UA98612C2 - Імуногенна композиція, придатна для людини, що включає антиген або антигенний препарат у комбінації з ад'ювантом, який містить qs21 у формі ліпосоми та 3d-mpl - Google Patents

Abstract

Винахід стосується імуногенної композиції в об'ємі, прийнятному для людської дози, що включає антиген або антигенний препарат у комбінації з ад'ювантом, де ад'ювант складається з QS21, що представлений у формі ліпосоми, та 3D-MPL, де вказаний QS21 та вказаний 3D-MPL є обидва присутніми у вказаній людькій дозі на рівні від 9 до 30 мкг. У даному винаході додатково запропонована ад'ювантна композиція у відповідному об'ємі дози для людини від 9 до 30 мкг QS21 та 3D-MPL.

Description

Даний винахід стосується удосконалених композицій вакцини, способів їх виготовлення та їх застосування в медицині. Зокрема, у винаході розглядаються композиції ад'ювантної вакцини, де ад'ювант являє собою ліпосомальний препарат, що складається з сапоніну та ліпополісахариду.

Даний винахід додатково стосується складу вакцини проти грипу та схем вакцинації для імунізації проти захворювання на грип.

Нові композиції або вакцини з удосконаленою імуногенністю завжди потрібні. Як одна із стратегій, застосовують ад'юванти з метою спроби покращення імунної реакції на будь-який конкретний антиген.

Ліпополісахариди (ЛІПС) являють собою головну поверхневу молекулу і знаходяться виключно у зовнішньому шарі зовнішньої мембрани грам-негативних бактерій. ЛПС перешкоджають знищенню бактерій за допомогою комплементу сироватки і фагоцитарних клітин, вони залучені до росту з утворенням колоній. Ліпополісахариди являють собою групу структурно споріднених складних молекул розміром приблизно 10000 Да і складаються з трьох ковалентно зв'язаних ділянок: () ланцюг О-специфічного полісахариду (О-антиген) на зовнішній ділянці; (ії) основний олігосахарид центральної ділянки; (ії) ліпід А - як найглибша ділянка, що служить як гідрофобний якір, він містить одиниці глюкозаміну дисахариду, які несуть жирні кислоти з довгим ланцюгом.

Продемонстровано, що біологічна активність ліпополісахаридів, наприклад, смертельна токсичність, пірогенність і ад'ювантність, пов'язана з фрагментом ліпіду А. На відмінність від цього, імуногенність пов'язана з О-специфічним компонентом полісахариду (О-антигеном). Як ліпополісахариди, так і ліпід А давно відомі своїми сильними ад'ювантними ефектами, але висока токсичність вказаних молекул перешкоджала їх застосуванню при виготовленні композицій вакцин.

Отже, зроблені значні зусилля з метою зменшення токсичності ЛПС або ліпіду А із збереженням їх ад'ювантних властивостей.

Мутант ЗаЇІтопеїйПа тіппезоїа К595 був виділений в 1966 році з культури батьківського (гладкого) штаму (ІГидегії; еї а. 1966 Апп. М.М. Асай. 5сі. 133:349-374). Був проведений скринінг вибраних колоній щодо їх сприйнятливості до лізису під дією групи фагів, і тільки ті колонії, які виявили вузький інтервал чутливості (чутливі тільки до одного або двох фагів), були вибрані для подальшого вивчення.

Дана спроба привела до виділення глибокого шершавого (деер гошуді) штаму мутанта, який є дефектним з точку зору біосинтезу ліпополісахаридів, його позначили як 5. тіппезоїа 595.

У порівнянні з іншими ЛПС ліпополісахариди, продуковані мутантом 5. тіппезоїа К595, мають відносно просту структуру: (ї) вони не містять О-специфічної ділянки, що являє собою ознаку, відповідальну за мінливість від типу дикого гладкого фенотипу до шершавого фенотипу мутанта і приводить до втрати вірулентності; (і) основна ділянка є дуже короткою, дана властивість збільшує чутливість штаму до різноманітності хімічних речовин; (ії) фрагмент ліпіду А екстенсивно ацильований і містить до 7 жирних кислот.

Ліпід А 4-монофосфорилу (МРІ), який може бути одержаний шляхом кислотного гідролізу ЛПС, екстрагованого з глибокого шершавого штаму мутанта грам-негативних бактерій, зберігає ад'ювантні властивості ліпополісахариду при прояві токсичності, яка зменшується з фактором більше 1000 (з даними смертельної дози на курячих ембріонах) (доппзоп еї аїЇ. 1987 Веу. Іпіесі. 20 бів. 9 Буррі:5512-

З516). Ліпополісахарид звичайно кип'ятять із зворотним холодильником в розчинах мінеральної кислоти помірної сили (наприклад, 0,1 М НС) протягом періоду приблизно 30 хвилин. Даний спосіб приводить до дефосфорилювання в положенні 1 та відщеплення карбоксильної групи в положенні 6", даючи в результаті МРІ..

Ліпід А 3-О-деацильованого монофосфорилу (30О-МРІ), який можна одержати шляхом гідролізу

МРІ. в слабко лужних умовах, володіє додатково зменшеною токсичністю при збереженні ад'ювантних властивостей, див. 054.912,094 (КіБрі ІттипоспетісаІ5). Лужний гідроліз звичайно здійснюють в органічному розчиннику, такому як суміш хлороформу/метанолу, шляхом насичення водного розчину слабкої основи, наприклад, 0,5 М розчин карбонату натрію при рН 10.5.

Подальшу інформацію щодо одержання З30О-МРІ можна отримати, наприклад, з О54,912,094 та

МО02/078637 (Согіха Согрогаїоп).

Сапоніни квілаї являють собою суміш тритерпенових гликозидів, екстрагованих з кори мильного дерева (Оціїазда заропагіа). Необроблені сапоніни широко застосовують як ад'юванти у ветеринарії.

ОиіЇ-А являє собою частково очищений водний екстракт матеріалу сапоніну квілаї. О521 являє собою

Нріс очищену нетоксичну фракцію ОціЇ-А, а спосіб його виробництва розкритий (як ОА21) в патенті

США Мо 5,057,540.

Як приклад, вакцини проти грипу та вакцини проти вірусу бородавки людини (НРМ) розроблені з ад'ювантами.

Віруси грипу являють собою одні з найбільш розповсюджених вірусів у світі, що вражають як людей, так і худобу. Грип призводить до економічних збитків, захворюваності та навіть смертності із значними показниками.

Вірус грипу являє собою оболонковий РНК-вірус з розміром частинки приблизно 125 нм у діаметрі.

Він складається в основному з внутрішнього нуклеокапсиду або ядра рибонуклеїнової кислоти (РНК), зв'язаного з нуклеопротеїном, оточеним вірусною оболонкою з ліпідною двошаровою структурою та зовнішніми глікопротеїнами. Внутрішній шар вірусної оболонки складається в основному з матричних білків, а зовнішній шар - здебільшого з ліпідного матеріалу, одержаного від хазяїна. Вірус грипу складається з двох поверхневих антигенів, глікопротеїнової нейрамінідазі (МА) та гемаглютиніну (НА), які з'являються як піки довжиною 10-12 нм на поверхні частинок. Саме вказані поверхневі білки, особливо гемаглютинін, визначають антигенну специфічність підтипів грипу.

Вказані поверхневі антигени прогресивно, іноді швидко, піддаються деяким змінам, що приводить до антигенних варіацій грипу. Вказані антигенні зміни, які називаються "мінливістю", є непередбачуваними і можуть здійснювати драматичний вплив з імунологічної точки зору, оскільки вони кінець кінцем приводять до появи нових штамів грипу, які надають можливість вірусу уникати імунної системи, спричиняючи добре відомі, майже щорічні епідемії.

Всесвітня організація охорони здоров'я у співпраці з національними комітетами з охорони здоров'я і виробниками вакцин визначають штами вірусу грипу, які необхідно включати до вакцини проти грипу кожен сезон.

НА являє собою найбільш важливий антиген у визначенні серологічної специфічності різних штамів грипу. Даний білок розміром 75-80 кДа містить численні антигенні детермінанти, деяка кількість яких знаходяться на ділянках, що піддаються послідовним змінам в різних штамах (штам-специфічні детермінанти), а інші - на ділянках, які є спільними для багатьох молекул НА (розповсюджені детермінанти).

Віруси грипу спричиняють епідемії майже кожної зими, з розповсюдженістю інфікування вірусом типу А або В до 4095 протягом шести тижнів. Інфікування вірусом грипу призводить до різних патологічних станів, від субклінічної інфекції внаслідок легкої інфекції верхніх дихальних шляхів до тяжкої вірусної пневмонії. Типові епідемії грипу спричиняють зростання в частоті захворювання на пневмонію та захворювань нижніх дихальних шляхів, свідоцтвом чого є збільшення випадків госпіталізації або смертності. Тяжкість захворювання, перш за все, визначається віком хазяїна, його імунним статусом та локалізацією інфекції.

Літні люди віком 65 років і старше є особливо вразливими, про що свідчить 80-90 95 всіх смертельних випадків, пов'язаних з грипом, в розвинених країнах. Також більш ймовірно, що у осіб з основними хронічними захворюваннями виникнуть ускладнення. Немовлята у віці декількох місяців також можуть перенести тяжке захворювання. Таким чином, вказані групи особливо потребують захисту. Крім даних груп ризику, міністерства охорони здоров'я також рекомендують вакцинацію здорових дорослих, які знаходяться в контакті з людьми похилого віку.

Вакцинація відіграє критичну роль в контролі щорічних епідемій грипу. Доступні на даний момент вакцини проти грипу є або інактивованими, або живими атенуйованими вакцинами проти грипу.

Інактивовані вакцини проти грипу складаються з трьох можливих форм одержання антигену: суцільний інактивований вірус, субвіріон, де очищені частинки вірусу руйнуються детергентами або іншими реактивами з метою солюбілізації ліпідної оболонки (так звана "розщеплена" вакцина) або очищений НА та МА (субодинична вакцина). Вказані інактивовані вакцини вводять внутрішньом'язово (в/м) або інтраназально (і/н).

Вакцини проти грипу всіх видів звичайно являють собою трьохвалентні вакцини. Вони загалом містять антигени, що походять з двох штамів вірусу грипу А та одного штаму вірусу грипу В.

Стандартна доза для ін'єкцій 0,5 мл в більшості випадків містить 15 мкг антигенного компоненту гемаглютиніну з кожного штаму, про що свідчать дані простої радіальної імунодифузії (ЗКО) (9.М. моса еї а!.: Ап ітргомеа 5іпдіє гадіа! іттиподійивіоп Тесппідие Тог Те аззау ої іпїсепга паетаддішіпіп апіїдеп: адаріайноп ог роїепсу деїіептіпайоп ої іпасіїмаїєд у/поїе мігив апа зибипії массіпев. .). Віої. етапа. (1977) 237-247; 9. М. Мооай еї аї., Іпіегтаїйопа! соПарогаїйме зішау ої зіпдіє гадіаї айивіоп апа

Ітітипое!есігторпогевів Тесппіднев ог Ше аззау ої Нкаетададішіпіп апіїдеп ої іпїпеплга мігив. У. Віої. єбапа. 9 (1981) 317-330).

Вакцини проти грипу, що доступні на даний момент, вважаються безпечними для всіх вікових груп (Оеє опа єї а. 1999, Массіпе, 17, 3094-3101). Однак, зареєстровано декілька повідомлень про те, що сучасні вакцини проти грипу неефективні для малюків молодше двох років. До того ж, показники ефективності вакцини для запобігання типовому підтвердженому захворюванню на грип, про які повідомляли, становлять 23-72 95 для літніх людей, вказані показники істотно нижчі, ніж показники ефективності 60-90 95, зареєстровані для молодих людей (Сомаєг"гі, 1994, У. Ат. Мей. Авзос, 21, 166- 1665; Сго55, 1995, Апп Іпієт. Меа. 123, 523-527). Продемонстровано, що ефективність вакцини проти грипу корелює з титрами сироватки антитіл інгібування гемаглютинації (НІ) вірусного штаму, а декілька досліджень виявили, що дорослі похилого віку демонструють нижчі титри НІ після імунізації проти грипу, ніж молоді люди (Мигазко, 2002, Ехрегітепіаї! дегопіоіоду, 37, 427-439).

Таким чином, на даний час існує потреба в нових вакцинах з удосконаленою імуногенністю.

Рецептура антигенної вакцини з сильними ад'ювантами є можливим підходом для підсилення імунних реакцій на субвіріонні антигени.

Субодинична вакцина проти грипу з ад'ювантом МЕ59, у формі емульсії масло-у-воді є комерційно доступною і продемонструвала здатність індукувати вищий титр антитіл, ніж вакцина, одержана з субодиничної вакцини без ад'юванту (Оеє 20 Бопайо еї аї!. 1999, Массіпе, 17, 3094-3101). Однак, у більш пізній публікації така ж сама вакцина не продемонструвала покращеного профілю в порівнянні з розщепленою вакциною без ад'юванту (Риїд-Вагьега вї а!., 2004, Массіпе 23, 283-289).

За своїм походженням протягом міжпандемічних періодів віруси грипу циркулюють подібно до вірусів попередньої епідемії. Віруси розповсюджуються серед людей з різними рівнями стану імунітету внаслідок інфекцій, яким люди піддавалися раніше в своєму житті. Така циркуляція за період, звичайно 2-3 роки, дає виділення нових штамів, які змінилися достатньо, щоб знову спричиняти епідемію серед загальної популяції даний процес має назву "антигенної мінливості". "Варіанти мінливості" можуть здійснювати різний вплив в різних групах населення, регіонах, країнах або континентах в будь-якому одному році, хоча за декілька років їх загальний вплив часто є однаковим.

Іншими словами, пандемії грипу відбуваються, коли з'являється новий вірус грипу, проти якого у людській популяції імунітет відсутній. Типові епідемії грипу спричиняють зростання захворюваності на пневмонію та захворювання нижніх відділів дихальних шляхів, про що свідчать підвищені показники госпіталізації або смертності. Більш ймовірно, що такі ускладнення виникнуть у людей похилого віку або осіб з базовими хронічними захворюваннями, але немовлята у віці декількох місяців також можуть перенести тяжке захворювання.

З непередбачуваними інтервалами з'являються нові віруси грипу з основним поверхневим антигеном, гемаглютиніном, але з повністю іншим підтипом, ніж у штамів, що циркулювали попереднього сезону. Антигени, що утворюються в результаті, можуть змінитися на 20-50 95 по відношенню до відповідного білка штамів, які до того моменту були розповсюджені серед людей. Це може призводити до того, що вірус буде просочуватися крізь "імунітет населення" і спричиняти пандемії. Даний феномен має назву "антигенної мінливості". Вважають, що як мінімум у минулому пандемії відбувалися, коли вірус грипу з різних видів, наприклад, вірус грипу птахів або свиней, перетинав бар'єр видів. Якщо такі віруси мають потенціал розповсюдження від людини до людини, вони можуть поширюватися по всьому світі протягом періоду від декількох місяців до року, спричиняючи в результаті пандемію. Наприклад, в 1957 році (азіатська пандемія грипу) віруси підтипу

Н2М2 замінили віруси НІМІ, які циркулювали в людській популяції як мінімум з 1918 року, коли вперше було виділено даний вірус. Н2НА та М2МА зазнавали антигенної мінливості в період 1957- 1968 років до тих пір, поки з появою нового підтипу грипу НА не був замінений в 1968 році (пандемія гонконгського грипу) на НЗМ2, після якого М2МА продовжував діяти разом з НЗНА (МакКаїїта еї аї., 1991, Ерідетіо). Інтесі. 106, 383-395).

Особливості штаму вірусу грипу, які надають йому потенціал спричинення спалаху пандемії, є наступними: він містить новий гемаглютинін в порівнянні з гемаглютиніном в існуючих на теперішній час штамах, що можуть супроводжуватися або не супроводжуватися зміною підтипу нейрамінідази; він може передаватися горизонтально в людській популяції; і він є патогенним для людини. Новий гемаглютинін може бути таким, який не виявляється в людській популяції протягом значного періоду часу, ймовірно, протягом ряду десятиліть, наприклад, Н2. Або це може бути гемаглютинін, який раніш не існував в людській популяції, наприклад Н5, НО, Н7 або Нб, що знайдені у птахів. У будь-якому випадку більшість, або як мінімум велика пропорція, або навіть вся популяція не зіткалася раніше з антигеном і є імунологічно не готовою до нього.

Віруси папіломи являють собою маленькі ДНК-віруси пухлини, які є дуже видоспецифічними. До теперішнього часу описано понад 100 індивідуальних людських генотипів вірусу папіломи (НРМ). НРМ загалом специфічні або для шкіри (наприклад, НРУ-1 та -2), або для слизових оболонок (наприклад,

НРУ-6 та -11) і звичайно спричиняють доброякісні пухлини (бородавки), які не проходять протягом декількох місяців або років. Такі доброякісні пухлини можуть бути болісними для людини, яка має подібну пухлину, але в цілому, за декількома виключеннями, вказані пухлини не становлять загрозу для життя. Деякі НРУ також асоціюються з раком. Найбільш виражена позитивна кореляція між НРМ і раком у людини існує між НРУ-16 та НРУ-18 та карциномою шийки матки. Рак шийки матки являє собою найбільш розповсюджене злоякісне новоутворення в країнах, що розвиваються, приблизно 500000 нових випадків з'являються в світі щорічно. На цей час з технічної точки зору можливо активно боротися з первинними інфекціями НРМ-16, і навіть діагностувати рак, що містить НРМУ-16, застосовуючи вакцини. Огляд перспектив профілактичної та терапевтичної вакцинації проти НРМУ-16 див. у Сазоп .)., Сііп. Іттипоїпег. 1994; 1(4) 293-306 апа Надепезеє М.БЕ., Іптесіоп5 іп Медісіпе 1997 14(7) 555-556, 559-564.

Хоча відбуваються незначні варіації, всі описані геноми НРУ містять як мінімум вісім ранніх генів, від Е! до Е8, та два пізніх генів 1 і 12. Крім того, верхня регуляторна ділянка, що рухається, містить регуляторні послідовності, які, очевидно, контролюють більшість транскрипційних явищ генома НРУ.

Вакцини, що базуються на НРМ 11, описані в УМО94/00152, УМО94/20137, УМО93/02184 та

УМО94/05792. Подібна вакцина може містити антиген 1 як мономер, капсомер або подібна до вірусу частинка. Способи одержання МІР добре відомі в даній галузі та включають підходи розкомлектації-

перекомплектації МІР з метою забезпечення збільшеної гомогенності, наприклад, як описано у

М/09913056 та 056245568. Такі частинки можуть додатково складатися з білків 12. Вакцини, що базуються на 12, описані, наприклад, у М/О93/00436. Інші підходи до вакцини НРМ базуються на ранніх білках, таких як Е7: або злитих білків, наприклад, 1 2-Е7.

Все ще існує потреба в удосконалених вакцинах, особливо у випадку грипу та в конкретних пандеміях грипу, а також для популяції людей похилого вік, або у разі вакцин НРУ.

Ад'юванти, що містять комбінації ліпополісахариду та сапоніни квілаї, розглядали раніш, наприклад у ЕРОб71948. Даний патент продемонстрував сильну синергію при комбінації ліпополісахариду (30О-МРІ) з сапоніном квілаї (20521). Зараз знайдено, що добрі ад'ювантні властивості можна забезпечити за допомогою комбінацій ліпополісахариду та сапоніну квілаї як імуностимулюючих засобів в ад'ювантній композиції, навіть тоді, коли імуностимулятори присутні в низьких кількостях в дозі для людини.

У першому аспекті даного винаходу запропонована імуногенна композиція, що складається з антигену або його антигенного препарату, в комбінації з ад'ювантною композицією, яка містить імунологічно активну фракцію сапоніну з кори ОиШа|а Заропагіа Моїїпа, представлену у формі ліпосоми та ліпополісахариду.

У другому аспекті даного винаходу запропонована імуногенна композиція, що складається з вірусу грипу або його антигенного препарату, в комбінації з ад'ювантом сапоніну, представленим у формі ліпосоми. У конкретному варіанті даного аспекту імуногенна композиція додатково містить похідне ліпіду А, наприклад ЗО-МРІ.

У відповідності до даного винаходу сапоніновий ад'ювант у формі ліпосоми містить активну фракцію сапоніну з кори ОшіПазда Заропагіа Моїїпа таку, як 0521, і стерол, наприклад, холестерин, у співвідношенні сапонін/стерол від 1:1 до 1:100 мас/мас.

Зокрема, вказана імуногенна композиція містить антиген з епітопом Т-клітини СО4. Альтернативно, вказана імуногенна композиція містить антиген з епітопом В-клітини.

Винахід також стосується застосування вірусу грипу або його антигенного препарату та ад'юванту, що містить імунологічно активну фракцію сапоніну з кори ОиШа|а Ззаропагіа Моїїпа, представлену у формі ліпосоми та ліпополісахариду, у виробництві імуногенної композиції для запобігання інфікування вірусом грипу та/або захворювання.

Винахід також стосується застосування антигену людського вірусу папіломи або антигенів або його антигенного препарату та ад'юванту, що містить імунологічно активну фракцію сапоніну з кори ОцйЙа/|а

Заропагіа Моїїпа, представленого у формі ліпосоми та ліпополісахариду, у виробництві імуногенної композиції для запобігання інфекції людським вірусом папіломи та/або захворювання. Винахід також стосується застосування антигену або антигенів цитомегаловірусу або його антигенного препарату та ад'юванту, що містить імунологічно активну фракцію сапоніну з кори ОиЙара баропагіа Моїтпа, представленого у формі ліпосоми та ліпополісахариду, у виробництві імуногенної композиції для запобігання інфікування цитомегаловірусом та/або захворювання.

Винахід також стосується застосування визначеного антигену бігеріососси5 рпештопіає або антигенів або його антигенного препарату та ад'юванту, що містить імунологічно активну фракцію сапоніну з кори ОшиШа)а Заропагіа Моїїпа, представленого у формі ліпосоми та ліпополісахариду, у виробництві імуногенної композиції, для запобігання інфікування 5бігеріососси5 рпештопіає та/або захворювання.

Винахід також стосується застосування антигену Ріахтодіцт ТаіІсірагит або антигенів або його антигенного препарату та ад'юванту, що містить імунологічно активну фракцію сапоніну з кори ОцйЙа/|а

Заропагіа Моїїпа, представленого у формі ліпосоми та ліпополісахариду, у виробництві імуногенної композиції для запобігання інфікування Ріазтодаішчт гаІсірагит та/або захворювання на малярію.

Винахід також стосується застосування антигену вірусу вітряної віспи або антигенів або його антигенного препарату та ад'юванту, що містить імунологічно активну фракцію сапоніну з кори ОцйЙа/|а

Заропагіа Моїїпа, представленого у формі ліпосоми та ліпополісахариду, у виробництві імуногенної композиції для запобігання інфікування вірусом вітряної віспи та/або захворювання.

В іншому аспекті запропоновано застосування (а) антигену або його антигенного препарату та (Б) ад'юванту, як визначено вище, у виробництві імуногенної композиції для стимулювання у людини як мінімум одного, або як мінімум двох або всіх з наступних явищ: (ї) покращеної імунної реакції Т-клітин ср4 проти вказаного антигену або його антигенного препарату, (ії) покращеної гуморальної імунної реакції проти вказаного антигену або його антигенного препарату, (ії) покращеної реакції В-лімфоцитів проти вказаного антигену або його антигенного препарату.

Зокрема, вказаний антиген являє собою вірус грипу, НРУ, цитомегаловірус, вірус вітряної віспи (МАМ), антиген Зігеріососси5 рпештопіає або малярії або його антигенний препарат, а вказана людина являє собою особу або популяцію, що піддається ризику, наприклад, дорослий з високим ризиком захворювання, людина похилого віку або немовля. У конкретному варіанті запропоновано застосування антигену або його антигенного препарату та ад'юванту, як визначено в даному описі, у виготовленні імуногенної композиції для вакцинації людини, зокрема людей похилого віку, проти патогена, з якого одержаний антиген в імуногенній композиції. Конкретно вказаний антиген являє собою вірус грипу, людський вірус папіломи, цитомегаловірус, вірус вітряної віспи, бігеріососси5 рпештопіає, Ріазітодіит рагазі(е, антиген або антигени або антигенні препарати.

Також запропонований спосіб вакцинації що включає доставку антигену або антигенної композиції, зокрема вірусу грипу або НРУ, цитомегаловірусу, вірусу вітряної віспи, Зігеріососси5 рпештопіає, Ріаєтодішт рагазіе, або його антигенного препарату та ад'юванту, як визначено вище, особі або популяції, які потребують даний антиген.

У конкретному варіанті імуногенна композиція може стимулювати покращену імунну реакцію Т- клітин СО4 проти вказаного антигену або його антигенного препарату, і, зокрема, вона може додатково стимулювати або гуморальну імунну реакцію, або покращену реакцію В-лімфоцитів або обидві в порівнянні з реакцією, що відбувається з неад'ювантним антигеном або антигенною композицією. Конкретно, вказана імунна реакція Т-клітин СО4 включає стимулювання перехресно- реактивної реакції Т-хелперів СО4. Конкретно вказана гуморальна імунна реакція включає стимулювання перехресно-реактивної реакції.

У подальшому варіанті запропонований спосіб або застосування, як визначено вище, захисту проти інфекції або захворювання, спричиненого патогеном, що являє собою варіант патогена, з якого одержаний антиген в імуногенній композиції. В іншому варіанті запропонований спосіб або застосування, як визначено вище, захисту проти інфекцій або захворювання, спричиненого патогеном, який містить антиген, що являє собою варіант вказаного антигену в імуногенній композиції. У конкретному варіанті запропоновано застосування антигену, зокрема грипу або НРУ, або його антигенного препарату у виробництві імуногенної композиції для повторної вакцинації людей, які одержали попередню вакцинацію імуногенною композицією, що містить антиген, зокрема грипу або

НРУ, або його антигенний препарат в комбінації з ад'ювантом, як описано в даному винаході.

У конкретному варіанті композиція, яку застосовують для повторної вакцинації, може додатково містити ад'ювант. В іншому конкретному варіанті імуногенна композиція для повторної вакцинації містить антиген, який складається з розповсюджених епітопів Т-клітин СО4 та антигену або антигенної композиції, застосованій у попередній вакцинації. Конкретно, імуногенна композиція для повторної вакцинації містить вірус грипу або його антигенний препарат, який складається з розповсюджених епітопів Т-клітин СО і вірусу грипу або антигенного препарату вірусу, що використовували для першої вакцинації.

В одному аспекті повторну вакцинацію проводять суб'єктам, які у попередній сезон одержали вакцину проти грипу. Звичайно повторну вакцинацію проводять як мінімум через 6 місяців після першої вакцинації, переважно, через 8-14 місяців, більш переважно приблизно, через 10-12 місяців. В іншому аспекті повторну вакцинацію проводять суб'єктам, які одержали композицію, що містить вірус грипу або його антигенний препарат, де як мінімум один штам асоціюється із спалахом пандемії або має потенціал, який асоціюється із спалахом пандемії.

У подальшому аспекті даного винаходу запропоновано застосування вірусу грипу або його антигенного препарату з першого штаму грипу у виробництві імуногенної композиції, як визначено в даному винаході, для захисту проти інфекцій грипу, спричинених варіантом штаму грипу.

Винахід також стосується способу вакцинації що включає доставку вірусу грипу або його антигенного препарату та ад'юванту, як визначено в даному винаході.

В іншому аспекті запропоновано спосіб вакцинації людини або популяції, які підлягають ризику, наприклад, дорослі з високим ризиком захворювання або люди похилого віку, причому вказаний спосіб включає введення імуногенної композиції проти грипу, яка складається з вірусу грипу або його антигенного препарату в комбінації з ад'ювантом, як визначено в даному винаході.

Ще в одному варіанті винаходу пропонується спосіб повторної вакцинації людей, які одержали попередню вакцинацію імуногенної композиції грипу, що складається з антигену грипу або його антигенного препарату з як мінімум одного штаму вірусу грипу в комбінації з ад'ювантом, як визначено в даному винаході, причому вказаний спосіб включає введення вказаній людині імуногенної композиції, яка містить вірус грипу або його або ад'ювантний, або неад'ювантний антигенний препарат. Даний винахід також стосується способу одержання імуногенної композиції, яка містить комбінацію сапонінового ад'юванту у формі ліпосоми з вірусом грипу або його антигенним препаратом і необов'язково з 30О-МРІ.

Інші аспекти та переваги даного винаходу описані далі в наступному детальному опису його переважних варіантів.

Фігура 1 - схематичне представлення одержання МРІ.

Фігура 2 - гуморальна реакція проти різних штамів грипу після імунізації тхорів експериментальними рецептурами: випробування на інгібування гемаглютинації (ЗМ /- ІСО95) до і після гетерологічного початку вакцинації (НІМІ А/5(осКпоЇт/24/90), після імунізації (НІМІ А/Мем/

СаІедопіа/20/99, НЗМ2 А/Рапата/2007/99 та В/5папддопад/7/97) та після гетерологічної провакційної проби (НЗМ2 АЛЛуотіпад/3/2003).

Фігура З - дослідження на тхорах: титру вірусів у назальних змивах після проведення провакційної проби (День 42).

Фігура 4 - дослідження на мишах: гуморальна реакція проти трьох штамів вакцини грипу після імунізації мишей експериментальними препаратами: випробування на інгібування гемаглютинації (СМТ -/- ІС95) в 21-й день після імунізації (НІМІ А/Мем/ СаІедопіа/20/99, НЗМ2 АЛЛлуотіпа/3/2003 та

В/Лапази/10/2003).

Фігура 5 - дослідження на мишах: проміжна імунна реакція клітин: специфічні по відношенню до грипу реакції Т-клітин ї- СО4 в 7-й день після імунізації.

Фігура 6 - дослідження на мишах: СМІ для СО4 - штам пулу (всі подвійні) - День 0 та День 21.

Фігура 7 - ОМТ в 0 та 21 день для антитіл НІ.

Фігура 8: частота місцевих і загальних симптомів у людей (всього і зв'язаних з рівнем 3), про які повідомляли протягом наступного періоду лікарського спостереження протягом 7 днів після імунізації ад'ювантними препаратами проти вірусу грипу, порівняння ад'ювантів з двома різними концентраціями імуностимуляторів.

Фігура 9: гуморальні реакції на НРМ 16 та 18 11 у мишей після імунізації ад'ювантними рецептурами НРУ, порівняння ад'ювантів з двома різними концентраціями імуностимуляторів.

Фігура 10: Клітинно-опосередкована імунна реакція у мишей: внутрішньоклітинне забарвлення цитокіну - М Р16 та 18 СО4-- Т-клітин після імунізації ад'ювантними рецептурами НРУ, порівняння ад'ювантів з двома різними концентраціями імуностимуляторів.

Фігура 11: продукування специфічних В-лімфоцитів після імунізації ад'ювантними рецептурами

НРУ, порівняння ад'ювантів з двома різними концентраціями імуностимуляторів.

Фігура 12: доклінічне порівняння ад'ювантних вакцин проти 5. рпештопіає у мишей, порівняння ад'ювантів з двома різними концентраціями імуностимуляторів.

Фігура 13: титр ЕГІЗБА анти-д9В морських свинок після імунізації ад'ювантною вакциною сб, порівняння ад'ювантів з двома різними концентраціями імуностимуляторів.

Фігура 14: титр нейтралізуючих анти-ЦМВ антитіл у морських свинок після імунізації ад'ювантною вакциною Об, порівняння ад'ювантів з двома різними концентраціями імуностимуляторів.

Фігура 15: титр ЕГІЗА анти-98 мишей після імунізації ад'ювантною вакциною 98.

Фігура 16: титр нейтралізуючих анти-ЦДМВ антитіл мишей імунізації ад'ювантною вакциною 98.

Фігура 17: дослідження на мишах: клітинно-опосередкований специфічний імунітет СО4-- та Сов проти ЦМВ після повторної стимуляції пулом пептидів 98 (7 днів після другої імунізації).

Фігура 18: дослідження на мишах: клітинно-опосередкований специфічний імунітет СО4ж проти

ЦМВ після повторної стимуляції двома різними дозуваннями фонду пептидів 9В (21-й день після другої імунізації).

Фігура 19: дослідження на мишах: клітинно-опосередкований специфічний імунітет СОвж проти

ЦМВ після повторної стимуляції двома різними дозуваннями фонду пептидів 9В (21-й день після другої імунізації).

Фігура 20: середнє геометричне значення титру антитіл (ЗМТ) проти С5Р навколопорозоїдного білка після імунізації ад'ювантною вакциною КТ5.5 у мишей, порівняння ад'ювантів з двома різними концентраціями імуностимуляторів.

Фігура 21: середнє геометричне значення титру антитіл (ЗМТ) проти поверхневого антигену гепатиту В (НВ») після імунізації ад'ювантною вакциною КТ5.5 у мишей, порівняння ад'ювантів з двома різними концентраціями імуностимуляторів.

Фігура 22: експресія І-2 та/або гама-інтерферону ех мімо Т-клітинами СО4 та СО8, специфічними по відношенню до СЗ9Р, після імунізації ад'ювантною КТ5.5 імуногенною композицією, порівняння ад'ювантів з двома різними концентраціями імуностимуляторів.

Фігура 23: експресія ІІ-2 та/або гама-інтерферону ех мімо Т-клітинами СО4 та СО8, специфічними по відношенню до НВ, після імунізації ад'ювантною КТ5.5 імуногенною композицією, порівняння ад'ювантів з двома різними концентраціями імуностимуляторів.

Фігура 24: гуморальні реакції у мишей після імунізації ад'ювантною трьохвалентною розщепленою вакциною проти грипу (А/Мемж/ СаІедопіа-АЛ/уотіпо, В//іапдо5зи), імуностимулятори в двох різних концентраціях.

Фігура 25: Клітинно-опосередкована імунна реакція у мишей після імунізації ад'ювантною трьохвалентною вакциною проти грипу (А/Мем СаІедопіа-АЛЛ/уотіпо, В//іапдзи), імуностимулятори в двох різних концентраціях.

Фігура 26: доклінічні результати досліджень на мишах у порівнянні ад'юванту вакцин МАМ 9Е з

АБО1В або АБО1Е.

Фігура 27: титр вірусів в назальних змивах після початку введення та проведення провакційної проби з антигенами вірусу грипу - імунізація простою або ад'ювантною А/Меу/ Саіедопіа.- АЛуотіпо,

В/Ліапдзи за допомогою ад'ювантних композицій, що містять імуностимулятори в двох різних концентраціях, у тхорів.

Фігура 28: Температура тіла у тхорів після початку введення та проведення провакційної проби антигенами грипу. Імунізація простою або ад'ювантною вакциною А/Мем/ СаїЇедопіа"-АЛууотіпод,

В/Ліапдзи за допомогою ад'ювантних композицій, що містять імуностимулятори в двох різних концентраціях.

Фігура 29: титр анти-НІ для штамів А рецептури трьохвалентної вакцини після імунізації та проведення провакційної проби препаратами антигену грипу. Імунізація простою або ад'ювантною

А/Мем/ Саїедопіа"-АЛ//уотіпу, В/Лапдзи за допомогою ад'ювантних композицій, що містять імуностимулятори вдвох різних концентраціях.

Фігура 30: титр анти-НІ для штаму В/діаапдзи і мінливого штаму, які використовували для провакційної проби після імунізації та проведення провакційної проби препаратами антигену грипу.

Імунізація простою або ад'ювантною вакциною А/Меу/ СаІедопіа.-АЛ/Л/уотіпдо, В/Ліапдзи за допомогою ад'ювантних композицій, що містять імуностимулятори в двох різних концентраціях.

Винахідники даного винаходу відкрили, що ад'ювантна композиція, яка містить сапонін, представлений у формі ліпосоми, та ліпополісахарид, де кожен імуностимулятор присутній в кількості мкг або менше на дозу для людини, може покращити імунні реакції на антигенний препарат і в той же час володіти більш низькою реактогенністю, ніж деякі з попередньо відомих рецептур, де імуностимулятори були присутні в більш високих кількостях на дозу для людини.

Винахідники даного винаходу також виявили, що рецептура проти грипу, яка становиться з вірусу грипу або його антигенного препарату разом з ад'ювантом, що містить сапонін, представлений у формі ліпосоми, і необов'язково додатково з похідним ліпіду А, наприклад, З30О-МРІ., могла покращити імунну реакцію Т-клітин СО4 проти вказаного антигену або антигенної композиції в порівнянні з рецептурою, одержаною з неад'ювантним вірусом або його антигенним препаратом. Рецептури з ад'ювантом сапоніну, представленим у формі ліпосоми, переважно застосовують з метою стимулювання реакцій Т-клітин СО4 проти грипу, які можуть виявляти епітопи грипу, представлені молекулами МНС класу ІІ. У даній заявці виявлено, що ефективно спрямувати систему клітинно- опосредкованого імунітету з метою збільшення реактивності проти гомологічних і мінливих штамів грипу (в порівнянні з вакцинацією та інфекцією).

Саме у конкретному варіанті даного винаходу композиції для застосування за даним винаходом можуть бути здатними забезпечити для людини кращий серозахист проти грипу після повторної вакцинації, як було встановлено кількістю випадків корелятів захисту грипу у людей. До того ж, саме в іншому конкретному варіанті вказана композиція для застосування за даним винаходом також може індукувати більш сильну реакцію В-лімфоцитів після першої вакцинації пацієнта-людини, і більш виражену гуморальну реакцію після повторної вакцинації в порівнянні з неад'ювантною композицією.

Ад'ювантні композиції проти грипу відповідно даного винаходу мають декілька переваг: 1) Переважну імуногенність: вони дозволять відновити слабку імунну реакцію у людей похилого віку (старше 50 років, звичайно старше 65 років) до рівнів, що спостерігаються у молодих людей (антитіло та/або реакції Т-клітин); 2) Переважний профіль перехресного захисту: підвищений перехресний захист проти варіантних (мінливих) штамів грипу; 3) Вони також дозволять застосовувати зменшену дозу антигену для подібної реакції, таким чином гарантуючи збільшення можливостей у випадку термінової необхідності (наприклад, пандемії).

В іншому аспекті винаходу винахідники відкрили, що ад'ювантна композиція, як визначено в даному описі, демонструє результати імуногенності як з точки зору продукування антитіл, так і частоти поствакцинації СО4, специфічної по відношенню до грипу, що є рівноцінними, або іноді більші, ніж ті, що генеруються з неад'ювантною вакциною. Даний ефект має особливе значення для популяції людей похилого віку і може бути досягнутий з ад'ювантом, як визначено в даному описі, та меншою дозою імуностимуляторів. Крім того, продемонстровано тенденцію, де симптоми реактогенності вищі в групі, яка одержала ад'ювантну вакцину з найвищою концентрацією імуностимуляторів, в порівнянні з групою, яка одержала ад'ювантну вакцину, де імуностимулятори містилися в нижчій концентрації.

Вказані дані можуть бути застосовані до інших форм таких же антигенів, а також до інших антигенів.

Сапоніновий ад'ювант

Ад'ювантна композиція даного винаходу містить ад'ювант сапоніну, представлений у формі ліпосоми.

Особливо придатним сапоніном для застосування в даному винаході є Опції А та його похідні. Опції

А являє собою препарат сапоніну, добутий з південноамериканського дерева Оціа)а бЗаропагіа Моїїпа, він був вперше описаний Оаїздаага еї аї, у 1974 році ("Заропіп адіимапіє", АгсПім. Тиг діе дезатіє

Мігивіогзепипа, Мої. 44, бргіпдег Мепад, Вепіп, р243-254), як такий, що володіє ад'ювантою активністю.

Очищені фрагменти ОЇ А були добуті за допомогою ВЕРХ, зберігаючи ад'юванту активність без токсичності, пов'язаної з Оці А (ЕР 0 362 278), наприклад, 057 та 0521 (також відомі як СА7 та

ОСА21). 05-21 являє собою природний сапонін з кори ОціПа|а заропагіа Моїїпа, який стимулює СЮОв8 цитотоксичні Т-клітини (СТІ), клітини ТА1 та домінуючу реакцію антитіла Ідсга, і він є переважним сапоніном в контексті даного винаходу.

У відповідній формі даного винаходу ад'ювант сапоніну в межах імуногенної композиції являє собою похідне Заропагіа тоїїйпа диїЇ А, переважно імунологічно активної фракції Оці А, наприклад,

О517 або 0521, придатною є 02521. В одному варіанті композиції даного винаходу містять імунологічно активну фракцію сапоніну, істотною мірою в чистій формі. Переважно композиції даного винаходу містять 2521, істотною мірою в чистій формі, тобто 0521 має чистоту як мінімум 90 95, наприклад, як мінімум 95 95, або як мінімум 98 95.

У конкретному варіанті 0521 присутній у вигляді менш реактогенної композиції, де він гаситься екзогенним стеролом, наприклад, холестерином. Існують декілька конкретних форм менш реактогенних композицій, де 0521 гаситься екзогенним холестерином. У конкретному варіанті сапонін/стерол знаходиться у формі ліпосомної структури (МО 96/33739, Приклад 1). У даному варіанті ліпосоми відповідно містять нейтральний ліпід, наприклад, фосфатидилхолін, який, відповідно, є некристалічним при кімнатній температурі, наприклад, фосфатидилхолін яєчного жовтка, діолеоїлфосфатидилхолін (БОРС) або ділаурилфосфатидилхолін. Ліпосоми можуть також містити заряджений ліпід, який збільшує стабільність структури ліпосомного 0521 для ліпосом, що складаються з насичених ліпідів. У даних випадках кількість зарядженого ліпіду становить, відповідно, 1-2095 (мас), переважно 5-10 905. Співвідношення стерол до фосфоліпіду становить 1-50 9о (моль/моль), відповідно 20-25 95.

Відповідні стероли включають п-ситостерол, стігмастерол, ергостерол, ергокальциферол і холестерин. В одному конкретному варіанті ад'ювантна композиція містить холестерин як стерол. Дані стероли добре відомі в даній галузі, наприклад холестерин, описаний в МегскК Іпаех, 11-е видання, с. 341, як стерол, що зустрічається у природі, знайдений у тваринному жирі.

Ад'ювантні композиції даного винаходу, що містять 0521 і стерол, особливо холестерин, демонструють знижену реактогенність в порівнянні з композиціями, де стерол відсутній, при збереженні ад'ювантного ефекту. Дослідження реактогенності можна оцінити у відповідності до способів, розкритих у УМО 96/33739. Відповідно даного винаходу під стеролом мають на увазі екзогенний стерол, тобто стерол, що не є ендогенним для організму, з якого одержують антигенний препарат, але його додають до антигенного препарату або згодом, у момент виготовлення рецептури.

Звичайно, вказаний стерол можна додавати протягом подальшого виготовлення рецептури антигенного препарату з ад'ювантом сапоніну, використовуючи, наприклад, сапонін у формі, що погашена стеролом. Відповідно екзогенний стерол асоціюється з ад'ювантом сапоніну, як описано у

МО 96/33739.

Якщо активна фракція сапоніну являє собою 0521, співвідношення 0521: стерол буде звичайно присутній в кількості порядку від 1:100 до 1:1 (мас), переважно від 1:10 до 1:1 (мас), і переважно від 1:5 до 1:1 (мас). Відповідно, присутній додатковий стерол, співвідношення О521/стерол становить як мінімум 1:2 (мас). В одному варіанті співвідношення О521/стерол становить 1:5 (мас). Стерол, відповідно, являє собою холестерин.

Інші придатні сапоніни походять з рослин Аезсціи5 ПпПірросабзіапит (каштан кінський) або суорпійа 5ігиПпішт (качим перекотиполе). Інші сапоніни, які описані в літературі, включають ескін, який описаний в МегсКк Іпаех (12-е видання: стаття 3737) як суміш сапонінів, що зустрічається в насінні каштану кінського, латинська назва Аевсціи5 Пірросазіапит. Описане його добування за допомогою хроматографії та очищення (Ріеадіег, АггпейтЩеїІ-Рог5сп. 4, 213 (1953)), а також за допомогою іонно- обмінних смол (Егбгіпуд еї аІ., США 3,238,190). Фракції ескіну були очищені, і показано, що вони є біологічно активними речовинами (ХУо5піКау/а М еї аї. (Спет Ріагт Виї (ТоКусо) 1996; серпень, 44(8): 1454-1464)). Сапоальбін з сурзорпйа б5ігшпішт (Б. Мосічеп еї аї., 1968, 9. Рпагт, Ве!д., 42, 213-226) також описаний, наприклад, відносно продукування ІЗСОМ.

Ключовим аспектом даного винаходу є той факт, що імунологічно активний сапонін, що переважно являє собою 0521, можна застосовувати в менших кількостях, ніж вважали придатним раніше, менше мкг, наприклад, від 1 до 30 мкг на дозу імуногенної композиції для людини.

Таким чином, у даному винаході пропонується доза імуногенної композиції для людини, що містить імунологічно активний сапонін, переважно 0521, на рівні 30 мкг або менше, наприклад від 1 до 30 мкг.

В одному варіанті імуногенна композиція в об'ємі, який придатний для дози для людини, доза імуногенної композиції для людини містить 2521 на рівні приблизно 25 мкг, наприклад, 20-30 мкг, переважно від 21 до 29 мкг або від 22 до 28 мкг, або від 23 до 27 мкг, або від 24 до 26 мкг, або 25 мкг.

В іншому варіанті доза імуногенної композиції для людини містить 0521 на рівні приблизно 10 мкг, наприклад, 5-15 мкг, переважно від 6 до 14 мкг, наприклад, від 7 до 13 мкг або від 8 до 12 мкг або від 9 до 11 мкг, або 10 мкг.

У подальшому варіанті доза для людини імуногенної композиції містить 2521 на рівні приблизно 5 мкг, наприклад, від 1 до 9 мкг, або від 2 до 8 мкг або, відповідно, від З до 7 мкг або від 4 до 6 мкг, або 5

МКГ.

Відповідною кількістю 0521 є, наприклад, будь-яка з 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 мкг (мас/об.) на дозу імуногенної композиції для людини.

Під терміном "доза для людини" мають на увазі дозу, яка являє собою об'єм, придатний для застосування у людини. Звичайно дана доза знаходиться в межах від 0,3 до 1,5 мл. В одному варіанті доза для людини становить 0,5 мл. У подальшому варіанті доза для людини вища, ніж 0,5 мл, наприклад, 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 або 1 мл. У подальшому варіанті, доза для людини знаходиться в межах від 1 мл до 1,5 мл. Даний винахід характеризується тим, що кожна доза для людини містить 30 мкг або менше, наприклад, від 1 до ЗО мкг 20521.

У винаході додатково пропонується ад'ювантна композиція, що містить 30 мкг або менше, наприклад, від 1 до 30 мкг 2521. Звичайно, така ад'ювантна композиція буде міститися у відповідному об'ємі дози для людини. Якщо ад'ювант, що перебуває в рідкій формі, потрібно скомбінувати з рідкою формою антигенної композиції, то ад'ювантна композиція буде у відповідному об'ємі дози для людини, який становить приблизно половину передбачуваного кінцевого об'єму дози для людини, наприклад, 360 мкл об'єму для передбачуваної дози для людини 0,7 мл, або 250 мкл об'єму для передбачуваної дози для людини 0,5 мл. Ад'ювантну композицію розбавляють при комбінації з антигенною композицією з метою одержання кінцевої дози вакцини для людини. Кінцевий об'єм такої дози звичайно буде змінюватися залежно від початкового об'єму ад'ювантної композиції та об'єму антигенної композиції, доданої до ад'ювантної композиції. В альтернативному варіанті рідкий ад'ювант застосовують з метою відновлення композиції ліофілізованого антигену. У даному варіанті відповідний об'єм дози для людини ад'ювантної композиції приблизно дорівнює кінцевому об'єму дози для людини. Рідку ад'ювантну композицію додають до пробірки, що містить композицію ліофілізованого антигену. Кінцева доза для людини може варіювати в межах від 0,5 до 1,5 мл. У конкретному варіанті доза для людини становить 0,5 мл, у вказаному варіанті композиція вакцини даного винаходу буде містити рівень 0521 30 мкг або нижче, наприклад, від 1 до 30 мкг на дозу для людини 0,5 мл, до того ж, у даному варіанті ад'ювантна композиція даного винаходу буде містити рівень 0521 30 мкг або нижче, наприклад, від 1 до 30 мкг на 250 мкл ад'ювантної композиції, або на 500 мкл ад'ювантної композиції, в залежності від того, чи будуть комбінувати ад'ювантну композицію з рідиною, або з композицією ліофілізованого антигену відповідно.

Конкретно при комбінуванні з антигеном грипу можна застосовувати кількість 0521, наприклад, 1- 100 мкг (мас/об.) на дозу композиції, переважно 10-50 мкг (мас/об.) на дозу композиції. Відповідною кількістю 0521 є, наприклад, будь-яка з 1,2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49 або 50 мкг (мас/об.) на дозу композиції. Більш переважно, кількість 0521 варіює від 25 до 75 мкг (мас/об.) на дозу композиції. Звичайно, доза композиції буде варіюватися від приблизно 0,5 мл до приблизно 1 мл. Типова доза вакцини становить 0,5 мл, 0,6 мл, 0,7 мл, 0,8 мл, 0,9 мл або 1 мл. У переважному варіанті кінцева концентрація 2521 50 мкг міститься у мілілітрі композиції вакцини, або мкг на 0,5 мл дози вакцини. В інших переважних варіантах кінцева концентрація 2521 35,7 мкг або 71,4 мкг міститься у мілілітрі композиції вакцини. Конкретно об'єм дози вакцини 0,5 мл містить 25 мкг або 50 мкг 0521 на дозу.

Доза 0521, відповідно, може підсилювати імунну реакцію на антиген у людини. Зокрема, відповідною кількістю 2521 є така, яка покращує імунологічний потенціал композиції в порівнянні з неад'ювантною композицією, або в порівнянні з ад'ювантною композицією з іншою кількістю 0521, будучи прийнятою за профілем реактогенності.

Ад'ювант 30О-МРІ.

Композиція додатково містить ад'ювант, що являє собою ліпополісахарид, відповідно нетоксичне похідне ліпіду А, особливо ліпід А монофосфорилу або, більш переважно, ліпід А З-деацильований монофосфорил (30-МРІ).

З0О-МРІ. продається під назвою МРІ. СіІахозтійКіїпе Віоіодісаіє М.А. і позначається в даному документі як МРІ. або 30О-МРІ.,, див., наприклад, патенти США МоМо 436,727; 4,877,611; 4,866,034 та 4,912,094. Перш за все, 30О-МР'І. дає реакції СО4-- Т-клітин з фенотипом ІЄМ-9 (Тп1). З3О-МРІ. можна одержати за допомогою способів, розкритих в СВ 2 220 211 А. З хімічної точки зору він являє собою суміш ліпіду А З-деацильованого монофосфорилу з 3, 4, 5 або б ацильованими ланцюгами.

Переважно в композиціях даного винаходу використовують маленьку частинку 30О-МРІ. Маленька частинка З30О-МРІ має такий розмір, що можна здійснити її стерильну фільтрацію крізь фільтр з розміром отворів 0,22 мкм. Такі препарати описані у УМО 94/21292.

Ключовим аспектом даного винаходу є той факт, що ліпополісахарид, який переважно являє собою 30-МРІ.,, можна застосовувати в менших кількостях, ніж вважали придатним раніше, менше 30 мкг, наприклад, від 1 до 30 мкг на дозу імуногенної композиції для людини.

Таким чином, у даному винаході пропонується доза імуногенної композиції для людини, що містить ліпополісахарид, переважно 30О-МРІ,, на рівні 30 мкг або менше, наприклад від 1 до 30 мкг.

В одному варіанті доза імуногенної композиції для людини містить 30О-МРІ. на рівні приблизно 25 мкг, наприклад, 20-30 мкг, переважно від 21 до 29 мкг, або від 22 до 28 мкг, або від 23 до 27 мкг, або від 24 до 26 мкг, або 25 мкг. В іншому варіанті доза імуногенної композиції для людини містить 30-

МРІ. на рівні приблизно 10 мкг, наприклад, від 5 до 15 мкг, переважно від 6 до 14 мкг, наприклад, від 7 до 13 мкг або від 8 до 12 мкг або від 9 до 11 мкг, або 10 мкг.

У подальшому варіанті, доза для людини імуногенної композиції містить на рівні приблизно 5 мкг, наприклад між 1 і 9 мкг, або між 2 і 8 мкг або, відповідно, між З і 7 мкг або 4 і 6 мкг, або 5 мкг.

Відповідною кількістю З30О-МРІ. є, наприклад, будь-яка 31,2, 3,4,5,6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 мкг (мас/об.) на дозу імуногенної композиції для людини.

В одному варіанті об'єм дози для людини становить 0,5 мл. У подальшому варіанті імуногенна композиція знаходиться в об'ємі, придатному для дози для людини, об'єм якої більше 0,5 мл, наприклад, 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 або 1 мл. У подальшому варіанті, доза для людини знаходиться в межах від 1 мл до 1,5 мл. Даний винахід характеризується тим, що кожна доза для людини містить 30 мкг або менше, наприклад, від 1 до 30 мкг 3З0О-МРІ.

У винаході додатково пропонується ад'ювантна композиція, що містить 30 мкг або менше, наприклад, від 1 до 30 мкг З30О-МРІ. Звичайно, така ад'ювантна композиція буде міститися у відповідному об'ємі дози для людини. Якщо ад'ювант, що перебуває в рідкій формі, необхідно поєднати з рідкою формою антигенної композиції, то ад'ювантна композиція буде міститися у відповідному об'ємі дози для людини, який становить приблизно половину передбачуваного кінцевого об'єму дози для людини, наприклад, 360 мкл об'єму для передбачуваної дози для людини 0,7 мл, або 250 мкл об'єму для передбачуваної дози для людини 0,5 мл. Ад'ювантну композицію розбавляють при поєднанні з антигенною композицією з метою одержання кінцевої дози імуногенної композиції для людини. Кінцевий об'єм такої дози звичайно буде змінюватися в залежності від початкового об'єму ад'ювантної композиції та об'єму антигенної композиції, доданої до ад'ювантної композиції. В альтернативному варіанті рідку ад'ювантну композицію застосовують з метою відновлення композиції ліофілізованого антигену. У даному варіанті відповідний об'єм дози для людини ад'ювантної композиції приблизно дорівнює кінцевому об'єму дози для людини. Рідку ад'ювантну композицію додають до пробірки, що містить композицію ліофілізованого антигену. Об'єм кінцевої дози для людини може варіювати в межах від 0,5 до 1,5 мл. В конкретному варіанті об'єм дози для людини становить 0,5 мл, у вказаному варіанті композиція вакцини даного винаходу буде містити кількість 30-

МРІ. 30 мкг або менше, наприклад, від 1 до 30 мкг на дозу для людини 0,5 мл, до того ж, у даному варіанті ад'ювантна композиція даного винаходу буде містити кількість ЗО-МРІ 30 мкг або менше, наприклад, від 1 до 30 мкг на 250 мкл ад'ювантної композиції, або на 500 мкл ад'ювантної композиції, в залежності від того, чи будуть поєднувати ад'ювантну композицію з рідиною, або з композицією ліофілізованого антигену відповідно.

Якщо імуногенна композиція містить вірус грипу або його антигенний препарат, то ад'ювантна композиція, яка складається з сапоніну, представленого у формі ліпосоми, і, необов'язково, додатково з похідним ліпіду А, особливо ліпід А монофосфорилом або, більш переважно, 3О-МРІ. У даному варіанті можна застосовувати кількість ЗО-МРІ., наприклад, 1-100 мкг (мас/об.) на дозу композиції, переважно 10-50 мкг (мас/об.) на дозу композиції. Відповідною кількістю 30О-МРІ. є, наприклад, будь- яказ3з1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, Аб, 47, 48, 49 або 50 мкг (мас/об.) на дозу композиції. Більш переважно, кількість З3О-МРІ. варіює від 25 до 75 мкг (мас/об.) на дозу композиції.

Звичайно, об'єм дози композиції буде варіювати від приблизно 0,5 мл до приблизно 1 мл. Типова доза вакцини становить 0,5 мл, 0,6 мл, 0,7 мл, 0,8 мл, 0,9 мл або 1 мл. В одному варіанті кінцева концентрація З0О-МРІ 50 мкг міститься у мілілітрі композиції вакцини, або 25 мкг на 0,5 мл дози вакцини. В іншому варіанті кінцева концентрація 30О-МРІ. 35,7 мкг або 71,4 мкг міститься у мілілітрі композиції вакцини. Конкретно об'єм дози вакцини 0,5 мл містить 25 мкг або 50 мкг 30О-МРІ. на дозу.

Доза З30О-МРІ, відповідно, може підсилювати імунну реакцію на антиген у людини. Зокрема, відповідною кількістю ЗО-МРІ. є така, яка покращує імунологічний потенціал композиції в порівнянні з неад'ювантною композицією, або в порівнянні з ад'ювантною композицією, що містить іншу кількість

МРІ'.,, будучи прийнятою за профілем реактогенності.

Відповідні композиції даного винаходу являють собою композиції, де ліпосоми спочатку виготовляють без МРІ (як описано у МО 96/33739), а потім додають МРІ, переважно у вигляді маленьких частинок розміром менше 100 нм або частинок, для яких можна здійснити стерильну фільтрацію крізь фільтр з розміром частинок 0,22 мкм. Таким чином, МРІ. не міститься в оболонці везикули (відомий як зовнішній МР). Композиції, де МР'І. міститься в оболонці везикули (відомий як внутрішній МРІ також розглядають як аспект даного винаходу. Антиген може міститися в оболонці везикули або міститься за межами оболонки везикули. Переважно, розчинні антигени знаходяться за межами оболонки, тоді як гідрофобні або ліпідовані антигени можуть міститися усередині або за межами оболонки.

В одному варіанті ад'ювантна композиція даного винаходу містить як ліпополісахарид, так і імунологічно активний сапонін. У конкретному варіанті даного винаходу ліпополісахарид являє собою

З0О-МРІ,, а імунологічно активний сапонін являє собою 0521. В іншому варіанті даного винаходу ад'ювантна композиція складається в основному з ліпополісахариду та імунологічно активного сапоніну у ліпосомальній рецептурі. Відповідно, в одній формі даного варіанту ад'ювантна композиція складається в основному з 30О-МРІ. та 0521, вона необов'язково містить стерол, що переважно являє собою холестерин.

В іншому варіанті даного винаходу ад'ювантна композиція містить ліпополісахарид та імунологічно активний сапонін у ліпосомальній рецептурі в комбінації з одним або більше додаткових імуностимуляторів або ад'ювантів. Відповідно, в одній формі даного варіанту ліпополісахарид являє собою 30-МРІ,, а імунологічно активний сапонін являє собою 0521.

У конкретному варіанті 20521 та 30-МРІ присутні в однаковій кінцевій концентрації на дозу імуногенної композиції для людини. В одному аспекті даного варіанту доза імуногенної композиції для людини містить кінцевий рівень 25 мкг ЗО-МРІ. та 25 мкг 0521. В іншому варіанті доза імуногенної композиції для людини містить кінцеву кількість 10 мкг як МРІ,, так ії 0521. В іншому конкретному варіанті запропонована ад'ювантна композиція, що має об'єм 250 мкл і містить кількість 25 мкг ЗО-МРІ. та 25 мкг 0521, або 10 мкг кожного з них: МРГ. та 0521.

Антигени, які можна використовувати з ад'ювантними композиціями даного винаходу, містять вірусні, паразитичні, бактеріальні або асоційовані з пухлинами антигени, наприклад, вірус грипу або його антигенний препарат для застосування відповідно даного винаходу, що може являти собою розщеплений вірус грипу або антигенний препарат розщепленого вірусу. В альтернативному варіанті препарат проти грипу може містити інший тип антигену грипу, наприклад, інактивований суцільний вірус або очищений НА та МА (субодинична вакцина), або вірус грипу. В іншому варіанті вірус грипу може являти собою живий атенуйований препарат проти грипу.

Розщеплений вірус грипу або антигенний препарат розщепленого вірусу для застосування відповідно даного винаходу переважно являє собою препарат інактивованого вірусу, де частинки вірусу руйнуються детергентами або іншими реактивами з метою солюбілізації ліпідної оболонки.

Розщеплений вірус або антигенні препарати розщепленого вірусу виготовляють відповідно за допомогою фрагментації суцільного вірусу грипу як інфекційного, так й інактивованого, з солюбілізуючими концентраціями органічних розчинників або детергентів і подальшим видаленням всього або більшості солюбілізуючого агента та частини або більшості вірусного ліпідного матеріалу.

Під розщепленим антигенним препаратом вірусу мається на увазі розщеплений препарат вірусу, який може піддаватися очищенню до деякої міри в порівнянні з розщепленим вірусом при зберіганні більшості антигенних властивостей компонентів розщепленого вірусу. Наприклад, при продукуванні в яйці розщеплений вірус може бути очищений від забруднюючих яєчних білків, або при продукуванні в культурі клітини розщеплений вірус може бути очищений від домішок клітини хазяїна. Антигенний препарат розщепленого вірусу може містити розщеплені антигенні компоненти вірусу більш, ніж одного вірусного штаму. Вакцини, що містять розщеплений вірус (названі "розщеплена вакцина проти грипу") або антигенні препарати розщепленого вірусу звичайно містять залишкові матричні білки та нуклеопротеїни, а іноді ліпіди, а також білки мембранної оболонки. Такі розщеплені вакцини вірусу звичайно будуть містити більшість або всі структурні білки вірусу, хоча необов'язково в тих же пропорціях, в яких вони містяться у суцільному вірусі.

Альтернативно, вірус грипу може бути у формі вакцини з суцільного вірусу. Даний факт може бути перевагою над розщепленою вакциною вірусу для пандемічної ситуації, оскільки він дозволяє уникнути невпевненості в тому, чи може розщеплена вакцина вірусу бути успішно продукованою для нового штаму вірусу грипу. Для деяких штамів звичайні детергенти, які використовують для одержання розщепленого вірусу, можуть пошкодити вірус і зробити його непридатним. Хоча завжди існує можливість застосування різних детергентів та/або розробки іншого способу для одержання розщепленої вакцини, це буде вимагати певного часу, якого може не бути в умовах пандемічної ситуації. Крім того, для більшого ступеня впевненості до підходу до суцільного вірусу існує також більша потужність продукування вакцини, ніж для розщепленого вірусу, оскільки втрачаються значні кількості антигену протягом додаткових стадій очищення, необхідних для одержання придатної розщепленої вакцини.

В іншому варіанті препарат проти вірусу грипу знаходиться у формі очищеної субодиничної вакцини грипу. Субодиничні вакцини грипу звичайно містять два головних білка оболонки, НА та МА, і можуть мати додаткову перевагу над суцільновіріонними вакцинами, оскільки вони загалом є менш реактогенними, особливо для людей, вакцинованих у молодому віці. Субодиничні вакцини можна приготувати або рекомбінантним способом, або за допомогою очищення із частинок зруйнованого вірусу.

В іншому варіанті препарат проти вірусу грипу знаходиться у формі віросоми. Віросоми являють собою сферичні, одношарові везикули, які зберігають функціональні вірусні оболонкові глікопротеїни

НА та МА в аутентичній конформації, вставлені у двошарову мембрану фосфоліпідів віросом.

Вказаний вірус грипу або його антигенний препарат можна одержати з яєць або з культури клітини.

Наприклад, антиген вірусу грипу або його антигенний препарат відповідно даного винаходу можна одержати за допомогою звичайного способу на яйцях курячих ембріонів, вирощуючи вірус грипу в яйцях і очищуючи одержану алантоїсну рідину. Віруси в яйцях можуть накопичуватися у великих кількостях протягом нетривалого часу. Альтернативно, їх можна одержати будь-яким із способів нового покоління, із застосуванням клітини або культури клітини з метою вирощування вірусу або поверхневих антигенів експресованого рекомбінантного вірусу грипу. Придатні субстрати клітин для вирощування вірусу включають, наприклад, ниркові клітини собаки такі, як МОСК або клітини клону

МОСК, МОСсК-подібні клітини, ниркові клітини мавпи такі, як клітини АСМК, включаючи клітини Мего, придатні лінії клітин свині, або будь-який інший тип клітин ссавців, придатний для продукування вірусу грипу з метою одержання вакцини. Придатні субстрати клітин також включають людські клітини, наприклад, клітини МКСО-5. Придатні субстрати клітин не обмежені лініями клітин; наприклад, первинні клітини такі, як фібробласти курячих ембріонів та пташині лінії клітин, також використовують з метою одержання вакцини.

Антиген вірусу грипу або його антигенний препарат можна одержати шляхом будь-якого з цілої низки комерційно застосовуваних способів, наприклад, спосіб розщепленого вірусу грипу, описаний в патенті Мо 0О 300 833 та БО 211 444, включений до даного опису шляхом посилання. Традиційно розщеплений вірусу грипу одержують, застосовуючи обробку розчинником/детергентом, наприклад, три-н-бутилфосфат або діетиловий ефір в комбінації з Твін "М (відомого як розщеплення "Твін-ефір",, і даний спосіб все ще застосовують в деяких засобах для виробництва. Інші агенти, які застосовують зараз для розщеплення, включають детергенти або протеолітичні ферменти, або солі жовчі, наприклад, натрію дезоксихолат, як описано у патенті Ме БО 155 875, включеному в даний опис як посилання. Детергенти, які можна застосовувати як агенти для розщеплення, включають катіонні детергенти, наприклад, цетилтриметиламонію бромід (СТАВ), інші іонні детергенти, наприклад, лаурилсульфат, тауродезоксихолат, або неїонні детергенти такі, як ті, що описані вище, включаючи

Тритон Х-100 (наприклад, у способі, описаному Опа еї аї, 2000, Віоіодісаі5 28, 95-103) і Тритон М-101, або комбінації будь-яких двох або більше детергентів.

Спосіб одержання розщепленої вакцини може включає ряд різних фільтрацій та/або інших стадій відокремлення, наприклад, стадії ультрацентрифугування, ультрафільтрації, зонального центрифугування та хроматографії (наприклад, іонообміном) в різноманітних комбінаціях, і необов'язково, стадію інактивації наприклад, за допомогою тепла, формальдегіду або п- пропіолактону або УФ, який можна проводити до або після розщеплення. Спосіб розщеплення можна проводити як партію, безперервний або напів-безперервний процес. Переважний спосіб розщеплення та очищення для розщепленої імуногенної композиції описаний у УМО 02/097072.

Переважні антигенні препарати розщепленої вакцини проти грипу відповідно даного винаходу містять залишкову кількість Твіну 80 та/або Тритону Х-100, що залишається із способу одержання, хоча вони можуть додаватися або їх концентрації коректують після одержання розщепленого антигену. Переважною є присутність як Твіну 80, так ії Тритону Х-100. Переважними інтервалами для кінцевих концентрацій даних неіонної поверхнево-активних речовин в дозі вакцини є наступні: Твіну 80 0,01-1 95, більш переважно, приблизно 0,1 95 (мас/об.), Тритону Х-100-0,001-0,1 95 (мас/об.), більш переважно, 0,005-0,02 95 (мас./об.).

В конкретному варіанті кінцева концентрація для Твіну 80 знаходиться в межах від 0,025 95 до 0,09 95 (мас/об.). В іншому конкретному варіанті антиген вводять як 2-х порядкову концентровану суміш, яка має концентрацію Твіну 80 у межах від 0,025 95 до 0,295 (мас/об.), і яку необхідно розбавляти вдвічі для одержання кінцевої рецептури з ад'ювантом (або додати буфер у контрольну рецептуру).

В іншому конкретному варіанті кінцева концентрація Тритону Х-100 знаходиться у межах від 0,004 95 до 0,017 95 (мас/об.). В іншому конкретному варіанті антиген вводять як 2-х порядкову концентровану суміш, яка містить концентрацію Тритона Х-100 у межах від 0,005 95 до 0,034 95 (мас/об.), і яку необхідно розбавляти вдвічі для одержання кінцевої рецептури з ад'ювантом (або додати буфер у контрольну рецептуру).

Переважно, препарат проти грипу виготовляють в присутності низького рівня тіомерсалу, або, переважно, за відсутності тіомерсалу. Переважно, препарат проти грипу, отриманий в результаті, є стабільним за відсутності органортутних консервантів, зокрема, даний препарат не містить залишкового тіомерсалу. Зокрема, препарат проти вірусу грипу містить антиген гемаглютиніну, стабілізований за відсутності тіомерсалу, або він знаходиться на низьких рівнях тіомерсалу (звичайно, мкг /ьмл або менше). Конкретно стабілізацію штаму грипу В проводять за допомогою похідного альфа-токоферолу, наприклад, альфа-токоферолу сукцинат (також відомий як вітаміну Е сукцинат, тобто МЕ5). Такі препарати та способи їх одержання розкриті у УМО 02/097072.

Переважна композиція містить три інактивованих антигени розщепленого віріону, приготовлених із штамів грипу відповідного сезону, рекомендованих Всесвітньою організацією охорони здоров'я.

Переважно, вірус грипу або його антигенний препарат та ад'ювант відповідно даного винаходу містяться в одному контейнері. Такий підхід називається "підходом однієї пробірки". Переважно пробірка являє собою попередньо заповнений шприц. В альтернативному варіанті вірус грипу або його антигенний препарат та ад'ювант відповідно даного винаходу містяться в окремих контейнерах або пробірках, їх змішують безпосередньо перед застосуванням або при введенні суб'єкту. Такий підхід називається "підходом двох пробірок". Наприклад, якщо вакцина являє собою двохкомпонентну вакцину для повного об'єму дози 0,7 мл, то сконцентровані антигени (наприклад, сконцентровані тривалентні інактивовані антигени розщепленого віріону) представлені в одній пробірці (335 мкл) (контейнер для антигену), а попередньо заповнений шприц, містить ад'ювант (360 мкл) (контейнер для ад'юванту). Під час ін'єкції вміст пробірки, що містить концентровані трьохвалентні інактивовані антигени розщепленого віріону, витягають з пробірки за допомогою шприца, що містить ад'ювант, після легкого струшування шприца. До введення ін'єкції використовувану голку заміняють голкою для внутрішньом'язового введення, а об'єм доводять до 530 мкл. В даному прикладі одна доза кандидата реконструйованої ад'ювантної вакцини грипу відповідає 530 мкл.

В одному аспекті винаходу, де є багатовалентна композиція, як мінімум один штам грипу у вказаній багатовалентній імуногенній композиції, як визначено в даному описі, асоціюється із спалахом пандемії або має потенціал, який асоціюється із спалахом пандемії. Такий штам може також мати назву "пандемічним штамом" у тексті, наведеному нижче. Зокрема, коли вакцина являє собою багатовалентну вакцину, наприклад двовалентну, або трьохвалентну або чотирьохвалентну вакцину, то як мінімум один штам асоціюється із спалахом пандемії або має потенціал, який асоціюється із спалахом пандемії. Придатні штами являють собою, не обмежуючись ними: НЬМІ, НОМ2, Н7М7 та намМе.

Вказаний вірус грипу або його антигенний препарат переважно є багатовалентним, наприклад двовалентним або трьохвалентним або чотирьохвалентним. Переважно вірус грипу або його антигенний препарат є трьохвалентним або чотирьохвалентним і містить антигени трьох різних штамів грипу, причому як мінімум один штам, асоційований із спалахом пандемії або має потенціал, який асоціюється із спалахом пандемії.

Особливості штаму вірусу грипу, які надають йому потенціал, що спричиняє спалах пандемії, є наступними: він містить новий гемаглютинін в порівнянні з гемаглютиніном існуючих на теперішній час штамів; він може передаватися горизонтально в популяції людей; і він Є патогенним для людини.

Новий гемаглютинін може бути таким, який не виявляється в людській популяції протягом значного періоду часу, ймовірно, протягом ряду десятиліть, наприклад, Н2. Або це може бути гемаглютинін, який раніше не існував в людській популяції, наприклад Н5, НО, Н7 або Нб, знайдені у птахів. В будь- якому випадку більшість, або як мінімум велика частина, або навіть вся популяція не зіткалася раніше з антигеном і є імунологічно не готовою до нього.

Певні групи людей звичайно піддаються підвищеному ризику стати інфікованими грипом у випадку пандемії. Особливо вразливими є люди похилого віку, пацієнти з хронічними захворюваннями та маленькі діти, але багато молодих і очевидно здорових людей також знаходяться в групі ризику. У випадку грипу Н2 частина популяції, народженої після 1968 року, має підвищений ризик інфікування грипом. Для вказаних груп важливо бути ефективно захищеними, якового скоріше та простим способом.

Інша група людей, яка знаходиться в зоні підвищеного ризику, - це мандрівники. Сьогодні люди подорожують більше, ніж будь-коли раніше, а регіони, де з'являється більшість нових вірусів, Китай та

Південно-східна Азія, в останні роки стали популярними місцями для подорожей. Така зміна маршрутів для подорожей надає можливість новим вірусам розповсюджуватися у світі за лічені тижні замість місяців або років.

Таким чином, для даних груп людей існує конкретна потреба у вакцинації з метою захисту проти грипу в пандемічній ситуації або потенційно пандемічній ситуації. Придатними штамами для даної мети є, не обмежуючись ними: Н5МІ1, НОМ2, Н7М7 та Н2М2.

Необов'язково композиція може містити більш, ніж три валентності, наприклад, три непандемічні штами плюс пандемічний штам. Альтернативно композиція може містити три пандемічних штами.

Переважно композиція містить три пандемічних штами.

Іншими прикладами антигенів для імуногенної композиції даного винаходу є собою стрептококові антигени, такі, як антигени стрептококу групи А або стрептококу групи В, але найбільш переважно, зігеріососси5 рпештопіае. Найбільш переважно, застосовують як мінімум один білок та/або як мінімум один сахаридний антиген. Як мінімум один білковий антиген(и) бігеріососси5 рпештопіає найбільш переважно вибирають з групи, що складається з: пневмолізину, РерА або його варіантів трансмембранної делеції, РерсС або його варіантів трансмембранної делеції, РзаА або його варіантів трансмембранної делеції, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази, СбБрА або його варіантів трансмембранної делеції, РІМА, РО, РІВ, РІЧЕ, ЗрзаА, І МІВ, ГГ мс, ГУМА, 5р125, 5р101, 5р128, 5р130 та Зр133, або його імунологічно функціонального еквіваленту (наприклад, злиття доменів згаданих вище білків, наприклад, злиті білки РІШЮЕ, описані в М/001 /98334 та УМО 03/54007).

Деякі композиції описані в УМО 00/56359, МО 02/22167 та УМО 02/22168 (включені до даного опису шляхом посилання).

Антиген може містити антигени капсулярного сахариду (переважно, кон'юговані з білком-носієм), де сахариди (найбільш переважно полісахарид) одержують як мінімум з чотирьох серотипів пневмококу. В одному варіанті чотири серотипи включають 568, 14, 19Е та 23РЕ. У подальшому варіанті до композиції входять як мінімум 7 серотипів, наприклад, серотипи, які походять з серотипів 4, 68, 9М,

14, 18С, 19, та 23Б. У подальшому варіанті до композиції входять як мінімум 10 серотипів, наприклад, в одному варіанті композиція містить капсулярний сахарид, що походить з серотипів 1, 4, 5, 68, 7Е, 9М, 14, 18С, 19Е та 23Е (переважно, кон'юговані з білком-носієм). В іншому варіанті імуногенна композиція містить капсулярний сахарид, що походить з серотипів 1, 3, 4, 5, 6В, 7Е, 9М, 14, 18С, 192 та 23Е, У переважному варіанті даного винаходу включені як мінімум 13 сахаридних антигенів (переважно, кон'юговані з білком-носієм), хоча подальші антигени сахариду, наприклад, 23- валентні (такі, як серотипи 1, 2, 3, 4, 5, 68, 7Р, 8, 9М, 9М, 10А, 114А, 12Е, 14, В, 17, 18С, 19А, 19Е, 20, 22, 23Е та ЗЗЕ) також розглядаються у винаході.

Хоча згадані вище сахариди мають перевагу в довжині, природну форму полісахариду, необхідно розуміти, що полісахариди, зменшені в розмірі, також можна використовувати, оскільки вони зберігають імуногенність (див., наприклад, ЕР 497524 та 497525), якщо існує така необхідність при зв'язуванні з білком-носієм.

Для запобігання/зменшення інтенсивності пневмонії в популяції літніх людей (155 років) та отиту середнього вуха у немовлят (віком до 18 місяців) і дітей (звичайно від 18 місяців до 5 років) переважним варіантом даного винаходу буде комбінація багатовалентного сахариду Зігеріососси5 рпешитопіа, як описано в даному описі, з білком Зігеріососси5 рпештопіа, переважно вибраним з групи білків, наведених вище. Комбінацію пневмококових білків також можна придатним чином застосовувати, як описано нижче.

Пневмококові білки

Антигени Зігеріососси5 рпештопіа переважно вибирають з групи, що складається з: білку сімейства полігістидин тріад (РИХ), білка сімейства Літ (Гу), холін-зв'язуючого білка, білків, що містять мотив І РХТО (де Х являє собою будь-яку амінокислоту), білків, що містять сигнальну послідовність

Типу ЇЇ ЇХХС (де Х являє собою будь-яку амінокислоту) та білків, що містять мотив сигнальної послідовності Типу І. Переважні приклади в межах вказаних категорій (або мотиви) являють собою наступні білки (вкорочення або його імунологічно функціональний еквівалент):

Сімейство РІЇ (полігістидин тріад) включає білки РА, РІВ, РО і РНЕ. Сімейство характеризується послідовністю ліпідування, двома доменами, відокремленими ділянкою, збагаченою проліном, і декількома гістидиновими тріадами, можливо залученими до зв'язування металу або нуклеозиду або в ферментну активність, (3-5) ділянками, згорнутими в кільця, збереженим М-кінцем і гетерогенним С-кінцем. Воно присутнє у всіх перевірених штамах пневмококів. Гомологічні білки також знайдені у інших стрептококів і Меїззегіа. Переважні члени даного сімейства включають РА, РИЇВ та

РІО. Більш переважно, воно складається з РА або РП. Однак, зрозуміло, що терміни РЕ, В, бі Е стосуються білків, що містять послідовності, розкриті в цитатах нижче, а також їх варіанти, що зустрічаються в природі (і штучні варіанти) та демонструють гомологію послідовності, ідентичної білкам, на які посилаються, як мінімум на 90 95. Переважно вони є ідентичними як мінімум на 95 95, а найбільш переважною є ідентичність на 97 95.

Стосовно білків РПЇ, РІПА розкритий в УУО 98/18930, і те ж саме стосується 5р36. Як визначено вище, він являє собою білок з сімейства полігістидин тріад і містить сигнальний мотив типу ЇЇ ЇХХС.

РТЮ розкритий в МО 00/37105, і також його позначають як 5роз360О0. Як визначено вище, він також являє собою білок з сімейства полігістидин тріад і містить сигнальний мотив типу І ЇХХС. РИВ розкритий в УМО 00/37105, і також його позначають як 5розЗ6В. Інший член сімейства РПЇВ являє собою СЗ-деградуючий поліпептид, як розкрито в УМО 00/17370. Даний білок також належить до сімейства полігістидин тріад і містить сигнальний мотив типу ІП ЇХХС. Переважним імунологічно функціональним еквівалентом є білок 5р42, розкритий в УМО 98/18930. Зріз РИЇВ (приблизно 79 кДа) розкритий в МУО99/15675, який також вважають членом сімейства РПЇХ. РІМЧЕ розкритий в УУО00/30299, і його позначають як ВМН-3. зр5А являє собою холін-зв'язуючий білок (Сбр), розкритий в УМО 98/39450.

Сімейство І уї являє собою асоційовані з мембраною білки, пов'язані з лізисом клітини. М-Кінцевий домен включає холін-зв'язуючий домен(и), однак сімейство ГГ уї не демонструє всіх ознак, знайдених у сімействі холін-зв'язуючого білка (Сбр), як відзначено нижче, і, таким чином вважають, що для цілей даного винаходу сімейство І уї відрізняється від сімейства Сбрр. На відмінність від сімейства Сбр, С- кінцевий домен містить каталітичний домен сімейства білка Гуї. Сімейство складається з І УА, В та С.

Стосовно сімейства Гуї, ГУСТА розкритий в Копаа еї аїЇ., Еиг У Віоспет, 164:621-624 (1987). ГУуїВ розкритий в М/О 98/18930, і його також позначають як 5р46. ГуїС також розкритий в М/О 98/18930, і його також позначають як 5рео1. Переважним членом даного сімейства є І мс.

Інший переважний варіант являє собою вкорочення сімейства Гуї (особливо ГУКА), де "Гу", як визначено вище, і "вкорочення" означають білки, у яких не вистачає 50 95 або більше холін-зв'язуючої ділянки. Переважно, у таких білків повністю не вистачає холін-зв'язуючої ділянки. 5р125 являє собою приклад пневмококового поверхневого білка із якірним мотивом стінки клітини І РХТО (де Х являє собою будь-яку амінокислоту). Встановлено, що будь-який білок даного класу пневмококового поверхневого білка з даним мотивом є придатним в межах контексту даного винаходу, і, таким чином, вважається іншим білююм за даним винаходом. Власне 5р125 безпосередньо розкритий в МО

98/18930, він також відомий як 2трВ - цинк металопротеїназа. 5р101 розкритий в УМО 98/067 34 (де він позначений посиланням 2 у85993). Він характеризується сигнальною послідовністю типу І. зр1іЗ3 розкритий в МО 98/06734 (де він позначений посиланням Ж у85992). Він також характеризується сигнальною послідовністю типу І. 5р128 та 5р130 розкриті в МО 00/76540.

Білки, які використовують у даному винаході, переважно вибирають з групи РП, РА і РІЧЕ або комбінації 2 або всіх трьох вказаних білків (тобто РАНО, АжЕ, О-Е або АО-Е).

Інші білкові пневмококові антигени, які можуть бути включені, являють собою один або більше антигенів з групи, що складається з: пневмолізину (також його позначають як Ріу; переважно знешкоджений шляхом хімічної обробки або мутацією) (ММО 96/05859, УМО 90/06951, МО 99/038841,

РзаА та його варіантів трансмембранної делеції (Веггу 4 Райоп, Іптесі Іттип 1996 30 Рес; 64(12):5255- 62), Р5рА і його варіантів трансмембранної делеції (США 5804193, УМО 92/14488, УМО 99/53940), Рорс і його варіантів трансмембранної делеції (МО 97/09994, УМУО 99/53940), член сімейства холін- зв'язуючого білка (Срр) (наприклад, СррА і його варіантів трансмембранної делеції (М/О 97/41151; УМО 99/51266)), глицеральдегід-3-фосфат-дегідрогенази (Іпїесї. Іттип. 1996 64:3544), Н5Р70 (УМО 96/40928), РерА (Запспе;-Веаю єї ам. РЕМ5 МісгоріоЇ Гей 1998, 164:207-14), М подібних білків (Патентована заявка 5В, Мо ЕР 0837130) та адгезину 18627 (Патентована заявка 5В, Мо ЕР 0834568).

Даний винахід також включає імунологічно функціональні еквіваленти або вкорочення таких білків (як визначено вище). Стосовно сімейства холін-зв'язуючого білка, члени даного сімейства були спочатку ідентифіковані як пневмококові білки, які можна було очистити за допомогою холін-афінної хроматографії. Всі холін-зв'язуючі білки зв'язані не ковалентним зв'язком з фосфорилхоліновими фрагментами тейхоєвої кислоти стінки клітини та ліпотейхоєвою кислотою, асоційованою з мембраною. Із структурної точки зору, вони містять декілька спільних ділянок у всьому сімействі, хоча справжня природа білків (послідовність амінокислот, довжина, та інш.) може змінюватися. Загалом, холін-зв'язуючі білки складаються з М-кінцевої ділянки (М), збережених повторюваних ділянок (К1 та/або К2), ділянки, збагаченої проліном (Р), і збереженої холін-зв'язуючої ділянки (С), що складається з множинних повторень, що становить приблизно одну половину білка. В даній заявці термін "сімейство холін-зв'язуючого білка (Сбр)" позначає вибраний з групи, що складається з холін- зв'язуючих білків, як ідентифіковано в М/О 97/41151, РЬОСА, ЗрзА, РорС, СЬрА, СррО та Срро. СррА розкритий в УМО 97/41151. СьрО і СБро розкритий в УМО 00/29434. РерС розкритий в УМО 97/09994.

РЬсА розкритий в УМО 98/21337. Переважно, холін-зв'язуючі білки вибирають з групи, що складається з

СррА, РБСА, 5р5А та Ророс.

Якщо Сбр являє собою інший білок, який використовують, то він може бути вкороченням Сбр, причому "Сбр" визначено вище, а до "вкорочення" відносять білки, у яких не вистачає 50 95 або більше холін-зв'язуючої ділянки (С). Переважно, у таких білків не вистачає повністю холін-зв'язуючої ділянки. Більш переважно, таким вкороченим білкам не вистачає (Її) холін-зв'язуючої ділянки та (ії) також половини частини М-кінця білка, але залишається як мінімум одна повторювана ділянка (К1 або

К2). Ще більш переважно, вкорочення містить 2 повторювані ділянки (К1 та К2). Приклади таких переважних варіантів являють собою МЕїхХК2, КІіхК2, МКІ1хХК2Р та КІхкКагР, як проілюстровано в

УММО99/51266 або УМО99/51188, однак, у контексті даного винаходу розглядаються також інші холін- зв'язуючі білки, яким бракує подібної повторюваної ділянки. В композиції за даним винаходом також можуть бути використані Сбр Вкорочення-|уї химерні білки (або злиття). Переважно він складається з

МАЇХК2 (або КІхН2, або МАЇхХКагР, або КІхК2Р) Сьр та С-кінцеві частини (Сіепт, тобто такі, що не містять холін-зв'язуючих доменів) ГГ уї (наприклад, ГуїСсСтегт або 5ре1 Сіепт). Більш переважно Сврр вибирають з групи, що складається з СррА, РОСА, 5р5А та РерС. Ще більш переважно, він являє собою СррА. Переважно, ГІ уї являє собою | МС (його також позначають як 5ро1).

Також можуть бути використані РерА або РзаА вкорочення, в яких не вистачає холін-зв'язуючого домену (С), і які виражаються як білок, злитий з Гуї. Переважно І уї являє собою І ус.

У пневмококовій композиції можливо об'єднати різні пневмококові білки за даним винаходом.

Переважну комбінацію білків за даним винаходом вибирають з 2 або більше (З або 4) різних категорій, наприклад, білки, що містять мотив сигнальної послідовності типу ІІ І ХХС (де Х являє собою будь-яку амінокислоту, наприклад, сімейства полігістидин тріад (РП), холін-зв'язуючі білки (Сбр), білки, що містять мотив сигнальної послідовності типу І (наприклад, 5р101), білки, що містять мотив І РХТО (де

Х являє собою будь-яку амінокислоту, наприклад, 5р128, Зр130), токсини (наприклад, РІУ) та інш.

Переважні приклади в межах вказаних категорій (або мотиви) являють собою білки, згадані вище, або їх імунологічно функціональні еквіваленти. Токсин ї- РИЇ, токсин ї- Сбр, РІП-СЬр і токсин ї- РІ-СЬр являють собою переважні комбінації категорії.

Переважні придатні комбінації включають, не обмежуючись ними, РП --МКІхХК2, РОЗМАХ К2- 5ре1 Сієепт химерні або злиті білки, РІОЖРІУ, РІПОжЗзрІ128, РІИЮ»РзЗах, РИЮР»5рА, РІПАЖМА ХК,

РТІА-МАїхХА2-5реОї Стегт химерні або злиті білки, РІТАЖРІУ, РІАжЗзр128, РІМАжРзаА, РА РегрА,

МАТхА2н у, МАїхА2аАРзрА, МАїхХА2аРзаА, МАїхА2--5рі28, ВІХхВ2нН у, /ВІхА2аРзрА,

КІхК2жРзад. Переважно МКІхХК2 (або КІ1хК2) походить з СррА або РерсС. Більш переважно він походить з СррА.

Особливо переважна комбінація пневмококових білків включає Ріу (або вкорочення, або його імунологічно функціональний еквівалент) ж- РО (або вкорочення, або його імунологічно функціональний еквівалент) необов'язково з МКІхХК2 (або КІхХК2, або МКІхХК2Р, або КіхкКаР).

Переважно МКІхХК2 (або КІ1хХК2, або МАКЇїхХК2Р, або КІхХК2Р) походить з СЬБрА або Р5рс. Більш переважно він походить з Сб.

Антиген може являти собою кон'югат пневмококового сахариду, що складається з антигенів полісахариду, одержаних з як мінімум чотирьох серотипів, переважно як мінімум семи серотипів, більш переважно, як мінімум десяти серотипів, і як мінімум одного, але переважно 2, 3, або 4, білків зігеріососси5 рпештопіає, переважно вибраних з групи білків, описаних вище. Переважно один з білків являє собою РП (або його імунологічно функціональний еквівалент) та/або Ріу (або його імунологічно функціональний еквівалент).

Проблема, пов'язана з полісахаридним підходом до вакцинації, полягає в тому, що полісахариди рег 5е є слабкими імуногенами. З метою її подолання сахариди можуть бути кон'югованими з білками- носіями, які забезпечують допомогу Т-клітин. Таким чином, переважно, сахариди, які використовують у даному винаході, зв'язуються з подібним білком-носієм. Приклади таких носіїв, які звичайно застосовують на даний момент для приготування сахаридних імуногенів, включають анатоксини дифтерії та правця (ОТ, ОТ СКМ197 та ТТ, відповідно), гемоціанін Кеупоїе І ітреї (КІН), ОМРС з М. тепіпойіаї5 та очищене похідне білку туберкуліну (РРО).

Переважний носій для пневмококового сахариду, базуючись на імуногенних композиціях (або вакцинах), являє собою білок Ю Наепторпйи5 іпйцеплаеє (ЕР 59461 О-В), або його фрагменти.

Фрагменти, придатні для застосування, включають фрагменти, що включають епітопи Т-хелперу.

Зокрема, фрагмент білка Ю переважно буде містити М-кінцеву 1/3 білка. Білок-носій О придатний як носій в композиціях, де кон'юговані множинні антигени пневмококового сахариду. Один або більше пневмококовий сахарид в комбінації може бути придатним чином кон'югованим у білок 0.

Наступний переважний носій для пневмококового сахариду являє собою безпосередньо пневмококовий білок (як визначається вище в розділі "Пневмококові білки за даним винаходом ").

Сахарид може бути зв'язаний з білком-носієм будь-яким відомим способом (наприклад, І ікийе,

Патент США 4,372,945 та Аптог еї аІ., Патент США 4,474,757). Переважно здійснюють кон'югацію

СОАР (М/О 95/08348).

Переважно, співвідношення кон'югатів сахариду та білка (мас/мас.) становить від 0,3:1 до 1:1, більш переважно, від 0,6:1 до 0,8:1, і ще більш переважно, приблизно 0,7:1.

Особливо переважні композиції за даним винаходом містять один або більше кон'югований пневмококовий сахарид і один або більше пневмококовий білок за даним винаходом. Крім того, пневмококові сахариди та білки можна стабільно зберігати як суцільні компоненти, адсорбовані на алюмінію фосфаті в рідкій формі.

В іншому аспекті даного винаходу композиція вакцини може містити антиген людського цитомегаловірусу (НСММ). НСММУ - це ДНК-вірус людини, що належить до сімейства вірусів герпеса, і являє собою провідну причину вроджених вад у немовлят, а також спричиняє серйозні медичні проблеми у пацієнтів, що піддаються ризику розладів з боку імунної системи. Клінічне захворювання спричиняє різноманітні симптоми, включаючи пропасницю, гепатит, пневмоніт та інфекційний мононуклеоз.

В одному варіанті антиген НСММ являє собою злитий білок або його імуногенне похідне, що складається з частини глікопротеїну НСМУ, злитої з частиною глікопротеїну НБМ. Глікопротеїн НСММ звичайно являє собою ОВ, а глікопротеїн НОМ звичайно являє собою дО, зокрема, НОМ типу 2 90 (902). Злиття звичайно відбувається між амінокислотою М-кінцевої частини білюа 908 НСММ та амінокислотою С-кінцевої частини білка 900 НБУ. Як білку ОВ НСМУ, так і компонентам білка 9800 НЗМ злитого білка може не вистачати домену якорю мембрани.

Частина білка 968 НСММ може містити неподільну форму 08 НОМУ. Це може бути досягнуте шляхом зміни одної або більше амінокислот на ділянці поділу білка, наприклад, заміни Агд458 та

Агд459 на Сім і Тйиг, відповідно. Частина білка НЗМ може містити сигнальну послідовність 902 (амінокислоти 1-25) і необов'язково амінокислоти 26-52 др2 та/або послідовність з 902, яка являє собою РЕОЗАГІ ЕОРЕО або її функціональні еквіваленти, які можуть бути коротшими або довшими.

Подальші послідовності з 90 НОМ можна додавати до злитого білку, наприклад, в С-кінці білка ЗВ

НОМУ.

В одному варіанті злитий білок містить амінокислоти 1-52 білка 902 НБУ, з'єднаних із залишками 28-685 білка 98 НСМУ. Такий злитий білок позначається 98685" НСМУ. В іншому варіанті послідовність амінокислоти РЕОЗАГІ ЕОРЕО, яка походить з внутрішньої послідовності 902, можна включати в кінець С-терміналу білка 986857 з метою утворення білка, що позначається як 9868577

НОМУ. Вказані конкретні злиті білки описані детальніше в УМО 95/31555.

Інший імуноген, придатний для застосування як вакцина НОМУ, являє собою ррб5, матричний білок НСМУ, як описано в УМО 94/00150 (Сйу ої Норе).

В іншому варіанті даного винаходу імуногенні композиції містять антиген або антигенний препарат,

що походить від вірусу папіломи людини (НРУ), який, як вважають, відповідає за статеві бородавки (НРУб або НРМТІ1 та інші), та/або віруси НРУ, відповідальні за рак шийки матки (НРМ16, НРМ18 та інші).

В одному варіанті форми профілактичних або терапевтичних композицій проти статевої бородавки містять частинки 1 або капсомери та злиті білки, що складаються з одного або більше антигенів, вибраних з білків Е1, Е2, Е5 Еб, Е7, 11 та 12 вірусу папіломи людини.

В одному варіанті форми злитого білка являють собою: І 2Е7, як розкрито в УМО 96/26277, та білка

Б(1/3)-Е7, розкритого в В 9717953.5 (РСТ/ЕРО8/05285).

Переважною інфекцією шийки матки є НРУ або рак, профілактична або терапевтична композиція може містити антигени НРУ 16 або 18. Наприклад, мономери антигену 11 або 12, або антигени І 1 або

Ї2, представлені разом як подібні до вірусу частинки (МІ Р), або один білок 1/1, представлений в структурі МІР або капсомеру. Такі антигени, подібні до вірусу частинки, та капсомери відомі рег 5е.

Див., наприклад, УМО94/00152, МУО94/20137, УМО94/05792, і ММО93/02184.

Додаткові ранні білюим можуть бути включені окремо, або як злиті білки, такі, як Е7, Е2 або, переважно, Е5, наприклад; особливо переважними є варіанти, які включають МІ Р, що складається із злитих білків 1 Е7 (МО 96/11272).

В одному варіанті антигени НРУ 16 містять ранні білки ЕЄ або Е7, злиті з білком-носієм О з метою утворення білок О - злиття Еб або Е7 з НРУ 16, або його комбінації; або комбінації ЕЄ або Е7 з І 2 (ММО 96/26277).

Альтернативно, ранні білки Еб та Е7 НРМ 16 або 18 можуть бути представленими в єдиній молекулі, переважно в злитті білка О-Еб/Е7. Така композиція може необов'язково містити як білки Еб, так і білки Е7, або обидва з НРУ 18, переважно у формі білка О - Еб або білка 0 - Е7 злитого білка або білка ОО Еб/Е7 злитого білка.

Композиція даного винаходу може додатково містити антигени з інших типів НРУ, переважно з

НРМ 31 або 33.

Онкогенні типи НРУ включають НРМ 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 та 68. Таким чином, композиція за даним винаходом може містити антигени з одного або більше вказаних типів НРУ, крім

НРМ 16 та/або НРУ 18.

НРМ 11 МІ Р або капсомери, придатні за даним винаходом, можуть містити або складатися з 11 повної довжини або імуногенного фрагменту І 1. Якщо МІ Р або капсомер містить або складається з імуногенного фрагменту 111, то відповідні імуногенні фрагменти НРУ 1/1 містять вкорочення, делеції, заміщення або інсерційні мутанти 1/1. Такі імуногенні фрагменти можуть відповідно підсилювати імунну реакцію, вказана імунна реакція здатна розпізнавати білок 11, наприклад, подібні до вірусу частинки з типу НРУ, з якого був одержаний білок І 1.

Відповідні імуногенні фрагменти 1 містять вкорочені білки 1. В одному аспекті вкорочення видаляє ядерний сигнал локалізації. В іншому аспекті вкорочення являє собою вкорочення С-кінця. В іншому аспекті вкорочення С-кінця видалено менше, ніж 50 амінокислот, наприклад, менше, ніж 40 амінокислот. Якщо 1 походить з НРМ16, то в іншому аспекті вкорочення С-кінця видалено 34 амінокислоти з НРМ16 11. Якщо 11 походить з НРМ18, то в подальшому аспекті вкорочення С-кінця видалено 35 амінокислот з НРМУ18 І 1.

Відповідні урізані послідовності 1 для НРМ16 та 18 приводяться в МО 06/114312. Послідовність

НРМІ16 може також бути такою, яка розкрита в УМО9405792 або Ш56649167, наприклад, відповідно є вкороченою. Відповідні вкорочення здійснені в положенні, еквівалентному тому, що описувалося вище, що оцінюється за порівнянням послідовностей.

Альтернативна послідовність НРМ18 розкрита в М/О9629413, яка може бути відповідним чином вкороченою. Відповідні вкорочення здійснені в положенні, еквівалентному тому, що описувалося вище, що оцінюється за порівнянням послідовностей.

Інші послідовності НРМ16 і НРУ18 є добре відомими в даній галузі і можуть бути придатними для застосування в даному винаході.

Якщо білок 1 походить з іншого типу НРМ, то можуть бути використані С-кінцеві вкорочення, відповідні тим, що зроблені для НРМУ16 та НРУ18, базуючись на ДНК або вирівнюванні послідовностей білка. Відповідні вкорочені білків Ї1 НРМУЗ1 та 45 приводяться в МО 06/114312.

Відповідні вкорочення, наприклад, НРМ 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 та 68, також можуть бути зроблені, в одному аспекті шляхом видалення еквівалентних С-кінцевих частин білка І 1 з тих, що описані вище, що оцінюється за порівнянням послідовностей.

Білок І 1 або імуногенний фрагмент за даним винаходом може необов'язково мати форму злитого білка, наприклад, білка злиття І 1 з І 2 або раннім білком.

Білок 1 НРУ, відповідно, має форму капсомеру або подібної до вірусу частинки (МІ Р). В одному аспекті подібні до вірусу частинки, НРМ можна використовувати в даному винаході. Подібні до вірусу частинки, НРМ та способи продукування МІ Р добре відомі в даній галузі. МІ Р звичайно конструюють з

Ї1 ї необов'язково із структурних білків 2 даного вірусу, див. приклад М/О9420137, 055985610,

МО9611272, 0О5659950881, О5бЗ36177881, ЕР 595935. В даному винаході можна використовувати будь-який придатний МІ Р НРУ, який пропонує перехресний захист такий, як! 1 або І 1-41 2 МІ Р.

Відповідно, подібна до вірусу частинка являє собою тільки І 1-МІ Р.

Композиція за даним винаходом може містити комбінацію НРМ1Є6 11 МІ Р та НРМ18 11 МІ Р, або комбінацію НРМ 1 МІ Р з НРМІ16, 18, 31 та 45, або більші комбінації, і складається з НРМУ16 та 18 або

НРМІ6, 18, 31 та 45 1 1 МІ Р, або великі комбінації, причому І1 необов'язково вкорочується, як описано в даному описі.

В конкретному варіанті даного винаходу один або більше додаткових антигенів типів НРУ, які спричиняють рак, застосовують з антигенами НРМ16 та/або 18, причому антигени вибирають з наступних типів НРУ: НРУ 31, 45, 33, 58 та 52. Як описано в даному описі, антиген може в кожному випадку являти собою 111, наприклад, у формі МІР або капсомерів 11. Таким чином, антигени НРМ для застосування в даних композиціях, способах і застосуванні, описані в даному описі, можуть містити або складатися з 1 МІ Р або капсомерів з НРМ16, 18, 31, 45, 33, 58 та 52. 11 МІР можуть являти собою тільки І 1-МІ Р або в комбінації з іншим антигеном, наприклад, 312 в І 1-4 2 МІ Р. Білок 1 може відповідно бути вкороченим, як описано в даному описі.

Утворення МІР може бути оцінене за допомогою стандартних методів таких, як електронна мікроскопія та розсіювання світла динамічним лазером.

Подібна до вірусу частинка може складатися з білку І 1 повної довжини. В одному аспекті білок 11, який використовують з метою утворення МІ Р, являє собою вкорочений білок 11, як описано вище.

Подібні до вірусу частинки можна одержати в будь-якому придатному субстраті клітин, такі, як дріжджові клітини або клітини комахи, наприклад, в системі експресії паличкового вірусу, тоді як методи одержання МІР добре відомі в даній галузі, наприклад, з посилань М/09913056, США 641694581, 626176581 та 56245568 даного опису, повний зміст, яких включений шляхом посилання.

Подібну до вірусу частинку можна одержати за допомогою методів розкомлектації- перекомплектації, які можуть дати більш стійкі та/або гомогенні, подібні до вірусу частинки вірусу папіломи. Наприклад, МоСагпйпу еї аі), 1998 "Оцапійайме Оізаззетріу апа Кеаззетбріу ої Нитап

Рарйотамігих Туре 11 Мігив Ке Рапйісіев іп Мито" У. Мігоїоду 72(1):33-41, описує розкомлектацію та перекомплектацію рекомбінантних, подібних до вірусу частинок 11 НРМ11, очищених з клітин комахи, з метою одержання гомогенного препарату МР. В УУМО9913056 і 0О56245568 також описані способи розкомлектації-перекомплектації для виготовлення подібних до вірусу частинок НРУ.

В одному аспекті НРУ МІ Р одержані, як описано в УУМО9913056 або 56245568.

Композиції за даним винаходом можуть містити антигени або антигенні препарати, одержані з паразитів, що спричиняють малярію, наприклад Ріабзітодішт Таісірагит або Ріазтодішт мімах.

Наприклад, можливі антигени, що походять з Ріазітодішт Таісірагит, містять навкоколопорозоїдний білок (білок С5), ЕТ515 М5РІ, М5РЗ, І ЗА, І ЗАЗ, АМА! і ТЕАР. КТ5 являє собою гібридний білок, що складається в істотній мірі із всієї С-кінцевої частини навкоколопорозоїдного білка (С5) Р.

Таісірагит, зв'язаного через чотири амінокислоти частини рге52 поверхневого антигену гепатиту В з поверхневим (5) антигеном вірусу гепатиту В. Його повна структура розкрита в міжнародній патентній заявці Мо РСТ/ЕРО2/02591, опублікованій за номером УМО 93/10152 з пріоритетної патентної заявки

Великобританії Ме9124390.7. При експресії в дріжджах ЕТ5 продукується як частинка ліпопротеїну, а при спільній експресії з антигеном 5 з НВМУ він продукує змішану частинку, відому як КТ5,5. Антигени

ТКАР описані в міжнародній патентній заявці РСТ/ЗВ89/00895, опублікованій під номером УМО 90/01496. Переважний варіант даного винаходу являє собою вакцину проти малярії, де антигенний препарат містить комбінацію КТ5.5 та антигенів ТКАР. Іншими антигенами симпластів, що являють собою вірогідні кандидати на компоненти багатоступінчастої вакцини проти малярії, є Р. Тасірагит

М5РІ, АМАТ, М5РЗ, ЕВА, СІ ОКР, КАРІ, КАР2, секвестрин, РІЕМРІ, РІЗ32, І ЗА1, І ЗАЗ, 5ТАВР,

ЗАЇ ЗА, РІЕХРІ, Ріїз25, Рі28, РЕ527/25, РІ16, Рі548/45, РІ5230 та їх аналоги в Ріазтодішт 5рр. Один варіант даного винаходу являє собою композицію, що містить білок КТ5,5 або С5 або його фрагмент, наприклад, частину С5 КТ5,5 в комбінації з одним або більше додаткових малярійних антигенів, які можна вибрати, наприклад з групи, що складається з МОР1, М5РЗ, АМАТ, І ЗАТ або І 5АЗ. Можливі антигени з Р мімах включають навкоколопорозоїдний білок (білок СБ) і білок зв'язування антигену Оину та його фрагменти, наприклад, РУКІЇ (див., наприклад М/О02/12292).

Інші можливі антигени, які можна застосовувати в імуногенних композиціях за даним винаходом, включають:

Стрептококові антигени, такі, як антигени стрептококу групи А або стрептококу групи В, антигени, відповідно одержані з ВІЛ-1 (наприклад, антиген Е4 або його фрагменти, або дад або його фрагменти, наприклад раа4, їаї, пеї, др120 або др160 або фрагменти будь-якого з них), вірусу герпеса людини такі, як 90 або його похідні, або безпосередній ранній білок, наприклад, ІСР27 з НЗМІ або Н5еМ2, цитомегаловірусу (особливо вірусу людини евзр) (наприклад, ОВ або його похідні), ротавірусу (включаючи живі атенуйовані віруси), вірусу Епштейна-Барра (наприклад, др350 або його похідні), вірусу вітряної віспи (наприклад, орі, ІЇ та ІЄ63), або вірусу гепатиту такого, як вірус гепатиту В (наприклад, поверхневий антиген гепатиту В або його похідне), вірусу гепатиту А, вірусу гепатиту С і вірусу гепатиту Е, або з інших вірусних патогенів, таких як параміксовіруси: респіраторний синцитіальний вірус (наприклад, білки Е, М та ОС або їх похідні), вірус парагрипу, вірус кору, вірус свинки, віруси папіломи людини (наприклад, НРУб, 11, 16, 18), флавівіруси (наприклад, вірус жовтої гарячки, вірус денге, вірус кліщового енцефаліту, вірус японського енцефаліту) або вірус грипу (суцільний живий або інактивований вірус, розщеплений вірус грипу, вирощений в яйцях або клітинах

МОСК, або суцільні віросоми грипу (як описано К. СіІшсК, Массіпе, 1992, 10, 915-920) або їх очищені або рекомбінантні білки, наприклад НА, МР, МА, або білки М, або їх комбінації), або одержані з бактеріальних патогенів таких, як Меї55егіа 5рр, включаючи М. допогпеа та М. тепіпойіаі5 (наприклад, капсулярні сахариди та їх кон'югати, трансферин-зв'язуючі білки, лактоферин-зв'язуючі білки, РІЇС, адгезини); 5. руодепез (наприклад, білки М або їх фрагменти, протеаза С5А, ліпотейхоєві кислоти), 5. адаіасцає, 5. тшапе5; Н. дисгеуї; Могахейа 5рр, включаючи М. саїагнаїй5, також відомого як

Вгаппатегпйа саїгагтнаїї5 (наприклад, адгезини та інвазини з високою та низькою молекулярною масою;

ВогаеїеМйа 5рр, включаючи В. репивз5і5 (наприклад, пертактин, токсин коклюшу або його похідні, волокнистий гемаглютинін, аденілатциклаза, фімбрії), В. рагарегіиб55іє та В. Бгопспізеріїса;

Мусобасіетцут 5рр., включаючи М. (шбегсціов5і5 (наприклад, ЕБАТб, антиген 85А, -В або -С), М. Бомів,

М. Іергає, М. амішт, М. рагагшбБегсиціо5і5, М. 5зтедтаїйі5; І едіопейа 5рр, включаючи ГГ. рпешторпійа;

Е5сПегіспіа 5рр, включаючи ентеротоксичні Е. соїї (наприклад, фактори колонізації, токсин, нестійкий до тепла, або його похідні, токсин, стійкий до тепла, або його похідні), ентерогеморагічні Е. соїї, ентеропатогенні Е. соїї (наприклад, подібний до токсину токсин Шига або його похідні); Мібгіо 5рр, включаючи У. споїегає (наприклад, токсин холери або його похідні); ЗпідеПа 5рр, включаючи 5. 5оппеї, 5. дузепієгіає, 5. Пехпегтії; Хегвіпіа 5рр, включаючи У. епіегосоїйіса (наприклад, білок Мор), У. ребвіїв, У. рзепдоїшрегсиціо5і5; Сатру!іобасіеєег 5рр, включаючи С. |е)ипі (наприклад, токсини, адгезини та інвазини) і С. соїї; ЗаІтопейа 5рр., включаючи 5. їурпї, 5. рагагурпі, 5. споїІегаезиці5, 5. епіегйаїі5; І ібїегіа 5рр., включаючи ГІ. топосуїодепев; Неїїсобрасіег зрр, включаючи Н. руїогі (наприклад, уреаза, каталаза, токсин вакуолізації); Рхоендотопах 5рр, включаючи Р. аєегидіпоза; арпуіососсив5 5рр., включаючи 5. ацгеи5, 5. ерідегтідіє; Епіегососсиб5 5рр., включаючи Е. Таесаїї5, Е. Таесішт; Сіозігідіигп 5рр., включаючи С. їеїапі (наприклад, токсин правця та його похідне), С. Броїшіпит (наприклад, токсин ботулізму та його похідне), С. аїнісйіе (наприклад, токсини А або В клостридій та їх похідні); Васійи5 5рр., включаючи В. апійгасіє (наприклад, токсин ботулізму та його похідні); Согупебрасіегішт 5рр., включаючи С. аірпіпегіае (наприклад, токсин дифтерії та його похідні); Вогтеїйа 5рр., включаючи В. ригддогегі (наприклад, О5рА, ОзрС, ОБрА, ОбБрВ), В. дагіпії (наприклад, О5рА, О5рС, ЮБрА, ОбБрВ), В. аїеїйї (наприклад, О5рА, ОзрС, ОБрА, ОбБрВІ), В. апаегзопії (наприклад, О5рА, ОзрС, ОБрА, ОБрВ), В.

Пегтвії; Епгіїспіа 5рр., включаючи Е. едиі та агент гранулоцитного ерліхіозу людини; КісКейвіа 5рр, включаючи К. гіскейвії, СпІатуадіа 5рр., включаючи С. ігаспотаїйй5 (наприклад, МОМР, гепарин- зв'язуючі білки), С. рпештопіає (наприклад, МОМР, гєпарин-зв'язуючі білки), С. реШасі; І еріоз5ріга 5рр., включаючи /Г. іпіеІтодапе; Тгеропета 5рр., включаючи Т. раїїйдит (наприклад, рідкісні білки зовнішньої мембрани), Т. депіїсоїа, Т. пуодузепіегпає; або одержані з паразитів, таких, як Ріахтодішт 5рр., включаючи Р. ТаІсірагит; Тохоріазєта 5рр., включаючи Т. допаїйї (наприклад, 5АС2, ЗАСЗ, Т934);

Епіатоера 5рр., включаючи Е. Пізіоїуйса; Вабрезіа 5рр., включаючи В. тісгоїї; Тгтурапозота 5рр., включаючи Т. сги7і; Сіагаіа 5рр., включаючи с. Іатрбіїа; І ебзптапіа 5рр., включаючи /. таог,

Рпештосузії5 5рр., включаючи Р. сагіпії; Тгіспотопазх 5рр., включаючи Т. мадіпаїї5; Зспізовіота 5рр., включаючи 5. тапзопі, або одержані з дріжджів, таких, як Сапаїда 5рр., включаючи С. аїБісапв;

Стгуріососсиз5 5рр., включаючи С. пеоїогтапв.

Інші переважні конкретні антигени для М. їшбегсцо5і5 являють собою, наприклад, ТО Ка12, ТЬ НО,

ТЬ Наз5, Тр38-1. Ега 14, ОРМ, МТІ, М5Г., тТТс2 та пТОС1 (УМО 99/51748), МІБ72Е та М72. Білки для М. їшрегсцо5і5 також включають злиті білки та їх варіанти, де як мінімум два, переважно три поліпептиди

М. їшюрегсицо5і5 злиті в більший білок. Переважні злиття включають Ка12-ТЬНО-НКаз5, Ега14-ОРМ-МТІ,

ОРМ-МТІ-М5І, Ега14-ОРМ-МТІ-М5І-тТОб2, Ега14-ОРУ-МТІ-М5І, ОРМ-МТОЄ-М5І-тТСС2, ТЬНнО-

ОРМУ-МТІ (МО 99/51748). Конкретна послідовність Ка12-Трп9-КаЗ35, яку можна згадати, визначена як

ЗЕО ІЮ МО: 6 ММО2006/117240 разом з варіантами, в яких 5ег 704 вказаної послідовності мутує, тільки не в серин, наприклад, в Аа, а його похідні включаються в кінець Ні М-кінця відповідної довжини (наприклад, ЗЕО ІЮО МО: 2 або 4 М/О2006/117240)".

Приклади антигенів для Спіатуаїа 5рр., наприклад С. ігаспотаїйй5, вибрані з СТ858, СТО89, СТ875,

МОМР, СТ622, РітрО, РітрО та їх фрагментів, ЗУМІВ та будь-яких їх імуногенних фрагментів (наприклад, РтрОра та Ртрора) та їх комбінації. Переважні комбінації антигенів містять СТ858,

СТО89 та СТ875. Конкретні послідовності та комбінації, які можна використовувати, описані в

УМО2006/104890. Переважні бактеріальні композиції містять антигени, одержані з Наеторпійн5 5рр., включаючи Н. іпїсеп7ає тип В (наприклад, РЕР та його кон'югати), нетиповий Н. іпїшеп7ає, наприклад

ОМРО2б, адгезини з високою молекулярною масою, Р5, Рб, білок ЮО та ліпопротеїн 0, фімбрин і пептиди, одержані з фімбрину, (США 5,843,464) або варіанти множинних копій, або їх злиті білки.

Похідні поверхневого антигену гепатиту В добре відомі в даній галузі і включають набір антигенів

Ргеб51, Ргеб52 5, описаний в європейських патентних заявках ЕР-А-414 374; 578, та ЕР 198-474. В одному переважному аспекті рецептури вакцини антигени винаходу містять антиген ВІЛ-1, др120,

особливо при експресії в клітинах СНО. В іншому варіанті композиції антигенів за винаходом містять 9021, як визначено вище.

Композиції можуть також містити протипухлиний антиген і бути придатними для імунотерапевтичного лікування видів раку. Наприклад, антиген може являти собою антигени відторгнення пухлини такі, як ті, що використовують при раку передміхурової залози, молочної залози, прямої кишки, легень, підшлункової залози, нирок або меланоми. Приклади антигенів включають

МАСЕ 1, З та МАСЕ 4 або інші антигени МАСЕ такі, як розкриті в М/099/40188, РЕАМЕ, ВАСЕ, І аде (також відомі як ММ Ео5 1) БАСЕ та НАСЕ (УМО 99/53061) або САСЕ (КобБбіп5 і КажаКаті, 1996,

Ситепі Оріпіоп5 іп Іттипоіоаду 8, рр5 628-636; Мап деп Еупаеє еї аї., Іпіегпайопа! Чошттаї ої Сіїпіса! 8

І арогаїогу Кезеагсп (представлений в 1997 р.); Соїтеаїе еї аї. (1997), дУоигпа! ої Ше Майопаї! Сапсег

Іп5ійше 89, р293. Дійсно, вказані антигени експресуються в широкому спектрі типів пухлин, наприклад, меланомі, раку легень, саркомі та раку сечового міхура.

Антигени МАСЕ для застосування в даному винаході можуть бути виражені як злитий білок з посилювачем експресії або з імунологічним злитим партнером. Зокрема, біллк МАСЕ може бути злитим з білком О з Неаторпійси5 іпіцеп7ає В або його ліпідованим похідним. Зокрема, злитий партнер може містити першу 1/3 білка 0. Такі конструкти розкриті в УМО99/40188.

Інші пухлино-специфічні антигени включають, не обмежуючись КБА (СА733) пухлино- специфічними гангліозидами, наприклад, від 5М2 та ОМ3З або їх кон'югатів з білками-носіями; або вказаний антиген може являти собою пептидний гормон, наприклад, гонадотропін-рилізінг гормон повної довжини (СЗпКН, УМО 95/20600), довгий пептид 10 коротких амінокислот, придатний для лікування багатьох видів раку або при імунній кастрації.

У переважному варіанті використовують антигени передміхурової залози такі, як простата- специфічний антиген (РБА), РБЕСА (РМАБ 95(4) 1735-1740 1998), РОМА або антиген, відомий як простаза.

Простаза являє собою простата-специфічну протеазу (подібну до трипсину) довжиною 254 амінокислоти із збереженою каталітичною тріадою Н-0-5 серинпротеази та препептидною послідовністю аміно-кінця, що вказує на потенційну секреторну функцію (Р. Меїбоп, и бап, С.

Еегдизоп, Р. Мов, В. Сеїїпав, І. Носа 5 К. Мапа, "МоіІєсшціаг сіопіпа апа сНагасієгізайоп ої рговіазе, ап апагодеп-гедиіаїєай зегіпе ргоївазе улІй рговіаїе гезігісієд ехргезвіоп, Іп Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА (1999) 96, 3114-3119). Описана передбачувана ділянка глікозиляту. Передбачена структура є у великій мірі подібною до інших відомих серинпротеаз, демонструючи, що зрілий поліпептид складається з одного домену. Зрілий білок має довжину 224 амінокислоти, причому один епітоп А2 обробляється природно.

Послідовність нуклеотидів простази та встановлена послідовність поліпептиду і гомологів розкрита у Еегдихзоп еї аї. (Ргос. Маї!. Асай. Зсі. ОБА 1999, 96, 3114-3119) та в міжнародних патентних заявках

УМО 98/12302 (а також відповідному патенті США 5,955,306), МУМО 98/20117 (а також відповідних патентах США 5,840,871 та 5,786,148) (простата-специфічний калікреїн) та М/О 00/04149 (Р7ОЗР).

У даному винаході запропоновано композиції, які містять продукти злиття білка простази, що базуються на білку простази і його фрагментах та гомологах ("похідних"). Такі похідні придатні для застосування в рецептурах терапевтичних вакцин, які корисні для лікування пухлин передміхурової залози. Звичайно фрагмент буде містити як мінімум 20, переважно 50, більш переважно, 100 суміжних амінокислот, як розкрито в патенті та патентних заявках, на які здійснюється посилання вище.

Інший переважний антиген передміхурової залози відомий як Р5О15, 5БЕО ІЮ МО: 113 М/О98/37814.

Імуногенні фрагменти та їх частини містять як мінімум 20, переважно 50, більш переважно 100 суміжних амінокислот, як розкрито в патентній заявці, на яку посилаються вище. Наприклад, див.

РБІ108 (УМО 98/50567). Інші простата-специфічні антигени відомі з М/098/37418 та УМО/004149. ІНШИЙ являє собою ЗТЕАР РМАЗ 96 14523 14528 7-12 1999.

Інші антигени, асоційовані з пухлинами, придатні в контексті даного винаходу, включають: Ріши-1 у

ВіоІ. Снет 274 (22) 15633-15645, 1999, НА5Н-1, НазН-2, Стірю (Заіотоп єї а! Віоеззаувз 199, 21 61-70, патент США 5654140), криптін - патент США 5 981 215. Крім того, антигени, особливо доречні для терапії раку, також містять тирозиназу та сурвівін.

Муцин одержують з пептидів таких, як Мис, див., наприклад, патенти США 5744,144, 5,827 ,666 УМО 8805054, 4,963,484. Конкретно розглянутий Мис 1, одержаний з пептидів, які містять як мінімум одну повторену одиницю пептиду Мис 1, переважно як мінімум два таких повторення, що розпізнаються антитілом 5М3 (США 6 054 438). Інший муцин, одержаний з пептидів, містить пептид з Мис 5.

Антиген за даним винаходом може являти собою антигени раку молочної залози, такі як пег 2 Мен, мамаглобін (Патент США 5668267) або антигени, що розкриті у УМО /00 52165, УУО99/33869,

УО99/19479, УМО 98/45328. Антигени Ппег 2 Меи розкриті в патенті США 5,801,005. Переважно Пег 2

Меи містять повний позаклітинний домен (складається приблизно з 1-645 амінокислот) або його фрагменти і як мінімум імуногенну частину або повний внутрішньоклітинний домен приблизно 580 амінокислот С-кінця. Зокрема, внутрішньоклітинна частина повинна містити домен фосфорилування або його фрагменти. Такі конструкти розкриті у МУМО 00/44899. Особливо переважний конструкт відомий як ЕСО, РО другий відомий як ЕСО РО, див. М/О/00/44899. Для цілей даного опису, Ппег 2 Мей може походити з щура, миші або людини.

Композиції можуть містити антигени, асоційовані з механізмами підтримки пухлини (наприклад, ангіогенез, інвазія пухлини), наприклад, їе 2, МЕСЕ.

Передбачається, що в композиціях за даним винаходом можна застосовувати антигени Воїтеїїа 5р.

Наприклад, антигени можуть містити нуклеїнову кислоту, антиген, одержаний з патогена, або антигенні препарати, білок, продукований рекомбінантним способом, або пептиди та химерні злиті білки. Зокрема, антиген являє собою О5рА. О5рА може являти собою повний зрілий білок в ефективній ліпідованій форми клітини-хазяїна (Е. соїї), має назву (Гіро-О5рА) або неліпідоване похідне. Такі неліпідовані похідні складаються з неліпідованого М51-О5рА злитого білка, який містить перші 81 амінокислоти М-кінця неструктурованого білка (М51) вірусу грипу, та повного білка О5рА, а інший, МОР-О5рА, являє собою неліпідовану форму О5рА, який несе З додаткові амінокислоти М- кінця. Композиції даного винаходу можна застосовувати для профілактики або терапії алергії. Такі вакцини будуть містити антигени, специфічні (наприклад, ЮОег рі) та неспецифічні алергени (наприклад, пептиди, одержані з (ДЕ людини, включаючи, але не обмежуючись, декапептид Стенворта (ЕР 0 477 231 ВІ1)).

Композиції за даним винаходом можна також застосовувати для профілактики або терапії інших, крім алергії, хронічних розладів, раку або інфекційних захворювань. Такі хронічні розлади являють собою такі захворювання, як атеросклероз і хвороба Альцгеймера.

Композиції за даним винаходом є особливо придатними для імунотерапевтичного лікування захворювань таких як хронічні стани та види раку, а також для терапії хронічних інфекцій. Відповідно, композиції за даним винаходом є особливо придатними для імунотерапії інфекційних захворювань, наприклад, туберкульозу (ТБ), СНІДу та інфекцій вірусом гепатиту В (НерВ).

Також, в контексті СНІДу запропоновано спосіб лікування людини, вразливої або такої, що страждає на СНІД. Спосіб полягає у введенні пацієнту вакцини за даним винаходом, таким чином зменшуючи передбачуване падіння кількості СО4-- Т-клітин, спричиненне наступним інфекуванням ВІЛ або сповільнюючи, або зупиняючи падіння СО4-- Т-клітин у людини, яка уже інфікована ВІЛ.

Інші антигени містять скоріше бактеріальні (переважно капсулярні) сахариди, ніж вказані пневмококові (або крім них) антигени, описані вище. Полісахаридні антигени звичайно зберігають у вигляді рідкої маси, адсорбованої на алюмінію фосфаті, і, таким чином, для одержання композицій вакцин за даним винаходом вказану у вигляді рідкої маси змішують екстемпорально з ад'ювантом за даним винаходом. Переважно інші бактеріальні сахариди вибирають з групи, що складається з: капсулярного сахариду серогрупи А М. тепіпойіаі5 (МепА), капсулярного сахариду серогрупи С М. тепіпойаї5 (Мепс), капсулярного сахариду серогрупи МУ М. тепіпойаїйв5 (Меп), капсулярного сахариду серогрупи М/-135 М. тепіпойідіз (МепуУМ), капсулярного сахариду стрептококової групи І групи В, капсулярного сахариду стрептококової групи ІІ групи В, капсулярного сахариду стрептококової групи ПІ групи В, капсулярного сахариду стрептококової групи ІМ групи В, капсулярного сахариду стрептококової групи М групи В, капсулярного сахариду 5іарпуіососси5 аийгеи5 типу 5, капсулярного сахариду еіарпуїососси5 ацгеи5 типу 8, Мі сахариду з ЗаїЇтопейПа їурпї, ліпополісахариду М. тепіпойаі5, ліпополісахариду М. сайагтнаїїй та ліпополісахариду Н. іпїсеп7ає. Під ліпополісахаридом мають на увазі як природний ліпополісахарид (або ліпо-олігосахарид), так і ліпополісахарид, де частина ліпіду А знешкоджена за допомогою будь-якого з низки відомих способів (див., наприклад,

УМО 97/18837 або УМО 98/33923), або будь-яку молекулу, що містить О-полісахарид, одержаний з вказаного ліпополісахариду. Під ліпополісахаридом М. тепіпойідіє мають на увазі один або більше з 12 відомих імунотипів (1,12, 13,14, 15,16,17, 18,19, 110, 111 або 112). Особливо переважні комбінації являють собою композиції, що містять: 1) кон'югований Ніб, кон'югований МепА та кон'югований Мепс; 2) кон'югований Нір, кон'юЮгований Мепу та кон'югований Мепс; 3) кон'югований

НіБ і кон'югований МепС; та 4) кон'югований МепА, кон'югований МепС, кон'юЮютгований Мепу та кон'югований Мепуу-135. Кількість Р5 в кожному із згаданих вище кон'югатів може становити 5 або 10 мкг кожного на 0,5 мл дози для людини. Переважно Ні, МепА, МепсС, МепуУу-135 та Мепу являють собою кон'югати ТТ.

Проблема, що асоціюється з полісахаридним підходом до вакцинації, полягає в тому, що полісахариди рег 5е являють собою погані імуногени. З метою її подолання сахариди даного винаходу можуть бути кон'югованими з білкамм-носіями, які забезпечують допомогу Т-клітин. Таким чином, сахариди, які використовують у даному винаході, переважно, зв'язуються з подібним білком-носієм.

Приклади таких носіїв, які звичайно застосовують на даний момент для приготування сахаридних імуногенів, включають анатоксини дифтерії та правця (ОТ, ОТ СКМІ197 та ТТ, відповідно), гемоціанін фісурелових (КІН), білок О Наеторпйиз5 іпїчеплає (ЕР 59461 О-В), ОМРС М. тепіпойіаі та очищене похідне білку туберкуліну (РРО).

Сахарид може бути зв'язаний з білком-носієм за допомогою відомого способу (наприклад, ГГ ікпїїеє,

Патент США 4,372,945 та Агтог еї аїІ., Патент США 4,474,757). Переважно, здійснюють кон'югацію

СОАР (М/О 95/08348).

Переважно співвідношення білокхахарид (мас.) для кон'югатів становить від 0,3:1 до 1:1, більш переважно, від 0,6:1 до 0,8:1, і ще більш переважно, приблизно 0,7:1.

Комбінації антигенів, які забезпечують захист проти пневмококу та іншого патогена, входять до даного винаходу. Багато педіатричних вакцин на цей час постачають як комбіновані вакцини з метою зменшення кількості ін'єкцій, що повинна отримати дитина. Таким чином, для педіатричних вакцин можна розробити рецептуру з іншими антигенами інших патогенів та пневмококовими вакцинами за даним винаходом. Наприклад, до технології приготування вакцин за даним винаходом можна включити (або вводити окремо, але одночасно) добре відому ""трьеовалентну" комбіновану вакцину, що містить анатоксин дифтерії (ОТ), анатоксин правця (ТТ) та компоненти коклюшу |звичайно знешкоджений анатоксин коклюшу (РТ) та/(або волоконний гемаглютинін (ЕНА), необов'язково, з пертактином (РЕМ) та/або аглютиніном 1-2), наприклад, присутня на ринку вакцина ІМЕАМКІХ-ЮОТРа "м (ЗтійКіїпеВееспат Віоіодіса!5), яка містить антигени ОТ, ТТ, РТ, ЕНА та РЕМ, або суцільноклітинний компонент коклюшу, наприклад, такий, як присутня на ринку Тгйапгіх"м, ЗтпййКіІіпеВееспат Віоодіса!в5.

Комбінована вакцина може також містити інший антиген, наприклад, поверхневий антиген гепатиту В (НВ5АО), антигени вірусу поліомієліту (наприклад, інактивований трьохвалентний вірус поліомієліту -

ІРМ), білки зовнішньої оболонки МогахеїЇа саїйатнпаїйх, атипові білки Наеторпійн5 іпЯсеплає, білки зовнішньої оболонки М. тепіподйаїв5 В.

Прикладами переважних антигенів білка МогахеїІа сагагтнаїїйв, які можна включити до комбінованої вакцини (особливо для запобігання отиту середнього вуха), є: ОМР106 (МО 97/41731 (Апіех) 8 МО 96/34960 (РМСО)); ОМР21; ГЬрА та/або І Бр (МО 98/55606 (РМО)|; ТЬрА та/або ТЬрвВ (МО 97/13785 та

МО 97/32980 (РМО)|; СорВ (Неїтіпеп МЕ, еї аї. (1993) Іптесі. Іттип. 61:2003-20101; О5рА1 та/або

О5рАг (МО 93/03761 (Університет Техасу)Ї; ОтрСО; Назк (РСТ/ЕР99/03824); РІО (РСТ/ЕР99/03823);

ОМРВ5 (РСТ/ЕРОО/О1468); ІроОб (Великобританія 9917977.2); Іро10 (Великобританія 9918208.1); їро11 (Великобританія 9918302.2); Іро18 (Великобританія 9918038.2); Рб (РСТ/ЕРО9/03038); 015 (РСТ/ЕР99/03822); ОтріА! (РСТ/ЕРО9/06781); НІУЗ (РСТ/ЕРО9/03257); та ОтрЕ. Приклади атипових антигенів Наеторпййн5 іпйиеплає, які можна включити до комбінованої вакцини (особливо для запобігання отиту середнього вуха), включають: білок фімбрину КСША 5766608-Опіо біаіеє Везвагсі

Еошципааїййоп)| та продукт його злиття, що містять пептиди Інаприклад, пептидні злиття І В1 (); США 5843464 (051) або УМО 99/64067|. ОМР2б6 (МО 97/01638 (Согіес5))Ї; Рб (ЕР 281673 (Державний

Університет Нью-Йорка); ТЬрА та/або ТЬрВ; Ніа; Неї; Ніп47; НІ; Нтм/1; Нтм/2; Нтм/3; Нтм/4; Нар; 015 (МО 94/12641); білок О (ЕР 594610); Р2; та Р5 (МО 94/26304).

Інші розглянуті комбінації являють собою пневмококовий сахарид та білок за даним винаходом в комбінації з вірусними антигенами, наприклад, проти грипу (атенуйовані, розщеплені або субодиничні

Інаприклад, нейрамінідаза поверхневих глікопротеїнів (МА) та гемаглютинін (НА), див., наприклад,

СНа!Іоирка І. єї аї, Єиг. Удошгпаї Сіїп. Місгобіо!. Іптесі. бів. 1996, 15:121-127|, К5М (наприклад, антигени Е та б або продукти злиття РГ/б, див., наприклад, Зсптіаії А. С. еї аї, У Мігої, Мау 2001, р4594-4603), РІМЗ (наприклад, білки НМ та РЕ, див. вище Зсптіаї еї аї.), з вітряною віспою (наприклад, (атенуйований, глікопротеїн І-М та інш.), і будь-який (або всі) компонент(и) ММЕ (кір, свинка, краснуха). Переважна педіатрична комбінована вакцина, яка розглядається в даному винаході для повного вилікування або запобігання отиту середнього вуха, містить: один або більше сахаридних антигенів бігеріососси5 рпештопіає (переважно кон'югованих з білком 0), один або більше пневмококових білків (переважно білки, описані вище) та один або більше поверхнево реакційний антигенів МогахеїІа сагагнаїй» та/або атиповий Наеторпйи5 іпїсеплає. Білок ЮО можна придатним чином застосовувати як білок-носій для пневмококового сахариду (як згадано вище), оскільки він являє собою імуноген, здатний продукувати захист проміжних В-клітин проти атипового Н. іпйцеплає (піНі). Антигени Могахеїа саїагтнаїй» або атипового Наеторпійи5 іпїйсеплає можна включати до вакцини у субодиничній формі або можна додавати як антигени, присутні на поверхні міхурців зовнішніх мембрани, одержаних з бактерій.

Імуногенні властивості імуногенної композиції, яку застосовують для вакцинації за даним винаходом

У даному винаході імуногенна композиція переважно здатна стимулювати покращену імунну реакцію Т-клітин СО4 проти як мінімум одного антигенного компоненту або антигенної композиції в порівнянні з імунною реакцією Т-клітин СО4, одержаною з використанням відповідної неад'ювантної композиції, тобто вона не містить екзогенного ад'юванту (у даному описі вона також означає "просту композицію"). В конкретному варіанті, де імуногенна композиція являє собою композицію проти грипу, і де препарат вакцини проти грипу складається з декількох штамів грипу, один з яких являє собою пандемічний штам, вказана покращена імунна реакція Т-клітин СО4 спрямована проти пандемічного штаму грипу.

Під "покращеною імунною реакцією Т-клітин СО4" мають на увазі, що більш виражену реакцію СО4 одержують у ссавця після введення ад'ювантної імуногенної композиції, ніж після введення такої ж композиції без ад'юванту. Наприклад, більш виражену реакцію Т-клітин СО4 одержують у пацієнта- людини при введенні імуногенної композиції, що містить вірус грипу або його антигенний препарат разом з ад'ювантом відповідно даного винаходу, в порівнянні з реакцією, індукованою після введення неад'ювантної імуногенної композиції, що містить вірус грипу або його антигенний препарат. Така рецептура буде придатним чином застосовуватися з метою стимулювання реакції Т-клітин СО4 проти грипу, яка здатна виявляти епітопи грипу, представлені молекулами класу І! МНС.

Зокрема, але не виключно, вказану покращену імунну реакцію Т-клітин СО4 одержують у імунологічно наївного пацієнта, тобто пацієнта, який є серонегативним по відношенню до вказаного вірусу грипу або антигену. Така серонегативність може бути результатом того, що вказаний пацієнт ніколи не стикався з подібним вірусом або антигеном (так званий "наївний" пацієнт) або, альтернативно, не відреагував на вказаний антиген, з яким зіткнувся одного разу. В конкретному аспекті вказану імунну реакцію Т-клітин СО4 одержують у суб'єкта, який піддається ризику розладу з боку імунної системи, наприклад, у немолодої людини, звичайно 65 років або старше, або дорослої молодої людини, молодше 65 років з високим ризиком розвитку патологічного стану ("дорослий з високим ризиком"), або дитини молодше двох років.

Покращену імунну реакцію Т-клітин СО4 можна оцінити шляхом вимірювання кількості клітин, що продукують будь-який з наступних цитокінів: - клітини, що продукують як мінімум два різних цитокіни (СО401., 1-2, ТЕМ-у, ТМЕос); - клітини, що продукують як мінімум СО401. та інший цитокін (І--2, ТМЕос, ІЕМ-у); - клітини, що продукують як мінімум ІІ--2 та інший цитокін (СО40І, ТМЕо, ІЕМ-у); - клітини, що продукують як мінімум ІЕМ-у та інший цитокін (1-2, ТМЕс, СО401); - клітини, що продукують як мінімум ТМЕс: та інший цитокін (1-2, СО401., ТЕМ-у).

Покращена імунна реакція Т-клітин СО4 буде виникати, якщо клітини, що продукують будь-який із згаданих вище цитокінів, будуть присутні у більшій кількості після введення ад'ювантної композиції в порівнянні з введенням неад'ювантної композиції. Звичайно будуть виникати як мінімум один, переважно два з п'яти станів, згаданих у даному описі вище. В конкретному варіанті клітини, що продукують всі чотири цитокіни, будуть присутні у більшій кількості в групі ад'ювантної вакцини в порівнянні з групою неад'ювантної вакцини.

Покращену імунну реакцію Т-клітин СО4, що забезпечується за допомогою ад'ювантної композиції проти грипу за даним винаходом, в ідеалі можна одержати після одного одиничного введення. Підхід одиничної дози буде надзвичайно доречним, наприклад, у випадку швидко о клінічнурн спалаху епідемічної ситуації. За певних обставин, особливо для популяції людей похилого віку, або у випадку дітей (молодше 9 років), щеплення яких проти грипу здійснюється вперше, або у випадку пандемій, може бути переважним введення двох доз однієї композиції для даного сезону. Другу дозу вказаної однієї композиції (вона все ще вважається «композицією для першої вакцинації») можна вводити протягом первинної імунної реакції і відповідно планувати. Звичайно другу дозу композиції вводять через декілька тижнів або приблизно один місяць, наприклад, 2 тижні, З тижні, 4 тижні, 5 тижнів або 6 тижнів, після введення першої дози з метою допомоги зміцнення імунної системи осіб, несприйнятливих або слабко сприйнятливих до вакцини.

В іншому варіанті введення вказаної імуногенної композиції стимулює покращену реакцію В- лімфоцитів у пацієнтів, яким вводять ад'ювантну імуногенну композицію в порівнянні з реакцією В- лімфоцитів, індукованою у людей, імунізованих неад'ювантною композицією. Покращена реакція В- лімфоцитів може означати підвищену зустрічальність В-лімфоцитів периферичної крові, здатних до диференціації до клітин плазми, що виділяють антитіла до антигену, що зустрічається, за даними вимірювання стимуляції іп міго диференціації.

В іншому варіанті введення вказаної імуногенної композиції стимулює покращену гуморальну реакцію у пацієнтів, яким вводять ад'ювантну імуногенну композицію в порівнянні з гуморальною реакцією, індукованою у людей, імунізованих неад'ювантною композицією. Вказану гуморальну імунну реакцію можна виміряти відповідно до будь-якої методики, що наводиться в деталях у прикладі І, особливо в розділах 1.1 (1.1.1), 1.2 (1.2.1) та 1.3 (1.3.5.2). Якщо імуногенна композиція являє собою композицію грипу, то одержують конкретно вказану гуморальну реакцію проти гомологічних і гетероогічних штамів. Зокрема, вказана гетероогічна гуморальна імунна реакція означає гуморальну реакцію між штамами грипу, і її називають «перехресно-реактивною» гуморальною імунною реакцією.

Вказана «перехресно-реактивна» гуморальна імунна реакція включає стимулювання реакції проти штаму грипу, що являє собою варіант (дрейф) штаму грипу, який використовують для вакцинації.

Приклад подібної реакції ілюстрований в прикладі 1.3.1 та у фіг. 2.

У конкретному варіанті введення вказаної ад'ювантної імуногенної композиції стимулює як мінімум дві з наступних реакцій: () покращену імунну реакцію Т-клітин СО4, (ії) покращену реакцію В- лімфоцитів, (ії) покращену гуморальну реакцію проти як мінімум одного компоненту антигену(ів) або антигенної композиції в порівнянні з будь-якою імунною реакцією, одержаною за допомогою відповідної неад'ювантної композиції, тобто, не містить екзогенного ад'юванту (у даному описі вона також означає «просту композицію»).

В іншому конкретному варіанті вакцинація композицією для першої вакцинації ад'ювантна, не здійснює впливу на реакцію СО8, що піддавався б вимірюванню.

Саме у конкретному варіанті даного винаходу композиція, що містить вірус грипу або його антигенний препарат, виготовлена з ад'ювантом сапоніну, представленого у формі ліпосоми, зокрема, сапоніну 2521 в його погашеній формі з холестерином, є ефективною з точки зору стимулювання реакцій Т-клітин у популяції людей, що піддається ризику розладу з боку імунної системи. В одному варіанті вказаний ад'ювант додатково являє собою ад'ювант 30О-МРІ. Зокрема, введення єдиної дози імуногенної композиції для першої вакцинації, як описано у даному винаході, здатне забезпечити кращий серозахист, за даними кореляції захисту для вакцин проти грипу, після повторної вакцинації проти грипу популяції літніх людей, ніж вакцинація неад'ювантною вакциною проти грипу. Заявлена ад'ювантна рецептура також може стимулювати покращену імунну реакцію Т-клітин СО4 проти вірусу грипу в порівнянні з імунною реакцією, одержаною при введенні неад'ювантної рецептури. Вказані дані можуть асоціюватися з підвищеною чутливістю до вакцинації або антигенного прояву інфекції мів - а-міз грипу. До того ж, вони можуть також асоціюватися з перехресною реактивністю, тобто більш високою здатністю реагувати на штами варіантів грипу. Така покращена реакція може бути особливо переважною для популяції людей з підвищеним ризиком розладів з боку імунної системи, наприклад, у популяції людей похилого віку (65 років та старше), зокрема, високому ризику піддається популяція людей похилого віку. Вказана реакція може в результаті приводити до зменшення загальної зустрічальності захворювання та показників смертності, а також запобіганню звернень по невідкладну допомогу до лікарні у випадку пневмонії та інших грипоподібних захворювань. Така реакція може також бути переважною для дитячої популяції (молодше 5 років, переважно молодше 2 років). До того ж, вона може викликати стимуляцію реакції Т-клітин СО4, що є більш постійною в часі, наприклад, все ще присутня через рік після першої вакцинації в порівнянні з реакцією, індукованою за допомогою неад'ювантної рецептури.

В конкретному аспекті імунна реакція Т-клітин СО4, наприклад, покращена імунна реакція Т-клітин с0р4, одержана у не наївного суб'єкта, включає стимуляцію перехресно-реактивної реакції Т-хелперів

СО4. Зокрема, кількість перехресно-реактивних Т-клітин СО4 збільшена. Під «перехресно- реактивною» реакцією СО4 мається на увазі Т-клітина СО4, націлена на розрізнення епітопів поміж штамами грипу.

Звичайно, доступні вакцини проти грипу ефективні тільки проти зараження штамами вірусу грипу, які містять гемаглютинін з подібними антигенними властивостями. Коли інфекційний (циркулюючий) вірус грипу зазнає незначних змін (наприклад, точкової мутації або акумуляції точкових мутацій, що в результаті дає зміни амінокислот, наприклад, в поверхневих глікопротеїнах, зокрема в гемаглютиніні (варіант антигенної мінливості штаму вірусу), то вакцина все ще може забезпечувати деякий захист, хоча вона може надавати тільки обмежений захист, оскільки новостворені варіанти можуть уникати імунітету, стимульованого попередньою інфекцією грипу або вакцинацією. Антигенна мінливість відповідальна за щорічні епідемії, які виникають протягом міжпандемічних періодів (МЛІеу 5 5Кепеї, 1987, Апп. Неу. Віоспет. 56, 365-394). Стимуляція перехресно-реактивних Т-клітин СО4 дає додаткову перевагу композиції за даним винаходом в тому, що вона може також надавати перехресний захист, іншими словами, захист проти гетерологічних інфекцій, тобто інфекції, спричинених циркулюючим штамом грипу, що являє собою варіант (наприклад, дрейф) штаму грипу, що міститься в імуногенній композиції. Така стимуляція може бути переважною, якщо циркулюючий штам важко репродукувати в яйцях або виростити в культурі клітини, вважаючи застосування мінливого штаму робочою альтернативою. Вона може також бути переважною, коли суб'єкт одержує другу вакцинацію через декілька місяців або рік після першої вакцинації, а штам грипу, який використовують в імуногенній композиції для другої імунізації, являє собою штам мінливого варіанту штаму, який використовують в композиції, яку застосовують для першої вакцинації.

Таким чином, як визначено в даному описі, ад'ювантна імуногенна композиція проти грипу має більшу здатність до стимуляції серозахисту та перехресно-реактивних Т-клітин СО4 у вакцинованих людей похилого віку. Дана характеристика може асоціюватися з більшою здатністю реагування проти варіанту штаму даного штаму, який присутній в імуногенній композиції. Вказана властивість може стати важливою перевагою у випадку пандемічної ситуації. Наприклад, полівалентна імуногенна композиція проти грипу, що містить будь-який або декілька штамів Н5, Н2, НО, Н7 або Нб, може забезпечити більшу здатність реагування проти пандемічного варіанту, тобто мінливого штаму вказаного пандемічного штаму(ів) як за допомогою подальшої вакцинації, так і випадку інфікування вказаним мінливим штамом.

Виявлення перехресно-реактивних Т-клітин СО4 після вакцинації вакциною проти грипу

Т-клітини СО4, які можуть розпізнати як гомологічні, так і мінливі штами грипу, названі в даному документі «перехресно-реактивними». Ад'ювантні композиції проти грипу, як описано в даному описі, здатні демонструвати гетеросубтипову перехресну реактивність, оскільки існує помітна перехресна реактивність проти мінливих штамів грипу. Як вказано вище, виявлено, що імунізуюча здатність препарату з пандемічною вакциною, ефективного проти мінливих пандемічних штамів, може бути важливою властивістю у випадку пандемій.

На підтвердження згаданих вище спостережень у людині ідентифіковані епітопи Т-клітин СО4, які містять різні штами грипу (СеїЇдег С еї аї. 1998, Іпі Іттипої. 10(2):211-22; Сеїдег СМ еї аї. 1996 У Мікої.

70(7):4787-90; Сеїдег СМ еї аї. 1995 У Мігої. 1995 69(12):7497-506).

В конкретному варіанті ад'ювантна композиція може дати додаткову перевагу, забезпечуючи кращий захист проти циркулюючих штамів, які зазнали основної зміні (такої, як генна рекомбінація, наприклад, між двома різними видами) в гемаглютиніні (антигенне переміщення), проти якого доступні на теперішній час вакцини не є ефективними.

Повторна вакцинація та композиція, яку використовують для повторної вакцинації (композиція для ревакцинації)

В одному варіанті даний винахід передбачає застосування вірусу грипу або його антигенного препарату у виробництві імуногенної композиції для повторної вакцинації людей, які одержали попередню вакцинацію імуногенною композицією, як заявлено в даному описі.

В одному аспекті даного винаходу пропонується застосування вірусу грипу або його антигенного препарату з першого пандемічного штаму грипу у виробництві ад'ювантної імуногенної композиції, як визначено в даному описі, для захисту проти інфекцій грипу, спричинених штамом грипу, який являє собою варіант вказаного першого штаму грипу.

В іншому аспекті даний винахід передбачає застосування вірусу грипу або його антигенного препарату у виробництві імуногенної композиції грипу для повторної вакцинації людей, які одержали попередню вакцинацію ад'ювантною композицією проти грипу, як заявлено в даному описі, або ад'ювантною композицією проти грипу, що містить штам варіантного грипу, причому ад'ювант є таким, як визначено в даному описі.

В іншому аспекті даний винахід передбачає спосіб вакцинації популяції людей або людини проти одного штаму вірусу грипу після повторної вакцинації вказаної людини або популяції проти штаму варіантного вірусу грипу, вказаний спосіб включає введення вказаній людини (ї) першої композиції, що містить вірус грипу або його антигенний препарат з першого штаму вірусу грипу та ад'ювант, як визначено в даному описі, та (ії) другої імуногенної композиції, що містить варіант штаму вірусу грипу вказаного першого штаму вірусу грипу. В конкретному варіанті вказаний перший штам асоціюється із спалахом пандемії або має потенціал, який асоціюється із спалахом пандемії. В іншому конкретному варіанті вказаний варіантний штам асоціюється із спалахом пандемії або має потенціал, який асоціюється із спалахом пандемії. Зокрема, повторну вакцинацію проводять композицією грипу, яка містить як мінімум один штам, що являє собою циркулюючий пандемічний штам. Як основна композиція, так і композиція для ревакцинації може бути полівалентною, тобто може містити як мінімум два штами вірусу грипу. Якщо композиція(ї) є полівалентною(ними), як мінімум один штам асоціюється із спалахом пандемії або має потенціал, який асоціюється із спалахом пандемії. Звичайно повторну вакцинацію проводять як мінімум через б місяців після першої вакцинації(ій), переважно через 8-14 місяців, більш переважно через приблизно 10-12 місяців.

Імуногенна композиція для повторної вакцинації (композиція для ревакцинації), може містити будь- який тип антигенного препарату, як інактивованого, так і живого атенуйованого. Вона може містити такий же тип антигенного препарату, наприклад, розщеплений вірус грипу або його антигенний препарат, суцільний віріон, або очищену вакцину НА та МА (субодиничну), як й імуногенна композиція, яку використовували для першої вакцинації. Альтернативно композиція для ревакцинації може містити інший тип антигену грипу, ніж той, що застосовували в першій вакцинації. Переважно застосовують розщеплений вірус. Композиція для ревакцинації може бути ад'ювантною або неад'ювантною.

Неад'ювантна композиція для ревакцинації може являти собою РіІцчагіх "М/а-Кіхе/пПив5рій, яку водять внутрішньом'язово. Рецептура містить три антигени інактивованого розщепленого о кліні, виготовлені із штамів, рекомендованих Всесвітньою організацією охорони здоров'я, для відповідного сезону грипу.

Композиція для ревакцинації може бути ад'ювантною або неад'ювантною. В конкретному варіанті композиція для ревакцинації містить о клініч ад'ювант, що являє собою сапонін, як визначено в даному описі.

В конкретному варіанті імуногенна композиція для повторної вакцинації (також в даному описі вона має назву «композиції для ревакцинації») містить вірус грипу або його антигенний препарат, який складається з розповсюджених епітопів Т-клітин СО4 та вірусу грипу або його антигенного препарату, який використовували для першої вакцинації. Розповсюджений епітоп Т-клітин СО4 призначається для позначення пептидів/послідовностей/епітопів з різних антигенів, які можна розпізнати за допомогою такої ж клітини СО4 (див. приклади описаних епітопів в: сзеїдег С еї аї!. 1998, Іпі Іттипо). 19(2):211-22; Севідег СМ еї аї. 1996 У Мігої. 70(7):4787-90; СеїЇдег СМ еї аї. 1995 .) Мігої. 1995 69(12):7497- 506).

У варіанті відповідно даного винаходу композиція для ревакцинації являє собою одновалентну композицію грипу, що містить штам грипу, який асоціюється із спалахом пандемії або має потенціал, який асоціюється із спалахом пандемії. Зокрема, вказаний штам в композиції для ревакцинації являє собою циркулюючий пандемічний штам. Придатні штами являють собою, не обмежуючись ними:

НОМ, НеОМ2, Н7М?7 та Н2М2. Вказаний штам може бути таким же як і той, або один з тих, що присутні в композиції, яку застосовують для першої вакцинації. В альтернативному варіанті вказаний штам може являти собою варіантний штам, тобто мінливий штам, даного штаму, присутній в композиції, яку застосовують для першої вакцинації.

В іншому конкретному варіанті композиція для ревакцинації являє собою полівалентну вакцину проти грипу. Зокрема, якщо композиція для ревакцинації являє собою полівалентну вакцину, наприклад, двохвалентну, трьовалентну або чотирьохвалентну вакцину, то як мінімум один штам асоціюється із спалахом пандемії або має потенціал, який асоціюється із спалахом пандемії. У конкретному варіанті два або більше штамів в композиції для ревакцинації являють собою пандемічні штами. В іншому конкретному варіанті як мінімум один пандемічний штам в композиції для ревакцинації має такий же тип, як один або декілька штамів, присутніх в композиції, яку застосовують для першої вакцинації. В альтернативному варіанті як мінімум один штам може бути варіантним штамом, тобто мінливим штамом, як мінімум одного пандемічного штаму, присутнього в композиції, яку застосовують для першої вакцинації. Зокрема як мінімум один штам в композиції для ревакцинації являє собою циркулюючий пандемічний штам. Композиція для ревакцинації може бути ад'ювантною, або неад'ювантною.

Звичайно композицію для ревакцинації, якщо її застосовують, вводять в наступному сезоні грипу, наприклад, приблизно через один рік після введення першої імуногенної композиції. Композицію для ревакцинації можна також вводити кожного подальшого року (третя, четверта, п'ята вакцинація, і так далі). Композиція для ревакцинації може бути такою ж, як і композиція, яку використовували для першої вакцинації. Відповідно, композиція для ревакцинації містить вірус грипу або його антигенний препарат, що являє собою варіантний штам вірусу грипу, який використовували для першої вакцинації. Зокрема, штами вірусу грипу або їх антигенні препарати вибирають відповідно до еталонного матеріалу, розповсюдженого Всесвітньою організацією охорони здоров'я таким чином, що вони пристосовані до штаму грипу, який циркулює в рік повторної вакцинації.

Антиген грипу або антигенна композиція, яку використовують у повторній вакцинації, переважно містить ад'ювант, відповідно, як описано вище. Ад'ювант може являти собою сапонін, представлений у формі ліпосоми, як описано в даному описі вище, який є переважним, але необов'язково містить додатковий ад'ювант, такий, як 30-МРІ.

В одному аспекті повторна вакцинація стимулює будь-яке, переважно два або всі з наступних явищ: () покращену реакцію СО4 проти вірусу грипу або його антигенного препарату, або (ії) покращену реакцію В-лімфоцитів або (ії) покращену гуморальну реакцію в порівнянні з еквівалентною реакцією, індукованою після першої вакцинації вірусом грипу без ад'юванту або його антигенним препаратом. Переважно імунологічна реакція(ї), індукована після повторної вакцинації вірусом грипу з ад'ювантом або його антигенним препаратом, як визначено в даному описі, є більш вираженою, ніж відповідна реакція, індукована після повторної вакцинації неад'ювантною композицією. Переважно імунологічні реакції, індуковані після повторної вакцинації переважно розщепленим вірусом грипу, без ад'юванту, є більш вираженими в популяції, яка одержала першу вакцинацію ад'ювантною, переважно розщепленою композицією грипу, ніж відповідна реакція в популяції, яка одержала першу вакцинацію неад'ювантною, переважно розщепленою композицією проти грипу.

У конкретному варіанті повторна вакцинація суб'єктів композицією для ревакцинації, що містить вірус грипу та сапоніновий ад'ювант у формі ліпосоми, як визначено в даному описі вище, демонструє більш високі титри антитіл, ніж відповідні показники в групі людей, вакцинованих вперше неад'ювантною композицією та яким проведено ревакцинацію неад'ювантною композицією. Вплив ад'юванту як підсилення реакції на повторну вакцинацію у вигляді антитіл є особливо важливим для популяції людей похилого віку, у яких, як відомо, слабка реакція на вакцинацію або інфекції, спричиненні вірусом грипу. Перевага, що асоціюється з ад'ювантною композицією була також позначена в термінах покращення реакції Т-клітин СОВА після проходження повторної вакцинації.

Конкретно, ад'ювантна композиція за даним винаходом здатна стимулювати кращу перехресну реактивність проти мінливого штаму (штам грипу з наступного сезону грипу) в порівнянні із захистом, наданим контрольною вакциною. Вказана перехресна реактивність продемонструвала вищу персистенцію в порівнянні з тою, що одержана при введенні неад'ювантної рецептури. Вплив ад'юванту у вигляді підсилення перехресної реактивності проти мінливого штаму є важливим у випадку пандемічної ситуації.

У подальшому варіанті даного винаходу розглядається схема вакцинації, в якій першу вакцинацію проводять композицією проти грипу, переважно розщепленої композицією проти грипу, що складається з як мінімум одного штаму грипу, який міг би потенційно спричиняти спалах пандемії, а повторну вакцинацію проводять циркулюючим штамом, як пандемічним штамом, так і класичним штамом.

Епітоп СО4 в НА

Дана антигенна мінливість переважно знаходиться на ділянках епітопу вірусних поверхневих білків гемаглютиніну (НА) та нейрамінідази (МА). Відомо, що будь-яка різниця в епітопах клітин СО4 та В, яку використовує вірус різних штамів грипу для вторгнення в адаптивну реакцію імунної системи хазяїна, буде відігравати та відіграє головну роль у вакцинації проти грипу. Епітопи Т-клітин СО4, в яких містяться різні штами грипу, ідентифіковані у людині (див., наприклад: сеїЇдег С еї аї. 1998, Іпі Іттипо!).

190(2):211-22; Сеїдег СМ еї аїЇ. 1996 9 Мігої. 70(7):4787-90; апа Сеідег СМ еї аїЇ. 1995 9 Мігої. 1995 69(12):7497-506).

В конкретному варіанті повторну вакцинацію проводять, застосовуючи композицію для ревакцинації, яка містить вірус грипу або його антигенний препарат, у якому знаходяться розповсюджені епітопи Т-клітин СО4 з антигеном вірусу грипу або його антигенним препаратом, що використовують для першої вакцинації. Таким чином, даний винахід стосується застосування імуногенної композиції, що містить пандемічний вірус грипу або його антигенний препарат та сапонін у формі ліпосоми, зокрема 0521 в його знешкодженій формі з холестерином, необов'язково з 30-МРІ, у виробництві компоненту першої вакцинації багатодозової вакцини, крім того, багатодозова вакцина містить як дозу ревакцинації вірус грипу або його антигенний препарат, у якому знаходяться розповсюджені епітопи Т-клітин СО4 з антигеном пандемічного вірусу грипу або його антигенним препаратом вірусу в дозі, введеній при першій вакцинації.

Засоби вакцинації

Імуногенні композиції за даним винаходом можна вводити будь-яким придатним способом, таким як внутрішньошкірний, крізь слизову оболонку, наприклад, інтраназально, пероральний, внутрішньом'язовий або підшкірний. Добре відомі в даній галузі й інші шляхи доставки препарату.

Для імуногенної ад'ювантної композиції переважним є внутрішньом'язовий спосіб введення препарату.

Внутрішньошкірне введення являє собою інший придатний спосіб. Можна застосовувати будь-який відповідний пристрій для внутрішньошкірного введення, наприклад, пристрої з короткими голками, описані в патентах США 4,886,499, 5,190,521, 5,328,483, 5,527,288, 4,270,537, 5,015,235, 5,141,496, 5,417,662. Внутрішньошкірні вакцини можна також вводити за допомогою пристроїв, які обмежують ефективну довжину проникнення голки в шкіру, таких як описані у М/О99/34850 та ЕР1092444, що включені до даного опису шляхом посилання, а також їх функціональні еквіваленти. Також придатними є безголкові інжектори, які доставляють рідкі вакцини в шкіру через рідкий безголковий інжектор або через голку, яка проколює роговий шар (5ігаїшт согпешт), і дає струмінь, який досягає дерми. Безголкові інжектори описані, наприклад, в патентах США 5,480,381, 5,599,302, 5,334,144, 5,993,412, 5,649,912, 5,569,189, 5,704,911, 5,383,851, 5,893,397, 5,466,220, 5,339,163, 5,312,335, 5,503,627, 5,064,413, 5,520, 639, 4,596,556, 4,790,824, 4,941,880, 4,940,460, УМО 97/37705 та УМО 97/13537. Також придатними є балістичні пристрої доставки порошку/частинок, в яких застосовують стислий газ з метою прискорення проходження вакцини у формі порошку через зовнішні шари шкіри до дерми. Крім того, можна застосовувати звичайні шприци в класичному способі внутрішньошкірного введення за Манту (тапіоих).

Іншим придатним способом введення препаратів є підшкірний. Можна використовувати будь-який придатний пристрій для підшкірного введення, наприклад, класичну голку. Переважно застосовують безголковий інжектор такий, як той, що описаний у УМО 01/05453, МО 01/05452, МО 01/05451, МО 01/32243, МО 01/41840, МО 01/41839, МО 01/47585, МО 01/56637, МО 01/58512, МО 01/64269, МО 01/78810, УМО 01/91835, УМО 01/97884, МО 02/09796, УМО 02/34317. Більш переважно, вказаний пристрій заповнюють заздалегідь рідким препаратом вакцини.

Альтернативно вакцину вводять інтраназально. Звичайно вакцину вводять місцево в область носоглотки, переважно, не вдихаючи в легені. Бажано застосовувати пристрій для інтраназального введення, який доставляє препарат вакцини в область носоглотки без або в істотній мірі без надходження в легені.

Переважні пристрої для інтраназального введення вакцин відповідно даного винаходу являють собою спрєї. Відповідні комерційно доступні носові спреї включають Асси5ргау "м (Весіоп РіскКіп5оп).

Розпилювачі дають дуже дрібні бризки, які можна легко вдихати в легені, і, таким чином, вони не досягають ефективно слизової оболонки носу. Таким чином, розпилювачі не є переважними.

Переважні спреї для інтраназального введення являють собою пристрої, для яких робота пристрою не залежить від тиску, застосованого споживачем. Вказані пристрої відомі як пристрої порогового тиску. Рідина вивільняється з насадки тільки, коли застосований о клін тиск. Вказані пристрої полегшують доставку бризок з регулярним розміром крапель. Пристрої порогового тиску, придатні для застосування за даним винаходом, відомі в даній галузі та описані, наприклад, у МО 91/13281 ї ЕР 311 863 В та ЕР 516 636, що включені до даного опису шляхом посилання. Такі пристрої комерційно доступні від Ртіешег трнН, а також описані в Воттег, К. К. Рпаптасеціїса! Тесппоїоду

Епигоре, Зері 1999.

Переважні інтраназальні пристрої утворюють крапельки (розміри вимірювали, застосовуючи воду як рідину) в інтервалі від 1 до 200 мкм, переважно 10-120 мкм. При розмірі менше 10 мкм існує ризик інгаляції, таким чином, бажаною є присутність не більше, ніж приблизно 5 95 крапельок розміром менше 10 мкм. Крапельки розміром більше 120 мкм не розпорошуються, як і менші крапельки, тому бажано, щоб було не більше, ніж приблизно 5 95 крапельок розміром більше 120 мкм.

Доставка Ві- дози є подальшою переважною особливістю системи інтраназальної доставки для застосування вакцин відповідно даного винаходу. Пристрої Ві-дози містять дві субдози єдиної дози вакцини, по одній субдозі для введення до кожної ніздрі. Звичайно дві субдози присутні в єдиній камері, а конструкція пристрою дозволяє за один раз зробити ефективну доставку однієї субдози.

Альтернативно можна застосовувати пристрій з монодозою для введення вакцин відповідно даного винаходу.

Альтернативно, епідермальний або трансдермальний спосіб вакцинації також розглядається у даному винаході.

В конкретному аспекті даного винаходу ад'ювантну імуногенну композицію для першого введення можна вводити внутрішньом'язово, а композицію для ревакцинації ад'ювантну, або неад'ювантну, можна вводити за допомогою іншого способу, наприклад, внутрішньошкірно, підшкірно або інтраназально. В іншому конкретному варіанті імуногенна композиція, що містить конкретно антиген вірусу грипу або його антигенний препарат для першого введення, може містити стандартну кількість

НА 15 мкг на штам грипу, а композиція для ревакцинації проти грипу може містити низьку дозу НА, тобто нижче 15 кг, в залежності від способу введення, її можна вводити у меншому об'ємі.

Популяції для вакцинації

Цільова популяція для вакцинації може являти собою осіб з ризиком розладів з боку імунної системи. Люди з ризиком розладів з боку імунної системи загалом в меншій мірі здатні реагувати на антиген, зокрема, на антиген грипу, в порівнянні із здоровими дорослими людьми.

Переважно, цільова популяція являє собою популяцію, яка не спрямована проти грипу, або будучи наївною (наприклад, пандемічний штам мів а мі5), або яка раніше не зреагувала на інфекцію грипу або вакцинацію. Переважно, цільова популяція складається з людей похилого віку, відповідно, віком 65 років, і до даної популяції також входять дорослі молодше вказаного віку з високим ризиком захворювання (тобто від 18 до 64 років), наприклад, люди, що працюють в медичних установах, або молоді люди з фактором ризику, наприклад, серцево-судинних та легеневих захворювань або діабету.

Інша цільова популяція складається з дітей від 6 місяців життя і старше, особливо дітей віком 6-23 місяців, яких госпіталізували з відносно високим показником, пов'язаним з грипом. Переважно, цільова популяція являє собою людей похилого віку старше 65 років.

Схеми вакцинації, дозування та додаткові критерії ефективності

В більшості випадків придатні імуногенні композиції відповідно даного винаходу являють собою стандартну ін'єкційну дозу 0,5 мл, і якщо композиція проти грипу містить 15 мкг антигенного компоненту гемаглютиніну із всіх або кожного штаму грипу, що виміряно за допомогою єдиної радіальної імунодифузії (ЗКО) (У У.М. Умоса еї аї.: 9. ВіоїЇ. апа. 5 (1977) 237-247; 93. М. Мооа еї аї., 9.

Віої. Єїапа. 9 (1981) 317-330). Відповідно, об'єм дози вакцини буде становити від 0,5 мл до 1 мл, зокрема стандартом є 0,5 мл або 0,7 мл об'єму дози вакцини. Для вакцин проти грипу звичайно буде зроблена невелика корекція об'єму дози в залежності від концентрації НА в оригінальному цілому зразку.

Відповідно, вказана імуногенна композиція містить низьку дозу антигену НА, наприклад, будь-яку з 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 або 14 мкг НА на штам грипу.

Переважно, доза вакцини відповідно даного винаходу, зокрема низька доза вакцини, може вводитися в меньшому об'ємі, ніж звичайні розщеплені вакцини грипу, які вводять ін'єкційним способом, що становить звичайно приблизно 0,5; 0,7 або 1 мл на дозу. Дози маленького об'єму відповідно даного винаходу переважно менші за 500 мкл, більш переважно, менші за 300 мкл, ще більш переважно, не більше, ніж приблизно 200 мкл або менше на дозу.

Таким чином, переважна доза вакцини маленького об'єму відповідно одного з аспектів даного винаходу являє собою дозу з низькою дозою антигену в маленькому об'ємі, наприклад, приблизно 15 мкг або приблизно 7,5 мкг НА або приблизно 3,0 мкг НА (на штам) в об'ємі приблизно 200 мкл.

Лікарські засоби проти грипу за даним винаходом переважно відповідають певним міжнародним критеріям для вакцин.

Міжнародні стандарти застосовують з метою вимірювання ефективності вакцин проти грипу.

Офіційні критерії Євросоюзу для ефективної вакцини проти грипу наведені нижче в табл. 1.

Теоретично для того, щоб відповідати вимогам Євросоюзу, вакцина проти грипу повинна відповідати тільки одному з критеріїв, наведених у таблиці для всіх штамів грипу, включених у вакцину. Композиції за даним винаходом відповідають як мінімум одному такому критерію.

Однак, на практиці, як мінімум два або всі три критерії повинні узгоджуватися для всіх штамів, особливо для нової вакцини, наприклад, для нової вакцини, призначеної для іншого способу введення. За певних обставин два критерії можуть бути достатніми. Наприклад, може бути прийнятним, щоб всі штами відповідали двом з трьох вказаних критеріїв, тоді як третьому критерію відповідають деякі, але не всі штами (наприклад, два з трьох штамів). Дані вимоги є різними для популяцій дорослих (18-60 років) та популяцій людей похилого віку (» 60 років).

Таблиця 1

11111111 л8-6бброкв.///// | »боОроків./:КО х Показник сероконверсії визначають як відсоток вакцинованих людей, у яких спостерігалося зростання інгібування гемаглютиніну (НІ) в сироватці як мінімум на чотири порядки після вакцинації, для кожного штаму вакцини. "к Фактор конверсії визначають як порядкове зростання середнього геометричного значення титрів (ЗМТ) НІ в сироватці після вакцинації, для кожного штаму вакцини. --х Показник захисту визначають як відсоток вакцинованих людей з титром НІ сироватки, рівною або більшою, ніж 1:40 після вакцинації (для кожного штаму вакцини), і він звичайно приймається як такий, що вказує на захист.

В іншому аспекті даного винаходу запропоновано спосіб розробки вакцини проти захворювань, відомих як ті, що лікуються за допомогою активації СО4-- Т-клітин, який включає 1) вибір антигену, що містить СО4- епітопи, та 2) комбінацію вказаного антигену з сапоніновим ад'ювантом у формі ліпосоми, як визначено в даному описі вище, причому вказана вакцина при введенні вказаному ссавцю може стимулювати підсилену реакцію Т-клітин СО4 у вказаного ссавця.

Викладення всіх посилань в даній заявці, включаючи патентні заявки та видані патенти, в даному описі супроводжуються повними посиланнями.

З метою уникнення сумнівів терміни «містити», «містять» і «містить», використані винахідниками в даному описі, можна необов'язково замінити термінами «складають», «складаються 3» і «складається 3», відповідно, в кожному випадку.

Даний винахід буде далі описаний з посиланням на наступні необмежуючі приклади:

В Прикладі І описані імунологічні способи зчитування, які застосовують в дослідженнях на мишах, тхорах та людях.

В Прикладі ІІ описане одержання ліпосомального ад'юванту МРІ /0521.

В Прикладі Ії описано доклінічну оцінку ад'ювантної та неад'ювантної вакцини проти грипу на тхорах.

В Прикладі ІМ продемонстровано доклінічну оцінку ад'ювантної та неад'ювантної вакцини проти грипу у наївних і базових мишей С57ВІ/6.

В Прикладі М описано порівняння ад'ювантної вакцини проти грипу з ЗО-МРІ в двох різних концентраціях у мишей.

В Прикладі МІ описано порівняння ад'ювантної вакцини проти грипу з ЗО-МРІ в двох різних концентраціях у людей похилого віку.

В Прикладі МІ! описано доклінічну оцінку ад'ювантних вакцин НРУ у мишей.

В Прикладі МІ! описано доклінічну оцінку ад'ювантної та неад'ювантної імуногенних композицій з цитомегаловірусом.

В Прикладі ІХ описано доклінічну оцінку ад'ювантної композиції вакцини КТ5.5 з ЗО-МРІ в двох різних концентраціях.

В Прикладі Х описано клінічну оцінку ад'ювантної вакцини КТ5.5 з ЗО-МРІ в двох різних концентраціях.

Приклад І - Імунологічні способи зчитування 11. Способи на мишах

І.1.1. Випробування на інгібування гемаглютинації

Методика тестування

Визначені титри антитіл проти гемаглютиніну трьох штамів вірусу грипу із застосуванням випробування на інгібування гемаглютинації (НІ). Принцип випробування НІ заснований на здатності специфічних антитіл проти грипу інгібувати гемаглютинацію курячих еритроцитів (КВС) під дією гемаглютиніну вірусу грипу (НА). Зразки сироватки, інактивовані за допомогою тепла, спочатку обробляли каоліном та курячими еритроцитами з метою видалення неспецифічних інгібіторів. Після первинної обробки зразки сироватки, розведені на два порядки, інкубували з 4 одиницями гемаглютинації кожного штаму грипу. Далі додавали курячі еритроцити та оцінювали інгібування аглютинації. Титри виражали як еквівалентні величини найвищого розведення сироватки, в якому вона повністю інгібувала гемаглютинацію. Оскільки перше розведення сироваток становило 1:20, невизначений рівень був оцінений як титр, що дорівнює 10.

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз виконували на титрах НІ після вакцинації із застосуванням ШОМІЗТАТ.

Протокол, який використовували для аналізу розбіжностей, можна стисло описати наступним образом:

- Год трансформація даних; - тест Шапіро-Уілка (Зпаріго-МЛІК) для кожної популяції (групи) для перевірки нормальності розподілу груп; - тест Кохрана (Соспгап) для перевірки гомогенності розбіжностей між різними популяціями (групами); - двосторонній аналіз розбіжностей, проведений в групах; - тест Тукея (ТиКеу) НЗО множинних порівнянь.

І.1.2. Внутрішньоклітинне забарвлення цитокіну

Дана техніка дозволяє визначення кількості Т-лімфоцитів, специфічних для антигенів, на підставі продукування цитокіну: Т-клітини ефектора та/або Т-лімфоцити ефектора продукують інтерферон-у та/або головні Т-лімфоцити продукують 1ЇІ--2. На 7-й день після імунізації збирають моноядерні клітини периферичної крові.

Лімфоїдні клітини повторно стимулюють іп міїго в присутності інгібітору секреції (брефелдину):

Далі вказані клітини обробляють за звичайною методикою імунофлуоресценції із застосуванням флуоресцентні антитіла (204, СО8, ІЄМ-у та 1-2). Результати виражають як зустрічальність цитокін- позитивних клітин в межах Т-клітин СО4/С08. Внутрішньоклітинне забарвлення цитокінів Т-клітин виконували на 7-й день моноядерних клітин периферичної крові після другої імунізації. У мишей відбирали кров та вміщували її у гепаринізоване середовище КРМІнАаа. Для крові КРМІнАдаЙ - розведені суспензії периферичних лімфоцитів крові були розділені на шари на градієнті І утрпоїуїе-

Матютаї! відповідно до рекомендованого протоколу (центрифугування протягом 20 хвилин при 2500 об./хв та кімнатній температурі). Моноядерні клітини видаляли на межі розподілу, промивали 2 рази в

ЕРМІтАдіа, а суспензії моноядерних клітин периферичної крові були скоректовані до 2х105 клітин/мл в

ЕРМІ з вмістом 5 95 сироватки телячих ембріонів.

Антигенну стимуляцію моноядерних клітин периферичної крові іп міго проводили при кінцевій концентрації 1х106 клітин/мл (пробірка для аналізу за допомогою сортеру клітин із збудження флуоресценцією |РАС5|Ї) за допомогою трьохвалентної розщепленої вакцини проти грипу на мікрогранулах (5 мкг НА/штам) або суцільною РІ (1 мкг НА/штам), а потім інкубували протягом 2 годин при 37 "С з додаванням анти-СО28 та анти-СО494 (1 мкг /мл для обох).

Додавання обох антитіл, збільшена проліферація та продукування цитокіну активованими Т- клітинами та клітинами- природними кілерами може давати спільний стимулюючий сигнал для індукування цитотоксичних Т-лімфоцитів.

Крім того, моноядерні клітини периферичної крові також стимулювали протягом всієї ночі трьохвалентною розщепленою вакциною проти грипу (30 мкг НА/штам) або суцільною БІ (5 мкг

НА/штам) - пульсуванням дендритних клітин, що походять з кісткового мозку (1х109 клітин/мл), які були виготовлені шляхом пульсації дендритних клітин, що походять з кісткового мозку, з розщепленою вакциною проти грипу (60 мкг НА/штамів) або трьоохвалентною РІ суцільного грипу (10 мкг НА/штам) протягом б годин при 37 "С. Після стадії повторного стимулювання антигену, моноядерні клітини периферичної крові інкубують протягом ночі в присутності брефелдину (1 мкг /мл) при 37 "С з метою інгібування секреції цитокіну.

Забарвлення інтерферону-у (ІЕМ-УЛІ -2/604/С08 виконують наступним способом: Суспензії клітин промивають, суспендують повторно в 50 мкл розчину фосфатного буферу з вмістом 1 95 сироватки телячого ембріону, що містить 2 95 Ес блокуючого реактиву (1/50; 2.4052). Після інкубації протягом 10 хвилин при 4 "С додавали 50 мкл суміші анти-СО4-РЕ (2/50) та анти-СО8 на Ср (3/50) та інкубували протягом 30 хвилин при 4 "С. Після промивання б розчині фосфатного буферу з вмістом 1 95 сироватки телячого ембріону клітини просочували, повторно суспендуючи в 200 мкл Суоїїх-Суїюрегт (Кії ВО) та інкубували протягом 20 хвилин при 4 "С. Далі клітини промивали Регт Умахп (Кії ВО) та повторно суспендували в 50 мкл суміші анти-ІЕМ-у АРС (1/50) ж анти-ІЇ-2 РІТС (1/50), розбавленої

Репт Умах5п. Після інкубації протягом як мінімум 2 годин та як максимум цілої ночі при 4 "С клітини промивали Регт УмМахпй і повторно суспендували в розчині фосфатного буферу з вмістом 1 95 сироватки телячого ембріону ж- 1 96 параформальдегіду. Аналіз зразків виконували за допомогою

ЕАС5. Живі клітини закривали (Е5С/55С) і виконували комплектування --50,000 перетворень (лімфоцити) або 35,000 перетворень на СО4- Т-клітинах. Відсотковий вміст ІЕМ-у ж- або І/2 обчислювали на СО4-- та СЮО8-- замкнутих популяціях.

І.2. Способи на тхорах

І.2.1. Випробування на інгібування гемаглютинації (НІ)

Методика тестування

Визначені титри антитіл проти гемаглютиніну трьох штамів вірусу грипу в ході випробування на інгібування гемаглютинації (НІ). Принцип випробування НІ заснований на здатності специфічних антитіл проти грипу інгібувати гемаглютинацію курячих еритроцитів (КВС) за допомогою гемаглютиніну вірусу грипу (НА). Зразки сироватки спочатку обробляли 25 95 розчином нейрамінидази (КОЕ) та інактивували за допомогою тепла з метою видалення неспецифічних інгібіторів. Після первинної обробки зразки сироватки, розведені на два порядки, інкубували з 4 одиницями гемаглютинації кожного штаму грипу. Далі додавали курячі еритроцити та оцінювали інгібування аглютинації із застосуванням проміжків для зчитування. Титри виражали як еквівалентні величини найвищого розведення сироватки, в якому вона повністю інгібувала гемаглютинацію. Оскільки перше розведення сироватки становило 1:10, невизначений рівень був оцінений як титр, що дорівнює 5.

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз виконували на титрах НІ (41-й день перед проведенням провакційної проби із застосуванням ОМІЗТАТ. Протокол, який використовували для аналізу розбіжностей, можна стисло описати наступним образом: - Год трансформація даних; - тест Шапіро-Уілка (Зпаріго-МЛІК) для кожної популяції (групи) для перевірки нормальності розподілу груп; - тест Кохрана (Соспгап) для перевірки гомогенності розбіжностей між різними популяціями (групами); - тест взаємодії односторонній АМОМА: - тест Тукея (ТиКеу) НЗО множинних порівнянь.

І.2.2. Назальні змиви

Назальні змиви одержували шляхом введення 5 мл розчину фосфатного буферу в обидві ніздрі пробуджених тварин. Інокулят збирали в чашки Петрі та вміщували до контейнерів для зразків в сухому льоду.

Визначення титру вірусів в назальні змивах

Всі зразки назальних змивів були спочатку стерильно профільтровані крізь фільтри Зріп Х (Совіаг) з метою виключення бактеріального забруднення. 50 мкл серійних розведень назальних змивів на десять порядків переносили на пластини для мікротитрування, що містили 50 мкл середовища (10 лунок/розведення). Далі додавали 100 мкл клітин собачої нирки Медлін-Дербі (МОСК, 2,4х105 клітин/імл) до кожної лунки та інкубували при 35 "С протягом 5-7 днів. Після 6-7 днів інкубації середовище для культивування обережно видаляли, та додавали 100 мкл 1/20 М/5Т-1, що містить середовище, та інкубували ще протягом 18 годин.

Інтенсивність забарвлення жовтим барвником формазаном, продукована при зменшенні М/5Т-1 життєздатними клітинами, яка є пропорційною кількості життєздатних клітин, присутніх в лунці в кінці аналізу титрування вірусу, визначають, вимірюючи оптичну густину в кожній лунці на відповідній довжині хвилі (450 нм). Граничний показник визначають як середню величину ОЮ для незаражених контрольних клітин - 0,3 ОО (0,3 ОО відповідає ж/- З ЗІЮем ОО для незаражених контрольних клітин).

Позитивний результат визначають, коли ОО « граничного показника, і навпаки, негативний результат визначають, коли ОО » граничного показника. Титри поширення вірусу визначали за "Кеєй та Миепсі" та виражали як І 09 ТСІЮОзо/мл.

І.3. Аналізи для оцінки імунної реакції у людей

І.3.1. Аналіз інгібування гемаглютинації

Імунну реакцію визначали, вимірюючи антитіла НІ за допомогою застосування способу, описаного центром співробітництва з проблем грипу Всесвітньої організації охорони здоров'я, центрів за контролем над захворюваннями, Атланта, США (1991).

Вимірювання титру антитіл проводили на заморожених та відталих зразках сироватки за допомогою стандартизованого та всесторонньо валідованого мікрометоду із застосуванням 4 одиниць інгібування гемаглютинації (4 НІЮ) відповідних антигенів і 0,595 суспензії курячих еритроцитів.

Неспецифічні інгібітори сироватки видаляли шляхом термічної обробки та за допомогою ферменту, що знищує рецептор.

Одержані сироватки були оцінені щодо рівнів антитіла НІ. Починаючи з початкового розведення 1:10, серії розведення (з фактором 2) готували до кінцевого розведення 1:20480. Кінцева точка титрування була взята як найвища стадія розведення, яка демонструвала повне інгібування (100 95) гемаглютинації. Всі аналізи виконували в подвійному повторенні,

І.3.2. Аналіз інгібування нейрамінідази

Аналіз виконували на пластинах для мікротитрування, вкритих фетуїном. Готували 2-х порядкові серії розведення антисироватки та змішували із стандартизованою кількістю вірусу грипу А НЗМ2,

НІМ! або грипу В. Випробування базувалося на біологічній активності нейрамінідази, яка ферментативно вивільняє нейрамінінову кислоту з фетуїну. Після розщеплення кінцевої нейрамінінової кислоти був виявлений О1-О-галактоз-М-ацетил-галактозамін. Арахісовий аглютинін, маркірований пероксидазою хріну (НКР), з Агаспіз Ппуродаєа, що специфічно зв'язується із структурами галактози, додавали в лунки. Кількість зв'язаного аглютиніну можна виявити та здійснити кількісне визначення реакції субстрату з тетра-метилбензідином (ТМВ). Найвище розведення антитіл, яке все ще інгібує вірусну активність нейрамінідази як мінімум на 50 95, як показано, складає титр МІ.

І.3.3. Аналіз нейтралізуючих антитіл

Вимірювання нейтралізуючих антитіл проводили на заморожених та відталих зразках сироватки.

Нейтралізацію вірусу за допомогою антитіл, що містяться в сироватці, визначали із застосуванням аналізу мікронейтралізації. В аналізі використовували сироватку без подальшої обробки. Кожен зразок сироватки аналізували тричі. Стандартизовану кількість вірусу змішували з серійними розведеннями сироватки та інкубували, щоб забезпечити зв'язування антитіл з вірусом. Суспензію клітин, що містить певну кількість клітин МОСК, далі додавали до суміші вірусу та антисироватки та інкубували при 33 С. Після проходження інкубаційного періоду реплікацію вірусу візуалізували за допомогою гемаглютинації курячих еритроцитів. 50 9о титр нейтралізації сироватки розраховували за методом

Ріда та Мюнха (Кееа апа Миепсі).

І.3.4. Клітинно-опосередкований специфічний імунітет, оцінений за допомогою протокової цитометрії цитокінів (СЕС)

Специфічні по відношенню до антигену Т-клітини СО4 та СО8 периферичної крові можна повторно стимулювати іп міго з метою продукування 1-2, СО40І, ТМЕ-альфа та ІЕМ при інкубації з відповідним антигеном. Таким чином, специфічні по відношенню до антигену Т-клітини СО4 та СО8 можна перерахувати за допомогою протокової цитометрії після звичайного маркування клітинного фенотипу імунофлуоресценцією, а також продукування внутрішньоклітинних цитокінів. В даному дослідженні антиген вакцини проти грипу, а також пептиди, що походять з специфічного білка грипу, застосовували як антиген з метою повторної стимуляції Т-клітин, специфічних по відношенню до грипу. Результати виражали як зустрічальність Т-клітин СО4 або СО8, позитивних на цитокін (и), в межах субпопуляції Т-клітин СО4 або СОВ8.

І-3.5. Статистичні методи

І.3.5.1. Первинні кінцеві точки - Відсотковий вміст, інтенсивність і зв'язок з вакцинацією стійких місцевих і системних ознак та симптомів в наступний період лікарського спостереження протягом 7 днів (тобто день вакцинації та 6 наступних днів) після вакцинації та загалом. - Відсотковий вміст, інтенсивність і зв'язок з вакцинацією нестійких місцевих і системних ознак та симптомів в наступний період лікарського спостереження протягом 21 дня (тобто день вакцинації та наступних днів) після вакцинації та загалом. - Випадки серйозних побічних ефектів протягом всього дослідження.

І.3.5.2. Вторинні кінцеві точки

Для гуморальної імунної реакції:

Спостережувані змінні: - В 0 та 21 день: інгібування гемаглютинації сироватки (НІ) та титри антитіл МІ аналізували окремо проти кожного з трьох штамів вірусу грипу, представлених у даній вакцині (анти-НІ1МІ1, анти-НЗМ2 та анти-В-антитіла). - В 0 та 21 день: титри нейтралізуючих антитіл аналізували окремо проти кожного з трьох штамів вірусу грипу, представлених у даній вакцині.

Одержані змінні (з 95 95 довірчим інтервалом): - Середнє геометричне значення титрів (ЗМТ) антитіл НІ сироватки з 95 95 довірчим інтервалом (95 9о СІ) до та після вакцинації. - Показники сероконверсії" з 95 95 СІ в 21-й день. - Фактори конверсії "" з 95 95 СІ в 21-й день. - Показники серозахисту""" з 95 95 СІ в 21-й день. - Середнє геометричне значення титрів антитіл МІ сироватки (з 95 95 довірчими інтервалами) у всіх точках часу. "Показники сероконверсії визначені як відсоток вакцинованих людей, у яких спостерігали збільшення в титрів НІ сироватки як мінімум на 4 порядки на 21-й день в порівнянні з днем 0 для кожного штаму вакцини. як фактор конверсії визначений як збільшення середнього геометричного значення титрів Ні сироватки на 21-й день в порівнянні з днем 0 для кожного штаму вакцини. ях Показник захисту визначений як відсоток вакцинованих людей з титром НІ сироватки - 40 після вакцинації (для кожного штаму вакцини), який звичайно приймають як вакцинацію, що вказує на захист.

Для клітинно-опосередкованої специфічної імунної реакції:

Спостережувана змінна:

В 0 та 21 день: частота позитивних щодо цитокіну клітин СО4/С0О8 на 105 в різних випробуваннях.

В кожному випробуванні здійснюють кількісне визначення реакції Т-клітин СО4/С0О8: - Пептидний антиген грипу (р) (точну природу та походження вказаних антигенів необхідно надати/пояснити). - Розщеплений антиген грипу (51). - Суцільний антиген грипу (м/ї).

Одержані змінні:

- клітини, які продукують як мінімум два різних цитокіни (СО401., 1-2, ТЕМ-у, ТМЕ-с); - клітини, які продукують як мінімум СО40!. та інший цитокін (1-2, ТМЕ-о, ІЕМ-у); - клітини, які продукують як мінімум 1-2 та інший цитокін (СО40, ТМЕ-о, ІЕМ-у); - клітини, які продукують як мінімум ІЕМ-у та інший цитокін (І--2, ТМЕ-о, СО401); - клітини, які продукують як мінімум ТМЕ-с та інший цитокін (1-2, СО401., ТЕМ-у).

І.3.5.3. Аналіз імуногенності

Аналіз імуногенності базується на загальній вакцинованій когорті. Для кожної групи лікування були обчислені наступні параметри (з 95 95 довірчим інтервалом): - Середнє геометричне значення титрів (СМТ) антитіл НІ та М1 на 0 та 21-й день. - Середнє геометричне значення титрів (МТ) нейтралізуючих антитіл в 0 та 21-й день. - Фактори конверсії на 21-й день. - Показники сероконверсії (53) на 21-й день визначені як відсоток вакцинованих людей, у яких спостерігали збільшення титрів НІ сироватки як мінімум на 4 порядки на 21-й день в порівнянні з днем 0. - Показники серозахисту на 21-й день визначені як відсоток вакцинованих людей з титром Ні сироватки - 1:40. - Зустрічальність Т-лімфоцитів СО4/СО08, що виділяються в реакції, була підсумована (описувальна статистика) для кожної групи вакцинації, в кожній точці часу (день 0, день 21) і для кожного антигену (пептидний грип (рі), розщеплений грип (57) і суцільний грип (УМ)). - Описувальна статистика індивідуальної різниці між точками часу (після-до) відповідає кожній групі вакцинації та кожному антигену (рії, 51 та м/ї) в кожних 5 різних випробуваннях. - Непараметричнє випробування (випробування Крускалля-Уолліса (КгизкКаї!-Умаїїїв|) застосовували з метою порівняння відмінності розташування між З групами, а статистичне р-значення обчислювали для кожного антигену в кожних 5 різних випробуваннях. Всі випробування, що демонструють двохсторонні значення Р«:0,05, вважалися статистично значущими.

Приклад ІІ - Одержання ліпосомального ад'юванту МРІ /2521

ІІ. З Одержання рідкої суспензії МР.

Рідку масу МРГ. (скорочення для 30-МРІ, тобто ліпід А 3-О-дезацильованого монофосфорилу, використане в даному документі) готують з ліофілізованого порошку 30О-МР'І.. Рідка маса МРГ. являє собою стабільну концентровану (приблизно 1 мг/мл) водну дисперсію сировини, готової для використання в рецептурі вакцини або ад'ювантній рецептурі. Схематичне представлення способу одержання наведене на фіг. 1.

Для максимального розміру партії 12 г одержання рідкої маси МРІ проводять в стерильних скляних контейнерах. Диспергування МРІ. складається з наступних стадій: - суспендування порошку МРІ. у воді для ін'єкцій; - дизагрегація будь-яких великих агрегатів шляхом нагрівання (термальна обробка); - зменшення розміру частинок з 100 нм до 200 нм за допомогою мікророзрідження; - попередня фільтрація на попередньому фільтрі Запосієап з розміром отворів 0,8/0,65 мкм; - стерильна фільтрація при кімнатній температурі (Запобгап Р з розміром отворів 0,22 мкм).

Порошок МРІ. ліофілізували за допомогою мікророзрідження, що в результаті дає стабільну колоїдну дисперсію у воді (частинки МРІ з розміром, прийнятним для стерильної фільтрації).

Ліофілізований порошок МРІ диспергують у воді для ін'єкцій з метою одержання 10 мг/мл необробленої суспензії. Далі суспензію піддають тепловій обробці, постійно перемішуючи. Після охолоджування до кімнатної температури, починають процес мікророзрідження з метою зменшення розміру частинок. Мікророзрідження проводять із застосуванням апарату М11ОЕН Місгойнпідіс5, в якому дисперсія безперервно циркулює крізь камеру взаємодії мікророзрідження, при певному тиску для мінімальної кількості проходжень (кількість циклів: Птіп). Гривалість мікророзрідження, яка представляє кількість циклів, обчислюють на основі виміряної швидкості потоку та об'єму дисперсії.

На даному обладнанні при даному тиску швидкість потоку, що одержують в результаті, може змінюватися від однієї камери взаємодії до іншої і протягом життєвого циклу для конкретної камери взаємодії. В даному прикладі застосовують камеру взаємодії типу Е20У Місгойнчідіс5. Оскільки ефективність мікророзрідження пов'язана з парою показників "тиск - швидкість потоку", тривалість обробки може змінюватися від однієї партії до іншої. Необхідну тривалість 1 циклу обчислюють на базі швидкості потоку. Швидкість потоку, яка розглядається, являє собою швидкість потоку, Виміряну з використанням води для ін'єкції безпосередньо перед введенням МРі в апарат. Один цикл визначають як час (у хвилинах), необхідний для того, щоб повний об'єм МРІ. пройшов через апарат один раз. Час, необхідний для проходження п циклів обчислюють наступним чином: п х кількість МРІ. для обробки (мл) / швидкість потоку (мл/хв)

Таким чином, відповідно пристосовують кількість циклів. Мінімальна кількість циклів для виконання (птіп) описана для переважного обладнання і камер взаємодії, які використовують. Загальну кількість циклів для обігу визначають в результаті вимірювання розміру частинок, що виконують після циклів

Птіп. Ліміт (діт) розміру частинок визначають на базі історичних даних. Вимірювання проводять за допомогою техніки спектроскопії фотонної кореляції (РС5), а діт виражають як одномодальний результат (7амегаде). При даному ліміті мікророзрідження може бути зупинено після Птіп циклів. Вище даного ліміту мікророзрідження продовжується до тих пір, поки не одержують задовільне зменшення розміру, як максимум ще 50 циклів.

Якщо фільтрація не відбувається негайно після мікророзрідження, то диспергованний МРІ. зберігають при температурі від 42 до 8 "С в очікуванні його перенесення на ділянку фільтрації.

Після мікророзрідження дисперсію розбавляють водою для ін'єкцій і фільтрують в асептичних умовах крізь фільтр з розміром отворів 0,22 мкм в ламінарному потоці. Кінцева концентрація МРІ. становить 1 мг/мл (0,80-1,20 мг/мл). 1.2 Одержання ліпосомального ад'юванту МРІ/0521

Даний ад'ювант, названий АБО, містить ЗО-МРІ. та 2521 в погашеній формі з холестерином, він був одержаний, як описано у М/О 96/33739, включеному шляхом посилання в даний опис. Зокрема, ад'ювант АБЗОЇ1 був в основному виготовлений як Приклад 1.1 у М/О 96/33739. Ад'ювант АБО1В містить: ліпосоми, які, в свою чергу, складаються з діолеоїлфосфатідилхоліну (ПОРС), холестерину та ЗО МР.

ЇУ кількості 1000 мкг СОРС, 250 мкг холестерину та 50 мкг З30О-МРІ, кожне значення наведено приблизно на дозу вакцини), 521 |50 мкг на дозу), фосфатного масі буферу та води, доведеної до об'єму 0,5 мл.

Ад'ювант АБЗО1ТЕ містить такі ж інгредієнти, як і АБО1В, але в нижчій концентрації в кількості 500 мкг роОРС, 125 мкг холестерину, 25 мкг ЗО-МРІ та 25 мкг 0521, фосфатного Масі буферу та води, доведеної до об'єму 0,5 мл.

В процесі продукування ліпосом, що містять МРІ, в етанолі розчиняють РоОРС (діолеоїлфосфатідилхолін), холестерин і МРІ При випаровуванні розчинника під вакуумом утворюється ліпідна плівка. Додають сольовий розчин фосфатного буферу (ЗУ мМ МагНРО», 41 мм

КН2РО», 100 мМ Масі) при рн 6,1, а суміш піддають попередній гомогенізації, після якої проводять гомогенізацію високим тиском при 15000 фунт/дюйм? (приблизно 15-20 циклів). Вказаний процес приводить до продукування ліпосом, які стерильно фільтрують крізь фільтр з розміром отворів 0,22 мкм в асептичних (клас 100) умовах. Стерильний продукт потім розподіляють в стерильні скляні контейнери та зберігають в холодній кімнаті (від 42 до 8 "С).

Продуковані таким способом ліпосоми містять у мембрані МРІ. ("МРІ. у варіанті" УМО 96/33739).

О521 додають у водний розчин та доводять до бажаної концентрації.

Приклад ПІ - доклінічна оцінка ад'ювантної та неад'гавантної вакцини проти грипу на тхорах.

Ш.1. Обгрунтування та цілі

Інфекція грипу на моделі тхорів приблизно імітує грип у людей, стосовно як чутливості до інфекції, так і клінічної реакції.

Тхір є твариною, надзвичайно чутливою до інфікування вірусами як грипу А, так і грипу В без попередньої адаптації вірусних штамів. Таким чином, дана тварина є чудовою зразковою системою для досліджень захисту, що надають вакцини, які вводять проти грипу. Дане вивчення досліджувало ефективність різних треохвалентних розщеплених ад'ювантнмх або неад'ювантних вакцин з метою зменшення симптомів захворювання (температури тіла) та поширення вірусу в носових секреціях тхорів, яким проводили провакційну пробу гомологічними штамами.

Завдання даного експерименту мала на меті продемонструвати ефективність ад'ювантної вакцини проти грипу в порівнянні з простою (неад'ювантною) вакциною.

Кінцеві точки дослідження складали: 1) Первинна кінцева точка: зменшення поширення вірусу в назальних змивах після гомологічної провакційної проби; 2) Вторинні кінцеві точки: аналіз гуморальної реакції титрів НІ. 1.2. Дизайн експерименту

ІІ.2.1. Лікування/група (табл. 1)

Самок тхорів (Мизхієїа ршогіив Тиго) у віці 14-20 тижнів доставили з розплідника МІЗАМ (Гемпшир,

Великобританія). На день 0 тхорам почали вводити гетеросубтиповий штам НІМ1 А/5(осКПоЇт/24/90 (4 Год ТСІОво/мл). На 21 день тхорам вводили внутрішньом'язову ін'єкцію повної дози для людини (500 мкг дози вакцини, 15 мкг НА/ штам) комбінації НІМ1 А/Мем/ СаІедопіа/20/99, НЗМ2 А/Рапата/2007/99 і

В/5папдаопад/7/97. Далі на 42 день тхорам проводили провакційну пробу шляхом інтраназального введення гетеросубтипового штаму НЗМ2 АЛ/уОотіпд/3/2003 (4,5 І од ТСІО5оО/мл).

Таблиця 1

Коментарі дозування дозування що провокаційна

1111111111111проб77 | | 77777777

Повна доза для Початок введення

Трьохвалентний і й НІМІ 1 й людини: 15 мкг |В/м; день 21 І/н простий НА/штам (А/5осКОЇт/24/90), день (9) - Початок введення

Трьохвалентний / | Повна доза для НІМ 2 МРІ-О521 у людини: 15 мкг |В/м; день 21 І/н піпосомах НА/штам (М Віоскотуга/ во); день 6 тхорів/група. Ін/П - Індивідуальний/пул

ІІ.2.2. Одержання рецептур вакцини (табл. 2)

Рецептура 1: Трьохвалентна розщеплена проста (неад'ювантна) рецептура: До води для ін'єкцій додають розчин фосфатного буферу, концентрований на 10 порядків (рН 7.4 при концентрації на один порядок), а також суміш, що містить Твін 80, Тритон Х-100 і МЕ5 (в кількості, беручи до уваги детергенти, присутні в штамах). Після перемішування протягом 5 хвилин додають 15 мкг кожного з штамів НІМІ, НЗМ2 та 17,5 мкг штаму В, перемішуючи протягом 10 хвилин між кожними додаваннями.

Рецептуру перемішують протягом як мінімум 15 хвилин і зберігають при 4 "С, якщо не вводять безпосередньо.

Рецептура 2: Трьохвалентна розщеплена ад'ювантна вакцина проти грипу з МРІ/О521 в ліпосомах:

До води для ін'єкції додають розчин фосфатного буферу, концентрований на 10 порядків (рН 7,4 при концентрації на один порядок), а також суміш, що містить Твін 80, Тритон Х-100 і МЕЗ (в кількості, беручи до уваги детергенти, присутні в штамах). Після перемішування протягом 5 хвилин додають 15 мкг кожного з штамів НІМІ, НЗМІ2 та 17,5 мкг штаму В, перемішуючи протягом 10 хвилин між кожними додаваннями. Рецептуру перемішують протягом 15 хвилин. Додають попередньо одержану суміш так називаного 0О521-МРІїп до рецептури, а потім перемішують протягом як мінімум 15 хвилин.

Попередньо одержану суміш 0О521-МРІ п являє собою суміш ліпосом (одержану з ПООРС 40 мг/мл, холестерину 10 мг/мл, МРІ 2 мг/мл) та імуностимулятор 0521. Дану попередню суміш інкубують протягом як мінімум 15 хвилин до того, як додати її до трьохвалентної розщепленої суміші.

Концентрація МРІ. та 0521 в кінцевій рецептурі складає 50 мкг на 500 мкл. Рецептуру зберігають при 4 "С, якщо не вводять безпосередньо.

Примітка: В кожну рецептуру додають розчин фосфатного буферу, концентрований на 10 порядків, з метою досягнення ізотонічності, і він концентрований на 1 порядок в кінцевому об'ємі.

Об'єм Н2О обчислюють з метою досягнення цільового об'єму.

Таблиця 2

Кінцева композиція рецептур 1 та 2 (рецептури, приготовлені з розщепленими штамами (для 500 мкл) . Тритон

НІМ: 15 мкг 1 НЗМ2:15 мкг |375 мкг! 55 мкг / 50 мкг

В: 17,5 мкг

НІМ: 15 мкг 2 НЗМ2:15 мкг |375 мкг! 55 мкг / 50 мкг 1 мг 250 мкг | 50 мкг | 50 мкг

В: 17,5 мкг

ПІ.2.3. Зчитування (табл. 3)

Таблиця З провакційної проби анти-НІ шо, випробування на . імунізації, після сироватки 2. - антитіла (титри НІ) роди інгібування гемаглютинації провакційної проби

ПІ.3. Результати

Схематичне представлення результатів наведене на фіг. 1 та 2.

ПІ.3.1. Гуморальний імунітет (фіг. 1). Активність інгібування гемаглютинації проти штамів вакцини

НЗМ2 (штам вакцини А/Рапата/2007/99 та штам провакційної проби АЛЛ/уотіпа/3/2003) була знайдена в сироватках 6 тварин на групу на 17-й день після початку інтраназального гетерологічного введення на 21-й день після імунізації та на 13-й день після проведення провакційної проби.

Титри антитіл анти-гемаглютиніну трьох штамів вірусу грипу визначали, застосовуючи випробування на інгібування гемаглютинації (НІ), як детально описано в прикладі 1.2.1. Зроблені наступні висновки: - Для двох штамів А/НЗМІ2 ії для всіх груп спостерігали активацію титрів НІ у всіх вакцинованих групах після імунізації. - Після імунізації вакциною А/Рапата/2007/99 спостерігали статистично значущі більш високі титри

НІ анти-А/Рапата/2007/99, коли трьохвалентна розщеплена вакцина є ад'ювантною з МРІ/О521 в ліпосомах в порівнянні з трьохвалентною розщепленою простою вакциною. - Після імунізації вакциною А/Рапата/2007/99 трьохвалєнтна розщеплена ад'ювантна вакцина з

МРІ/О521 в ліпосомах могла істотно підвищувати титри Ні до гетерологичного штаму

АЛМуотіпа/3/2003 (перехресна реактивність до проведення провакційної проби даним мінливим штамом). - Після проведення провакційної проби вакциною АЛЛуотіпд/3/2003 спостерігали значуще зростання титрів НІ анти-АЛ/ууотіпад/3/2003 як для трьохвалентної розщепленої простої вакцини, так і для трьохвалентної розщепленої ад'ювантної вакцини з МРІ /2521 в ліпосомах. - Для штамів А/Мем/ СаІедопіа/20/99 та В/Зпапддопод/7/97 спостерігали статистично значущі більш високі титри НІ, коли трьохвалєнтна розщеплена вакцина є ад'ювантною з МРІ/0521 в ліпосомах в порівнянні з трьеохвалентною розщепленою простою вакциною. 1.3.2. Поширення вірусу (фіг. 3).

Вірусне титрування назальних змивів проводили 6 тваринам на групу, як описано в деталях у прикладі І.2.3. Назальні змиви виконували шляхом введення 5 мл розчину фосфатного буферу в обидві ніздрі пробуджених тваринам. Інокуляцію збирали в чашки Петрі та розміщували в контейнери для зразків при температурі -80 "С. - Два дні після проведення провакційної проби спостерігали статистично значуще зниження поширення вірусу при введенні трьохвалентної розщепленої ад'ювантної вакцини з МРІГ/2521 в ліпосомах в порівнянні з трьохвалентною розщепленою простою вакциною. - На 49-й день: (7 днів після проведення провакційної проби) в назальних змивах не було знайдено ніяких вірусів. 1.3.3. Результати експерименту

Спостерігали більші гуморальні реакції (титрів НІ) при введенні трьохвалентної розщепленої ад'ювантної вакцини з МРІ /20521 в ліпосомах в порівнянні з трьеохвалентною розщепленою простою вакциною для всіх 4 штамів.

Після імунізації вакциною А/Рапата/2007/99 тільки трьоохвалентної розщепленої ад'ювантної вакцини з МРІ/9521 в ліпосомах змогла істотно збільшити титри Ні на гетерологічний штам

АЛМуотіпа/3/2003 (перехресна реактивність до проведення провакційної проби даним штамом).

МРІ/2521 в ліпосомальних рецептурах виявився ефективним при перевірки захисної ефективності у тхорів (зниження поширення вірусу після проведення гетерологічної провакційної проби). Як виявлено, спостережувана перехресна реакція після імунізації трьохвалентною розщепленою вакциною з МРІ/2521 в ліпосомах проти мінливого штаму, що застосовували для проведення провакційної проби, корелювала з захисним ефектом, який спостерігали у тхорів.

Приклад ІМ - доклінічну оцінка ад'ювантної та неад'ювантної вакцини проти грипу в наївних і основних мишах С57ВІ/6.

ІМ.1. Дизайн та завдання експерименту

Для даного експерименту використовували мишей С57ВІ/6 з гетерологічними штамами.

Метою даного експерименту було порівняння гуморальної (титри Ні) та СМІ (ІС5, внутрішньоклітинне забарвлення цитокіну) імунних реакцій, індукованих комерційно доступною трьохвалентною розщепленою вакциною (РіІшйагіх"м) (зІахоЗтййпКіІпе проти трьохвалентної субодиничної вакцини (вакцина СпПігоп, Адгірра!"М), а також реакції СМІ, одержаної з вказаними вакцинами, ад'ювантними з ліпосомами, що містять тільки ЗО-МР',, тільки 00521 (0521 в ліпосомах, тобто знешкоджений 0521) або МРІ/0521 в ліпосомах. У прикладі, наведеному нижче в даному описі, рецептури готували, починаючи з розщеплення мономаси з метою досягнення однакового складу, як і у вакцині Ріцагіх, а не з комерційно доступних доз Ріцагіх. Одержані рецептури були названі "РіІчагіх подібні".

ІМ.1.1. Лікування/групи

Самок мишей С57ВІ/6 віком 6-8 тижнів привезли з Нагіап Ногеї, Голандія. На день 0 мишей почали вакцинувати гетеросубтиповими штамами (5 мкг суцільний інактивований гемаглютинін Нім!

А/Веїіпд/262/95, НЗМ2 А/Рапата/2007/99, В/5папдаопд/7/97). На 28-й день мишам вводили внутрішньом'язову ін'єкцію 1,5 мкг трьеохвалентної розщепленої вакцини НА (А/Мем/ СаІедопіа/20/99,

АЛМуотіпа/3/2003, В//Лапд5зи/10/2003) простої або ад'ювантної (див. групи в таблицях 4-6 нижче).

Таблиця 4 (неад'ювантна) - Рішйагіх подібна містить ліпосоми ліпосомах лі - 6 дви ин М ЛМтть | Початостетеролочного введення 0 з ня пнескттнюеютьшеньсо ліпосомах 79 ЇРВ5 77771717 |Початоктетерологічного введення ОО " РІцагіх подібні. 16 мишей/група

ІМ.1.2. Одержання рецептур вакцин

Рецептура для групи 1:

До води для ін'єкцій додають розчин фосфатного буферу, концентрований на 10 порядків (рН 7.4 при концентрації на один порядок), а також суміш, що містить Твін 80, Тритон Х-100 і МЕЗ (в кількості, беручи до уваги детергенти, присутні в штамах). Після перемішування протягом 5 хвилин додають 15 мкг кожного з штамів НІМІ, НЗМО2 та 15 мкг штаму В, перемішуючи протягом 10 хвилин між кожними додаваннями. Рецептуру перемішують протягом як мінімум 15 хвилин і зберігають при 4 "С, якщо не вводять безпосередньо.

Рецептура для групи 2:

До води для ін'єкцій додають розчин фосфатного буферу, концентрований на 10 порядків (рН 7,4 при концентрації на один порядок), а також суміш, що містить Твін 80, Тритон Х-100 і МЕЗ (в кількості, беручи до уваги детергенти, присутні в штамах). Після перемішування протягом 5 хвилин додають 15 мкг кожного з штамів НІМІ, НЗМО2 та 15 мкг штаму В, перемішуючи протягом 10 хвилин між кожними додаваннями. Рецептуру перемішують протягом 15 хвилин. Додають концентровані ліпосоми, що містять З30О-МРІ. (одержаний з СОРС 40 мг/мл, холестерину 10 мг/мл, ЗО-МРІ 2 мг/мл), з метою досягнення кінцевої концентрації МРІ. 50 мкг на дозу. Рецептуру перемішують протягом як мінімум 15 хвилин і зберігають при 4 "С, якщо не вводять безпосередньо.

Рецептура для групи 3:

До води для ін'єкцій додають розчин фосфатного буферу, концентрований на 10 порядків (рН 7,4 при концентрації на один порядок), а також суміш, що містить Твін 80, Тритон Х-100 і МЕЗ (в кількості, беручи до уваги детергенти, присутні в штамах). Після перемішування протягом 5 хвилин додають 15 мкг кожного з штамів НІМІ, НЗМ2 та 15 мкг штаму В, перемішуючи протягом 10 хвилин між кожним додаванням. Рецептуру перемішують протягом 15 хвилин Додають попередню суміш ліпосом (одержану з ООРС 40 мг/мл, холестерину 10 мг/мл) та 0521, називаного "00521", з метою досягнення концентрації 0521 50 мкг на дозу. Дану попередню суміш інкубують протягом як мінімум 15 хвилин до того, як додати її до трьохвалентної розщепленої суміші. Рецептуру перемішують протягом як мінімум хвилин і зберігають при 4 "С, якщо не вводять безпосередньо.

Рецептура для групи 4:

До води для ін'єкцій додають розчин фосфатного буферу, концентрований на 10 порядків (рН 7,4 при концентрації на один порядок), а також суміш, що містить Твін 80, Тритон Х-100 і МЕЗ (в кількості, беручи до уваги детергенти, присутні в штамах). Після перемішування протягом 5 хвилин додають 15 мкг кожного з штамів НІМІ, НЗМО2 та 15 мкг штаму В, перемішуючи протягом 10 хвилин між кожними додаваннями. Рецептуру перемішують протягом 15 хвилин. Додають суміш ліпосом, що містять 30-

МРІ (одержаний з СОРС 40 мг/мл, холестерину 10 мг/мл, ЗО-МРІ 2 мг/мл) та 92521 з метою досягнення концентрацій 0521 та МРІ. 50 мкг на дозу. Дану суміш інкубують протягом як мінімум 15 хвилин до того, як додати її до трьохвалєнтної розщепленої суміші. Так названу рецептуру

"трьеохвалентний розщеплений МРІ /2521 в ліпосомах" перемішують як мінімум 15 хвилин і зберігають при 4 "С, якщо не вводять безпосередньо.

Примітка: В групах 1-4 додають розчин фосфатного буферу, концентрований на 10 порядків, з метою досягнення ізотонічності, і він концентрований на 1 порядок в кінцевому об'ємі. Об'єм НгОо обчислюють з метою досягнення цільового об'єму.

Рецептура для групи 5:

Одну дозу Аддгіраї"М змішують з рівним розчину фосфатного буферу з рН 7,4. Рецептуру перемішують протягом як мінімум 15 хвилин і зберігають при 4 "С, якщо не вводять безпосередньо.

Рецептура для групи 6:

Змішують розчин фосфатного буферу рн 7,4 та одну дозу Адагіра! М. Потім додають ліпосоми, що містять ЗО-МРІ. (одержаний з СОРС 40 мг/мл, холестерину 10 мг/мл, З30О-МРІ 2 мг/мл), перемішуючи, з метою досягнення еквіваленту 50 мкг МРІ. на дозу. Рецептуру перемішують протягом як мінімум 15 хвилин і зберігають при 4 "С, якщо не вводять безпосередньо.

Примітка: Розчин фосфатного буферу додають з метою досягнення ізотонічності в кінцевому об'ємі. Аддгіра! складає половину об'єму рецептури.

Рецептура для групи 7:

Змішують розчин фосфатного буферу рН 7,4 та одну дозу Аддгіра! М. Потім додають попередню суміш ліпосом (одержану з ОРС 40 мг/мл, холестерину 10 мг/мл) та 0521, так називаного "СО521", перемішуючи, з метою досягнення еквіваленту 50 мкг 0521. Дану попередню суміш інкубують протягом як мінімум 15 хвилин до того, як її додати. Рецептуру перемішують протягом як мінімум 15 хвилин і зберігають при 4 "С, якщо не вводять безпосередньо.

Примітка: Розчин фосфатного буферу додають з метою досягнення ізотонічності в кінцевому об'ємі. Аддгіра! складає половину об'єму рецептури.

Рецептура для групи 8:

Змішують розчин фосфатного буферу рН 7,4 та одну дозу Аддгіра!"М. До рецептури додають попередню суміш, так називану "00521-МРГ іп", перемішуючи її. Попередня суміш 0О521-МРІ іп являє собою суміш ліпосом (одержану з ООРС 40 мг/мл, холестерину 10 мг/мл, МРІ 2 мг/мл) та імуностимулятор 0521. Дану попередню суміш інкубують протягом як мінімум 15 хвилин до того, як її додають до суміші Аддгіра/розчин фосфатного буферу. Кількість МРІ. та О521 в рецептурі складає 50 мкг кожен. Рецептуру перемішують протягом як мінімум 15 хвилин і зберігають при 4 "С, якщо не вводять безпосередньо.

Примітка: Розчин фосфатного буферу додають з метою досягнення ізотонічності в кінцевому об'ємі. Аддгіра! складає половину об'єму рецептури.

Таблиця 5

Кінцева композиція рецептур 1-4, приготованих з розщепленими штамами (для 1 мл)

НІМ: 15 мкг 1 НЗМ2: 15 мкг 750 мкг 110 мкг /100 мкг

В: 17,5 мкг 2 (ідентичний! ідентичний 1| 110 мкг МО мкг/ Ямг | 250мк |50мк/ -

З (ідентичний! ідентичний 1| 110 мкг МО мкг/ Ямг | 250мкг | - )/ 5Омк

Таблиця 6

Кінцева композиція рецептур 5-8, приготованих з вакциною Аддгіра! М (1 мл) |ІдозавакцинмАсдйра! |. - ЇЇ Її 6 дентичний5д 1777 їм | 250мег | 5бмже | - 07 Цідентичний5ї///////// 1777 їмг | 250мг | -- | 5б0мк 8 |ідентичний5 | їмг | 250мке | 5бмкг | 5б0мк

ЇМ. 1.3. Зчитування (табл. 7)

Таблиця 7 й 21-й день після с,

Анти-НІ антитіла (титри НІ) й ом сироватки інгібування імунізації (49 день) ш гемаглютинації бра, СОВ8, 11 -2, ІЕМ-у (РАС) РВІ. п забарвлення (35 день) й итокін

Ін/Ф - Індивідуальний/пул

ІМ.2. Результати

ІМ.2.1. Гуморальна реакція (титрів НІ через 21 день після імунізації).

Гуморальні реакції за титрами НІ - фіг. 4.

Виявили активність інгібування гемаглютинації проти трьох штамів вакцини (А/Мем/

СаІедопіа/20/99, АЛМуотіпа/3/2003, В/іапдзи/10/2003) в сироватках 8 тварин на групу на 21-й день після імунізації. - В порівнянні з мишами, імунізованими розчином фосфатного буферу, спостерігали підвищення в титрах НІ після імунізації з всіма вакцинами-кандидатами проти грипу, перевіреними на всі три штами (трьохвалентна розщеплена вакцина або трьохвалентна субодинична вакцина). - Для всіх трьох штамів спостерігали статистично значущі більш високі титри НІ у мишей, імунізованих трьеохвалентною розщепленою вакциною, ад'ювантною з тільки 0О521 або МРІ/0521 в ліпосомах, в порівнянні з мишами, імунізованими трьохвалентною розщепленою вакциною Ріи простою або ад'ювантною з ліпосомами, що містять тільки 30О-МРІ. Ранжування для гуморальної реакції було наступним: (МРІ /2521 в ліпосомах - тільки 0О521) » (Ліпосоми, що містять тільки 30-

МРІ. - проста вакцина) » розчин фосфатного буферу. - Для всіх трьох штамів спостерігали статистично значущі більш високі титри НІ у мишей, імунізованих трьохвалентною субодиницею, ад'ювантною з тільки 0О521, ліпосомами, що містять тільки ЗО-МРІ або МРІ/О521 в ліпосомах, в порівнянні з мишами, імунізованими трьеохвалентною розщепленою простою вакциною. Ранжування для гуморальної реакції було наступним: (МРІ/2521 в ліпосомах - тільки 0БО5Б21 - ліпосоми, що містять тільки ЗО-МРІ) » проста вакцина » розчин фосфатного буферу. - Трьоохвалентна розщеплена вакцина та трьоохвалентна субодиниця індукували подібні титри НІ, коли рецептури були неад'ювантними або ад'ювантними з тільки 0О521 або МРІ/9521 в ліпосомах.

ІМ.2.2. Клітинно-опосередкована імунна реакція (ІС5 на 7 день після імунізації).

Реакції клітини СО4 Т - Фігура 5

РВМСОС 8 мишей на групу збирали на 7-й день після імунізації та перевіряли в 4 пулах по 2 миші/групу.

В умовах всієї кількості Т-клітин СО4-ж, специфічних по відношенню до вакцини Рій з суцільної вірусу (експрєсують ІІ--2, ІЕМ-у та обидва цитокіни): - Незалежно від рецептури, спостерігали ідентичні реакції СО4- Т-клітин для трьохвалентної розщепленої вакцини і трьохвалентної субодиничної вакцини. - Спостерігали більш виражені реакції СО4.- Т-клітин для трьохвалентних рецептур (розщепленої або субодиничної), з ад'ювантом МРІ/О521 в ліпосомах в порівнянні з трьохвалентними рецептурами (розщепленими або субодиничними) простими або з ад'ювантом у вигляді ліпосом, що містять тільки

З0О-МРІ або тільки 0О521. - Для клітинної реакції, індукованої трьохвалентною рецептурою (розщепленою або субодиничною) існує синергічний ефект ліпосом, ще містять З0О-МРІ 400521, в порівнянні з окремо роз21 або ліпосомами. що містять тільки 3О-МРІ. - Ранжування для клітинної реакції було наступним: МРІ /9521 в ліпосомах » (ліпосоми, що містять тільки 3ЗО-МРІ, - тільки 09521 - проста - розчин фосфатного буферу).

ІМ.3. Підсумок результатів і висновки - Для всіх трьох штамів спостерігали статистично значущі більш високі титри НІ у мишей, імунізованих трьохвалентними рецептурами (розщепленими або субодиничними), ад'ювантними з тільки 009521 або МРІ/9521 в ліпосомах, в порівнянні з мишами, імунізованими простими трьохвалентними рецептурами (розщепленими або субодиничними). Очевидно, ліпосоми, що містять тільки З30О-МРІ, індукують більш виражені гуморальні реакції при їх комбінації з треохвалентною субодиничною, ніж з трьеохвалентною розщепленою вакциною. - Незалежно від рецептури, одержані подібні реакції СО4- Т-клітин для трьохвалентної розщепленої вакцини (Рінчагіх) і трьохвалентної субодиничної вакцини (АдгірраїЇ). - Трьохвалентні рецептури (розщеплені або субодиничні), з ад'ювантом МРІ/0521 в ліпосомах, індукували більш виражені реакції СО4- Т-клітин в порівнянні з трьохвалентними рецептурами (розщепленими або субодиничними) простими або з ад'ювантом у вигляді ліпосом, що містять тільки

З30-МРІ. або 0521 тільки (00521) в ліпосомах.

Приклад М. Доклінічне порівняння вакцина, що містить препарат розщепленого антигену грипу з ад'ювантом З0О-МРІ /0521 в ліпосомальній рецептурі (3О-МРІ. в двох різних концентраціях)

М.1. - миші.

М.1.1. Дизайн та мета експерименту.

Для даного експерименту використовували мишей С57В1/6, яким спочатку ввели гетерологічні штами. Метою даного експерименту було проаналізувати гуморальні імунні реакції (титри НІ) та СМІ (ІС5, внутрішньоклітинне забарвлення цитокіну), індуковані комерційно доступною трьохвалентною розщепленою вакциною (Рінцагіх"М) (зІахозтіййКіІїпе в неад'ювантній формі та з ад'ювантом у вигляді ліпосом, що містять дві різні концентрації ЗО-МРІ. та 0521.

М.1.2 Лікування/Група

Самок мишей С57ВІ/6 віком 8 тижнів привезли з Нагіап Ногеї, Голандія.

В день 0 почали вакцинацію мишей інтраназально гетеросубтиповими штамами (суцільним інактивованим А/Веїпод/262/95, НЗМ2 А/Рапата/2007/99, В/Зпапаопа/7/97). На 28-й день мишам здійснювали внутрішньом'язову ін'єкцію трьохвалентної розщепленої вакцини (А/Мем/ СаїІедопіа,

АЛЛуотіпо, В/діапд5и) простої або з двома різними концентраціями ад'юванту у вигляді імуностимуляторів в ліпосомальних рецептурах (див. групи в таблиці 8 нижче).

Таблиця 8

Трьохвалентна Початок гетерологічного введення 1 розщеплена Рін-1,5 проста ро, суцільний інактивований 5 мкг/20 мкг/штам/ 50 мкл мкл інтраназально

Трьохвалентна ліпосоми, що містять | Початок гетерологічного введення 2 розщеплена РіІши-1,5 мкг ЗО-МРІ. 50 мкгна 0,5 |00О, суцільний інактивований 5 мкг/20 /штам/50 мкл мл дози мкл інтраназально оз удшдеи вжите рон

З розщеплена Рін-1,5 ро, суцільний інактивований 5 мкг/20 мл дози . мкг/штам/50 мкл мкл інтраназально

Трьохвалентна МРІ. та О521 25 мкгна Початок гетерологічного введення 4 розщеплена Рін-1,5 05 МЛ ро, суцільний інактивований 5 мкг/20 ,; дози . мкг/штам/50 мкл мкл інтраназально оз ШЕ ми рин» розщеплена Рін-1,5 ро, суцільний інактивований 5 мкг/20 0,5 мл дози й мкг/штам/50 мкл мкл інтраназально

Розчин фосфатного Початок гетєрологічного введення ро, суцільний інактивований 5 мк/20 буферу мкл інтраназально

Рецептури приготовані як у прикладі ІМ.

М.1.3 Результати.

Гуморальні реакції за титрами НІ - фіг. 24.

Виявили активність інгібування гемаглютинації проти трьох штамів вакцини в сироватках 9 тварин на групу на 21-й день після імунізації. - В порівнянні з мишами, імунізованими розчином фосфатного буферу, спостерігали підвищення титрів НІ після імунізації всіма кандидатами вакцини проти грипу, перевіреними на всі три штами. - Для всіх трьох штамів спостерігали статистично значущі більш високі титри НІ у мишей, імунізованих трьеохвалентною розщепленою вакциною, з ад'ювантом та 0521 в будь-якій концентрації, в порівнянні з мишами, імунізованими трьохвалентною простою розщепленою вакциною Ріи (максимальне р-значення - 0,03). - Не спостерігали статистично значущої різниці між двома ліпосомальними ад'ювантними групами.

Клітинно-опосередкована імунна реакція (ІС5 на 7-й день після імунізації), - фіг. 25.

РВМСОС 9 мишей на групу збирали на 7-й день після імунізації та перевіряли в 3 пулах по 3 миші/групу.

В умовах всієї кількості Т-клітин СО4ж, специфічних по відношенню до вакцини Рій з суцільним вірусом (експресують ІІ--2, ІРМ-у та обидва цитокіни):

Як можна побачити на фіг. 25, найбільш виражені специфічні реакції у вигляді ІЕМ-у для СО4-- Т- клітин були одержані після імунізації трьеохвалентною розщепленою вакциною з ад'ювантом у вигляді найвищої концентрації імуностимуляторів. Однак, реакції Т-клітин ІЕМ-у у вигляді І/2 та І 2 були подібними для двох концентрацій імуностимуляторів.

Приклад МІ. Клінічне випробування в популяції людей похилого віку старше 65 років вакциною, що містить препарат з розщепленим антигеном грипу з ад'ювантом у вигляді МРІ /20521 в ліпосомальній рецептурі (3О-МРІ в двох різних концентраціях)

МІ.1. Дизайн і завдання дослідження

Відкрите, рандомізоване дослідження фази ІЛІ з метою демонстрації ефективності в умовах клітинно-опосередкованої імунної реакції вакцин - кандидатів проти грипу СіахозтійНКіїпе Віоіодісаїв5, що містять різні ад'юванти, які вводять популяції людей похилого віку (65 років і старше), в порівнянні з РіІпагіх "М (відомою як а-Кіх "м у Бельгії), яку вводять дорослим (віком 18-40 років).

Були сформовані чотири паралельні групи: - 75 дорослих осіб (віком 18-40 років) в одній контрольній групі, які одержували одну дозу Ріцагіх "М (Група Рівагіх). - 200 осіб похилого віку (65 років і старше) випадковим чином були розподілені в співвідношенні 3:32 на три групи: - одна група з 75 осіб, які одержують вакцину проти грипу, ад'ювантну з АБЗО1В; - одна група з 75 осіб, які одержують вакцину проти грипу з ад'ювантом АБОЇ1 Е; - контрольна група вакцини Рій з 50 осіб, які одержують одну дозу РіІмчагіх "М,

Первинне завдання

Головна мета - продемонструвати ефективність на 21-й день після вакцинації ад'ювантними вакцинами проти грипу, які вводять людям похилого віку (65 років і старше) в порівнянні з РіІчагіх"М, що вводять дорослим людям (віком 18-40 років) з точки зору зустрічальності Т-лімфоцитів СО4, специфічних для грипу, що продукують як мінімум два різних цитокіни (СО401І,, 1-2, ТМЕ-ос, ТЕМ-у).

Вторинні завдання

Вторинними завданнями є наступні: 1) Оцінка безпечності та реактогенності вакцинації ад'ювантними вакцинами-кандидатами проти грипу протягом 21 дня після внутрішньом'язового введення вакцини людям похилого віку (65 років і старше). РіІсагіх "М використовують як еталон. 2) Оцінка гуморальної імунної реакції (титр анти-гемаглютиніну) через 21, 90 та 180 днів після вакцинації ад'ювантними вакцинами-кандидатами проти грипу. Ріцагіх "М використовують як еталон.

Третинне завдання

Третинне завдання - оцінити клітинно-опосередковану імунну реакцію (продукування ІЕМ-у, ЇЇ -2,

СО40Ї та ТМЕ-о і реакцію В-лімфоцитів) через 21, 90 та 180 днів після вакцинації ад'ювантними вакцинами проти грипу. РіІцагіх М використовують як еталон.

МІ.2. Композиція вакцини та введення

Застосовують два різних ад'юванти: 1. Ад'ювант АБО1В на базі ліпосоми, що містить 50 мкг МРІ. та 0521. 2. АБО1Е рецептуру АБО1В, розведену на два порядки.

Контроль: повна доза РіІшцагіх "М внутрішньом'язово.

Всі вакцини призначені для внутрішньом'язового введення. Штами, використані в п'яти вакцинах, являють собою штами, рекомендовані Всесвітньою організацією охорони здоров'я на 2005-2006 рр. для сезону в північній півкулі, тобто А/Мем/ СаІедопіа/20/99 (НІМІ), А/Мем/ Могк/7/2004 (НЗМ2) та

В/Лапази/10/2003.

Три антигени інактивованого розщепленого віріону (одновалентний препарату у формі ін-балк), які використовувані в рецептурі ад'ювантної вакцини-кандидата проти грипу, є такими ж, як і активні інгредієнти, що використовують в рецептурі комерційно доступної інактивованої вакцини проти грипу

Еінагіх "м/а-Кіх 77--35К Віо з розщепленим віріоном. їх одержують з вірусів, вирощених в яйцях. Вказані штами грипу рекомендовані для сезону 2005/2006 рр., як застосовано в рецептурі комерційної

ЕІцагіх "м/а-Кіх М на 2005/2006 рр.

Штами, які використовують в трьох вакцинах, являють собою штами, рекомендовані Всесвітньою організацією охорони здоров'я на 2005-2006 рр. для сезону в північної півкулі, тобто - А/Мем СаІедопіа/20/99 (Н, М.) ІМА-116; - А/Мем Хотк/55/2004 (НЗМ2) МУМО Х-157; - ВЛЛапази/10/2003.

Подібно до Ріцагіх "М/а-Кіх "М ад'ювантна вакцина містить 15 мкг гемаглютиніну (НА) кожного штам вірусу грипу на дозу.

МІ.2.1. Опис серій ад'ювантної вакцини АЗО1В

Ад'ювантна вакцина-кандидат проти грипу АБОЇВ являє собою 2-хкомпонентну вакцину, що складається з концентрованих трьохвалентних інактивованих антигенів розщепленого віріону, вміщених до скляної ампули, та самої скляної ампули, що містить ад'ювант АБЗО1В. Під час ін'єкції вміст ампули з зд'ювантом витягають і вводять шляхом ін'єкції в пробірку, яка містить концентровані трьохвалентні інактивовані антигени розщепленого віріону. Після перемішування вміст набирають у шприц і заміняють голку на голку для внутрішньом'язового введення. Використовувану голку заміняють на голку для внутрішньом'язового введення і доводять об'єм до 1 мл. Одна доза відновленої ад'ювантної вакцини-кандидата проти грипу АБЗО1В відповідає 1 мл.

Ад'ювантна вакцина-кандидат проти типу АБО1В являє собою вакцину без консервантів.

МІ.2.2. Композиція ад'ювантної клінічної серії АБО1В

Одна доза відновленої ад'ювантної вакцини проти грипу АЗОЇВ відповідає 1 мл. Її склад наведений в табл. 8. Вона містить 15 мкг НА кожного штаму вірусу грипу, як і в зареєстрованій вакцині

ЕіІцагіх "М/а-КіхФф).

Таблиця 8

Склад (компоненти грипу та ад'юванту) відновленої ад'ювантної вакцини-кандидата проти грипу АБОТВ

Інактивованірозщепленівірібїниїд ОЇ 77777771 -Лпосоми 11111111 діолеїлфосфатидилхолін (ПОРС)

МІ.2.3. Спосіб виробництва серії ад'ювантної вакцини АбО1В

Виробництво ад'ювантної вакцини проти грипу АБО1В складається з трьох основних стадій: - Рецептура трьохвалентної кінцевої маси (концентрований 2 рази) без ад'юванту і заповнення контейнера з антигеном. - Одержання ад'юванту АБО1В. - Екстемпоральне розведення ад'ювантної розщепленої вакцини АЗО1В вірусу.

Рецептура трьохвалентного готового препарату у формі ін-балк без ад'юванту та заповнення контейнера з антигеном

Об'єми трьох одновалентних препаратів у формі ін-балк на базі вмісту НА, визначеного для кожного з одновалентних препаратів у формі ін-балк до виготовлення препарату та для цільового об'єму 1320 мл. У воді для ін'єкцій розбавляють концентрований сольовий розчин фосфатного буферу

РО» Ма/Ко (80 мкг/дозу) і попередньо виготовлену суміш Твіну 80, Тритону Х-100 та с- токоферилгідросуцинату. Далі три концентровані монопрепарати у формі ін-балк (А/Мем/

СаІєдопіа/20/99 ІМА-116, А/Мем/ Моїк/55/2004 МУМС Х-157, В/іапдзи/10/2003) вводять послідовно до кінцевого розчину, що складається з сольового розчину фосфатного буферу/Твіну 80-Тритону Х-100- розчину о-токоферилу гідросукцинату (рН 7,8, 81 мМ Масі, 1,56 мМ КСІ, 4,79 мМ МагНРО», 0,87 мМ

КНеРО», 7,2 мМ МангРО», 72.8 мМ К»НРО», 750 мкг/мл Твіну 80, 110 мкг/мл Тритону Х-100 та 100 мкг/мл а-токоферилгідросуцинату) з метою одержання кінцевої концентрації 30 мкг НА (НІТМ1 та НЗМ2) штамів на мл трьохвалентної кінцевої маси (15 мкг НА/штам А /500 мкл трьохвалентної кінцевої маси) та 35 мкг НА штаму В (17,5 мкг НА/ штам В /500 мкл кінцевого трьохзалентного препарату у формі ін- балк). Між додаванням кожного одновалентного препарату у формі ін-балк суміш перемішують протягом 10-30 хвилин при кімнатній температурі. Після додавання останнього одновалентного препарату у формі ін-балк та перемішування протягом 15-30 хвилин рН перевіряють та коригують до 7,65:0,25 за допомогою НСІ або Ммаон.

Кінцевим трьохвалентним препаратом антигенів у формі ін-балк заповняють в асептичних умовах стерильні скляні ампули типу І об'ємом З мл (Європ. Фарм.). Кожна ампула містить об'єм 600 мкл (500 мкл т 100 мкл вільного простору).

Одержання ад'юванту у формі ін-балк АБО1В та заповнення контейнера з ад'ювантом

Ад'ювант АБО1В готують шляхом перемішування двох компонентів: 0521 та ліпосом, що містять

МРІ. Нижче наведено:гпосіб одержання кожного з вказаних компонентів. 0521 являє собою тритерпеновий глікозид, одержаний з кори дерева Оціа|а заропагіа, виробництва компанії Адийа

Умогопезівег, МА, США (на цей час має назву Апіідепіс5). 521 постачають як ліофілізований порошок до О5К ВіоІодісаіє. Одержання 20521 в О5К Віо складається з суспендування порошку 0521 у воді для ін'єкцій в концентрації приблизно 5 мг/мл, корекції рН до рН 6,0-0,2 та стерильної фільтрації.

Рідку масу 0521 зберігають при -20" С в поліетиленових контейнерах.

МРІ являє собою ліпід А 3-О-деацил-4-монофосфорилу, одержаний послідовним гідролізом кислоти та основи ліпополісахариду з штаму Ке595 Заітопейа тіппезоїа. Його виробляє О5К

Віоіодісаі5, Гамільтон, Монтана. МРГ. у формі ін-балк та постачає як ліофілізовану сіль триетиламіну (ТЕА).

В процесі продукування ліпосом, що містять МРІ, СОРС (діолеїлфосфатідилхолін), холестерин та

МРГ. розчиняють в етанолі. Утворюють ліпідну плівку шляхом випарювання розчинника під вакуумом.

Додають сольовий розчин фосфатного буферу, що містить 9 мМ МагНРО», 41 мМ КНеРоО», 100 мм масі (рн 6,1), і суміш піддають попередній гомогенізації з наступною гомогенізацією під високим тиском в 15,000 фунт/дюйм: (-/- 20 циклів). Дана процедура приводить до продукування ліпосом, які стерильно фільтрують крізь фільтр з розміром отворів 0,22 мкм в асептичній (клас 100) зоні. Далі одержаний стерильний продукт вміщують до стерильних скляних контейнерів і зберігають в холодній кімнаті (2-8 "С).

Одержану стерильну масу ліпосом змішують із стерильним розчином ін-балк 0521. Після перемішування протягом 30 хвилин одержану суміш додають до суміші води для ін'єкцій та фосфату 500 мМ, масі 1М, рн 6,1 при розведенні в 10 разів. Кількість фосфату 500 мМ, Масі 1М (рн 6,1) при розведенні в 10 разів обчислюють з метою досягнення ізотонічності в кінцевому об'ємі. Перевіряють рН. Далі здійснюють стерильну фільтрацію ад'юванту (0,22 мкм) та вміщують його в ампули в асептичних умовах. Ампули зберігають при температурі від - 2 до 18 "с.

Розчинник АБО1 В являє собою опалесцентну безбарвну рідину, вільну від механічних включень, що міститься в стерильній скляній ампулі типа 1. Цільове заповнення кожної ампули становить 0,7 мл у відповідності до специфікації (20,5 мл).

Екстемпоральне розведення ад'ювантної розщепленої вакцини АБО1В вірусу

Під час ін'єкції вміст ампули, що містить ад'ювант, витягають і вводять шляхом ін'єкції в пробірку, яка містить концентровані трьохвалентні інактивовані антигени розщепленого віріону. Після перемішування вміст набирають у шприц і заміняють голку на голку для внутрішньом'язового введення, а доводять об'єм до 1 мл. Одна доза відновленої ад'ювантної вакцини - кандидата проти грипу АБО1В відповідає 1 мл.

МІ.2.4. Опис серій ад'ювантної вакцини АБО1Е

Ад'ювантна вакцина-кандидат проти грипу АБОТЕ являє собою З-хкомпонентну вакцину, що складається з концентрованих трьохвалентних інактивованих антигенів розщепленого віріону, вміщених до скляної ампули, та скляної ампули, що містить ад'ювант АЗОВ, їі скляної ампули, що містить розчинник (розчин натрію хлориду для ін'єкцій) для розведення АБО1В на два порядки.

Для приготування ад'юванту АБЗО1ТЕ вміст ампули з розчинником набирають у шприц і вводять в пробірку, яка містить ад'ювант АЗО1В, з наступним перемішуванням. Під час ін'єкції 600 мкл ад'юванту

АБОТЕ набирають у шприц з ампули, що містить АБОТЕ, і вводять в пробірку, яка містить концентровані трьохвалентні інактивовані антигени розщепленого віріону. Після перемішування вміст набирають у шприц і заміняють голку на голку для внутрішньом'язозого введення. Одна доза відновленої ад'ювантної вакцини-кандидата проти грипу АБЗО1В відповідає 1 мл.

Ад'ювантна вакцина-кандидат проти грипу АБО1ТЕ являє собою вакцину без консервантів.

МІ.2.5. Композиція клінічної серії ад'ювантної АБОТЕ

Одна доза відновленої ад'ювантної вакцини проти грипу АБО1Е відповідає 1 мл. Її склад наведено в табл. 9. Вона містить 15 мкг НА кожного штаму вірусу грипу, як і в зареєстрованій вакцині РіІшцагіх "М/а-

КіхФ).

Таблиця 9

Склад (компоненти грипу та ад'юванту) відновленої ад'ювантної вакцини-кандидата проти грипу АБОТЕ

Інактивовані розщеплені вібріони - ЛІПОСОМИ !

МІ.2.6. Спосіб виробництва серії ад'ювантної вакцини АБОТЕ

Виробництво ад'ювантної вакцини пре-а грипу АБО1В складається з трьох основних стадій: - Рецептура кінцевого трьохвалентного препарату у формі ін-балк маси (2х концентрований) без ад'юванту і заповнення контейнера з антигеном. - Одержання ад'юванту АБО1В. - Одержання ад'юванту АБОТЕ після екстемпорального розведення ад'ювантної вакцини розщепленого вірусу АБО1Е.

Рецептура кінцевого трьохвалентного препарату у формі ін-балк без ад'юванту та заповнення контейнера з антигеном

Див. розділ М.2.3 щодо ад'ювантної вакцини проти грипу АБО18В.

Одержання ад'юванту у формі ін-балі. А5О1В та заповнення контейнера з ад'ювантом

Див. розділ М.2.3 щодо ад'ювантної вакцини проти грипу АБО18В.

Екстемпоральне розведення ад'ювантної вакцини розщепленого вірусу АБОТЕ

Для приготування ад'юванту АБЗО1ТЕ вміст ампули з розчинником набирають у шприц і вводять в пробірку, яка містить ад'ювант А5БО1В, з наступним перемішуванням. Під час ін'єкції 600 мкл ад'юванту

АБОТЕ набирають у шприц з ампули, що містить АБОТЕ, і вводять в пробірку, яка містить концентровані трьохвалентні інактивовані антигени розщепленого віріону. Після перемішування вміст набирають у шприц і заміняють голку на голку для внутрішньом'язового введення. Одна доза відновленої ад'ювантної вакцини-кандидата проти грипу АБОТЕ відповідає 1 мл.

Чотири заплановані відвідування лікаря на одного суб'єкта: в дні 0, 21, 90 та 180 з одержання зразка крові при кожному відвідуванні з метою оцінювання імуногенності.

Схема вакцинації: одна ін'єкція вакцини проти грипу в день 0.

МІ.2.7 - Імунологічні аналізи

Випробування на інгібування гемаглютинації

Імунну реакцію визначають шляхом вимірювання антитіл інгібування гемаглютинації (НІ), застосовуючи спосіб, описаний центром співробітництва з проблем грипу Всесвітньої організації охорони здоров'я, центрів за контролем над захворюваннями, Атланта, США (1991). Вимірювання титру антитіл проводили на заморожених та відталих зразках сироватки за допомогою стандартизованого та всесторонньо валідованого мікрометоду, застосовуючи 4 одиниці інгібування гемаглютинації (4 НІЮ) відповідних антигенів; 0,5 9о суспензії курячих еритроцитів. Неспецифічні інгібітори сироватки видаляли шляхом термічної обробки та за допомогою ферменту, що знищує рецептор. Одержані сироватки були оцінені щодо рівнів антитіл НІ. Починаючи з початкового розведення 1:10, серії розведення (з фактором 2) готували до кінцевого розведення 1:20480. Кінцева точка титрування була взята як найвища стадія розведення, яка демонструвала повне інгібування (100 Фо) гемаглютинації. Всі аналізи виконували в подвійному повторенні.

Протокова цитометрія цитокінів (СЕС), яку застосовують з метою оцінки зустрічальності Т-клітин ср4 або СО8, позитивних на цитокіни).

Специфічні по відношенню до антигену Т-клітини СО4 та СО8 периферичної крові можна повторно стимулювати іп міго з метою продукування І/-2, СО40Ї, ТМЕ-альфа та ІМ при інкубації з їх відповідним антигеном. Таким чином, специфічні по відношенню до антигену Т-клітини СО4 та СО8 можна перерахувати за допомогою протокової цитометрії після звичайного маркування клітинного фенотипу імунофлуоресценцією, а також продукування внутрішньоклітинних цитокінів. В даному дослідженні антигени вакцини проти грипу будуть застосовуватися, як антигени з метою повторної стимуляції Т-клітин, специфічних по відношенню до грипу. Результати будуть виражатися як зустрічальність Т-клітин СО4 або СОВ8, позитивних на цитокін(и), в межах субпопуляції Т-клітин СО4 або СОВ8.

ЕПІ5РОТ, застосований з метою оцінки зустрічальності В-лімфоцитів

Технологія ЕїЇї5рої для В-клітин дозволяє зробити кількісне визначення В-лімфоцитів, специфічних по відношенню до даного антигену. В-лімфоцити можна стимулювати для диференціювання на клітини плазми іп міго після вирощування з Сро протягом 5 днів. Специфічні по відношенню до антигену клітини плазми, що генеруються іп мійго, можуть, таким чином, бути перераховані, застосовуючи аналіз еїїєрої В-клітин. Стисло клітини плазми, що генеруються іп міїго, інкубують на пластинах з культурою, покритих антигеном. Клітини плазми, специфічні по відношенню до антигену, будуть утворювати плями антитіла/антигена, які можна визначити звичайною імуноферментною процедурою. В даному дослідженні використовують штами вакцини проти грипу або анти-людській імуноглобулін з метою покриття пластин з культурою для того, щоб перерахувати клітини анти-грипу або клітини плазми, що виділяють дос, відповідно. Результати виражають як зустрічальність антиген- специфічної плазми в межах мільйона з клітин плазми, продукуючих Ід.

Дослідницька Характеристика РВМС

Можна виконувати експресію відібраних маркерів поверхні/активації (тобто СО4., СО8, СраБно, сраБ5кКА, СО028, СО27 або деякі КІК). Функцію Т-лімфоцитів, стимульованих вакциною, можна визначити за допомогою аналізу маркерів самонаведення (тобто ССК7, СХСОК5), цитокінів (цитокіни Т- хелперу 1 або Т-хелперу 2), або аналізуючи експресію факторів, пов'язаним з регуляторними функціями такими, як Рохр3, СТІ А-4, або ТОЕрД. Зокрема, популяція СО8-СО28- або популяції інших регуляторних Т-клітин можна проаналізувати у відношенні до гуморальних реакцій В та Т-клітин до антигену вакцини.

МІ.3. Результати вивчення імуногенності

МІ.3.1. Кінцеві точки СМІ та результати

Для характеристики реакції СМІ після вакцинації ад'ювантними вакцинами проти грипу Т- лімфоцити СОА та СО8 стимулювали повторно іп міїго, застосовуючи антигени з трьох штамів вакцини (використовувані індивідуально або у фонді). Специфічні по відношенню до грипу Т-лімфоцити сра/СО08 перераховували за допомогою протокової цитометрії з наступним звичайним маркуванням імунофлуоресценцією продукування внутрішньоклітинних цитокінів (1-2, ІЕМ-у, ТМЕ- і 20401).

Оцінка первинної кінцевої точки.

В 21-й день: Реакція СМІ у всіх суб'єктів з точки зору зустрічальності специфічного по відношенню до грипу Т-лімфоцита СО4 на 105 у випробуваннях, що продукують як мінімум два різних цитокіни (ІІ - 2, ТЕМ-у, ТМЕ-о ії 040).

Для оцінки реакції СМІ зустрічальність СО4, специфічних по відношенню до грипу, аналізують наступним способом:

Використовуючи підхід ефективності, ефективність як мінімум однієї ад'ювантної вакцини- кандидата проти грипу (введеної людям похилого віку 2 65 років - група, яку назвали Ріи похилого віку або Ріш ЕЇ 0) в порівнянні з Рійагіх "М (введеної дорослим людям 18-40 років - група, яку назвали Рій молодого віку або Ріш УМО) досягалася, якщо верхній ліміт двостороннього 98,75 95 довірчого інтервалу на співвідношенні середнього геометричного значення (СМ) (між групою, яка одержувала

РІнагіх "м (18-40 років), та ад'ювантною вакциною-кандидатом проти грипу (група 2 65 років) з точки зору зустрічальності специфічних по відношенню до грипу Т-клітин СО4, продукуючих як мінімум два цитокіни в 21-й день був нижче 2,0.

Шев ахдорослий о

СМад вакцинапроти грипу

В 21-й день після вакцинації зробили комп'ютерну обробку 98,75 95 довірчого інтервалу співвідношень ОМ, застосовуючи аналіз моделі коваріації (АМСРМА) на перетворенні логарифма 10 даних показників зустрічальності. Модель АМСОМА включала групу вакцини як фіксований ефект (РіІсагіх "м (18-40 років) проти ад'ювантної вакцини-кандидата проти грипу (265 років)) і зустрічальність попередньої вакцинації як регресор. Співвідношення ОМ та їх 98,75 95 СІ одержані як перетворення показника відмінності відповідної групи в моделі. 98,75 95 СІ для скоректованого ЗМ одержують шляхом експоненціального перетворення 98,75905 Сі для найменшого квадратного середнього значення групи, згаданої вище моделі АМСОМА.

Результати - Виведений шляхом висновку аналіз (табл. 10)

В таблиці 10 представлені скоректовані СМ та співвідношення ОМ (з їх 98,75 95 СІ) специфічного по відношенню до грипу Т-лімфоцита СО4, що продукує як мінімум два цитокіни (1-2, ІЕМ-у, ТМЕ-о; та

СО401І) в 21-й день після повторної стимуляції іп міго з "фондовими антигенами ІІ". Для кожної ад'ювантної вакцини проти грипу верхній ліміт двостороннього 98,75 956 Сі співвідношення ОМ знаходиться набагато нижче клінічного ліміту 2,0. Даний факт демонструє ефективність обох ад'ювантних вакцин проти грипу, які вводять людям похилого віку, в порівняні і з вакциною РіІваагіх "М, яку вводять дорослим віком від 18 до 40 років з точки зору зустрічальності специфічного по відношенню до грипу СО4.

Таблиця 10

Скоректовані співвідношення ЗМ специфічних по відношенню до грипу Т-клітин СО4, що продукують як мінімум два цитокіни після повторної стимуляції фондовими антигенами вакцини, день 21 (когорта АТР, випробування на імуногенність) 07711111111111111111171111111 Співвідношення СМ (РіиуУМс/АБОЇВ).д/-/://ЖЗ о пимМа | АБОЇВ | 77777777 Ї7771717171717171717171719889сС11сС1С 07711111 Співвідношення ЗМО(РІУМС/АВОЇВ).д-/-: о пимМа | АБОЇВ | 77777777 Ї7771717171717171717171719889сС11сС1С

Скоректований СМ - середнє геометричне антитіло, скоректоване для основного титру; М - кількість суб'єктів з доступними результатами до та після вакцинація; 98,8 95 СІ-98,8 95 довірчий інтервал для скоректованого співвідношення ОМ (модель Апсома: коректування для основної лінії); ГІ. - нижній лігніт, ОЇ. - верхній ліміт; Джерело даних - додаток, таблиця ША.

Результати - Описувальний аналіз (фіг. б)

Основні одержані дані були такими: 1) До вакцинації реакція СМІ вища у молодих дорослих, ніж у людей похилого віку. 2) Після вакцинації: - спостерігали бустерний ефект вакцини проти грипу при реакції СМІ у молодих дорослих (18-40 років); - реакцію СМІ у людей похилого віку, які одержували ад'ювантну вакцину проти грипу, можна порівняти з реакцією СМІ у молодих дорослих.

Різниця в реакціях Т-лімфоцитів СО4 для досліджуваних (І/-2, СбО0401Ї, ТМЕ-о та ІЕМ-у) всіх цитокінів до та після вакцинації була значно вищою у ад'ювантних вакцин в порівнянні з РіІмцагіх "М у всіх випробуваннях.

Аналіз третинної задачі:

Для оцінки третинної кінцевої точки в 0, 21, 90 та 180 дні вимірювали зустрічальність специфічних по відношенню де грипу Т- лімфоцитів СО4/СО8 та В-лімфоцитів. - Підсумована зустрічальність специфічних по відношенню до грипу Т-лімфоцитів СО4/С08 (описувальна статистика) для кожної вакцинованої групи в 0 та 21 день для кожного антигену. - Непараметричне випробування (тест Уїлкоксона (УМісохоп)) застосовували з метою порівняння розташування різниці між двома групами (ад'ювантної вакцини проти грипу проти Річагіх"М), а статистичне р-значення обчислювали для кожного антигену в кожному різному випробуванні. - Описувальну статистику в індивідуальній різниці між реакціями в 21 день/ 0 день (до та після вакцинації) розраховують для кожної групи вакцинації та для кожного антигену в кожному різному випробуванні. - Непараметричне випробування (тест Уїлкоксона) застосовують з метою порівняння індивідуальної різниці (до та після вакцинації), а статистичне р-значення будуть обчислювати для кожного антигену в кожному різному випробуванні.

В таблиці 11 представлені р-значення з тесту Уїлкоксона, що використовують для порівняння різниці зустрічальності Т-лімфоцитів СО4, специфічних по відношенню до грипу.

Результати - Оцінка третинної кінцевої точки (табл. 11) Головними висновками є наступні: - Середнє геометричне значення зустрічальності специфічних по відношенню до грипу Т-клітин сбра4 до вакцинації було подібним у всіх групах людей похилого віку, але вони були вищі у дорослих віком від 18 до 40 років. - У людей похилого віку зустрічальність специфічних по відношенню до грипу Т-лімфоцитів СО4 після вакцинації (в 21-й день) була значно вища після вакцинації (ад'ювантними вакцинами, ніж

Рінагіх "м, - Після вакцинації зустрічальність специфічних по відношенню до грипу Т-лімфоцитів СО4 залишалася нижчою у людей похилого віку, вакцинованих ад'ювантними вакцинами АБЗО1В або

АЗО1Е, ніж у дорослих віком від 18 до 40 роками, вакцинованих РіІчагіх "М, - Зустрічальність специфічних по відношенню до грипу Т-клітин СО8 середнього геометричного значення до та після вакцинації була в основному подібна у всіх групах.

Таблиця 11

Виведена шляхом висновку статистика: р-значення з тестів Крускаля-Уолліса для Т-клітин СО4 в кожній точці часу (Когорта АТР, випробування на імуногенність)

Опис тесту 11111101 АВОЇВпротигчвСО | АБО: протигівІО З

77111111 Дденьо | День2! | Деньо | День!

Результати - Оцінка кінцевих точок гуморальної імунної реакції

Спостережувані змінні:

В 0, 21, 90 та 180 дні: титри антитіл інгібування гемаглютинації сироватки (НІ) аналізували окремо проти кожного з трьох штамів вірусу грипу, представлених у даній вакцині (анти-НІМІ, анти-НЗМ2 та анти-В-антитіла).

Показник граничної частоти для антитіл НІ проти всіх антигенів вакцин визначали в лабораторії до аналізу (він дорівнює 1:10). Серонегативний суб'єкт являє собою суб'єкт, чий титр антитіл нижче показника граничної частоти. Серопозитивний суб'єкт являє собою суб'єкт, чий титр антитіл більший, або дорівнює показник граничної частоти. Титр антитіл нижче показника граничної частоти представляє довільне значення половини показника граничної частоти.

Базуючись на титрах антитіл НІ, обчислюють наступні параметри: - Середнє геометричне значення титрів (ЗМТ) антитіл НІ на 0 та 21-й день, обчислене за допомогою анти-Іод середнього значення перетворень титру Ід. - Фактори сероконверсії (ЗЕ) в 21-й день, визначені як порядкове зростання в сироватці НІ СМТ в 21-й день в порівнянні з днем 0. - Показники сероконверсії (5С) в 21-й день, визначені як відсоток вакцинованих людей з титрами

НІ до вакцинації «1:10 та титрами після вакцинації 21:40, або титрами до вакцинації 21:10 та зростанням як мінімум на 4 порядки титрів після вакцинації. - Показники серозахисту (РЕ) в 21-й день, визначені як відсоток вакцинованих людей з титрами

НІ сироватки 21:40. 95 95 СІ для ОМ одержують в межах кожної групи окремо. Спочатку одержують 95 95 СІ середнього значення Іод-перетвореного титру, припускаючи, що Іод-перетворені титри звичайно розповсюджуються з невідомою розбіжністю. Далі 9595 СІ для СМ одержують експоненціальним перетворенням 95 95 СІ для середнього значення Іод-перетвореного титру.

Відсутність серологічного результату для конкретного вимірювання антитіл не заміщають. Таким чином, суб'єкт без серологічного результату в даній точці часу не враховується в аналізі даного випробування для даній точці часу.

Результати гуморальної імунної реакції (фіг. 7 і табл. 12)

Середні геометричні значення антитіл НІ до вакцинації для всіх З штамів вакцин знаходилися в межах однакового інтервалу в 4 групах лікування. Після вакцинації спостерігається чіткий вплив 2 ад'ювантів, які збільшують гуморальну реакцію у людей похилого віку в порівнянні із стандартним

ЕіІмагіх в той же самій популяції (фіг. 7, показана на лінійній шкалі, але подібний вплив видний очевидно і на логарифмічній шкалі).

Середні геометричні значення - значно вище для НІМІ для АБО1Е; - значно вище для НЗМ2 для обох ад'ювантів. - Не спостерігали ніякої істотної різниці з точки зору поствакцинації СМТ між двома групами суб'єктів, які одержали ад'ювантні вакцини.

Двадцять один день після вакцинації у суб'єктів, вакцинованих Рівчагіх (18-40 років), спостерігали більш сильну реакцію НІ для штамів Мем СаІедопіа та ВЛапдзи. Як показано в таблиці 12, ад'ювантні вакцини проти грипу перевищили вимоги Європейських органів власті щодо щорічної реєстрації вакцин проти грипу розщепленого віріону І"Замітка для посібника по гармонізації вимог для вакцин проти грипу для імунологічної оцінки щорічних змін штамів" (СРМР/ВУУР/214/96)| у суб'єктів старше 60 років.

Після вакцинації спостерігали статистичну різницю з точки зору показників серозахисту антитіл НІ між групою Рівцагіх (265 роки) та РІшШАЗО18В і РІшШАБЗО1ТЕ для штаму А/Н1М1/ Мем СаІедопіа.

Для кожного штаму вакцин показники серозахисту для 2 груп ад'ювантної вакцини проти грипу знаходяться в одному інтервалі в порівнянні з групою Рівагіх (18-40 років).

Для кожного штаму вакцин показники серозахисту для 2 груп ад'ювантної вакцини проти грипу знаходяться в одному інтервалі в порівнянні з групою Рівчагіх (18-40 років), крім штаму Мем СаІедопіа.

Таблиця 12

Показники серозахисту, показники сероконверсії та фактори конверсії в 21 день

(когорта АТР, випробування на імуногенність)

Показник

Показник сероконверсії (24- Фактор

Штами Група М серозахисту порядкове конверсії (ТИТр НІ240) 95 збільшення) І95 Фо СІ| Фо 95 95 СІ| до

Стандарт ЄО (60 років) | | 56095 | 53095 2 -: | 520 (Стандарт ЄО(«б0років) | | 57095 | »40956 | 525

А/Мем

Саіедопіа (НІМІ) д/Мем Уоїк (нЗ3мг)

В/лапави (В)

М - загальна кількість суб'єктів; 95 - Відсотковий зміст суб'єктів з титром в 21-й день в межах вказаного інтервалу; СІ - довірчий інтервал.

МІ.3.2. Висновки щодо вивчення імуногенності - Зустрічальність специфічних по відношенню до грипу СО4 до вакцинації була значно нижче у людей похилого віку в порівнянні з дорослими віком від 18 до 40 років. Після вакцинації РіІцагіх'м зустрічальність після вакцинації (21-й день) залишилася нижчою у людей похилого віку в порівнянні з молодими людьми. Навпаки, продемонстрована ефективність з точки зору зустрічальності після вакцинації специфічних по відношенню до грипу СОА4 після вакцинації ад'ювантними вакцинами людей похилого віку в порівнянні з вакцинацією дорослих віком від 18 до 40 років за допомогою Річагіх "М, - Щодо гуморальної імунної реакції з точки зору реакції антитіл НІ, всі вакцини проти грипу виконували вимоги Європейських органів власті щодо щорічної реєстрації інактивованих вакцин проти грипу "Замітка для посібника по гармонізації вимог для вакцин проти грипу для імунологічної оцінки щорічних змін штамів" (СРМР/ВУУР/214/96)Ї. У людей похилого віку ад'ювантні вакцини опосередковували як мінімум тенденцію для досягнення вищої гуморальної імунної реакції до гемаглютиніну грипу, ніж РіІцагіх "мМ. В таблиці 13 наведена істотна різниця між гуморальною імунною реакцією проти кожного штаму вакцини, опосередкованого у людей похилого віку ад'ювантними вакцинами в порівнянні з РіІцйагіх "М. В порівнянні з дорослими віком від 18 до 40 років, вакцинованими

РІсагіх"М, люди похилого віку, вакциновані ад'ювантними вакцинами, демонстрували тенденцію зростання СМТ та фактору сероконверсії після вакцинації в 21-й день проти штаму А/Мем/ Могк.

Таблиця 13

Штами грипу, які продемонстрували значно вищу гуморальну імунну реакцію (базуючись на не перевищенні 95 95 СІ) у людей похилого віку, вакцинованих різними ад'ювантними вакцинами в порівнянні з РіІшцагіх в той же самій популяції двав дентин снення | овннтя | ння сероконверсії серозахисту сероконверсії чАБОІВ 0 ЇА/лемуюк | 0 |А/юемСаівдопа |: масою ддеитжо | 0000000 фАМенсаюют

СМТ після вакц. - середнє геометричне значення титру після вакцинації.

МІ.А4 Висновки щодо вивчення реактогенності

МІ.4.1. Реєстрація побічних ефектів (АЕ)

Реєстрували стійки симптоми (див. табл. 14), які з'являлися в наступний період лікарського спостереження протягом 7 днів (день вакцинації та 6 наступних днів). Також реєстрували нестійкі симптоми, які з'являлися в наступний період лікарського спостереження протягом 21 днів (день вакцинації та 2043 наступних днів). Оцінена інтенсивність наступних побічних ефектів, як описано в таблиці 15.

Таблиця 14

Стійки місцеві/загальні побічні ефекти

Стійки місцеві побічні ефекти Стійкі загальні побічні ефекти

Біль в місці ін'єкції Втома

Почервоніння в місці ін'єкції Гарячка

Припухлість в місці ін'єкції Головний біль

Гематома Біль у м'язах 11111111 ДОзноб 11111111 |Біль в суглобах руки через ін'єкцію 11111111 |Біль в суглобах на інших ділянках

М.В. Температуру реєстрували увечері. Якщо необхідно було зробити додаткові вимірювання температури в інший час дня, то найвищу температуру реєстрували.

Таблиця 15

Шкала інтенсивності для стійких симптомів у дорослих

Побічний ефект Шкала інтенсивності Параметр 777717171710 7 |відсутній сп пирію 11101111 при дотик

Біль в місці ін'єкції --- при руху кінцівки перешкоджає нормальній діяльності . ера зареєстровано найбільший діаметр

Почервоніння в місці ін'єкції : поверхні . сор адоою зареєстровано найбільший діаметр

Припухлість в місці ін'єкції : поверхні соді зареєстровано найбільший діаметр

Гематома в місці ін'єкції : поверхні

Гарячка" 0 зареєстрована температура ус "Е 77171710 |відсутній з бі легко переноситься

Головний біль Я - заважає нормальній діяльності перешкоджає нормальній діяльності 77171710 |відсутній легко переноситься

Втома Я - заважає нормальній діяльності перешкоджає нормальній діяльності 77171710 |відсутній

Біль в суглобах, в місці ін'єкції легко переноситься та інших ділянках заважає нормальній діяльності перешкоджає нормальній діяльності 77171710 |відсутній легко переноситься

Біль у м'язах Я : заважає нормальній діяльності перешкоджає нормальній діяльності 77171710 |відсутній легко переноситься

Озноб Р --ИЯ-- - заважає нормальній діяльності перешкоджає нормальній діяльності " Гарячку визначають як додаткову температуру 237,5 70 (99,5 Р).

Максимальна інтенсивність почервоніння/припухлості в місці ін'єкції оцінювали таким способом: 0 складає 0 мм; 1 складає » 0 - х 20 мм; 2 складає » 20 - х 50 мм; З складає » 50 мм.

Максимальна інтенсивність гарячки оцінювали таким способом: 1 складає » 37,5 - х 38,0 "С; 2 складає » 38,0 - х 39,0 "С; З складає » 39,0.

Дослідник робить оцінку інтенсивності для всіх інших побічних ефектів, тобто нестійких симптомів, включаючи стійки побічні ефекти, про які повідомляли протягом всього дослідження. Оцінка базується на клінічної оцінки дослідника. Інтенсивність кожного зареєстрованого АЕ оцінюється по однієї з наступних категорій: 1 (м'який) - АЕ, який легко переноситься суб'єктом, спричиняючи мінімальний дискомфорт і не заважаючи щоденній активності; 2 (помірний) - АЕ, який доставляє значний дискомфорт, заважаючи нормальній щоденній активності;

З (тяжкий) - АЕ, який перешкоджає нормальній, щоденній активності (у дорослих /підлітків, такий

АЕ, наприклад, перешкоджає відвідування роботи/школи і вимагає необхідним проведення коригуючої терапії).

М.1.4.2. Реєстрація побічних ефектів (АЕ)

У людей похилого віку реактогеннісгть, що спостерігалася при введенні ад'ювантних вакцин в умовах як місцевих, так: загальних симптомів, була вищою, ніж при застосуванні Ріцагіх "М,

Збільшилися не тільки зустрічальність, а також і інтенсивність симптомів після вакцинації ад'ювантними вакцинами (фіг. 8). Шкала симптомів З продемонструвала тенденцію до підвищення в групі, яка одержала ад'ювантну вакцину з найвищою концентрацію імуностимуляторів (МР, 0521), в порівнянні з групою, яка одержувала ад'ювантну вакцину, де імуностимулятори знаходилися в нижчій концентрації. У всіх випадках, однак, симптоми швидко зникали.

Приклад МІ!: Доклінічна оцінка ад'ювантних вакцин НРУ у мишей.

У даному дослідженні застосовували двохвалентну антигенну композицію з вірусом папіломи людини (НРУ), комбінуючи подібні до вірусу частинки (МІ Р), утворені з 1 НРМ16 та 11 з НРМ18 як антиген. Задача дослідження була порівняти ефективність даного антигенного препарату при введенні його в рецептуру з АБО1В та 1/5 розведенням АБО18В, протиставивши його з ад'ювантом, що використовують на теперішній час в вакцині О5К проти раку шику матки, АБЗО4 (МРІ'. на галунах).

МІІ.1 - Вакцинація

В 0 та 28 день мишам (кількість - 12 на групу) вводили ін'єкційним способом рецептури вакцин, що містять НРМ16/18 І 1 (2 мкг або 0,5 мкг кожного), одержаних з процесу Ні-5 80/80! та в рецептуру яких входять АБЗО4 (50 мкг МРІ. зроблений на галуні) або АБО1В (50 мкг 0521 - 50 мкг МРІ в 0,5 мл) 1/10 та 1/50 дози для людини. Оскільки дослідження проводили на мишах, 1/10 дози для людини можна взяти як еквівалентну рецептурі АБО1В для людини, тобто 50 мкг 2521 та 50 мкг МРІ. в 0,5 мл, а 1/50 можна взяти як 1/5 розведення рецептури АБО1В для людини, тобто 10 мкг 0521 та 10 мкг МРІ в 0,5 мл.

Зразки крові брали в 14 та 45 день після введення дози ІЇ з метою аналізу загальної кількості специфічних антитіл типу анти-Ї1 в індивідуальних сироватках. Внутрішньоклітинне забарвлення цитокінів вимірювали в 7-й та 14-й день після другої імунізації на РВМС, а в 45-й день після другої імунізації для вимірювання застосовували клітини селезінки. Зустрічальність специфічних В- лімфоцитів МІ Р вимірювали в 45-й день після другої імунізації, застосовуючи клітини селезінки.

МІІ.2 - Анти-НРМ 16/1811 ЕПІЗА

Кількісне визначення антитіл анти-НРМУ-16б та НРМУ-18 1 виконували за допомогою ЕГІЗА, застосовуючи НРУ-16 і НРУ-18 І 1 як покриття. Антигени розбавляли в кінцевій концентрації 0,5 мкг/мл у розчині фосфатного буферу і адсорбували протягом ночі при 4"С на планшетах для мікротитрування з 96 лунками (Махізогр Іттипо-ріаїє, Нунк, Данія). Далі пластинки інкубували протягом 1 години при 37 "С з розчином фосфатного буферу, що містить 1 95 альбумін; коров'ячої сироватки (буфер насичення). Сироватки, розбавлені в буфері, що містить розчин фосфатного буферу я 0,1 95 Твін 20--1 95 альбумін коров'ячої сироватки, додавали до пластинок, покритих НРМ 11, та інкубували протягом 1 години 30 хвилин при 37 "С. Пластини промивали чотири рази розчином фосфатного буферу, 0,195 Твіном 20 та біотин-кон'югованим анти-мишачим Ід (Бако,

Великобританія), розбавленим в 1/1000 в буфері насичення, додавали до кожної лунки та інкубували протягом 1 години 30 хвилин при 37 "С. Після стадії миття додають пероксидазу стрептавідину хріну (рако, Великобританія), розбавлену 1/3000 в буфері насичення, протягом додаткових 30 хвилин при 37 "С. Пластинки промивали, як вказано вище, та інкубували протягом 20 хвилин при кімнатній температурі з розчином 0,04 95 О-фенілендіаміну (Зідта), 0,03 95 Нг2О» в 0,195 Твіні 20, 0,05М цитратного буфера рн 4,5. Реакцію зупиняли за допомогою 2М Но5О»х і зчитували при 492/620 нм.

Титри ЕГІЗА розраховували з посилання ЗойМахрРго (використовуючи рівняння чотирьох параметрів) і виражали в ЄО/мл.

МІІ.З - Внутрішньоклітинне забарвлення цитокінів (ІС5)

Внутрішньоклітинне забарвлення цитокінів Т-клітин виконували на лімфоцитах периферичної крові в 7-й та 14-й день після другої імунізації. У мишей відбирали моноядерні клітини периферичної крові (1 депо/групу) або клітини селезінки (4 депо З органів на групу). Антигенну стимуляцію клітин селезінки іп міго проводили при кінцевій концентрації 5 105 клітин/мл (мікропланшети з 96 лунками) з МІ Р 16 або 18, (5 мкг/мл) ж антитіла (1 мкг/мл) С0494 СО28, а потім інкубували протягом З годин при 37 "С. Після стадії повторного стимулювання антигену клітини інкубували протягом ночі при 37 "С в присутності брефелдину (1 мкг/мл) при 37 "С з метою інгібування секреції цитокіну. Забарвлення клітин виконували наступним способом: суспензії клітин промивали, суспендували повторно в 50 мкл розчину фосфатного буферу з вмістом 195 сироватки телячого ембріону, що містить 295 Ес блокуючого реактиву (1/60; 2,402). Після інкубації протягом 10 хвилин при 4 "С додавали 50 мкл, суміші анти-СО4-АРС (1/50) та анти-СО8 на Ср (1/50) та інкубували протягом 30 хвилю, при 4 "С. Після промивання в розчині фосфатного буферу з вмістом 195 сироватки телячого ембріону клітини просочували, повторно суспендуючи в 200 мкл Суїюйх-Суїорепт (Кіїї ВО) та інкубували протягом 20 хвилин при 4 "С. Далі клітини промивали Репт УмМазп (Кі ВО) та повторно суспендували в 50 мкл суміші анти-ІЕМ-у АРС (1/50) ж анти-ІІ -2 РІТС (1/50), розбавленої Репт Умахп. Після інкубації протягом 2 годин при 4 "С клітини промивали Регт УмМазхпй і повторно суспендували в розчині фосфатного буферу з вмістом 195 сироватки телячого ембріону ж- 195 параформальдегіду. Аналіз зразків виконували за допомогою БАС5. Живі клітини закривали (Е5С/55542) і виконували комплектування -20,000 перетворень (лімфоцити). Відсотковий вміст ІЕМ-у ж або І 2-- обчислювали на СО4- та Сов замкнутих популяціях.

МІІ.4 - В-лімфоцити

В 45-й день після другого імунізації мишей умертвляли, клітини селезінок видаляли за допомогою градієнту лімфопрепарату (цедарлану). Далі В-клітини повторно суспендували в середовищі КРМІ 16 (Гібко - сірсо), що містить добавки (натрію піруват 1 мМ, неосновні амінокислоти МЕМ, Реп/5ігер, глютамін ії р-2 меркаптоетанол), 595 сироватки телячих ембріонів, 50 О/мл ІПпІЇ-2 (еБіосайнс - еВіозсіепсе) і З мкг/мл Сро. Клітини культивували протягом п'яти днів при кінцевій концентрації 106 клітин/імл, в 5 мл на б плоскодонних лунках. Після стадії активації з етанолом нітроцелюлозні пластини (Мийізсгееп-ІР; Міййроге) покривали 10 мкг/мл МІР або козячим анти-мишачим Ід (ЗАМ;

Зідта), розбавляючи 1/200 у розчині фосфатного буферу. Після стадії насичення повним середедовищем 100 мкг 2х105 клітин/мл додавали на пластини, покриті МІ Р, а 100 пластини 105 та

Бх105 клітин/мл додавали на пластини САМ. Після часу інкубації протягом 2 годин при 37 "С пластини зберігали протягом ночі при 4 "С. Пластини промивали чотири рази розчином фосфатного буферу, 0,1 95 Твіном 20 та анти-мишачим Ід Віої, розведеним 1/200 у розчині фосфатного буферу з вмістом 1 95 сироватки телячого альбуміну. 5 95 сироватки телячих ембріонів (буфер розведення) розподіляли на пластини та інкубували протягом 2 годин при 37 "С. Після стадії промивання додавали екстравідин

НЕР (бідта), розбавлений 1/550 в буфері розведення, протягом додаткової 1 години при: 37 "с.

Пластини промивали, як вказано вище, та інкубували протягом 10 хвилин при кімнатній температурі розчином АЕС (Зідта). Реакцію припиняли, обережно обполіскуючи пластини в проточній воді. Коли пластини обсихали, зчитували К5400.

МІІ.5 - Статистичний аналіз

Середні значення рецептури порівнювали, застосовуючи односторонній аналіз розбіжностей (АМОМА 1). Аналіз проводили, а перетворених даних І0д910 з метою нормалізації. Якщо знаходили істотну різницю між середніми значеннями способу (р-значення ха 0,05), то виконували парні порівняння серед середніх значень на 0,05 значущому рівні (тест множинного порівняння Стьюдента-

Ньюмена-Кеулза (5іцдепі-Мемтап-Кепиів)).

МІ1.6 - Результати

Миші були імунізовані, як описано в вище МІІ.1. Застосовували наступні групи: 1/10 дози для людини (еквівалентної, 50 1/50 дози для людини (еквівалентної 10 1/10 дози для людини (еквівалентної 50 1/50 дози для людини (еквівалентної 10 1/10 дози для людини (еквівалентної 50 1/50 дози для людини (еквівалентної 10 ово знеутеивітовми во Мр 1/10 дози для людини (еквівалентної 50 8 |НРМІЄб18І10О,5 мк фАБОЇВ (1/5БОдозидля людини (еквівалентної 10

11111101 дмеемРінабямлно)////: СУ

МІІ. 6.1 - Гуморальні реакції

Не спостерігали значного інтервалу дози для двох перевірених доз антигенів з розведенням ад'юванту або для титрів антитіл анти-НРМУ16-І 1, або для титрів антитіл анти-НРУТ1 8-11 (фіг. 9).

Не спостерігали значного інтервалу дози для двох перевірених доз кожного ад'юванту, якою би не була доза антигену для титрів антитіл анти-НРМУ16-1 1.

Якщо дивитися на титри антитіл анти-НРМ18-11, то можна побачити невелике зростання в титрі для АБО1В (1/10 НО) в порівнянні з АЗО1В (1/50 НО), як зміряно в 14-й день після імунізації І! (2,5- порядковий інтервал дози, р-значення - 0,0035), однак, даний інтервал спостерігали тільки для 2 мкг антигену, а не для 0,5 мкг антигену (р-значення - 0,0867). До 45 дня після імунізації ІЇ не спостерігали ніякого значного інтервалу дози для двох перевірених доз кожного ад'юванту, якою би не була доза антигену,

МІІ.6.2 - Клітинні реакції

Внутрішньоклітинне забарвлення цитокінів

Не спостерігали впливу інтервалу дози антигену для двох перевірених доз антигенів, якою би не була доза ад'юванту для НРМ18-11. Одержані подібні зустрічальності специфічних СО4-- Т-клітин

МІ Р1І16 з двома перевіреними дозами антигенів з різними дозами ад'ювантів (фіг. 10)

Для АБЗО18 (1/10 НО) спостерігали невеликий ефект дози (2,6 порядки, р-значення - 0,0009 для

НРМУТ18-11; 2 порядки р-значення - 0,0187 для НРМ16-1 1) в порівнянні з АБО1В (1/50 НО), однак, даний інтервал спостерігали тільки для 2 мкг антигену, а не для 0,5 мкг антигену.

Специфічні В-лімфоцити

Не спостерігали впливу інтервалу дози антигену для двох перевірених доз антигенів, якою би не була доза ад'юванту для НРУ16 або 1811 (фіг. 11).

Не спостерігали впливу інтервалу дози ад'юванту для двох перевірених доз ад'ювантів, якою би не була доза антигену для НРМУ17 або 1811.

Як можна побачити із згаданих вище результатів, 1/5 розведень АБО1В дає рецептуру, яка має еквівалентну ефективність в імуногенних композиціях як і сам АБЗО1В.

Приклад МІ: Доклінічна оцінка ад'ювантних вакцин проти 5. рпештопіає у мишей.

Пневмококова вакцина, що використовують у даному дослідженні, являла собою 11-валентну ад'ювантну пневмококову кон'югантну вакцину (11 РСМ/А5Б), що складається з суміші 11 пневмококових полісахаридних кон'югатів, ад'ювантних або з АБОЇ1В, або АЗБО1ТЕ. Кон'югати складаються з серотипів очищених полісахаридів 1, 3, 4, 5, 6В, 7Е, 9М, 14, 18С, 19Е та 23Е 5. рпештопіає, кожен, індивідуально кон'юЮгований з білком-носієм, або антитоксином дифтерії (ОТ), антитоксином правця (ТТ), або білком О з Н. іпйшеплає (РО). Вакцини представлені як висушений виморожуванням порошок, який відновлюють з одним з рідких ад'ювантів. 11РСМ/А5 продукований, як вказано нижче:

Активація та умови приєднання специфічні для кожного полісахариду. Вказані дані наведені в таблиці нижче. Сортований по величині полісахарид (за винятком РБ55, 6В та 23Е) розчиняли в Масі 2М або у воді для ін'єкцій (М/РІ). Оцінювали оптимальну концентрацію полісахаридів для всіх серотипів. Всі серотипи, окрім серотипу 18С, кон'юговані безпосередньо з білком-носієм, як описано в деталях нижче.

З 100 мг/мл запасного розчину в ацетилнітрилі або в розчині ацетонітрилу/води 50 95:50 95 СОАР (співвідношення СОАР/РБЗ 0,75 мг/мг Р5) додавали до розчину полісахариду. Через 1,5 хвилини додавали 0,2М-0,3М Маон з метою одержання конкретної активації рН. Активацію полісахариду виконували при даній рН протягом З хвилин при 25 "С. Очищений білок (білок О або ОТ) (його кількість залежить від початкового співвідношення РБ/ білка-носія) додавали до активованого полісахариду, і виконувалася реакція приєднання при конкретній рН протягом до 2 годин (в залежності від серотипу), коректуючи рН. З метою погашення не реагуючих груп ефіру ціанату далі до суміші додавали 2М розчин гліцину. Коректували рН до рН погашення (рН 9.0). Розчин перемішували протягом 30 хвилин при 25 "С, а потім безперервно повільно перемішували протягом всієї ночі при 2-8 7.

Одержання 18С: 18С був зв'язаний з білком-носієм через лінкер - дігідрозидадипінової кислоти (АОН). До кон'югації серотип 18С полісахариду піддавали мікрофлюїдизації.

Дериватизація антитоксину правця з ЕБАС

Для дериватизації антитоксину правця очищений ТТ розбавляли в 25 мг/мл 0,2М Масі, і додавали прокладку АЮН для досягнення кінцевої концентрації 0,2М. Коли розчинення прокладки було завершено, рн коректували до 6,2. Потім додавали ЕВАС (1-етил-3-(З-діметил- амінопропіл)карбодіїмід) з метою досягнення кінцевої концентрації 0,02М, а суміш перемішували протягом 1 години, коректуючи рН. Реакцію конденсації зупиняли, збільшуючи рН до 9,0 як мінімум протягом 30 хвилин при 25 "С. Далі фільтрували дериватизований ТТ (10 кДа мембрана СО) з метою видалення залишкових кількостей АОН та реактиву ЕОАС

На закінчення масу ТТан стерильно профільтрували до стадії приєднання і зберігали при -70 "С.

Хімічне приєднання ТТадн до Р5 18С

Деталі параметрів кон'югації можна знайти в таблиці 1.

Розбавляли 2г мікрофлюїдизованого полісахариду в певній концентрації у воді та коректували до 2М Масі, додаючи порошок Масі.

Розчин СОАР (100 мг/мл свіжо приготований в 50/50 об/0б ацетонітрилу) додавали з метою досягнення відповідного співвідношення СОАР/РБ.

Піднімали рН до рН активації 9,0, додаючи 0,3М Маон та стабілізували при даній рН до додавання

Тан.

Через З хвилини дериватизований ТПТадн (20 мг/мл в 0,2 М Масі) додавали з метою досягнення співвідношення 2ТТдн/Р5, рН коректували до приєднання рН 9,0. Розчин залишали на одну годину, коректуючи рн.

З метою погашення додавали 2М розчину гліцину до суміші Р/ Тан/СОАР.

Коректували рН до рН погашення (рн 9,0).

Розчин перемішували протягом 30 хвилин при 25 "С, а потім залишали на ніч, безперервно повільно перемішуючи при 2-8 "С.

Очищення кон'югатів:

Кон'югати очищали за допомогою гель - фільтрації, застосовуючи колонку Ззерпасгу! 50ООНЕК гель - фільтрації, яку урівноважують 0,15М Масі (550ООНЕК для 18С) з метою видалення маленьких молекул (влючаючи ОМАР), і некон'югованого полісахариду та білка. Базуючись на різних розмірах молекул компонентів реакції, спочатку елююються кон'югати РБ-РО, РО-ТТ або РБ5Б-ОТ, далі вільний полісахарид, потім вільним РО або вільний ОТ і нарешті, ОМАР та інші солі (Масі, гліцин).

Фракції, що містять кон'югати, знаходять за допомогою УФгвонм. Фракції вносять до пулу відповідно до їх Ка, стерильно фільтрують (0,22 мкм) та зберігають при 2-8 7С. Визначили співвідношення

РоБ/білок в рецептурах кон'югатів.

Специфічні умови активації/приєднання/гасіння полісахариду 5. Рпештопіає-Кон'югати білка О/ТТ/ОТ Серотип | Ямкфлд | Змкфлд | 4мкфлд | 5 | 68 | 7ЕРмкфлд

Початкові співвідношення 1,5/1 1/1 1,5/1 1/1 1 12/11

РЗ/РО (мас/мабс.)

СОАР конц.

РЗконц(м/имл) | 50 | 50 | 45 | 90 | 238

Початковий білок- носій/співвідношення Р5 12/11 12/11 2/1 1,5/1 1 (мас/мас.)

Далі змішують разом 11 кон'югатів, а кінцевий антигенний препарат змішують з відповідним ад'ювантом до імунізації.

В 0, 14 та 28 день групі мишей ВаїЇр/с, що складалися з 40 самок у віці 4 тижнів, вводили внутрішньом'язово 0,1 мкг 11-валентними кон'югатами полісахариду, які входили в склад рецептури з

А5БО18В, або АБО1Е. Антитіла анти-Р5 до дозували за допомогою ЕГІ5А в сироватках, зібраних в 42 день.

Як можна бачити з фіг. 12, порівнянь реакції спостерігали між розбавленою рецептурою АБО1Е, порівнюючи з рецептурою АБО1В, за винятком РБЗ 14, в якому більшу реакцію спостерігали у АБО1В, та РБ5 19Р, в якому більшу реакцію в якому більшу у АБО1ТЕ.

Приклад ІХ: Доклінічна оцінка ад'ювантних та неад'ювантних імуногенних композицій проти цитомегаловірусу.

ЇХ.1: Морські свинки.

ІХ. 111 Анти-оВ ЕїЇїза

Кількісне визначення антитіл анти-с60В виконували за допомогою ЕГІЗА, застосовуючи 98В як антиген покриття. Антиген розбавляли в кінцевій концентрації 4 мкг/мл у розчині фосфатного буферу та 100 мкл інкубували протягом ночі при 4 "С на планшетах для мікротитрування з 96 лунками. Далі пластинки насичали протягом 1 години при 37 "С з 200 мкл розчину фосфатного буферу, що містить 195 альбумін коров'ячої сироватки. Серійні розведення на два порядки сироваток додавали (100 мкл/лунку) та інкубували протягом 1 години 30 хвилин при 37 "С. Пластини промивали чотири рази розчином фосфатного буферу, С 0,1 95 Твіном 20, а 100 мкл анти-морської свинки (до пероксидази хріну (бако, Великобританія) додавали до кожній лунки та інкубували протягом 1 години 30 хвилин при 37 "С. Пластини промивали чотири рази розчином фосфатного буферу, 0,1 95 Твіном 20 і один раз водою. Потім їх інкубували протягом 20 хвилин при 22 "С з 100 мкл розчину О-фенілендіаміну (Зідта) в 0,1 М цитратного буфера, рН 4.2. Дану реакцію зупиняли за допомогою 100 мкл 2М Но5О». та зчитували при 490/620 нм. Титри ЕїЇїза вибачали інтерполяцією показників ОО з еталону 5ОЙМахрРго.

Титри виражали в ЄО/мл.

Статистичний аналіз виконували в 14 день після даних ЕїЇїза вакцинації 2 із застосуванням

ОМІЗТАТ. Протокол, який використовували для аналізу розбіжностей, можна стисло описати наступним образом: - Год трансформація даних; - тест Шапіро-Уілка (Зпаріго-МЛІК) для кожної популяції (групи) для перевірки нормальності розподілу груп; - тест Кохрана (Соспгап) для перевірки гомогенності розбіжностей між різними популяціями (групами); - аналіз розбіжностей на вибіркових даних (односторонній); - тест Тукея (ТиКеу) НО множинних порівнянь.

ЇХ.1.2 - Аналіз нейтралізації

До проведення даного аналізу клітини і МКСОС5 (10000 клітин/200 мкл середовище МЕМ) розподіляли на мікропланшети з 9б лунками та інкубували протягом З днів з СО при 37760.

Виконували двохпорядкові розведення інактивованих сироваток (30 хвилин при 56 "С) реалізовані та інкубували з 100 мкл вірусного розчину (800 МО/мл) протягом 1 години при 37 "С. Після інкубації 100 мкл суміші сироватки/вірусу інокулювали на мікропланшетах з 96 лунками, що містять моношар МКС5.

Пластини центрифугували при 2000 обігів на хвилину протягом 1 години при 35 "С. Після інкубування протягом всієї ночі при 37 "С, пластини фіксували 80 95 розчином ацетону (20 хвилин при -20 "С).

Розчин ацетону відкидали, а позитивні до СММ клітини визначали, застосовуючи специфічний моноклональний анти-безпосередній ранній антиген протягом 1 години при 37 "С. Пластини тричі промивали розчином фосфатного буферу та біотін-кон'югований анти-мишачий Ід додавали в кожну лунку та інкубували протягом 1 години при 37 "С. Після стадії промивання додавали пероксидазу стрептавідину хріну протягом додаткових 30 хвилин при 37 "С. Пластини промивали чотири рази та інкубували протягом 10 хвилин розчином щиро синього. Реєстрували специфічні пофарбовані сигнали, досліджуючи їх під мікроскопом. Титри нейтралізації виражали як зворотно пропорційні самого великого розведення сироватки, що надає 50 95 скорочення позитивних до СММ клітин в порівнянні з вірусним контролем (СММУ « клітини без сироватки).

ІЇХ.1.3 - Протоколи імунізації

Були імунізовані 4 групи. Кожна група складалася з 8 самок Нагііеу Сті:(Па) морські свинки віком 5- 8 тижнів, за винятком контрольної групи (група 4), що містить тільки 4 суб'єкти. Суб'єктам зробили вакцинацію внутрішньом'язово в 0 та 28 дні. Зразки сироватки збирали 28 днів після першої імунізації та 14 днів після другої імунізації. Аналізи ЕїЇїза виконували, як описано вище, на сироватці, взятій в 28 день після першої імунізації та 14 день після другої імунізації. Аналізи нейтралізації виконували, як описано вище, в 14 день після другої імунізації. Групи являли собою такі, як наведено нижче: 1 ов мМас/////// 22111191 АБОІВ///::/ пи з ПУТ: ЗИ ПО ЕТО

Антиген готували, як описано нижче:

Антиген вакцини єкспресує в клітинах яєчника китайського хом'яка (СНО) як 987", вкорочена химера, що містить пептидні послідовності з глікопротеїну 90 вірусу простого герпеса (Негрез 5ітріех) 2 (НБЗМ2) на його М та С-кінці. ЗВ" вкорочений на домені його С-кінця, який містить якірну послідовність мембрани, і, таким чином, виділяється в культуру супернатанта.

Для перших трьох груп, 15 мкг 9877, що містить 500 мкл розчину фосфатного буферу, АБО1В або

АБЗОТЕ (приготовлений як в прикладі ІІ, 2, описаного вище) вводили шляхом внутрішньом'язової ін'єкції. В групі 4 вводили внутрішньом'язово тільки розчин фосфатного буферу.

ЇХ.1.4 - Результати

Як можна побачити у фіг. 13, спостерігали значно вищі титри ЕГІЗА анти-9В для двох ад'ювантних груп в порівнянні з простою групою о9В (на 8 та на 5,5 порядків вище для 98 та АБЗО1В і др/АЗО1Е відповідно). Титри антитіл після дози другої імунізації були небагато вищими (1,5 порядки) в групі 9В/А5О18В в порівнянні з групою 9В/АЗО1Е.

Множинне порівняння: Тукей - НЕЮ

Проста | (81777777 47917 11111111

АЗОТЕ ЇЇ 78 7771777771717111552939.4....ЙЮЙ.1777И11111111111Ї11

АБОІВ | 8 | 56942 | 7 | Щ Ї

Проста«АЗОТЕ - АБО1В

Що стосується титрів нейтралізації (фіг. 14): - Не спостерігали специфічних антитіл нейтралізації в простій групі 98. - В обох ад'ювантних групах знайдені специфічних антитіла нейтралізації. - Спостерігали подібні рівні антитіл нейтралізації в обох ад'ювантних групах.

ЇХ.2 - Миші

ЇХ.2.1-ЕГІ5А анти 98

Кількісне визначення антитіл анти-с60В виконували за допомогою ЕГІЗА, застосовуючи 98В як антиген покриття. Антиген розбавляли в кінцевій концентрації 1 мкг/мл у розчині фосфатного буферу та 100 мкл інкубували протягом ночі при 4 "С на планшети для мікротитрування з 96 лунками. Далі планшети насичали протягом 1 години при 37 "С з 200 мкл розчину фосфатного буферу, що містить 195 альбумін коров'ячої сироватки. Серійні розведення на два порядки сироваток додавали (100 мкл/лунку) та інкубували протягом 1 години 30 хвилин при 37 "С. Пластини промивали чотири рази розчином фосфатного буферу, 0,1 95 Твіном 20, а 100 мкл пероксидази хріну стрептавідін додавали до кожній лунки протягом додаткових 30 хвилин при 37 "С. Планшети промивали чотири рази розчином фосфатного буферу, 0,1 95 Твіном 20 і один раз водою. Потім їх інкубували протягом 10 хвилин при 22 "С з 100 мкл 75 95 розчину тетра-метил-бензидину в 0,1 М цитратного буфера, рН 5,8.

Дану реакцію зупиняли за допомогою 100 мкл 0,4М Н25О» та зчитували при 450/620 нм. Титри Еїїзза визначали інтерполяцією показників ОО з еталону ЗОЙМахрРго. Титри виражали в ЄО/мл.

Статистичний аналіз виконували в 14 день після даних ЕїЇїза вакцинації 2 із застосуванням

ОМІЗТАТ. Протокол, який використовували для аналізу розбіжностей, можна стисло описати наступним образом: - Год трансформація даних; - тест Шапіро-Уілка (Зпаріго-ММІК) для кожної популяції (групи) для перевірки нормальності розподілу груп; - тест Кохрана (Соспгап) для перевірки гомогенності розбіжностей між різними популяціями (групами); - аналіз розбіжностей на вибіркових даних (односторонній); - тест Тукея (ТиКеу) НЗО множинних порівнянь.

ЇХ.2.2 - Аналіз нейтралізації

До проведення даного аналізу клітини МКСО5 (10000 клітин/200 мкл середовище МЕМ) розподіляли на мікропланшети з 96 лунками та інкубували протягом З днів з 595 СО» при 37 "С. Виконували двохпорядкові розведення (60 мкл) інактивованих сироваток (30 хвилин при 56 "С) інкубували з 60 мкл вірусного розчину (800 МО/мл) протягом 1 години при 37 "С. Після інкубації 100 мкл суміші сироватки/вірусу інокулювали на мікропланшетах з 96 лунками, що містять клітини МКО5. Пластини центрифугували при 2000 обігів на хвилину протягом 1 години при 35 "С. Після інкубування протягом всієї ночі при 37 "С, планшети фіксували 80 9о розчином ацетону (20 хвилин при -20 "С). Розчин ацетону відкидали, а позитивні клітини СММ визначали, застосовуючи специфічний моноклональний анти-безпосередній ранній антиген І (І-І) протягом 1 години при 37 "С. Планшети тричі промивали: розчином фосфатного буферу та біотін-кон'югований анти-мишачим Ід додавали в кожну лунку та інкубували протягом 1 години при 37" С. Після стадії промивання додавали пероксидазу стрептавідину хріну протягом додаткових 30 хвилин при 37 "С. Планшети промивали чотири рази та інкубували протягом 10 хвилин розчином щиро синього. Реєстрували специфічні пофарбовані сигнали, досліджуючи їх під мікроскопом. Титри нейтралізації виражали як зворотно пропорційні щодо самого великого розведення сироватки, що надає 5095 скорочення позитивних клітин СММ в порівнянні з вірусним контролем (СММУ « клітини без сироватки).

ІЇХ.2.3 - Внутрішньоклітинне забарвлення цитокіну

Внутрішньоклітинне забарвлення цитокінів Т-клітин виконували на лімфоцитах периферичної крові в 7-й та 21 день після другої імунізації. У мишей відбирали лімфоцити периферичної крові (1 депо на групу). Антигенну стимуляцію лімфоцитів іп міго (кінцева концентрація 1057 клітин/мл) проводили або з пулом пептиду, що включає послідовність СМУ, або з білком 98. Суміш лімфоцитів периферичної крові/антигену інкубували протягом 2 годин при 37 "С. Потім клітини інкубували протягом ночі в присутності брефелдину (1 мкг/мл) при 37 "С з метою інгібування секреції цитокіну.

Забарвлення клітин виконують наступним способом: суспензії клітин промивали, суспендували повторно в 50 мкл розчину фосфатного буферу з вмістом 1 96 сироватки телячого ембріону, що містить 2 95 Ес блокуючого реактиву. Після інкубації протягом 10 хвилин при 4 "С додавали 50 мкл суміші анти-СО4 РЕ та анти-СО8 на Ср та інкубували протягом 30 хвилин при 4 "С. Після стадії промивання в розчині фосфатного буферу з вмістом 1 95 сироватки телячого ембріону мембрани клітин просочували, повторно суспендуючи в 200 мкл Суоїїх-Суїорегпт (Кі ВесКіоп ОісКіпбоп) та інкубували протягом 20 хвилин при 4 "С. Далі клітини промивали Репт Умах5п (Кії ВО) та повторно суспендували в 50 мкл суміші анти-ІЕМ-у АРС жанти-1Ї -2 РІТС, розбавленої Регт УмМазі. Після інкубації протягом 2 годин при 4 "С клітини повторно суспендували в розчині фосфатного буферу з вмістом 1 95 сироватки телячого ембріону «з 1 95 параформальдегіду.

Аналіз зразків виконували за допомогою ЕАС5. Живі клітини закривали (ЕЗС/5552) і виконували комплектування /- 20000 перетворень. Відсотковий вміст ІЕМ-у ї- або ІЇ/2-- обчислювали на СО4- та

Сов замкнутих популяціях.

ІХ.2.4 - Протоколи імунізації

Були імунізовані 4 групи. Кожна група складалася з 12 самок мишей С57ВІ/6 віком 4-10 тижнів. нини а «ЗО ПО хо У З а 111ов1111111111711111111111111111АБОІВ///// 811 Гов1111111111111111АБОТЕ ГГ (

Антиген готували, як описано нижче:

Антиген вакцини експресується в клітинах яєчника китайського хом'яка (СНО) як 98", вкорочена химера, що містить пептидні послідовності з глікопротеїну дО вірусу простого герпеса (Негрез 5ітріех) 2 (Н5БМ2) на його М та С-кінцях. ЗВ" вкорочений на домені його С-кінця, який містить якірну послідовність мембрани, і, таким чином, виділяється в культуру супернатанта.

Для кожної групи при концентрації 1,5 мкг/дозу 9877 складається з 625 мкл розчину фосфатного буферу, або ад'юванту АБО1ТЇВ або АБОТЕ (приготовлені як в прикладі ІІ.2, описаного вище, з концентрацією імуностимуляторів 100 мкл на мл або 50 мкл імуностимуляторів на мл відповідно). 50 мкл (тобто 1/10 дози для людини 0,5 мл) вводили внутрішньом'язово. Одній контрольній групі мишей вводили ін'єкцію сольовим розчином. Ін'єкції здійснювали в 0 та 28 день. Зразки сироватки збирали через 14 днів після других ін'єкцій для аналізу ЕЇ І5А та аналізу нейтралізації. РВІ. збирали в 7-й та 21- й день після других ін'єкцій на ІС5.

ЇХ.2.5 - Результати

Титри ЕГІЗА анти - 98 (фіг. 15).

Спостерігали від дуже слабкого до не виявленого рівня антитіл анти-98В в неад'ювантній групі 98.

Однак, спостерігали високу реакцію антитіл (на 65 і 66 порядків вище) в обох ад'ювантних групах як в

АБЗО1В, так ії АБО1ТЕ відповідно. Не спостерігали статистично значущої різниці між групою АБО1В та

АБО1Е.

Множинне порівняння: Тукей - НЕЮ

Проста | (12 77772132 17771111 Її

АЗОТЕ | 12 ї17777771759317..ї...и1 11111111

АБОІВ | 12 | 39375... |... | Ї

Проста«А5ЗО1 Е - АБО1В.

Титри нейтралізації анти-СММ (фігура 16).

Спостерігали значущо вищі титри нейтралізації анти-9В для двох ад'ювантних груп в порівнянні з простою групою 9В. Не спостерігали значущої різниці в титрах нейтралізації антитіл між рецептурами

АБО18 та АЗО1Е.

Клітинно-опосередкований імунітет.

За рахунок дуже низького рівня реакції, спостережуваної після повторної стимуляції 7 зразків після

ІЇ їмунізації, не можна виявити розходження між групами і не можна розпізнати остаточної реакції для стимуляції СО4 та СОВ8 (фіг. 17). Дані реакції від слабкої до невиявленої ймовірно відбувалися за рахунок технічної проблеми при одержанні зразків. Однак, реакції можна побачити протягом 21 дня після другої ін'єкції. Дані СО4 (фіг. 18) не демонструють різниці після повторної стимуляції за допомогою В (5 мкг/мл) або пептидів (2 мкг/мл або 4 мкг/мл). Подібний профіль цитокіну спостерігають для АБОТЕ та АБО1В. Для стимуляції СО8 не можна спостерігати остаточної реакції (фіг. 19).

Дані експерименти демонструють, що для іншої антигенної композиції та в двох різних організмах ад'ювант, що має нижчі рівні вмісту імуностимуляторів, є імунологічно ефективним, як той, що має вищі рівні.

Х: Доклінічна оцінка ад'ювантної вакцини КТ5,5

Х.1 - Рецептура

Антигенну композицію, КТ5,5 продукують в засспаготусев сегмізіає, і вона складається з двох білків, КТ5 та 5, які внутрішньоклітинно і спонтанно комплектуються в змішані полімерні структури твердих частинок, кожну з яких оцінюють як ту, що містить в середньому 100 поліпептидів. КТ5 являє собою 51 кДа гібридний ланцюг поліпептиду з 424 амінокислот, що складаються з 189аа з поверхневого антигену спорозоїда штаму МЕ53З паразита Р. гаіІсірагит малярії (антиген С5Р, а. а. 207- 395), злитого з аміно кінцем білка 5 вірусу гепатиту В. 5 являє собою 24 кДа поліпептид (довжиною 226 амінокислоти), відповідний поверхневому антигену вірусу В гепатиту В. Ліофілізована гранула антигену містить приблизно 50 мкг (при розробці для внесення в рецептуру 0,5 мл з АБО1В) або 25 мкг (при розробці для внесення в рецептуру 0,5 мл з АБО1ТЕ) антигену.

А5БО1В та АБО1Е готували, перемішуючи різні компоненти (розчин фосфатного буферу, ліпосоми,

МРІ. та 0521) в резервуарі, компоненти перемішували в асептичних умовах. Потім продукт стерильно фільтрували перед заповненням в ампули або шприци. Перед використанням з метою відновлення ліофілізованої гранули з антигеном рідкий ад'ювант зберігали при 2 "С - 48 76.

Х.2 - Експерименти на мишах

Виконували два експерименти на мишах метою яких було порівняння імунних реакцій, специфічних по відношенню до КТ5,5 індукованих за допомогою КТ5,5/АБЗО18В в порівнянні з КТ5,5, В рецептуру якого входила АБОТЕ. У кожному експерименті миші С57ВІ/6 (10 мишей/групу) були імунізовані внутрішньом'язово тричі з інтервалом в два тижні 10,5 або 2,5 мкг ЕТ5,5, в складі якого є ад'юванти АБО1ТВ або АБО1Е. Дві групи, контролю А5, були імунізовані або тільки АБО13, або тільки

АБЗО1Е. Реакції антитіл, специфічних по відношенню до НВ ії С5, оцінювали для кожної миші за допомогою ЕГІЗА через 15 після третьої імунізації. Титри середнє геометричних значень антитіл та їх 95 95 довірчі інтервали обчислювали для всіх мишей, що одержували однакове лікування в обох експериментах. Статистичні аналізи виконували за даними фонду з обох експериментів з метою оцінки ефекту ад'юванту та ефектів дози антигену. Специфічні реакції по відношенню до Т-клітин СО4 та СО8 вимірювали шляхом протокової цитометрії через 7 днів після другої та третьої імунізацій на пулах гемоцитів, взятих з 5 мишей на групу. Таким чином, виявили показники для кожної групи в кожному експерименті.

Гуморальна імунна реакція

Як можна побачити на фіг. 20 та 21, обидва ад'юванти АБО1ЇВ та АБО1ТЕ індукують сильні порівнянні реакції антитіл проте С5Р і НВ.

На трьохлійному методі АМОМА на титрах середніх геометричних значень анти-С5Р продемонстрували, що не існує значущих відмінностей між АБОТВ та АБО1ТЕ для 5 або 2,5 мкг доз втТ5,5.

Для дози 10 мкг було виявлено, що ад'ютант АБО1В стимулює вищі титри анти-С5, ніж АБЗО1Е, а співвідношення СМТ "група АБО1В/ група АБО1ТЕ" складало 1,93 (95 95 СІ: 1,33-2,79; р - 0,001).

Клітинно-опосередкована специфічна імунна реакція

Фігури 22 та 23 демонструють рівні Т-клітин СО4 та СО8, специфічних по відношенню до С5Р та

НВ, які експресують ІІ -2 та/або ІЄМ-у.

Реакція СО4, специфічна по відношенню до С5Р, має тенденцію до збільшення з АБЗО1В в порівнянні з АБОТЕ після трьох імунізації, тоді як реакція Т-клітин СО8 з АБОТЕ еквівалентна або краща, ніж з АБО1В.

Реакція СО4, специфічна по відношенню до НВ, має тенденцію до збільшення з АБОЇВ в порівнянні з АБОТЕ після трьох імунізацій за винятком нижчої дози КТ5,5, в якої рівні Т-клітин СО4 рівняються між двома ад'ювантами. Реакції Т-клітин СО8, специфічні по відношенню до НВ, індуковані за допомогою КТ5,5, в складі з АБО1ТЕ, є еквівалентними або кращим, ніж реакції, індуковані за допомогою КТ5,5, в складі з А5О18В.

Вважають, що вказані відмінності знаходяться в межах очікуваної мінливості аналізів клітинної імунології.

Доклінічна оцінка вакцини КТ5,5/АБЗО1Е на мишах виявила прийнятний профіль безпеки, подібний профілю КТ5,5/АЗО18В.

ХІ: Клінічна оцінка КТ5,5/АБЗО1Е.

Рецептури готували, як описано в прикладі Х вище. Сахарозу застосовували як наповнювач в ліофілізованій гранулі з антигеном. Як і в прикладі Х, рідкий ад'ювант застосовують з метою відновлення ліофілізованого антигену. АБОТЕ готували, як описано в прикладі 1І.2, та зберігали при 2 "С - 48 "С до того часу, поки він буде потрібним для відновлення.

Зараз ІЇ проводять рандомізоване подвійно-сліпе дослідження безпеки та імуногенності КТ5,5 з ад'ювантом АБЗОТЕ фази за участю дітей віком від 18 місяців до 4 років, проживаючих в Габоні. Схема вакцинації являє собою схему вакцинації дітей в 0, 1, 2 місяці. Для КТ5,5/АЗО1Е при введенні З доз внутрішньом'язово за схемою вакцинації в 0, 1, 2-місяці дітей віком від 18 місяців до 4 років, проживаючих в малярія-ендемічній зоні, задачі дослідження є наступними:

Первинні - оцінка безпеки протягом одного місяця після введення дози 3; - визначення ефективності щодо емульсії масла-в-воді ад'ювантної вакцині КТ5,5 з точки зору реакції антитіл анти-С5 через один місяць після введення дози 3.

Вторинні - оцінка реактогенності протягом одного місяця після введення дози 3; - визначення ефективності щодо емульсії масло-у-воді ад'ювантної вакцині КТ5,5 з точки зору реакції антитіл анти-НВ через один місяць після введення дози 3; - спостереження за серозахистом проти гепатиту В протягом одного місяця після введення дози 3; - спостереження за реакцією анти-С5 протягом одного місяця після введення дози 3.

Третинні - безпека в межах від 1 місяця З після введення дози З до 12 місяців після введення дози 3; - гуморальна імунна реакція на антиген С5 протягом 12 місяців після введення дози 3; - гуморальна імунна реакція на антиген НВ протягом 12 місяців після введення дози 3.

Дослідницькі - оцінка Т-клітинно-опосередкованої імунної реакції на антиген С5 протягом 12 місяців після введення дози 3; - оцінка імунної реакції В-лімфоцитів на антиген С5 протягом 12 місяців після введення дози 3; - спостереження за реакцією анти-С5 протягом одного місяця після введення дози З відповідно задокументованому статусу імунізації НВМ при скринінгу.

В дослідженні приймали участь 180 суб'єктів, 90 з них одержували ад'ювантну вакцину з ад'ювантом емульсії масло-у-воді, попередньо запатентованим (іменованим "контролем" в таблицях нижче), а 90 суб'єктів одержували ад'ювантну вакцину з АБОТЕ. Був проведений скринінг здорових дітей чоловічої та жіночої статі віком від 18 місяців до 4 років. Вакцини вводили шляхом внутрішньом'язової ін'єкції в дельтовидний м'яз.

Зустрічальність і природа симптомів (стійких і не стійких), про які повідомляли протягом 7-денного періоду пост вакцинації (дні 0-6) після кожної дози і в цілому (Вся вакцинована когорта) 11111111 | Будь-якийсимптом | Загальнісимптоми | Місцевісимптоми:/ 111111 1959с1| | | |959с1| | | |9595с (|трулаМ п (95 (ШО ОС (м ока 96 ф- ОС (м Ти 96 0 с дозаї (53-19 оз ее о зе вве я зе зе зве зе

Гр.2 190 | 47 522|41,4|62,9| 90 | 26 |28,9 119,8 39,4 | 90 | З2 35,6 |25,7 46,3)

Гр.2 | 87 | 53 60,9149,9|71,2| 87 | 39 |44,8 341 55,9, 87 | 34 Ї39,1|28,8 501

Гр.2 | 85 82 96,5190,0199,3| 85 | 50 |58,8 47,6 69,4 | 85 | 79 192,9|85,9 97,4 доза вити /суб'єктів|Гр.2 | 90 | 85 (94,4|87,5|98,2.| 90 | 70 |77,8|67,8| 85,9 | 90 | 84 |(93,3|86,1197,5

Гр.1-КТ5,5.АБО1Е; Гр.2 - контроль; ГГ. - нижній ліміт; ОЇ. - верхній ліміт.

Для кожної дози та в цілому/суб'єкту:

М - кількість суб'єктів як мінімум з однією введеною дозою; п/96- число/відсотковий вміст суб'єктів, у яких проявляється як мінімум один симптом при введені будь-якої вакцини, що досліджується.

В цілому / для дози:

М « кількість введених доз; п/до- кількість / відсотковий вміст доз після прояви як мінімум одного симптому при введенні будь-якої вакцини, що досліджується; 95 95 СІ - точний довірчий інтервал, І. - нижчий ліміт, ОЇ. - верхній ліміт.

Вказані дані демонструють, що КТ5,5 вакцина з ад'ювантом АБОТЕ надала прийнятні результати реактогенності у дитячій популяції при порівнянні з контрольним препаратом.

Серологічні реакції вимірювали, оцінюючи реакції антитіл на дубликації НВ та С5Р (анти КЗ321ІК).

Сироватку для визначення антитіл збирали при скринінгу, в 60-й та в 90 день (при другій вакцинації та третій вакцинації). Рівні антитіл проти С5 вимірювали стандартною методологією ЕГІЗА, застосовуючи антиген КЗ32І ЕК, адсорбований на пластині з антитілом еталон-стандартом як контроль відповідно до стандартних операційних процедур лабораторії. Результати записують в ЄО/мл.

Антитіло, специфічне по відношенню до поверхневого антигену гепатиту В, вимірювали, застосовуючи комерційно доступний імуноаналіз ЕГІ5ЗА (тестовий набір АОБАВ ЕЇА від АрБрою), або еквівалентний аналіз відповідно до інструкцій даного аналізу. Результати записують в моО/мл.

Показники серопозитивності та МС для антитіл анти-С5 (Вся вакцинована когорта) 11111111 б5ЕШУМЛ | ом Її 11111111 рес | 77771 5зсі її "Антитіло| група|хронометраж М п) 96| ШІ | ОЇ |значення І | Ш1 | Міп | Мах скринінг Щ|8910100| 00141 03 |09 | 09 | «05 | «05

Гр. 1

Анти- с5 скринінг Щ|9011/|11|001|60 03 |02|09 | «051 05

Гр.2

ФІМОес) | 80 |80|100|95,5| 100 | 164,8 |134,1|202,6| 6,3 |2093,6

Гр. 1-КТ5,5.АБО1Е

Гр. 2 - Контроль;

ОМС - середнє геометричне значення концентрації антитіл, обчислене на всіх суб'єктах;

М - кількість суб'єктів з доступними результатами; п/9о х кількість/відсотковий вміст суб'єктів з концентрацією в межах вказаного інтервалу; 95 95 СІ-95 95 довірчий інтервал; І І. - нижчий ліміт, ШІ. - верхній ліміт; МІМ/МАХ - мінімальний/максимальний.

Показники серопозитивності та МС для антитіл анти-НВ (Вся вакцинована когорта) 11111111 | яко МмМОомМи | // смс Її Її пил Я ПЕТ ет ПОНЯ ПОН ТЕСТУ о ОНИ ПОН ПОЛЯ "Антитіло|група|хронометраж МІ п| 96| | ОСіІзначення | 0 / Мі | Мах скринінг 89043 48,3137,6|59,2| 40,8 | 23,3 | 71,4 | «10.0 | 46421,6

Гр. 1

Анти-

НВ скринінг 190037 41,|30,8|52,0)Ї 20,0 | 12,8 | 31.0 | «10.0 | 30796,4

Гр.2 (ФІП(090) 80,80 |100|95,5|100| 19485,0 |13511,3(28099,9| 178,6 (1103974)

Гр. 1-К15,5.АБО1Е;

Гр. 2 - Контроль;

ОМС - середнє геометричне значення концентрації антитіл, обчислене на всіх суб'єктах;

М - кількість суб'єктів з доступними результатами; п/9о6 х число/відсотковий вміст суб'єктів з концентрацією в межах вказаного інтервалу; 95 95 СІ-95 95 довірчий інтервал; І! І. - нижчий ліміт, ШОЇ. - верхній ліміт;

МІМ/МАХ - мінімальний/максимальний.

Вказані дані демонструють, що рецептура вакцини КТ5,5 з ад'ювантом АБО1ТЕ надала прийнятні гуморальні імунні реакції у дитячій популяції при порівнянні з валідованим контролем.

Приклад ХІ!: Доклінічна оцінка вірусу вітряної віспи з АБО1В в порівнянні з АБОТЕ.

Вакцина-кандидат складається з вкороченого оболочкового білка МАМ, 9Е, продукованого в клітинах СНО.

Для даного дослідження мишей С57ВІ /6 (п-48) спочатку вакцинували однією дозою для людини (НО) Магіїгіх (4-4 (09 бляшкоутворюючих одиниць/дозу), яку вводили підшкірно. Через п'ять тижнів після початку вакцинації Магіїгіх мишей розподілили на 5 груп по 12 мишей у кожній, і в день 0 та 28 вводили їм внутрішньом'язово (в великогомілкову кістку) 5 мкг тільки ЗЕ, 5 мкг ФЕКАБЗОТЕ" (1/10 НОЮ) або 5 мкг

Я9ЕХАБЗО18В (1/10 НО). Контрольній групі мишей (тільки з початковою дозою) вводили ін'єкцію сольового розчину (0,9 95 масі). Імунні реакції оцінювали в 14 та/або 30 дні після другої вакцинації. Оцінювали рівні всіх специфічних антитіл ДЕ та зустрічальність (І2/ЛЕМ-у) Т-клітин СО4 та СО8, що продукують цитокін.

Реакції, специфічні по відношенню до антитіл ЯЕ:

ЕЗА був розроблений з метою знайти і визначити кількість ЗЕ-специфічних антитіл в сироватках мишей, застосовуючи білок ЗЕ як антиген покриття. Титри ЕГІЗА визначали як зворотну величину розведення сироватки, продукованого виміром поглинання (оптична густина), рівного 50 95 показника максимальної абсорбції. Титри ЕГІЗА обчислювали за допомогою аналізу регресу.

Дані демонструють, що ЗЕ АБЗОТЕ та 9Е А5БО1В індукували подібні рівні ЗЕ, специфічні по відношенню до антитіл (р-значення » 0,05). Обидві рецептури стимулювали значуще вищі реакції в порівнянні з тільки антигеном 9Е (10-13 порядки, р-значення « 0,05) в як в 14-й, так і в 30-й день після другої вакцинації (фіг. 26).

Реакції ЗЕ, специфічні по відношенню до СО4 та СО8

Продукування цитокіну оцінювали в Т-клітинах СО4 та СО8, застосовуючи техніку внутрішньоклітинного забарвлення цитокінів. З кожної групи 12 мишей відбирали клітини селезінки через 30 днів після другої вакцинації та 4 групи розміщали в пули по З селезінки. Клітини селезінки (1 х 105) інкубували протягом 2 годин в присутності пептидів ЗЕ (63 пептидів), що охоплюють суцільний білок ЗЕ (20аа пептидів / 10аа накладення), а потім клітини інкубували протягом ночі в присутності брефелдину. Далі клітини забарвлювали флуоресцентною тАбБ, специфічною по відношенню до клітинної поверхні СО4/СО8, після просочування внутрішньоклітинними цитокінами 1-2 та ІЄМ-у.

Як показано у фіг. 26, хоча подібні профілі цитокіну (П2ЛЕМ-у) стимулювали як за допомогою Я9Е

А5О1В, так і рецептурами ЗЕ АБО1ТЕ, рецептура АБО1В стимулювала більшу величину СО4 та СО8 клітин, продукуючих цитокін (на 2 порядки, р»0,05 для СО4, на 3,6 порядки, р»0,05 для СО8). За рахунок несподівано високої мінливості реакцій Т-клітин можливість знайти істотну різницю між ад'ювантними дозами була дуже обмежена («50 95), Важливо, що обидва д9Е, в склад яких входили

А5БО1В або АБО1Е, стимулювали Т-клітини СО4, продукуючі цитокін, із значущо вищою величиною (на 13,3 порядки, р«е0,05) в порівнянні з тільки ЗЕ. Вищі різні клітин СОЗ також стимулювали 9Е з АБО1ТВ або АБО1Е (на 3,8 порядки, р«е0,05) в складі рецептури в порівнянні з тільки антигеном ОЕ.

Приклад ХІІ: Доклінічна оцінка АБО1В проти АБО1ТЕ на моделі тхорів, інфікованих грипом.

Матеріали та способи

Самок тхорів (Мизхієїа ршогіив Тиго) у віці 14-20 тижнів доставили з розплідника МІЗАМ (Гемпшир,

Великобританія). На день 0 тхорам почали вводити гетеросубтиповий штам НІМІ інтраназально в дозі 250 мкл А/5іосКпоЇпт/24/90 (4 Год ТСІОво/мл). На 21 день тхорам вводили внутрішньом'язову ін'єкцію повної дозі, для людини (1000 мкл дози вакцини, 15 мкг НА на штам А) в комбінації з Н1М1

А/Мемж/ СаіІедопіа/20/99 (15 мкг/мл), НЗМ2 АЛЛуотіпад/3/2003 (15 мкг/мл) та В/)Лапд5и/10/2003 (17,5 мкг/мл). Далі на 42 день тхорам проводили провакційну пробу інтраназально 250 мкл гетеросубтипового штаму М/п.А/МУ7/55/04 (4,5 І од ТСІЮзо/мл).

Вакцинації в 21 день проводили або простою трьоохвалентною рецептурою ("проста" в таблицях нижче), або трьеохвалентною ад'ювантною рецептурою з АБО1ТВ (АБО1В" в таблицях нижче), або

АБО1ТЕ ("АБО1ТЕ" в таблицях нижче). Рецептури готували, як описано в прикладі З вище.

Моніторинг температури тіла:

Індизначення відуальні температури контролювали протягом періоду проведення провакційної проби та оцінювали, застосовуючи імплантати телеметрії, які реєстрували кожну індивідуальну температуру у тварин кожні 15 хвилин до і після проведення провакційної проби. Всі імплантати перевіряли та обновляли, і виконували нове калібрування за допомогою О5І до розміщення у черевній порожнині. Всіх тварин розміщали індивідуально в одній клітці протягом проведення вказаних вимірювань.

Температури реєстрували кожні 15 хвилин протягом 6 днів до початку вакцинації та протягом 4 днів після початку вакцинації, а також З дні до проведення провакційної проби та протягом 7 днів після неї.

Випробування на інгібування гемаглютинації (НІ).

Методика тестування

Визначені титри антитіл проти гемаглютиніну трьох штамів вірусу грипу із застосуванням випробування на інгібування гемаглютинації (НІ). Принцип випробування НІ заснований на здатності специфічних антитіл проти грипу інгібувати гемаглютинацію курячих еритроцитів (КВС) під дією гемаглютиніну вірусу грипу (НА). Зразки сироватки спочатку обробляли 25 95 розчином нейрамінидази (КОЕ) та інактивували за допомогою тепла з метою видалення неспецифічних інгібіторів. Після первинної обробки зразки сироватки, розведені на два порядки, інкубували з 4 одиницями гемаглютинації кожного штаму грипу. Далі додавали курячі еритроцити та оцінювали інгібування аглютинації із застосуванням проміжків для зчитування. Титри виражали як еквівалентні величини найвищого розведення сироватки, в якому вона повністю інгібувала гемаглютинацію. Оскільки перше розведення сироватки становило 1:10, невизначений рівень був оцінений як титр, що дорівнює 5.

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз виконували на титрах НІ (41-й день перед проведенням провакційної проби із застосуванням ОМІЗТАТ. Протокол, який використовували для аналізу розбіжностей, можна стисло описати наступним образом: - Год трансформація даних; - тест Шапіро-Уілка (Зпаріго-МЛІК) для кожної популяції (групи) для перевірки нормальності розподілу груп; - тест Кохрана (Соспгап) для перевірки гомогенності розбіжностей між різними популяціями (групами); - односторонній аналіз розбіжностей, проведений в групах; - тест Тукея (ТиКеу) НЗО множинних порівнянь.

Визначення титру вірусів в назальні змивах

Всі зразки назальних змивів були спочатку стерильно профільтровані крізь фільтри Зріп Х (Совіаг) з метою виключення бактеріального забруднення. 50 мкл серійних розведень назальних змивів на десять порядків переносили на пластини для мікротитрування, що містили 50 мкл середовища (10 лунок/розведення). Далі додавали 100 мкл клітин собачої нирки Медлін-Дербі (МОСК, 2,4х105 клітин/імл) до кожної лунки та інкубували при 35 "С протягом 6-7 днів. Після 6-7 днів інкубації середовище для культивування обережно видаляли, та додавали 100 мкл 1/20 М/5Т-1, що містить середовище, та інкубували ще протягом 18 годин. Інтенсивність жовтого барвника формазану, продукованого при зменшенні М/5Т-1 життєздатними клітинами, яка є пропорційною кількості життєздатних клітин, присутніх в лунці в кінці аналізу титрування вірусу, визначають, вимірюючи оптичну густину в кожній лунці на відповідній довжині хвилі (450 нм). Граничний показник визначають як середню величину ОО для незаражених контрольних клітин - 0,3 00 (0,3 ОО відповідає ч/- З БІШЄмМ

ОО для незаражених контрольних клітин). Позитивний результат визначають, коли ОО « граничного показника, і навпаки, негативний результат визначають, коли ОО » граничного показника. Титри поширення вірусу визначали за "Кеєй та Миепсі" та виражали як І од ТСІЮзо/мл.

Аналіз лімфопроліферації.

РВМС збирали за допомогою центрифугування градієнта густини (20 хвилин при 2500 обігів в хвилину та 4 "С) у розчині лімфоліту ссавця Рісоїї! Седапапе. РВМС повторно суспендували в 5 мл середовища для культивування (КРМІ/АЯа при 4 С) та 10 95 нормальної сироватки тхора. Добавки складалися з 100 мМ натрію пірувату неосновних амінокислот МЕМ, пеніциліну/стрептаміцину, глутаміну та 1000 х концентрованого Д-2 меркаптоетанолу. Свіжо ізольовані РВМС безпосередньо застосовували в аналізах проліферації іп міго. Клітини поміщали на 96-лункові плоскодонні пластини з культурою тканини при 2х105 клітинах/лунках та вирощували культуру з різними концентраціями антигену (від 0,1 де 1 мкг НА суцільного інактивованого вірусу) на період часу від 44 до 96 годин, а потім мітили пульсацією з 0,5 мкКі ("НІтимідину. Введення радіомітки оцінювали через 4-16 годин за допомогою спектроскопії р-емісії.

Результати

Вірусне навантаження назальних змивах після проведення провакційної проби.

Назальні змиви збирали за 2 дні до з початку вакцинації (початку вакцинації - день 0) в 1, 2 та 7 дні після початку вакцинації, а також за 4 дні до проведення провакційної проби (проведення провакційної проби - день 42) і протягом періоду 7 днів після проведення провакційної проби. Грула| 2 | 0 | я | зе | «7 | 39 | 42| 43 | 44 | 45 | 47 | 49

Проста | 0,82 | 1,84 535/| 1,85 08 | /1,82)|5771|444| 1,97 | 09

АБОТЕ | 0082 | |г2гил1|583| 1651 08 | /|162|493)|415| 24 | 0,65

ВОІВ | 081 | |2гебі|538| пе |082| |1,74| 25 | 1,89 | 1,350 09

Поширення вірусу після початку вакцинації.

У всіх тхорів спостерігали пік поширення вірусу через 2 дні після початку вакцинації. Через 7 днів після початку вакцинації спостерігали тільки залишкове вірусне навантаження у всіх групах.

Поширення вірусу після проведення провакційної проби.

Спостерігали пік поширення вірусу через 24 години після проведення провакційної проби.

Вірусне титрування через З дні після проведення провакційної проби показало високі титри вірусу (немає захисту) у тхорів, імунізованих трьеохвалентною розщепленою простою вакциною. Спостерігали менше скорочення поширення вірусу у тхорів, імунізованих трьеохвалентною розщепленою вакциною з

АЗО1Е, ніж трьеохвалентною розщепленою ад'ювантною вакциною з АБО1В.

Моніторинг температури:

Температуру тіла контролювали протягом 6 днів до початку вакцинації (початку вакцинації - день 0) та протягом 4 днів після початку вакцинації, а також З дні до проведення провакційної проби та протягом 7 днів після неї (проведення провакційної проби - день 42). Вимірювання проводили кожні хвилин і середню величину обчислювали у полудень для кожної групи. Результати можна побачити у фіг. 28.

Після початку вакцинації.

Температура тіла, що реєстрували до, під час та після початку вакцинації, продемонструвала збільшення температури у всіх групах.

Після проведення провакційної проби.

Інтерпретація моніторингу температури тіла важка. Спостерігали невелике зростання температури тіла після проведення провакційної проби у тхорів, імунізованих трьеохвалентною розщепленою простою вакциною та трьохвалентною розщепленою вакциною з АБОТЕ, але не з треохвалентною розщепленою вакциною з АБО1В. Показники, наведені нижче, одержані у низки тхорів з підвищеною температурою »0,4 76.

Зростання температури після проведення провакційної проби

Трьохвалентна проста вакцина: 5/8 (--0,4, 0,4, 40,5, 0,7, -0,8)

Трьохвалентна АБО1ТВ 0/8

Трьохвалентна АБОТЕ 6/8 (--0,4, -0,4, --0,5, --0,5, --0,9,--1,6).

Дане зчитування менш сильне, ніж інші зчитування, застосовані у тхорів.

Випробування на інгібування гемаглютинації (НІ)

Зразки сироватки були зібрані за 4 дні до початку вакцинації, 17 днів після початку вакцинації, через 21 день після імунізації та через 13 днів після проведення провакційної проби. Результати можна побачити у фіг. 29 та 30. Для всіх трьох штамів вакцини спостерігали статистично значущі вищі титри НІ у тхорів, імунізованих трьохвалентною розщепленою ад'ювантною вакциною з АБО1В або

АБЗО1Е в порівнянні з трьеохвалентною розщепленою простою вакциною. Не спостерігали різниці між двома ад'ювантними групами. Порівнюючи з іншими групами, спостерігали статистично значущі вищі титри НІ перехресної реактивності у А/Мем/ МогкК НЗМ2 (штам провакційної проби) після імунізації тхорів трьеохвалентними розщепленими ад'ювантними вакцинами з АБО18В.

Те пі им ВАК І

ПО ЕЗБЕНКСЯ еБеНКея гя дат. зга. од. м. Х, Ах, замчеВад МУ Ах хдгіватй

СУК Нама СОЮ ТИВ прут ериіих СКК

БЕН Мов СКОКИН Я

Н жом ан

М в я Я

ОЗНАК г вк щен 5

Живу і ж З хакі

Ком с я до м

Еірхассході і сі: Ск м В км

ВІЗІКОМ М ЦИМИ ММ М Ох МОВ НОЯ

М

Каси им дейміі МКК

Я; не ПВХ ЗАСН сил ККУ сечжкдімеха томі Й СХ сеожа

ЗИМИ ом ою КМ хі:

Крат од Юма т дм

КТКІЖЕМИАТИтТМІ ІМ ДЮ РО МеЯТ АХ фреска пт Ко ВЕ

Мер яння пов В Я

: нн і я пк си ВК ТМ і ! дручемии ЛК МК ! їж шк нн НН

Н М по о АХ х х ;

Н ТО Др диню мух .

НІШ ї о ! і і : У ;

Н КЗ Не Й і : і ! Н НН тож за Шо, і ! НИ МО У жо щі ! і

І щ А Хстиєттюх ІН 1 Е і ЕНН НН нон В НН А НО СМ зниНННЯ ї г р М ІК КУ ПИ ИН Н 1 Ж 5 ТЕКТИ НКУ КК КИТИ МВ ВА и ЕК АН а і

Н пон а : ш ПОМ і

МИНЕ хх сосок МАКИ То ИН т хі ікло пиття яння тини с о

Подххх ї па м я її ЩЕ

ГгАйдоо о ЗОнни г Гопгототто тт ААМА ТАТ НК КК ТТ КАТА Т. ІН уд ан а НН пееттлигрия да пи:

МІШКУ нн ах о о : : ї : А і - і нн МАННА

СП ПОН :

Шо Н

З дае ВІМУУ СНЕКИ ЗДМУ КЕ і

ЩЕ ПО НН: її щ ДА а й ; х Шрдуутт тини й !

Ох. ; : її г : : : і я : Ї : ! ге що | : ще

Її шо кхо : ; ! оо лк Е щ . і : ї Б і : ІЗ ї ; Н ше дення ОЇ ЕН ря ЕЕ сохзвняя Н

Ток : Ії В Н їз : З ЖОВ Н

У : ВО ш Ще ї 5: Й ! їх : она а Не

Н ГУ ве АННА вий В кни т поко '

Н кт МКМ ОМ екон ии 00 ДТЕК Ме Кемекеою СІДМЄТАХ АК

Зешее -ї нн : ;

Хе ї яю юю юю їх Ж Шк і

ДО аниовия їх ї. м у м м ї !

ПЕКИ . 1 ПО НК і : - песен : ОПП Ех пошани що пи

В Е пижжкету іже ПМК ІМ : ї 7 ВДККЖ, учнях ! ! ШЕ і ож! | і ! В і ї Кі

Н їх В ї й й

Н 1 ях: - ! У тю | : й ' Е дк т тд ІН ! г х ОХ Еї

КЕ вінннпннтттиует ее ес и КВ мосесссіх НН М і х й ПисХеМІ я МЕ Км и СЕ МИХ і

Пов в и в пах ї нин в: с

ПЕ орех пуття хх з СНИ Ки

Мер МІ нн іонним ТТ: Н

Пе хе ГУ пзжуяужннуяуттяяяя я няття х він я

Ор Й й ї шення

ПДК им тюки мк НН о я пе

НІ Мити АХААМАКТЯ : ще и

Не оо п а я - !

УМХ КА юю юю жк юю й ше й плмеміни КМр ЕГІУ : га ї БЯ :

Н ЖЕ Лд дусииитимяя тля й. я ех Кі

М РУШ ОЧИУ й

Н т ОХ й

Н Ж ше | : ' шк Ех 3 ож ї сооваднаня І

Н ЩО Н ї КО і

Н 5 п : ше і

Н том Щ кін

Н От -- і З ЩЕ ж Х ПО НН МАУ і су в І ТОД м МЕМ лек ЩЕ х й Ккхтеемсекткх протя кхкуя зачлкюктюкєкю кання АКА КАНАЛАХ АААААААААААХ ві Н ї її І . ЖАКА ВАННА КАК кН ких й їх

МО дже Н п ах ш Е ох АНА ДИНА НААН : ща ЩЕ

Вова Я : кока ни и

В ОЙ де пе юю КТК КИ КТ Н

ПЕ они ннттттттттння пенею пжеееннк рекет еккт тут пек і ши і дАчхкКюж ххх ! пан п

ШИ в в я І ! БО лаккААЛАЛАЛАААААВИ и А АААААА КИ ААИТАКАКК ї

Я ки ме І

Н : : | І : : : | . І

Е Н - х ї ї й :

І і ї ї І ї ! : :

Я І | . х | : с : ТИ : м ! : «АК ух 1: Е

Її пе АКА - п

Е х : І Кл Я

Е са : ЕНН ПЕ Е 3 ШЕ Н І пі Й ! 1 - : ВН НЕ ї : п ї 11: НЕ Її і

Н Ку : ТР: НЕ Її : У ї І ті і Е : соя ї ШІ: НИ і Е

З Я 1 ї ' і ІЗ Ах ї НВ | БІВ : хх : ох гі і Ії

Н М: : рої НИ Шу і

Н - : ї:ї Гі т | !

Н су тору НИШН і Гл ї й в НН рі РІ? 1:

Н х Н НН НИ ТЕ і

Н : НИЙ їі Рі ї

Н х : : ЩО і НЕ р

Н т : 1 ще і НМ 11 ! БУ : 1 А НИ її 1 ' Ж І 1 ТВ Н її КУ

Н п : НИК: ' | НИ і

Н ш і НЕ Н НИ Е

І х Н НК: НИ НІ Е

Н хе Н 1 Кох НИ: Її ; і і ЕІ З: : х Н ТО БОГ НИ щ с

Н Ко Меч НИХ. Н і ЩЕ : ї ! ЯАНКХ і Н : НИ Н Зх ! і і У Бої у З:

Н Н Ощ ії їх Я і

Е Н їх їй НИ 1 Е : Н У т НИ ож ї : Н І їх к ' 1 сте ЩЕ : ш ши шин. ок її ї Н КОХ ї т НИ ЕН х її 1 Н що 1 ВЖЕ НЕ ТР ї її

Н і щу і В ої НЕ і ШЕ і 1-58 МАКОМ ж: ИНА меш ї

Е 7 Н ПЕН... -:45.. ЖК з рас ке: ї ї кн п ; не Кот Е ї ХДУ ня Ор ощяж о ! неро її дващ 1 Ов Е шк а и фол нннной нн дівки ї в и сон и і ЩЕ 3 ї хеегеофетойдессіе то фоттснх чені ню говуттю ВЕ роту й : п не НА С ЕН ик оо го Ідкотамлюцуює сист оком Н Он но ом и ; шт ії

У хкетиаХх пелети терти миня ; ПЕТ Те ї мн а НВ ї не ЕН Ве се: М НИ о: З ІН Я, ЗА ДН

А ії ВОМ за ро БК рн : й ще і ПоБОний дччнучннннянннннняй ! пишний ПИ ни

Ів МИМО УКИМАХ ення пеня

СУ поча

Н ско уко от жюютют і екю ж юю се АХА 7 ' пе не Ше :

І У АН КІ У ск и ЩІ ї

Н ож руни Уа ВН з ри В :

І ДЕК М СІ КАМ :

Н л пи АААККХАТ НТ ШЕ ї ДО ум ї Ї ї се. т ї Ба ї ї х ї : ШО Х й ї п і: и й : . . | Н ЕМ і З 7 НЯ ЕН

Я я І ї ї БЕЗ М Н : ХЕ : ї о й г і : З : 1 Н : ЩЕ о

Мод я 5 '

Н ща вті, 2. | з г : Е Н КЕ Ме У НК Роде рі

Н ра Н ХК І : дай Бо ШЕ

Н шо Н тиша МА й. ЖЕ г ЩІ

Н Ж ді ХЕ М 5 вх СОН М Гі

ІЧ РУШ ДИ ши сейнся КЕ ШЕ кщ ШЕ ї ї Н її. х ВІД шу! НЕ В РОЗД ТЕО оросюоююкосі : : їх Я : М шк пИЦУ УКЛ зала я МИХ Ідею ї Е РО Ве Со : : ТКА отуттвев НЕ

І 7 МАКЕТІВ о нн : : Го, НЕ

Ї поруку пиютютииК І ТТ Н Трейсі АКОМА МИ рочужнх | у : і п ШИ ЗО роя: ОТО жк слу упо Її пл її: ни в ян ох Файннннжю ЇЙ Тжтимеюює 1Охтмк ії: ї м ОМ що Кк їх : Н лі : 1 ПМЖ Дурний утоми аресве у ї нн мн мм мя її ! Кк Уиож и Ей уекенд уктруртнеюдтня май щої : ММК Митної ТЛА Ш Ши одн і пон нин шт : мнения Уч пе х Н хо нн а ж я х С ОН а плрея : 5 СФекктиєттєєєєтєєєюєю кю п

ПУ А им Є да не я ї ї пні ДЯ НМ тк ше вай Вій С й світо попою т Н : пощння ШЕ і патАДАААН Ан аллля ще і ооо ! :

Н МИХККУХ рт й

Н ККУ й і Що й ї зе. ЖЖ З . й ї х і : й ї Сб шмд. ! х ШО ММ З | й ї х Що | о

Н - ко й ї дО | й і : « і : б : ІЗ я ї ; ї С ї І Її Н ГНН ко ї - : ї Н Н ї а, ї ї : І Н і ї Я -ї ї І : уми Н рі їх мо КМ руд ме Й що ще Ш : шо М ГО домкх ее ке г : лОВУА пт ГЕ п Се ща г : : : МИНЕ ІОН т ех МИТ ЩХ Га 1 пооуо х МИ ТІ іч МОЙ ЯВИ: БУ ще : под ї МЕ МИ ї МОХ що БЕ гі

Я ГУ Н ке ШІ од п ЩІ щи КОМ сш 1 Б Н т. Ти РО КУ па ТЕПИ ХК сне ннананнния ЩЕ 1 оо ННІ МИ ЖИВ НО ДШМ інн или М У Я і

Я Зими п С ОО : : ну ту й : Медея Гинеюсинх р ениувонх Фауюлютня: 1 Беж КИ дини КІ шАИИ пОТМЙМая З:

Я ЕМ Метихети ик Ху Вин : для, Ед Ті

Н Пт вежею УАД ую туя ни ин Не ! ї ЕОР АСТ ІАЖЕ ї ЗК : Зх. Х ях 2-х тю тити тюлю їм. НИ НН НК Ден сдеттмх й

Ок х ще пон наня ооо вав

М ни ах пи

С пн : пеня няння ення ї дит уми: Кі ВКМ т мито : пити плн ннннннннку : панни мі

Е птн ААКАХ НААН ЩЕ

В АТАК Ж АК КК М ЖК і . : ДІДУ пули й : 2 Її. її її

ОО ї хг: : У Н й : Хо ще й : ЛІ Н о ї с Н

ЩЕ Н її

Е Ба Н Ф : зх т ЕЕ . ЕН Ї : ї ' ї : В ї : рі ' 1: ї Еш і ї Мак ї ї ЩЕ

Ії їх ! СНИ ТИ де вч: рі

В пу з КОН УК як

Е в Я Ка ї шМ Ех г ш ї по лдщої ШОЖІ Н п ВО ВА її ї що ЖІ ВОК Н ЕЕчнн ЕН НЕО ЩЕ ї х. І ї ї шен пита Зшия ре 1: ї пе І п НЕРУ ек ШІ БО ЩЕ ї С ї пола Мод « пдих Мої ВК і : Боже в КЕ ро ЖД КИОЇ вик її ї Кто щу п шоп ШЕ ав ШІ КЕ ЕЕ і ї МО ї Р МЕ Ваня оп М ще ш ї « І х дез рен МОЖЕ ШИТИ ІЗ Н КОХ з НЕ ї їояежох МАЖХ ре МИ ЩІ намір ВН, суху Кн Я се : іа Мор и ниття т Я ребро ш ї у дае ЕК нннуте Ми ткрння ТАКТ ! " почуй т В леді хни З пись пиежжи ОЇ Тихим мит п МКМ ом : : юні Пк : зх, і Тосюжхщю 175 її ї їх о екосинном ілянпини ОЇ : і снення Ще ї їх питииииик нен Тим т ня Н ще Н БУ вв нан фоллмтня тити шен ди щу ТОЖ: їх НИ НН ви НН НН ; : ! Ян ПИЛИП МУ ММ МАХ в ення МІП ХМ ПО

Н ХМ МКМ У ЗМК КИМ ДИКІ КИ НИМИ т ДИТ Тут ВИ КУ КИИМ СКМ,

Н З ожжкг кі Б підем Хр У Я

Н З уж МмлАлумах м ба ух

ОВ. 0 дечи сте

Ох : сему : ККУ Н У шмНдКУ ол х

ТОЖ же жили лях іжитх

Босха у митися

ТО Жію Ех Е Н

Кок : нт Е ' їм її ' : ї ' хм НИ ШИН їх ї НИ ян Н 155.4 З ииинн КЕ Н

ЕНН Я : ї КН Н

Бо ї Я фнич о КС Н

Н БУ : . шт ших пу КО І

ОКЕАН сн маша ЖЕО і. ОЗ. щ У Е

Н ЩО Не в Гео МИХ я КОЖ МТ -Х спе І

Божа 01 В й І М КУ МИ БЕКОЇ ВН шо рок оф охо МКК ем МКК зу ММ з КК отул М М лу ОКК оряния ер

КО. Н із Пак Її дама Її КОЛО І хо ТОМ ИМНМХК гоодамий І ПХОМНИМАКЮТ , БУ ИН ниКимІ ух у - 1 роджх їжу З Роками Її Н пежи У Н мим я п

Н рошхамж: Рожа і і хжюмеихиі, Ша ВО щої

ОТ рожі РОК ЖАО рух І ММК І удо. МЕККА ІОВ НІ

Н І Ї Н ї Я : : т Н : их гЯН рення в. мон нов нн и нн о п в нн нон

Пише Е щ ї Б Н ек ї д і. ря Н рам ї ГО Н хх ї Мд 1 мн кн п пн пн пн п в

В ІНК БУ 1 щ Н їх Я ЕХ Н ром В л ї УЖ : ще ї це 1 : ооо нов кн о и нн и в п в на в ци т х ї м Ку У ? сх : см т не НИ що

Во осв о КАН НН НН Сх Кн нн розро п о ко нн кн нн о в п и нн м и В ! МУ Денте 35 ВЕНУ ХНИ, КТК ЦЮХ, пут укус Кк КВК ЖНОМЕ : Е Н

Н В що - Пор ' ! У ПОМ БМмМімтУМИ МН ЗУМІІЯХ Н

Н Об фен є нт

Н Н пе НН ї -4 роми ОсКО т Н ї яко Н

Кох Н ун Н

Кох і ї Н

ТОЖ хм ї Н

НИШЕНКЯ І ї '

Код Н ї '

КОДІОЕ о 1 ї ря Я В Н бод Н ї Н ее ї '

Код оті їх Н

ГЕ Н с І Н

ТЕЖ оз ї ї роза Н п Н

ГБО пхМмх ї МИ Н хакі І : НЕ Н ож Тим МО Н ЕК !

КосщоЕ ї МОЙ Н ПИКА Н

Не с ЖИМ Н ГО Й

ЕЕ хх КО - Мох Ге Н

ЖЕ : де ЕМШЕ ІЗ КО ШИМИ Н

ОТОЙ ої ї І ШИ УЛУХА км: КОХ Н ж КО ж Н ех МИЛІ У ТУ Мо ЗВУ '

В ШЕ п Ве ВК сх МА ОН що : мож МК ТиМКу п ЗТ ЩИТИ ШИТИ ГНН ШХ м Н

ТЕ щ ОО НА СН З ННЯ ну пе Ех пн КЕ у ї ПММ (МИМО ЗИ ТеМО ЦДОКММАХЄ ЗИМУ ЗНАКИ о МиМУмо ЩЕ ХІМ 1 : ї У й Н В Н ї у : Н й ї я ті : :ОСВИХВЕЦ:. родимі! СЛФТИУІДУ Іжа Мам СИНУ 1 сящшеУю ї ЩБщищО Її важ 1 : : : Я ф тку пон ОД ПИ Н 1 : Н Мк : пе мхохІ фанти ФЕМ М : : і : : ї : ЕТ З Н

Н : Н ї Е. : т : і ожехоМх К

БО злак: ца опо Ро охк ої ГЕН А т шМм 1: 4 ово 153 т т М в п НН ВД

Фіг. З о і ! ї ІЗ ї дну пф у у тити ння МЕ

І а 3 пит ї МК 3 МЕМ ІК ІЕУ ї ї 1 ї м ще ОМ Її : соя ї ї ПКУ ХАМ МВВ ЕМ. : х 1 ї хаті кни атм 1 т осякоадй З ї ї 1:

ОС ЖАМОЯ што щу ї ї 1

Оле і ПИКА Н ї 1: от ху 4 БИКА КО 3 ї 1: : о ЖЖ Б ЕЕ Н : її ох Н МИМО К ТМ 2 1: їх ї Я і ї 1: 1: ше НІ Н : 1

РЖ оз ПКЕЕ і і 1:

ОО ПТМ і ї її

ОХ й ВЕОКМІМНННН Ї ї 1:

ШЕ: ЗМАЦИНН МУКУ З : и о Ва

ОТ мі ШЛОБИЦКШИМ . екУнн КУ ВИН Е МИХ ї хо Кі ре 1 ПИ МЕМ Я хОосж і МКМ КХ Ї КМ МЕНЯ.

КО оку 1 МИЛИХ : КМИН ЕМ МАХ ВУ їж ОЖЕКЬ Я МЕНШИХ, ї ПИВ МИХ їО-йООЖШЖК У ї ПЕК Т КО ИН

ЕОУ ! ШИТИ ВІ ї БХМІ ХМК ПЕК

НКУ хх ЗК ЛИЖ ї я Її ПОСТА МЕ ше

ОЗ ММК А Ве ВИН о

Ой МЕЖАХ ОО А ШИМИ», ШИ ЖОМИХ КК МАКСА Її

ЕШИКУ : ОО ЦИ ШИШКИ їЕ ПоКЕЕВВ Со У

ОО шщщА БМЕМХКНК МКК ВЕЖ жиио ДУМИ ІНН:

ІЩЕ Ж З КАК смоннинн в С С сонні НН,

КОЛОТ ЕК КЕ ТШХ й КІЕММХХ осшоесинив в ї і КОМ ХКЖИ ОХ ПИШНЕ ПИЛИ ТЕО ЖИ ПК ї й МеЕХМВ ЕКО ИККНКЕ КОДЕК ЖК, ВЕК МІХ ї КО ОО В НН М ВУ ї і КК І ПЕК ні МОН М У СОКН ї : зм; ЗК ПК КИ КВН МЕ ХХ З ї ще ОБ ще ПЕ ОІВ МЕ БУ ДАК ВАК Е ї ПАКЕЖКККО КК пен ПИ ОН ММ т ОиИ А М А М ї й ск ех іх щен зе ї

І кох: ТЕ ІМИТА ЯК ї ї й х

БО ї

КО Мвт ук ї ше. і ММ мим: ше! Теж мідні А ро ПЕК МЖК: З шт жи Н с НИ: Я

У мА: Н

ОО ву Н

Х. МО п :

ЩО шЯ : т р МИКИТА о і що Же ЕТЬЯ Е

Бу ше НИКА 1

ЩО САМОТИ і

ШО ЛУ х ШІ мех ;

Ом Ж й вд вк ліахахи Н

МОХ ТЕ Комі п кун ШлрБІ ОгуЕ пика Н ад МК АК ТІ НЯ шорт :

Х ЖЕ ря . і

Хо ява ий і ;

Х ХОМ : Н х СН ї Н їх йшлі « вниз Н х овен : хр ! -О ОВЕН і Же і я ПТ дДЕ ори ЕЕ е кі

МО ОМ ско ОБ ЛЕТІ пд ДЕННА сх ПТО КУТИНУ У сей БІДИ пт Чий ут ик : ІЗ її КЛЕМ ми тосж БИКІВ я ля Ху ет : БАЛІ по НН Я «дО ТЕ шлю мох з Н «ІБ М Ос жу питид М т т

ДЖЕ о 8. ВК КІ ЗОНИ ШУ Бл Упор и тет от ї Коти ОЕ ТУТ сукні ет шили ПЖ ОЗ ЕОлІ ЕН

МЖК деедумю ВД ІЖЕ ВН НН НЕ Трест Зпий ос її прози рі ЕН

Тих ДК и три ді Фр ее И АН ія п: ЕМО Л ТІ ї ще житт 11. : М олдни пучати і МОЖ ол,

МЕМ со сілемнх КАМ о НД ПИ НЯ

ПЕК КК Коти КМ КТК КЕ ВД КЛ ОК Коен МАК їх

ТЕМНИМИ КИ тини В за й їх ш ра га Ф х НУ Ех Х Е Щ В ХЕ х й х ЇУ гу БУ Е а х КУ З З х в У Б р Ії ва хх Я Кх Х хо Х ї З й

КЗ й х Х й хх Й ї х ї я сх

Фіг. ї хана цми пихіть стаких ЗІ сек СЕНИК ТАКИМ КИ

ЩЕ БМВ МН САМ ТИК А я -

ОВК сугееннчннтютютюєтття ї -ОЕ Е

З Н ї В :

НЕ ; З Ст : ;

Ж ху 1 ВНУ м и ШЕ М и СО В А А

З ЗТ хуя мулів х тя КО Жах ігмікитиитя мами ери рити тити Е: ТЕ : : х КадоКитту ИУ г І Н х

ЩО хі 5 х с ЕН ІННУ рейх Е

Сх ї що Ех : и : ТЕ х

БУ кт. ЖЕ Низ фестини Ин З яя -4 Грн

З. ОК. Мости ул Коліно, 1.03 БО ГЯВЕЕ КЕ

ЩО ОД ЖЕ Ох Я х : Ки ШУ гену І

Б Щидії ОХ т : ІНН ГаШеНННЯ ІЯ

ВЗА й дея г Боня Ко ї ще ГУВЕН 2-Х СТИ 1 . «НВО Вени Ееучідннн ке й тк ї я пеня З Ви м и А о п м о о а ан ВХ чу ТЕ й

СТ НК кін вн нон ви ВИНУ ТК: Білл БО Кі ї з щоку Н В УДЕНН ! ук КЕ ї

ХХ З Н : БЕН: мої М: І ї ТКУ т

Ж пом Н Зп ви В панни нн п и о С

В 45 Ех, пен о нини М нання На : Б | Ро: :

В ЖОлря : пл ЕН ше ГИЗННЕ: УЖ В вх НН ц Зош фІмлі ГШй Н ЕТ ПИЖ ІЯ х Чи -- БАНК ІЗ Н ї ГНН ія

ЗХ УЗН : Фостер ник пе в я ї й МОррид юн р Од оф ють ВИ лХ Не Н Шо Ши Е т Цим ЕЕ СМ прі) НБН себя ЩОБИЬ ПТУЖЕ ї м ЦО пкт МА МА НН рас НУ : І Е х ця БО маш о я НН КН

З ЗЗОАК И дхлххинк М ли Дует диктат ВЕК НО ї ПЕ НКУ

КЗ ХСН ШУ ЕТ ЛЕ : фІілтдї рт БЕЖ ЕК : ПІШОЕ 1 їх х рили их ПІШИХ : ІПЦЕОХЗ НИ МИЛЕ ЖМий шносх НЕ НУ

Х ЦЕМЕОТЬ Кп при : ВК рити МЕ осн в В НК

ШО ОЗ ОЕ рееен ето ВО он КЕ МЕТИ т Ком КК ЕВ Ки ве т хх В ВЕН : ЗА я ОХ ВН Я МТВ ЖИТІ й Оля ВЕ КК ам ЕВ д що КО БАХ во Блум: БО ОО БТяЕ її Б др І

У ЩрдиЯ х КУРКУ Н ТІ Лют Н жи Е по КК КЕ

Е ов НК п НН а НИ НН НН хя В

ЩЕ ен КК кн нн КК и п ВН де ї ї т З Х :

Ще се Е ! т Я сн : хх

Х г, шт - ня К т- що т Бо як тк (З 7 ЕК 5 і Ов 8 От -ш в с В шов

З я ся х хх ісвн я ох. В Бо ее по ле ТУ Е є х я Сея ІЗ лих хе -- У г. 5 Ії її ГЕ ра іа

У с їх п ї їх у ли к Й як се -- Ган ЕчьЯ чає ой щш ше а ко хе Ме пк їх їй ки зу

ОМС Я зу ЩЕ ху Фо х 3 ех С СО ННЕ СОННЕ з сх Оу т я : м З й в 7 ке й ке мя ЖЕ ся «Е сх Ех ще Ж І

МУ ще ЖЖ З: Б Ко воя хх Ко р їх що Ку

Ес І НН СУ ж ха ше ОО КЗ З че щи - щ т що Ка т ЕВ

Но їй. Я щи Боу х рай т щу с т ве гу тУх Я Бі

БУ й ке Кк й і: Ч

М Фо ря «7 Га с ІЗ КЗ х УЖЕ ПЛЕН УХ

ВН А : 7 стане ТХ :

Н Що Ма длюй ще : ї ЗІ т ї

В Желе вТ ЕХ « ї 1 ж ВКМ Я й й :

ХЕ : НИ яУНЕ І

ХО : НН І

ОО МОМИЕКНІ Я НИ ї ен ЇЇ км рі :

БО жи БК -к рі чо :

Коо- МОЯ і р т ї

Бош ї х І: рі Я

НЯ 1 ГЕ Її ж НН :

КОЖ рух ГЕ «В . РК: :

РОЛЕ ЖИВУ З ВИ ГИ - І ї

В - ї УХДІ 4 7 ЧОН ї

Нео : Ве ПЕ НН ХЛ о ї

КО теж т Б: Н Сея ї їОЖОВЩУКа я ІТТ ГІВ НК БІ Її

ІК і ТІК Не СТВ Ох ВН їж Н МК ІК І ПІ :

Осо вм НЕ ГЛ: СИН ІТ. Я :

ОО МКК Я де ІЛ 35 ХХ їмо БО КК Я : ож ! - т МОВУ КОЖ ЖЖ 0 Я їх їх в -ї З: ВИШ В ВН ВК УДК ШИИ

РОК яю | ут Й Ох Ів ща ПВА І п ТОЛОЖ :

ОС ит 1 Ох ож ща Оп: НЕК ХК ПЕ Я

НКУ Не м а ем а ГТ З МЕ МО І т М :

ОК ої МИ шк КЕ т. МОВАХ 12. 17 МЛ Я

Н КН ї КУ ШО НЕ п СХ НУ 1: КБ г: :

РОБКИ Мт ШТ ' НАВ 1 :. УТ, ї : ОБ МІД ко БОМ. ОСА. ОС АК у, ї троє ВМ соту : і

Н Я кі Б пром Н 7 м х. ЗО: па ЦКрсу. Ж ЗКУ АКІ Н я ПНЯ ХЖіже сих п МАК ка и І

Н ТЕЙ МИЗКІ ру «лк МЕ ще яд т Оу Н

Н що 011 МЕЖ 000012 дини нттитиилитнний 1 Ка Хо ї : ЖЕН З Кі дод чими І

Я РК КОМ рахи КЕ ня :

Н ї ДОК хатах ХХ ї Ех : со дожив ої ща до «- ї ї

Н що АЧХ ї ї щк ї їв : і їжи : ї К ї х Ся к ї Не ї : Я Я КУ Н ї ї : МО дере ФОЛУКЕТУ, Н ї ї : о КН ХУ Я ! НН ї : - Ї уки 1 щ :

Н й Н ТК НЕ ї ! явної еВ ТЕ В ож КЕН Я НН і В р і т КНЕУ :

Н дО хі Н х ЕН В І че Її

Я її вада Я : «ої Ко ОКХ : ї ї жОООСМОКОМ Я Н Ті МЕЖ РАК її : : В ї Н 1: я ЕХ 1 7ЖХ їз ї

Н м ' ік ІЗ МКУ Ох ОЗ їх

Н ВЗ : Н НУ ї пох ОО : «КК ул ї т

Н З поруку З Н її ї От НОВУ ЩА Фо НВ ї ; ОКО о МВ окр шк НЕ ТЕЖ 5 ке НВ ї ї х її ща ЯН КеУ-Я З М ще ре Не ї ї Х хі ЯН Мтажо БО БО БУ НО: НЯ ї ї Жора БЕ Еш МОБ Я Ж М Ж МУ ЗВ Не : ї ОД КЕЯ е Кз Бе А БО Ох КОВШ 12 ї : ОКА М КІ т Ми ОК ШК Во й В ї й НЯ пот МІ СВ А Бай КУ ПО Не ї ї ов пов КІ МІЖ ТІК 2 БУ ІТ ГК: ї їх ОКА мер МЕЖ си МКМ син КК сном ММ. ри дн ї : ЗЕ в ЗК НН - З ї : що ; ї

Я я ЧУ г Теж біжу Зх :

Я піку хв йгм ж до Ми Б МУКА ї

Н ХАКІ чом АК. ех Я ит ще МЕ ї

Фіг. 9

Ії.

гостин нене Кт т т тет

Под прорнанщ

КК ло ЧЕ в ї і Кк : в.

Е УЖ вки ше КЕ с ванн» : ож Н .

А дах по : ри я ВМ де» З ож ї ож ї : роду ; ; і 1 роде Го х БУС Н їх КОМ й А : ВМ : Е

Її ї : ; ї

МО КУ Н : Е осей ! : ро Ат ї :

Кох ї г В Е роде ї : ! '

ГО кої Н : , родеофацу 4 Е М :

Ох ії ї В : : ! іш і : ! ЩЕ '

ЕЕ ! ; ! і Е

В ОБ їде М з її і в Б іа В : щ ЩЕ !

ОК З ЕЕ Н :; Й не :

Ех і ГЕН З іже ВВ їх шк З 143 Ж ок кох у Щ Н і іо дя св БО 5 г . Е : щ Е

КОТ ща х же х. ЩЕ ї У І

Ко Н ї Я КУ ЩЕ х Б гону г З 7 і З ши и ж І НС УНН ' пен з ни на ШЕ, С, ВН ЖК ВИ Шви СВ Мои і м ни ни п Я Н Н І ; : В тні шк ші Її

Н Ж Н Н і-ї жу! чної зо! свої щої свої ярі і 8 НУ | Ві ї

Н тові іі Віск ІС Я БІ М МІВ ВІ СВІ і

Н іа ро: ЕВ МІ іі ВІКІ Ед шо і п БО І щі У І МОВ ОщО Р І Я І Н

Н ве НН не в З НА НН БІВ БІ ВІВ ше і ОБОВ Бої и ЗО ОН А І І І ЕЕ и А ННЯ ї АК : 2 ! Б р КК в жі КД НЕОН ТЕ Ж Е ! : он Во ЗОН е Тож Я : : щ і : | : В Я : Н ї Н ЕМ і Н і Е В : ї ї нс Вис Гу щь ї ї

Н ї Н ї : Й ния ї шк тва ли и Ва їм З . ї ке Кен пох прє, ЧА Н ож ї Її Ка ща РЕ е ща Н З ж І З

Н З УМ Коба Ібн: бра: Ж ТОЖ ІсЕ ЯЗОК Н Ж і і ї КІ ІК Я МОЩ. Н КОХ ВОМУ: т РОН Іс ГК Е Е ; ї | дих Тож осад їди їзди і! | Е ! ї ії щи сова її вої ВЖК : Я | ! : ї ГО: РОБИ: хе Ох Н Н : у 1 і х Я ще шу

Н пики кю тить нтютют юю кити ж юю юююююя нн нн а а х

Її ек ех : Н : З ї Кок х що В КОЖ я Н

Ї : дахи : : і КУ жу ї ї ше ххже КУ ах ТК тре ! х и А С й З І

Од Е - ; і

НН : : і ; і обу тиші : ! : :

ІООВУКА Я щ- : Кооозекд : і ро Е а : її вЕХ Я ! ї Н - Я ; '

Оу пух 4 Н І: Н Н Н о В и і : :

Іо ї : і Е ! їж : ІТн- Жщ 4 ! і ох ї : ї ЗЕ й КН ; і од ДХУ я шеї ОМ му ве і і

БО ДЕ З СО 13 Ж Се 1

У Її рі о ШУ і і

НЯ Я 1:18 Е 32 ОО ще ще

Я : У ої : КУ їм Я г т їв : і

Її кдд х й де мов Ж ще Кб що З ! !

ОКОМ З Е оо хх КУ й Е З Б ИН і 3 '

Р їв що З В ші ше М В ЕІ БІ п Е

КО Н Н с З Є ОЩ зя КЕ Же З ще з і і і ї | Х і. КУ і. ПАК Км Ха лом німу В АВ ел оф ее КУМ и М Ким шини 2 і ; : у мн: ї

ОМ ї Н Ї Н 3 мі міні вікі що і он што Н

ОБ іш ек я Віші ві іі ві З Не Ме: | ! ох іш 1 дО ОР ОМ її І Ж УК МІ СН ОО І РР З

Не ра КАК КОР А КІ ОР Ол Ж і р рБіІшіківІ віші КІ в юіІ І ВАІ ОБЖ Ж І ФМ ТОЇ Н і ВІКІ вів ШЕ ник ЖЕ щ

Я Кі Ка хі НК еаЛНН НИЗИН АК НС І ке х Е

Н НКУ З їОЩЕ ОКУ Нижох Н Е Її : ; і

Н Н | ї ї : Н Н : КЕ.

Н Н Н ї І Н ом Кох пз сша

Н Н ї ех оду ї жилу їойщ. Оп Має : І Ве Її ав б ї й: Ярдх ОО БжЖвК ої бро м а У і рожх Олек тк Олех Н МНН і пи пух З зак Кі

Н Ко Б онек ї зиу ї за їофгиж фо зу 1 зх: МЕМ: ї і і С НН ЕЕ М В З В С С В ВХ ВЕ КС : і ! для нен ощИх ско рогднюттнжн няння няння жи т укятнинтнняня пари то !

ТОЖ хх 1ОЕ ХК, 1: ФЖКАЮ

НН в ї 1ОЖЕ ї се ВЕ

НИШ ОЗ !

Н х те Н : сту 1 ї | АК : А :

НИКЯ зе о «АЙ ки : ж як «ВО : с і ї - Ї ї х І

ЕН: ач : їж ЩІК

ТОЖ і : не й : Н Її У

РОЩОДЕ ж вик Я

БО шлю : о : х Н ї ї

БО сх. з я Н ї 3 ніш : Н ї ї я вОохх : Н не : !

РОщдО їх Ї В ша В Е гоже : - ШО В Е о шої : : КН м Ї Е

ОО ЕЕ - зн, КО еН ї Шк :

Рол СБЕ Х - Ж НОВЕ В т

Н МНЕ ї І ЗВ ЩІ як КЕ

ОА І ; БЕХ КЕ те ші

НИМ мм З У КЕ ЩО КАК Бя :

НН НН а , Я БИ Шк 5 .

НУК ХАОС ї ІВ ШЕ БАХ ща мя Е

ОО 1 у ПИШИ ЕКО 5 о :

ЕЕ ОБ Я БИ МЕ

Ко ту ОМ ШИ ЕБеВ) СЕ

БОБОЯ УЯВУ не - ї ЗМК СОН З НИ: «і я : соте С : о і х ХК ндлжулини Ж уенлллнн КТК ЩІ

НУ ГЕРЕ Кале ннн Кх на ск щі ; й

Оле УК тя по оби МД «и «НУ :

РО щу ня ск їв КІ Же їж що Їх бої її я 5 ! я / що й У Щі ту ЗК ї : прик зуб 1 Ш ї ї

Н пе ко ня сю жу, їош ж мет й іх Я

Е | ШЕ :

НИ Н : і заці і

Кок ї 2 ї ще ЯКІВ. їй : г Е ї 1 т І ї : З т й х ї Н ї ї ї їх Н СК х '

Щ : Е Н ГУ т : | Я ї ї ї ; ! Я ї :

ЕЕ | : Я і ї ї

І цу ни. ч : ! Й

Оощо : З 3 шко ї ї

КОошох м У мадам Ка : :

Той ТБ т ОКА МІВОЄ Е : ї Мох : ї З КМ Е :

Її ож і ОКУ ВН Е : її ї п ОН Е :

Мо Н ро КІН Е ї

ОБ Н : Пра ВІ

І ПОМ : - М ШЕ ї :

ЖЕО Н : о ЕМО ; :

ІЗ КО, сокухю бує у ік М : : і: Я У у Ох КМ Й МЕ : щі | ОБЖ Ки п КЕ

БО ї : хо Бали ї й : ї МО ї з І шоу НЯ соб я Е

Ії п. ї ї Н че Ка У п. Ми С Я : її ЩЕ : і Н ї ї Шерої МН Ге І Е : од ї : І 1 ї ї ШІ Ка ше що :

Я ке ї ї ї ї ї 7 Мис ТЇ ОБ ВХ нен В

Її ж їх З і Н 1 ії ож ШИ! МК п ; ї Мох сеї Н ІЗ 1 ї - шли МИ КЕ СЕ Е ши і ЕК ЖИ МТ: М БУТ ї їОже па | Н 1 КО: БИ НО М п

БЕ ї і Н 1 і ОО БА Кт ди п

Ок ї : Н і і БЕХ На и и

Го жох ї їх ІЗ ІЗ рога із ПАСА дет АВ деле іа нї

Шк ї хм шт з іще а і й М КК ВМ а оленя ни рок пен 10 п і ЩО

Е ши Ку УЖ Слів ї ї ЩА МИ Ко Хіду КЕ их ма ще : ї хх зх. кг Ту РУ коса во ї їх с НБК У МИХ М. іще ї КУ СУК Сен ща і ! БижікУ мя ЕУЯ Я шк

Міші . я ня

Н жжкжжюююєююююєюєюєя

Молинянлянняняляяняняяняяя

Фін. 11 по ї поаня І пен пегеееттеєкккєюкннєтх ! пннуужкекюккнкя м :

Н ї : ї

Ф я ЩЕ : ї а днк: ДЖОЛІ прое ДІМ : їх пи кипм ним: зажими АЛІ ІТ : ' мище Ванни ниви: вк ниж х ми Вайне : МЕМ НМТ у МНК ї пошана о ! плн ИААУх : пн МАШИНИ ! й : т дечллллтяуцетя тки їх дев З і і ! Й - АБИ | й ! 80 т В | ї

І: | : ще вич о сту З і ж дош їх і

Ж ІА й

Ж на і : ЕК ннннснетнняї за ш

Кожної Пієтетнняя зв Щи м І нн нини ! ще ; і | ! пиххтеекнєєтююттткння Б ЩЕ ї З У Н ІЗ сюжктєтт нет хиххукуухкктєтки З ш

Е З у. і ї пкккакнж тюки і с Щи ІІ пи ЗШ Щ і й ко і ЖЕ сутки удуккдкююююкча ххх ка ххк ххх Її. 1 : ех пишно я с ШИ 1 (ЩЕ «о ВО та няння В З Е 3 жк м. ; КЕ кл: птн няня Я : :

В. То х і ЕВ КІ ХУ о дллллтлилдАлАлАДИ тітку п. й і щу с ОКО пиття КУ пи шо ше во ЗО о а «ФК ДОК оон й

Я ОХ М: клю ск икк о ії ВМ їх і БО о нини пере о й

Ф їі ше й ші ОКХ МИТИХВХ доб і й т во СК ЕВ кое БЖ вн С нн мам : . -- ж ГЕ БЕЖ їх х Кн ння и шк

Ем скли їх МОЖ УЗ. З вах ЕК ах т о т ; о В МИТ а х Р: У: ст Її М Хм ШК ГИ ЗЕ с В У і

Пжеи шк Х І дня ПЛ Не ї; и МАЛУ В 1

ГЕ У хх ще НК ПО НКУ «- .. : :

Н ЕК ЕК З же ОМВО ПОМ. с КВ с :

ХО З ПЕЖО ПО СОМ. є ; т | -х 5 з і ЗЕ х Н

ЩІ що Те о ВУ за В ЗВ а В В НЕ Н ї 4 ; : і п: пллтнччятнтттттттннннн долу жккх юки мУч пен ах І т - Соки ме це дж КН м 3

КЕ ИЖ МЛ МІЖ к жики: дала МУ яхт кл лАААЮЮЮ і 3: че пАААААААААААААААХ А Кл уж ! с ї .

ЖЕ уллллижучччючтучух

БУ м х пеєтін теж нтттотетя З : КІ о кон ин

Е І С гехтеєеєтєтєєттєттяттєтєюєєютию

Е 0 ВКЦКЦХ пмеиєєєююнюнятя Її гу ї ї Ш дання ема поету АХА кл лтяниЇ

ОХ У УК Ую Ук ! я 5. ОС і М дууже й і юю ю кю те і : Ху син пеюжюююк юю юю ююююкююя ях | 7 ; й Я Й ' . З 3 Ин: по пи : | 3 ХХ: НН : 7 п ЗХ

Е ДЖ фен ннялалялнлллляятя З : НИНІ В ух Я КУКУХ . пе сей ! . ЗХ З плкчіхектя и М МВ» хоч ую иия ї : З ї «І Мн ОО : я 1 жен т я ння Я о

СМТ хрееююєюююкдеююютття іх с Й : КУ о боунях з. з КОХ ХААЛАМІЖУ Уж хх І Я

Ї ї. АААЖААААНТ ДІ Ходи : х х СК лилия іх В (5 и с З і ЗУ па жАЖАААЛАХАААХАААААХ ; . - ІЗ Ш Детехттяютихххх КО лили х З х С плчхуччянюєткєкккєєктєжнк т хєєннн

З Я роллю нн КОХА холи ! з пли, ДЖ сн, є Х

ЗО х х зу ; З с.

Х путь З З ї і | Щі ІЙ скжжх кпк ТУ хх сте дик о ААХАКАЖАХКУК ЖУК ААЧКАААНКХВ і ! Ж ЛУКАХ ж ех

Х Ко ТУ очно ж ско пет КВ ак шк жуки І Зими УК ще - пледе кт укркююнюнкх ї ще сежх кю ІЙ СЕ вне : Я Мен и вв ху З ї ї мкм М у кока ЗИ ї - ї Сескхсхккткікюткєкюкєкєєкєтююкя я пере ток І т кл кн ; ся си і пилою сами Ки ви іх як удунтть ння лит У їе

З ; Май палке плуиєю Ки Ж г: т ИЙ З: Я. ях пекжлятятнтя аж ДМскєєсєсєєсккєксеткктєтсккккя «МЕ

СУ й і ! ву ухутг сн уккяттххякижи о ї. шо їй щ- пллллля ще АААМАХААААХКІ ХАКІ А Н ААЛАХАЮЯ

Е Хвоя хозкюий ММ Дідюлкнкнллили ниця птн я : Ба. пекуча шк . нини Ми

І і . й пу МАК дхакАА АКА АААКААКНЯ плн лю кюк ту КАНЯ ; г х а КІ

ЖАКА Ж у у у у у у ух кт чт лхккнннхннннлня днк т птах етан кити вих ; тиха це ТЕМНИМИ: В - ї ФІ приииия, у | пли - пули пилку З я Е тежтеееттииеежттииисия дики к ти києтюєюиня і

ЖИ ех Й І ї ХК лрехкчючьчухуьму У КУ КУА ААУ УК УКХ У У У У У КК У У У У У УКВ У У У У У УК У Кп Ку у ню ух о ї сум ую ую ї Щі пфижжинжтих й ї ДуниллжаЖАН НТ ААААЖККАКАКАЖАЖААЖВЮ Ж ях

КАЛІ АААЛААВАКАХАХК КТ я ДК палАААААНААААААААД АТАКА : 1 кААЛАЛААААААЛАААХАААААХАА

ІЗ З й ПИ лалААААКАА АКА АКА АКА. Е длАлАХАХАААД ЮНАКА Я й ї пн А АНА АННА ХА АТАКИ К ї . Й й І - ше хх. дххжиях як лляні. пам а В ; плин т

З ї КАЖАН АТ ЖК У Жюк ї аж ; ТІ ЕЙ ххкх ї ще З ї ? 5 з пинннинннни аа ї : й Й ЕН Е папу НАНУ НІНІ КНТ, пляжні А х ХП па ТК Т ТТ ТТ ти 2 й Щ Н

М У х і геектєкєютюєєюєютюяя етос ї . й й З т Шоскюююєнєтюєєєєютюєсююня 4 : оно ни скор

Н У ї МЕ що ПТІКИХ ЇЖУ су . й МЕЖ няння ння ВЕ и. 7

М | щ ПИ по ї Со ЕХ ШЩунетюнннннннююєнннюнннннннннннн нний З

М | ІЗ ІЕЕ итяянянянтянян КЕ ї пляятя ЕЕ 3 | ш ІВ Ех : 3 НК сесеттетеетететт тео 1 : ПУ ІОГИШИ ПДММ екикижююиня З

Ех Е Кров и

Є нен кни я 5 й 3 ВО МИНЕ ПИТИ ИН: Мк тчнннннннй З

М Пи ооо я ен З

М : УМО ПОМ ек зей АЙ М !

М НЕ КТК холу « я хх У ша хе ї хх ша ї ххх Ну де Ки по п Ос АХ АААААААЛАЛАЛАХ ; дал ї Іра щи сов й кох ше

АХА

3 питати ат. п ее нж Ми а иа ! т - - щ пиття пит

Н х спліт ул чт А літу оч

ЗА ЯБА оессесееетн о нн

КАТКИ АТч

Хижі тя Ж тк кг. не их . . . - ; : - г змоп це дип :

Крик тими ЩАМ гм Ше

Май НМИ ТЕМ

ЗО - ять ех лом пужтттятяяттяяянтняння знижуючи 1КМККК я | ї

М ТЗІ хо пехляхляляхактя яння . Я н плхлятинихя

З плити нти ! г КД фони

І їх ЗККМХЕ СВ» ї хх 1 . ЗНУ -: : УК: п Алютех га ЗОНУ ПИ В Мило

Е ЩИД фен і : . ноя ЕН ТОЖ

І 5ООФЕ дня пох о. : | я Ії ВИМ І ІЗ

ККУ З ІЗ я плити кХ Я х т, СЕ нн «Ф сетей "В щу Бе т. х ох п о і Ж ЩОКУ лриєиеюнуя БІЙ о го У КТ С МЕМ МИ І / . : ї ШТ їх МК ІЧ . Ох плллляи я : зх МК АААААААААХА чл Я : ще ОВК ННЯ пААААААХАЛЯ

ШИПИ дл КЕ КЕ Е /

КЗ ЕМО Пе КО

КУ З плАААЛІ КІТ АААААААТАТ Пт З ї ЯЗ дес ши : о.

Я ; ТИМ СУ ще 1 й ї МЕИЛУ ШІ, МКК І

Н | КЗ ! пклння, З : зн х ЗОН пеня тлтялии тити 1

ТВА н о ВЕК ; ние КИТ НИ Микитин у пи. плит БО її. : ї АМС МИХ ОЇ сх . : Х КОЖ ниж УЖ Ж ніж :

ОКе хо УМХ налили тис тт вн нн нн х жк : хх пове оо ния х ки ен : й

Др УКю ми : Я й

І ! зи т зу У ся паче ї У мотать УЗ Н см З з, : те : ЕМВ ЕК Духянянчячятнтяунтнттнтні щі пдлечтчяюю ня - зужнтнянянхнтнняняу З ї паща а нн ях селяни няння : ї ї т

Е : пеню і х Пляж Ве пе пи нах не й

Б й ---к пт пееечх ПАК КК УУКуу жу иЙ ; СВ і не Диєюєтититя не й ринв в Шо "

І: Меелененя - і Ше пккхкк юки т

Лідпоце ме ме ци лнІ М ! плллллляні!

Дам АХАААААХХ ХХХ учня г!

МАХ п пт ї

Н Хр рхххккххнккххякн Її

Ії

Ії

Ії т ек

В ПХТ тет еетттюттюеткттнї ї є июня В і ї УК ДМеумея : ! і г од : В : г : їх : Я , ї : ; ї. Няні нннннянннннни ня : ЖЕ феннененюннняя ї ! ! ї М ї : ! Її / : : ті

Н ї : і ! ! ; : Й зн єю щЕ : в А ВВ Дня І

КОЖ ї НН ру ВК : Її ї хх ДУ Дух ДІЛ ВЕ І ї КУ НВ УЗН ЕН Її ще. : фИШМІпИ Мт Ії с | п т - пісттнн ї х Н ЖИМ Кт шететекккке ЗО ТИ Ддяхччтттткуюкуююююєкитттнкннх ЩЕ

Я х сін ення ВН Я г ще М Бики БИ с Її хі : і І вижили ОУН Е : Н МЛ КЕ ши я п : ' ПІД Х дігтнт тт фен рено ї

Я 1 о нн ни п шен !

І Дня ТЕЩЕ но ВИМИ Я 0 ї

І Н УМ щу ШИНИ АК ее ЩЕ

Н ! МН ЗИЕИНИ ЖК ВЕК НЕ : В МИИККОМИШИИ ЗШ ПИТ: КОКО ЩО

Я Н іш комин се 5 в і : Н ва а а - : пеня ї ШЕ : р княхян КЕ І пах АЛЕ ї Ви ках кфнннннтенннннни : : У плете на п ОХ 5 ш Ї : шжжжюююииєєиу ПЕТ их лиже В и їй щ ї пк КУ ПОН о НН і

Фіг. 16 пелет ТТ ут юю почни ! ур я ет умиукяииня о і а дали, ох о М о КО

Н - УМ ЖАЧИКМХ ЦКУ у. !

Н ГУ і

Н БІ жк ! - ща

Н Я :

Н Я !

Н «к !

Н ї : і: - і т ще Н ї х Н 3 їх : 3 З Н 3 Ж Н :

З ра які ї х Кия

З БУ : 3 І :

З ш : 3 З : її х ї ї І - :

Н х ї

З х щі і З я

Н НУ :

ІЗ Х. ї

І ТЕ г

І Я х

І Х. КІ : гя ; ї Бо Н ! ї Я і

ІЗ х : ; Х Се ї що МІЯ !

Ї КЕ ї : г у

І ; : ї їх ї тт. ї ! ї гу Я : ї у : 5 і: : ї : ОН ис педнн КО ння 1 ї . Н КАХ ння КУКИ г

Я БУ ДК КХ хтуннтннятютю тях, пис нт ЩЕ . А я Н теж 1 ода ЗУ р і 1 и К-Т х сакх. Н тк У УЗН : ц Я ! я ОробущЕ і Боже ої Моб ов ом ! Н тити КЕ кре. НЕ ри Дав ИН плоду 4 и - х по З ВХ Що

Тр юю юю кутю : т Н ц й д ї С ; ще | :

ЕК нн ша З не ї пе і есе В пос ї ЕК Н веНчК ї вини ВИ

Ева : мая : й нн нн нн я і ха он нон кн с З Зх щ фест сеттттттнн ! сн ! ЩІ ї ш ш ам А З

Б Не ІН ШУМ МЕС Кум ОМ і

Н Я ТММ ШУМУ ТИНИМІ С !

Е МЕ ве ї

Н Що я ї пе Н

Н ї

Н х ! . ї х | : п Н :

Н Ф і : Х Н ї г: Н

Н КУ Н : : Х фак :

Н ті ВН : ї ї і ї и Е ї Х | : ї КУ Н :

Н й

Н К | : ї ї. ї - Н '

І ХЕ Н : х Х Н ї х : : ї ї Н : х ся :

Н Е я : ЖЕ І : БЗЯ Н : ХЕ Н :

Н х Н т БУ ' : ї їх і ! ї ТЕ Н ! х : З ї х щої : і Х о 1 Ки : :

Я ся ї :

Я Б ІЗ Е ї А : ї их. ї : ї БОЯ Н 7 С ї : ї Х Н : ї її І Е ї ве : І ! 5 і КУА екножартти и ВЕК паху п кю і с Е : КК ннн ох КК кухлик, ВК пе ! ї ї ЕК роса нти а НС шо! ! Ве ЗЕ Я а еВ: ОО. мае : п рою : дошок ї Б ЗА ! : : покла : в НН СК ЗШ !

Я рЕНя Я ЕХ ї пложуучу нки ум мання ! і нн ни а і то ; : КААААААААДАЛААААААХАД УААН : ми : тт ; дв :

Ов НЕЇ МКУ. : А ї МОЩІ Я ї пилялий с а шюЕнавц Є х яв в в Я я ЯКО ья До їж ПК нн тіні і КО : В :

КООШЕЛУМттеннннлнтнннтитт, нин ня ї лося ї о : В ' ше ПД НЕ КН и Зв НИ КИНЕ ї

ВОВКОМ нн нн нн Ви МНК ї ее ; п :

ОО фохааитх уч юю жАХАКААХНІНІХ У кишка З А ї и : я в ЕЕ і ж -- а ВЕ Но

Не: ен нн о ет

ХУ ЦІ ПТМ МІВ

Н пр, нн а ї : ЩЕ ТИВНА СТУК: ПЕПТЕННЯМ ЗМУ УК МЕЖІ ї

І т, чКУЯ :

В ЕОООЖАХ Я ї : Б Я : : її І Я ї х Я : : їх Н Н т т . Н : : шо Я я Я 3 Бу Н : ї ПЕ Н : 1 х Н Н 1 ЯЯ Н :

Н х Н :

Н їх Н Н

Н БУ і Н

Н з ї Н ! х код : : Е ЗД : ї ЇХ ї : ї х ї : т ї ї ї : ще : :

Її х Ї : : -х що :

З ро : ї їх Я пл : 1 ве Я рт і ї : і п Я ї :

Н пк : і : і 3 :

Н ях : ї Н Н :

Н 5 : і ї І 3 :

Н Як : Н ї Н 3 : і с і кання і З :

Н Те Н Ти загин с :

Н х : ДО Ух МЕТО : ня НН НН НВ у х Н ї 2. х. Я 2-2 2х Я :

Н й ни я З НН НЕ Кн НК НН С М Б ЗЧННН :

Н їх РОСА: 01 ОЖРНЕО о му КОС Маг : х - : Я ї Н Я мае :

У Н жалі х пк о дракон о же :

Н : ЗУ ї КЕ Я ЖУК Я :

Н рвана її Пеюорчум з Ма. яму др Ех КУеКЯ Н тег Н тк ї

РОС Куй ЗМК БЕЖ ї Шо і пода і що В нан нн а м нн и М п о КК ВК ї р пк т : можх ї с, Н рія Н хи ї

ШЕ ТК ю : рем ї ЖКХХ Н ІАЕ Н ВА І нн ж и в в п 1 Зх жук. : кож ї У ті Е т и Н р ї

ВОЗ СН се І ТЗ ї МА Я ПА Н Ж І

Тунлллжнетт тютюн нин юю УК КЕ є

Н ГМО МТМ УМ ПЕ МАМИ 3 Ж МЕТУМИХ : і ЩО р Я : МОВА я :

Н хх : :

Н ЛЕ : :

Н : :

Н - : :

Н КУ : Я

Н ща : Я

Н х ї Я і Ж кк : і ЗЕ :

Н с І : і СХ : :

Н я Н Я

Н х Н Я : х Н : ї поту і ї ї я ПДМ Я ї г Н ї ї х Н Я ї х Я З ї ЩЕ Н ї ї СЕ т Я ї ТЕ. Н Я : КОЮ фен Ї

Я М Н ї Й : : ДЕ Н рт, ї Н Я

Я Щ Н Н їх ї НІ І

Я ке і ! ї Н | ї : ТЕ і Н ї 2 і ї : 5 А : ї 1 і ї : х А : ї з х ї : хх | У ї В т ї

Я ш Н ооо ТКУ ї : ОН Ко п В о їх х ї яко Н ї я Я Н В т ї

Н тп І коса п 1 Я схем Н шо В, ІЗ : Я : -Е А не: НВ З М СУ В СЯ кі т:

Н х Н яея : ще Н мер ї ак її : ОО ВЕНИ КОСЯЖОВО АНЯ, її

Н ! -. 1 Н Н її ху Кк і вні шу Н же : вод: : Не її

ХУ ее Я КВН ІК : МК : де : КАК її нн нн нон нн вна о

Хо сере «к : ши 1 йо Я тре. : Мр т:

Ір ак і по ! ПЕК Н ПЕН Її ЕХ ї ла и а и ї ї Я її

Хв с Ер, : кл Н ту ух Н уд ї іх 5. т:

ЗК ее Мер і ФА Н плУЄ Н 5. ї ре її а а а п НН ПИ и ня отити ТАТА,

КК КАТА КК и ААААХАТ КЛ тт ; пан ;

НН КЗ п Е

З Я имени кине й г ки Н

Н МОГ ФИДВИЕ НІМ МДЕ МеНУе РИМІ ЩО ке :

З в :

Н ООН т : і Б я В

І « В і ї ук ї і ї ш Н ;

Н Х Н ; х ГУ ї ї бів / ї по я В

Н п ї :

Ко В

Е х. х :

Н ря ї :

Н ш ї :

Я ї ї х ї Я 1 г шої і

Н ОТ і

А Е ! !

Н х. Я ; їх : : ї М ' :

Її Ук ' і

ІЗ а Н Н ї Е Н і ї Кк Н : ї її Н : х - и і х з ї Й !

З 5 Її ве я В і х ї МЕЩОЕИ ПВА і ї ду : БАМИ Наше п Н і Е ї МЕНЕ Гола ПДААКК Н і ге ї БІЛЕТ ОгХ МАЛЕ юна х

Н и в и НЕ ! Не ника нн в ни ни !

Е їх І ОЗАНЕЯ. : ЗМО ЩЕ 10 ож ВЕ : мат рі : й Хо Н дит : Дон Я Тед НЕ

Н їх о вЕшж РОСАЖКНЮ 10 Же. і в в по З пен ї дея рі ї зле рдиок Ї ЕН Я ТЕН В плив Я ТУ ПЕ па ВХ дах Н и нн и ок уеко ке ША: ние нн НВ Не ЩЕ пе ОЕь ї воє : их їх о ЕН і тан ллжнянніия у нн и В - Ше

Ко а а В х : дна : тунихх :

ТУ НЕ т кх В МОЕ Н пох В пок ІЩЕ гака КН НН НН АННИ в и п оо пи ни й пеки М ОХ зак «с 1

Я Б ІвінлифмоВ ІМ Мур оди о С КМ ; і хх ех - ї я шк т : х ї : с І і

Н х І : ї х Е і

Я х ї Н

Н х ї і ї т асо Її ;

Н р ХАОС І ї ПЕ ї ! ї ПУ ї Е х ле ї ї ї «Е ї Е ї ле ї : ї Ж «щі ї ї Мол і ї КЗ ї Е ї КУ ї :

ІЗ З. ї і ї ПЕ ї ' ї КУ ї ї х ї ї ї ї 3 т «4 ї ЖК Ц

З 2. ї : У І диплому Е 1 х : Мом песто 5 ! т Н ТА з Ко : 1 КЗ : М ї с з м я і

ЖОВ он - ВОК о ни нн СО ! МОЗКОМ соку еткюертю Якекн і

Н п я ж є а НН З : 1 Ф ОТ ЗиащЕ її Зо Ол мВ і ма Бі

В й і Щек ї ОК ЛЕ Н ВО Н ех їх : ї міни аа я НН ен нн о ан МНН поананик ни ін не ії

Н Я СЕ Н ПКУ Н ОЕЛЕК» Н ЗХ Н КОЖ її ік иа елек о і НИК АН КИ НИ !

ТВ СВК к : п Н слВ Н ЗЕ Н ГКУ У: ів мк лх і МОМ нин нн ин нн ни АК ! нн нн нн нн ; ня де : гро Н он З хх Я хх ! сп і мому й Н ллея х КЗ ва нн и п аю и нн п о

Фіг. 19 ' ддоддотет гоп АМАЛО ЛО тт от оо пен а нн ан Я па аа ! т і ІЗ

Н

'

Н

' Н ' Н і Сежєєєкєсксску і с суху кїхкккууккккєєюєюєккккхєєєюєєкююткккєю у

Н СКК скк ххх юки хх КК Кк кххюхввв кю кни хх хкккккхккккююю єю і

Н дю унннннннннннняннучку єння

Н Н | '

Н Н

Н кі ж Її

Н І ї і

Н ші З ї

І: хі Н Її ще Її х паї 1 ї 3 Іру ЩІ 1 х ОБО, і

Зх ОА ! я ОО кові Її

Бу ЧИ :

ХО жеже: ІЯ п В х о ! я ОБ ї : ух і

Е нії Пи - ї : Ко

Я ди Н ї ші нт й Ока : ЩИХ ТЕКИ ІБК - ше ОМИЙ Ми ЖЕ Миртй БИ .

Н же о ришщ МИ МЕЖ МА НУ якїшя

І НИ І МЕ МА пий МОг

Н 100 КА БО МИХ МЕЖА МЕ Га ! : жк МЕЖІ ТК ОО МЕЖ М с! КО !

ІЗ КОКО ХК у ШИ МЕЖ Я. і : їОБМА ПЕ МЕ ПИКА КОЕХЕ МО і ; хо В БО ТЕ ТЕ : ОХ ра: ! ї ОО ЖЖ МИ М РЕЯ РА Іа і : НКУ БО БЕХ З НА ЗНА

Н В п шій й і Хе хЯ по КК Є ЩЕ ; З 2 ЩЕ щі се с е їх і З « їх Кз ї Ко ! с ся СЯ зх Я Я і СЯ я - й но -

Я СВЙ ш У Кая д як

Н Я Ко. а я ке ке і Е-а : КЗ : ! Н і ІЗ і Н

Ї и КК Кт УК кю

Хосююттт ут у ут

Фіг. 20 "

пити кт тя кни тили ! ко дуття є ї пееннкентинктв шеххтятнтт тт ттхуххкукктх Ї ї х. 5 ї ї Й . їх Ї у х ї сеї : 7 | ї її : ї І ІЗ ї ї І ї ї щої сеедссо ї Й і І : вк Ми ен се ї М : г : ї М і КМ , І і її : Б х І сеєтежу 1 ї кі ЕХ МУ х СО ех БІГ '

ЕЕ ШЕ: МКУ З кУкх ПІК З ШИМОТ ї Н х ОО ВНХ ХК хім п і КЕ я

М. ї ПІ МО вит ОЗ ше З

БУ дії ОЗ А ЕКО ЕК КІ ЗТЕ їх. й | Н : Х ше КЕ МИХ ЛИЖІ КИ Вп шим ТЕ НІ їх ї НО ММ Я НН КИШКА УА Е п й х : Е я МЕ ШЛИШИТЬ В КІШЕЕ ЛЯ 1 : х а МЕ КО Х РУ МИЩ КІ што 11 ї ї о й ів Н ГО ШТ Є ї ІЛ ШІ ІД 11 : ї і і ї З КУ БК Ки ІЗЦИИА шШомІті 13 ї і ! З ВХ ЕШЛІ п Влді Кл хе: Болт КОЖ ЗБ а го п : : я З З ОА ЗЕ попи ТИЦІ Ве 31 : : І: ще у КО З ІК путі пу І 3: : І. БЕ а Б МИХ ЛЕ ТОПИК Ж, 3:

КИ пк ГО КИШКА Еш М щі

У Ш п Га ВЕЖІ пет КОЖ Ши сті ІЧ : ! Б М СЯ ГО ПЛІЩИ Коля дини

Н ТИЛ КАК ШИ МИ ТІЙ. ис . А дкчттлллкнтя 3: - ШТ МО Ку КИ ТОП «ХМК дети уєєтет жк : : Ж БА МКК МКК НОВ ПИ ї НО Киха МЕДИМКИ МИША ДОДАВ ит КОХ - т

М ОК ЕК ККУ донеутиня й т : : ІОСМ КУМ ММ скхдяяя 7 Й : й

Х До МКМ схххухння Й ії ії ї | ї щ- ї С З ХО С Б 1

Е с З х ІК щк ї

Я У ке о: 5 ще ща ї ї КХ КЗ щК щ Кк їЕ х х х й З ма: - К-е 1 : х Х 2 МЕ : їй ї дк З х з КЗ - М ї х Ех як з

Я п Ще З ; : кА ЖЖ ЖЖ юки жкхк пок денти

У шхгнентктхххккки 3 пхтхтхчхянлятянттикя, ; птллхяяхуукхтккх : пуххутуткукктхкткх не ї х плини шко,

Н ху ппеепи тел тт | І є Нео їх . | ІЛ Я

ХХ В

НАНУ

І я . пежтетееєюкююююткктяттти :

З ї пнлллттляткютнкюхя Ш : | ЩІ днини тя плн 1

Ш й м АЖЖААААААКАКАААХЯІ НІ

Й для Ся . пили тКААКЮ ЮК ; : нат

З ! птААААКААЮЮААН ЮНІ КАН ЮТН КА Що і х 1 по ШИ . | п. пили, пежгетиктесетиеистеєюкєютюєюя песен Е . | гежгететекєютеикииития : і пееектетктткяя

Е зі пежжютююююєютєєєяннннннхя х Щ : . х | Ї ї ї а х шині і

І ! і щі У штккуктютиттяттт ниття ї БеЯ й палю дуття

З ЗК рин - Й 1 / я . х, . . З нні ШІ . . : мож пли тю кю ї Е . с що пий диякюяя яння ї а ння ЗА пеня ру ї В ЗО шо МЕ інн Ро Я й : ї що ЕЕ Я КУ СИНУ ГИсеННУ Ух 22 МИ 1

В пн Ж ША М ХЕ пе Й ВИП ст УКХ х Е щ ПЕ «КА У ШИ: САМІ се І Й

І їх КОМИ МА ММ КО АННИ й ї т НИ МОЗ ММ ПИВ й й то КОБЕ, око і й їй

Ж НИК : Й їй Е В І ї п АК й І х що сх У ХЕ с ХУ Н їх й т й БО Ех я мкй Н і В х УЖЕ щу шх й у

І: х «З пе Кі ох де КЕ:

Кос КЗ сх во Щ й Е і їх й хг же «їх в 5 ї й й й й т М сплю.

І І й і Й їй Ки пнНААААЛАЛАХАААЛИЯ.

І Й й й їй й плитиААААХ ААААААХАЯ ! й щі ща а соттААВАААААААААХАХАЯ й й й плаАААЛААА АНА АААААА АлАТ ! й пАААКАЛААААААААААААААТАЯ лк АНА Щ паяти зе нхнуялттяях. Її хну яужжяя пз янялн ян пуху АНЯ

В

У ї. длахлто нку ! 33 ПАНІ ААААААКАНЖАХАХАКААААКАХ і ; пан АААНАКАХАААА АХ тА ї ш пААААААААЛАТ ЛИ КАЛ шк їж КАААААХААААЛ АТАК ши й пал ААААН Я ї ї Х ЩЕ дурним : / / ї З ден -

У | УАМКМ дини 3

МАКОМ ЕН ї її ї Ї І ч БУ й вх Е

Й питне тет ї . 1 хажжлаХАЛАХААААЛААААХ ня

Й ; ХАААААААХАІ пиААКНН АК / Дедал пити ит АААКА пн ААНАААААКААНАТЯ - : і панлАААААЮЮ ЮНАК ;

КИ кожне ї : нш 3

Й Й ле покеєеекоююнюя В зжжжжжтитияоят зхнжня 3

Н фоеєюєюєтюєюю юю нянжкюю педреєтюсююююююяк ний ї і гою жєюию я ; ! ! ; пееюежиекееесюсютя я Ї ;

Н З ї ки : Н ше

І Й КЕ сЯ В плитки З : 5 «ідола иАитиу : і АЖ нити й

Н ї ї вени й ох її ЩЕ по М ПЕ Що й кох ЦИ ТЕ г зу жААААААААЛІ ЛІКАХ лляних ї / с - ях. КЕ КІ плити

Олю ЕН МКУ лляні Дня й : ХЕ хо пн КЕЙ у : пу йшла пллжкжнжлжттня, ЩЕ Се ї : По ХК М ниття ТК З шо ї р Я р І Ж РИН кличку ї і . ОК ДОК флеииинкжяих ше

КЕ пОЩИВ у. «ВИХ ння тт й ї . ОК ТЕ Меяенякткхнн КВ ТВ ее

ОБ ОК й ТВ дек ТО СЕ в ш - | В і ши КЕ рення Ол КЗ и ІН

РИШКУ ЖЕК ле МХ КІ І Е ца Е ї - 3 ПК М СН Ко ХК ди М : ! ї о 1ООХОКМ МАЕ Ех ХІД кюютнситт и дня -

Ох НІШІ ГУ ее ВИ Жккси нЖ КОЖ я Й й

Е й «4 МКК нюх но я і Й й Й її ие - й Й В й

ТІ а Ох А. са , я хї см Оу у зай ях Хе ня ї ї ї с АК. ах ще Е і 1 ща на ХЕ ХЕ ЩІ З

Ге І Ко ще Кк -ц -й ї с. Й К ш Ех КЗ о хо кп: « х я ШИ А МЕ Х а ЩЕ щі Б З -Ї їх у І Й й Є Є пек ххкткткєтино ї 25 КУ ща З й в Щ Н й й з й й пжекиюєєєиюикєюєюєюкхкккхх с щ я шттххтаниттнтт тут кккккюю ! М пттхтхтя ля чхянчтчнякнт, і сеюєюеєкнкух

ІГ.

хнннкАкк Кк к Кк ш дж Кк Ж Жака ! в я

Дежкллженнняянннтя дедккджчкккннчкнннкчкннн пкккх Кк т че

ЕЕ погттуоттттттт коки і

Е пня ий й - геєкикжкке ення й й 1 У. Секкюккєюкккикю юю хх яки ; ї Уккюккуукукк юю ххх кк ик є : їОш Фодянннячяняя ще ї МКЕЦХХ ик Ті

Ой ї Її

І | | пен ШЕ

І Її ! нн ння і ! ; : і їх ПЕК кк тик жиююю юю ох ї і ЯКЕ еннккижнюя не й | о плнляняяжят нини ш

Е | : С «жі хжнннжжжя й

НИХ : СД пеня Ві Дня : : ші . й а Ї : ї с кккеК кю ю кю ска ЕН

Є | о о ! Фнжккюккюююююююю юки г

КОЖ РОБ КК юиреюеоєююєюююд м сттюнню ж ї ! : т

ПУ Фр Дюююнююююююютй ее ї : Н - планом

Еш її | в : КК сне отттес

Ох РОШО А о о ННЯ одунтеннЙ и їх БОЖА ЯВНУ ЗД лети Конттнння поту і

Кох НЕ Кр Плити Ки ен ЕІ ва о І

Е ее КД плат Мини отия ТЕ ІЗ Мо: ка

ЕЕ дл ЕН ШИ Кл та БЮ дтуллутнтаткк й 2 СЕС Мона й ОМ мої еооотелнно М Тех й

Ко ТОК! їі ПИ пен нина Гя о г КОЖНЕ М однжнлинннни дини ДНК: 1 її

Ох ее ен КЩЕХ А ха Мор: в

РИН Ек Що кое ШОА КЕ вл ОЖЕТ1і111ігіу й

О1Е КО. лили ШИ МЕ тер трояяняит ня М їх їОВЕЩ НОВУ лі сен п й їх їОТАХ ШИХ суекенян КМ МЕ ! ! що ше

Її Є Те деееютит юю Оса Ма Мен хО Ма ко о НН УНІ Е

ОжЖ ТЕТ Ма ШЛЕ ВК НН

Ох ї МІ кох МИЛЕ ілжкх, ДИВ М. с й хх ОБЕК. о и НИВУ " й т тв ун Ккеи ! й й й 7 1-х ШО й й Е р 1 - ся хх п Не : о я ях. Ж Б КЕ ї х хе ДИ: Б Ой ще хх 1 5 Х Х я роя Кх

Ох МУ « Ка. хі ще що

Ох ш си г КУ о а

КИШНЯ Де п пе в їЕ і 8 й с СЕ У С ко хі. ї У МКУ МАХ МУ п Сх й шк

І й й В де те зе оз ннвнивиннякі

І І й Й й й й савани й щі щі й нин

І ще ЗЕ У пу утекти

Н вза па ке меня яння

Е нен

Е паяння рі с нення рі кож пох вже тяжі улеи й : СЯ ючи яю ж юю юю - г

Ко Хх. уттжня ве І

Е | ОЦЕ щ

КО Н : І , псисткикй

Е Її | винах - | пеееютжю ижеитеннкккяя і с : пееие тися ртекетттяюня й і | Е плллтджжжтюя няття Е

З Н х мя ніжні ке ня я тикт ї : ще г с ДМЕ лренлинннидня он ттлктяжтлятя іти й

ОО ож петля тт Кт й : т : ЕЕ яяхяккюкккіхні тя МА В : - як сикткнккиякї Що | шк

Кох вини і НИ : о і

ОСЕ ОЙ ІК нянні і

КОЖ ТОМІ поет тних ТЕ В й хо ЩО Дитини т й шк

Її Ку дО МО УНН ПН гі

КОЕ ОТИХ М ОР дани лили ї о й ї нення Кн З й ї п ди фиииия с хе ШУ Ши : ; її нн У Я злу 101 ши і о ; м : Пеєєєєриюєююєесяиитикккя Е !

ОХ Коші мех МЕ дини синя : о ї ОЖИНА М пен А Мине 11 пу хі

ЕВ тОЛЕЕ КОД ження Іа ще З ші хз я Ж се М НЕК Кухоль :

Е - рома МА щ- ТЕ КМ ; :

Кох ож ГО Бог Унн щ УК озитлятнй В й ї

У т цит и й МЛИМИВ ти ХМ і й ї

ОХ ФОЖИЩоО І: Тож КУ і й Е

ОК у НО Я й т -

ХО З СУ ще ШТ КЗ КЗ : : з. З ве ЧУ «ЕЕ Н з Х де ох щ т хх Н їЕ ще В 5 5 пі Кк

Ох -Е хх У ще Ех З хх З «Е шк й ше їх

СНУ з - -е ке « Є їх и КБ 2 Її р НО ї ко МТ Щ КЗ 2 0 Ще 2-4 : й Х реєст юки є і І писк жюжююююєюєюююя ї ие

Хоєееитириуииииииииюиня

Фіг. 23

Іг.

Н С дчлжллллллячєєєєєєєютєєтєєєєєєюєєттєєєттте

Еш ОЇ

Н у !

НИ Ме Її 1 Ме і І з Кз Ки

М ск /

НУ ЗККЕ; | Ї

ЩЕ ЗК ї ; ї 15. ХА па я щу й

ТЕ чн не Мох ; пой ї їх КО ї гей пебах о і їх СУ ІЗ п, ОБ С, В ОО 2 СНИ ук: кн. Од ще в ї т " 5 ше й сирне ріже їх «му дидх З ПК отут по КК ркурних кое тее с їх зах о о УТ те ї думати т КВК Ма ОБ м ЯКУ ме шиї НВ Н шенні ' пи І ОО ши ши ми ВИ ШЕ Зк Н МЕ ношення У 1 ЖЕ гі

Їду Ше щ ї вин нина х ї Не ни

Ноя Н пон нин ! З ! ОБЖ шо !

Е п В у; 1 хх у а ї ! км КнККм БУ : ї дочки плн і щ ча п ж юю ум сл 3 писк юки п ! родленннчнтю У ння и дл : рого ОКА й і с со ин й їх зії Ї їе зії її Як ї 1 ких й Її

МЕ ща ї

ГЕ пої Й І

МЕ ОНА : ї 155. УМ й ї . тв вд : ве : 3

ТЕ Я У щу Ї Бе ї й ща ї ПУ сек ря НУ ї ; ВООя що п НЕ

Н пев - може Во ї- й шин їх БУК я - т ме ех Сх етезу щих мок ща . й що но ту сн ЗО ПЕК ТО поМЕМУВ ВЗ АК ПТК ТКУ : а 1: ! Би в Ко Іво» І хе й і ех і ШИ : ТОК меха МОЖ плхх А Б - ї ХЛУМТЕ НИ М осеее неєсетесттуєня її : Я х ДИЛреєюеет пек 8 В Ка й і ща вн ш : ши : раки ІЗ КЗ : їх пиилилл дитина тля пох : я виш о Звіт нн и ол ТЕ шк ше і Педсои с вое кан ни З 1 КА о до о ши

Усхучхчняначчхххкууєєххкукххкткхкхкті хх М ПИ

Я ПУХУ пресу у ут чую

Н Б Її

Н Ї Ї і я-Я І

Не Шо | Ї

І: Я Її

НЕ | І

НУ зі І ! З дик А І

ТЕ ЛЕМ З. й І їЕ х че ї | ї їЕ а Й Ї

Й ке се кі сок ті - ке х СХ 1:

ТЕ Ї ПА х : Ух муки

Ж Не ни по ЩО ШИ ок Зк ЕЙ одн» ку ре ж щі. МИ т полою В ння тт и ЕК ЕКх, ви їй Е і о нн ян я Ж фура ее КеАЖеВК готТИях кн ої а її ї МЛК Тана Мм о ее ні кеш. п : ТОВ: ТК пхя ї ОВЖННК о век ОН АЖЕВ ши ! Ж зма І пан поь ва ; з т : руде Я БУ : Вони ней : й : ен, ше Е Мн зи нн З : ни Н Тоєєєєєєєєвтнттттетт ження ше я Н що ом СІМ В

ТІК Гени Та ую ую уч юєкюия

АКНЕ з

Хот

Мпа АХА КОКО КТК ат ; і г птху і ї пи: і ї Ж і

В зх. й вве як '

В. | х ЧЕ

КО і

НЯ й | жи :

Ох Н пхпУ ; рож і Мина

ЕЕ 7 ВиУОо Н з щ КУТ ВУ і

ЕЕ ЗНЕНО: ти охт і:

ЖЕ і ЗНА: Х

У ї ЩІК БТІ Е о Н ОЗ Не ! ї ТУЛЕ Н ЗТ БИ :

ЕЕ ї ГО М ї ЩИ : Вих вила і ї ще Н щи КЗ

Ко ж нні ТНК Ми С

РОЗ роя КНУ ЕЕ деденех гл КК Н

ІЗ У ШО КАХ І щЯ ЗИ: М ЗЕ ї бМеИЕ Кл й ї жу І Зх У ЧУМИ ДИНЯ ООН дизувх ! 1 ша і У ХХ КЕХН КИЦУЙ СИ зн

Я | хо КОХ В У БУМ КО ! 1 В НИ Тротеї ВЕ Козсй СЕЛ В

КО ТОВЩЕ НИК тин Киї тя плині ж М БУ ши с Мови ккекнедетня ПЕН єекентрнняя щих ! : І ! ї ще : і ци м ї г. З ЛІІЖИТ я юки ккиєкик зм ная ; КЕ Е Ї що т

Я Н Фет схо Мекка ї дат Н пеня уко ІЧ і кн ах сер : ва Х дккм п ни ї п ї ща ям і й пен нн не то : ЩІ" шишк ш нн нн у її ши ни шк інки 35 Н Ще Ксееттеттнтенннніня сесетет : ее ! шк пприав За фусхчеечтесрвісєтнкесєнефессесетететтття : КЗ и ни :

Поу тних У : А п тоне с | ШЕ шик я

ШОСЕ А я н л е не А у

Фіг. 25

«юннати сЖЖюткки кн зесікккккккня кдд АК АХ КАК МКК кет кшнвкнкя ект нин

ММА КЕХ і

Н і

ЖК: щоки ую

МКМ я вових

Н пе : :

Н ї

Н В ї й

Н соми ; ! і ОВК ЖКИМ Я ; ! х ї ж ї і : Є і т ї : : А ва ї Е ; -е ТИО т й ок !

Н Бе х Ї юка ща ї св. 1 о с їх Кте З :

Н зер жо Ме : х жк ій Б Мой : ї й Я Н АКА ин мах си : ї х : ЕЕ т ок. : хо вне Мих хх с Н : ОО я ТУ І ПК КУ і ; 7 Щі ШИ яти ВЖИ і : КУ о Х ОО документи, З ! ЩІ оо КВК оодюю соло МКУ нон Кс у

Я ХН ШИ

' ТУ таких Н ї Ї ЩЕ «М МКУ, : і ЗБ. 5 ве я ще і

Н ЖЕ. М МУ 2 КЕНЕ дет юею : : бр ЯК бро АБО пуття ТТН КТК Я ККУ КТІ КАНАТ ННЯ КИ АТ ТАТ.

Кеннлнжютютн няння щ.

ГТ Худо

Я ОБМАН НнннН Кфконнй ШИ ! З Я о х иа дов» ре і ах ЇРЕМЕУХВИВ рення звінкн ш Мокія у 5 хе

ПОМ

ДО

ПЕ кл Й ; ; ; й

МоОЩО Ол Ї Її : їх в я

НКУ : : ие Я І ї ї ші : х ї ї : Е с хОВ 3 і НВ Я В ЕЕ оКоожа : ЕЕ : Її з шко жд З : І : !

З : : : ЕЕ т КД т т ; Н ї лі : ЗАКІ : ша : Н т: : ше ї ї хе

Еш : ї т ї ке і ЯКО

ОТО. : пк ки ОА 5 і і ЗВ

БО НИНЕШН. У В ї ІІ 1 5

КО М : Тл ЕК : Е ї - бі в ш ЗО 2 її їй КО

МОЖ о вЕ о ВК ОБЕРЕ ОК ї їх Б Ще шо Ї ЖЖ. ВЕ м Шетететті тітки х. няння В сок ВМ нон пох сх

ЖЕ фен ни КА и конт ери. Ж ср сх

СЗШКЯ З; В толк Ка ИН Я : МК око ЩЕ ко ія хвИ Зб ка і ех і жещвкі М : то ее

НО тома З АВМ З : прегюєюхжеттсн схе» ! я Кос їі жщжех | Бек х Кок кухюжюти

ХО Ж І ща : ож ах і : ше ;

Я В ! з З тож св. ї і їі ! «оо Ї : : :

СН ї : ше шодо тя З ї Я | ; :

ВО : Ні Н Н : жен Я і : Я Я

ОМ оїй ї Толя сід : Е

СТ : голок ВЕ :

ОД т. : Н Ко я ї : - я ВА: о НИ и п о Я -

СНИ ко о С Ох рт т пише виш

ЦЕ и НО їв ! п Коен! лю) 1 Бей З Стня фе | : ще : і : 7 депо НН 7 ем

Н З Тож в. Ж Он бив долі ук зе

Е Е ВЕ Яру АБО Я лу ВИК г

Ї ЩЕ иа ЕВ АВОТК а ЗНлх

Фіг. 26

Гудим носи

ДЕХКХ дети укнткктккнккя

Е ЩЕ

Ж 2 нн "ши ши ! НЕ пе щоб Ех о ОК

Не Я ЕЕ ще. пух тн нитки схунжкюхюнх: ЗІ хх ВВ

КЗ : сни Гн т нт ща

МО Арт і. ЖЕ НЕНе : Ж ЗМ б о. . покіччннн хх и п ААААЛІ КАМІНА МІК КУ ААААХ Аня ВК НК Ме

МО Дня й ' В, ЕК нн мини х Н сн нн ни г Кер ж

Ід рюккююкке Щі се БІК ЗМК жк

Н НЕ -ооя Ми ЗМ з дя : Ме ФОН Я ех ши

Н щи Оу ПЕК ин г спадок у ОК 0 ЗКЯ З Це ЗНАВ ї вве а й. .ї

В ОЩЕБ Ї дих В МН НІК БО. й | се СОН, ВО НК Кн Кн я

З СУКИ пуху МЕН що ще се ша І п са Вже З

ТЕХ хх ше :

Тржикун шик ЦК Фохтних дру среєчккекєєкитххкуусееее ек кеекекееекетккккх

Шк єю юки юююююю юю юю кю ююю Ки ююю юю юки ;

МІП С

Б ДРЕЦірнН хх ї Ви тя ід умо ден

Б н--- нн. как,

Не ї по НН ЩЕ г ок кН ЧЕ лк лю : ВЕ Б я

ЙО дюн Ой ї : М Я ї ї що 5 хх Н М ШИ о ж плач кт : м КН нання пов

ШУ 0уу Дух тк кет тютюн о її - їй НВ ві МКК ОМ я . ! В КУ ПІЦ х ВЕ і ши и ; ше р ші З дня

ДУ Мотечеуткстукт ех укуетететекеттиттттттнн п п о

СТЕ веороввкучих ЕЕ ех ШрООях 0 фо: щі и їй що Не де ке З .

Фіг.

печемо Мои рожа

Кон

СУ ня пон анннни

З : ше ружа : пок а КОКОН

Х Я межи - кож и ВИК КВ АХ

МЕ дення но нн пееенееюю тет ннятх сни ни ше ох ож ТО. подив х йо їх ПО дбоеууттм З. ях КТ Яй х Зк у ож и С я й ТУ я

ДВ у Ех нн ВИ ж вк ДК укл оту КУ жи Б ши Я на ж х. ще КК Джен и а о а нн

Я Я ох А НН ша Ол уми БОКС Я дна БОЮ ШО Фет о щеі УЮ де: КІ пк ФЮу ДИдОТимі Мом

МОЖ АЖ ОМ АХ РК Хе ТМ ж т ЖЖ тіше о СУК ОЖМОВОХ мосту я

Ми сеММ мн УєЕИМ ХК М щем НН ЖМншМоМ СКК паси хі ке Е ФК Кум ІДИ ЛИМ МІН И т

З реа Ж их

Я ях хї гох

Я ; де Кх Я : дення :Х я Х - у

І ї є хх 5. х ві т

ДОД пряну нят нення ія ї нд БТ по Ка х ї х ОХ Ка т Кам реч ї М ОХ СЕ Я Ах коли дееттку втеч ннрвктінкя : їх ж Тк її; . Оу хи ЩУЖУКМУЮМММ І

Н КО ох, и. ЕМ яко реж дМЕ Ки : шк ВА ях: 7 Ж я ї сера МИ : Ком о АХ в х гі ї й гх ПЕКІН : Ота ЕХ ї Ок оте

Р в ТАМ я - АХ. Є К Би ршНкя К 2 КУЩ й о г

Унинн н ни М жу ТІ ТАКТ : Шк ІЗ : В я Не В ом Е

Тома Я КЗ хе В «7 У

Н сту Ме лк - Мі : пед ії мож ! : : х а ОКО ру : ме ї; ЗА А де. лк сеї КЕ х; Кх о т х Со о вн нн НН НН НАННЯ - У БУШН жо ї- її х З ще у ши М хх хо м в ан З НН ЗВ З ЗВ З М ЗЕ З ЗВ С М ЗО ше

ДУМ ЕММА и тям вин в нн нн нн нн ПЕДА ї Уж : пий п

І п : ВК : МКК ще ПУ. но й : поки я : подии

Же Оу сени,

СДН: они нн ви ННЯ ся ї Ерік ПЕК Ї і ПЕК кри ВУ ЖКА їй : ПО ем ОВ

З. : ПО п:

ЛЕ В Ек МУ х : ДЕК мкА

Ж В МЕТО сних ше он ооя ув ще ДИТИ АХ кон п оо ни ооо чих. : г ЩЕ ї ПМИКІ ие ОХ : що ОЕОБеНее х Нею т АСОМ

НЩ ХЕКНЕЕІ ит, УК

Н ТЕНи НА во

Н ЕН КК і ра РН

Я . ру сх ІНВ ния ПНО ких : сккос До ЗНЕЦІх МК : пен КК ом ВАН ІЕМ СПК з имя о КК у ВК КУКА сну М КВК ння

Може М інтЕ км плюИШЛИгО сх ХХ

ОА и ОО нн тиху ХХ : х ї

Н х ї 1 ха пи я . кол хлло я нанеси

Н

Я Н ж ї їх : х : г у ї Н їх Н ї; : дитя й Н ПЕК З

БУ як офі

ЖК уллииуют п т п ЛЕК ЛЕТИ ТАК ти пе птроолоєтюю КАЖЕ К

КУ : МИ АМВІ ях ї

Н плин ї

Н

Е

Н і

Н дня

Н мет

В 5 мо

М у КУКИ КК ДИ МАУ дю не Ме Од : ши МИ

Н еко рим і щей КО я

Н до Ук ї КолуНУХ Кон

МД; бек ит тет тюю тютюн Во нанни пенннняжкк Кн

ЩІ МИХ МКУ ї Й о КА

Н по СО КУ ї ЕП ШОЕ хи

Н ОМ ПН Ки ї ШЕ КИя НА

Ду днтун ую КУ КУ УК ут и АКА ТЕЖ ку МЕМ КК юю

ЕЗЖУМВКЛО Мате ШИХ З тпм

Фіг. 29

МКеМШЦИ МУ У ти ї і

З

Н

Н

Н

Н

Н

Н

Н

Н

Н

Н

Н

І х юю Кк: 1

ОДУ фр кю сук ух ку уяжяууикК, нн в в КО ! ДАТІ ї

ДЕ фену мит няня июня тик Урни : Ж : ся : Мих

Я во й : дес Я і Пен ус

Н ПИЛИМИКУХ ок : НЯ ЖІ і ОЗ КОКС удо КОКО У ни МУКИ нов КИ тн Оси цях ПУХ жом м тих яке мм пф «ВИК МККим КУКИ ПИМК ІИ Тот.

Н МИХ третю у тити Кук :

Н ї : : : :

Н ї :

Н ї Н

Тож у і я і

НУ ї Н

Я : пен мн

ЖЕ Н ТЕНи ІВ ї я ї ї НА од : НЯ ШИ

РО ММ бони тт тт петесчютннянння ПВЕК АВ їж 2 і скік ший

Ох ї ТАК ТВИ УМ 8 Я З днини

КОХ оз 4 і : ї ! ї ї ВН ЗО : : Н ому ПИАОХХ : : Н а ВН ля : : і БА БНВО Н

Н нн ВО ЗКУ НН Н ! Не бтркев о СЕ Кою ся Ко і

Й 7 Н : БчцпечнНх БЕН Хв мае і

Й ' Я 1 Н

Claims (26)

1. Імуногенна композиція в об'ємі, прийнятному для людської дози, що включає антиген або антигенний препарат у комбінації з ад'ювантом, де ад'ювант містить 0521, що представлений у формі ліпосоми, та 30-МРІ,, де вказаний 0521 та вказаний 30-МРІ, є обидва присутніми у вказаній людській дозі на рівні від 9 до 30 мкг.

2. Імуногенна композиція за п. І, де вказана ад'ювантна композиція додатково включає стерол, причому співвідношення сапонін/стерол знаходиться у межах від 1:1 до 1:100 ваг./ваг.

3. Імуногенна композиція за п. 2, де вказаний стерол є холестерином.

4. Імуногенна композиція за будь-яким з пунктів 1-3, де співвідношення 0521:30-МРІ, складає 1.1.

5. Імуногенна композиція за будь-яким з попередніх пунктів, де вказаний 30-МРІ. є присутнім у кількості 25 мкг.

6. Імуногенна композиція за будь-яким з попередніх пунктів, де вказаний 0521 є присутнім у кількості 25 мкг.

7. Імуногенна композиція за будь-яким з попередніх пунктів, де вказаний об'єм, прийнятний для людської дози, становить від 0,5 до 1,5 мл.

8. Імуногенна композиція за будь-яким з пунктів 1-7, де вказаний антиген або антигенний препарат походить від вірусу вітряної віспи (УХУ).

9, Імуногенна композиція за п. 8, де вказаний антиген або антигенний препарат, що походить від М/У, являє собою вкорочений білок оболонки УЛУ, ев.

10. Імуногенна композиція за будь-яким з пунктів 1-7, де вказаний антиген або антигенний препарат походить від РіІазтодійт ГаІстрагит.

11. Імуногенна композиція за будь-яким з пунктів 1-7, де вказаний антиген походить від М. Шшбегсиов185.

12. Імуногенна композиція за п. 11, де вказаний антиген або антигенний препарат, що походить від Мусобасіегішт шрегсцо5і5, є вибраним з ТЬ Ка12, ТЬ НО, ТЬ Каз35, ТЬЗ38-1, Ета 14, ОРУ, МТІ, МБ, тТТС2 та ЯТССІ1.

13. Імуногенна композиція за п. 11, де вказаний антиген або антигенний препарат, що походить від Мусобасіегійт Шшрегсиціові5, являє собою Ка-12-ТЬпПО-Ка35 або його варіант, в якому 5ег/04 послідовності є мутованим до іншої амінокислоти, відмінної від серину, або його похідні, що містять М-термінальну гістидинову мітку прийнятної довжини.

14. Імуногенна композиція за п. 11, де антиген являє собою М72.

15. Імуногенна композиція за будь-яким з пунктів 1-7, де антиген походить від НСМУ.

16. Імуногенна композиція за будь-яким з пунктів 1-7, де антиген походить від НІУ-1.

17. Імуногенна композиція за будь-яким з пунктів 1-7, де антиген походить від СпПатувіа

5рр.

18. Імуногенна композиція за п. 17, де вказаний антиген або антигенний препарат, що походить від СпПатуцдіа 5рр., є таким з Спатуйдіа (гаспотайв.

19. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 17 або 18, де вказаний антиген або антигенний препарат, що походить від СПіатудіа 5рр., є вибраним з СТ858, СТО89, СТ875, МОМР, СТе22, РтрО, Ртро, 5У/ІВ та імуногенних фрагментів будь-якого з них та їх комбінацій.

20. Імуногенна композиція за п. 19, де вказаний антиген або антигенний препарат, що походить від Спіатуана 5рр., являє собою комбінацію СТ858, СТОВ89 та СТ875.

21. Людська доза імуногенної композиції за будь-яким з пунктів 1-20 для застосування у медицині.

22. Ад'ювантна композиція в об'ємі, прийнятному для застосування у людській дозі імуногенної композиції, що складається з 9-30 мкг 30-МРІ, та 9-30 мкг 0521, представленого у формі ліпосоми.

23. Ад'ювантна композиція за п. 22, де вказаний 30-МРІ,. є присутнім у кількості 25 мкг.

24. Ад'ювантна композиція за п. 22, де вказаний 30-МРІ, є присутнім у кількості 10 мкг.

25. Ад'ювантна композиція за п. 22 або п. 23, де вказаний 0521 є присутнім у кількості 25 мкг.

26. Ад'ювантна композиція за будь-яким з пп. 22 або 24, де вказаний 0521 є присутнім у кількості 10 мкг.