WO1982003772A1

WO1982003772A1 - Medicament nouveau constitue par un complexe aprotinine-plasmine et procede de preparation de ce nouveau complexe

Info

Publication number: WO1982003772A1
Application number: PCT/FR1982/000078
Authority: WO
Inventors: Sa Choay
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1981-04-30
Filing date: 1982-04-29
Publication date: 1982-11-11
Anticipated expiration: 1983-10-30
Also published as: FR2504921B1; EP0077796A1; JPS58500610A; FR2504921A1

Abstract

Medicament nouveau constitue par un complexe aprotinine-plasmine, dans lequel l'aprotinine et la plasmine sont presentes dans un rapport qui peut varier de 1/1 a 2/1 environ. Procede de preparation de ce complexe, qui consiste a mettre en contact de la plasmine ou son precurseur, a savoir le plasminogene associe a un activateur, avec de l'aprotinine, en quantites appropriees, dans un solvant approprie, et a purifier le complexe aprotinine-plasmine obtenu par passage sur une colonne Sepharose-lysine. Application en tant que medicament pour les traitements fibrinolytiques.

Description

MEDICAMENT NOUVEAU CONSTITUE PAR UN COMPLEXE APROTININE- PLASMINE ET PROCEDE DE PREPARATION DE CE NOUVEAU COMPLEXE La présente invention est relative à un produit nouveau constitué par un complexe aprotinine-plasmine et plus particulièrement aprotinine-lys plasmine humaine et à l'utilisation de ce complexe nouveau en tant que médicament, notamment en tant que thrombolytique.

L'aprotinine est un inhibiteur naturel compétitif d'un certain nombre d'endopeptidases, extrait d'organes de bovins tels que poumons, pancréas, parotides, dans lesquels il est présent dans les microsomes cellulaires. Son activité d'inhibition, en particulier vis-à-vis de la trypsine, de la kallikréine et de la plasmine, a permis son utilisation en thérapeutique, notamment dans les fibrinolyses cataclysmiques en raison de son activité antiplasmine. L'Inventeur (cf. VAIREL E.G., ANTOINE G., Ann. Anesth. Franc., 1963, IV, n° spécial, 23) a pu démontrer que tout syndrome fibrinolytique est déclenché par une coagulation intravasculaire ; or, comme on le sait, une telle fibrinolyse est sous la dépendance de la plasmine, enzyme protéolytique formée à partir d'un précurseur plasmatique, le plasminogène, laquelle dégrade la fibrine qui constitue le caillot, en petits fragments solubles. Ainsi, la plasmine présente dans le sang circulant provoque la fibrinolyse du caillot. Or, l'aprotinine est un antifibrinolytique qui exerce une action d'inhibition de la fibrinolyse, en sorte que l'on aurait pu s'attendre à ce que son administration bien connue en thérapeutique, entraîne des phénomènes de coagulation intravasculaire. Or, ce n'est pas le cas : l'aprotinine est très largement utilisée dans le traitement des pancrëatites, sans provoquer le développement de syndromes de coagulation intravasculaire, bien que l'on observe dans tous les cas une hypercoagulation accompagnée d'une hyperfibrinolyse. De même, l'Inventeur a montré [VAIREL E.G., HUREAU J., Ann. Pharm. Franc., 1973, 31 (6), 409] que l'accélération de la coagulation par injection, chez le chien, de kaolin ou de trypsine, n'est pas modifiée par l'administration d'aprotinine et que l'on n'observe généralement pas de phénomène de coagulation intravasculaire. Par contre, l'administration d'acide epsilon-amino-caproïque, qui est un inhibiteur synthétique de la fibrinolyse, à la place de l'aprotinine, provoque la mort rapide des animaux d'expérience, par infarcissement cardiovasculaire massif, ce qui tendrait à démontrer que cet inhibiteur synthétique s'opposerait à la fibrinolyse aussi bien qu'à la fibrinogénolyse, alors que l'aprotinine ne serait, in vivo, inhibiteur que de la fibrinogénolyse (le fibrinogène étant, comme on le sait, le précurseur de la fibrine, et étant transformé en cette dernière sous l'action de la thrombine), son action antifibrinolytique s'expliquant par son action d'inhibition de la plasmine avec laquelle elle forme in situ un complexe enzyme-inhibiteur, considéré dans la Littérature comme étant dénué d'activité aussi bien vis-à-vis du fibrinogène que de la fibrine.

Des complexes plasmine-aprotinine ont été préparés dans l'Art antérieur [cf. "The Journal of Biological Chemistry, vol. 250, n° 10, 25 Mai 1975, p. 3988-3995, L. SUMMARIA, L. ARZADON, P. BERNABE et K.C. ROBBINS :

"The activation of Plasminogen to Plasmine by ϋrokinase in the présence of the Plasmin inhibitor trasylol" et "Thrombosis Research, 17, p. 143-152, B. WIMAN : "on the reaction of plasmin or plasmin-streptokinase complex with aprotinin or α₂-a-ntiplasmine"] ; toutefois, ces complexes ont essentiellement été préparés dans le but, pour l'équipe de SUMMARIA et Alia, ce démontrer qu'il ne se produit pas de clivages importants de s liaisons peptidiques dans la fraction qui comporte un -NH₂ terminal, des Gluplasminogènes humains ou de lapin et dans le Asp-plasminogène de chat ou dans le X-plasminogène de chien, pendant l'activation par des quantités catalytiques d'urokinase dans 25 % de glycérol, en présence de "Trasylol" (dénomination commerciale de l'aprotinine Bayer). Le but recherché par B. WIMAN a été, par exemple, d'étudier la cinétique de la réaction d'inactivation de la plasmine par l'aprotinine par la formation d'un complexe présent au cours d'une première étape de la réaction, sous une forme réversible et, au cours d'une deuxième étape, sous une forme modifiée, également réversible, à partir d'un mélange de plasmine avec un excès (60 %) d'aprotinine par rapport à la plasmine. SUMMARIA et Alia ont confirmé, dans leur étude précitée, que les complexes plasmineaprotinine sont inactifs en tant qu'enzymes. Aucune de ces publications n'a envisagé la possibilité d'une utilisation de ces complexes en thérapeutique, le but clairement visé de leurs Auteurs étant de tenter d'expliciter des mécanismes biochimiques en utilisant la propriété de l'aprotinine d'inhiber la plasmine in situ, à l'aide de modèles formés in vitro.

L'Inventeur a à présent mis en évidence que le complexe aprotinine-plasmine n'est pas inerte vis-à-vis de la fibrine, dans certaines conditions, et que, de ce fait, il peut être utilisé en tant que nouveau médicament fibrinolytique.

En effet, contrairement à ce que l'on croyait être le comportement du complexe qui se formerait in situ entre l'aprotinine et la plasmine et que l'on considérait comme tout à fait inerte tant vis-à-vis de la fibrine que du fibrinogène, l'Inventeur a pu établir que le produit nouveau conforme à l'invention n'est inerte que vis-à-vis du fibrinogène et ne l'est pas vis-à-vis de la fibrine. De plus, il est connu que les α2antiplasmines contenues dans le plasma sont capables d'inhiber les deux tiers environ de la plasmine pouvant être générée dans le plasma , à l ' égard de laquelle ils j ouent le rôle d ' inhibiteurs naturels présents dans le sang circulant ; de ce fait , il faut , pour que la fibrinolyse puisse se produire , que l ' on ait abaissé le taux d' α₂antiplasmines jusqu ' à un certain point , afin de permettre à la plasmine de jouer son rôle vis-à-vis de la fibrine , ce qui a pour effet une consommation très importante du plasminogène circulant , ce qui nécessite dé pourvoir à un apport externe de plasmine ou de plasminogène . Or , alors que la plasmine présente dans le sang circulant est inhibée par les α-antiplasmines , l ' Inventeur a pu établir que lorsque la plasmine est complexée avec l ' aprotinine conformément à l ' invention, elle est inerte vis-à-vis des α₂ antiplasmines , ce qui fait que l ' apport de plasmine nécessaire à la fibrinolyse est considérablement réduit et que cette dernière est susceptible d' exercer immédiatement son action . La présente invention a donc pour objet un médicament nouveau constitué par un complexe aprotinine-plasmine.

Selon un itode de réalisation avantageux de l'invention, le médicament nouveau est constitué par un complexe aprotinine-lys plasmine humaine.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'aprotinine et la plasmine sont présentes dans le complexe en quantités équimoléculaires, ce rapport 1/1 étant exprimé dans ce qui va suivre par l'abréviation AP.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'aprotinine et la plasmine sont présentes dans le complexe dans un rapport aprotinine/plasmine de 2/1,ce rapport 2/1 étant exprimé dans ce qui va suivre par l'abréviation APA.

La présente invention a également pour objet un nouveau procédé de préparation du complexe aprotinineplasmine , lequel consiste à mettre en contact de la plasmine ou son précurseur, le plasminogène associé à un activateur , avec de l ' aprotinine , en quantités appropriées , dans un solvant convenable , le complexe aprotinine-plasmin. formé étant purifié par passage sur une colonne de Sépharose-lysine, de manière à éliminer l'excès éventuel d'aprotinine et le cas échéant l'activateur si celui-ci a été précédemment ajouté et le complexe étant ensuite élué par l'acide epsilon-amino-caproïque à une concentration molaire d'au moins 0,05 M.

Selon un mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, dans le cas où l'on met en oeuvre le précurseur de la plasmine, à savoir le plasminogène, celui-ci est un plasminogène partiellement pré-activé tel que celui qui a été décrit dans le Brevet CHOAY n° 73 45289 déposé le 18 Décembre 1973 et publié sous le n° 2 254 316.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, l'activateur associé au plasminogène est l'urokinase.

Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, le mélange d'aprotinine et de plasmine comprend au moins 1400 à 2000 UIP d'aprotinine pour 1 microkatal de plasmine dans le cas où l'on cherche à obtenir un complexe dans lequel l'aprotinine et la plasmine doivent être présentes en quantités équimoléculaires.

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, le mélange d'aprotinine et de plasmine comprend au moins 3500 à 5000 UIP d'aprotinine pour 1 microkatal de plasmine, et avantageusement 3600 à 4000 UIP d'aprotinine pour 1 microkatal de plasmine, dans le cas où l'on cherche à obtenir un complexe dans lequel l'aprotinine et la plasmine doivent être présentes dans un rapport 2/1.

Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé qui fait l'objet de la présente invention, la complexation de l'aprotinine et de la plasmine est réalisée par incubation d'un mélange d'aprotinine et de plasmine, ou de plasminogène associé à un activateur, à une température comprise entre l'ambiante et 40°C. Selon une disposition particulière de ce mode de réalisation, dans le cas où l'on utilise le plasminogène associé à un activateur, la durée de l'incubation est suffisante - de l'ordre d'une heure environ -, pour provoquer la transformation du plasminogène en plasmine et la complexation de cette dernière avec l'aprotinine, ce temps pouvant être réduit à quelques minutes dans le cas où l'on met en oeuvre la plasmine.

Conformément à l'invention, le pH du mélange est de l'ordre de 7,4 ± 0,4.

Les différents paramètres ci-dessus indiqués, c'est-à-dire concentration des produits en présence, température, pH, durée d'incubation, sont ajustés les uns aux autres en vue d'obtenir le complexe désiré. Comme il est bien connu dans ce type de réaction, ces différents paramètres sont généralement en relation directe les uns avec les autres et il est clair que la modification de l'un de ces facteurs conduit à l'ajustement des autres en conséquence. Egalement conformément à l'invention, le complexe formé conformément à l'invention, est lyophilisé.

La Demanderesse a pu mettre en évidence que le complexe aprotinine-plasmine conforme à l'invention se fixe sur la fibrine, une certaine quantité d'aprotinine se trouve alors libérée et entraînée dans le plasma.

Le complexe ainsi modifié par la fibrine possède alors des propriétés fibrinolytiques qui s'exercent directement sur le support fibrine en l'hydrolysant. Cette modification a été démontrée, conformément à l'invention, par le dosage de l'activité inhibitrice de l'aprotinine sur la trypsine, selon la méthode de la Pharmacopée française, d'une part directement et, d'autre part, dans le surnageant trichloracétique 5 % dont la plasmine précipitée est éliminée. on constate :

1°) l'absence d'une activité inhibitrice directe du complexe sur la trypsine ; la totalité de l'inhibiteur engagé dans le complexe peut être retrouvée dans le surnageant trichloracétique de la solution du complexe ; 2°) en présence de fibrine, le complexe acquiert une activite inhibitrice directe sur la trypsine, ce qui montre une libération partielle d'aprotinine. De plus, le surnageant du précipité trichloracétique de l'ensemble (fibrine, fibrinopeptides, complexe et aprotinine libre), permet de retrouver dans le surnageant la totalité de l'aprotinine engagée dans le complexe.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.

L'invention vise plus particulièrement le médicament nouveau conforme à l'invention, ainsi que le procédé et les moyens mis en oeuvre pour sa préparation et son utilisation.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation du complexe conforme à l'invention, de dosage de l'aprotinine libérée du complexe, ainsi qu'à un compte-rendu d'expérimentations relatives à l'activité pharmacologique du nouveau complexe conforme à l'invention. Il doit être bien entendu toutefois que ces exempies de préparation et de dosage et ce compte-rendu d'expérimentations sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 - OBTENTION D'UN COMPLEXE APA On mélange :

- Lys plasminogène 30 microkatals

- Aprotinine 300 000 UIP

- Urokinase 6 000 UCTA dans 2 ml de solution tampon phosphaté 0,15 M, pH 7,4. Le plasminogène activé par la streptokinase ou l'urokinase est dosé par son activité estérolytique sur l'ester mêthylique de la N-α-acétyl glycyl-L-lysine (AGLME) : l'unité 1 microkatal out l'activité enzymatique qui hydrolyse une mole de substrat par seconde à 30ºC - pH 8,10.

On incube pendant une heure.

Sur une colonne de lysine-Sépharose (Pharmacia) de 9 mm de diamètre et 14 cm de long, équilibrée avec le tampon phosphate, on effectue une chromatographie d'affinité du mélange incubé.

L'excès d'aprotinine et l'urokinase, non retenus sur le support, sont présents dans un premier pic (1) représenté à la figure 1 des dessins annexés, qui apparaît dès l'écoulement d'un volume égal à celui de la colonne.

Le complexe APA est élué par le tampon phosphate additionné de 0,05 M d'acade ε-araino-caproïque (cf. flèche 3). Il apparaît dans un pic étroit (2), représentant dans cet essai, 6 ml d'éluat.

Cet éluat est débarrassé de l'acide ε-aminocaproïque par dialyse. Le dialysat est lyophilisé. EXEMPLE 2 - OBTENTION D'UN COMPLEXE APA a) Formation ducomplexe On mélange :

- Lys-plasmine 800 mg

- Aprotinine 64 mg dans 5 ml d'eau distillée.

On fait incuber 5 mn à température ambiante. On lyophilise et on obtient environ 850 mg du complexe aprotinine-plasmine, soit un rendement pratiquement quantitatif. b) Purification du complexe

On procède comme indiqué à l'Exemple 1, mais avec une colonne de taille adaptée.

EXEMPLE 3 - OBTENTION D'UN COMPLEXE AP On mélange :

- Lys-plasmine (titrant 2 μKatals/mg) 100 g

- Aprotinine (titrant 50 000 UlP/mg) 8,0 g On incube dans les mêmes conditions qu'à l'Exemple 2 et on lyophilise ; on obtient environ 100 g du complexe. CARACTERISATION DU PRODUIT

- Le nouveau complexe conforme à I'invention présente les caractéristiques physico-chimiques suivantes: . son poids moléculaire après filtration sur "ULTROGEL" est de l'ordre de 90 000 pour le complexe dans lequel l'aprotinine et la plasmine sont présentes dans un rapport 2/1, et il est de l'ordre de 84 000 pour le complexe dans lequel l'aprotinine et la plasmine sont présentes en quantités équimoléculaires ; . la constante d'association du complexe AP calculée par

FRITZ H., SCHULT H., MEISTER R., WERLE E. - Z. Physiol.

Chem., 1969, 350, 1531, est égale à 3 × 10⁸.

- Le complexe peut être en partie dissocié en présence de fibrine, ainsi qu'il est décrit plus loin et acquiert, notamment en ce qui concerne le complexe APA, du fait de sa dissociation partielle, des propriétés fibrinolytiques.

- Les caractéristiques biologiques du complexe conforme à l'invention, sont les suivantes : . il est inactif vis-à-vis du fibrinogène, en milieu plasmatique, . il est inactif vis-à-vis d'un excédent de plasmine. Dosage de l'aprotinine libérée du complexe APA

On dose lî aprotinine libérée du complexe, en procédant comme décrit ci-après, dans le but de déterminer la quantité d'aprotinine fixée par microkatal de plasmine, dans le complexe conforme à l'invention. a) On forme le complexe aprotinine-plasmine conforme à l'invention à partir : . de 25 microkatals de Lys-plasminogène humain dont l'activité a été préalablement mesurée, . d'urokinase,

. et d'un excès d'aprotinine (cf. Exemple 1 ci-dessus) ; On incube pendant une heure à 37°C. On filtre sur une colonne de lysine-Sépharose qui retient le complexe, tandis que l'excès d' aprotinine et l'urokinase, qui ne sont pas retenus sur le support, s'écoulent de la colonne.

Le complexe aprotinine-lys plasmine humaine obtenu, est élué par de l'acide ε-amino-caprolque, puis dialyse pour éliminer ce dernier. b) On dissout le complexe obtenu dans du sérum physiologique. c) On ajoute à cette solution, de l'acide trichloracétique concentré en quantité suffisante pour obtenir une concentration finale d'acide trichloracétique de 5 % dans la solution de complexe. Il se forme un précipité contenant la plasmine décomplexée, leσuel est éliminé par centrifugation.

On recueille le surnageant, qui contient l'aprotinine ; on ajuste le pH à 8, puis on dose l'aprotinine présente dans le surnageant, par inhibition de l'action de la trypsine sur BAEE, à 253 nm, suivant la méthode de la Pharmacopée Française.

Le dosage montre que 100 000 UIP d'aprotinine ont été libérées du complexe, soit environ 4 000 UIP par microkatal de plasmine¬

Le dosage d'aprotinine dans le complexe AP peut être réalisé de la même manière. Identification et differenciction ducomplexedans leguel l'aprotinine et la plasmine sonu présentes dans un rapport 2/1 (APA) et du comglexe dans leg uel elles sont présentes dans un rappory 1/ 1 (AP)

1. On met en suspension de la plasmine dans un tampon voisin de la neutralité ; on ajoute à cette solution un large excès d'aprotinine ; après incubation à la température du laboratoire (environ 20°C) pendant 30 minutes, la solution est passée au travers d'une colonne de lysine-Sépharose.

Il se forme le complexe 2/1 qui est retenu sur la colonne,tandis que l'excès d' aprotinine se trouve dans l'effluent. On évalue la quantité d'aprotinine présente dans cet effluent et, connaissant la quantité mise en oeuvre, on calcule la quantité d'aprotinine fixée sur 1 mg de la plasmine utilisée.

2. Pour une quantité connue de cette plasmine, on ajoute alors dans les mêmes conditions que précédemment, la moitié de la quantité d'aprotinine calculée de manière à ce que le mélange soit équimoléculaire.

Pour vérifier la composition du complexe et établir qu'il s'agit bien d'un complexe équimoléculaire, la solution obtenue a été soumise à une filtration moléculaire sur colonne d' "Ultrogel AcA 44" et l'activité de l'effluent a été étudiée du début à la fin de la sortie des protéines. L'activité spécifique de tous ces échantillons a été identique, et la sortie s'est établie en un seul pic. Le poids moléculaire est donc homogène et l'activité spécifique identique. Etant donné la nature du mélange, ces résultats montrent que le complexe formé est homogène et par conséquent équimoléculaire. Ceci montre également que les constantes d'association des deux molécules d'aprotinine sur une molécule de plasmine sont suffisamment différentes pour que les techniques d'analyse ne puissent pas déceler deux formes de complexe. COMPTE-RENDU D'EXPERIMENTATIONS DEMONTRANT L'ACTIVITE

PHARMACOLOGIQUE DU COMPLEXE CONFORME A L'INVENTION 1°) Comportement du complexe aprotinine-plasmine APA au contast de la fibrine

500 mg de fibrinogène humain (Kabivitrum) sont dissous dans 80 ml de tampon Tris- ClH, pH 7,4, 0,05 M contenant 0,01 % de mercurothiolate de sodium ; 20 ml de plasma humain citrate sont ajoutés à cette solution (apport de facteur XIII).

Sous agitation, sont ajoutés 100 NIH de thrombine (Roche) dissous dans 10 ml de solution de Cl₂Ca M/20. Après 20 minutes d'incubation à 37°C, la fibrine est recueillie par centrifugation, puis mise en suspension dans

500 ml du tampon Tris par dispersion mécanique (Ultraturax ) . Après agitation de 15 minutes, la fibrine est recueillie par centrifugation à + 10ºC et remise en suspension dans

500 ml de tampon et agitée de la même manière que précédemment. Ce lavage est éventuellement répété afin d'obtenir une fibrine insensible à l'urokinase Choay ou à la streptokinase Behring (à 1 ml de suspension de fibrine, 0,1 ml de solution de SK à 1000 Ul/ml ou 0,1 ml d'UK à 1000 UCTA/ml est ajouté ; aucune dissolution ne doit être observée après incubation d'une heure à 37°C).

La totalité de la fibrine est alors dispersée mécaniquement dans 50 ml de tampon. Cette suspension sert à constituer une colonne de 15 cm de long et de 0,9 cm de diamètre. Cette colonne est alimentée en continu par une pompe, l'effluent est analysé par un lecteur U.V. avant d'être distribué par un collecteur de fractions (matériel LKB). L'équilibre de la colonne est obtenu par passage de la solution tampon Tris sous un débit de 10 ml/heure pendant 2 heures.

2° ) Comportement du complexe aprotinine-lys plasmine humaine APA vis-à-vis de la fibrine en milieu tampon 2 ml de la solution du complexe inactif correspondant à 8 microkatals de plasmine et additionnés de 50 000 uIP d'aprotinine en excès, sont déposés au sommet de la colonne de fibrine, puis un débit de 10 ml/heure de tampon est appliqué. Résultats

Un pic apparaît entre le 10ème et le 16ème ml d'effluent ; il contient imiquement l'aprotinine ajoutée en excès en même temps que la dissolution du sommet de la colonne est observée, dissolution qui est complète après 90 minutes.

Ceci prouve que l'aprotinine n'est pas adsorbée sur la fibrine et qu'à partir du moment où seul le complexe se trouve en présence de fibrine, la dissolution de cette dernière est observée.

Si au début de l'observation de la lyse, le tampon est additionné de 0,05 M d'acide ε-amino-caproïque, la dissolution de la fibrine ne se poursuit pas et le complexe, comme débit plus loin, est lué de la fibrine ; il apparaît dans un pic assez large.

En remplaçant la fibrine comme support par le Sépharose-lysine défini par DEUTSCH D. et MERTZ E.T. - Science 1970, 170, 1095 pour la purification du plasminogène, on observe que le complexe aprotinine-plasmine est retenu sur la colonne de Sépharose-lysine, alors que l'aprotinine en excès est éliminée ; ] 'excès d'aprotinine est présent dans l'éluat frontal et le complexe est élué par l'acide ε-amino-caproïque. Cette observation a été utilisée pour le développement du procédé de préparation du complexe conforme à l'invention tel que décrit à l'Exemple 1 ci-dessus.

Conclusions

Le complexe APA, dont la constante d'association est très forte, est partiellement dissocié en présence de fibrine. Tout se passe comme si le complexe aprotinineplasmine transformé comme décrit plus loin, formait un complexe transitoire avec la fibrine. 3°) Comportement du complexe aprotininr-plasmine APA en milieu plasmatique humain

A/ Mise en évidence de l'action lytique sur la fibrine

La colonne de fibrine étant réalisée comme précédemment, 20 ml de plasma humain citrate dilués au 1/2 avec le tampon Tris ont servi à équilibrer la colonne sous un débit de 12,5 ml/heure.

2 ml de la solution du complexe inactif correspondant à 8 microkatals de plasmine, sont additionnés de 50 000 uIP d'aprotinine en excès, puis mélangés à 100 ml de plasma humain citrate dilué au 1/2 avec la solution tampon. Ce mélange a été passé sur la colonne de fibrine avec un débit de 12,5 ml/heure, puis 300 ml de plasma flilué au 1/2 ont été passés.

Résultats a) L'inhibiteur se libère beaucoup plus lentement que dans le premier cas considéré et il faut attendre le passage de 50 ml de plasma d'élurion pour qu'il soit complètement élué. b) la fibrinolyse débute après que 100 ml de plas- ma d'élution soient passés au travers de la colonne. Cette lyse se poursuit, mais se limite à la moitié de la colonne. Ceci peut être du à l'intervention des α₂ antipiasmines présentes en large excès dans le plasma. Il peut être également supposé qu'après 48 heures, la plasmine soit dégradée. Conclusions

L'expérience réalisée en milieu plasmatique démontre que le complexe aprotinine-lys-plasmine humaine est également dissocié en milieu plasmatique humain et qu'il exerce son action fibrinolytique, ce qui permet d'envisager son utilisation comme thérapeutique spécifique de choix des coagulations intravasculaires. B/ Mise en évidence de la libération d' aorotinine en milieu plasmatigue a) On fait transiter le complexe APA conforme à l' invention comprenant 10 m i c r o k a t a l s de plasmine et 40 000 uIP d'aprotinine (1 microkatal pour

4 000 uIP), en solution dans 50 ml de plasma dilué au

1/2, à travers une colonne remplie de fibrine. Le complexe se fixe sur le caillot de fibrine. b) On fait alors transiter à travers la colonne du plasma humain citrate, dilué au 1/2 et ne contenant pas de complexe.

Ce plasma dilué au 1/2, ayant transité au travers de la colonne, additionné de 25 u de streptokinase par ml et coagulé par la thrombine, donne un caillot dont le temps de lyse est de l'ordre de 5 mn.

Ce même plasma ayant transité au travers de la colonne de fibrine chargée de complexe, additionné de la même manière de 25 u de streptokinase/ml et coagulé par la thrombine, donne un caillot dont le temps de lyse est supérieur à 35 mn. Ceci montre que le plasma, en transitant au travers de la colonne s'est chargé d'inhibiteur, augmentant. ainsi le temps de lyse.

Cette expérimentation illustre clairement que le complexe aprotinine-plasmine ne devient actif en tant que fibrinolytique qu'en présence de fibrine et après libération d'une partie de l'aprotinine initialement complexée dans le milieu plasmatique, ce qui met en évidence les deux formes sous lesquelles le complexe se présente, à savoir : - une forme stable inactive dans laquelle l'aprotinine est présente dans une proportion de 2/1 par rapport à la plasmine et une forme active, dans laquelle le rapport aprotinine-plasmine s'est abaissé, une partie de l'aprotinine ayant été libérée dans le plasma, en présence de fibrine.

4°) Etude de la durée de la présence du complexe aprotinine-paasmine APA dans le sang circulant après injection intraveineuse au lapin

A. Le potentiel fibrinolytique du sang est étudié en utilisant une des méthodes d'étude des fibrinolytiques; celle-ci est décrite page 274 et suivantes par E.G. VAIREL dans "Progress in Chemical fibrinolysis and thrombolysis", vol. 1, édité par J.F. Davidson, M.M. Samama et P.C.

Desnoyers - Raven Press - New York. Le sang citraté (1/20 de citrate de sodium à 9%) est centrifugé pour obtenir un plasma pauvre en plaquettes Le plasma citrate est recalcifié et on introduit aussitôt 0,5 ml dans le tube central à fond poreux, alors qu'en même temps, on obtient le même niveau dans le tube externe, avec une solution tampon pH 7,4, 0,15 mg. Les tubes sont maintenus à 37°C. Après coagulation ferme, le lavage est obtenu par addition de tampon à 37°C dans le tube externe ; la différence de niveau obtenue fait que le tampon pénètre au travers du caillot de bas en haut, et réalise son lavage. Le liquide de lavage après avoir traversé le caillot, est éliminé par siphonnage. Ce lavage peut être arrêté après 3 heures. Les tubes sont maintenus à 37°C.

Après 24 heures, un caillot constitué à partir de sang normal n'a subi aucune modification ; un caillot constitué à partir de sang contenant du complexe aprotinine- plasmine conforme à l'invention a subi une dissolution partielle ou totale.

L'observation de la lyse du caillot plasmatique d'un animal ayant reçu préalablement une injection de complexe aprotinine-plasmine APA signifie que du complexe aprotinine-plasmine APA est encore présent dans le sang au moment du prélèvement. Ceci montre que le complexe est susceptible de poursuivre son action pendant une durée prolongée, ce qui n'est pas observé avec les fibrinolytiques actuellement utilisés en clinique (streptokinase, urokinase ou plasmine).

L'Inventeur a pratiqué cet essai en prélevant le sang dans l'artère centrale de l'oreille avant l'administration du complexe aprotinine-plasmine APA, puis 1 mn après, 30 minutes après, 2 heures, 4 heures et 5 heures 30 après l'injection dans la veine marginale de l'oreille. Les résultats observés après injection de 25 microkatals de lys-plasmine inhibée par 2mg d'aprotinine pure, sont consignés dans le Tableau ci-après. Le signe "+" indique que le caillot a lysé. Le signe "O" qu'il n'y a pas eu de lyse. On constate que, chez 5 animaux sur 6, le complexe est encore présent à la 2ème heure et que chez 3 animaux sur 4, il est encore présent au cours de la 5ème heure.

5°) Etude de l'activité fibrinolvtique du complexe aprotinine-plasmine APA in vivo Cette étude a été effectuée sur le lapin. 18 animaux ont été utilisés. On dégage une fémorale de lapin, on fait une ligature d'amont amovible, et, après avoir chassé le sang de la partie fémorale dégagée, on fait une ligature d'aval, également amovible.

A l'aide d'une petite aiguille de 4/10è on injecte dans la partie ainsi isolée, du sang prélevé dans l'artère centrale de l'oreille du lapin ( soit environ 0,05 à 0,10 ml).

L'aiguille étant maintenue en place, on injecte

0,01 ml de solution de thrombine concentrée. Il se forme presque immédiatement un caillot à l'intérieur de la partie isolée. On déplace alors la ligature d'aval en direction de la ligature d'amont, de manière que la ligature d'aval se trouve en amont du trou de piqûre, puis on lève très légèrement la ligature d'amont pour faire pénétrer un peu de sang dans le sac formé par les deux ligatures.

Le sang introduit se coagule sous l'effet de la thrombine précédemment introduite dans le sac.

On laisse les deux ligatures en place pendant 1/4 d'heure au bout duquel on retire totalement la ligature d'amont. La thrombine contenue dans le caillot diffuse alors et s'étend dans des zones non dénudées.

Une heure après le début de l'expérience, on lève la ligature d'aval.

Résultats Animaux témoins : Des observations effectuées 24 heures et 48 heures plus tard, montrent que l'artère est complètement bouchée et que le caillot reste en place. Animaux traités

12 lapins sont traités immédiatement après l'enlèvement de la ligature d'aval, par une injection massive de complexe comprenant 50 microkatals de plasmine et 200 000 UIP d'aprotinine dans la veine marginale de l'oreille.

On observe chez 50 % des animaux la libération totale de l'artère dans les 24 heures qui suivent l'injection. Cette étude montre que, dans les conditions expérimentales, le complexe aprotinine-plasmine conforme à l'invention est capable de lyser un caillot in vivo chez le lapin.

6°) Etude in vitro des propriétés du complexe équimoléculaire aprotinine-plasmine - Compataison avec la plasmine et avec le complexe 2 aprotinines/1 plasmine, saturé A - Etudede l'activité directe surcaillots standards de fibrinogène humain Toutes les solutions sont faites dans un tampon phosphate-CINa isotonique pH 7,2.

Dans des tubes à hémolyse placés dans un bain-marie à 37°C, on introduit 0,1 ml de solution de plasmine ou de complexe à différentes concentrations, puis 0,1 ml de solution de thrombine à 25 NIH/ml.

On injecte à l'aide d'une seringue rhéomètre 1 ml de solution de fibrinogène humain â 1 % de protéines coagulables. Le temps compris entre l'injection du fibrinogène et la lyse complète du caillot est mesuré. Résultats : Le même temps de lyse (8 minutes) a été obtenu avec 0,0075 μKat. de plasmine complexée et avec 0,002 μKat. de plasmine seule. Dans ce test, 27 % de l'activité de la plasmine subsiste après complexation avec l'aprotinine mole à mole. B - Etude de l ' activité directe sur caillots de plasmas humains (pool)

Cet essai est calqué sur le précédent sauf que la solution de fibrinogène est remplacé par le plasma . La coagulation est obtenue par 50 microlitres de thrombine à 250 NIH/ml ( 10 fois plus concentrée) .

L ' ordre d ' addition des réactifs est le même que pour l ' essai précédent . Résultats : (AP = complexe 1/1 - APA = complexe 2/1) .

Dans cet essai, on trouve également que le complexe 1/1 a conservé environ 30 % de l'activité directe de la plasmine engagée.

Nota : Cette activité est beaucoup plus progressive pour le complexe AP que pour la plasmine ; ceci est dû à l'inhibition de la seule plasmine par les antiplasmines plasmatiques. C - Comparaison de l'activité dans le temps de la plasmine et des complexes 1/1 et 2/1 sur le caillot de plasma humain Dans les boites de Petri à fond bien plat, de 9 cm de diamètre, on introduit 9 ml de plasma humain citraté, puis 0,5 ml de solution de thrombine à 50 NIH/ml. On agite légèrement par rotation de la boîte. On laisse coaguler sur un plan horizontal.

Une heure après, les solutions de plasmine, complexe 1/1 ou complexe 2/1 sont déposées sur ces plaques sous un volume de 30 microlitres. Les aires de lyse sont mesurées toutes les 24 heures.

Les graphiques reportés aux figures 2 à 4 annexées, montrent l'évolution des surfaces de lyse dans le temps et, en particulier : - la figure 2 donne l'évolution de la surface de lyse en mm² en fonction du temps, exprimé en jours, après dépôt sur les plaques précitées de 30 microlitres d'une solution à 7,5 μkatals de plasmine/ml respectivement sous la forme de plasmine seule, du complexe 1/1 et du complexe 2/1,

- la figure 3 montre la courbe d'évolution de ladite surface de lyse dans le cas où la plasmine est déposée sous les trois formes respectives ci-dessus, en solutions à 15 μkatals/ml, et - la figure 4 montre la courbe d'évolution de la surface de lyse dans le cas où la plasmine est déposée sous les trois formes respectives ci-dessus en solutions à 30 μkatals/ml.

Dans ces trois figures : - les courbes IV, VII et X se réfèrent aux solutions de plasmine seule ;

- les courbes V, VIII et XI aux solutions de complexe AP (1/1), et

- les courbes VI, IX et XII aux solutions de complexe APA (2/1).

Ces courbes montrent que dès la 12ème heure, les aires de lyse sous l'action de la plasmine n'évoluent plus : ceci est dû à l'inactivation par les inhibiteurs plasmatiques car, sur plaques de fibrine pure, les aires de lyse s'accentuent pendant plus de 48 heures. Cette stabilisation au bout de 12 heures n'est donc pas due à une dégradation de l'enzyme. Au bout de 24 heures, les aires de lyse dues au complexe 1/1 sont presque équivalentes à celles de la plasmine engagée, alors qu'il faut attendre plus de 48 heures pour observer le même résultat avec le complexe 2/1.

L'accroissement des surfaces de lyse pendant une semaine est observé avec les deux complexes et fait apparaître leur insensibilité aux inhibiteurs plasmatiques et leur stabilité. L'avantage du complexe 1/1 sur le complexe 2/1 réside en son activité directe immédiate importante (25 à 35 % de celle de la plasmine), tandis que la stabilité du complexe 2/1 est supérieure à celle du complexe 1/1. 7°) Tests de toxicité

On a injecté à la souris une quantité de complexe comprenant 2 microkatals de plasmine et 8 000 uIP d'aprotinine dans 0,5 ml de sérum physiologique, par voie intraveineuse. On a utilisé pour réaliser ces tests de toxicité, dix animaux : aucune anomalie n'a été constatée : les dix animaux étaient vivants au bout de 21 jours. 8°) Indications et posologie

Le nouveau complexe aprotinine-plasmine conforme à l'invention est particulièrement indiqué pour tous traitements fibrinolytiques et notamment pour le traitement des embolies, des thromboses, des microcaillots des capillaires, des coagulations intravasculaires disséminées (CIVD) fréquentes en néphrologie, etc... La stabilité du complexe conforme à l'invention pourrait avantageusement être utilisée pour obtenir une fibrinolyse thérapeutique locale, notamment dans les thromboses artérielles, du fait que son activité se prolonge pendant plusieurs heures, au lieu de ne durer que quelques minutes comme c'est le cas pour les fibrinolytiques actuellement connus. Le complexe est avanrageusement. à administrer de 50 à 300 microkatals de placτr:i::G: complexée avec l'aprotinine par 24 heures.

Le complexe conforme à l'invention est avantageusèment administré en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable, tel que le soluté chloruré isotonique, par exemple, par voie parentérale, de préférence intraveineuse.

Il résulte de la description qui précède que, quels que soient les modes de mise en oeuvre et de réalisation adoptés, l'on obtient un médicament doué d'une activité fibrinolyti^que efficace et rapide, à des doses relativement réduites, étant donné son action prolongée.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre et de réalisation qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse, au contraire, toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1º- Médicament nouveau, caractérisé en ce qu'il est constitué par un complexe aprotinine-plasmine.

2°- Médicament nouveau selon la Revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par un complexe aprotinine-lys plasmine humaine.

3°- Complexe selon la Revendication 1 ou la Revendication 2, caractérisé en ce que la plasmine est présente sous la forme de son précurseur, le plasminogène associé à un activateur.

4°- Complexe selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'aprotinine et la plasmine sont présentes dans le complexe en quantités équimoléculaires. 5°- Complexe selon l'une quelconque des Revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'aprotinine et la plasmine sont présentes dans le complexe, dans un rapport aprotinine/plasmine de l'ordre de 2/1.

6°- Procédé de préparation du nouveau médicament selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact de la plasmine ou son précurseur, le plasminogène associé à un activateur, avec de l'aprotinine, en quantités appropriées, dans un solvant convenable, le complexe aprotinine-plasmine formé étant purifié par passage sur une colonne de Sépharose-lysine, de manière à éliminer l'excès éventuel d'aprotinine et le cas échéant l'activateur, si celui-ci a été précédemment ajouté, le complexe étant ensuite élué par l'acide ε-amino-caproïque à une concentration molaire d'au moins 0,05 M.

7°- Procédé selon la Revendication 6, caractérisé en ce que dans le cas où l'on met en oeuvre le précurseur de la plasmine, à savoir le plasminogène, celuici est de préférence du lys-plasminogène et notamment du lys-plasminogène humain.

8°- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que l'activateur associé au plasminogène, est l'urokinase.

9°- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le mélange d'aprotinine et de plasmine comprend au moins 1400 à 2000 UIP d'aprotinine pour 1 microkatal de plasmine, dans le cas où l'obtention d'un complexe dans lequel l'aprotinine et la plasmine doivent être présentes en quantités équimoléculaires est recherchée.

10°- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le mélange d' aprotinine et de plasmine comprend au moins 3500 à 5000 UIP d' aprotinine pour 1 microkatal de plasmine, et avantageusement 3600 à 4000 UIP d' aprotinine pour 1 microkatal de plasmine, dans le cas où l'obtention d'un complexe dans lequel l'aprotinine et la plasmine doivent être présentes dans un rapport 2/1, est recherchée.

11º- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 6 à 10, caractérisé en ce que la complexation de l'aprotinine et de la plasmine est réalisée par incubation d'un mélange d'aprotinine et de plasmine, ou de plasminogène associé à un activateur, à une température comprise entre l'ambiante et 40°C.

12°- Procédé selon la Revendication 11, caractérisé en ce que dans le cas où l'on utilise le plasminogène associé à un activateur, la durée de l'incubation est suffisante - de l'ordre d'une heure environ - pour provoquer la transformation du plasminogène en plasmine et la complexation de cette dernière avec l'aprotinine, ce temps pouvant être réduit à quelques minutes dans le cas où l'on met en oeuvre la plasmine.

13°- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 6 à 12, caractérisé en ce que le pH du mélange est de l'ordre de 7,4 ±0,4.

14°- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 6 à 13, caractérisé en ce que le complexe formé est lyophilisé.