WO1991006005A1

WO1991006005A1 - Method of assaying d-vanillylmandelic acid, and reagent and kit therefor

Info

Publication number: WO1991006005A1
Application number: PCT/JP1990/001344
Authority: WO
Inventors: Manami Kuroda; Masato Sugi
Original assignee: Yamasa Shoyu KK
Current assignee: Yamasa Shoyu KK
Priority date: 1989-10-19
Filing date: 1990-10-18
Publication date: 1991-05-02
Anticipated expiration: 1992-04-19
Also published as: AU638500B2; ATE136650T1; EP0450095A4; AU6532390A; US5298397A; JPH0782015B2; DE69026497T2; EP0450095A1; CA2044154A1; EP0450095B1; CA2044154C; DE69026497D1

Description

明細書

D型バニリルマンデル酸の測定法およびそれに使用する試薬およびキット技術分野

本発明は生体試料中に含まれる D型バニリルマンデル酸の測定法およびそれに使用する試薬およびキットに関するものである。

背景技術

カテコールアミン酸性代謝物を産生する腫瘍としては, 褐色細胞腫および神経芽細胞腫が知られている。神経芽細胞腿は主に小児に発生し、日本におてはマススクリー二ングの測定項目とされている。

生体内における神経芽細胞腫の存在の確認は尿中の力テコールアミン酸性代謝物であるバニリルマンデル酸 ( V M A ) およびホモバニリン酸（H V A ) の含有量を測定することにより判断されている。

従来、尿中の V M Aおよび H V Aの測定に用いられている方法としてはスポット法、ディップ法などの定性法、高速液体クロマトグラフィー（H P L C ) 法、免疫学的測定法などの定量法が報告されている。スポット法、ディップ法は偽陽性の出現率が高く、必ずしも満足できる方法ではない。また、 H P L C法は精度の点では信頼できる俊れた方法であるが、装置の維持、管理に熟練の専従者を必要とし、かつ複数の検体を同時に処理できないという欠点を有している。

これに対して、免疫学的測定法は上述の従来法の欠点を克服できるものと期待されている（特開昭 60— 1 23765号公報、特開昭 62 - 1 1 165号公報、 Biogenic Amines, Vol .4, No.3, pp229〜 235

( 1 987) 、小児がん、 J_£、 250 - 252

( 1 988) 、改訂版神経芽钿胞腫マス，スクリーニング、第 148〜 1 52頁、 1 989年、社会福祉法人恩賜財団母子愛育会発行、 Journal of Immunological Methods. 118. 101 〜107(1989) など参照）。

VM Aは下記式で示すように、その分子内に不斉炭素を有し、光学活性の異なる二つの光学異性体（D型と L 型）が存在する。

〔式中、は不斉炭素を示す〕

しかし、従来報告されている免疫学的測定法では、 D 型 VM Aを特異的に測定できるか否かに関してはまったく言及されておらず、その示唆もされていない。発明の開示

本発明者らは D型 VMAを特異的に、しかも簡便に測定する方法を開発すべく研究を重ねた結果、抗 D型 VMA抗体の取得に成功し、該抗体を用いて極めて簡便な方法により生体試料中の D型 VM Aのみを特異的に測定する方法を確立し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、生体試料中の D型 VM Aを下記の（A) 〜（D) 工程により測定する方法において、検量曲線を作成するための標準物質として D型 VMAと L 型 VMAの等量混合物（ラセミ混合物）を使用し、標識化抗 V M A抗体として標識化抗 D型 VM A抗体を使用し、下記（D) 工程において得られた値から生体試料中に含まれる D型 VM Aの濃度を算出することを特徴とする生体試料中の D型 V M Aの測定法に関するものである。

(A) 固相に VMAを結合させて得た固相化 VMAと標識化抗 VMA抗体を用い、生体試料中の VMA と固相化 VM Aとを標識化抗 VM A抗体に対して競合反応させる工程；

( B ) 液相部と固相部とを分離し、固相部を必要により洗浄する工程；

( C ) 固相化 VM Aに結合した標識化抗 VM A抗体の標識量またはそれ以外の標識量を測定する工程；および

(D) 生体試料の代わりに既知の濃度の VMA (標準物質）を使用する以外は上記（A) 〜（ C) 工程と同様の方法を実施することにより得られる標識量と VMA濃度との関係を示す曲線（検量曲線）を作成するか、あるいは関係式を求め、該検量曲線または該関係式から上記（ C) 工程で得られた標識量に対応する VMAの濃度を算出し、該濃度を生体試料中に含まれる V MAの濃度とするェ住。

また、本発明は上記測定法で使用する下記の①〜③の特性を有する抗 D型 VM A抗体試薬に関するものである _t

① 親和性

D型 VMAに特異的に反応する。

② 交差性

D型 V M Aへの反応性を 1 0 0 %とした場合の L 型 VM Aへの反応性は 1 %以下である。

③ クラス

I g Gに属する。

さらに、本発明は上記測定法を実施するための、下記の①および②の試薬から構成される D型 VM A測定用キットに関するものである。

① 標識化された上記抗 D型 VM A抗体試薬

② 固相化 VMA試薬

図面の簡単な説明

第 1図は、 VM Aのラセミ混合物（D L— VMA) を標準物質として用い、作成した検量曲線を示すグラフでめ

発明を実施するための最良の形態 I . D型 VMAの測定法

本発明方法は上述の（A) 〜（D) 工程で示される四工程より構成される。

(A) 工程

(A) 工程で使用する生体試料としては、尿、血液、体液、精液、髄液など試料中に D型 VMAを含有する可能性のあるものであれば特に制限されない。

たとえば、尿を生体試料として使用する場合には採取した原尿を必要により希釈 ¾ (たとえば、リン酸緩銜生理食塩水（P B S) など）で 2〜 20倍に希釈したものを試料として使用する。また、濾紙に吸収させた尿を P B Sで抽出して得た濾紙抽出尿も試料として使用することができる。

(A) 工程で使用する固相化 VMAはハプテンの固相化法として通常用いられている方法により調製することができる。たとえば、 VMAと高分子担体との複合体をマイクロプレートなどの固相に常法により結合させればよい。

高分子担体と結合させる VMAとしては、 D型 VMA または D型 VM Aと L型 VMAとの等量混合物（ラセミ混合物）を使用することができる。一ら —

複合体を調製するために使用する高分子担体としては、通常ハプテン抗原に対する抗体の作成にあたり常用されている天然の高分子担体を使用することができる。たとえば、ゥシ血清アルブミン、ゥサギ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンなどの動物血清アルブミン類、ゥシ血清グロブリン、ゥサギ血清グロブリン、ヒト血清グ口ブリン、ヒッジ血清グロプリンなどの動物血清グロプリン類、ゥシチログロブリン、ゥサギチログロブリンなどの動物チログロブリン類、ゥシヘモグロビン、ヒッジへモグロビン、ヒトヘモグロビンなどの動物ヘモグロビン類、キーホールリンぺッ卜へモシァニンなどのへモシァニン類などを例示することができる。

高分子担体と V M Aとの結合はマンニッヒ反応を応用することにより実施することができる（特開昭 6 1 — 1 1 1 5 2号公報参照）。

上述のようにして得られた複合体を結合させるための固相の形状、大きさおよび材質は特に制限されない。すなわち、マイクロプレート、ディスク、チューブ、ビーズ、ラテックスなどの固相として常用されているものを使用すればよい。

固相と上記複合体との結合は、吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法、包括法などいずれも適用することができる。具体的に、このような結合法は固定化酵素の調製に利用されている方法を応用すればよく、たとえば「固定化酵素」（昭和 5 0年、（株）講談社発行）第 9〜 7 5頁などの成書を参照することができる。

(A) 工程で標識化抗 D型 VMA抗体として使用する抗 D型 VMA抗体は、たとえば上述の VMAと高分子担体との複合体を免疫抗原とし、該免疫抗原を動物に投与して生体内に D型 VMAを認識する抗体を産生させ、これを取得する方法に従って調製することができる。

免疫抗原を投与する動物としては、ゥシ、ゥマ、ヒッジ、ャギ、ラット、マウス、モルモット、ィヌ、ブタ、ゥサギ、サル、ハト、ニヮトリなどいずれであつてもよく、特にマウス、ラッ卜、モル乇ット、ゥサギ、ャギなどが好都合である。

このような動物への免疫抗原の投与は常法に従って行えばよく、たとえば、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ミヨウノ、'ンアジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳菌ァジュバン卜などの各種アジュバントと上述の免疫抗原との懸濁液を調製し、これを上記動物の静脈内、腹腔内、皮下または皮内に投与すればよい。

投与量は、動物としてゥサギ、モルモットを使用する場合には復合体の量として 0. 0 1〜 1 0mg/匹、またはマウス、ラットを使用する場合には、 0. 0 0 1〜 1 mgZ匹程度が好適である。

初回投与後、 1〜4週間おきに 1〜 5回程度の上記と同様の追加免疫を行うことで、 D型 V M Aを認識する抗体を産生させることができる。

このようにして産生された抗体は、最終免疫の 1〜 2 週間後に採血し、これを遠心分離することにより抗血清として取得することができる。抗体の精製が必要とされる場合には、さらに、溶解度差を利用した選択的分別法 (たとえば、塩析、アルコール沈殿など）、電荷の差を利用した分別法（たとえばイオン交換クロマトグラフィ一、電気泳動など）、分子量の差を利用した分別法（たとえば超遠心法、ゲル濾過法など）などの常法を適宜組み合わせて抗血清中に存在する抗体を抗体のクラスごとに分別精製してもよい。特に、免疫抗原として使用した D型 V M Aと高分子担体との複合体を固定化して得た固定化抗原を利用すると、 D型 V M Aを認識する抗体のみを分別精製しうる。

次に、モノクローナル抗体の調製について説明すれば、該モノクローナル抗体は公知の細胞融合法、 E B ウィルスなどによるトランスフォーメーション法などを適宜応用することにより調製することができる。

モノクローナル抗体の大量生産により好適な細胞融合法を例に挙げ説明すれば、たとえば以下の手順で D型 V M Aを認識するモノクローナル抗体を取得することができる。 a) 抗体産生細胞の調製

前記免疫抗原を動物、好ましくはマウス、ラットなどに抗血清の場合と同様に免疫し、免疫を獲得した動物からの脾細胞、リンパ節細胞、末梢血リンパ球などの抗体産生細胞を常法により取得する。

b) ミエローマ細胞の調製

ミエローマ細胞としては、マウス、ラッ卜、ヒトなどの種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。通常、 8 - ァザグァニン耐性株が用いられ、この細胞株はヒポキサンチン - グァニンホスホリ r シノレ卜ランスフェラーゼ (Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) を欠損しヒポキサンチン ♦ アミノプテリン · チミジン（HAT) 培地に生育できない。また細胞の性質として免疫グロブリンを分泌しない、いわゆる非分泌型の細胞株であることが好ましい C ミエローマ細胞株の具体例としては、 P 3 X 63Ag8 (A T C C T I B— 9) (Nature. 256, 495 - 497 ( 1 975) ) 、 P 3 X 63 Ag8 U. 1

( P U ₂ ) (AT C C C R L - 1 597) (Current Topics in Microbiology and I niniunol ogy , 81 , 1 - 7 ( 1 978) ) 、 P 3 X 63 Ag8. 653 (AT C C C R L - 1 5 8 0 ) (J. Immunology, 1 2 3 , 1 54 8 - 1 5 5 0 ( 1 9 7 9 ) ) 、 P 2 /N S I Z 1 — Ag4— 1 ( A T C C T I B— 1 8) (European J .1 inraunology, 6_, 5 1 1 - 5 1 9 ( 1 9 7 6 ) ) 、 S p 2 / O - Ag 1 4 ( A T C C C R L - 1 58 1 ) (Nature, 2 7 6 , 2 6 9 - 2 7 0 ( 1 9 7 8) ) などのマウスミエローマ細胞株、 2 1 0. R C Y. A l . 2. 3 (Y 3 - Agl . 2. 3 ) (A T C C C R L - 1 6 3 1 ) (Nature, 2 7 7 , 1 3 1 - 1 3 3 ( 1 9 7 9 ) ) などのラットミエローマ細胞株、 U - 2 6 6— (ProcNatl .Acad.

Sci.U.S.A.. 7 7 , 54 2 9 ( 1 9 8 0 ) ) 、 G M 1 5 0 0 (Nature, 288, 4 88 ( 1 9 8 0 ) 、 K R 一 4 (ProcNatl .Acad.Sei.U.S.A. , 7 9 , 6 6 5 1 ( 1 9 82 ) ) などのヒトミエローマ細胞株を例示することができる。

c) 細胞融合

細胞融合にあたっては、抗体産生細胞に適合したミエローマ細胞を選定する。細胞融合は、イーグルの最少必須培地（M E M) 、ダルベッコ変法イーグル培地

(D M E M) 、 R P M I 1 64 0培地などの動物細胞培養用培地中で 1 0 ' 〜 1 0 ^οノ mlのミエローマ細胞と抗体産生細胞を混合比 1 ： 4〜 1 0に混合し、 3 7でで 1 〜 1 0分間細胞同士を接触させることにより効率よく融合を行うことができる。細胞融合を促進させるために、平均分子量 1 000〜 6000のポリエチレングリコール（P E G) 、ポリビニールアルコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を使用することができる。

また、電気パルスを利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させることもできる。

d) 選択培地におけるハイプリドーマの選別

細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリドーマを選別する手段としては、選択的培地における細胞の選択的増殖を利用する方法を用いることができる。たとえば、細胞懸濁液を 1 5 %ゥシ胎児血清（ F C S ) 含有 R P M I 1 640培地などで適当に希釈後、マイクロプレート上に 1 0 〜 1 0⁶ Zゥエル程度まき、各ゥエルに選択培地（たとえば、 HAT培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。ミエローマ細胞として 8 - ァザグァニン耐性株、選択培地として HAT 培地を用いた場合は、未融合のミエローマ細胞は培養 1 0日目ぐらいまでに死滅し、正常細胞である抗体産生細胞もインビトロ（in vitro) では長期間生育できないので、培養 1 0〜 14日目から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。

e) D型 VM Aを認識するモノク口一ナル抗体を産生するハイプリドーマの検索

D型 VM Aを認識するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマの検索は、酵素免疫測定法（ E L A、 E L I S A ) 、ラジオィムノアッセィ（ R I A ) などによって行うことができる。たとえば、前記の免疫抗原 (特に D型 V M Aと高分子担体との複合体）および免疫抗原作製時に使用した高分子担体をそれぞれ吸着させた 9 6ゥエル E L I S A用マイクロプレートにモノクロ一ナル抗体を含む培養上清を添加して免疫抗原および高分子担体と反応させ、次いで結合した特異抗体に酵素標識抗免疫グロブリン抗体を反応させるか、あるいはビォチン標識抗免疫グロブリン抗体を反応させたのちァビジン D -酵素標識体を反応させ、次いでいずれの場合とも各ゥエルに酵素基質を加えて発色させる。免疫抗原を固定化したゥエルにおいては発色し、高分子担体を固定化したゥエルでは発色しない培養上清を選別することにより、 D型 V M Aと特異的に反応する抗体を産生するハイプリドーマを検索することができる。

f) クローニング

ハイプリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天法、フィプリンゲル法、蛍光励起セルソーター法などにより行うことができる。

g) モノクローナル抗体の産生

このようにして取得したハイプリドーマからモノクローナル抗体を産生する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法などが採用されうる。細胞培養法においては、ハイプリドーマを 1 0〜 1 5 % F C S含有 R PM I 1 640培地、無血清培地などの動物細胞培養用培地中で培養し、その培養上清液から抗体を取得することができる。

腹水から回収する方法では、ハイプリドーマと腫瘍組織適合性が一致する動物に、プリスタン（2, 6, 1 0, 14 - テトラメチルペン夕デカン）などの鉱物油を腹腔内に投与した後、たとえばマウスの場合にはハイプリド一マを約 1 0⁷ Z匹腹腔内投与する。ハイプリドーマは 1 C！〜 18日ほどで腹水腫瘍を形成し、血清および腹水中に高濃度に抗体を生産する。

抗体の精製が必要とされる場合には、硫安塩折法、 D E A Eセルロースなどの陰ィォン交換体を利用するィォン交換ク口マトグラフィ一、プロテイン A -セファロースなどを用いるァフィ二ティ一クロマ卜グラフィ一、分子ふるいクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択し、組み合わせることにより精製することができる 0

このようにして得られた抗体は標識化して本発明方法に供する。

使用する抗体は抗体そのものであってもよいが、非特異的な吸着を防止する意味から抗体の活性フラグメン卜を使用するのが好ましい。

抗体の活性フラグメントは、抗体の特徴を保持するもの（たとえば、 F ( a b ⁷ ) ₂、 F a b ' 、 F a bなどの各種フラグメント）であればいずれのものであってもよい。これら活性フラグメントの調製は、精製抗体をパパイン、ペプシン、トリプシンなどのプロテア一ゼを用いて限定分解する方法など公知の方法を適用して行うことができる（たとえば「免疫生化学研究法（铳生化学実験講座 5 ) 」、日本生化学会編、 89頁（ 1 986年）参照）。

抗体に結合させる標識剤としては、放射性同位体（たとえば ^a8P、 ³ H、 ⁵ じなど）、酵素（たとえば、 β - ガラクトシダーゼ、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファタ一ゼ、グルコース - 6 - リン酸デヒドロゲナ一ゼ、力タラ一ゼ、グルコースォキシダ一ゼ、乳酸ォキシダーゼ、アルコールォキシダーゼ、モノアミンォキシダーゼなど）、補酵素 ·補欠分子族（たとえば、 F AD、 F MN、 A T P、ピオチン、ヘムなど）、フルォレセィン誘導体（たとえば、フルォレイセンイソチオシアナ一ト、フルォレセインチオフルハ'ミノレなど）、ローダミン誘導体（たとえば、テトラメチルローダミン Bイソチォシアナートなど）、ゥムベリフエロンおよび 1 - ァニリノ - 8 - ナフタレンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノール誘導体（たとえば、ルミノール、イソルミノ一ル、 N - ( 6 - ァミノへキシル） - N - ェチルイソノレミノールなど）などを用いることができる。抗体またはその活性フラグメントと標識剤との結合は、成書〔たとえば、「続生化学実験講座 5 免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、（ 1 986年発行）第 1 02〜 1 1 2頁〕に記載されているような公知の方法から適宜選択して実施すればよい。

( A) 工程においては、前述の固相化 VM Aと生体試料中の VM Aとを標識化抗 D型 V MA抗体に対して競合反応させる。反応は 4〜 50 C、好ましくは 20〜 40 Cで 0. 1〜； L 0時間、好ましくは 0. 5〜 2時間程度接触させることにより実施することができる。

(B) 工程

本発明方法の（B) 工程においては、（A) 工程終了後、液相部と固相部を分離（BZF分離）し、必要に応じて固相部を洗浄する工程である。

BZF分離は固相から液相部を除去できる方法であればいずれの方法であってもよい。具体的には、マイクロプレート、チューブ等を固相として使用した場合には固相部を傾けたり、洗浄したり、反転または回転させることにより液相を固相から物理的に除去することができる。また、ビーズ、ラテックスなどの粒状の固相を使用した場合には濾過、遠心分離、吸引、洗浄などの手段により液相と固相を分離することができる。

BZF分離後、固相の洗浄は、 P B Sなどの緩銜液または食塩水などの塩溶液を用いて行うことができる。また、洗浄は B / F分離と同時に行ってもよい。

( C ) 工程

本発明方法の（ C) 工程は固相に結合した標識化抗 D 型 VM A抗体の標識量またはそれ以外の標識量を測定する Ifeでめ ₀

標識量の測定は、使用した標識の種類に応じてその標識の測定に使用している通常の方法を用いて実施すればよい。

たとえば、放射性同位元素を標識として使用した場合には液体シンチレーシヨンカウンタ一等を用いて測定することができる。また標識としてペルォキシダーゼ、力タラーゼ、グルコースォキシダーゼ、乳酸ォキシダーゼ、アルコールォキシダーゼ、モノアミンォキシダーゼなどの酸化還元酵素を用いた場合には、基質として過酸化水素（H ₂0₂ ) 、呈色試薬として o - フヱニレンジアミン、 2 , 2 ' - ァミノビス（ 3 - ェチルベンズチアゾリンスルホン酸）アンモニゥム酸（A B T S ) 、 3, 3' , 5, 5 ' ーテトラメチルベンチジン（TMB Z ) などを使用し、 ^ - ガラクトシダーゼを用いた時には基質としてフルォレセイン - ジ - ( y8 - D - ガラクトビラノシド）を使用し、反応後の溶液中の吸光度または蛍光強度を測定すればよい。

(D) 工程

(D) 工程においては、既知濃度の VMAラセミ混合物を用いて作成した検量曲線から上述の（ C) 工程で測定した生体試料の標識量に対応する D型 VM Aの濃度を算出する工程である。

本発明方法で使用する標準曲線は標準物質として

VMAのラセミ混合物を使用して作成する。 VMAは通常ラセミ混合物の形で市販されており、このラセミ混合物は光学分割することができるが、操作が煩雑で、かつ分割収率も満足できるものではない。このため、ラセミ混合物自体を標準物質として使用する方が好都合である (D) 工程おける D型 VMAの算出の方法は、 VMA のラセミ混合物を用いて作成した検量曲線から得られる値を半分にして D型 VM Aの濃度とする方法が最も簡便な方法である。しかし、本発明方法においては上記方法に限定されるものではなく、たとえば、 V M Aのラセミ混合物を用いて測定した標識量を縦軸に、 VMAのラセミ混合物の半分の濃度を横軸にして検量曲線を作成し、該検量曲線から試料中の D型 VM Aの濃度を直接的に求める方法、 VMAのラセミ混合物を用いて測定した標識量と VMAのラセミ混合物中の D型 VM Aの濃度との関係式をコンピュータ一により求め、該関係式から試料中の D型 V M Aの濃度を求める方法など、 VMAのラセミ混合物を標準物質として用いた検量曲線または関係式から D型 V M Aの濃度を算出できる方法であればいずれの方法であっても採用することができる。 Π. 抗 D型 VMA抗体試薬

上記測定法で使用する抗体試薬としては、後述の実施例で示されているような下記の性質を有するものが好ましい。

① 親和性

D型 VM Aに特異的に反応する。

② 交差性

D型 V M Aへの反応性を 1 0 0 %とした場合の L 型 V M Aへの反応性は 1 %以下である。

③ クラス

I g Gに属する。

このような性質、特に L型 VMAに対する交差性が 1 %以下であるものを使用すれば、標準物質として VMA のラセミ混合物を使用しても、該標準物質中の L型 V M Aとの反応性はほぼ完全に無視することができる。このため、上記測定法の（D) 工程で示したような極めて簡便な方法で D型 VM Aの真の存在量を算出することができる、という効果を有する。

上記抗体試薬を標識化する場合の標識の種類および標識化方法は、既に I ― (A) 工程の段で説明したとおりある。

Π. D型 VMA測定用キット

本発明の測定法を実施するための測定用キットは少なくとも下記の試薬を構成成分とする。 ① 標識化された上記抗 D型 VMA抗体試薬

② 固相化 VM A試薬

上記キットにおいて①の本発明の抗体試薬を標識したものを使用することにより L型 VMAとの反応性を無視できるため、 ②の固相化 VMA試薬中の VMAとしては D型 VMAはもとより VMAのラセミ混合物を使用することもできる。

具体的には、酵素標識化した抗体試薬を用いる測定キットは、例えば下記の試薬から構成される。

① 固相化 VM A試薬（マイクロプレートに VM Aラセミ混合物を結合させたもの）

② ペルォキシダーゼで標識した上記抗 D型 VM A抗体試薬

③ 基質液（過酸化水素 + TMB Z )

④ 酵素反応停止液（硫酸水溶液）

⑤ 既知濃度の標準物質（VMAラセミ混合物）上記各試薬の調製法およびこれら試薬から構成されるキットを用いた D型 VMAの測定法の詳細は、後述の実施例に記載したとおりである。

以下、実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。実施例 1

① 標識化抗 D型 VMA抗体の調製

VMAのラセミ混合物（以下「D L— VMA」と記載する） 0. 3 mMおよびヒト血清アルブミン（H S A) 1 0 0 ^を 0. 3 M炭酸水素ナトリウム溶液 1. 0mlに溶解させ、 3 7 %ホルマリン 0. 2mlを加え、 3 M酢酸ナトリゥム溶液で p H 6〜 7に調整した。共栓試験管の空間部を窒素ガスで置換し、 2 0 ± 3。Cで 7 0時間遮光下反応させた。反応後、 1 0での蒸留水で数回透析し、凍結乾燥して D L - VMA - H S A複合体を得た。

上述の D L - V M A— H S A ( 1 mg/ml) を生理食塩水に溶解させ、完全フロイントアジュバントと 1 ： 1で混合してエマルジョンとしたものを BalbZ cマウス（雌、 6週齡）の腹腔内に 5 0 ; g / 1 0 0 1投与して初回免疫とした。

初回免疫後、 2週間おきに数回、同様の方法で免疫した後、最終免疫として上記ェマルジヨン 5 0 μ g Z

1 0 0 fi I をマウスの尾静脈に投与した。

最終免疫から 3日後にマウスの脾細胞を摘出し、ィ一ダルの最少必須培地（M E M) で洗浄した。マウスミエローマ P 3 x 6 3 Ag8 U. 1 ( P ₃ U ₂ ) (A T C C C R L - 1 5 9 7 ) を M E Mで洗浄し、脾細胞と

P g U iを 1 0 : 1で混合したのち遠心分離して得たぺレツトに 5 0 %ポリエチレングリコール（ P E G)

1 0 0 0含有 M E M溶液 1 mlを徐々に加えて、細胞融合を行った。さらに、 M E M溶液を加えて 1 0 mlとし、遠心分離して得たペレットを 1 0 %ゥシ胎児血清（ F C S ) 含有 R P M I 1 64 0培地に P s TJ として 3 X 10⁴ eel 1/ 0. 1 mlとなるように懸濁させ、 9 6ウェルマィクロプレートに各ゥエル 0. 1 mlずつ分注した。 1 日後、 11 丁培地を 0. 1 ml添加し、その後 3〜4 日ごとに培地の半分量を新しい H A T培地で交換し、ハイプリドーマの生育が認められたゥエル（ 1 1 5 2株）の上清

1 0 0 1 を分取し、 P B S 2 0 0 1で希釈した。あらかじめ H S Aでコートした 9 6ウェルマイク口プレートおよび D型 V MA— H S A { 1 0 g /ml) でコートした 9 6ウェルマイク口プレートに上記の希釈した培養上清液をそれぞれ 5 0 gずつ添加した。アビジン D - 酵素結合体として、アビジン D -ペルォキシダーゼ（ベクタ一社製）、基質および発色剤として過酸化水素および 4 - ァミノアンチビリン/フエノールを用いた

E L I S A法により D型 V MA— H S Aと反応し、

H S Aと反応しない抗体を産生するハイプリドーマ 2 5 株（ 1 1 5 2株中）を選択した（ 1次スクリーニング）。次に D型 V MA— H S A ( 0. 1 μ. g / ml) を 1 ゥエルあたりで 5 0 〃 1加えてコートしたプレートに、前述で選択したハイプリドーマの培養上清 2 5 cz 1 と D L — V MAの希釈液（ 1 6 0、 3 2、 6. 4、 1. 2 8、

0. 2 5 6、 0. 0 5、 0 ( /z g D L - V MAZml))をそれぞれ 2 5 1加えた。室温下、 1時間保持した後、発色剤として 0 - フユ二レンジアミンを使う他は前述の E L I S A法の場合と同じ試薬を用いて、競合法による酵素免疫測定法を行つた。

D L - VMA 0 n g / mlでの吸光度と、各濃度の吸光度の差を調べ、低濃度において吸光度の差が大きいモノクローナル抗体を産生する 4種のハイプリドーマ（V 9 0 1株、 V 9 1 1株、 V 9 1 2株、 V 9 14株）を選別した（ 2次スクリーニング）。

次に限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行った。クローニング後、細胞（ハイプリドーマ）を培養して細胞数を増やし、あらかじめプリスタンを腹腔内に投与して 1ヶ月位たつたマウスの腹腔内へ一匹あたり 3 X 1 0 ⁶細胞を投与した。

2週間後マウス 1匹あたり約 2 0 mlの腹水を採取した, 腹水約 4 0ml ( 2匹分）と同量の P B Sを加えて希釈した後、飽和硫安を加え、 5 0 %硫安飽和条件下にて沈殿する画分を遠心分離した。この沈殿画分に約 1 0 mlの 0. 1モルトリス -塩酸緩衝液（ p H 7. 2) を加えて溶解させ、これを同綾街液に対して 2日間透析した。

次に、抗体溶液を D E 5 2 (ワットマン社製）を充填したカラム（ 2 2 mm X 6 5 cm) に添加し、素通り画分を集め、次にこの素通り画分をウルトロゲル A c A44

( I B F社製）を充填したカラム（ 2 2 mmX 6 5 cm) に添加しゲル濾過することにより、約 6 0 0 mgの精製抗体を得た。

2次スクリーニングによって選別した 4株のハイプリドーマにより得られた抗 D型 V MA抗体の免疫学的性質を以下に示す。

特異的親和性：

いずれの抗体も D型 VM Aに対して特異的に反応するものであった。

交差性：

D型 V M Aに対する結合性を 1 0 0 %とした時、他のカテコールアミン酸性代謝物に対する抗体の交差性を調ベた結果を第 1表に示す。

カテコールアミン酸性代謝物抗体結合性 (重量％)

D型 VM A 1 0 0

D L - V M A 5 0

L型 V M A < 1

ホモバニリン酸（H V A) < 0. 0 1

3 , 4 - ジヒドロキシマンデ 4

リン酸（ D 0 M A )

3 , 4 - ジヒドロキシフエ二 < 0. 0 1 ノレ酢酸（ D 0 P A C )

メタネフイリン < 0. 0 1 バニルピルビン酸 4 なお、交差性は、各カテコールアミン酸性代謝物についてそれぞれ標準曲線を描き、 50%阻害時（点）における各カテコールアミン酸性代謝物の濃度比を比較する方法により求めた。

サブクラス ♦ タイプ：

得られた抗体のサブクラスは I _g G ₂ „ Z (1株）と I _g G丄 ( 3株）であった。

このようにして得たモノクローナル抗体液 5ml (濃度 1 OiagZml) を、 0. 1モル酢酸緩衝液（p H 3. 9 ) に対して透折した。透析して得たモノクローナル抗体液に 5 mlの酵素液〔ペプシン 2 oig、塩化ナトリウム

8. 7mgを 0. 1モル酢酸緩街液（p H 3. 9) に溶解させたもの〕を加え、 37でで一晚反応させた。反応液を 0. 1 Mホウ酸锾衝液（p H8. 0) に対して透析後、ウルトロゲル A c A 44を用いてゲル滹過し、

F ( a b ' ) ₂画分を集めた。得られた F ( a b ' ) ₂ 画分溶液を 4m / mlとなるようにセントリ一フロー（ァミコン社）を用いて濃縮した後、 0. 1モルりん酸緩衝液（ p H 6. 0 ) に対して透析した。次に 2 - メルカプトェチルァミン 1 1 mgを 5 raMの E D T Aを含む 0. 1 M りん酸緩衝液（p H 6. 0) に溶解させ、この溶液

l O O yu lを F ( a b ' ) つ液 1 mlに加えて 37でで 90分間反応させた。反応後、反応液をセフアデックス G 25でゲル濾過し、素通りのたんぱく質画分を集め、セントリ一フローを用いて l mlまで濃縮し、抗 D型

V M Aモノクローナル抗体の F a b ' 溶液を得た。

次に、ホースラディッシュベルォキシダーゼ

(HR P 0 ：東洋紡鑌（株）製） 4 ragを 0. 6 mlの 0. 1モルりん酸緩衝液（P H 7, 0) に溶解させた。

N - サクシ二ミジル - 4 - ( N - マレイミドメチル）シクロへキサン - 1 - カルボキシレート（EMC S)

1. 5 ragに対し、 N , N - ジメチルホルムアミド（DM F) を加え、 1 5. 4ingZmlとなるように溶解させた。この溶液 60 ^ 1 と、先に調製した HR P O溶液とを混合し、室温で 2時間反応させた。次に、反応液をセファデックス G 25カラム（ 1 X 45 cm) でゲル濾過を行い、溶出液の 403 nmにおける吸収を測定し、 H R P 0に相当する素通り画分を集めセン卜リーフローを用いて 1 ml まで濃縮してマレイミド基を導入した HR P 0溶液を得た。

上記の F a b ' 溶液 lmlとマレイミド基を導入した

H R P 0溶液 1 mlを混合し、 4でで一晚反応させた。次に反応液全量をウルトロゲル A c A 44カラム（ 1. 5 X 4 5 cm) を用いてゲル濾過を行い、溶出液の 280 nra と 403 nmの吸収を測定し、 HR P Oと F a b' がほぼ 1 ： 1に結合していると推定される画分を集めた。得られた画分を P B Sに対して透析後、セントリーフローで濃縮し、ペルォキシダーゼ標識化抗 D型 VMA抗体溶液とした。

② 固相化抗原プレートの調製

①で調製した D L— VMA— H S A複合体を 5 mlの P B Sに溶解して抗原液とし、これを 9 6ゥエルマイクロプレートに 1 ゥエルあたり 5 0 ^ 1加え、室温に 1時間放置して吸着させた。残余の抗原液を除去したのち、各ゥエルを 3回 P B Sで洗浄した。次に、ゥエルの抗原未吸着部分をプロックするため 3 %のゼラチンを含む P B Sを 1 ゥエルあたり 3 0 0 /ί 1加えて室温に 1 時間放置し、残余のゼラチン含有 P B Sを除去後、減圧乾燥を行い、固相化抗原プレートとした。

③ D型 VMAおよび L型 VMAの調製

下記の移動相に溶解させた D L— VM Α溶液（0. 2 〜 2ragZml ：シグマ社製）を光学分割ク口マトグラフィ一用充填力ラムを用いた高速液体ク口マトグラフィー

(H P L C ) 法を用いて D型 VMAと L型 VMAに分離した。 H P L Cの分離条件は以下のとおりである。

, D型 VMA、 L型 VMAの分離条件：

カラム

T S K gel Enantio L I (4. 6imnx 2 5 cm : 東ソー（株）製）

移動相

0. 5πιΜ硫酸銅水溶液 - 1 -

流速

0. 5〜： L mlZ分

検出

2 54 ηιπ

分取した D型 VMA画分および L型 VMA画分についてそれぞれ ίμ—の吸収ビークが得られることを上述と同様の H P L C法で確認した。

このようにして得られた D型 VMA画分および L型 VMA画分中の VMAは銅イオンとの錯体を形成しているため、それぞれの画分 0. 7 mlに対して 2. 6 %塩酸溶液 0. 5mlを加えて錯体を破壊した。次に、酢酸ェチル 3 mlを加え、さらに塩化ナ卜リゥ厶を飽和状態になるまで加え、 1 0分間振遨後、それぞれの VMAを含有する酢酸ェチル層を分取し、窒素ガスで溶媒を留去し、得られた残渣を P B S 3 0 0 ^ 1 に溶解させて D型 VM A 溶液または L型 VMA溶液とした。

D型 VMAの確認は、 D L— V M Aから Armstrong らの方法 (Biochem.Biophys.Acta..2 5, 44 2

( 1 9 5 7 ) ) により得られた D型 VM A溶液を上述の H P L C法に供し、保持時間を比較することにより行つた。

④ 試料の測定

上述の D型 VMA溶液または L型 VMA溶液 5 0 β 1 およびペルォキシダーゼ標識抗 D型 VMA抗体溶液 5 0 11 1 を各ゥエルに加え、室温で 1時間静置反応させた。上記反応後、各ゥエルの液を捨て、 0. 9 %食塩水を用いて各ゥエルを洗浄した。

上記洗浄後、基質液（ 1 fflMHつ 0つと 0. 2 5 Μ

ΤΜ Β Ζを含有） 1 0 0 1 を加えて 2 5分間静置した, 反応停止液（ 2 Ν硫酸溶液） 1 0 0 1を加え、 4 5 0 nraにおける吸光度を 9 6穴マイクロプレートリ一ダー M P R - A4 (東ソ一（株）製）を用いて測定した。測定後、標準物質として既知濃度の D L— VMAを用いて作成した検量曲線（第 1図）から上記の吸光度に対応する VMA量を求めた。

また、同様の試料を H P L C法により測定した。

H P L C法の測定条件は下記のとおりである。

•測定条件：

カラム

P - 1 8 T (4 X 250 mm : I R I C A社製）移動相

リン酸緩衝液（p H 3. 0、 1. 3 6 Mアセトン、 0. 0 1 3raME D T A含有）

検出

電気化学的検出器∑— 87 5 (電圧 85 0raV :

I R I C A社製）

流速

0. 8ml/分測定結果を第 2表に示す,

1) 濃度単位は H g / ml

% 1 検出限界以上で測定できない

* 2 検出限界以下で測定できない第 2表から明らかなように、本発明方法は D型 VMA を特異的に測定できるのに対し、使用した標識化抗体が L型 V M Aとはほとんど反応しないため、 L型 VMAを測定できないことが明確となった。

実施例 2

① D型 VM A溶液を用いた検量曲線の作成

標準物質として既知の濃度の D型 VM A溶液を用いて実施例 1 と同様に反応させて検量曲線を作成した。

② 尿検体の測定

P B Sで 1 0倍に希釈した尿検体（A、 B、 C) を試料として実施例 1に記載した方法で尿検体中の D型

VMAを測定した。 4 5 0 innにおける吸光度もとに D L 一 VMAを用いて作成した実施例 1の検量曲線（第 1図）および D型 VM Aを用いて作成した上記検量曲線の 2つの検量線からそれぞれの V M Aの濃度を求めた。

また、実施例 1に記載した H P L C法により上記尿検体の VM A濃度を求めた。なお H P L C法の場合も D L 一 VMAと D型 VMAの 2つの標準物質を使用して検体中の VMA濃度を算出した。

検体の測定結果を第 3表に示す。第 3 表

1) 濃度単位は g Zml

H P L C法では D型と L型を区別できないので、標準物質として D型 VMAおよび D L— VMAを用いてもほぼ同等の値を与える。これに対して、本発明方法は D型 V M Aに特異的な抗体を使用しているために D L— VMAを標準物質として用いた時には標準物質中の全 VMAの半分量（D型 VMAの含有量）と反応する。したがって、 D L— VMAを標準物質として作成した検量曲線を用いて尿検体中の VM Aの濃度を求めると現実に存在する D型 VMAの 2倍の値が得られる。このため、標識化抗体として標識化抗 D型 VM A抗体および標準物質として D L— VMAを使用する本発明においては、測定により得られた値を半分にすることにより検体中の真の D型 VMAの値を求めることができる。

次に、コンピューターを用いて D L— VMAを用いて作成した検量曲線（第 1図）の解析を行い、本発明方法により得られる検体の吸光度（y) と検体中の D型

VMAの濃度（ X ) との間には下記の関係式が成立することを見出した。このため、検出曲線を作製しなくとも下記式より直接的に D型 VM Aの濃度を求めることもできる。なお、下記式の係数（a〜 d) は今回の測定系における係数であり、常に一定でないことは明らかである。 a - d

y

+ ( c /x) b + d a = 1. 478

b 0. 9 144

c 0 63

d 0. 02398 産業上の利用可能性本発明方法は、 D型 VMAを特異的に測定できるため. 神経芽細胞腿のマススクリーニングに適用することがでさる o

また、本発明の抗体試薬は、 L型 VMAと交差性が 1 %以下であるため、標準物質および固相化 VMA試薬を調製するた.めの VMAとして VMAのラセミ混合物を使用することができる。

さらに、上記抗体試薬を含む本発明の測定キットは本発明方法を実施するのに最適の測定用キットである。

Claims

請求の範囲

1. 生体試料中の D型バニリルマンデル酸（D型 VMA) を下記の（A) ~ (D) 工程により測定する方法において、検量曲線を作成するための標準物質として D型バニリルマンデル酸と L型バニリルマンデル酸の等量混合物（ラセミ混合物）を使用し、標識化抗バニリルマンデル酸抗体として標識化抗 D型バニリルマンデル酸抗体を使用し、下記（D) 工程において得られた値から生体試料中に含まれる D型バニリルマンデル酸の濃度を算出することを特徴とする生体試料中の D型バニリルマンデル酸の測定法：

(A) 固相にバニリルマンデル酸を結合させて得た固相化バニリルマンデル酸と標識化抗バニリルマンデル酸抗体を用い、生体試料中のバニリルマンデン酸と固相化バニリルマンデル酸とを標識化抗バ二リルマンデル酸抗体に対して競合反応させるェ程；

(B) 液相部と固相部とを分離し、固相部を必要により洗浄する工程；

( C ) 固相化バニリルマンデル酸に結合した標識化抗バニリルマンデル酸抗体の標識量またはそれ以外の標識量を測定する工程；および

(D) 生体試料の代わりに既知の濃度のバニリルマンデル酸（標準物質）を使用する以外は上記（A) 〜（ C) 工程と同様の方法を実施することにより得られる標識量とバニリルマンデル酸濃度との関係を示す曲線（検量曲線）を作成するか、あるいは関係式を求め、該検量曲線または該関係式から上記（C ) 工程で得られた標識量に対応するバニリルマンデル酸の濃度を算出し、該濃度を生体試料中に含まれるバニリルマンデル酸の濃度とする工程。

2. 抗 D型 VMA抗体が下記の①〜③の特性を有するものである、請求项 1記載の測定法：

① 親和性

D型 VMAに対して特異的に反応する；

② 交差性

D型 V M Aへの反応性を 1 ◦ 0 %とした場合の L 型 VM Aへの反応性は 1 %以下である；および

③ クラス

I g Gに属する。

3. 固相化 VMAが V N Aのラセミ混合物を固相に結合したものである、請求項 1または 2記載の測定法。

4. 請求項 1記載の測定法で使用する下記の①〜③ の特性を有する抗 D型 VM A抗体試薬：

① 親和性

D型 VM Aに対して特異的に反応する； ② 交差性

D型 VMAへの反応性を 1 00 %とした場合の L 型 VMAへの反応性は 1 %以下である；および

③ クラス

I g Gに厲する。

5. 請求項 1記載の測定法を実施するための、下記の①および②の試薬から構成される D型 VM A測定用キッ卜：

① 下記の A〜 (：の特性を有する標識化抗 D型 VM A 抗体試薬：

A 親和性

D型 VMAに特異的に反応する；

B 交差性

D型 VMAへの反応性を 1 00%とした場合の L 型 VM Aへの反応性は 1 %以下である；および

C クラス

I g Gに属する；

および

② 固相化 VMA試薬。

6. 固相化 VMA試薬が VMAのラセミ混合物を固相に結合させたものである、請求項 5記載の測定用キッ卜 ₀