ( 2 ) と同様にして家兎に免疫し、このプロべプチドに対するポリクロ一ナル抗体を得た。得られたポリクローナル抗体を用いて、実施例 2に記載された同様の方法に従ってサンドィツチ測定系を作成した。この測定系を用いてラット 'ォステオカルシンのプロペプチドの標準曲線を作成した。その結果を図 1 4に示した。この図 1 4からラット ·ォステオカルシンのプロぺブチドの測定も本発明により可能であることが判明した。

発明の効果

本発明の免疫学的な測定方法によれば、検査試料中に微量存在するォステオカルシンのプロべプチド、プロォステオカルシンまたはそれらの合計量のそれぞれを区別して、高感度でしかも正確に測定することができる。これらの測定結果は種々の臨床に極めて有意義に利用される。これらの測定結果は、一般に骨形成の状態を反映しているので、例えばヒ卜の臨床の場合について説明すると、小児骨形成の指標、成人 D治療、骨転移治療、骨芽細胞活性能の測定、癌骨転移治療効果の判定などに利用される。

殊にォステオカルシンのプロべプチドの測定結果は、骨代謝における骨形成の状態の診断に極めて有利に利用される。このプロべプチドを高感度且つ正確に測定する手段は本発明によって初めて提供されたものであ。

Claims

請求の範囲

1 . 検査試料中のォステオカルシンのプロべプチドをサンドイッチ法により免疫学的に測定する方法において、不溶性担体に結合した抗体

(第 1抗体) および標識化した抗体（第 2抗体）としてォステオカルシンのプロべプチドを特異的認識する抗体を使用することを特徴とする方法。

2. 該第 1抗体及び該第 2抗体がいずれもォステオカルシンのプロぺプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体である第 1項記載による

~h法。

3. 該第 1抗体及び該第 2抗体のいずれか一方がォステオカルシンのプ口べプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体であり、他方が、ォステオカルシンのプロべプチドのアミノ酸配列の 1 4位から 2 6位までの配列を特異的に認識するポリクローナル抗体またはモノクロ一ナル抗体である第 1項記載による方法。

4. 該ォステオカルシンのプロべプチドがヒト ·ォステオカルシンのプロぺプチドである、ヒト検査試料中のヒト ·ォステオカルシンのプロぺプチドを測定する第 1〜 3項記載のいずれかによる方法。

5. 該ォステオカルシンのプロべプチドが特定動物のォステオカルシンのプロべプチドである、その特定動物の検査試料中のォステオカルシンのプロべプチドを測定する第 1〜 3項記載のいずれかによる方法。

6. 該特定動物が、ラット、マウスまたは犬である第 5項記載による方法。

7. ( a ) 固相抗体（第 1抗体）、

( b ) 標識抗体（第 2抗体）、 ( c ) 溶解剤、

( d ) 洗浄剤

( e ) 標準物質および

( f ) 酵素で標識化された標識抗体を使用する場合には、酵素活性を測定するための基質および反応停止剤、

を組合せてなる、検査試料中のォステオカルシンのプロべプチドを測定するためのキッ卜であって、

第 1抗体および第 2抗体がォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識する抗体である、

ことを特徴とするォステオカルシンのプロべプチドを免疫学的に測定するためのキット。

8. 該第 1抗体および該第 2抗体がいずれもォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体である第 7項記載によるキット。

9. 該第 1抗体および該第 2抗体のいずれか一方がォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体であり、他方が、ォステオカルシンのプロべプチドのァミノ酸配列の 1 4位から 2 6位までの配列を特異的に認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である第 7項記載によるキット。

1 0. 該（e ) 標準物質が動物血清を含有している第 7項記載によるキッ卜。

1 1 . 検査試料中のプロォステオカルシンをサンドィツチ法により免疫学的に測定する方法において、不溶性担体に結合した抗体（第 1抗体）および標識化した抗体（第 2抗体）のいずれか一方の抗体がォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識する抗体であり、他方の抗体がォステオカルシンを特異的に認識する抗体であることを特徴とする方法。

12. 該ォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識する抗体がポリクローナル抗体である第 11項記載による方法。

13. 該ォステオカルシンを特異的に認識する抗体がポリクローナル抗体である第 11項または第 1..2項記載による方法。 '

14. 該ォステオカルシンを特異的に認識する抗体がォステオカルシンの C末端の 14個のアミノ酸配列領域を特異的に記載するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である第 11〜13項のいずれかの記載による方法。

15. 該プロォステオカルシンがヒト ·プロォステオカルシンである、ヒト検査試料中のヒト ·プロォステオカルシンを測定する第 11〜第 14項記載のいずれかによる方法。

16. 該プロォステオカルシンが特定動物のプロォステオカルシンである、その特定動物の検査試料中のプロォステオカルシンを測定する第 11〜14項記載のいずれかによる方法。

17. 該特定動物がラット、マウスまたは犬である第 16項記载による方法。

18. (a) 固相抗体（第 1抗体）、

(b) 標識抗体（第 2抗体）、

(c) 溶解剤、

(d) 洗浄剤

(e) 標準物質および ( f ) 酵素で標識化された標識抗体を使用する場合には、酵素活性を測定するための基質および反応停止剤、

を組合せてなる、検査試料中のプロォステオカルシンを測定するためのキッ卜であって、

第 1抗体および第 2抗体のいずれか

—方の抗体がォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識する抗体であり、他方の抗体がォステオカルシンを特異的に認識する抗体であることを特徴とするプロォステオカルシンを免疫学的に測定するためのキット。

1 9. 該ォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識する抗体がポリクローナル抗体である第 1 7項記載によるキット。

2 0. 該ォステオカルシンを特異的に認識する抗体がポリクローナル抗体である第 1 8項または第 1 9項記載によるキット。

2 1 . 該ォステオカルシンを特異的に認識する抗体がォステオカルシンの C末端の 1 4個のアミノ酸配列領域を特異的に認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である第 1 8〜2 0項のいずれかの記載によるキット。

2 2. 該（e ) 標準物質が動物血清を含有している第 1 7項記載によるキッ卜。

2 3. 検査試料中のォステオカルシンのプロべプチドおよびプロォステォカルシンの合計量を競合法により免疫学的に測定する方法において、不溶性担体に結合する抗体または不溶化されうる抗体として、ォステォカルシンのプロべプチドを特異的に認識する抗体を使用することを特徴とする方法。

2 4. 該ォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識する抗体がポリクローナル抗体である第 2 3項記載による方法。

2 5. 該ォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識する抗体が、該プロべプチドのァミノ酸配列 1位〜 1 3位を特異的に認識するポリクローナル抗体である第 2 3項記載による方法。

2 6. ヒト検査試料中のヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドおよびヒト ·プロォステオカルシンの合計量を測定する第 2 3〜2 5項記載のいずれかによる方法。

2 7. 特定動物の検査試料中のその特定動物のォステオカルシンのプロぺプチドおよびその特定動物のプロォステオカルシンの合計量を測定する第 2 3〜2 5項記載のいずれかによる方法。

2 8. 該特定動物が、ラット、マウスまたは犬である第 2 5項記載による方法。

2 9. 請求の範囲第 1項、第 1 1項または第 2 3項記載の方法によって測定されたォステオカルシンのプロべプチド、プロォステオカルシンまたはそれらの合計量の値に基づいて、検査したヒトまたは動物の骨形成の状態を診断する方法。

3 0. ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドを特異的に認識するポリクローナル抗体。

3 1 . ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドのァミノ酸配列における

1 4位から 2 6位を特異的に認識するポリクローナル抗体。

3 2. ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドのァミノ酸配列における

1位〜 1 3位を特異的に認識するポリクロ一ナル抗体。

3 3. ヒト ·ォステオカルシンのプロべプチドのァミノ酸配列における 1 4位〜 2 6位を特異的に認識するモノクロ一ナル抗体。

4 . 該モノクローナル抗体がハイプリドーマ 3 F 9または 4 E 1 2から産生されるものである第 3 1項記載によるモノクローナル抗体。