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WO1992006114A1 - Polypeptides derives de l'interleukine-1 beta, procede de preparation et utilisation, notamment dans le cadre des pathologies osteoarticulaires - Google Patents

Polypeptides derives de l'interleukine-1 beta, procede de preparation et utilisation, notamment dans le cadre des pathologies osteoarticulaires Download PDF

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Publication number
WO1992006114A1
WO1992006114A1 PCT/FR1991/000779 FR9100779W WO9206114A1 WO 1992006114 A1 WO1992006114 A1 WO 1992006114A1 FR 9100779 W FR9100779 W FR 9100779W WO 9206114 A1 WO9206114 A1 WO 9206114A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
illβ
polypeptides
polypeptide
derivatives
cartilage
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1991/000779
Other languages
English (en)
Inventor
Françoise GUINET
Terence Cartwright
Jean-Dominique Guitton
Bernard Terlain
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
Publication of WO1992006114A1 publication Critical patent/WO1992006114A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to new polypeptides derived from human interleukin-1 beta (ILl ⁇ ). More particularly, it relates to polypeptides capable of inhibiting certain activities of human IL1 ⁇ , and as such, usable pharmacologically, as selective antagonists of IL1 ⁇ .
  • the invention also relates to a process for the microbiological preparation of these polypeptides, the genetic material involved in this process (DNA sequences, plasmids, host cells), as well as pharmaceutical compositions comprising these polypeptides as active principle.
  • Interleukin-1 beta is a cytokine secreted in particular by macrophages, which plays a determining role in the development of the immune response. This activity is carried out via membrane receptors present on the surface of lymphocytes, and is involved in lymphocyte activation and differentiation.
  • this molecule also has other activities.
  • it is capable of inducing the proliferation of fibroblasts, and of inducing or stimulating the production of mediators or enzymes (PAF, prostaglandins, proteases, histamine, etc.) in endothelial cells, chondrocytes, fibroblasts and basophils.
  • mediators or enzymes PAF, prostaglandins, proteases, histamine, etc.
  • neutrophils it facilitates the activation process, a process which is accompanied by the release of lipid mediators and proteases. It is still capable of acting on thermoregulatory centers, on bone marrow, on the liver, to stimulate protein synthesis or the maturation of leukocytes.
  • ILl ⁇ has become a preferred pharmacological target, and many studies are carried out with the aim of using this molecule for therapeutic purposes.
  • ILl ⁇ produced locally by a macrophage can interact as well with a T lymphocyte than with a chondrocyte, and thus stimulate the immune system or the production of neutral proteases (proteoglycanase, collagenase ..) which will increase the catabolism of cartilage.
  • neutral proteases proteoglycanase, collagenase ..
  • the use of ILl ⁇ for the purpose of stimulating the immune system risks generating an inflammatory reaction at the same time.
  • an IL1 ⁇ inhibitor to reduce an inflammatory reaction or damage to the cartilage may have an associated immunosuppressive effect.
  • EP 276 778 which describes derivatives of ILl ⁇ carrying modifications on the first 4 N-terminal amino acids, and whose activity is altered.
  • Patent EP 237 967 also describes a panoply of molecules derived from ILl ⁇ , having different activity profiles, and in particular molecules exhibiting mutations on cysteine residues located in ⁇ sheets of the molecule.
  • ILl ⁇ IL1 receptor
  • Sims et al Science vol 241, 1988
  • an IL1 antagonist inhibitor Eisenberg et al; Nature, vol 343, 1990.
  • the first is not specific for a given cell type, and, taking into account the pleiotropism of ILl ⁇ , risks presenting significant side effects (immunodeficiency).
  • the second which binds to T cell receptors.
  • An object of the invention therefore lies in polypeptides derived from the human ⁇ ILl, characterized in that they possess the ability to selectively inhibit the effect of human metabolism ILl ⁇ cartilage.
  • the effect on the metabolism of cartilage includes both the effect on catabolism and on anabolism, as determined in the examples.
  • the selective effect of the derivatives of the invention means that they have, vis-à-vis immunity cells, and T cells more particularly, an affinity lower than ILl ⁇ mature.
  • polypeptides of the invention are derived from ILl ⁇ by modifications of the primary structure, according to a strategy aimed at dissociating the properties of the molecule.
  • polypeptides according to the present invention are derived from ILl ⁇ by structural modifications inside or close to loops.
  • ILl ⁇ is indeed a protein of structural class ⁇ , made up of 12 ⁇ sheets linked together by loops. See in particular the structure published by Priestle et al., EMBO J. Vol 7, 339 (1988), represented in FIG. 1. It has now been found that the loops of the molecule are sensitive regions, likely to play a role in extramolecular interactions. Therefore, it is particularly advantageous to modify the structure of ILl ⁇ by focusing on these regions, or on close residues. Even more particularly, the structural modifications relate to the loops located between the sheets 4-5, 5-6, 7-8, 10-11 and 11-12 shown in FIG. 1, or on residues close to these loops. Preferably, the modification or modifications of the primary structure are mutations, punctual or not, additions or deletions of one or more amino acids.
  • polypeptides corresponding to the characteristics of the invention, there may be mentioned more particularly the polypeptides:
  • - ( 126 Ala; 128 Ala) -ILl ⁇ that is to say a derivative of ILl ⁇ in which the glutamine and glutamic acid residues respectively at positions 126 and 128 are replaced by alanine residues
  • - ⁇ ( 50 Gly- 51 Gly) -ILl ⁇ that is to say a derivative of ILl ⁇ in which the glycine residues 50 and 51 have been deleted.
  • the derivatives according to the present invention also include all the fragments of the polypeptides described above, that is to say the fragments of the polypeptides derived from lTLl ⁇ having the capacity to selectively inhibit the effect of human ILl ⁇ on the cartilage metabolism.
  • These fragments can be obtained in several ways, in particular by cleavage of the polypeptides or by direct expression of truncated genes.
  • the selectivity of the derivatives of the invention has been studied on different parameters, reflecting the immune, inflammatory and regulatory functions of cartilage metabolism.
  • DNA sequences coding for the polypetides or the fragments of polypeptides having the characteristics defined above are DNA sequences comprising all or part of a sequence chosen from those presented in FIG. 2a, b, c.
  • the subject of the invention is also the cloning and / or expression vectors containing one or more DNA sequences defined above. They can in particular be integrative or self-replicating vectors. In these vectors, the DNA sequence (s) can be placed under the control of sequences allowing their expression, and possibly their secretion. The choice of vector type and expression signals may in particular depend on the host chosen. Several examples of these vectors are given later.
  • a subject of the invention is also the recombinant cells containing a cloning and / or expression vector as defined above.
  • it can be both plant and animal cells, eukaryotic and prokaryotic, therefore that these cells are capable of expressing a heterologous protein.
  • These cells can be obtained by conjugation, transformation, electroporation, or any other technique which makes it possible to introduce a DNA fragment into a cell.
  • the subject of the invention is also a process for the preparation of polypeptides or fragments of polypeptides having the characteristics defined above, process characterized in that a cell as above is cultured under expression conditions and recovers the products obtained.
  • compositions comprising one or more polypeptides as defined above or fragments of these polypeptides, associated with any pharmaceutically acceptable vehicle.
  • Such compositions find application in particular in the context of osteoarticular pathologies (arthritis, etc.).
  • FIG. 1 represents the three-dimensional structure of ILl ⁇ , as described by Priestle et al above,
  • - Figure 2 represents the nucleotide sequences: a) of the complete synthetic gene of ILl ⁇ , b) of the derivative of ILl ⁇ ( 63 Ser; 65 Ser) -ILl ⁇ , c) of the derivative of ILl ⁇ ( 126 Ala; 128 Ala) -ILl ⁇ , d) of the derivative of ILl ⁇ ⁇ ( 50 Gly- 51 Gly) -ILl ⁇ .
  • FIG. 3 describes the structure of cloning and / or expression vectors containing the DNA sequences of FIG. 2 under the control of sequences allowing their expression
  • Table 1 collates the results obtained concerning the biological activity of derivatives of ILl ⁇ on the immune reaction
  • a gene coding for the entirely synthetic IL1 ⁇ was constructed, by assembling 14 chemically synthesized oligonucleotides.
  • the sequence of the complete gene obtained is given in FIG. 2a. This sequence differs from that published at positions 483 (TCC), 506 (T), 435 (CATATG), and 896 (AACGTT).
  • oligonucleotides have been prepared, and in particular the oligonucleotides of sequence:
  • nucleotide sequences derived from the IL1 ⁇ gene were obtained, the whole sequences of which are shown in fig 2b, 2c and 2d. These sequences code respectively for the polypepides ( 63 Ser; 65 Ser) -ILl ⁇ , ( 126 Ala; 128 Ala) -ILl ⁇ , and ⁇ ( 50 Gly- 51 Gly) -ILl ⁇ .
  • mutagenesis techniques known to those skilled in the art can be used for the preparation of derivatives according to the invention, and in particular the PCR technique.
  • ILl ⁇ and its derivatives were produced microbiologically at E.coli. It is clear that the lessons given in this application allow the skilled person to reproduce the invention in another cell type.
  • the culture conditions used are those described by Jung et al. (Ann.
  • the cloning and expression vectors used in the invention were obtained from the plasmid pXL1029 described by Jung et al. These vectors contain the DNA sequences coding for the derivatives of ILl ⁇ under the control of the operator / promoter thermosensitive region of the bacteriophage lambda Clts-O / P ⁇ . Other expression signals can obviously be used, deriving for example from bacterial or phage genes, as well as signals allowing the secretion of the polypeptides produced.
  • integrative vectors can be obtained by inserting homologous DNA sequences into the vector, making it possible to increase the plasmid stability.
  • the vectors thus described were introduced into the E. coli E103S strain. Under the conditions defined above, the derivatives of the invention were produced at high rates and in soluble form, that is to say easily purifiable.
  • This reference activity reflects the specific activity of ILl ⁇ and of the derivatives of the invention. This test reproduces in vitro the immunostimulating effect of IL1 ⁇ by activation of T lymphocytes.
  • the protocol used is as follows: The thymocytes used were obtained from mouse thymus (C3H / Ouj). The cells are cultured, at a rate of 1, 5.10 thymocytes / ml, in the presence of PHA
  • Thymocyte proliferation is measured during the last 5 hours of each culture by adding MTT (dimethyl-thiazo diphenyl tetrazolium) to the medium, which is transformed into an insoluble salt on contact with the cells.
  • MTT dimethyl-thiazo diphenyl tetrazolium
  • the residual insoluble salt is then dissolved in the presence of 0.04N HCl in propanol, and the concentration is measured by reading the OD at 560/690 nm according to the technique of Mosmann (J. Immunol. Methods, 65, 55 (1983). )).
  • the results are presented in Table 1.
  • the cells are cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum, at 37 ° C., in an atmosphere containing 5% CO 2.
  • the fixation tests are carried out using ILl ⁇ labeled with iodine 125 I. For this, 100 ⁇ l of lymphocyte suspension are incubated for 3 h at 23 ° C. in the presence of 50 ⁇ M of labeled ILl ⁇ and azide of 0.2% sodium, which inhibits the internalization process.
  • the cells are separated from the supernatant by centrifugation on a silicone / paraffin mixture and the radioactivity present in the cell fraction is counted.
  • Tms mean survival time
  • ILl ⁇ produced during an inflammatory state (or an ILl ⁇ type activity), leads to a decrease in the serum zinc level.
  • ILl ⁇ stimulates the synthesis of "acute phase proteins" by hepatic enzymes which, to do this, mobilize serum zinc.
  • the effect of the derivatives of the invention on the serum zinc level was determined by emission spectrometry with an argon plasma source, 4 hours after intraperitoneal injection of. doses of ILl ⁇ or of derivatives of the invention varying between 0.2 and 20 ng per mouse.
  • GM-CSF in particular by immunocompetent cells. It is possible to measure this activity by detecting the proliferation of bone marrow cells induced by a mouse serum treated with ILl ⁇ or the derivatives of the invention. More specifically, sera from OF- mice. were obtained at different times after intravenous injection of derivatives of the invention, by sampling, coagulation 45 min at room temperature and centrifugation. Proliferation is measured on cells of mouse marrow cultured for 3 days in the presence of the sera obtained above, after addition of M ' 1'1' according to the technique of Mosmann [J. Immunol. Methods, 65, 55 (1983)]. Since M-CSF activates the multiplication and metabolic activity of medullary cells, the intensity of the coloration accounts for the ability of the ILl ⁇ derivative to stimulate the production of M-CSF in vivo.
  • ILl ⁇ or the derivatives of the invention are administered intraperitoneally at doses varying between 2 and 200 ng per mouse. The consumption is measured between the times 1 hour and 1 hour 30 minutes by weighing the remaining food. The reduction in consumption caused by the different forms of ILl ⁇ is determined by comparison with control mice.
  • the derivatives of the invention were tested compared to ILl ⁇ , in order to determine their activity on the anabolism and on the catabolism of cartilage, and this, by measuring their capacity to:
  • proteoglycanases proteoglycanases, metalloproteases, etc.
  • degradation of the cartilage matrix was also carried out on primary culture of chondrocytes, by incorporation of sulfur 35 S. The cells are cultured for 6 to
  • the cell model used is a primary culture of rat chondrocytes, prepared and cultivated under the following conditions: Rat embryos (Sprague Dawley) are removed on the 13th day of gestation, on which then sterilely remove leg buds from the lower and upper limbs. After enzymatic dissociation of these buds (trypsin), the cell lysate obtained is homogenized, then filtered through a sieve to remove any residual tissue. The cells are then counted, centrifuged, and the pellet is taken up with the culture medium. The cells thus obtained constitute the noxious solution. For each experiment, the cells (25.10 / ml) are innoculated in a culture dish and maintained between 2 and 4 h at 37 ° C to allow their fixation. According to the test, the protocols described above are carried out.
  • This activity is similar to that described in i /, since it is these neutral proteases which are mainly responsible for the degradation of cartilage.
  • This activity is determined indirectly, by measuring the degradation of azocoll (synthetic substrate) induced by different cultures of chondrocytes cultured in the presence of ILl ⁇ or derivatives. Concretely, the chondrocytes of a first subculture are precultured for 24 h before any stimulation. Dilutions of ILl ⁇ derivatives according to the invention are added to the medium for 30 h, at 37 ° C, under 5% CO2.
  • the azocoll (10 mg / ml) is introduced at pH 7.4 and at 37 ° C., and left in contact for 5 h with stirring.
  • the optical density at 550 nm is then read, which is proportional to the quantity of degraded azocoll, and therefore of secreted proteases. More specifically, this assay reports on the proteoglycanases and collagenases produced. The results are presented in Table 4).
  • k / Attach to rabbit chondrocytes This parameter demonstrates that the inhibitory effect of the derivatives of the invention on the metabolism of cartilage is not due to a correlated disappearance of their affinity for the chondrocyte receptors.
  • the chondrocytes are cultured in the same medium and under the same conditions as the lymphocytes of experiments b / and c /.
  • the cells are incubated at 20 ° C in the presence of a solution of 125 I-ILl ⁇ lOOpM.
  • the cells in rinsed stmt monolayer, solubilized by means of SDS (sodium dodecyl sulfate) and the fixed radioactivity is counted.
  • SDS sodium dodecyl sulfate

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux dérivés inhibiteurs de certains effets de l'interleukine-1 béta, un procédé microbiologique pour leur préparation, et des compositions pharmaceutiques les comprenant, utilisables dans le cadre des pathologies ostéoarticulaires.

Description

POLYPEPTIDES DERIVES DE LTNTERLEUKINE-1 BETA. PROCEDE DE
PREPARATION ET UTILISATION. NOTAMMENT DANS LE CADRE DES
PATHOLOGIES OSTCQARTIÇULAIRES
La présente invention concerne de nouveaux polypeptides dérivés de l'interleukine-1 béta humaine (ILlβ). Plus particulièrement, elle concerne des polypeptides capables d'inhiber certaines activités de l'ILlβ humaine, et à ce titre, utilisables pharmacologiquement, comme antagonistes sélectifs de l'ILlβ. L'invention concerne également un procédé de préparation microbiologique de ces polypeptides, le matériel génétique impliqué dans ce procédé (séquences d'ADN, plasmides, cellules hôtes), ainsi que des compositions pharmaceutiques comprenant ces polypeptides comme principe actif.
L'interleukine-1 béta est une cytokine sécrétée notamment par les macrophages, qui joue un rôle déterminant dans le développement de la réponse immunitaire. Cette activité s'effectue par l'intermédiaire de récepteurs membranaires présents à la surface des lymphocytes, et intervient au niveau de l'activation et de la différenciation lymphocytaire.
Mais, en raison de la diversité des cellules cibles de l'ILlB, cette molécule possède également d'autres activités. Ainsi, elle est capable d'induire la prolifération des fibroblastes, et d'induire ou de stimuler la production de médiateurs ou d'enzymes (PAF, prostaglandines, protéases, histamine ..) chez les cellules endothéliales, les chondrocytes, les fibroblastes et les basophiles. Par ailleurs, sur les polynucléaires neutrophiles, elle facilite le processus d'activation, processus qui s'accompagne d'une libération de médiateurs lipidiques et de protéases. Elle est encore capable d'agir sur les centres thermorégulateurs, sur la moelle osseuse, sur le foie, pour stimuler la synthèse protéique ou la maturation des leucocytes. Toutes ces activités de l'ILlβ expliquent son rôle important dans le développement de la réponse inflammatoire et dans la régulation du métabolisme des cartilages. Plus précisément dans ce dernier cas, un effet de l'ILlβ a été observé aussi bien sur la synthèse des protéines du tissu conjonctif (anabolisme) que sur leur dégradation (catabolisme). Ainsi, du fait de ses nombreuses propriétés, l'ILlβ est devenue une cible pharmacologique privilégiée, et de nombreux travaux sont effectués dans le but d'utiliser cette molécule à des fins thérapeutiques.
Toutefois, les interférences entre les multiples activités de l'ILlβ sont grandes. Ainsi, l'ILlβ produite localement par un macrophage peut aussi bien interagir avec un lymphocyte T qu'avec un chondrocyte, et ainsi stimuler le système immunitaire ou la production de protéases neutres (protéoglycanase, collagénase ..) qui vont augmenter le catabolisme des cartilages. De même, les relations entre la réponse pro-inflammatoire et la réponse immunitaire ne peuvent être dissociées. De ce fait, l'utilisation de l'ILlβ dans le but de stimuler le système immunitaire risque d'engendrer parallèlement une réaction inflammatoire. Réciproquement, l'emploi d'un inhibiteur de l'ILlβ pour réduire une réaction inflammatoire ou une lésion des cartilages risque d'avoir un effet associé immunodépressif .
Dans ces conditions, l'existence de multiples propriétés constitue également un inconvénient important, qui limite les conditions d'utilisation thérapeutique de l'ILlβ.
Pour tenter de remédier à cet inconvénient, différents mutants de l'ILlβ ont été produits.
On connait en particulier le brevet EP 276 778, qui décrit des dérivés de l'ILlβ portant des modifications sur les 4 premiers acides aminés N-terminaux, et dont l'activité est altérée.
Le brevet EP 237 967 décrit également une panoplie de molécules dérivées de l'ILlβ, présentant différents profils d'activité, et notamment des molécules présentant des mutations sur des résidus cystéine situés dans des feuillets β de la molécule.
Toutefois, aucun des mutants décrits dans ces documents ne présente de spécificité suffisante vis-à-vis d'une activité de l'ILlβ. De plus, il existe généralement une bonne corrélation entre les activités biologiques des analogues étudiés et leur affinité pour les récepteurs, ce qui indique que les différents fonctions biologiques de ces molécules ne sont pas dissociées.
Plus récemment enfin, ont été mis en évidence des antagonistes potentiels naturels de l'ILlβ. Il s'agit d'un récepteur soluble d'ILl (Sims et al; Science vol 241, 1988) et d'un inhibiteur antagoniste des IL1 (Eisenberg et al; Nature, vol 343, 1990). Toutefois, le premier n'est pas spécifique d'un type cellulaire donné, et, compte tenu du pléiotropisme de l'ILlβ, risque de présenter des effets secondaires importants (immunodéficience). Il en va de même avec le second qui se fixe aux récepteurs des lymphocytes T.
Dans ces conditions, il n'existe pas de molécules suffisamment sélectives, permettant de dissocier les différentes activités de l'ILlβ pour une meilleure utilisation pharmacologique. La demanderesse a maintenant mis au point des analogues de l'ILlβ capables d'inhiber sélectivement l'activité sur le métabolis- me des cartilages, sans interférer avec le système immunitaire.
Un objet de l'invention réside donc dans des polypeptides dérivés de l'ILlβ humaine, caractérisés en ce qu'ils possèdent la capacité d'inhiber sélectivement l'effet de l'ILlβ humaine sur le métabolisme des cartilages.
Au sens de la présente invention, l'effet sur le métabolisme des cartilages comprend aussi bien l'effet sur le catabolisme que sur l'anabolisme, ainsi que déterminé dans les exemples. De même, selon l'invention, l'effet sélectif des dérivés de l'invention signifie qu'ils présentent, vis-à-vis des cellules de l'immunité, et des lymphocytes T plus particulièrement, une affinité inférieure à l'ILlβ mature.
Les polypeptides de l'invention dérivent de l'ILlβ par modifications de la structure primaire, selon une stratégie visant à dissocier les propriétés de la molécule. En particulier, les polypeptides selon la présente invention dérivent de l'ILlβ par modifications structurales à l'intérieur ou proches de boucles.
L'ILlβ est en effet une protéine de classe structurale β, constituée de 12 feuillets β reliés entre eux par des boucles. Voir notamment la structure publiée par Priestle et al., EMBO J. Vol 7, 339 (1988), représentée sur la figure 1. Il a maintenant été trouvé que les boucles de la molécule sont des régions sensibles, susceptibles de jouer un rôle dans les interactions extramoléculaires. De ce fait, il est particulièrement avantageux e modifier la structure de l'ILlβ en se focalisant sur ces régions, ou sur des résidus proches. Encore plus particulièrement, les modifications structurales portent sur les boucles situées entre les feuillets 4-5, 5-6, 7-8, 10-11 et 11-12 représentées figure 1, ou sur des résidus proches de ces boucles. Préférentiellement, la ou les modifications de la structure primaire sont des mutations, ponctuelles ou non, des additions ou des délétions d'un ou plusieurs acides aminés.
Les modifications de structure primaire opérées ont ainsi permis de dissocier les activités de l'ILlβ. La spécificité obtenue permet dès lors d'augmenter les potentialités thérapeutiques des molécules, puisqu'il devient possible d'inhiber sélectivement certains effets de lTLlβ tout en conservant l'activité recherchée.
Parmi les polypeptides répondant aux caractéristiques de l'invention, on peut citer plus particulièrement les polypeptides:
- (63Ser;65Ser)-ILlβ, c'est à dire un dérivé de l'ILlβ dans lequel les résidus lysine aux positions 63 et 65 sont remplacés par des résidus serine,
- (126Ala; 128Ala)-ILlβ, c'est à dire un dérivé de l'ILlβ dans lequel les résidus glutamine et acide glutamique respectivement aux positions 126 et 128 sont remplacés par des résidus alanîne, - δ(50Gly-51Gly)-ILlβ, c'est à dire un dérivé de l'ILlβ dans lequel les résidus glycine 50 et 51 ont été délétés.
Par ailleurs, les dérivés selon la présente invention comprennent également tous les fragments des polypeptides décrits ci-dessus, c'est à dire les fragments des polypeptides dérivés de lTLlβ possédant la capacité d'inhiber sélectivement l'effet de l'ILlβ humaine sur le métabolisme des cartilages. Ces fragments peuvent être obtenus de plusieurs façons, en particulier par clivage des polypeptides ou par expression directe de gènes tronqués.
La sélectivité des dérivés de l'invention a été étudiée sur différents paramètres, reflétant les fonctions immunitaire, inflammatoire et de régulation du métabolisme des cartilages.
Les différentes activités des polypeptides de l'invention sont présentées dans les exemples.
Un autre objet de l'invention réside dans les séquences d'ADN codant pour les polypetides ou les fragments de polypeptides ayant les caractéristiques définies ci-dessus. Préférentiellement, il s'agit de séquences d'ADN comprenant tout ou partie d'une séquence choisie parmi celles présentées à la figure 2a,b,c.
L'obtention et la purification de ces séquences sont décrites dans les exemples.
L'invention a également pour objet les vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant une ou plusieurs séquences d'ADN définies ci-dessus. Il peut en particulier s'agir de vecteurs intégratifs ou autoréplicatifs. Dans ces vecteurs, la ou les séquences d'ADN peuvent être placées sous le contrôle de séquences permettant leur expression, et éventuellement leur sécrétion. Le choix du type de vecteur et des signaux d'expression peut en particulier dépendre de l'hôte choisi. Plusieurs exemples de ces vecteurs sont donnés ultérieurement.
L'invention a aussi pour objet les cellules recombinées contenant un vecteur de clonage et/ou d'expression tel que défini ci-dessus. Notamment, il peut s'agir aussi bien de cellules végétales qu'animales, eucaryotes que procaryotes, dès lors que ces cellules sont capables d'exprimer une protéine hétérologue. Ces cellules peuvent être obtenues par conjugaison, transformation, electroporation, ou tout autre technique permettant d'introduire un fragment d'ADN dans une cellule.
L'invention a encore pour objet un procédé de préparation de polypeptides ou de fragments de polypeptides ayant les caractéristiques définies ci-avant, procédé caractérisé en ce que l'on cultive une cellule telle que ci-dessus dans des conditions d'expression et on récupère les produits obtenus.
Enfin, l'invention a pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant un ou plusieurs polypeptides tels que définis plus haut ou des fragments de ces polypeptides, associés à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable. De telles compositions trouvent application notamment dans le cadre des pathologies ostéoarticulaires (arthrose, ...).
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
DESCRIPTION DES FIGURES
- La figure 1 représente la structure tridimensionnelle de l'ILlβ, telle que décrite par Priestle et coll précitée,
. - La figure 2 représente les séquences nucléotidiques : a) du gène synthétique complet de l'ILlβ, b) du dérivé de l'ILlβ (63Ser;65Ser)-ILlβ, c) du dérivé de l'ILlβ (126Ala; 128Ala)-ILlβ, d) du dérivé de l'ILlβ δ(50Gly-51Gly)-ILlβ.
- La figure 3 décrit la structure de vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant les séquences d'ADN de la figure 2 sous le contrôle de séquences permettant leur expression,
- Le tableau 1 rassemble les résultats obtenus concernant l'activité biologique de dérivés de l'ILlβ sur la réaction immunitaire,
- Le tableau 2 rassemble les résultats obtenus concernant l'activité biologique de dérivés de l'ILlβ sur la réaction inflammatoire et sur l'hématopoièse, - Les tableaux 3 et 4 réunissent les résultats obtenus concernant l'activité biologique de dérivés de l'ILlβ sur le métabolisme des cartilages. I. PREPARATION DES DERIVES
A - Construction du gène de l'ILlβ
Un gène codant pour l'ILlβ entièrement synthétique a été construit, par assemblage de 14 oligonucléotides synthétisés chimiquement. La séquence du gène complet obtenu est donnée figure 2a. Cette séquence diffère de celles publiées aux positions 483 (TCC), 506 (T), 435 (CATATG), et 896 (AACGTT).
B - Elaboration de dérivés selon l'invention
Différents dérivés de l'ILlβ selon l'invention ont été obtenus par mutagénèse dirigée, en utilisant le Kit Amersham (réf. RPN 1523). A cet effet, plusieurs oligonucléotides ont été préparés, et notamment les oligonucléotides de séquence :
. Oligol (39 mer)
5'-GTGGCCTTGGGCCTCAGCGAAAGCAATCTGTACCTGTCC-3'
.Oligo2(36mer)
5'-ATCAGCACCTCTGCAGCAGCAAACATGCCCGTCTTC-3'
.Oligo3 (36mer)
5'-ATGTCCTTTGTACAAGGAAGTAATGACAAAATACCT-3'
En appliquant la technique mentionnée ci-avant, des séquences nucléoti- diques dérivées du gène de l'ILlβ ont été obtenues, dont les séquences entières sont présentées figue 2b, 2c et 2d. Ces séquences codent respectivement pour les polypep¬ tides (63Ser;65Ser)-ILlβ, (126Ala; 128Ala)-ILlβ, et δ(50Gly-51Gly)-ILlβ.
D'autres techniques de mutagénèse connues de l'homme de l'art peuvent être utilisées pour la préparation de dérivés selon l'invention, et notamment la technique PCR.
C - Expression
L'ILlβ et ses dérivés ont été produits par voie microbiologique chez E.coli. Il est clair que les enseignements donnés dans la présente demande permettent à l'homme du métier de reproduire l'invention dans un autre type cellulaire.
Les conditions de culture utilisées sont celles décrites par Jung et al. (Ann.
Inst. Pasteur/Microbiol. (1988), 139, p 129).
Les vecteurs de clonage et d'expression utilisés dans l'invention ont été obtenus à partir du plasmide pXL1029 décrit par Jung et al. Ces vecteurs contiennent les séquences d'ADN codant pour les dérivés de l'ILlβ sous le contrôle de la région thermosensible opérateur/promoteur du bactériophage lambda Clts-O/P^. D'autres signaux d'expression peuvent bien évidemment être utilisés, dérivant par exemple de gènes bactériens ou phagiques, ainsi que des signaux permettant la sécrétion des polypeptides produits. De plus, des vecteurs intégratifs peuvent être obtenus en insérant dans le vecteur des séquences d'ADN homologue, permettant d'augmenter la stabilité plasmidique.
Les vecteurs ainsi décrits ont été introduits dans la souche E. coli E103S. Dans les conditions définies ci-dessus, les dérivés de l'invention on été produits à des taux élevés et sous forme soluble, c'est-à-dire facilement purifiable.
D - Purification
Les dérivés de l'invention ont été purifiés selon le protocole suivant :
1) Lyse cellulaire : 14 g de culot cellulaire sont repris dans 54 ml de tampon Al (Tris 50 mM pH 7,5 EDTA 5 mM PMSF 1 mM, β-mercaptoéthanol 5 mM) et lysés aux ultrasons. Après centrifugation, on obtient le surnageant SI.
2) Précipitation des acides nucléiques : 1,84 g de sulfate de streptomycine sont ajoutés, le mélange est agité 30 minutes à 4°C avant d'être centrifugé à 18 000 rpm. On obtient le surnageant S2.
3) Précipitations au sulfate d'ammonium : Une première précipitation à 45% de saturation en sulfate d'ammonium est effectuée (30 minutes à 20°C), et le surnageant S3 est récupéré après centifugation à 18 000 rpm. Une seconde précipitation à 65% de saturation en sulfate d'ammonium est réalisée dans des conditions identiques. Le culot C4 qui contient les dérivés de l'ILlfi est dialyse contre le tampon A2 (Tris 50 mM pH 8 PMSF 0,1 mM EDTA 2 mM). 4) Chromatographie sur FFQ ("Fast Flow QEAE" Pharmacia) : Les 24 ml de C4 sont déposés sur un échangeur d'anion FFQ équilibré avec le tampon A3 (Tris 50 mM pH 8). La majorité des protéines de E. coli se fixent sur la matrice, contrairement aux dérivés de l'invention.
5) Précipitation au sulfate d'ammonium 75%. 6) Chromatographie d'exclusion de gel : Le précipité est déposé sur une colonne de Séphacryl S100 (Pharmacia) équilibrée avec le tampon A4 (Acétate de sodium 50 mM pH 5).
7) Chromatographie sur mono S : L'éluat S100 est déposé sur échangeur de cation mono S équilibré avec le tampon A4. Les dérivés de l'ILlβ sont élues par un gradient de NaCl.
De cette manière les résultats suivants ont été obtenus : Polvpeptide Expression (*) Pureté
(63Ser;65Ser)-ILlβ 5 >95 %
(126Ala; 128Ala)-ILlβ 9 99 % δ(50Gly-51Gly)-ILlβ 5 96 % (*) ( % des protéines solubles
II. CARACTERISAΗON BIOLOGIQUE DES DERIVES
A - Activité sur le système immunitaire
L'étude des paramètres suivants permet d'évaluer l'effet relatif des dérivés de l'ILlβ selon l'invention sur le système immunitaire.
a/ Activité LAF : Cette activité de référence reflète l'activité spécifique de l'ILlβ et des dérivés de l'invention. Ce test reproduit in vitro l'effet îmmunostimulant de l'ILlβ par activation des lymphocytes T. Le protocole utilisé est le suivant: Les thymocytes utilisés ont été obtenus à partir de thymus de souris (C3H/Ouj). Les cellules sont mises en culture, à raison de 1 ,5.10 thymocytes/ml, en présence de PHA
(1 μg ml) pendant 20 minutes. Des dilutions appropriées d'ILlβ ou des dérivés de l'invention sont ensuite ajoutées, et la culture est maintenue 72 h à 37°C sous 7,5% de CQ2. La prolifération des thymocytes est mesurée pendant les 5 dernières heures de chaque culture en ajoutant dans le milieu du MTT (diméthyl-thiazo diphényl tétrazolium), qui est transformé en sel insoluble au contact des cellules. Le sel insoluble résiduel est ensuite dissous en présence d'HCl 0.04N dans le propanol, et la concentration est mesurée par lecture de la DO à 560/690 nm selon la technique de Mosmann (J.Immunol. Methods, 65, 55 (1983)). Les résultats sont présentés dans le tableau 1. b/ Mesure des paramètres de fixation sur des lymphomes B humains : les cellules Raji.
Les cellules sont cultivées en milieu RPMI 1640 supplémenté par 10% de sérum de veau foetal, à 37°C, dans une atmosphère contenant 5% de CO2. Les tests de fixation sont réalisés au moyen d'ILlβ marquée à l'iode 125 I. Pour cela, 100 μl de suspension lymphocytaire sont incubés pendant 3 h à 23°C en présence de 50 pM d'ILlβ marquée et d'azidure de sodium 0,2%, qui inhibe le processus d'internalisation.
A la fin de l'incubation, les cellules sont séparées du surnageant par centrifugation sur mélange silicone/ paraffine et la radioactivité présente dans la fraction cellulaire est comptée.
L'analyse en Scatchard des résultats permet de déterminer le nombre de sites de fixation de l'ILlβ et l'affinité correspondante (KD).
Les propriétés de fixation des dérivés de l'invention sont ensuite déterminées par compétition avec l'ILlβ mature. Pour cela, différentes concentrations d'ILlβ froide ou des dérivés selon l'invention sont préincubées pendant 15 minutes en présence d'ILlβ marquée. Les expériences de liaison sont ensuite conduites selon le protocole décrit ci-dessus. Les résultats obtenus permettent de déterminer la valeur des CI50 (concentration inhibant 50% de la liaison de l'ILlβ mature) des dérivés, et de déduire ainsi leur Kl selon l'équation : KI = CI50/(1+L/KD) avec L = Concentration en ILlβ marquée. KD = constante de dissociation de l'ILlβ.
Les résultats sont présentés dans le tableau 1.
c/ Mesure des paramètres de fixation sur des thymocytes murins : les cellules EL4-6.1. Les protocoles utilisés sont identiques à ceux décrits en b/.
L'analyse en Scatchard des résultats permet de déterminer le nombre de sites de fixation de l'ILlβ, l'affinité correspondante de l'ILlβ et le Kl des dérivés de l'invention. Les résultats sont présentés dans le tableau 1.
d/ Mesure de la résistance aux infections à Listeria chez la souris. Il est connu que l'ILlβ, de par ses propriétés immunostimulantes, protège la souris contre des doses mortelles de Listeria. Une étude comparative de l'effet des dérivés de l'ILlβ selon l'invention sur cette résistance a été réalisée : Au temps 0, on administre par voie intraveineuse à chaque souris OF testée : - 0,2 ml d'une suspension (en soluté physiologique) préparée à partir d'un stock congelé de germes,
- 0,2 ml d'un dérivé de l'invention, ou du véhicule seul (souris témoin). Au temps 10 jours, le temps moyen de survie (Tms) est déterminé, et les résultats sont exprimés sous forme d'indice de protection :
I = Tms (traitée)/Tms (témoin) . 100
L'effet protecteur des dérivés de l'ILlβ selon l'invention est présenté dans le tableau 1.
Les résultats obtenus sur le système immunitaire montrent que les dérivés de l'invention n'ont pas l'effet immunostimulant de l'ILlβ. Mais ils montrent aussi et surtout qu'ils n'ont pas d'effet immunosuppresseur, en dépit de leur effet antagoniste sur le métabolisme des cartilages, ainsi que présenté au point C.
B - Activités pro-inflammatoire et hé atopoiétique (tableau 2)
L'effet comparatif de l'ILlβ et des dérivés de l'invention sur ces activités a été déterminé par:
e/ Mesure de l'hypozincémie chez la souris. L'ILlβ produite lors d'un état inflammatoire (ou une activité de type ILlβ), entraîne une diminution du taux sérique de zinc. Une interprétation de ce phénomène est que l'ILlβ stimule la synthèse d'"acute phase proteins" par les enzymes hépatiques qui, pour ce faire, mobilisent le zinc sérique. L'effet des dérivés de l'invention sur le taux de zinc sérique a été déterminé par spectrométrie d'émission avec source à plasma d'argon, 4 heures après injection intrapéritonéale de. doses d'ILlβ ou de dérivés de l'invention variant entre 0,2 et 20 ng par souris.
f/ Mesure de l'induction de CSF ("Colony Stimulating Factor") chez la souris. Il est connu que l'ILlβ stimule la production de CSF (G-CSF, M-CSF,
GM-CSF), en particulier par les cellules immunocompétentes. Il est possible de mesurer cette activité en détectant la prolifération de cellules de la moelle osseuse induite par un sérum de souris traitée par l'ILlβ ou les dérivés de l'invention. Plus précisément, des sérums de souris OF-. ont été obtenus à différents temps après injection intraveineuse de dérivés de l'invention, par prélèvement, coagulation 45 min à température ambiante et centrifugation. La prolifération est mesurée sur cellules de moelle fémorale de souris cultivées pendant 3 jours en présence des sérums obtenus ci-dessus, après ajout de M'1'1' selon la technique de Mosmann [J. Immunol. Methods, 65, 55 (1983)]. Le M-CSF activant la multiplication et l'activité métabolique des cellules médullaires, l'intensité de la coloration rend compte de l'aptitude du dérivé de l'ILlβ à stimuler in vivo la production de M-CSF.
g/ Mesure de la diminution de consommation de nourriture chez la souris, . qui reflète les potentialités anorexigènes de l'ILlβ, médiées par les prostaglandines. L'ILlβ ou les dérivés de l'invention sont administrés par voie intrapéritonéaîe à des doses variant entre 2 et 200 ng par souris. La consommation est mesurée entre les temps 1 heure et 1 heure 30 minutes par pesée de la nourriture restante. La diminution de consommation engendrée par les différentes formes d'ILlβ est déterminée par comparaison avec des souris témoins.
L'ensemble de ces résultats indique clairement une diminution des propriétés pro-inflammatoires des dérivés de l'invention par rapport à l'ILlβ mature.
C - Activité sur le métabolisme des cartilages
Les dérivés de l'invention ont été testés comparativement à l'ILlβ, afin de déterminer leur activité sur l'anabolisme et sur le catabolisme du cartilage, et ceci, en mesurant leur capacité à :
h/ Inhiber la synthèse des protéoglycans (anabolisme). Il a été montré en effet que la capacité des chondrocytes à synthétiser une matryce cartilagineuse soit fortement diminuée en présence d'ILlβ. Cet effet apparaît d'ailleurs comme primordial dans la pathologie arthrosique. La mesure de cette activité a été effectuée sur culture primaire de chondrocytes, par incorporation de soufre 35 S. Les cellules sont cultivées pendant 24 h# puis les échantillons à tester sont ajoutés, et la culture est maintenue 8 à 10 jours à 37°C. L'incorporation de soufre 35S (SO4) est réalisée durant 16 à 24 h, et la quantité de soufre incorporé dans l'amas cellulaire est dosée. Les résultats sont exprimés sous la forme du pourcentage d'incorporation de 35 S par rapport au témoin, puis en pourcentage d'inhibition de la synthèse des protéoglycans (voir tableau 3).
i/ Dégrader les protéoglycans (catabolisme des cartilages). Il a en effet été mis en évidence que l'ILlβ était capable d'induire, via la production de protéases
(protéoglycanases, métalloprotéases ..), la dégradation de la matrice cartilagineuse. La mesure de cette activité a également été effectuée sur culture primaire de chondrocytes, par incorporation de soufre 35 S. Les cellules sont cultivées pendant 6 à
8 jours (délai permettant la formation de nodules de cartilage), puis l'incorporation de soufre S (SO est réalisée durant 16 à 24 h. Après lavage, les échantillons à tester sont ajoutés, et la culture est maintenue 6 à 8 jours à 37°C. La quantité de soufre résiduel dans l'amas cellulaire est ensuite dosée. Les résultats sont exprimés sous la forme du pourcentage de 35 S incorporé résiduel par rapport au témoin, puis en pourcentage de dégradation du cartilage par rapport au témoin (tableau 3).
Pour la mesure des activités h et i/, le modèle cellulaire utilisé est une culture primaire de chondrocytes de rat, préparée et cultivée dans les conditions suivantes: Des embryons de rat (Sprague Dawley) sont prélevés au 13ème jour de gestation, sur lesquels on prélève ensuite de manière stérile des bourgeons de pattes des membres inférieurs et supérieurs. Après dissociation enzymatique de ces bourgeons (trypsine), le lysat cellulaire obtenu est homogénéisé, puis filtré sur tamis pour éliminer tout tissu résiduel. Les cellules sont alors comptées, centrifugées, et le culot est repris avec le milieu de culture. Les cellules ainsi obtenues constituent la solution d'i noculation. Pour chaque expérience, les cellules (25.10 /ml) sont innoculées en boite de culture et maintenues entre 2 et 4 h à 37°C pour permettre leur fixation. Selon le test, les protocoles décrits ci-dessus sont réalisés.
j/ Induire la sécrétion de protéases neutres par les chondrocytes de lapin.
Cette activité se rapproche de celle décrite en i/, puisque ce sont ces protéases neutres qui sont principalement responsables de la dégradation du cartilage. Cette activité est déterminée indirectement, par mesure de la dégradation de l'azocoll (substrat synthétique) induite par différentes cultures de chondrocytes cultivées en présence d'ILlβ ou des dérivés. Concrètement, les chondrocytes d'une première sous-culture sont pré-cultivés pendant 24 h avant toute stimulation. Des dilutions de dérivés d'ILlβ selon l'invention sont ajoutées au milieu pendant 30 h, à 37°C, sous 5% de CO2.
Après traitement trypsique, l'azocoll (10 mg/ml) est introduit à pH 7,4 et à 37°C, et laissé en contact pendant 5 h sous agitation. On lit alors la densité optique à 550 nm, qui est proportionnelle à la quantité d'azocoll dégradée, et donc de protéases sécrétées. Plus spécifiquement, ce dosage rend compte des protéoglycanases et collagénases produites. Les résultats sont présentés dans le tableau 4). k/ Se fixer sur les chondrocytes de lapin. Ce paramètre démontre que l'effet inhibiteur des dérivés de l'invention sur le métabolisme des cartilages n'est pas dû à une disparition corrélée de leur affinité pour les récepteurs des chondrocytes.
Les chondrocytes sont cultivés dans le même milieu et aux mêmes conditions que les lymphocytes des expériences b/ et c/. Lorsque la confluence est atteinte (tapis monocouche), les cellules sont incubées à 20°C en présence d'une solution de 125 I-ILlβ lOOpM. Au bout de 4 h, les cellules en monocouche stmt rincées, solubilisées au moyen de SDS (sodium dodécyl sulfate) et la radioactivité fixée est comptée. Les propriétés de fixation des dérivés de l'invention sont ensuite déterminées par compétition avec l'ILlβ mature, selon le protocole décrit dans l'expérience b/.
L'analyse en Scatchard des résultats permet de déterminer le nombre de sites de fixation de l'ILlβ, l'affinité correspondante de l'ILlβ et le Kl des dérivés de l'invention. Les résultats sont présentés dans le tableau 4.
1/ Moduler chez la souùis l'anabolisme du tissu cartilagineux au niveau de la rotule, après injection intra-articulaire d'ILlβ. Cette expérience permet d'ajjprétier in vivo l'activité des dérivés de l'ILlβ de l'invention (tableau 3). L'ILlβ ou les dérivés selon l'invention sont injectés au temps t=0 dans l'articulation fémorotibiale. A t=24 h, une injection intraveineuse de 35 SO4Na2 est pratiquée (10 μCi par souris). Au temps t=48 h, Les souris sont sacrifiées et les rotules prélevées. Les cartilages sont ensuite digérés (NaOH N) et la radioactivité incorporée est comptée. Les résultats sont traités pour faire apparaître les variations de radioactivité dues aux différents dérivés de l'ILlβ.
L'ensemble des résultats présentés fait apparaître une dissociation nette des activités des dérivés de l'invention, en ce sens qu'ils sont capables d'inhiber sélectivement les effets de l'ILlβ sur le métabolisme des cartilages, sans affecter la réponse immunitaire. Cette dissociation permet une meilleure utilisation thérapeutique des propriétés des l'ILlβ.

Claims

REVENDICATIONS
I. Polypeptides dérivés de l'ILlβ humaine, caractérisés en ce qu'ils possèdent la capacité d'inhiber sélectivement l'effet de l'ILlβ humaine sur le métabolisme des cartilages.
2. Polypeptides selon la revendication 1 caractérisés en ce qu'ils dérivent de l'ILlβ par modifications de la structure primaire à l'intérieur ou proches de boucles.
3. Polypeptides selon la revendication 2 caractérisés en ce qu'il s'agit des boucles situées entre les feuillets 4-5, 5-6, 7-8, 10-11 et 11-12, telles que représentées sur la figure 1.
4. Polypeptides selon la revendication 2 caractérisés en ce que la ou les
' modifications structurales sont des mutations, ponctuelles ou non, des additions ou des délétions d'un ou plusieurs acides aminés.
5. Polypeptide (63Ser;65Ser)-ILlβ.
6. Polypeptide (126Ala; 128Ala)-ILlβ.
7. Polypeptide δ(50Gly-51Gly)-ILlβ.
8. Fragment d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 2 à 7 caractérisé en ce qu'il possède la capacité d'inhiber sélectivement l'effet de l'ILlβ humaine sur le métabolisme des cartilages.
9. Séquence d'ADN codant pour un polypeptide ou un fragment de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 8.
10. Séquence d'ADN selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie d'une séquence choisie parmi celles présentées aux figures 2b, 2c et 2d.
II. Vecteur de clonage et bu d'expression caractérisé en ce qu'il contient une séquence d'ADN selon l'une des revendications 9 et 10.
12. Vecteur de clonage et/ou d'expression selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il est intégratif ou autoréplicatif .
13. Cellule recombinée contenant un vecteur selon l'une des revendications 11 et 12.
14. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une des revendications
1 à 7 ou d'un fragment de polypeptide selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule recombinée selon la revendication 13 dans des conditions d'expression, et on récupère le produit obtenu.
15. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides ou fragments de polypeptides selon l'une des revendications 1 à 8.
16. Composition pharmaceutique selon la revendication 15 destinée au traitement des pathologies ostéoarticulaires.
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