UA81100C2 - Isolated monoclonal human antibody that binds to human il-12 - Google Patents

Description

Ця заявка частково базується на, та посилається на пріоритет за (05 Ргомізіопа! (тимчасовою заявкою) 60/223,358 поданою 7 серпня 2000р. та 60/236,827, поданою 29 вересня 2000р.|, кожну з яких повністю включено до даної заявки шляхом посилання.

Даний винахід відноситься до антитіл, включаючи вказані частини або варіанти, специфічні хоча б до одного Інтерлейкину-12 (І/-12), протеїну або його фрагменту, так само як до нуклеїнових кислот, що кодують антитіла до 1-12, комплементарних нуклеїнових кислот, векторів, клітин-хазяїв та способів їх одержання та використання, включаючи терапевтичні композиції, застосування та пристрої.

Інтерлейкин-12 (11-12) є гетеродимерним цитокіном, який складається з глікозильованих поліпептидних ланцюгів із масою 35 та 40кДа, зв'язаних дисульфідним зв'язком. Цитокін синтезується та секретується антиген-презентованими клітинами, включаючи дендритні клітини, моноцити, макрофаги, В-клітини, клітини

Лангерганса та кератиноцити, так само як і природними клітинами-кілерами (МК-клітинами). 11-12 опосередковує різноманітні біологічні процеси, та згадується як фактор стимуляції МК-клітин (МК5Б), фактор стимуляції Т-клітин, цитотоксичний фактор дозрівання Т-лімфоцитів та фактор ЕВвВУ- трансформованих ліній В-клітин (Сигів, 5). Н. А. »., еї аї, Сіїпіса! Місгоріоюоду Неміємув, 10: 742-780 (1997)|.

Інтерлейкин-12 може зв'язуватися з рецептором 1-12, експресованим на плазматичній мембрані клітин (напр., Т-клітин, МК-клітин), таким чином змінюючи (напр., ініціюючи, попереджуючи) біологічні процеси.

Наприклад, зв'язування 1-12 із рецептором І--12 може стимулювати проліферацію Т-клітин та МК-клітин, посилити цитолітичну активність цитотоксичних Т-клітин (СТІ), ГАК-клітин та МкК-клітин (кілерів, активованих лімфокіном), викликати вироблення гама-інтерферону (ЕМ САММА) Т- та МК-клітинами та викликати диференціацію простих ТпО-клітин у Тп1-клітини, що продукують ІЕМ САММА та 1--2 |іпспієті, а, Аппиа! Вемієм ої Іттипоіоду, 13: 251-276 (1995)). Зокрема, І--12 є життєво необхідним для утворення цитолітичних клітин (напр., МК, СТ) та для створення клітинної імунної відповіді (напр., клітинна відповідь, опосередкована ТП1 клітинами).

Таким чином, 1--12 є критично важливим для вироблення та регулювання як захисної імунної (напр., пригнічення інфекцій), так і патологічної імунної відповіді (напр., аутоіїмунітет) (Непаггак, 9. А. апа Вгипаа, М.

У., Гарогаюгу Іпмезіїдайоп, 72: 619-637 (1995)). Таким чином, імунна відповідь (напр., захисна та патогенна) може бути підсилена, пригнічена або попереджена через маніпулювання біологічною активністю 1-12 іп мімо, наприклад через антитіло.

Химерні, поліклональні (напр., антисироватки) та/(або моноклональні антитіла (Маре) та фрагменти (напр., протеїнові продукти їх протеолітичного розщеплення або злиття) ссавців крім людини, є потенційними терапевтичними засобами, котрі були вивчені у деяких випадках при спробі лікування певних захворювань. Однак, такі антитіла або фрагменти можуть викликати імунну відповідь при застосуванні на людях. Така імунна відповідь може спричинити опосередковане імунокомплексом вивільнення антитіл або їх фрагментів з циркуляції і зробити повторне застосування неприйнятним для терапії, знижуючи таким чином терапевтичну користь для пацієнта та обмежити повторне застосування антитіл чи фрагментів.

Наприклад, повторне застосування антитіл або фрагментів, які включають частини антитіл не людини, можуть призвести до сироваткових захворювань та/або анафілаксії. Як відомо з рівня техніки, для того, щоб попередити ці та інші проблеми, було випробувано багато підходів для зниження імуногенності таких антитіл та їх частин, включаючи химеризацію та гуманізацію. Ці та інші підходи, тим не менш, можуть забезпечувати антитілами чи їх фрагментами з деякою імуногенністю, низькою афінністю, низькою авидністю або зі складнощами в клітинній культурі, при збільшенні масштабу, при продукуванні та/або низьким виходом продукту. Таким чином, такі антитіла чи фрагменти можуть бути недостатньо ідеально придатними для виробництва або використання в якості терапевтичних протеїнів.

Звідси випливає, що існує потреба як у запровадженні антитіл до 1І-12 або їх фрагментів, які подолають ще одну з зазначених проблем, так і в удосконаленні відомих антитіл чи їх фрагментів.

Даний винахід пропонує виділені антитіла людини, приматів, гризунів, ссавців, химерні, гуманізовані та/або СОБВ-гібридизовані антитіла до 1-12, імуноглобуліни, продукти розщеплення та інші вказані їхні частини чи варіанти, так само, як композиції антитіл до ІЇ/-12, кодуючі чи комплементарні нуклеїнові кислоти, вектори, клітини-хазяї, композиції, склади, пристрої, трансгенні тварини, та способи їх одержання та застосування, як описано та здійснено тут, в комбінації з відомими з рівня техніки.

Даним винаходом також запропоновано хоча б одне виділене антитіло до ІЇ-12, як описано тут.

Антитіло згідно з даним винаходом включає будь-який протеїн чи пептид, що містить молекулу, яка представлена хоча б частиною молекули імуноглобуліну, такою як, але не обмежено нею, регіон, що визначає компліментарність (СОК) важкого чи легкого ланцюга, чи регіон зв'язування з його лігандом, регіон варіабельності важкого чи легкого ланцюга, регіон константності важкого чи легкого ланцюга, каркасний регіон, або його частина, котрий може бути включений в антитіло даного винаходу. Антитіло винаходу може включати чи бути одержаним від будь-якого ссавця, такого як, але не обмеженого ним, людина, миша, кролик, щур, гризун, примат чи їх комбінації, та подібне.

Даним винаходом запропоновано, в одному з аспектів, молекули виділеної нуклеїнової кислоти, включаючи комплементарні чи гібридизовані, полінуклеотид, який кодує хоча б один ідіотип антитіл до ІІ-- 12, включаючи хоча б одну вказану послідовність, домен, частину або його варіант. Даний винахід також пропонує рекомбінантні вектори, що включають згадувані нуклеїнові молекули, які кодують антитіло до ідіотипу 1-12, клітину-хазяїн, яка містить таку нуклеїнову кислоту та/або вектори, так само як і способи одержання та/або використання таких нуклеїнових кислот антиідіотипічних антитіл, векторів та/або клітин- хазяїв.

Даний винахід також пропонує принаймні один спосіб експресії хоча б одного антитіла до 1-12 чи антитіла до ідіотипу 1-12 в клітині-хазяїні, який полягає в культивуванні клітини-хазяїна як описано тут, за умови, що хоча б одне антитіло до 1-12 експресується в кількостях, достатніх для детектування та/або виділення.

Даний винахід також пропонує принаймні одну композицію, яка містить (а) виділену нуклеїнову кислоту антитіла до 1-12 та/або антитіло як показано тут; та (б) придатний носій або дилюент. Носій чи дилюент може бути, але не обов'язково, фармацевтично прийнятним, відповідно до відомих носіїв чи дилюентів.

Композиція може, не обов'язково, далі включати принаймні одну складову, протеїн чи композицію.

Даний винахід також пропонує принаймні один спосіб чи композицію антитіла до 1--12 для застосування в терапевтично ефективній кількості для модуляції чи лікування хоча б одного стану клітини, тканини, органу, тварини чи пацієнта, пов'язаного із І-12, та/або такого, що передує йому, слідує за ним, перебігає за пов'язаних причин, як показано тут.

Даний винахід також пропонує принаймні одну композицію, пристрій та/або спосіб доставки терапевтично чи профілактично ефективної кількості принаймні одного антитіла до 1-12, згідно з даним винаходом.

Даний винахід далі пропонує хоча б один спосіб чи композицію з антитілами до 1-12, для діагностики хоча б одного стану клітини, тканини, органу, тварини чи пацієнта, пов'язаного із 1-12, та/або такого, що передує йому, слідує за ним, перебігає за пов'язаних причин, як показано тут.

Даний винахід також пропонує принаймні одну композицію, пристрій та/або спосіб доставки для діагностики хоча б одного антитіла до ІІ --12, відповідно до даного винаходу.

Фігури ТА та 18: діаграми, які демонструють зв'язування, що залежить від концентрації моноклональних анти-1І.-12 антитіл з іммобілізованим І/-12 людини. Анти-ІЇ-12 антитіла послідовно були промиті 1905

В5БА/РВ5 та інкубовані на платівках, покритих гПІ--12 на протязі однієї години при 37"С. Потім платівки двічі промивали 0.0295 Твином 20 (поліоксиетилен (20) монолаурат сорбітану), 0.15М сольовим розчином і потім тестували пероксидазою хрону (НКР) міченими антитілами козла специфічними до до каппа людини на протязі 1 години при кімнатній температурі. Платівки потім знову промивали, обробляли субстратом о- фенілендиаміну (ОР) і оптична щільність (00) кожної лунки вимірювалася при 490нм.

Фігура 2: смуги з ліва на право на Фігурах А та В відповідають 1-12 людини, І//12 р40 людини, 1-12 миші та маркерам молекулярної маси. На Фігурі А показано зони пофарбовані загальним протеїном.

Первісні зони з кожної смуги є І--12 людини (75кДа), р40 людини 1-12 (40кДа), та І/-12 миші (75кДа). На

Фігурі 28 показано угевіегп ріої одержаний з гелю, ідентичного до приведеного на Фігурі 2А. Пляму, обробляли С340 після НЕР міченими антитілами козла, специфічними до анти-Ідо людини та специфічно виявляли лише ІЇ/-12 людини (мономери та мультимери) та І/-12 р40 людини. Контрольні плями (не приведено) оброблені НЕР, міченими антитілами козла специфічними до анти-дое людини зовсім не виявляли зон.

Фігура 3: Аналіз оберненою РСЕ-транскрипцією експресії гену ІЕМу у РВ5 людини оброблених І1І--2, І - 12, 1--2-41-12 з або без анти-ІІ/-12 антитіл С340, 8.6.2, ізотипом контрольних антитіл. Загальна ЕМА була обернено транскрибована, ампліфікована за допомогою РСЕ з використанням ген-специфічних праймерів.

Також було визначено рівень р-актинової тЕМА в кожному зразку, що слугувало контролем для цілісності та вмісту ТЕМА.

Фігура 4: є гістограмою, яка відображає те, що анти-ІЇ-12 тАБ людини (С340) пригнічує вироблення інтерферону-у (ІЕМу) моноцитами збідненими на СО3- мононуклеарними клітинами периферичної крові (РВМСО), стимульованими 1--2-1Ї1-12. РВМС були культивовані на протязі п'яти годин в контрольних середовищах (без додавання цитокінів), середовищах з додаванням 1-12 (0.1Тнг/мл) плюс 1-2 (50МО/мл) (С-12/1-2), контрольних середовищах з додаванням тАб С340 (10до/ті) та середовищах 1--12/І-2, які містили тА С340 (10до/ті). Міжклітинний ІРМ-у був визначений за допомогою двокольорового імунофарбування СОЗ-РЕ та ІЄМу-РІТС. Дані наведено для одного донора.

Фігура 5: Діаграма, яка показує залежне від дози інгібування секреції ІЕМ-у лімфоцитами периферичної крові, стимульованими 1-2 плюс 1-12 двома різними групами анти-1ІЇ-12 тАбБр (С340) людини. РВІ людини (вх106/ті) культивувалися на протязі 24 годин із 10Ш/ті І--2, 1-2 плюс 4б0орад/ті 1І--12, або 1-2 плюс 1-12 та тА С340 як показано. Супернатанти культур було видалено та досліджено на ІЄМу за допомогою ЕА.

Фігура 6: Гістограма, яка показує залежне від дози інгібування цитотоксичності І АК-клітин індукованих

І/-12 плюс 1-2 антм-11І-12 тАр (0340) людини. Клітини ГАК-ефектори (РВІ людини, 8х106/ті) культивувалися на протязі 24 годин з 1-12 (400рд/ті) плюс 1-2 (100/ті) та тАБ С340 (5000пад/ті чи 50пд/ті як показано). Клітини ГАК-ефектори відмивалися та культивувалися із клітинами-мішенями Каї), міченими 51Сг на протязі чотирьох годин при співвідношенні ефектор до мішені (Е: Т) 80:11, та була визначена кількість 51Сг, вивільненого у середовище, внаслідок лізису клітин Каїї. Результати представлено як середнє при стандартній похибці трьох нормальних донорів. І/-12 позитивний контроль (1-12) є ефекторними клітинами, інкубованими з та без 1-12 антитіл. Фоном (ВКОБ) є ефекторні клітини, інкубовані без 1-12 або антитіл.

Фігури 7А та 7В: є гістограмами, які демонструють, що 1-12 плюс ІС-2-індукована експресія СЮО95 на мононуклеарні клітини периферичної крові СОЗ3- інгібується анти-І./-12 тА (2340) людини. РВМСО культивувалися на протязі 72 годин на середовищі з вмістом 1-12 0.Тпд/ті та субоптимальній дозі 1-2 (5010/тіІ) в присутності чи відсутності тА С340 (10йд/тіІ). Експресія С0О95 вимірювалася проточною цитометрією клітин, оброблених анти-СО95-РІТС. Світлопропускання виконувалося за допомогою двоколіроного аналізу (СОЗ чи СО56-РЕ ув. СО95-РІТС) та прямим уз. ортогональним світлорозсіювання.

Фігура 8: На діаграмі показано, що рекомбінантні антитіла людини (гС340) до 1-12 людини зв'язуються з імобілізованим 1-12 у спосіб, що не відрізняється від очищених тАб С340. Було визначено концентрацію "9340 в супернатанті трьох рекомбінантних клітинних ліній, які продукують гС340, та було визначено зв'язування супернатанту з 1-12 в ЕГІ5А.

Платівки було покрито 2йд/ті ІЇ/-12 людини та інкубовано з очищеними тАБб С340 з оригінальної гібридоми (стандарт) або супернатантами рекомбінантних клітинних ліній. ІІ -12-поріг антитіл було визначено за допомогою антитіл козла до дО (важкий ланцюгнлегкий ланцюг) людини, кон'югованими з лужною фосфатазою.

Фігура 9А-9С: є діаграмами, що показують кінетику росту та кількості антитіл, секретованих трьома незалежно одержаними КС-340 продукуючими субклонами рекомбінантних клітин (Ффіг.9А, субклон С3798В;

Фіг.9В, субклон СЗ381А; Фіг.9С, субклон 389А). Рекомбінантні клітини було висаджено в колби 175 із початковою щільністю 2х1Оклітин/ті в стандартному середовищі. Через різні проміжки часу клітини ресуспендували і визначали кількість живих клітин та значення (нд/ті) "С34Ов середовищі.

Даний винахід пропонує виділені рекомбінантні та/або синтетичні анти-іІІ-12 людини, приматів, гризунів,

ссавців, химерні, гуманізовані чи СОК-гібридизовані, антитіла та їх антиідіотипічні 1-12 антитіла, крім того, композиції та кодуючі молекули нуклеїнової кислоти, які включають хоч би один полінуклеотид, який кодує хоч би одне анти-ІЇ-12 антитіло або антиідіотипічне антитіло. Даний винахід також включає, але не обмежується цим, способи одержання та використання таких нуклеїнових кислот, антитіл та антиідіотипічних антитіл, включаючи діагностичні та терапевтичні композиції, способи та пристрої.

В цьому описі використані поняття, "антитіло до антиінтерлейкіну-12", " анти-ІЇ-12 антитіло", "частина анти-ІЇ-12 антитіла", "фрагмент анти-ІЇ-12 антитіла" та/або "варіант анти-ІЇ-12 антитіла" та подібні, включають будь-який протеїн чи пептид, що містить молекулу, представлену принаймні частиною молекули імуноглобуліну, такою як, але не обмежуючись, хоч би один регіон, який визначає компліментарність (СОК) важкого або легкого ланцюга чи його частину, що зв'язує ліганд, або регіон варіабельності важкого або легкого ланцюга, або константний регіон важкого або легкого ланцюга, каркасний регіон, чи будь-яка їхня частина, чи хоча б одна частина рецептора 1-12 чи зв'язуючого протеїну, який може бути включений в антитіло даного винаходу. Таке антитіло може діяти на специфічний ліганд, таким чаном, але не обмежуючись ним, що таке антитіло модулює, знижує, підвищує, антагонізує, агонізує, стримує, стимулює, блокує, інгібує, анулює та/або інтерферує з хоча б однією дією 1-12, хоча б з однією активністю чи зв'язуванням І/-12 або активністю чи зв'язуванням рецептора 1-12, іп мійго, іп 5йи та/або іп мімо. Як необмежуючий приклад, прийнятне анти-1ІЇ-12 антитіло, зазначена частина чи варіант даного винаходу може зв'язуватися принаймні з одним 1-12, з його зазначеною частиною, варіантом чи доменом. Прийнятне анти-1/-12 антитіло, зазначена частина чи варіант може також необов'язково впливати на принаймні одну активність чи функцію 1-12, таку як, але не обмежуючись нею: синтез ЕМА, ОМА чи протеїну, вивільнення

І/-12, передачу сигналів рецептора 1-12, розщеплення мембран ІІ--12, активність І--12, вироблення та/або синтез І/-12. Термін "антитіло" в подальшому описує антитіла в цілому, фрагменти розщеплення, їхні зазначені частини та варіанти, включаючи антитіла міметики або такі, що містять частини які імітують структуру та/"або функцію антитіл чи зазначених фрагментів чи частини їх, включаючи одноланцюгові антитіла та їхні фрагменти. Функціональні фрагменти включають антиген-зв'язуючі фрагменти, котрі зв'язують І/-12 людини. Даним винаходом охоплюються, наприклад, фрагмент антитіла здатний зв'язуватись із ІЇ-12 чи його частина, включаючи, але не обмежуючись цим: Раб (напр., гідроліз папаіном),

ЕРар' (напр., гідроліз пепсином та часткове відновлення) та К(аб) (напр., гідроліз пепсином), Тась (напр., гідроліз папаіном) рЕс' (напр., гідроліз пепсином чи плазміном) Ра (напр., гідроліз пепсином, часткове відновлення та реагрегація), Ем або 5сЕм (напр., методами молекулярної біології) (див. напр., Соїїїдап,

Іттипоіоду, зирга).

Такі фрагменти можуть бути одержані ферментативним розщепленням, методами синтезу чи рекомбінації, як відомо з рівня техніки та/або як описано тут. Антитіла також можуть бути одержані у вигляді різноманітних вкорочених форм, використовуючи гени антитіл, в яких один чи більше стоп-кодонів вставлені вище ніж природні стоп-сайти. Наприклад, комбінація генів, що кодують частину важкого ланцюга

Е (ар)»2 може бути сконструйована включенням послідовності ОМА, що кодує СН, домен та/або петельну ланку важкого ланцюга. Різні частини антитіл можуть бути з'єднані разом звичайним хімічним способом, чи виготовлені як цілий протеїн методами генетичної інженерії.

Як використано тут, термін "антитіла людини" відноситься до антитіла в якому переважно кожна частина протеїну (напр., СОЕ, каркас, Сі, Сн домени (напр., Сн1!, Сн2г, Сн3З), петля, (Мі, Мн)) є, переважно, неімуногенними для людини, лише з незначними змінами в послідовності та варіантами. Подібним чином, антитіла зазначені, як приматів (мавп, бабуїнів, шимпанзе та ін.), гризунів (мишей, щурів, кролів, морських свинок, ховрахів та ін.) та інших антитіл, зазначених як специфічних для ссавців, виду, підроду, роду, підсімейства, сімейства. Далі, химерні антитіла включають будь-яку комбінацію вищезгаданих антитіл. Такі зміни чи варіації необов'язково та переважно зберігають чи знижують імуногенність у людини чи інших видів, відносяться до немодифікованих антитіл. Отже, антитіла людини відмінними від химерних чи гуманізованих. Відмічено, що антитіла людини можуть продукуватися іншими тваринами, прокаріотичними чи еукаріотичними клітинами, здатними експресувати функціонально перегрупований ген імуноглобуліну людини (напр., важкий та/або легкий ланцюг). Далі, коли антитіло людини є одноланцюговим антитілом, воно може містити лінкерний пептид, який не зустрічається в природних антитілах людини. Наприклад, Ем може містити лінкерний пептид, з такими як два-вісім гліцини чи іншими амінокислотними залишками, які з'єднують різні регіони важкого ланцюга та різні регіони легкого ланцюга. Такий лінкерний пептид може бути визнано як пептид людського походження.

Біспецифічні, гетероспецифічні, гетерокон'югатні чи подібні антитіла також можуть бути використані як моноклональні, переважно людські чи гуманізовані, антитіла які мають специфічне зв'язування з принаймні двома різними антигенами. В даному випадку, однією із специфічностей зв'язування має бути принаймні одна до 1-12 протеїну, а друга має бути до іншого протеїну. Способи одержання біспецифічних антитіл відомі з рівня техніки. Традиційно, рекомбінантні способи одержання біспецифічних антитіл базуються на одночасній експресії двох пар важких ланцюгів-легких ланцюгів імуноглобуліну, де два важких ланцюги мають різні специфічності (Міївіеїп апа Сиеїйо, Маїшге 305: 537 (1983)). Завдяки випадковому виборові важких та легких ланцюгів, ці гібридоми (квадроми) потенційно виробляють суміш з 10 різних молекул антитіл, з яких лише одна має правильну біспецифічну структуру. Очищення правильних молекул, зазвича й проводиться за допомогою афінної хроматографії, яка є досить складною, що призводить до низького виходу продукту. Подібні процедури описано, наприклад, (М/О 93/08829, патенти 05 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, УМО 91/00360, УМО 92/00373, ЕР 03089, Тгашпескег ега!І., ЕМВО .). 10: 3655 (1991), З!,гезп еї аі., Мешйоаз іп Епгуто!оду 121: 210 (1986), які повністю включено сюди шляхом посилання).

Анти-1ІІ-12 антитіла (які також називають антитілами до 1-12) застосовні в способах та композиціях даного винаходу, можуть, необов'язково, характеризуватися високою афінністю зв'язування з 1ІІ/-12 та необов'язково та переважно, низькою токсичністю. Зокрема, придатними для даного винаходу є антитіла, зазначені фрагменти чи варіанти винаходу, де індивідуальні складові, такі як регіон варіабельності, регіон константності та каркас, поодиноко та/або разом, необов'язково та переважно мають низьку імуногенність.

Антитіла, які можуть бути застосовані в даному винаході, необов'язково можуть характеризуватися їхньою здатністю лікувати пацієнтів на протязі тривалого періоду із явним полегшенням симптомів та низькою та/або прийнятною токсичністю. Низька чи прийнятна імуногенність та/або висока афінність, так само як прийнятні властивості, можуть складати отримані терапевтичні результати. "Низька імуногенність" визначається як перевищення значень НАНА, НАСА чи НАМА відповідей менш ніж на 7595, чи переважно менш ніж на 5095 у пацієнтів та/або перевищення низьких титрів у пацієнтів (менш ніж 300, переважно менш ніж 100 визначених ферментативним імуноаналізом подвійного антигену) І|див., напр., ЄЇПойк ег аї., Гапсеї 344: 1125-1127 (1994), які повністю включено сюди шляхом посилання).

Модель

Виділені нуклеїнові амінокислоти даного винаходу можуть бути використані для виробництва принаймні одного антитіла до 1-12 чи вказаного його варіанту, який може бути використаний для визначення чи дії на клітину, тканину, орган чи тварину (включаючи ссавця та людей), діагностування, моніторингу, модулювання, лікування, підвищення, допомоги у попередженні погіршення, зниження симптомів хоча б одного зі станів, пов'язаних з ІІ--12, вибраних з, але не обмежених ними, принаймні одного імунного розладу чи захворювання, кардиоваскулярного розладу чи захворювання, інфекції, злоякісних новоутворень, та/або нейрологічних розладів чи захворювань, чи інших відомих чи визначених як станів, пов'язаних із ІІ -12.

Такий спосіб може включати застосування ефективної дози складу чи фармацевтичної композиції, яка містить принаймні одне анти-1ІЇ-12 антитіло до клітини, тканини, органу, тварини чи пацієнта для потреб такої модуляції, лікування, підвищення, попередження чи зниження симптомів, ефектів чи механізмів.

Ефективна кількість може становити від 0.001 до 500тд/кд на одиницю (напр., болус), багатократне чи тривале вживання, чи для досягнення концентрації в сироватці 0.01-5000дд/ті на однократне, багатократне чи тривале вживання, чи будь-який її ефективний діапазон чи значення, як зроблено та визначено з використанням відомих методів та, як описано тут чи відомо з подібних робіт.

Усі публікації чи патенти, процитовані тут є повністю включеними сюди шляхом посилання так, як вони відображають рівень техніки на час даного винаходу та/(або допомагають розкриттю та можливості здійснення даного винаходу. До публікацій віднесено будь-які наукові чи патентні публікації, чи будь-яка інформація доступна на носіях, включаючи всі записані, електронні чи друковані носії. Наступні посилання повністю включено шляхом посилання:

ІАизибеї, єї аї., ед., Ситепі Ргоїосо!в іп МоіІесшаг Віоіоду, допп УМієу 5 Бопв, Іпс., МУ, МУ (1987-2001);

ЗатбгоокК, еї аї., МоІесшаг Сіопіпд: А ІГарогаїгу Мапиа), 2па Еайоп, Соїй бргіпд Натбог, МУ (1989);

Напомапа І апе, анТтМбодієз, а І арогаїюгу Мапиаї, Соїа бргіпд Нагпог, МУ (1989); СоїПїдап, еї а!., єав., Сштепі

Ргоїюсоїв іп Іттипоіоду, допп УМієу 5 Бопв, Іпс., МУ (1994-2001); СоїПдап еї аї., Ситепі Ргоїосої!5 іп Ргоїєїп

Зсієпсе, дхопп УМієу 5 Зопв, МУ, МУ, (1997-2001).

Антитіла даного винаходу

Принаймні одне анти-1ІІЇ-12 антитіло даного винаходу може, необов'язково, бути вироблено клітинною лінією, змішаною клітинною лінією, іморталізованими клітинами чи клональною популяцією іморталізованих клітин, як відомо з рівня техніки. |Див. напр., А!Єзирбреї, еї аї., ед., Сиштепі Ргоїосо!5 іп Моїіесшаг Віоіоду, Ууопп

ММПеу б бопв, Іпс., МУ, ММ (1987-2001); Затьгоок, еї аї., МоІесшаг Сіопіпд: А І арогаїюгу Мапиаї, 2"Еашцоп,

Со бргіпд Нагрог, ММ (1989); Напом апа І апе; антиродіез, а І арогаїогу Мапиаї!, Соїа бргіпд Нагбог, МУ (1989); СоїпПідап, єї а!., едв., Ситепі Ргоїосої!в іп Іттипоіоду, допп Улієу б опе, Іпс., МУ (1994-2001); СоїЇїдап еї аі., Сштепі Ргоїосоїв іп Ргоїеїп 5сіепсе, доп УМієу 5 Бопз, МУ, МУ, (1997-2001), всі повністю включено шляхом посилання).

Антитіла людини, специфічні до протеїну І/-12 людини чи його фрагментів, можуть мати перевагу порівняно з відповідним імуногенним антигеном, таким як виділений та/або протеїном 1І/-12 чи його частиною (включаючи синтетичні молекули, такі як синтетичні пептиди). Інші специфічні чи загальні антитіла ссавців також можуть одержати перевагу. Виготовлення імуногенних антигенів та виробництво моноклональних антитіл може бути виконано за прийнятною методикою.

Наприклад, гібридома може бути одержана злиттям прийнятних іморталізованих клітинних ліній (напр., мієломні клітинні лінії такі, як, але не обмежуючись цими, 5рг2/0, 5р2/0-АС14, МБО, М51, М52, АЕ-1, І. 5, »243, Р3УХбЗАд8. 653, 5ра ЗАЗ, 5ра2 МАЇ, 5ра2 551, 5ра 5АБ, 0937, МІ А 144, АСТ ІМ, МОЇ Т4, СА-1, Ч"0ОАКАТ,

МЕНІ, К-562, СО5, ВАШІ, МІН 313, НІ-60, МГА 144, МАМАЇМУА, МЕШКО 2А, чи подібні, чи гетеромієломи, продукти їх злиття), чи будь-які клітини або злиті клітини, одержані з них, чи інші прийнятні клітинні лінії відомі з рівня техніки (Див. напр., м/млу.аїсс.ого, мули. Пегесп.соті| та подібні, до клітин, що продукують антитіла, такими, як але не обмежуючись ними, виділені чи клоновані клітини селезінки, периферичної крові, лімфи, мигдалеподібної залози, чи інших, які містять імунні чи В-клітини, чи інші клітини, які експресують важкий чи легкий ланцюг, константний чи варіабельний регіон чи каркас чи СОК-послідовність, ендогенні так само, як гетерогенні нуклеїнові кислоти, рекомбінантні чи ендогенні вірусів, бактерій, водоростей, прокаріотів, амфібій, комах, рептилій, риб, ссавців, гризунів, коней, баранів, кози, приматів, еукаріотів, геномну ОМА, СОМА, ОМА, мітохондріальну ОМА чи КМА, хлоропластну ОМА чи КМА, ппПКМА,

ТЕМА, ТЕМА, одно-, дво-, чи три ланцюгову, гібридизовану, та подібну чи їх комбінацію. ІДив. напр., зирга, апа Соїїдап, Іттипо!оду, зирга, спарієг 2, який повністю включено шляхом посилання|.

Клітини, що продукують антитіла можуть бути одержані з периферичної крові чи переважно, селезінки чи лімфатичних вузлів людини чи інших прийнятних тварин, котрі були імунізовані цільовим антигеном.

Інша прийнятна клітина-хазяїн може також бути використана для експресії гетерогенної чи ендогенної нуклеїнової кислоти, яка кодує антитіло, специфічний фрагмент чи його варіант, згідно з представленим винаходом. Злиті клітини (гібридоми) чи рекомбінантні клітини можуть бути виділені з використанням селективних культуральних умов чи інших прийнятних відомих методів, та клоновані обмеженим розведенням чи відбором клітин, чи іншим відомим способом. Клітини, які виробляють антитіла з бажаною специфічністю можуть бути відібрані прийнятним аналітичним методом (напр., ЕГІБЗА).

Можуть бути використані інші прийнятні способи одержання чи виділення антитіл необхідної специфічності, включаючи, але не обмежуючись цим, способи за допомогою яких відбирають рекомбінантні антитіла з пептидної чи протеїнової бібліотеки напр. але не обмежуючись цим, бактеріофагової, рибосомної, олігонуклеотидної, ЕММА, СОМА чи подібних; Інапр., якщо доступні, з дисплейних бібліотек

Сатрпдде апіроду Тесппоїодієз, Сатргпддевзпігтє. ШК; Могрпозув, Мапіпвгеід/Ріапед9, ОЕ; Віомайоп,

Арегдеєп, бсойапа, ОК: Віоіпмепі, па, Змедеп; Оуах Согр., Епгоп, Апйутах/Віозіїє; Хота, ВегКкеїєу, СА;

Іхзуз. Зее, напр., ЕР 368, 684, РСТ/5891/01134; РСТ/5892/01755; РСТ/2В92/002240; РСТ/2В92/00883;

РСТ/ав93/00605; 05 08/350260 (5/12/94); РСТ/а894/01422; РСТ/а894/02662; РСТ/2897/01835; (САТ/МКС);

М/090/14443; М/090/14424; МО90/14430; РСТ/О594/1234; М/092/18619; М/096/07754; (Зспррв); ЕР 614989 (Могрпобувз); УУ095/16027 (Віоіпулеп); УУО88/06630; М/090/3809 (Оуах); 5 4,704,692 2 (Епгоп);

РСТ/Ю591/02989 (АпПутах); УМО89/06283; ЕР 371998; ЕР 550400; (Хота); ЕР 229046; РСТ, 07149 (Іхвув)|; чи стохастично генерованих пептидів чи протеїнів - (05 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5524514, 5976862, МО 86/05803, ЕР 590689 (Іхзуз, тепер Арріїеа МоїІесшаг Емоїшіоп (АМІЕ) кожну з яких повністю включено шляхом посилання)|, або такі, що застосовуються при імунізації трансгенних тварин Інапр., 5СІО тісе, Мдиуєп еї аї., Місгобріо!. Іттипої!. 41: 901-907 (1997); Запани еї аї., Ст. Аем. Віоїесппої. 16: 95-118 (1996); Егеп еї аї., Іттипої. 93: 154-161 (1998), які повністю включено шляхом посилання|, котрі здатні виробляти певний перелік антитіл людини, як відомо з рівня техніки та/або описано тут. Такі методики, включаючи, але не обмежуючись цим, "гірозоте аїізріау" (Напез еї аї., Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА, 94: 4937- 4942 (Мау 1997); Напез єї аїЇ., Ргос. Май. Асад. Осі. ОБА, 95: 14130-14135 (Мом. 1998))|; методики виробництва антитіл за допомогою поодиноких клітин Інапр., спосіб одержання антитіл селектованих лімфоцитів ("ЗІГАМ") (05 раї. Мо. 5,627,052, УМеп еї аї., 9. Іттипої. 17: 887-892 (1987); Варсоок еї аї., Ргос.

Май. Асад. Осі. ОБА 93: 7843-7848 (1996)); мікракрапельно-гелева та проточна цитометрія (Роуеї! еї аї.,

Віоїеснпої!. 8: 333-337 (1990); Опе Сеї! Зувієтв, Сатрбгідде, МА; Стгау еї а)., 9). Ітт. Меїй.182: 155-163 (1995);

Кеппу еї аї., Віоїесппої!. 13: 787-790 (1995)); відбір В-клітин |БіеепракКкКег"з еї аї., Моїес. Віої. Нерогів 19: 125- 134 (1994); допак еї а!ї., Ргодгез55 Віоїесі, Мої. 5, Іп Міго Іттипігайоп іп Нубгідота Тесппоіоду, Воїтераєск, ей., Еівемієг Зсіеєпсе РибіїзНегз В. М., Атвіегдат, МемШепапавз (1988)|.

Також можуть бути використані способи створення чи гуманізації антитіл не людини та людини, які є загально відомими з рівня техніки. Загалом, гуманізовані чи сконструйовані антитіла мають один чи більше амінокислотних залишків з джерела, яке не є людиною, напр., але не обмежуючись до, миші, щура, кроля, примата - не людини чи інших ссавців. Ці амінокислотні залишки людини часто називають "імпортні" залишки, котрі звичайно одержуються з "Імпортного" варіабельного, константного чи іншого домену відомих послідовностей людини. Відомі послідовності Ід людини надано, напр.,

Гмилллу. порі. піт.пій.дом/епігег/диегу.їсді; мили. агсс.ого/рпаде/пар.ніті; млмлу.всідевісот/; млмлму.арсат.соту/; млмли.апіїродугезоцгсе.сот/опіїпесотр. (ті; мли. рибіїс.іазіасге.еди/"реаго/гезеагспіооів. піті; мумлу. тдеп.ипіпеїідеІрего.ае/5О/ЛТЛТ.НЕті; мулу. м пітеетап.сот/ттипоіоду/СНОБ/Ккируоб. піт; мул Тюгагу Фіпкдневіого/12429/ЛІттипе/АНТМброау. піті; мули. пи ті.ого/дгапівЛесіигев/1996/мар/; мли. ра. сат.ас.ик/"тгс7/тпікеіїтадев.піті; мули. апіродугезоцгсе.сот/; тер.Нагмага.еди/Віо іпко/ттипоіоду.піті; мли. іттипоіодуїїпКосот/; рагтрохлмиві.еди/-Нсепіег/Іпаех. пі ті; мумлу.ріоїтесп. шт ейц/-псі/ 0 мумлу.ребіо.сот/ра/340913/340913.піті; /- мумлу.паї. изда.дом/ажіс/рирз/антироду/; мули. гп.епіте-и.ас.|р/"уазинію/Еїїва. піті; мм. ріодевзідп.сот/аріе.азр; млмлу. спе ик/ахр/асз/даміезлЛіпкв.піті;. милу. ріотесн. й. ейи/Тосі/ргоїосої.піті;. мли. ізаспеїого/зіев део.піті; ахітиН Ітіпі-тагриго.де/"гек/АЕР Бан. піті; Базегу.исі.Кип.пі/ігааївЛіпке1.піті; мумли.тесабр. ипі- нпа.де/лттипо.Юте. пуми. еди/; мулу. тто-сре.сат. ас. икК/ті-дос/риріїс/ІМТ ВО. піті; мила. рі ипат.тх/міг/М тісе.піті; ітд. спивс. 81047; мили. Віоспет. сі. ас. ик/етапіп/арз/Іпаєх. піті; аНТпроау.рак.ас.ик/; ардеп.смт.ати.едиЛарлиуммардеп. піті; мумлу.ипі2н.сп/"попедде/АНОзетіпаг/5іІїдеб1. пЕті; мумлм.сгувіВрК. ас.ик/"ирс9о75/; мм. пітг. тго.ас.ик/СС/ссаємд/ссаємо. піт; милу. рак. сат.ас.ик/е тгс7/питапізайоп/ТАННР. пІті; млмли. рі пат. тх/міг/5їисшге/внаї аїт. піті; ммлиу. ріозсі. тівзоцШгі.еди/5тіпор/іпаєх. піті; млмли.сгуві.ріос.сат. ас.ик/Утоїїпал//лер-радез/Реріувроцесн.пі ті; мали. |егіпі ел ргодисів. піт; мумлу. раїепів.Ірт.сот/ірт.піті. Кабаї єї аі., Зедоепсез ої Ргоїеїп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегевзі, 0. 5. Оері. Неанйт (1983), повністю включено шляхом посилання). Дані імпортні послідовності можуть бути використані зниження імуногенності чи зниження, підвищення чи модифікації зв'язування, афінності, оп-гаїе, ой-гаїе, авідності, специфічності, періоду напів-розкпаду, чи інших прийнятних характеристик, як відомо з рівня техніки. Загалом, частина чи вся СОК-послідовність людини чи не людини зберігається тоді як константний та варіабельний регіони заміщуються амінокислотами людини чи іншими. Антитіла також, необов'язково, можуть бути гуманізовані зі збереженням високої афінності до антигену та інших бажаних біологічних властивостей. Щоб досягти цієї мети, гуманізовані антитіла можуть бути, необов'язково, одержані в результаті аналізу батьківських послідовностей та різноманітних концептуальних гуманізованих продуктів з використанням тривимірних моделей батьківських та гуманізованих послідовностей. Тривимірні моделі імуноглобуліну, взагалі, доступні та добре знайомі тим, хто обізнаний в рівні техніки.

Доступні комп'ютерні програми, які ілюструють та відображають можливі тривимірні конформаційні структури відібраних кандидатів серед імуноглобулінових послідовностей. Дослідження цих відображень дозволяє проаналізувати можливі ролі залишків у функціонуванні кандидатних імуноглобулінових послідовностей, напр., аналіз залишків, які впливають на здатність кандидатних імуноглобулінів на зв'язування з антигеном. Таким чином ЕК залишки можуть бути відібрані та комбіновані з консенсних та імпортних послідовностей, таким чином, що будуть одержані бажані характеристики антитіл, такі як збільшена афінність до цільового антигену(ів). Загалом, СОК-залишки прямо та більш значно включаються у вплив на зв'язування антигену. Гуманізація та конструювання антитіл даного винаходу може бути виконана за допомогою будь-якого відомого способу, такого як, але не обмежуючись цим, описані в: (Ми/іпіег (Чопез еї аї., Машге 321: 522 (1986); Віесптапп еї а!., Машге 332: 323 (1988); Метоеуеп еї аї., Зсіеєпсе 239: 1534 (1988)), 5ітз еї аї., 9. Іттипої. 151: 2296 (1993); Споїпіа апа Г ез5К, 9. Мо. Вісі. 196: 901 (1987), Сапег єї а!., Ргос. Майї). Асай. сі. 0. 5. А. 89: 4285 (1992); Ргевіа вї аї., 9У. Іттипої. 151: 2623 (1993), О5 раїепі Мов : 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539, 4816567, РСТ/: О598/16280, 00596/18978, 0591/09630, 0591/05939,

О594/01234, 4889/01334, 891/01134, 1892/01755; М/090/14443, УМО90/14424, М090/14430, ЕР229246, усі повністю включено шляхом посилання, включаючи посилання приведені в них).

Анти-1/-12 антитіла також можуть бути одержані імунізацією трансгенних тварин (напр., мишей, щурів,

ховрахів, приматів, але не людей, та їм подібних) здатних виробляти різноманітні антитіла людини, як описано та/або відомо з рівня техніки.

Клітини, що продукують анти-ІЇ/-12 антитіла також можуть бути виділені з таких тварин та бути іморталізованими прийнятними способоми, такими як способи приведені тут.

Трансгенні миші, які можуть виробляти спектр антитіл людина, що зв'язуються з антигенами людини, можуть бути одержані відомими способами І|напр., але не обмежуючись ними, . 5. Раї. Мов: 5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, 5,625,126, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 апа 5,789,650 видані на Гопрегу еї а).;

УаКобоміїв еї аі. УУО 98/50433, ЧдаКобоміїв еї а. УУО 98/24893, І опрего єї аІ. УУО 98/24884, І опрего еї а. МО 97/13852, І опрего єї а. МО 94/25585, Киспепараїе єї аі. УУО 96/34096, Киспепараїе еї аІ. ЕР 0463151 ВІ1,

Киспепараїе єї а. ЕР 0710719 АТ, Бигапі еї а. 05. Раї. Мо. 5,545,807, Впддетапп еї аі. УУ/УО 90/04036,

Вгоддетапп еї аї. ЕР 0438474 В 1, І опрегу еї аі. ЕР 0814259 А2, І опрего еї аІ. ОВ 2272440 А, І опрего еї а.

Майте 368: 856-859 (1994), Тауїог єї аї., Іпі. Іттипої. 6 (4) 579-591 (1994), Стгееп вї аї, Майте Сепеїйсв 7: 13- 21 (1994), Мепаеє? еї аї., Майшге Сепеїйсв 15: 146-156 (1997), єї аї., Мисієїс Асідз Незєагсі 20 (23): 6287-6295 (1992), Тиайоп еї аї., Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 90 (8) 3720-3724 (1993), І опрего еї аї., Іпї Вем Іттипої 13 (1): 65-93 (1995) апа Рівпмаїа еї аї., Маї Віоїесппої! 14 (7): 845-851 (1996), котрі повністю включено шляхом посилання).

В загалі, ці миші включають принаймні одну ОМА, що містить трансген з принаймні одного локусу імуноглобуліну людини, що функціонально перебудований, чи такий, що може бути підданий функціонаній перебудові. Ендогенні локуси імуноглобуліну в таких мишей можуть бути подрібнені чи видалені для того, щоб пригнітити здатність тварини виробляти антитіла, кодовані ендогенними генами.

Скринінг антитіл на специфічність зв'язування з подібними протеїнами чи фрагментами може бути просто проведений за допомогою дисплейних пептидних бібліотек. Цей метод включає скринінг великих колекцій пептидів для виявлення окремих, які мають потрібні функції чи властивості. Скринінг антитіл в пептичних дисплейних бібліотеках є дуже відомим в практиці. Дисплейні пептидні послідовності можуть мати довжину від З до 5000 чи більше амінокислот, найчастіше довжина становить 5-100 амінокислот, та ще частіше від 8 до 25 амінокислот. На додаток до способів генерування пептидних бібліотек прямим хімічним синтезом, описано декілька методів рекомбінантної ОМА.

Один тип включає відображення пептидної послідовності на поверхні бактеріофагу чи клітини. Кожний бактеріофаг чи клітина містить нуклеотидну послідовність, що кодує, зокрема дисплейну пептидну послідовність. Такий метод описано в |РСТ Раїепі Рибіїсайоп Мо5 91/17271, 91/18980, 91/19818, та 93/08278). Інші системи генерування бібліотек пептидів мають риси як хімічного синтезу іп міго так і рекомбінантних методів. Див. РСТ Раїепі Рибіїсайоп Мо5. 92/05258, 92/14843, та 96/19256. Див. також, 0. 5.

Раїепі Мов. 5,658,754; апа 5,643,768)|. Пептидні дисплейні бібліотеки, вектори та скринінгові набори комерційно доступні у таких поставників як: Ппмігодеп (Сагізрайд, СА), апа Сатьгідде Антироду Тесппоіодіе5 (Сатрьгіддезпіге, ОК). Зеє, напр., Ш. 5. Раї. Мо5. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, виданих на Еплоп; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, виданих на Оуах, 5427908, 5580717, виданих на АПйутах; 5885793, виданих на Сатюрюгідде антироду

ТесппоІодіе5; 5750373, виданих на Сепепіесп, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, виданих на Хота, Соїїїдап, зирга; А!,зибеї, зирга; ог затрьгоок, зирга. Кожний з перерахованих патентів та публікацій включено повністю шляхом посилання).

Антитіла даного винаходу можуть також бути вироблені з використанням принаймні однієї нуклеїнової кислоти, що кодує анти-1Ї-12 антитіло для створення трансгенних тварин чи ссавців таких як козлів, корів, коней, овець, та подібних, для вироблення таких антитіл в їхньому молоці. Такі тварини можуть бути створені з використанням відомих методів. |Див. напр., але не обмежуючись цими, О5 раїепі пов. 5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362; 5,304,489, та подібними, кожне з яких повністю включено шляхом посилання).

Антитіла даного винаходу додатково можуть бути вироблені з використанням принаймні однієї нуклеїнової кислоти, що кодує анти-1ІЇ-12 антитіло для створення трансгенних рослин та культивованих рослинних клітин (напр., але не обмежуючись ними, тютюн, кукурудза) котрі продукують такі антитіла, зазначені частини чи варіанти в частинах рослин чи в клітинах культивованих з них. Як не обмежуючий приклад, трансгенние листя тютюну, які експресує рекомбінантні протеїни було успішно застосовано для створення великої кількості рекомбінантних протеїнів, напр., з використанням індуцибельного промотору.

Див. напр., Статег еї аї., Сигг. Тор. Місгорої. Іттипої. 240: 95-118 (1999) та посилання, цитовані в ній).

Також, трансгенна кукурудза була використана для експресування протеїнів ссавців в комерційних кількостях, та з біологічними властивостями еквівалентними до таких, що продуковані в інших рекомбінантних системах чи виділені з природних джерел. |Див. напр., Носа еї а!., Аду. Ехр. Мед. Віо!. 464: 127-147 (1999) та цитовані там посилання), антитіла також були вироблені у великих кількостях з насіння трансгенних рослин, включаючи фрагменти антитіл, такі як одноланцюгове антитіло (5СЕУ5), включаючи насіння тютюну та коренеплоди картоплі. (Див. напр., Сопгай еї аї., Ріапі Мої. Віої. 38: 101- 109 (1998) та цитовані там посилання|. Таким чином, антитіла даного винаходу також можуть бути вироблені з використання трансгенних, відповідно до відомих способів. Див. також, напр., Різспег еї а!., Віоїтесппої. Аррі.

Віоспет. 30: 99-108 (Осі., 1999), Ма еї аї., Тгепаз Віотеснпої. 13: 522-7 (1995); Ма еї аї., Ріапі Рпузіо!. 109: 341-6 (1995); М/піеЇіат еї аї!., Віоспет. бос. Тгапв.22: 940-944 (1994); та посилання в них). Також загальні для експресії антитіл у рослин, але не обмежуючись цим. Кожні з приведених вище посилань повністю включено шляхом посилання.

Антитіла винаходу можуть зв'язувати анти-І.-12 людини з широким спектром афінності (Ко). У переважному втіленні принаймні одне тАр людини може зв'язувати І/-12 людини з високою афінністю.

Наприклад, тАб людини може зв'язувати 1-12 з Ко рівним чи менше ніж 1077М, так само як, але не обмежуючись цим, 0.1-9.9 (чи інше значення чи діапазон з) Х 1077, 1098, 1079, 1079, 1071, 1072, 1073 чи інше значення чи діапазон з них.

Афінність чи авидність антитіла до антигену може бути визначена експериментально з використанням відповідного методу, |див. напр., Веггої5Кку, еї аї., "Антироду-Антидеп Іпіегасіпе", по Еипдатепіаї

Іттипоіоду, Раш, М. Е., Еа., Намеп Ргев55: Мем/ МоїКк, МУ (1984); Кибу, дапіз Іттипоіоду, МУ. Н. Егеетап апа

Сотрапу: Мем Моїк, МУ (1992); та способи приведені тут). Значення афінності, окремих взаємодій антитіло- антиген можуть змінюватися в залежності від різних умов визначення (напр., концентрації солей, рН). Таким чином, визначення афінності та інших параметрів зв'язування антигену (напр., Ко, Ка, Ка) переважно виконують із стандартизованими розчинами антигену та антитіла, стандартизованим буфером, таким як буфер описаний тут.

Молекули нуклеїнової кислоти

За допомогою інформації наведеної тут, такої як нуклеотидна послідовність, що кодує принаймні 70- 10095 безперервних амінокислот принаймні однієї з ЗЕО ІО МОБ: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, специфічних фрагментів, варіантів чи консенсусних їх послідовностей, депонованих векторів, які містять принаймні одну з цих послідовностей, молекулу нуклеїнової кислоти даного винаходу та принаймні одне антитіло анти-1І-12 можуть бути одержані за допомогою методів описаних тут чи відомих з рівня техніки.

Молекули нуклеїнової кислоти даного винаходу можуть бути у вигляді ЕМА, таких як теМА, ппеМА,

ІВЕМА чи будь-яких інших форм, чи у вигляді ОМА, включаючи але не обмежуючсь, СОМА та геномної ОМА, одержаної клонуванням чи синтетично, чи будь-яких їх комбінацій. ОМА може бути триланцюгова, дволанцюгова чи будь-які їх комбінації. Будь-яка частина принаймні одного ланцюга ОМА чи РМАможе біти кодуючим ланцюгом, також відомим як смислова послідовність, чи може бути некодуючим ланцюгом, також відомим як антисмислова послідовність.

Виділені молекули нуклеїнової кислоти даного винаходу можуть включити молекули нуклеїнової кислоти які мають одну відкриту рамку зчитування (ОРЕ), необов'язково з одним чи більше інтронів, напр., але не обмежуючись до, принаймні одна зазначена частина принаймні однієї СОР, як СОК1, СОБКО та/або

СОКЗ, принаймні одного важкого ланцюга (напр., ЗЕО ІЮ МОБ: 1-3) чи легкого ланцюга (напр., ЗЕО ІЮ МОБ: 4-6); та молекули нуклеїнової кислоти, котрі містять нуклеотидну послідовність значно відмінну від такої, що наведена, але котра завдяки виродженості генетичного коду, все ще може кодувати принаймні одне анти-

І/--12 антитіло, як показано тут чи відомо з рівня техніки. Звичайно, генетичний код є дуже відомим на практиці. Таким чином, для обізнаного в даній галузі було б лише механічною процедурою створити такі вироджені варіанти нуклеїнової кислоти, що кодують специфічні анти-1І-12 антитіла. (Див. напр., А!изибреї, еї а!., зиргаї, і такі варіанти нуклеїнової кислоти також включено до даного винаходу. Необмужуючі приклади виділених молекул нуклеїнової кислоти даного винаходу включають ЗЕО ІЮ МОБ: 10-15, і відносяться до не обмежуючих прикладів нуклеїнової кислоти, яка кодує, відповідно НС СОК1, НС СОК2, НС СО3, 1 С СОМ1.

Го сОок2, 1 С СОМ, НС варіабельний регіон І С варіабельний регіон.

З іншого боку, винахід пропонує виділені молекули нуклеїнової кислоти, які кодують а(п) анти-1(--12 антитіло, що має амінокислотну послідовність, що кодується нуклетовою кислотою, яка міститься в плазміді, за депонованій як зазначене ім'я клону та АТОС Оерозії Мо5. відповідно, задепоновані в .

Як вказано тут, молекули нуклеїнової кислоти даного винаходу, котрі містять нуклеїнову кислоту, що кодує анти-І--12 антитіла можуть включати, але не обмежуються цим, таку кодуючу амінокислотну послідовність фрагменту антитіла, саму себе; кодуючу послідовність для повного антитіла частина її; кодуюча послідовність антитіла, фрагмент чи частина, так само як додаткові послідовності, так як і кодуюча послідовність принаймні одного сигнального лідерного чи злитого пептиду, з чи без вищезгаданої додаткової кодуючої послідовності, такий як, принаймні один інтрон разом із додатковою, некодуючою послідовністю, включаючи але не обмежуючи до, некодуючі 5' та 3' послідовності, такі як транскрибовані, не трансльовані послідовності, котрі грають роль в транскрипції, процесингу теМА, включаючи сплайсинг та сигнали поліаденілування (наприклад - зв'язування рибосоми та стабільність ТЕМА); додаткова кодуюча послідовність, що кодує додадкові амінокислоти, такі як ті, що надають додаткові функціональні характеристики. Таким чином, послідовність що кодує антитіло може бути злита з маркерною послідовністю, так як послідовність, що кодує пептид, котрий полегшує очищення злитого антитіла, що включає фрагменти чи частину.

Полінуклеотиди, котрі вибірково гібридизуються з полінуклеотидом, описаним тут

Даний винахід пропонує виділені нуклеїнові кислоти, котрі гібридизуються за певних умов гібридизації з нуклеотидом описаним тут. Отже, полінуклеотиди даної реалізації можуть використовуватися для виділення, визначення та/або підрахунку кількості нуклеїнової кислоти, яка містить такі полінуклеотиди.

Наприклад, полінуклеотиди даного винаходу можуть використовуватися для ідентифікації, виділення чи ампліфікації часткових чи повних клонів в депозитній бібліотеці. В деяких реалізаціях, полінуклеотиди є геномними чи виділеної послідовності СОМА, чи комплементарними до СОМА з бібліотеки нуклеїнових кислот людини чи ссавців.

Переважно, бібліотека СОМА містить принаймні 8095 повних послідовностей, переважно принаймні 8590 чи 9095 послідовностей повної довжини, більш переважно принаймні 9595 повних послідовностей.

Бібліотеки СОМА можуть бути нормалізовані для збільшення присутності послідовностей, що рідко зустрічаються. Низькі чи посередні умови жорсткості гібридизації є типовими, але не виключними, та застосовуються при послідовностях з низхькою схожістю до комплементарних послідовностей. Помірні чи жорсткі умови можуть, іноді, застосовуватися для послідовностей з більшою схожістю.

Умови низької жорсткості забезпечують селективну гібридизацію послідовностей із 7095-ю ідентичністю послідовностей та можуть застосуватися для ідентифікації ортологічних чи паралогічних послідовностей.

Необов'язково, полінуклеотиди даного винаходу будуть кодувати принаймні частину антитіла, кодованого полінуклеотидами описаними тут. Полінуклеотиди даного винаходу охоплюють послідовності нуклеїнової кислоти, котрі можуть бути використані для селективної гібридизації з полінуклеотидом, що кодує антитіло даного винаходу. (Див. напр., А!изибеї, зирга; Соїїїдап, зирга, які повністю включено шляхом посилання).

Конструювання нуклеїнових кислот

Виділені нуклеїнові кислоти даного винаходу можуть бути виготовлені з використанням (а) рекомбінантних методів, (б) синтетичних методів, (с) методів очищення, чи їх комбінацій, які відомо з рівня техніки.

Нуклеїнові кислоти можуть включати послідовності на додаток до полінуклеотиду даного винаходу.

Наприклад, мультиклонований сайт, який включає один або більше сайтів рестрикції ендонуклеази, може бути вставлений в нуклеїнову кислоту, для полегшення виділення полінуклеотиду.

Також, послідовності здатні до трансляції можуть бути введені для полегшення виділення полінуклеотиду даного винаходу. Наприклад, гексагістидинова маркерна послідовність забезпечує прийнятний спосіб для очищення протеїнів даного винаходу. Нуклеїнова кислота даного винаходу, крім кодуючої послідовності - необов'язково є вектором, адаптером чи лінкером для клонування та/або експресії полінуклеотиду даного винаходу.

Додаткові послідовності можуть бути додані до такого клонування та/або експресії послідовностей для оптимізації їхньої функції при клонуванні та/або експресії, для полегшення виділення полінуклеотиду, чи покращення введення поінуклеотиду в клітину. Використання векторів клонування, експресивних векторів, адаптерів та лінкерів добре відоме з практики. (див. напр., Ац,изибеї, зирга; ог Затьгоок, зирга)|.

Рекомбінантні методи конструювання нуклеїнових кислот

Композиції виділених нуклеїнових кислот даного винаходу, такі як ЕММА, СОМА, геномна ОМА чи будь-яка їх комбінація, можуть бути одержана з біологічних джерел з використанням багатьох методик клонування, відомих спеціалістом в даній галузі У деяких втіленнях, олігонуклеотидні зразки, які вибірково гібридизуються, за суворих умов, з полінуклеотидами даного винаходу використовуються для ідентифікації бажаної послідовності в бібліотеках ОМА чи геномної СОМА. Виділення ЕМА та конструювання СОМА та геном них бібліотек, є добре відомим для спеціаліста в даній галузі, (див. напр., А,изибеї, зирга; ог Затьгоок, зиргаї.

Скринінг нуклеїнових кислот та методи виділення сОМА чи геномна бібліотека може бути сринінгована з використанням зразку, який базується на послідовності полінуклеотиду даного винаходу, такого як описано тут. Зразки можуть бути використані для гібридизації з геномними послідовностями ОМА та СсОМА для виділення гомологічних генів з того самого чи іншого організму. Спеціалісти в даній галузі оцінять які різноманітні рівні жорсткості гібридизації можуть бути використані при аналізі; також жорсткими можуть бути середовища гібридизації та відмивання. При створенні більш жорстких умов гібридизації, збільшується ступінь компліментарності між зразком та цільовим продуктом для створення дуплексу. Рівень жорсткості може контролюватися одним або більше параметрами, такими як: температура, іонна сила, рН та присутність частково денатуруючого агенту, такого як формамід. Наприклад, жорсткості гібридизації може бути легко змінена зміною полярності реагуючого розчину через, наприклад, маніпулювання концентрацією формаміду в межах від 09о до 50905. Рівень компліментарності (ідентичності послідовності) потрібен для того, щоб зв'язування, яке визначається змінювалося відповідно до жорсткості гібридизаційного середовища та/або середовища для відмивання.

Рівень компліментарності буде оптимальним 10095 чи 70-10095 чи інше значення чи діапазон в цих межах.

Однак, має бути зрозуміло, що варіації дзеркальної послідовності в зразках та праймерах можуть бути компенсовані зниженням жорсткості гібридизаційного середовища та/або середовища для відмивання.

Методи ампліфікації ОМА чи ЕМА є добре відомими для спеціалістів в галузі та можуть бути використані відповідно до даного винаходу без зайвого експериментування, з використанням навчальних засобів та керівництв присутні в них.

Методи ампліфікації ОМА чи ЕМА включають, але не обмежуються цим, реакцію полімеразного ланцюга (РСК) та схожі ампліфікаційні процеси, (див. напр., ШЮ. 5. Раїепі Мо5. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, юю МиїЇїв, еї аї.; 4,795,699 апа 4,921,794 юю Тарбог, еї а1.; 5,142,033 (ю Іппів: 5,122,464 юю М/ізоп, еї аї.; 5,091,310 юю Іппів; 5,066,584 тю СуППепвієп, еї а!ї.; 4,889,818 ю Сейапа, єї а1!.; 4,994,370 о 5іМмег, еї а).; 4,766,067 10 Вібзулаз; 4,656,134 їо Кіпдоїд| та КМА-опосередковані ампліфікації, котрі використовують антисмислові ЕМА до цільової послідовності як шаблон для синтезу дволанцюгової ОМА (ШО. 5. Раїепі Мо. 5,130,238 о Маїек, еї аї., із комерційною назвою МАЗВАЇ, повний зміст котрого повністю включено шляхом посилання (Див. напр., А!,5ибеї, зирга; ог затогоок, зирга|. Наприклад, технологія реакції полімеразного ланцюга (РСЕ) може бути використана для ампліфікації послідовностей полінуклеотидів даного винаходу та подібних генів прямо з геномної ОМА чи СОМА бібліотеки. РСЕ та інші методи ампліфікації іп міго можуть бути корисні, наприклад, для клонування послідовностей нуклеїнових кислот, які кодують протеїни, які будуть експресовані, для того, щоб створити нуклеїнові кислоти для їх використання як зразків для визначення присутності бажаної теМА в зразку, для секвенування нуклеїнових кислот, чи для інших потреб. Приклади способів, достатніх для осіб, обізнаних в методах ампліфікації іп мйго знаходяться в

ІВегдег, зирга, затргоок, зирга, та А!зибеї, зирга, так само як і в Миїйї5, еї аІ., ШЮ. 5. Раїепі Мо. 4,683,202 (1987); та Іппів, єї аі., РОСА Ргоїосоіз А Сшіде Юю Меїйпод» апа Арріїсайопе, Едз., Асадетіс Ргев5 Іпс., Зап

Оіедо, СА (1990)). Комерційно доступні набори для геномних РСЕК-ампліфікацій відомі. Див. напр.,

Адмапіаде-аС Сепотіс РОСА Кії (Сіопієсп)). Додатково, напр., може біти використаний Т4 ген 32 протеїну (Воепгіпдег Мапппеїт) для покращення виходу продукту довгих РСР продуктів.

Синтетичні методи конструювання нуклеїнових кислот

Виділені нуклеїнові кислоти даного винаходу можуть бути одержані прямим хімічним синтезом за допомогою відомих методів |див., напр., А!,зибеї, еї а!., зирга). Хімічний синтез взагалі дає одноланцюговий олігонуклеотид, котрий може бути перетворений на дволанцюговий ОМА гібридизацією із комплементарною послідовністю чи полімеризацією ЮОМА-полімеразою з використанням одноланцюгової ОМА як шаблону.

Спеціалісти в даній галузі можуть побачити, що тоді як хімічний синтез ОМА може бути обмежений послідовністю близько 100 чи більше основ, довші послідовності можуть бути одержані об'єднуванням коротших послідовностей.

Касети рекомбінантної експресії

Даний винахід також пропонує касети рекомбінантної експресії, які включають нуклеїнові кислоти даного винаходу. Послідовності нуклеїнових кислот даного винаходу, наприклад, ОМА чи геномні послідовності, що кодують антитіла даного винаходу, можуть бути використані для конструювання касет рекомбінантної експресії, які можуть бути введені, принаймні, в одну клітину хазяїна. Касета рекомбінантної експресії буде, як правило, включати полінуклеотид даного винаходу, операбельно зв'язаний з регуляторними послідовностями ініціації транскрипції котрі будуть спрямовувати транскрипцію полінуклеотиду в конкретній клітині-хазяїні. Для прямого експресування нуклеїнових кислот даного винаходу можуть бути застосовані як гетерологічні, так і негетерологічні (напр., ендогенні) промотори.

У деяких втіленнях, виділенні нуклеїнові кислоти можуть слугувати промотором, енхансером, чи інший елемент може бути введений у відповідне місце (вище чи нижче, чи в інтрон) негетерологічної форми полінуклеотиду даного винаходу для підвищення чи зниження експресії полінуклеотиду даного винаходу.

Наприклад, ендогенні промотори можуть бути змінені іп ммо чи іп міго мутаціями, делеціями та/або заміною.

Вектори та клітини-хазяї

Даний винахід також відноситься до векторів, котрі включають виділені нуклеїнові кислоти даного винаходу, генетично сконструйовані клітини-хазяї з рекомбінантними векторами, та продукування принаймні одного анти-І--12 антитіла рекомбінантними методами які відомі з рівня техніки. Див. напр., затюогоок, еї а!., зирга; А!,изибеї, еї а!., зирга, кожний з яких повністю включено шляхом посилання).

Полінуклеотиди можуть, необов'язково, бути введеними в вектор, котрий містить селективний маркер для вирощування в клітині. Взагалі, плаз мідний вектор вводиться в преципітат, такий як преципітат фосфату кальцію, чи в комплекс із зарядженими ліпідами. Якщо вектор є вірусом, він може бути спакований іп міго за допомогою відповідної пакуючої клітинної лінії і потім перенесений в клітину хазяїна.

ОМА-вставка має бути безпосередньо прив'язана до відповідного промотора. Експресій ний конструкт в подальшому буде містити сайти ініціації транскрипції, термінації та, в транскрипційному регіоні, сайт зв'язування рибосоми для трансляції (напр., ШАА, ОСА чи ЦАС) відповідно розташований на кінці трансльованої ткМА, із переважанням ЦАА та АС для експресії еукаріотичних клітин.

Вектори експресії бажано, але не обов'язково будуть включати принаймні один селективний маркер.

Такі маркери включають, напр., але не обмежуючи цим, метотрексат (МТХ), дигідрофолат редуктазу (ОНЕК,

Раї. Мов. 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017|, ампіцилін, неоміцин (5418), мікофенолову кислоту, глютамат синтетазу (5, ИО5 Раї Мо5. 5,122,464; 5,770,359; 5,827,739|, резистентність до культури еукаріотичних клітин, та гени резистентності до тетрацикліну чи ампіциліну для культивування БЕ. соїї та інших бактерій чи прокаріотів (вище приведені патенти повністю включено сюди шляхом посилання). Відповідні культуральні середовища та умови описаних вище клітин-хазяїв добре відомі для спеціалістів в даній галузі.

Прийнятні вектори є очевидними для обізнаних професіоналів. Введення векторного конструкту до клітини хазяїна може бути виконано шляхом трансфекції фосфату кальцію, ОЕАЕ-декстран опосередкованої трансфекції, катіонної ліпід-опосередкованої трансфекції, електропорації, трансдукції, інфекції, чи іншими відомими способами. Такі способи описано в роботах, таких як (Затрбгоок, 5ирга,

Спаріеєгз» 1-4 та 16-18; Аизибреї!. зирга, Спарієгз: 1, 9, 13, 15, 16).

Принаймні одне антитіло даного винаходу може бути експресоване в модифікованій формі, такій як злитий протеїн, та може включати не лише сигнали експресії, але також додатковий гетерологічний функціональний регіон. Наприклад, регіон додаткових амінокислот, зокрема заряджених амінокислот, може бути доданим до М-ткінця антитіла для підвищення стабільності та стійкості в клітині-хазяїні, під час очищення, використання та зберігання.

Також частини пептидів можуть бути додані до антитіл даного винаходу для полегшення очищення. Такі регіони можуть бути видалені перед кінцевим приготуванням антитіла чи принаймні його фрагменту. Такі методи описані в багатьох стандартних лабораторних керівництвах, таких як, |(Затогоок, зирга, Спарієг5 17.29-17.42 та 18.1-18.74; А!,зибеї, зирга, Спаріег» 16, 17 та 181.

Такі пересічні навички в роботі є дуже поширеними в багатьох системах експресії придатних для експресування нуклеїнових кислот, які кодують протеїн даного винаходу.

Інакше, нуклеїнові кислоти даного винаходу можуть бути експресовані включанням (маніпуляцією) в клітині хазяїні, що містить ендогенну ОМА, яка кодує антитіла даного винаходу. Такий метод є добре відомим спеціалістам, напр., як описано в (05 рагепі Мо5. 5,580,734, 5,641,670, 5,33,46, та 5,733,761, які повністю включено шляхом посилання|.

Наочним прикладом клітинних культур, корисних для вироблення антитіл, зазначених частин та їхніх варіантів є клітини ссавців. Клітинна система ссавців часто буває у вигляді моношарів, хоча також використовуються суспензії чи біореактори клітин ссавців. Було розроблено багато ліній клітин-хазяїв, придатних для експресування інтактних глікозильованих протеїнів, включаючи СО5-1 (напр., АТОС СК. 1650), СО5-7 (напр., АТСС СВІ. 1651), НЕК293, ВНК21 (напр., АТСС СА -10), СНО (напр., АТСС СВІ. 1610) та клітинні лінії В5С-1 (напр., АТС СКІ -26), клітини Со5-7, клітини СНО, клітини пер 52, РЗУХбЗА98.653,

ЗР2/О-АдіЯ4, клітини 293, клітини Нега та їм подібні, котрі завжди є в розпорядженні, наприклад в (Атегісап

Туре Сийиге СоПесіоп, Мапавзза5, Ма (млум/.аїсс.ог9)). Переважні клітини-хазяї включають клітини лімфоїдного походження такі, як клітини мієломи та лімфоми. Зокрема переважними клітинами-хазяями є

РЗХбЗАОдВ, клітини 653 (АТСС Ассезвіоп Митбрег СКІ -1580) та клітини 5Р2/0-Аді4 (АТСС Ассезвіоп Митрег

СВІ-1851).

Експресивні вектори цих клітин можуть включати одну чи більше послідовностей управління експресією, таких як, але не обмежуючи до походження реплікації: промотор (напр., пізній чи ранній промотори 5М40, промотор СММ (ОБ Раї. Мо5. 5,168,062; 5,385,839), промотор НЗМ ІК, промотор рак (фосфогліцерат кіназа), арпа промотор ЕБ-1 (ОБ Раї Мо. 5,266,491)|, принаймні один промотор імуноглобуліну людини, енхансер, та/або сайти інформації процесингу, такі як сайти зв'язування рибосоми, сайти сплайсингу КМА, сайти поліаденілування Інапр., ЗМ40 великий Т Ад роїу А додатковий сайті, послідовності термінаторів транскрипції. |Див. А!Єзибреї еї аї., зирга; затюогоок, еї аї., зирга|. Інші клітини придатні для вироблення нуклеїнових кислот та протеїнів даного винаходу є відомими та/або доступними.

Напр., з |Атегісап Туре Сшштге СоПесіп СаїаІодие ої Сеї! Гіпез апа Нурідотав (м/млу.аїсс.ога)| чи інших відомих комерційних джерел.

Коли застосовуються еукаріотичні клітини-хазяї, у вектор звичайно вводяться послідовності поліаденілування чи термінації транскрипції. Прикладом послідовності термінатора є послідовність поліаденілування з бичачого гену гормону росту. Також можуть включатися послідовності для точного сплайсингу транскрипту. Прикладом сплайсингової послідовності є інтрон МР1 з 5М40 ІЗргадие, еї аї.,».

Міго!. 45: 773-781 (1983)). До того ж, для контролю за реплікацією в клітині-хазяїні генетичні послідовності можуть бути включені у вектор, що є добре відомим з рівня техніки.

Очищення антитіл

Антитіла до анти-І/-12 можуть бути одержані з рекомбінантної культури клітин добре відомими методами, але не обмежуючись ними, очищенням протеїну А, преципітацією сульфатом амонію чи етанолом, кислотною екстракцією, аніоно- чи катіонообмінною хроматографією, фосфоцелюлозною хроматографією, гідрофобною інтеракційною хроматографією, афінною хроматографією, гідроксиапатитною хроматографією та пектиновою хроматографією. Також може бути використана високо ефективна рідинна хроматографія (НРІ С") (див. напр., Соїйдап, Сигепі Ргоїосої5 іп Іттипоіоду, або

Сшитепі Ргоїосоїв іп Ргоїєїп бсіепсе, дхопп УМіїєу 5 опе, МУ, ММ, (1997-2001), Спаріег5 1, 4,6, 8, 9, 10, кожен повністю включено шляхом посилання|.

Антитіла даного винаходу звичайно включають очищені продукти, продукти процедури хімічного синтезу, продукти одержані методом рекомбінації з еукаріотичного хазяїна, включаючи, наприклад, клітини дріжджів, вищих рослин, комах та ссавців. Залежно від застосованого хазяїна в процесі рекомбінантного продукування, антитіла даного винаходу можуть бути глікозильовані чи неглікозильованими, з відданням переваги глікозильваним. Такі методи описано в багатьох стандартних лабораторних керівництвах, таких як, (Затргоок, зирга, Зесііоп5 17.37-17.42; Айвибеї, взирга, Спаріеєгз 10, 12, 13, 16, 18 апа 20, Соїїдап, Ргоїєїп

Зсієпсе, зирга, Спарієгв 12-14, котрі повністю включено шляхом посилання).

Анти-1ІІ -2 антитіла

Виділені антитіла даного винаходу включають антитіла, кодовані будь-яким з полінуклеотидів даного винаходу, як буде тут розглянуто більш докладно, чи інше виділене чи приготоване антитіло. Переважно, антитіло людини, чи антиген-зв'язуючий фрагмент, що зв'язує ІЇ/-12 людини, і таким чином, частково чи суттєво нейтралізує принаймні одну з біологічних активностей протеїну. Антитіло чи зазначена його частина чи варіант, котра частково чи, переважно, значною мірою, нейтралізує, принаймні одну біологічну активність принаймні одного протеїну І/-12 чи фрагменту, може зв'язувати протеїн чи фрагмент, і таким чином інгібувати дії, опосередковані зв'язуванням 1-12 з рецептором 1-12 або через інші залежні чи опосередковані 1-12 механізми. Термін "нейтралізуюче антитіло", як воно вживається тут, відноситься до антитіла, котре може інгібувати активність залежну від І--12 до 20-12095, переважно до 10, 20, 30, 40, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 10095, чи більше, в залежності від проби.

Здатність анти-ІЇ/-12 антитіл пригнічувати ІЇ/-12-залежну активність переважно визначалася, принаймні однією прийнятною пробою протеїну чи рецептору 1-12, як описано тут, чи відомо з рівня техніки. Антитіла людини згідно з винаходом можуть належати до будь-якого класу (Ідс, ІДдДА, І9М, ІЧЕ, до, еїс.) чи ізотипу, і можуть включати легкі ланцюги каппа чи лямбда. В одному з втілень, антитіла людини включають важкий ланцюг дб чи визначений фрагмент, наприклад, принаймні один з ізотипів, (951, Ідс2, ДдДОЗ чи ді.

Антитіла цього типу можуть бути виготовлені із застосуванням принаймні одного тарансгену легкого ланцюга людини (напр., дос, ІдДА та І9ДМ (напр., ут, уг, уЗ, у4), як описано тут та/або відомо з рівня техніки. В іншому втіленні, антитіло до ІЇ-12 людини включає важкий ланцюг ІдО1 та легкий ланцюг ІдО1.

Принаймні одне антитіло винаходу, зв'язує принаймні один зазначений епітоп, специфічний до принаймні одного протеїну 1--12, субодиниці, фрагменту, частини чи їх комбінації. Принаймні один епітоп може включати, принаймні один регіон зв'язування антитіла, який включає принаймні частину згаданого протеїну, епітоп котрого, переважно включає принаймні одну екстра целюлярну, розчинну чи цитоплазматичну частину вказаного протеїну. Принаймні один вказаний епітоп може включати будь-яку комбінацію з принаймні одного амінокислотного ланцюга з принаймні 1-3 амінокислот до повної зазначеної частини безперервних амінокислот ЗЕО ІЮ МО:9.

В загальному випадку, антитіло людини чи фрагмент зв'язування антигену даного винаходу буде включати регіон зв'язування антигену, котрий включає принаймні один регіон визначення компліментарності (СОВ1, СОК2 та СОКЗ) чи варіант принаймні одного варіабельного регіону важкого ланцюга, та принаймні один регіон визначення компліментарності (СОК!І, СОМК2 та СОКЗ) чи варіант принаймні одного варіабельного регіону легкого ланцюга. Як не обмежуючий приклад, антитіло чи частина зв'язування антигенучи варіант може включати принаймні один важкий ланцюг СОКЗ, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО:З та або один легкий ланцюг СОКЗ, який має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ

МО:6. В конкретному випадку, антитіло чи антиген-зв'язуючий фрагмент може мати регіон зв'язування антигену, який включає принаймні частину принаймні одного важкого ланцюга СОК (напр., СОКІ, СОМК2 та/або СОКЗ), котра має амінокислотну послідовність, що відповідає СОК -ам 1, 2 та/або З (напр., зЕО ІЮ

МОЗ: 1, 2 та/або 3). В іншому окремому втіленні, антитіло чи антиген-зв'язуюча частина, чи варіант може мати регіон зв'язування антигену, який включає принаймні частину одного легкого ланцюга СОК (напр.,

СОМ, СОК2 та/або СОКЗ) яка має амінокислотну послідовність, що відповідає СОВ-ам 1, 2 та/або З(напр.,

ЗЕО ІО МОЗ: 4. 5. та/або 6). В переважному втіленні три важкі ланцюги СОР -и та три легкі ланцюги СОК-и антитіла чи антиген-зв'язуючого фрагменту мають амінокислотні послідовності, які відповідають СОН, принаймні одного з тАб 12875, С340, чи будь-якому іншому, як описано тут. Такі антитіла можуть бути виготовлені хімічним введенням разом з різними частинами (напр., СОК»5, каркас) антитіл з використанням загальноприйнятих методик, виготовленням чи експресією (напр., однієї чи більше) молекул нуклеїнової кислоти, котра кодує антитіла з використанням загально відомих методик технологій рекомбінантних ОМА чи з використанням будь-якого іншого придатного методу.

Анти-1І-12 антитіла можуть включати принаймні один легкий чи важкий ланцюг варіабельного регіону визначеної амінокислотної послідовності. Наприклад, в переважній реалізації, анти-І/-12 антитіла включають принаймні одне з принаймні один варіабельний регіон важкого ланцюга, який необов'язково має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:7 та/або принаймні один варіабельний регіон легкого ланцюга, який необов'язково має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:8. Антитіла, котрі можуть зв'язувати 1-12 людини, та включають визначені варіабельні регіони важкого та легкого ланцюгів можуть бути виготовлені придатними методами, такими як фаговий дисплей (Каїзире, У., еї а)ї., Іпї УМої. Меа, 1 (5): 863-868 (1998)| чи методами, які використовують трансгенних тварин, як відомо з рівня техніки та/або описано тут. Наприклад, трансгенна миша, яка має функціонально перебудований трансген важкого ланцюга імуноглобуліну людини та трансген, який містить ОМА з локусу легкого ланцюга імуноглобуліну людини, котрий було піддано функціональній перебудові, може бути імунізована І/-12 людини чи його фрагментом для викликання вироблення антитіл. При потребі, клітини, що продукують антитіла, можуть бути виділені й гібридоми чи можуть бути виготовлені інші іморталізовані клітини, що продукують антитіла, як описано тут та/або відомо з рівня техніки.

Як альтернатива, можуть бути експресовані антитіла, за допомогою кодуючих нуклеїнових кислот чи їх частин в придатній клітині хазяїні.

Винахід, також стосується антитіл, антиген-зв'язуючих фрагментів, імуноглобулінових ланцюгів та СОВ- ів, котрі містять амінокислоти в послідовності, котра, значно схожа на амінокислотну послідовність, описану тут. Переважно, такі антитіла чи фрагменти зв'язування антигену та антитіла, котрі включають такі ланцюги чи СОВ-и, можуть зв'язувати 1-12 людини з високою афінністю (напр., Ко менше чи дорівнює приблизно 10:

ЗМ). Амінокислотні послідовності, котрі значно схожі на послідовність, описану тут, включають послідовності, які мають замінені консервативні амінокислоти, так само як делеції та/або інерції амінокислот. Заміна консервативної амінокислоти відноситься до такої заміни однієї амінокислоти другою, котра має хімічні та/або фізичні властивості (такі як, заряд, структура, полярність, гідрофобність/гідрофільність) схожі до таких у першої амінокислоти. Консервативні заміщення включають заміну однієї кислоти іншою в межах таких груп: лізин (К), аргінін (К) та гістидин (Н); аспартат (0) та глютамат (Е); аспарагін (М), глютамін (0), серин (5), треонін (Т), тирозин (ХУ). К, К, Н, О та Е; аланін (А), валін (М), лейцин (У), ізолейцин (І), пролін (Р), фенілаланін (Р), триптофан (М/), метионін (М), цистеїн (С) та гліцин (С); Е, УМ та М; С, 5 та Т.

Амінокислотні коди

Амінокислоти, що складають анти-1ІЇ-12 антитіла даного винаходу зазвичай скорочують. Позначення амінокислот можуть бути проставлені однолітерним кодом амінокислот, трилітерним кодом амінокислот чи тринуклеотидним кодоном(и) як це добре відомо з літератури (див. Аїрегів, В., еї аІ., Моїесшаг Віоіоду ої Тпе

Сеї, Тпіга Ед., Сапапа Рибіїзпіпо, Іпс., Мем Могк, 1994): 07777771 ТФАбр,///////// |Аврайс// |бАСсАС/С/С/С/:///:/:/С:(/4ШСУС- 77777777 не 7 |івоєнсіпе,д/ ФАСАД АОС, АОЮЇГСГС/7777777777772С мМ 77777777 |Ммеє////////// |Мешоппе// АВ С////:////::ОЕ.С:( АИ СГЦ

Р 77777771 Ф|Рю ////////////////// |Рюїле //// |ССАСоСсосссЙ42222г2ш9 о 77777777 (б |Сішатпе // |СААДСАСС//////7///77/7//:/:У/)?-

А 77777770 |Аю //////// |Аюїпйне / |АСА Або СоАСоС,Сос,соОсССш9

Анти-1ІІ-12 антитіла даного винаходу можуть включати одну чи більше амінокислотних замін, делецій чи вставок, як природніх мутацій так і маніпульованих людиною, як зазначено тут.

Звісно, що багато амінокислотних замін кваліфікована особа в даній галузі може зробити залежно від багатьох факторів, включаючи вище описані. Взагалі говорячи, кількість амінокислотних замін, вставок та делецій для будь-якого даного протеїну, фрагменту чи його варіанту, що походить від анти-1Ї -12 Ід, не може бути більшою за 40, 30, 20, 19, 18.17, 16, 15, 14, 13, 12,11.10,9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, так як і 1-30 чи значення в їх межах, як тут зазначено.

Амінокислоти в анти-ІЇ-12 антитілі даного винаходу, котрі є основними для функції, можуть бути визначені добре відомими з рівня техніки методами, такими як сайт-спрямованим мутагенезом чи аланін- скануючим мутагенезом (Інапр., А!,зибреї, зирга, Спарієїв 8, 15; Сиппіпойат апа Му/єїї5, Зсіеєпсе 244: 1081- 1085 (1989)Ї. Подальша процедура призводить до поодиноких аланінових мутацій в кожному залишку молекули. Одержані мутантні молекули потім перевіряються на біологічну активність, таку як, але не обмежену до, принаймні однієї дії нейтралізації І--12. Сайти, які є критичними для зв'язування антитіла, також можуть бути виявлені структурним аналізом, таким як кристалізація, ядерний магнітний резонанс чи фотоафінне мічення (Зтій, еї аї., У. Мої. Віо!. 224: 899-904 (1992) апа де Мов, єї аї., Зсієпсе 255: 306-312 (1992)).

Анти-І/-12 антитіла даного винаходу можуть включати, не обмежуючи до, принаймні одну частину, послідовність чи комбінацію від 5 до всіх безперервних амінокислот принаймні однієї з ЗЕО ІЮ МОБ: 1, 2, 3, 4,5, 6.

І/-12 антитіла чи зазначені частини чи варіанти даного винаходу можуть включати, але не обмежуючись до, принаймні одну частину, послідовністі чи комбінації вибраних з 3-5 безперервних амінокислот з ЗЕО ІЮО МО: 1, 5-17 безперервних амінокислот ЗЕО ІЮ МО: 2, 5-10 безперервних амінокислот з 5ЕО ІЮ МО: 3, 5-11 безперервних амінокислот з ЗЕО ІО МО: 4, 5-7 безперервних амінокислот з БЕО ІЮ

МО: 5; 5-9 безперервних амінокислот з ЗЕО ІО МО: 6; І ец21, І уз76, Меї83, 5ег85 з ЗЕО ІЮ МО: 7.

Анти-1/-12 антитіла також необов'язково можуть включати поліпептид з принаймні 70-10090 з 5, 17, 10, 11, 7, 9, 119, чи 108 безперервних амінокислот, принаймні однієї з ЗЕО ІЮ МОБ: 1,2, 3,4, 5,6, 7 чи 8.

В одній з реалізацій, амінокислотна послідовність ланцюга імуноглобуліну, чи його частини (напр., варіабельний регіон, СОК) має приблизно 70-10095 подібності (напр., 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 чи будь-який їх діапазон чи значення) до амінокислотної послідовності, відповідного ланцюга з принаймні одного з ЗЕО ІЮО МОБ: 7, 8.

Наприклад, амінокислотна послідовність варіабельного регіону легсого ланцюга може бути порівняна з послідовністю ЗЕО ІО МО: 8, чи амінокислотна послідовність важкого ланцюгу СОКЗ може бути порівняна з 5ЕО ІЮО МО: 3. Переважно, 70-10095 подібності до амінокислот (напр., 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 чи будь-який їх діапазон чи значення) визначено за допомогою добре відомого на практиці комп'ютерного алгоритму.

Зразкові послідовності варіабельного регіону легкого та важкого ланцюгів представлені в 5ЕО ГО МО5: 7 апа 8. Антитіла даного винаходу, чи зазначені їх варіанти, можуть включати будь-яку кількість безперервних амінокислотних залишків з антитіла даного винаходу, де це число вибрано з групи цілих значень, які знаходяться в межах 10-10095 від кількості безперервних залишків з анти-1ІЇ-12 антитіл.

Необов'язково, підпослідовність неперервних амінокислот має довжину принаймні приблизно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 чи більше амінокислот, чи будь-який інтервал чи значення з них. Також, кількість таких підпослідовностей може бути будь-яким цілим числом, вибраним з групи від 1 до 20, таким як, принаймні 2, 3, 4, чи 5.

Спеціалістам у даній галузі зрозуміло, що даний винахід включає принаймні одне біологічно активне антитіло даного винаходу. Біологічно активні антитіла мають специфічну дію, принаймні, 2095, 3095, чи 4095, та переважно, принаймні, 5095, 6095, чи 7095, та більш переважно, принаймні, 80905, 9095, чи 9595-100092 активності природних (несинтетичних), ендогенних чи подібних та відомих антитіл. Методи визначення та підрахунку ферментативної активності та специфічності до субстрату є добре відомими спеціалістам у даній галузі.

В іншому аспекті, винахід відноситься до антитіл людини та антиген зв'язуючих фрагментів, як описано тут, які модифіковані ковалентним приєднанням органічної частини. Така модифікація може давати антитіла чи антиген зв'язуючий фрагмент із поліпшеними фармакокінетичними показниками (такими як, збільшений періодом напіврозпаду сироватки іп мімо). Органічна частина може бути лінійною чи розгалуженою гідрофільною полімерною групою, групою жирної кислоти, чи групою естеру жирної кислоти.

В окремому випадку даного винаходу, гідрофільна полімерна група може мати молекулярну масу від приблизно 800 до приблизно 120,000Да та може бути поліалкановим гліколем (таким як, поліетиленгліколь (РЕС), поліпропіленгліколь (РЕСб)), вуглеводним полімером, амінокислотним полімером чи полівінілпіролідоном, та жирнокислотна група чи естерна жирно кислотна група може містити від восьми до чотирнадцяти атомів вуглецю.

Модифіковані антитіла та антиген зв'язуючі фрагменти винаходу можуть містити одну або більше органічних часток які є прямо чи непрямо ковалентно зв'язаними з антитілом. Кожна органічна частка, зв'язана з антитілом чи антиген зв'язуючим фрагментом винаходу може незалежно бути гідрофільною полімерною групою, жирнокислотною групою чи естерною жирнокислотною групою. Як використано тут, термін "жирна кислота" охоплює монокарбоксильні та дикарбоксильні кислоти. Термін "гідрофільна полімерна група", як вжито тут, відноситься до органічних полімерів, котрі більш розчинні в воді ніж октан.

Наприклад, полілізин є більш розчинним у ваді ніж октан. Таким чином, антитіла, модифіковані ковалентним приєднанням полілізину охоплені винаходом. Гідрофільні полімери, прийнятні для модифікування антитіл винаходу можуть бути лінійні чи розгалужені та включати, наприклад, поліалканові гліколі (такі як, РЕС, монометоксиполіетиленгліколь (пРЕС), РРО та подібні), вуглеводи (такі як, декстрин, целюлоза, олігосахариди, полісахариди та подібні), поліалканові оксиди (такі як, поліетиленоксид, поліпропілен оксид та подібні) та полівінілпіролідон. Переважно, гідрофільний полімер, котрий модифікує антитіло винаходу має молекулярну вагу від приблизно 800 до приблизно 150,000Да, як окрема молекулярна одиниця.

Наприклад, може бути використаний РЕСвооо та РЕСгоооо, де нижній індекс вказує на середню молекулярну вагу полімеру в дальтонах. Гідрофільна полімерна група може бути заміщена від одного до шести алкілів, жирнокислотною чи естерною жирнокислотною групами.

Гідрофільні полімери, заміщені жирними кислотами чи естерами жирних кислот можуть бути одержані прийнятними способами. Наприклад, полімер, котрий включає аміногрупу може бути приєднаний до карбоксилату жирної кислоти чи естеру жирної кислоти, та активований карбоксилат (такий як, активований

М,М-карбонілдиіїімідоазолем) на жирній кислоті чи естері жирної кислоти може бути приєднаний до гідроксильної групи на полімері.

Жирні кислоти та естери жирних кислот, придатні для модифікування антитіл винаходу можуть бути насиченими чи мати одну чи більше одиниць ненесиченості. Жирні кислоти, придатні для модифікування антитіл винаходу, включають, наприклад, п-додеканоат (Сіг2, лаурат), п-тетрадеканоат (Ста, мирістат), п- октадеконоат (Сів, стеарат), п-еікозаноат (Сго, арахідат) п-докозаноат (Сгг, бегенат), п-триаконтаноат (Сзо), п-тетраконтаноат (Сло), цис-лУ9-октадеканоат (Стів, олеат), усі цис-АБ5,8,11,14-еікозатетраеноати (Сго, арахідонат), октандіонову кислоту, тетрадекандіонову кислоту, актандіонову кислоту, докозандіонова кислота та подібні.

Придатні естери жирних кислот включають моноестери дикарбонових кислот, які мають лінійну чи розгалужену нижню алкильну групу. Нижня алкильна група може мати від одного до дванадцяти, переважно, від одного до шести, атомів вуглецю.

Модифіковані антитіла людини та антиген зв'язуючі фрагменти можуть бути одержані з використанням придатних методів, таких як реакцією з одним чи більше модифікуючих агентів. Термін "модифікуючий агент", використовується тут, по відношенню до придатних органічних груп (таких як, гідрофільний полімер, жирна кислота чи естер жирної кислоти) котрі мають активуючі групи. Термін "активуюча група" є хімічною одиницею чи функціональною групою, котра може, за відповідних умов, реагувати з другою хімічною групою, утворюючи, таким чином, ковалентний зв'язок між модифікуючим агентом та другою хімічною групою. Наприклад, аменореактивна активуюча група включає електорофільні групи такі як, тозилат,

мезилат, гало (хлоро, бромо, фторо, йодо), М-гідроксисукцинімідил естери (МН), та подібні. Активуючі групи можуть реагувати з тіолами, включаючи, наприклад, малеімідин, йодоацетил, акрололіл, піридин дисульфіди, тиол 5-тиол-2-нітробензойної кислоти (ТМВ-тиол) та подібні. Альдегідна функціональна група може бути приєднана до молекули, що містить амін- чи гідразид, та азидна група може реагувати з тривалентною фосфорною групою, утворюючи фосфоамідат чи фосфоїімідний зв'язки. Придатні способи введення груп в молекули відомі з рівня техніки (див., наприклад, Нептапзоп, 0. Т., Віосопішдаїе

Тесппіднез, Асадетіс Ргев5: Зап Оієдо, СА (1996)). Активуючі групи можуть бути зв'язані безпосередньо до органічних груп (таких як, гідрофільні полімери, жирні кислоти та естери жирних кислот), чи через лінкерні частки, наприклад, двовалентну Сі1-Сі2 групу в якій один чи більше атомів вуглецю можуть бути заміщені на гетероатом, такий як кисень, азот чи сірку. Придатні лінкерні частки включають, наприклад, тетраетиленгліколь, -(СНг)з-, /-МН-(СНг)в-МН-, /-(СНг)»-МН- та /-СН2-О-СНо-СНг-0О-СН2-СНг2-0О-СН-МН-.

Модифікуючі агенти, які мають лінкерні частки можуть бути одержані, наприклад, реагуванням моно-Вос- алкілдиамінів (таких як, моно-Вос-етилендиамін, моно-Вос-диаміногексан) із жирною кислотою в присутності 1-етил-3-(З-диметиламінопропил)-карбодиіміду (ЕОС), утворюючи амідний зв'язок між вільним аміном та карбоксилатом жирної кислоти. Захисна група Вос може бути видалена з продукту обробленням три хлороцтовою кислотою (ТЕА), для того, щоб відкрити первинний амін, котрий може бути приєднаний до іншого карбоксилату, як показано, чи може взаємодіяти з малеїновим ангідридом, та циклізацією отриманого продукту для одержання активованого малеїмідного похідного жирної кислоти Ідив., наприклад,

Тпотрзоп, еї аіІ., УМО 92/16221, повний зміст якого повністю включено сюди шляхом цитування|.

Модифіковані антитіла винаходу можуть бути одержані взаємодією антитіла людини чи антиген зв'язуючого фрагменту з модифікуючим агентом. Наприклад, органічна частка може бути приєднана до антитіла, несайт-специфічрим чином з використанням амінорективного модифікуючого агенту, наприклад,

МН5 естер РЕб.

Модифіковані антитіла людини чи антиген-зв'язуючі фрагменти можуть, також, бути одержані відновленням дисульфідних зв'язків (таких як, міжланцюгові дисульфідні зв'язки) антитіл чи антиген- зв'язуючих фрагментів. Відновлені антитіла чи антиген-зв'язуючі фрагменти, потім можуть реагувати з тиол- реагуючим модифікуючим фрагментом для одержання модифікованих антитіл винаходу. Модифіковані антитіла людини та/чи антиген-зв'язуючі фрагменти, які містять органічні частки, котрі специфічно зв'язуються з сайтами антитіла даного винаходу, можуть бути отримані використанням придатних методів, таких як реверс ний протеолізи |Різсп еї аї., Віосопісдагє Спеепі., 3: 147-153 (1992); Мепеп еї аї.,

Віосопішдаїе Спет., 5: 411-417 (1994); Китагап еї аї., Ргоїєїп 5сі. 6 (10): 2233-2241 (1997); НП еї а)., Вісага.

Спет., 24 (1): 59-68 (1996); Сарейаз еї аї., Віоїесппої. Віоепад., 56 (4): 456-463 (1997)), та методами описаними в |Негтапзоп, 0. Т. Віосопіцдаге Тесппідне5, Асадетіс Рге55: зап Оіедо, СА (1996).

Похідні протеїнові композиції антиідіотипічних анти-і! 2 |з антитіл

На додаток до моноклональних чи химерних анти-1І-12 антитіл, даний винахід також спрямований на антиідіотипічні (анти-Іа) антитіла, специфічні до таких антитіл винаходу. Анти-|Іа антитіла є антитілами, котрі розпізнають унікальні детермінанти звичайно пов'язані з регіоном зв'язування антигену іншого антитіла.

Анти-іа можуть бути одержані імунізацією тварин того ж виду та генетичного типу (такихяк, мишачі лінії) так як і джерело Ід-антитіл чи його регіон, який СОК. Імунізовані тварини будуть розпізнавати та відповідати на ідиотипічні детермінанти імунізуючих антитіл та виробляти анти-ій антитіла.

Похідні протеїнові композиції анти-1Ї -2 ІЗ

Даний винахід також пропонує принаймні одну композицію анти-1Ї-12 антитіл, котра містить принаймні одне, принаймні два, принаймні три, принаймні чотири, принаймні п'ять, принаймні шість чи більше анти-І-- 12 його антитіл, як показано тут та/або відомо з рівня техніки, котрі представлені у вигляді композиції, суміші чи у формі, що не зустрічається в природі. Такі композиції включають, принаймні, композиції, що не зустрічаються в природі, включаючи, принаймні, одну чи дві амінокислотні послідовності анти-1І-12 антитіла повної довжини, варіанти, домени, фрагменти чи зазначені варіанти позбавлені С- та/або М-термінальної послідовності, вибрані з групи, що містить 70-10095 від повних амінокислотних послідовностей з 5ЕО ІЮ

МОБ: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 чи 8 чи зазначених, фрагментів, доменів чи їх варіантів. Переважні композиції похідних анти-1ІЇ--12 протеїнів, фрагментів чи варіантів, включають принаймні одну чи дві повної довжини, фрагмент чи варіант частини послідовності анти-1І -12 антитіла, що містить СОР, 70-10095 5ЕО ІЮ МОБ: 1, 2,

З, 4, 5, 6, чи зазначений фрагмент, домен чи їх варіант. Така композиція може мати процентний склад по масі, об'єму, концентрації, полярності чи моляльності як на рідкий так і на сухий розчин, суміш. Суспензію, емульсію чи колоїд, як відомо з рівня техніки чи описано тут.

Композиції анти-ІЇ/-12 антитіл даного винаходу також можуть включати принаймні одну з будь-яких придатних та ефективних кількостей композиції чи фармацевтичної композиції, що включає принаймні одне анти-1--12 антитіло в клітині, тканині, органі, тварині чи пацієнті за потреби в модуляції, лікуванні чи терапії, яка необов'язково включає принаймні один ТМЕ-антагоніст (такий як, яле не обмежуючи ним, ТМЕ- антитіло, чи фрагмент, розчинний ТМЕ-рецептор чи фрагмент, злитий його протеїн чи мала молекула ТМЕ- антагоніста), анти ревматичний засіб (такий як, метотрексат, ауранофін, ауротіоглюкоза, азатіоприн, етанерсепт, золото-натрію тіомалат, гадроксихлорохін сульфат, лефлюномід, сульфазалзин), м'язовий релаксант, наркотик, нестероїдний протизапальний засіб (М5АЇ!Ю), анальгетик, анестетик, седативний засіб, місцевий анестетик, нервово-м'язовий блокатор, протимікробний (такий як, аміноглікозид, протигрибковий, протипаразитний, антивірусний, карбапенем, цефалоспорин, фторохінолон, макроліт, пеніцилін, сульфонамід, тетрациклін, інший антимікробний засіб), антипсоріатичний, корти костероїд, анаболічний стероїд, діабетичний агент, мінеральні й харчові добавки, тироїдний агент, вітамін, гормон пов'язаний з кальцієм, протидіарейний засіб, засіб проти кашлю, проти виразковий, послаблюючий, антикоагулянт, еритропоетин (такий як епоетин альфа), фіграстим (такий як, 6-С5Е, Мепродеп), саграмостим (СМ-С5БЕ,

І ешкіпе), імунізатор, імуноглобулін, імуносупресор, (такий як базіліксимаб, циклоспорин, даклизумаб), гормон росту, замінюючі гормони ліки, модулятор рецептору естрогену, мідріатичний, циклопедичний, алкілуючий агент, антиметаболіт, інгібітор мітозу, радіо фармацевтичний засіб, антидепресант, антиманійний агент, антипсихотичний, антиксиолітичний, гіпнотичний, симпатомемічний засоби, стимулятор, донепезіл, такрин, асматичні ліки, бета агоніст, інгаляційний стероїд, інгібітор лейкотриену,

метилксантин, хромолин, епінефрин чи аналог, дорназа альфа(Ри!тогуте), цитокін чи агоніст цитокіну.

Необмежуючі приклади таких цитокінінів включають, але не обмежують до, будь-який з від І/-1 до 1-23. придатні дозування є добре відомини. Див. напр., УмеїІ5 еї аІ., еа5., Рпаппасоїйпегару Напароок, 2па Еайіоп,

Арріеєюп апа Гапде, біатіога, СТ (2000); РОВ Рпаптасоровїа, Тагазсоп Роскеї Рнпаптасоровєїа 2000, Оеїшхе

Еайоп, Тагазсоп Рибіївєпіпо, Сота Гіпда, СА (2000), кожен з яких повністю включено шляхом посилання).

Протиракові та проти інфекційні засоби можуть також включати молекули токсинів, котрі пов'язані, зв'язані, разом формулюються чи разом приймаються з принаймні одним антитілом даного винаходу.

Токсин може, необов'язково діяти, селективно вбиваючи патогенні клітини чи тканини. Патогенні клітини можуть бути раковими чи іншими клітинами. Такі токсини можуть бути, але не обмежуючись цим, очищеними чи рекомбінантними токсинами, чи фрагментом токсину, який включає принаймні один цитотоксичний домен токсину, такий як, вибраний з принаймні одного з, рицин, зміїний (тваринний) токсин, чи бактеріальний токсин. Термін "токсин" також включає як ендотоксини, так і екзотоксини, які виробляються будь-якими природніми, мутантними чи рекомбінантними бактеріями чи вірусами, котрі можуть призводити до будь-яких патологічних станів у людей та інших ссавців, включаючи токсиновий шок, котрий може призвести до смерті. Такі токсини можуть включати, але не обмежуючись до них, теплолабільний ентеротоксин (ІТ), та тепло-стабільний ентеротоксин (57), ентеротоксигенної Е.соїї, цитотоксин ЗПпідеЇПа, ентеротоксини Аеготопав, їохіп-1 синдрому токсичного шоку (Т551-1), стафілококовий ентеротоксин А (5ЕА), епіегоїохіп В (ЗЕВ), чи С (ЗЕС), стрептококові ентеротоксини та подібні. Такі бактерії включають, але не обмежуються ними, штами та види ентеротоксигенної Е. соїї (ЕТЕС), ентерогеморрагічної ЄЕ. соїї (такі як, штами серотипу 0157:Н7), еїарпуюсосси5 о5ресіе5 (такі як,

Зарнуососси5 ацгеи5, Зіарпуіососсиз руодепевз), ЗпідеПйа зресіез (такі як, ЗпідейПа дузепіегіає, ЗпідеПа

Пехпегі, Зпідеїа роудіїї, апа ЗпідеПа зоппеї), Заітопеїйа з5ресіез5 (такі як, ЗаІтопеїІа їурпі, Заітопейа споїега- зців, Заітопеї Іа епіегійаїв), Сіозіпаішт з5ресіез (такі як, Сіовігідіит регітіпдеп5, Сіозігідішт аїйсіе, Сіовігідінт роїшіпит), Сатру!обасіег зресіез (такі як, Сатруобасіег іе)пі, Сатруорасіег Ттеф5), Неїїсорасіег зресіев, (такі як, Неїїсорасієег руїогі), Аеготопах 5зресіез (такі як, Аеготопаз зобра, Аеготопаз пуагорпіїа, Аеготопав саміає), Ріезіотопаз 5ПідеПоїде5, Мегзіпа епіегосоїйіса, Мірпйобз зресіез (е. 9., Мібпоз сНоіегає, Міргіоз раганетої/уїїсив), Кіервзієа зресіеєх, Реендотопавз аєгидіпоза, апа бігеріососсі. |Див., такі як, 5беїп, ед.,

ІМТЕАМАЇ МЕБІСІМЕ, Зга ей., рр.1-13, ГішШе, Вгом/п апа Со., Возіюоп, (1990); Емапв еї аї., еадз., Васієгіа!

Іп'єсіоп5е ої Нитапе: Ерідетіоіюду апа Сопігої, 26. Ед., рр.239-254, Ріепит Меаїса! ВоокК Со., Мем/ Хоїк (1991); Мапавеї! єї а), Рііпсіріє5 апа Ргасіїсе ої Іпгесійсив Оізеазев5, За. Еа., СпигспіїЇ Пміпдвіопе. Мем Хоїк (1990); Вегком єї а, едв., Те Мегок Мапиаї, 16ї1йп еайоп, Мегсок апа Со., Вапмау, М. у., 1992; Мооа еї аї,

ЕРЕМ5 Місгобіоіоду Іттипоіоду, 76: 121-134 (1991); Маїтаск еї аїЇ, бсієпсе, 248: 705-711 (1990), зміст цих посилань повністю включено шляхом посилання).

Суміші, композиції чи комбінації анти-іІІ-12 антитіл даного винаходу, також можуть включати принаймні один будь-який придатний допоміжний компонент, такий як, але не обмежуючись ними, розбавник, зв'язувач, стабілізатор, буфери, солі, ліофільні сольвенти, консерванти, ад'ювант, або подібний.

Фармацевтично придатні допоміжні агенти є переважними. Не обмежуючі приклади та методи отримання таких стерильних розчинів є добре відомими, такі як, але не обмежуючись ними, (Сеппаго, Еда.,

Кепііпдіоп'є Рпаптасешіса! Зсіепсе5, 18п Еайіоп, Маск Рибіїзпіпд Со. (Еазіоп, РА) 1990). Фармацевтично придатні носії, які можуть бути підібрані звичайним чином, є придатними за способом вживання, розчинністю та/або стабільністю композицій анти-1І-12 антитіл, фрагментів чи варіантів, як добре відомо з практики чи описано тут.

Фармацевтичні наповнювачі та добавки корисні в даній композиції включають, але не обмежують до, протеїни, пептиди, амінокислоти, ліпіди та вуглеводи (такі як, цукри, включаючи моносахариди, ди-, три-, тетра- та олігосахариди; похідні сахаридів такі як алдитоли, альдонові кислоти, естерифіковані цукри та подібні; полісахариди та полімери цукрів), котрі можуть бути представлені окремо чи в комбінації, включаючи один чи комбінацію 1-99.9995 за вагою чи об'ємом. Показовий протеїновий екципієнт включає сироватковий альбумін, такий як, сироватковий альбумін людини (Н5А), рекомбінантний альбумін людини (НА), желатин, казеїн та подібні. Представником амінокислотного /антитіло компоненту, котрий може діяти з буферною здатністю, включаючи аланін, гліцин, аргінін, бетаїн, гістидин, глютамінову кислоту, аспарагінову кислоту, цистеїн, лізин, лейцин, ізолейцин, валін, метіонін, фенілаланін, аспартам, та подібні.

Переважною амінокислотою є гліцин.

Вуглеводневі наповнювачі, придатні для використання у винаході включають, наприклад, моносахариди, такі як, лактозу, сахарозу, трегалозу, целобіозу, та подібні; полісахариди, такі як, рафінозу, мелезітозу, мальтодекстрини, декстрини, крохмалі, та подібні, альдитоли, такі як, манітол, ксилітол, малтітол, лактітол, ксилітол сорбітолу (глюцитол) міоінозитол, та подібні. Переважним вуглеводним наповнювачем для використання у винаході є манітол, трегалоза та рафіноза.

Композиції анти-І/-12 антитіл також можуть включати буфер чи агент, що корегує рН; звичайно, буфером є сіль, одержана з органічної кислоти чи основи. Типовими представниками буферів є солі органічних кислот, таких як солі лимонної кислоти, аскорбінової кислоти, глюконової кислоти, вугільної кислоти, тартакової кислоти, бурштинової кислоти, оцтової кислоти, фталевої кислоти; Тріс, трометамін гідрохлорид чи фосфатний буфер. Переважними буферами для використання в даних композиціях є солі органічних кислот, такі як цитрат.

Також, композиції анти-ІЇ-12 антитіл винаходу можуть включати полімерні наповнювачі/добавки такі як полівінілпіролідони, фіколи (полімерні цукри), декстрати (такі як, циклодекстрини, такі як 2-гідроксипропіл- (З-циклодекстрин), поліетиленгліколі, ароматизуючи агенти, атимікробні агенти, підсоллоджувачі, антиоксиданти, антистатичні агенти, сурфактанти (такі як, полісорбати, напр., "ТВИН 20" та "ТВИН 80"), ліпіди (такі як, фосфоліпіди, жирні кислоти) стероїди (напр., холестирол) та хелатоутворюючі агенти (напр.,

ЕОТА).

ЦІ та інші відомі фармацевтичні наповнювачі та/або добавки придатні для використання в композиціях анти-1--12 антитіл, їх частин чи варіантів, відповідно до винаходу є добре відомими спеціалістам, як це описано в ("Кетіпдіоп: Те Зсіепсе 8 Ргасіїсе ої Рпаптасу", 19 ей., УММіШате 8 УМіПатв, (1995), апа іп

Іпе"Рпузісіап'є ОезК Кетегепсе", 5274 ед., Медіса! Есопотіс5, МопімаІе, МУ (1998), дані розкриття повністю включено шляхом посилання)|. Переважним носієм чи наповню вальним матеріалом є вуглеводи (такі як, сахариди та алдітоли) та буфери (напр., цитрат) чи полімерні агенти.

Склади

Як було зазначено вище, винаходом передбачуються стабільні склади, котрі переважно є фосфатним буфером із сольовим розчином чи розчином певної солі, так само як консервований розчин містить консерванти, а консервовані склади широкого призначення придатні для фармацевтичного чи ветеринарного використання, які включають принаймні одне анти-ІЇ/-12 антитіло у фармацевтично прийнятному складі. Консервовані склади містять принаймні один відомий консервант чи, необов'язково, вибраний з групи, яка має принаймні один фенол, т-крезол, р-крезол, о-крезол, хлорокрезол, бензольний спирт, фенілртутний нітрил, феноксиетанол, формальдегід, хлорбутанол, магнію хлорид, (напр., гексагідрат), алкиллпарабен (метил, етил, пропил, бутил, та ін.), бензалконій хлорид, бензетоній хлорид, натрію дегідроацетат та тримерозал, чи їхні суміші в водному розчиннику. Можуть бути використані будь-які придатні концентрації чи суміші, як відомо з рівня техніки, такі як 0.001-595, чи будь-який інтервал чи значення в ньому, такі як, але не обмежуючись ними, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8,1.9,2.0,2.1,2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.1,2.8,2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 чи будь-який інтервал чи значення в ньому. Не обмежуючі приклади включають: без консервантів, 0.1-295 т-крезол (напр., 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.095), 0.1-395 бензил алкоголь (напр., 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5905), 0.001-0.595 тримерозал (напр., 0.005, 0.01), 0.001-2.095 фенол (напр., 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.095), 0.0005-1.095 алкилпарабен(и) (напр., 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0. 9, 1.095), та подібне.

Як було зазначено вище, винаходом запропоновано виріб, який складається зпакувального матеріалу та принаймні одиного флакону, який містить розчин принаймні одного анти-1ІЇ-12 антитіла, із певними буферами та/або консервантами, необов'язково у водному розчиннику, де зазначений пакувальний матеріал має зазначення, котре вказує на те, що цей розчин може зберігатися на протязі 1,2, 3,4,5,6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 годин чи більше.

Винахід також включає виріб, який складається з пакувального матеріалу, пешого флакону із ліофілізованим принаймні одним антитілом, та другого флакону із водним розчинником з буфером чи консервантом, де зазначений пакувальний матеріал має зазначення з інструкцією для пацієнта, як правильно розчинити принаймні одне анти-1ІЇ-12 антитіло у водному розчиннику для одержання розчину, котрий може зберігатися на протязі двадцяти чотирьох годин чи більше.

Принаймні одне анти-1І -12 антитіло, яке застосовується у відповідності з даним винаходом і може бути одержане методом рекомбінації, та включає приготування з клітин ссавців чи трансгенні, чи може бути виділено з біологічних джерел, як описано тут чи відомо з практики.

Певний набір принаймні одного анти-1ІЇ-12 антитіла в продукті даного винаходу може включати певну кількість отриману в наслідок регідратації, якщо в системі вологий/сухий, концентрації будуть становити від приблизно 1.0нд/ті до приблизно 1000тд/ті, хоча нижчі чи вищі концентрації є допустимими та залежними від призначеного носія чи засобу доставки, наприклад, склади у розчині будуть відрізнятися від трансдермального пластиру, легеневого, трансмукозного чи осмотичного чи мікронасосного методу.

Переважно, водний розчинник необов'язково може включати фармацевтично прийнятну кількість консерванту. Переважні консерванти включають вибрані з групи: фенол, т-крезол, р-крезол, о-крезол, хлорокрезол, бензольний спирт, алкилпарабен (метил, етил, пропил, бутил, та ін.), бензалконій хлорид, бензетоній хлорид, натрію дегідроацетат та тримерозал, чи їхні суміші. Концентрації консерванту, що використовується у складах є концентраціями, достатніми для досягнення антимікробного ефекту. Такі концентрації залежать від вибраного консерванту та завжди можуть бути визначені досвідченим професіоналом.

Інші наповнювачі, наприклад, ізотонічні агенти, буфери, антиоксиданти, підсилювачі консервантів, можуть, необов'язково, бути доданими до розчинника. Ізотонічний агент, такий як гліцерин, є загально вживаним у відомих концентраціях. Фізіологічно толерантний буфер, переважно додається для покращення контролю рН. Склади можуть мати широкий спектр значень рн, такий як від приблизно рН 4 до приблизно рН 10, та переважні значення від приблизно рН 5 до приблизно рн 9, та більш переважні значення від приблизно рН 6.0 до приблизно рН 8.0. Переважні склади даного винаходу мають значення рн від приблизно рН 6.8 до приблизно рН 7.8. Переважні буфери включають фосфатні буфери, біль переважно фосфат натрію, закрема забуферений сольовий розчин (РВ5Б).

Інші добавки, такі як фармацевтично прийнятні солюбілізатори, як Твин 20 (поліоксиетилен (20) сорбітан монолаурат), Твин 40 (поліоксиетилен (20) сорбітан монолаурат), Твин 80 (поліоксиетилен (20) сорбітан монолаурат), Рійгопіс Еб8 (блок сополімери поліоксиетилен полаоксипропілен) та РЕО (поліетиленгліколь) чи неіонні сурфактанти, такі як полісорбати 20 чи 80, чи роїохатег184 чи 188 Рішгопісю поліли, інші блок сополімери та хелатори, такі як ЕОТА та ЕСТА, необов'язково можуть бути додані до складів чи композицій для зменшення агрегації. Ці добавки, зокрема, є корисними, якщо для введення складу використовується пластиковий контейнер си помпа. Присутність фармацевтично прийнятного сурфактанту знижує схильність протеїну до агрегації.

Склад за даним винаходом може бути виготовлений у спосіб, котрий включає змішування принаймні одного анти-іІЇ/-12 антитіла та консерванту вибраного з групи: фенол, т-крезол, р-крезол, о-крезол, хлорокрезол, бензольний спирт, алкилпарабен (метил, етил, пропил, бутил, та ін.), бензалконій хлорид, бензетоній хлорид, натрію дегідроацетат та тримерозал, чи їхні суміші в водному розчиннику. Змішування принаймні одного анти-1ІІ-12 антитіла та консерванту в водному розчиннику проводиться з використанням загальноприйнятих методів розчинення та змішування. Для виготовлення прийнятного складу, наприклад, відміряну кількість принаймні одного анти-ІЇ-12 антитіла в буферному розчині комбінують із бажаним консервантом в буферному розчині в кількості достатній для одержання протеїну та консерванту в бажаних концентраціях. Варіації цього процесу є зрозумілими для будь-кого кваліфікованого спеціаліста в даній галузі. Наприклад, для додавання компонентів, при використанні додаткових добавок, потрібно створити відповідні температурні умови та рН, а також оптимізувати усі фактори для концентрації та способу приймання.

Заявлений склад може бути приготований для пацієнтів як готовий розчин чи як двофлаконовий із флаконом ліофілізованого, принаймні одного, анти-ІЇ-12 антитіла, котре розводиться другим флаконом, котрий містить воду, консервант та/або наповнювач, переважно фосфатний буфер та або сольовий розчин та вибрану сіль, у водному розчиннику. І флакон з одним розчином, і двофлаконовий, що потребує розведення, можуть бути використані повторно багато разів та можуть задовольнити пацієнтів на одно чи багато циклічне лікування, і таким чином може бути застосований більш зручний режим лікування, ніж доступні тепер.

Існуючі заявлені вироби є придатними для вживання на протязі до двадцяти чотирьох годин чи більше.

Відповідно до цього, нині заявлені вироби, надають більше переваг для пацієнтів. Склади винаходу можуть, необов'язково, надійно зберігатися при температурах від приблизно 27 до приблизно 40"С та зберігати біологічні властивості протеїну на протязі тривалого періоду часу, дозволяючи таким чином, зазначення на етикетці упаковки, що розчин може зберігатися та/або використовуватися через 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, чи 96 годин чи більше. Якщо використовується консервований розчинник, таке зазначення може містити термін використання до 1-12 місяців, півроку, півтора року, та/або два роки.

Розчин принаймні одного анти-І/-12 антитіла винаходу може бути виготовлений способом, який включає змішування принаймні одного антитіла у водному розчиннику. Змішування проводиться за допомогою загальноприйнятих методик розчинення та змішування. Для виготовлення придатного розчиннику, наприклад, відміряна кількість, принаймні одного антитіла у воді чи буфері з'єднується в кількості достатній для одержання протеїну та, необов'язково, консерванту чи буферу в бажаних концентраціях. Варіанти цього процесу є зрозумілими звичайному спеціалісту в даній галузі. Наприклад, для додавання компонентів, при використанні додаткових добавок, потрібно створити відповідні температурні умови та рн, а також оптимізувати усі фактори для концентрації та способу приймання.

Заявлений продукт може бути приготований для пацієнтів як готовий розчин чи як двофлаконовий із флаконом ліофілізованого, принаймні одного, анти-ІЇ-12 антитіла, котре розводиться другим флаконом, котрий містить воду, консервант та/або наповнювач, переважно фосфатний буфер та або сольовий розчин та вибрану сіль, у водному розчиннику. | флакон з одним розчином, і двофлаконовий набір, що потребує розведення, можуть бути використані повторно багато разів та можуть задовольнити пацієнтів при одно- чи багатоциклічному лікуванні і, таким чином, може бути застосований більш зручний режим лікування ніж доступні тепер.

Заявлений продукт може бути виготовлений не безпосередньо для пацієнтів, а через виготовлення для аптек, клінік чи інших подібних установ та закладів, у вигляді готового розчину чи як двофлаконовий із флаконом ліофілізованого, принаймні одного, анти-ІЇ-12 антитіла, котре розводиться другим флаконом, котрий містить водний розчинник. Готовий розчин в даному випадку може бути до одного літра чи більшого розміру, з такого великого резервуару менші порції розчину принаймні одного антитіла можуть бути одержані одноразово чи багаторазово для перенесення їх у менші флакони та запропоновані аптеками чи клініками для своїх покупців та/або пацієнтів.

Загально прийнятними пристроями, включаючи однофлаконові системи та пенін'єкторні пристрої для доставки розчину, такі як. ВО Реп5, ВО Ашо/|есіогт, Нита)есіб, МомоРепФ, В-ОФРеп, АшоРепФ, апа

ОріїРепФ, СепоїгоріпРепФ), Сепоїгопогт РепФ),, Нитаїйго РепФ), Несо-РепФ), Воїегоп РепФ, Віо|есюгФ,, і|есіф,

УЗ-Яйре,, МееаіІе-Ргее ІпіесіогФ), Іпіга)есіФ, Меаї-УесіФф, напр., як виготовлені чи розроблені Весіоп біскепзеп

ІЕгапкіїп таке, МУ, мли. ресіопаіїскепзоп.соті, Оізеїопіс |(Вигддог, 5угепапа, мумлиу.аїзеїопіс.соті, Віо|есі,

Рошапа, Огедоп |млмили.ріо|есі.соті|; Майопа! Меаіса! Ргодисіє, МУевіоп Меайіса! (Регегтфогоцди, ШК, мулу мевіоп-теаіїса!.сот)|, Меаі-Уесі Согр |Міппеароїї5, ММ, м/млиу. теаі)есісот|. Загально прийнятними пристроями двофлаконових систем, включаючи пенін'єкторні пристрої для розведення ліофілізованих ліків в картриджі для доставки розведеного розчину є такий як НитайїоРепФф.

Продукти, заявлені тут, включають пакувальний матеріал. Пакувальний матеріал надає, на додачу до інформації, що вимагається дозволяючими органами, умови, за яких продукт може застосовуватись.

Пакувальний матеріал даного винаходу надає інструкціє пацієнтам по розведенню принаймні одного анти- 1--12 антитіла у водному розчиннику для утворення розчину, та використанню розчину на протязі 2-24 годин чи більше для двох флаконів сухого/рідкого продукту. Для одного флаконового розчину продукт може містити зазначення, що такий розчин може бути використаний на протязі 2-24 годин чи більше. Заявлені тут продукти є придатними для фармацевтичних продуктів для людей.

Склади даного винаходу можуть бути виготовлені способом, котрий включає змішування принаймні одного анти-І/!-12 антитіла з вибраним буфером, переважно фосфатним буфером, що містить сольвий розчин чи вибрану сіль. Змішування принаймні одного антитіла та буфера у водному розчиннику проводиться загально прийнятими мотодами розчинення чи змішування. Для приготування прийнятного складу, наприклад, відміряну кількість принаймні одного антитіла у воді чи буфері комбінують із бажаним буферним агентом у воді в концентраціях, достатніх для одержання протеїну та буферу в бажаних концентраціях. Варіації цього процесу мають бути зрозумілі будь-кому середньому спеціалісту у даній галузі. Наприклад, для додавання компонентів, при використанні додаткових добавок, потрібно створити відповідні температурні умови та рН, а також оптимізувати усі фактори для концентрації та способу приймання.

Заявлені стабільні чи консервовані склади можуть бути надані пацієнтам як готові розчини чи як двофлаконові препарати, із флаконом ліофілізованого, принаймні одного, анти-іЇ-12 антитіла, котре розводиться другим флаконом, котрий містить консервант чи буфер і наповнювач у водному розчиннику. І флакон з одним розчином, і двофлаконовий препарат, що потребує розведення, можуть бути використані повторно багато разів та можуть задовольнити пацієнтів при одно- чи багатоциклічному лікуванні і таким чином, може бути застосований більш зручний режим лікування ніж доступні тепер.

Принаймні одне анти-1І--12 антитіло як в стабільному так і в консервованому складах чи розчинах, як описано тут, можуть вживатися пацієнтами, у відповідності з даним винаходом різними способами даставки, включаючи 5С чи ІМ ін'єкції; трансдермальний, легеневий, трансмукозний способи, імплантат, осмотичний насос, картридж, мікро насос чи інший спосіб, названий спеціалістом у даній галузі, як добре відомий у практиці.

Терапевтичні Застосування

Даний винахід також пропонує спосіб для модуляції чи лікування принаймні одного імунного захворювання клітини, тканини, органу, тварини чи пацієнта, включаючи, але не обмежуючись, принаймні один з: ревматоїдний артрит, підлітковий ревматоїдний артрит, системний прояв підліткового ревматоїдного артриту, псоріатичний артрит, анкілозний спондиліт, виразка шлунку, серонегативна артропатія, остеоартрит, запальні кишкові хвороби, виразкові коліти, системна ериматозна вовчанка, антифосфоліпідний синдром, іридоцикліт/уреїт/очний неврит, ідіопатичний легеневий фіброз, системний васкуліт/грануломатоз Вегнера, саркоїдоз, орхіт/лроцедури повної вазектомії, алергічні/атопічні захворювання, астма, алергічний риніт, екзема, алергічний контактний дерматит, алергічний конюктивіт, гіперчетливий пневмоніт, трансплантації відторгнення трансплантованих органів, захворювання "трансплантат проти хазяїна", синдром системної запальної відповіді, синдром сепсису, грам-позитивний сепсис, грам-негативний сепсис, сепсис негативний до культури, грибковий сепсис, нейропенічна лихоманка, уросепсис, менінгококкемія, травма/геморрагія, опіки, опромінення іонізуючою радіацією, гострий панкреатит, синдром дихальної недостатності дорослих, ревматоїдний артрит, гепатит спричинений алкоголем, хронічні запальні патології, саркоїдози, патологія Крона, серпово-клітинна анемія, діабет, нефроз, атопічні захворювання, реакції гіперчутливості, алергічні риніти, сінна лихоманка, затяжний риніт, кон'юнктивіт, ендометріоз, астма, кропивниця, системна анафілаксія, дерматит, злоякісна анемія, гемолітичні захворювання, тромбоцитопенія, відторгнення трансплантатом ореану чи тканини, відторгнення транпоантованої нирки, відторгнення транплантованоого серця, відторгнення трансплантованої печінки, відторгнення трансплантованої підшлункової залози, відторгнення трансплантованої легені, відторгнення трансплантованого кісткового мозку (ВМТ), відторгнення алотрансплантату шкіри, відторгнення трансплантованого хряща, відторгнення трансплантованої кістки, відторгнення трансплантованого тонкого кишківнику, відторгнення вживленого ембріонального тимусу, відторгнення трансплантованої пара щитовидної залози, відторгнення ксенотрансплантату будь-якого органу чи тканини, відторгнення алотрансплантатів, реакції анти рецепторної гіперчутливості хвороба Грейва, хвороба Рейнода (віброхвороба), інсулін-резистентний діабет типу В, астма, злоякісна міастенія, сито токсичність опосередкована антитілами, реакції гіперчутливостит типу ЇЇ, системна ериматозна вовчанка, РОЕМ5 синдром (поліневропатія, органомегалія, ендокринопатія, моноклональні грамопатія, та синдром змін в шкірі), поліневропатія, органомегалія, ендокринопатія, моноклональні грамопатія, та синдром змін в шкірі, антифосфоліпідний синдром, пемфігус, склеродерма, змішане захворювання сполучної тканини, ідіопатична хвороба Аддісона, цукровий діабет, хронічний активний гепатит, первинний міліарний цироз, вітіліго, васкуліт, синдром пост-ІМ кардіотомії, гіперчутливість ІМ типу, контактний дерматит, пневмоніт гіперчутливості, відторгнення алотрансплантату, грануллома спричинена внутрішньоклітинними організмами, чутливість до ліків, метаболічний/діопатичний, хворобі Вілсона, гемахроматоз, недостатність альфа-1-антитрипсину, діабетична ретинопатія, тироїдит Хашимото, остеопороз, оцінка гіпоталамо- гіпофізарно-адренальнальної вісі, первинний міліарний цироз, тироїдит, енцефаломієліт, кахексія, цистичний фіброз, хронічне захворювання легенів новонароджених, хронічне обструктивне захворювання легенів (СОРО), спадковий гематофогоцитний лімфогістіцистоз, дерматологічні стани, псоріаз, алопеція, нефротичний синдром, нефрит, гломерулярний нефрит, гостра ниркова недостатність, гемодіаліз, уремія, токсичність, прееклампсія, окКІЗ терапія, анти-саЗ терапія, цитокінінова терапія, хіміотерапія, радіаційна терапія (напр., включає, але не обмежується, тоастенія, анемія, кахексія, та подібні), хронічні отруєння саліцилатами, та подібні. |Див., наприклад, Мегок Мапиаї, 1211-17 Еайіопв, Мегек 5 Сотрапу, Вапмау, МУ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), РпаптпасоїШегару Напаброок, У/еїІв єї аї., едв., Зесопа Еайоп, Аррієюп апа Гапде, Зїатіога, Сопп. (1998, 2000), всі повністю включено шляхом посидання |.

Даний винахід також пропонує спосіб модуляції чи лікування принаймні одного кардіоваскулярного захворювання в клітині, тканині, органі, тварині чи пацієнті, включаючи але не обмежуючи до,

Втрачено при публікації

Втрачено при публікації одночасно та/або після, принаймні одного вибраного з принаймні одного ТМЕ-антагоніста, (напр., але не обмежуючи до, ТМЕ-антитіла чи фрагмента, розчинного ТМЕ-рецептора чи фрагмента, їхніх злитих протеїнів, чи малих молекул ТМЕ-антагоніста), анти ревматичного (напр., метотрексат, ауронафін, ауротіоглюкоза, азатіопрін, етанерсепт, тіомалат натрію золота, сульфат гідроксихлорохінону, лефлюномід сульфазалзіну) мязевий релаксант, наркотик, нестероїдні протизапальні ліки (МЗАЇІО), анальгетик, анестетик, седативні ліки, місцевий анестетик, нейромязевий блокатор, протимікробні (напр., аміноглікозид, протигрибковій, протипаразитний, противірусний препарати, карбапенем, цефалоспорин, фторхінон, макроліт, пеніцилін, сульфонамід, тетрациклін, інший протимікробний засіб), протипсоріатик, кортикостероїд, анаболічний стероїд, діабетичні агенти, мінерали, харчові добавки, тифоїдні агенти, вітаміни, гормон пов'язаний з кальцієм, протидіарейний, протикашльовий, протинудотний, противиразковий, послаблюючий, антикоагулянт, еритропоетин (напр., епоетин альфа), філграстим (напр., с-С5БЕ,

Меипродеп), саргамостим (5М-С5БЕ, лейкин), імунізатор, імуноглобулін, імуносупресор (напр., базиліксимаб, циклоспорин, даклізумаб), гормон росту, гормонозамісний препарат, модулятор рецептору естрогену, мідріатичний, мідріатичний, алкілуючий агент, антиметаболіт, мітотичний інгібітор, радіопрепарати, антидепресант, антиманійний агент, антипсихотичний, нейролептик, гіпнотичний, симпатоміметик, стимулятор, донепезіл, такрин, асматичні препарати, бета антагоністи, інгаляторні ліки, інгібітор лейкотриену, метилксантин, хромолін, епінефрин чи аналог, дорназа альфа (Риітолуте), цитокін чи антагоніст цитокіну. Прийнятні дозування добре відомі спеціалістам. Див. наприклад, Умеїї5 еї аї., еав5.,

РПпапгтасоїШегару Напароок, 2па Еайоп, Аррієюп апа ІГапде, біатіога, СТ (2000); РОА РНагтасоровіа,

Тагазсоп РосКеї Рпаптасороєїа 2000, ЮОеєїихе Еайіоп, Тагавсоп Рибіїзпіпд, Сота Сіпда, СА (2000), кожне з цих посилань повністю включено шляхом посилання).

ТМЕ-антагоністи придатні для композицій, комбінації терапевтичних пристроїв та/або способів даного винаходу (також включає принаймні одне антитіло даного винаходу, зазначену частину, чи його варіант), включаючи, але не обмежуючись, анти-ТМЕ антитіла, ТМЕ-ТМЕ антитіла, антиген-звязуючі його фрагменти, та рецепторні молекули, котрі специфічно зв'язуються з ТМЕ; сполуки, котрі попереджують та/або інгібують синтез ТМЕ, вивільнення ТМЕ чи його дію на клітини-мішені, такі як талідомід, тенідап, інгібітори фосфодіестирази (напр., пентоксифілін та роліпрам), А2о антагоніст аденозинового рецептора та А2р підсилювач аденозинового рецептора; сполуки, котрі попереджують та/або інгібують сигналювання ТМЕ- рецептора, такі як інгібітори кінази протеїну активованого мітогеном (МАР); сполуки, що блокують та/або інгібують мембранне розщеплення ТМЕ, такі як, інгібітори металопротеїнази; сполуки, що блокують та/або інгібують ТМЕ-дію, такі як, інгібітори ферменту конвертуючого ангіотензин (напр., каптоприл); сполуки, що блокують та/або інгібують синтез та/або вироблення ТМЕ, такі як інгібітори МАР-кінази.

Як використано тут, "антитіла фактору некрозу пухлини", "антитіла ТМЕ" "антитіла ТМЕ" чи фрагменти та подібні знижують, блокують, інгібують анулюють чи перешкоджають активності ТМЕ іп міїго, іп 5йи та/або іп мімо. Наприклад, придатні ТМЕ-антитіла людини даного винаходу можуть зв'язувати ТМЕс, включаючи анти-ТМЕ антитіла, антиген-звязуючі їх фрагменти, та зазначені їх мутанти чи домени, котрі специфічно зв'язуються з ТМЕо. Придатні ТМЕ-антитіла чи їх фрагменти здатні також знижувати блоккування, інгібування, анулювання чи перешкоджання синтезу ЕМА, ОМА чи протеїну ТМЕ, вивільнення ТМЕ, сигналювання рецептора ТЕ, мембранного розщеплення ТМЕ, активності ТМЕ, вироблення та/або синтезу

ТМЕ.

Химерні антитіла сСА2 складаються з антиген-зв'язуючого варіабельного регіону високоафінного мишачого антитіла до ТМЕРа дО | людини, зазначеного як А2, та константного регіону ДО І, каппа імуноглобуліну. Регіон Ес |до | людини надає галогенним антитілам ефекторну функцію, збільшує півперіод циркуляції сироватки та знижує імуногенність антитіл. Авидність та епітопна специфічність химерного антитіла сА2 походить від варіабельного регіону мишачого антитіла А2. В окремому виконанні, перевожним джерелом нуклеїнових кислот, що кодують варіабельний регіон мишачого антитіла А2 є клітинна лінія гібридоми Аг.

Химерні А2 (сСА2) нейтралізують цитотоксичну дію природніх та рекомбінантних ТМЕосо людини в залежності від дозування. При аналізуванні зв'язування антитіл А2 та рекомбінантного ТМЕРа людини, константа афінності була визначена рівною 1.04х10'7М". Переважні методи визначення специфічності моноклональних антитіл та афінності конкурентним інгібуванням можуть бути знайдені в (Напохму, еї аї., антиродіеєв: А ІГарогаюгу Мапиаї, Соїй Зргіпд Нагброг ІГарогасогу Ргез5, Соїа Зргіпд Нагрог, Мемж/ Могк, 1988;

Соїїдап еї а)ї., едв., Ситепі Ргоїосої5 іп Ітп2ипоіоду, Стеєпе Рибіїзпіпд Авзос. апа Умієу Іпіегзсіеєпсе, Мем мок, (1992-2000); Когброгеїа!., ІттипоїЇ. Тодау, 4: 72-79 (1983); А!йвиреї єї аї., єд5. Ситепі Ргоїюосоїв5 іп

Моїесшаг Віоіоду, У/іеу Іпіегесіепсе, Мем ХогК (1987-2000); апа Миїег, Мей. Егагуто)., 92: 589-601 (1983), ці посилання повністю включено сюди шляхом посилання).

В окремому втіленні, моноклональні мишачі антитіла А2 вироблялися клітинною лінією, позначеною як с134А. Химерні антитіла сА2 вироблялися клітинною лінією, позначеною як с1684А.

Додаткові приклади моноклональних анти-ТМЕ антитіл, котрі можуть бути використані в даному прикладі описані в спеціальній літературі (див. напр., О.5.Раїепі Мо. 5,231,024; МоїПег, А. еїа!., Суююкіпе 2 (3): 162-169 (1990); 0О.5.Раїепі Арріїсайоп Мо.07/943,852 (йей Зеріетбрег 11, 1992); Вацієп еї аї., Іпіегпайопаї!

Рибіїсайоп МО.М/091/02078 (рибріїзпей Рергоагу 21,1991); Кибіп еї аІ., ЕРО Раїепі Рибіїсайоп Мо.0218868 (риріїзпей Аргії 22, 1987); опе еї аІ.,, ЕРО Раїепі Рибіїсайоп Мо.0288088 (Осіорег 26,1988) Гіапд, еї аї.,

Віоспет.Віоррпуз. Вез.Сотт. 137:847-854 (1986); Меаодег, еї аї., Нубгідота 6:305-311 (1987); Репаїу еї аї.,

Нубргідота 6:359-369 (1957); Вііпдтап, еї аї., Нургідота 6:489-507 (1987); апа Нігаї, єї аї., дУ.Іттипої. Мей. 96:57-62 (1987), ці посилання повністю включено сюди шляхом посилання|.

Молекули рецептора ТМЕ

Переважними молекулами рецептора ТМЕ данного винаходу є такі, котрі зв'язують ТМЕ з високою афінністю |див. напр., РеІдтапп еї аї., ІпсТегпайопа! Рибіїсайоп Мо. УМО 92/07076 (риріїзпеа Аргії 30, 1992); зепаї! еї аї., Сеї! 61 : 361-370 (1990); апа І оєївспег єї аї., Се 61 : 351-359 (1990), ці посилання повністю включено сюди шляхом посилання), та не обов'язково мають низьку імуногенність. Зокрема, 55КОа (роб

ТМЕ-К) та 75КОа (р75 ТМЕ-К) клітинні поверхневі рецептори ТМЕ є корисними в даному винаході. Вкорочені форми цих рецепторів, які містять зовнішньоклітинні домени (ЕСО) цих рецепторів чи їх функціональні частини (див. напр., Согсогап еї а!., Еиг. У. Віоспет. 223: 831-840 (1994)), є також придатними для даного винаходу. Вкорочені форми ТМЕ-рецепторів, які містять ЕСО, були знайдені в сечі та сироватці та ідентифіковані, як З0кКОа та 40кКОа інгібіторні протеїни зв'язування ТМЕ (ЕпдеІтапп, Н. еї аї., 9. ВіоїЇ. С/ает. 265: 1531-1536 (1990)). Мультимерні молекули ТМЕ-рецепторів та злиті молекули ТМЕ-імунорецептора, та їх похідні, фрагменти чи частини є додатковими прикладами ТМЕ-рецепторних молекул, котрі є придатними для методів та композицій даного винаходу. Молекули ТМЕ-рецептора, котрі можу використовуватися у винаході, характеризуються їхньою здатністю лікувати пацієнтів на протязі тривалого періоду із від доброго до відмінного полегшення симптомів та низькою токсичністю. Низька імуногенність та/або висока афінність, так само як інші невизначені властивості, можуть робити внесок в досягнення терапевтичних результатів.

Мультимерні молекули ТМЕ-рецептора корисні для даного винаходу включають всю чи функціональну частису ЕСО чи ще ТМЕ-рецептори одним очи більше поліпептидними лінкерами чи іншими неполіпептидними лінкерами, такими як поліетиленгліколь (РЕС). Мультимерні молекули також можуть містити сигнальний пептид декретованого протеїну для спрямування експресії мультимерної молекули. Ці мультимерні молекули та способи їх одержання були описані в (0.5.Раїепі Арріїсайоп Мо.08/437,533 (йеа

Мау 9, 1995), зміст посилання повністю включено сюди через посилання).

Злиті молекули ТМЕ-імунорецептора корисні для методів і складів даного винаходу, охоплюють як мінімум одну частину одієї або більше молекул імуноглобуліну та всю або функціональну частину одого або більше рецепторів ТМЕ. Ці злиті молекули імунорецептора можуть збиратися як мономери, або гетеро- або гомо-мультимери. Злиті молекули імунорецептора можуть також бути моно валентні або мультивалентні.

Приклад такої злитої молекули ТМЕ-імунорецептора - це злитий протеїн ТМЕ-гесеріог/до. Злиті молекули

ТМЕ-імунорецептора і методи для їх одержання були описані в літературі (Геззіацег еї а!., Еиг. У. ІЧ 101.

21: 2883-2886 (1991); АзПКепа?і єї а!., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 88: 10535-10539 (1991); Рерреї еї а|., 9. Е, гр.

Мед. 174: 1483-1489 (1991); Коїї5 еї аї!., Ргос. іМеШ., Ісі2сіІ. Зсі. С БА 91: 215-219 (1994); Вишйег еєїа!., СуюкКіпе 6(6): 616623 (1994); ВаКег еїа!., ей. 9. Іттипої. 24: 2040-2048 (1994); Вешег еї аІ., ШО. 5. Раїєпі Мо. 5,447,851; апа |. 5. Арріїсайоп Мо. 08/442, 133 (Пеа Мау 16, 1995), кожне з цих посилань повністю включено тут через посилання|. Методи одержання злитиз молекул імунорецептора можуть бути також знайдені в

ІСароп еї а!., ). 5. Раїепі Мо. 5,116,964; Сароп еї аї., ). 5. Раїепі Мо. 5,225,538; апа Сароп вї а!., Машге 337: 525-531 (1989), це посиланння повністю включено тут через посилання).

Функціональний еквівалент, похідне, фрагмент або регіон молекули рецептора ТМЕ відноситься до частини молекули рецептора ТМЕ, або частини послідовності молекули рецептора ТМЕ, яка кодує молекулу рецептора ТМЕ, яка має достатній розмір і послідовності, щоб функціонально мати схожість до молекул рецептора ТМЕ, які можуть використовуватися в даному винаході (напр., зв'язувати ТМЕ з високою афінністю та мати низьку імуногенність). Функціональний еквівалент молекули рецептора ТМЕ також включає модифіковані молекули рецептора ТМЕ, які функціонально схожі до молекул рецептора ТМЕ, які можуть використовуватися в даному винаході (напр., зв'язувати ТМЕ з високою афінністю та мати низьку імуногенність). Наприклад, функціональний еквівалент молекули рецептора ТМЕ може містити "мовчазний" кодон або одну або більше замін амінокислот, делецій або доповнень (є. 9., заміна однієї кислотної амінокислоти на іншу з кислотну амінокислоту; або заміна одного кодону, що кодує гідрофобну амінокислоту на такий же чи інший кодон, що кодує гідрофобну амінокислоту). |Див. А!,Мзибеї еї аї., Сигепі

Ргоїюсоїв іп МоіІесшцаг Віоіоду, Сгеєпе Рибіївзпіпд Авзос. апа, У/ієу-Іпіегвсієпсе, Мем Хоїк (1987-2000)).

Цитокініни включають будь-який відомий цитокінін. Див. напр., ммлу.СоремппСміокКіпе5.сот. Антагоністи цитокініну включають, але не обмежують цими, будь-яке антитіло, фрагмент або міметик, будь-який розчинний рецептор, фрагмент або міметик, будь-який малу молекулу антагоніста, або будь-яку їхню комбінацію.

Терапевтичні Лікування. Будь-який метод даного винаходу може охоплювати метод тікування розладу опосередкованого 1-12, включаючи застосування ефективної кількості композиції або фармацевтичного композиції, що включає як мінімум одне антитіло анти-ІЇ-12 до клітини, тканини, органу, тварини або хворого за потреби такої модуляції, лікування або терапії. Такий метод може необов'язково включати охоплюють одночасне застосування або комбінаційну терапію для лікування таких імунних хвороб, там, де застосування зазначеного як мінімум одного антитіла анти-1ІЇ-12, його зазначеної частини або варіанту, також охоплює застосування, перед, одночасно, та/або після, як мінімум одного вибраного з антагоніста (напр., але не обмежено цим, антитіло ТМЕ або фрагмент, розчинний рецептор ТМЕ або фрагмент, їх злитими протеїнами, або малою молекулою антагоніста ТМЕ), антиревматик (е. 9д., метотрексат, ауранофін, ауротіоглюкоза, азатіопірин, етенерсепт, ауротіомалат натрію, сульфат гідроксихлорохінону, лерфлюномід, сульфазалзін), мязевий релаксант, наркотик, не стероїдні протизапальні ліки, болезаспокійливий засіб, анестезуючий засіб, заспокійливий засіб, місцевий анестетик, нейромязевий блокатор, антимікробний засіб (напр., аміноглікозид, протигрибковий засіб, антипаразитичний, противірусний, карбапенем, цефалоспорин, фторохінолон, макролід, пеніцилін, сульфонамід, тетрациклін, інший антимікробний засіб), антипсоріатичний засіб, кортикостероїд, анаболічний стероїд, агент пов'язаний з діабетом, мінерал, харчова добавка, тироїдний агент, вітамін, гормон пов'язаний з кальцієм, притилиарейний, притикашльвий, антиблювотне, противиразковий засіб, послаблюючий засіб, антикоагулятн, еритропеотин (напр., епоетин альфа), філграстим (напр. 5-С5Е, Мепродеп), сарграмостим (М-С5Е, лейкін), імунізатор, імуноглобулін, імуносупресант (напр., базілікксимаб, циклоспорин, даклізумаб), гормон росту, ліки заміни гормону, модулятор рецептора естрогену, мідриатичний засіб, циклоплегік, аклілуючий агент, антиметаболіт, мітотичний інгібітор, радіо фармацевтичний засіб, антидепресант, антиманійний агент, антипсихотичний, транквілізатор, снодійний засіб, симпатоммемічний засіб, стимулято, донепезіл, такрин, засіб для лікування астми, бета агоніст, вдихальний стероїд, інгібітор лейкотрену, метилксантин, хромолін, епінефрин або аналог, дорназа альфа (Риїтогуте), цитокінін або антагоніст цитокініну.

Звичайно, лікування патологічних станів проводиться за допомогою застосування ефективної кількості або дози як мінімум однієї композиції анти-І--12 антитіла, що повністю, в середньому, чи проміжок з як мінімум приблизно 0.01 до 500 міліграмів, принаймні одого анти-1І--12 антитіла /кілограм хворого на дозу, і переважно від як мінімум близько 0.1 до 100 міліграмів, антитіла /кілограм хворого на одне чи багаторазове вживання, залежно від специфічності дії, яка міститься в складі. Альтернативно, ефективна концентрація сироватки може становити 0.1-5000дд/т! сироватки, за одноразове або багаторазове застосування.

Прийнятні дозування відомі медичним практикуючим фахівцям і буде, звичайно, залежати від специфіки стану хвороби, специфічності активності застосовуваної композиції, і специфіки перебігу лікування. В деяких прикладах, для досягнення бажаної терапевтичної кількості, може бути необхідно запровадити багаторазове вживання, напр., повторювані індивідуальні вживання контрольованої або відміряної дози, де індивідуальні вживання повторюються, поки бажана щоденна доза або результат не буде досягнута.

Переважні можуть необов'язково включати 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, АЗ, 44, 45, Аб. 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76. 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 та/або 100-500тд/кд/застосування, чи будь-який проміжок, значення чи його частина, чи до досягнення концентрації сироватки 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 12, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10, 10.5, 10.9, 11, 11.5, 11.9, 12, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14, 14.5, 15, 15.5, 15.9, 16, 16.5, 16.9, 17, 17.5, 17.9, 18, 18.5, 18.9, 19, 19.5, 19.9, 20, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, та/або 5000ш/ті концентрація сироватки за єдине або багаторазове застосування, або будь-який проміжок, значення або його частину.

Альтернативно, дозування вживання може зміватися, залежно від відомих чинників, як наприклад особливості фармакодинаміки специфічного агенту, і його способу та шляху застосування; віку, здоров'я, і ваги одержувача; природи і тривалості симптомів, виду сумісного лікування, частоти застосування, та бажаного результату. Звичайно дозування активного інгредієнта може становити від близько 0.1 до 100 міліграмів на кілограм ваги тіла. Звичайно 0.1-50, і переважно 0.1-10 міліграмів на кілограм за застосування або в формі повільного вивільнення, є ефективним, для отримання бажаних результатів.

Як необмежуючий приклад, лікування людини або тварини може проведене як одноразове або періодичне дозування принаймні одного антитіла даного винаходу 0.1-100тод/код, як наприклад 0.5, 0.9, 1.0, 1.1,1.5,2,3,4,5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 або 100то/кад, за день, принаймні одне з на день 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24,25, 26,27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, або 40, або альтернативно або додатково, принаймні одне з на тиждень 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, АЗ, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 51, або 52, або альтернативно або додатково, принаймні одне з 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, або 20 років, або будь-якої комбінації цього, використовуючи одноразове вливання або повторювані дози.

Форми (композиції) дозування, відповідні для внутрішнього вживання, загалом містять від близько 0.1 міліграмів до близько 500 міліграмів активного інгредієнта на одиницю або контейнер. В цих фармацевтичних комподиціях активний інгредієнт звичайно присутній в кількості близько 0.5-99.99995 маси, від загальної ваги складу.

Для парентерального вдивання, антитіло може бути у вигляді розчину, суспензії, емульсії або ліофілізованого порошку в поєднанні, або окремо поданим, з прийнятним фармацевтичним парентеральним носієм. Приклади такого транспорту - це - вода, сольовий розчин, розчин Зінгера, розчин глюкози, і 1-1095-на сироватка альбуміну людини. Ліпосоми і неводний носій, як наприклад нелеткі олії також можуть використовуватися. Носій або ліофілізований порошок може містити добавки, які підтримують ізотонічність (напр., хлорид натрію, маннітол) і хімічну стабільність (напр., буфери і консерванти). Склади стерилізовані відомими або придатними методами.

Придатні фармацевтичні носії, описані в останньому виданні, (Кетіпдіоп'є Рпагтасешііса! Зсіепсев, А.

Озої, стандартний текст посилання в цьому полі)Ї.

Альтернативне Застосування

Багато відомих і тих що розробляються методів може що використовується згідно даного винаходу для застосування фармацевтично ефективних кількостей як мінімум одного анти-1ІЇ-12 антитіла, згідно даного винаходу. Тоді як легеневе вживання приводилося в даному описі, інші методи вживання можуть бути використувані згідно даного винаходу з прийнятними результатами.

Антитіла І--12 даного винаходу можуть представлені в носії, як розчин, емульсія, колоїд, або суспензія, або як сухий порошок, з використанням будь-яких з різноманітних пристроїв і методів, придатних для інгаляторного застосування або іншими методами, описаними тут або відомими в практиці.

Парентеральні Склади і Застосування

Склади для парентерального застосування можуть містити, як звичайннаповнювач стерильну воду або сольовий розчин, поліалкильні гліколі, як наприклад поліетиленгліколь, олії рослинного походження, гідрогенований нафталін і подібні. Водні або масляні суспензії для ін'єкцій можуть виготовлені, використовуючи відповідний емульгатор або зволожувач і суспензійний агент, згідно відомих методів.

Агенти для ін'єкції можуть бути нетоксичними, не для орального прийому розбавлювач, як наприклад водні розчини або ін'єкційний стерильний розчин або суспензія в розчиннику. Як придатний до вживання носій або розчинник можуть бути використані, вода, розчин Рінгера, ізотонічний сольовий розчин, і т.п. дозволений; як звичайний носій, або суспензійний розчинник може використовуватися стерильне нелетке масло. Для цих цілей може що використовується, будь-який вид нелеткого масла і жирної кислоти, включаючи природні або синтетичні або напівсинтетичні жирні масла або жирні кислоти; природні або синтетичні або напівсинтетичні моно- або ди- або тригліцериди. Парентеральне застосування, є відомим в практиці, і включає, але не обмежує, звичайний засіб для ін'єкцій, безголковий пристрій для ін'єкції стислого газу як описано в (0.5.Раї.Мо.5,851,198), та лазерний перфоруючий пристрій як описано в (О.5.Раї.Мо.5,839,446 повністю включений тут посиланням).

Альтернативне Доставления

Винахід крім того стосується вживання як мінімум одного антитіла анти-1І-12 парентерально, підшкірно, внутрішньом'язево, внутрішньовенно, внутрішньосуглобово, внутрішньобронхіально, внутрішньоочеревинно, іпігасарзшіаг внутрішньосуглобово, внутрішньохрящово. внутрішньопорожнинно, внутрішньоцеліарно, внутрішньоцеребрально, внутрішньоцеребровентрикулярно, внутрішньоободочно, внутрішньоцервікально, внутрішньошлунково, внутрішньопечінково, внутрішньоміокардіально, внутрішньокістково, внутрішньотазово, внутрішньоперікардіально, внутрішньоперіотонально, внутрішньоплеврально, внутрішньопростатно, внутрішньолегенево, внутрішньоректально, внутрішньонирково, внутрішньосітківково, внутрішньоспінально, внутрішньосиновіально, внутрішньоторакально, внутрішньоутробно, внутрішньоміхурово, за допомогою болюса, вагінально, ректально, буккально, підязиково, інтраназально, або трансдермальні засоби. Як мінімум один склад антитіла анти-ІЇ-12 може призначений для використовування парентерально (підшкірно, внутрішньом'язево або внутрішньовенно) або будь-якого іншого застосування особливо у формі рідких розчинів або суспензій; для використовування у вагінальному або ректальному застосуванні особливо у напівтвердих формах, як наприклад, але не обмежено до таких, креми і суппозиторії: для буккального, або підязикового застосування, як наприклад, але не обмежений до таких, у формі таблеток або капсул; або інтранозально, як наприклад, але не обмежено ними, у форма порошкув, носових крапель або аерозолів або певних агентв; або трансдермально, як наприклад, не обмежуючий, гель, мазь, примочка, суспензія або пластирна системою доставки з хімічним наповнювачем, як наприклад диметил сульфоксид, для зміни структури шкіри або збільшення концентрації ліків в трансдермальному пластирі |(Чипдіпдег, еї а). п "Опд Рептеєайоп

Еппапсетепі"; Нвієей, 0. 5., Ейв., рр.59-90 (Магсе! ОекКег, Іпс. Мем Могк 1994, повністю включено посиланням)і, або з окислюючими агентами, які уможливлюють використання формулювань, що містять протеїни і пептиди на шкірі (М/098/53847|, або використання електричних полів, для створення швидкоплинні транспортих шляхів, як наприклад електропорація, для збільшення рухливості заряджених ліків через шкіру, як наприклад іонофорез, або використання ультразвуку, як наприклад сонофорез

ІУ.5.Раї.Мо5.4,309,989 та 4,767,402| (згадані вище публікації і патенти, що є повністю включені тут посиланням).

Легеневе/Назальне застосування

Для легеневої адміністрації, переважно як мінімум один склад з антитілом анти-1Ї-12, доставлений в розмірі частинки, ефективному для досягнення більш низьких повітряних шляхів легенів або пазух. Згідно винаходу, як мінімум одне антитіло анти-1ІЇ-12 може доставлене будь-яким з різноманітних інгаляторних або назальних пристроїв, відомих в практиці для застосування терапевтичного агента вдихом. Ці пристрої, здатні до депонування аерозолізованих формулювань в синусні пазухи або альвеоли хворого, включають мірне дозування інгаляторів, розпилювачів, генераторів сухих пудр, пульверизаторів, і подібних. Інші пристрої, придатні для застосування для легеневого або носового застосування антитіл, також відомі в практиці. Всі такі пристрої можуть використовувати формулювання, придатні для застосування для розподілу антитіла в аерозолі. Такі аерозолі можуть включати або розчини (як водний, так і не водний) або тверді частки. Міряні інгаляторні дозатори подібно мірному інгалятору дозатору Мепіоїїп5, звичайно використовують рушійний газ і вимагають приведення в дію за допомогою вдиху Ідив. напр., МО 94/16970,

УМО 98/35888)|. Сухі інгалятори пудри подібні до Тигрипа|егтм (Авіга), Ноїапа|его (Стіахо), ОізкизФ (Спахо),

ЗрігозФіппа|ег (Оига), пристрої, що продаються, Іппаіе Тпегарешісв, і ЗзріппаіегФ інгалятор пудри (Різопв) котрий приводиться в дію вдиханням змішаної пудри (05 4668218 Авіга, ЕР 237507 Авіга, МО 97/25086

Сіахо, МО 94/08552 Бига, 5 5458135 Іппаіє, УМО 94/06498 ГРізоп5, повністю включено тут посиланнямі.

Розпилювачі подібно АЕкх'""Агадідт, ОКгамепіФпериції2ег (МаїПпсКгоаюО, і розпилювач Асогп ПФ (Медична

Продукція Магдне5з) (05 5404871 Агадідт, УМО 97/223761|, вище згадані, повністю включено тут посиланням, утворюють аерозолі з розчинів, тоді як дозовані аерозолі, сухі інгалятори пудри, і т.п. генерують малі аерозольні частки. Ці специфічні приклади комерційно доступних пристроїв для інгаляцій є представниками специфічних пристроїв, придатних для цього винаходу, і не є обмеженням даного винаходу винаходу.

Переважно, композиція, яка включає принаймні одне антитіло анти-1І-12, доставляється як інгалятор сухої пудри або пульверизатор. Це є окремі бажані особливості пристрою вдиху для застосування як мінімум одного антитіла даного винаходу. Наприклад, доставления інгаляційним пристроєм значно вигіднішою, легше відтворюваною, і точною. Пристрій вдиху може необов'язково доставляти малі сухі частки, наприклад менш ніж близько 10цт, краще близько 1-5дт, для покращення вдихуваності.

Застосування композицій антитіла 1-12 Аерозолем

Аерозоль, що включає протеїн композиції антитіла І/-12, може отримуватися, випирскуванням під тиском через насадку суспензій чи розчинів як мінімум одного антитіла анти-1Ї -12.

Розмір насадки і конфігурація, тиск застосовується, і рідка швидкість подачі можуть бути вибрані таким чином, щоб досягти бажаного виходу і розміру часток. Електроаерозоль може отримуватися, наприклад, електричним полем у поєднанні з капіляром або живлючою насадкою. Переважно, частки як мінімум композиції одного протеїну антитіла анти-ІЇ-12, доставляються пульверизатором, мають розмір частоки менш ніж близько 10шт, краще межах від приблизно 1 шт до приблизно 5идт, і краще за все від приблизно дит до приблизно Здт.

Формулювання як мінімум одного протеїну композиції антитіла анти-1ІЇ-12, придатне для використання пульверизатором, звичайно включають протеїн композиції антитіла у водному розчині з концентрацією від приблизно 0.1п9 до приблизно 100та4 0.1 як мінімум одного протеїу композиції антитіла анти-1ІЇї-12 на ті розчину або тд/дт, або будь-який проміжок або значення в ньому, напр., але не не обмежуючись до нього, 1,2,3,4,5,6,7,8,9,1,2,3,4,5,6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 або 100тд/ті або тд/д. Композиція може включати агенти, як наприклад наповнювач, буфер, ізотонічний агент, консервант, сурфактант, і, краще, цинк. Композиція може також включати наповнювач або агент стабілізації протеїну композиції антитіла, як наприклад буфер, відновлюючий засіб, додатковий протеїн, або вуглевод. Додаткові протеїни, корисні у формулюванні протеїнів композиції антитіла, включають альбумін, протамін, або подібний. Типові вуглеводи, корисні у формулюванні протеїнів композиції антитіла, включають сахарозу, манітол, лактозу, трегалозу, глюкозу, або подібний. Формулювання протеїну композиції антитіла може також включати сурфактант, який може знизити або запобігти поверхневу агрегацію протеїну композиції антитіла, викликану атомізацією розчину у формуванні аерозоля. Можуть використовуватися різні традиційні сурфактанти, як наприклад жирні кислотні поліоксиетиленефіри і алкоголі, та жирнокислотні естери поліоксиетилен сорбітолу. Кількості загалом можуть мати значення у проміжку 0.001-1495 ваги формулювання. Особливо переважним сурфактантами, для цілей цього винаходу є - поліоксиетилен сорбітан моноолеал, полісорбат 80, полісорбат 20, або подібний. Додаткові агенти, відомі в практиці для формулювань протеїну, як наприклад антитіла 1-12, або вказаних частин або варіантів, також можуть входити у формулювання.

Застосування композицій антитіла 1-12 за допомогою розпилювача

Протеїнова композиція антитіла може бути застосована як розпилювач, як наприклад струйний розпилювач або ультразвуковий розпилювач. Звичайно, в струйному розпилювачі! використовується джерело стислого повітря, для створення повітряного струменя високої швидкості через отвір. Оскільки газ розширяється після насадки, зона низького тиску створюється, який витягує розчин протеїну композиції антитіла через капілярну трубку, сполучену з резервуаром рідини. Потік рідини від капілярної трубки, розпадається в нестабільні філаменти і крапельки, на виході з трубки, створюючи аерозоль. Може використовуватися ряд конфігурацій, норм витоку, і типу перегородки, для досягнення бажаних особливостей від даного струйного розпилювача. В ультразвуковому розпилювачі, звичайно використовується п'єзоелектричний перетворювач для перетворення електричної енергії високої частоти, у вібраційну, механічну енергію. Ця енергія, передана формулюванню протеїну композиції антитіла або безпосередньо, або через зчіпну рідину, створюючи аерозоль, який включає протеїн композиції антитіла.

Більше переваг надає виконання в якому, частинки протеїну композиції антитіла, доставленого розпилювачем, мають розмір частинки менш ніж близько 1Ошт, краще в проміжку від близько їшт до близько 5мйт, і краще всього від близько 2йит до близько Здт.

Формулювання як мінімум одного антитіла анти-ІЬ-12, придатне для використання або з струйним або ультразвековим розпилювачем, звичайно мають концентрацію від близько 0.1т79 до близько 100т4д як мінімум одного протеїну антитіла анти-ІЇ-12 на ті розчину. Формулювання може включати такі агенти, як наприклад наповнювач, буфер, ізотонічний агент, консервант, сурфактант, і, краще, цинк. Формулювання може також включати наповнювач або стабілізатор як мінімум одного протеїну композиції антитіла анти- І - 12, як наприклад буфер, відновлюючий засіб, додатковий протеїн, або вуглевод. Додаткові протеїни, корисні у формулюванні як мінімум одного протеїну складу антитіла анти-ІЇ-12, включають альбумін, протамін, або подібний. Типові вуглеводи, корисні у формулюванні як мінімум одного антитіла анти-1І--12, включають сахарозу, манітол, лактоза, трегалозу, глюкоза, або подібний. Як мінімум одне формулювання антитіла анти-ІЇ-12 може також включати сурфактант, який може знизити або запобігти поверхневій агрегації як мінімум одного антитіла анти-1ІЇ-12, викликаній атомізацією розчину у формуванні аерозоля.

Можуть використовуватися різні придатні сурфактанти, як наприклад жирнокислотні ефіри поліоксиетилену, алкоголі і жирнокислотні ефіри поліоксиетилен сорбіталу. Кконцентрація речовини звичайно становить від приблизно 0.001 до приблизно 495 ваги формулювання. Особливо переважні сурфактанти, для цілей цього винаходу - це поліоксиетилен сорбітан моноолеат, полісорбат 80, полісорбат 20, або подібний. Додаткові агенти, відомі в практиці для формулювань протеїну, як наприклад протеїну антитіла можуть також увійти до формулювання.

Застосування композицій антитіла І/-12 дозований Інгалятор В дозованому інгаляторі (МОЇ), газ- витіснювач, як мінімум одне антитіло анти-ІЇІ -12, і будь-хто з наповнювачів або інші добавки, що містяться в контейнері у вигляді мікстури, включаючи зріджений, стислий газ. Приведення в дію дозуючого клапану випускає мікстуру у вигляді аерозоля, котра переважно містить частки розміром від менш ніж близько 10пшт, краще близько 1 шт до близько 5дт, і краще за все від близько 2 до близько Здшт. Бажаний розмір частки аерозоля може отриманий, при використанні формулювання протеїну композиції антитіла, одержуваної різними методами, відомими з приктики, включаючи такі, як струйні, розпилювальну сушку, конденсація критичної точки, або подібні. Переважні дозовані інгалятори, включають вироблювані ЗМ або сіахо і використовують як витіснюючий газ фторвуглеводень.

Формулювання як мінімум одного антитіла анти-І--12 для використовування з пристроєм дозуючого інгалятора загалом включають тонко дисперговану пудру, містячи як мінімум одне антитіло анти-1Ї-12 як суспензію в неводному середовищі, наприклад, суспендований в витіснюючому газі за допомогою сурфактанту. Витіснюючий газ може бути будь-яким загально прийнятним матеріалом, що використовується для цієї мети, як наприклад хлорфторвуглець, гідрохлорфторвуглець, гідрофторвуглець, або вуглеводень, включаючи трихлорфторометан, диихлордифторометан, дихлортетрафторетанол і 1,1,1,2-тетрафторметан, НЕА-134а (гідрофторалкан-134а), НЕА-227 (гідрофторалкан -227), або подібний.

Кращий пропелянт - це гідрофторвуглець. Сурфактант може бути вибраний, для стабілізації як мінімум одного антитіла анти-І--12 як як суспензії в пропелянті, щоб захисту активного агента від хімічної деградації, і подібне. Відповідний сурфапктант включає сорбітан триолеат, соєвий лецитин, олеїнова кислота, або подібний. В деяких випадках аерозолі розчину, яким віддана перевага, використовують розчинники, як наприклад етанол.

Додаткові агенти, відомі в практиці для формулювань протеїну, як наприклад протеїн можуть також увійти до формулювання.

Бідь-хто досвідчений в даній галузі розуміє, що методи даного винаходу можуть бути включати легеневе застосування як мінімум одного складу антитіла анти-ІЇ-12 за допомогою пристрої, не описаних тут.

Ротові Формулювання і Застосування

Формулювання для ротового вживання залежать від одночасного застосування із адювантами (напр., резорциноли і неіїонні сурфактанти, як наприклад оолеіловий ефір ополіоксиетилену і ефір п- гексадецилполіутилену), для штучного збільшення проникності стін кишківнику, також як і ферментативних інгібіторів (напр., інгібітори панкреатичного трипсину, диізопропілфторфосфату (ОРЕ) і триазоліл), для перешкоджання ферментативної деградації. Основа активної суміші для твердої форми дозування для орального застосування може дути одержана з принаймні однією добавкою з перерахованих сахароза, лактоза, целюлоза, манітол.трегалоза, рафіноза, мальтитол, декстран, крохмалі, агар, аргінати, хітини, хітозани, пектини, трагакантова камідь, гуміарабік, желатин, колаген, казеїн, альбумін, синтетичний або напівсинтетичний полімер, і гліцерид. Ці форми дозування можуть також містити інший вид(и) добавок, напр., інертний розбавлюючий агент, любрикант, як наприклад стеарат магнію, парабен, консервеючі агента, як наприклад сорбінова кислота, аскорбінова кислота, альфа-токоферол, антиоксидант, як наприклад цистеїн, дезинтегратор, звязувач, загущувач, буферний агент, підсолоджуючий агент, смаковий агента, ароматизуючий агент, і т.п.

Таблетки і пілюлі можуть також мати кишково-розчинне покриття. Рідкі препарати для орального застосування включають емульсію, сироп, еліксир, суспензію і розчин, придатні для медичного використовування. Ці препарати можуть містити інертні розбавлюючі агенти, що звичайно використовуються в даній галузі, напр., вода. Ліпосоми також зустрічаються як системи доставки ліків для інсуліну і гепарину (0.5.Раї.Мо.4,239,754)|. Також штучні полімерні мікросфери суміші використовувалися, для доставити фармпрепаратів амінокислот (протеіноїдів), (Ш. 5. Раї. Мо. 4,925,673)|. До того ж, носієві суміші, описані в (Ю. 5. Раї. Мо. 5,879,681 і Ш. 5. Раї. Мо. 5,5,871,753| які використовувалися, для доставки біологічно активних агентів, для внутрішнього прийому відомі в практиці. --------стали здесь-------

Формулювання для слизової і застосування

Для абсорбції через поверхні слизових оболонок, композиції і методи застосування як мінімум одного антитіла анти-ІЇ-12 включають емульсію, що включає велику кількість субмікронних часток, макромолекули адгезивні до слизової, біоактивні пептиди, і водну безперервну фазу, яка здійснює абсорбцію через поверхні слизових оболонок за допомогою досягнення мікроадгезії часток емульсії (0.5.Раї.Мо. 5,514,6701І.

Слизисті оболонки, придатні для застосування емульсій даного винаходу, можуть включати рогівковий, конюктивний, буккальний, підязиковий, носовий, вагінальний, легеневий, шлунковий, кишковий, і ректальний маршрути застосування. Формулювання для вагінального або ректального застосування, наприклад суппозиторії, можуть містити, як ноповнювачі, наприклад, поліалкенгліколі, вазелін, масло какао, і подібні. Формулювання для інтраназального застосування можуть бути твердими і містити, як наповнювачі, наприклад, лактозу або можуть бути водними чи маслянистими розчинами носових крапель.

Наповнювачі для буккального застосування включають цукри, стеарат кальцію, стеарат магнію, крохмаль прежелатинізований, і подібне (Ш.5.Раї.Мо. 5,849,6951І.

Трансдермальні Формулювання і застосування

Для трансдермального застосування, як мінімум одне анти-1ІІ-12антитіло, інкапсульоване в засоби доставки, як наприклад ліпосоми або полімерні наночастки, мікрочастки, макрокапсули або мікросфери (звичайно усі називаються мікрочастками, хоча іноді їх розрізняють), існує ряд відомих засобів доставки, включаючи синтетичні полімерні мікрочастки, зроблених, як наприклад з полігідрокси кислот, як наприклад полі молочна кислота, поліглікольна кислота і їх сополімери, поліортоестери, поліангідриди, і поліфосфазени, і природні полімери, як наприклад колаген, поліамінокислоти, альбумін і інші протеїни, альгінати та інші полісахариди, і їх комбінації (0.5.Раї.Мо. 5,814,599).

Тривале застосування і формулювання

Іноді може бути бажаним, щоб доставляти суміші даного винаходу до суб'єкта на протязі тривалого часу, наприклад, на протязі від одного тижня до одного року від одніго застосування. Можуть використовуватися різні дозувальні форми повільного вивільнення, депо або імплант.

Наприклад, форма дозування може містити фармацевтично прийнятну неотруйну сіль сполук, які мають низький ступінь розчинності в біологічних рідинах, наприклад (а) кислотна сіль з багатоосновною кислотою, такою як фосфорна кислота, сірчана кислота, лимонна кислота, тартарова кислота, дубильна кислота, кислота ратоїс, альгінінова кислота, кислота поліглютамінова, нафталенові моно- або дисульфонові кислоти, полігалактуронова кислота, і подібне; (Б) сіль з багатовалентним катіоном металу, як наприклад цинк, кальцій, вісмут, барій, магній, алюміній, мідь, кобальт, нікель, кадмій і подібні, або з органічним катіоном, утвореним від напр., М,М'-дибензил-етилендиаміну або етилендиаміну; або (с) комбінації (а) і (б) наприклад сіль танату цинку. Додатково, сполуки даного винаходу або, краще, відносно нерозчинна сіль, як наприклад тільки що описані, можуть бути сформульовані в гелі, наприклад, гель моностеарату алюмінію з, наприклад маслом сезаму, придатне для ін'єкцій. Особливо переважними солями, - є солі цинку, солі таннату цинку, солі ратоаїге, і подібні. Інший тип депонувального формулювання для повільного вивільнення для ін'єкцій могли б містити суміш або сіль, диспергована для інкапсуляції в повільно розкладаючийся, нетоксичний, неатнтигенний, полімер, як наприклад полімер полімолочної кислоти асід/полігліколевої кислоти наприклад як описано в (Ш.5.Раї.Мо.3,773,919|. Суміші або, краще, відносно нерозчинні солі, як наприклад описані вище можуть також бути сформульовані в силастикові пілюлі з холестерольною матрицею, зокрема для використання на тваринах. Додатково, формулювання повільного вивільнення, депо або імплантів, наприклад газові або рідинні ліпосоми, відомі в літературі (0. 5.

Раї. Мов. 5,770,222 апа "Зивіаіпей апа СопігоПей НеїІєазе ЮОгпид Оєїїмегу бузіетв", У. А. Вобіпзоп єд., Магсе!

Оеккегт, Іпс., М. У., 19781.

Те саме, що приведено в описі винаходу, може бути так зрозуміло з наступних прикладів, котрі приводяться як ілюстрації і не, що маються на увазі як обмеження.

Втрачено при публікації

Вектор рС4 використовується для експресії антитіла 1-12. Плазміда рс4 - це похідне плазміди рем2- апт (АТСС Ассезвзіоп Мо.37146). Плазміда містить ген миші ОНЕРК під контролем більш раннього промотора 5М40. Клітини яєчнику або інші китайського хом'яка, з недостатньою активністю дигідросульфолату, яка є трансфековані цими плазмідами, можуть бути вибрані, вирощуванням клітин на селективному середовищі

Інапр., аїрпа тіпиз МЕМ, Гіте Тесппоіодіе5, сСайпегзригд, МОЇ доповнене з хемотерапевтичним агентом метатрексату. Ампліфікація генів ОНЕК в клітинах, стійких до метотрету (МТХ), добре описана |див., напр.,

Р. МУ. АЇ,, еї а)., 9. Віої. Снет. 253: 1357-1370 (1978); 9. М. Натіїп апа С. Ма, Віоспет. єї Віорпув. Асіа 1097: 107-143 (1990); апа М. у. Раде апа М. А. будепнат, Віоїесппоіоду 9: 64-68 (1991)). Клітини, вирощені за збільшених концентрацій МТХ, розвивають резистентність до ліків, перевиробляючи цільовий фермент,

ОСНЕРК, в результаті ампліфікації гена ОНЕК. Якщо другий ген зв'язаний з геном ОНЕК, то він звичайно коампліфікується і переекспресовується. Є відомим в практиці, що цей підхід може використовуватися, для одержання клітинних ліній, які несуть більш ніж 1, 000 копій ампліфікованого гену(ів). Згодом, коли метотрексат видалено, отримані клітинні лінії, які містять ампліфікований ген, з'єднаний з однією або більше хромосомою/(ми) клітини хазяїна.

Плазміда рес. експресії цільового гену містить сильний промотор довгого кінцевого повтору (ІТК) вірусу саркоми Роуса (Сшіеп, еї а!., МоїІес. СеїІ. ВіоІ.5: 438-447 (1985)| плюс фрагмент, ізольований з енхансера безпосереднього раннього гену цитомегаловірусу людини (СМУ) |Возпаїгї, еї а!., Сеї! 41: 521-530 (1985)|.

Пізніше розташованим за промотором є Ватні, Хваї, і Азр718 сайти рестрикції літичними ферментами, які дозволяють інтеграцію генів. Після клону вальних сайтів плазміда містить З інтрон та сайт поліаденілування щурячого препроінсулінового гену. Також можуть бути використані інші високоефективні промотори для експресії, наприклад, промотор б-актину людини, ранній чи пізній промотори 5М40 чи довгий термінальний повтор з іншого ретровірусу, наприклад, ВІЛ та НТІМІ, Сіопіесп5 Теї-ОйЙ та Тег-Оп системи генної експресії та подібні системи можуть бути використані для експресії регульованого типу 1-12 в клітинах ссавців М. Сбоззеп, апа Н. Вшага, Ргос. Май. Асай. зЗсі. ОБА 89: 5547-5551 (1992))Ї. Для поліаденілування ткМА також можуть застосовуватися інші сигнали, наприклад, з гормону росту людини чи тобі нового гену. Стабільні клітинні лінії, які несуть цільовий ген інтегрований в хромосому також можуть бути виділені сотрансфекцією селектовним маркером таким як орі, 5418 чи гігроміцин. Використання більше ніж одного маркера на початку, наприклад, 5418 із метотрексатом дає значні переваги.

Плазміда рС4 розщеплюється ферментами рестрикції і потім дефосфорилюється за допомогою телячої кишкової фосфатази, загально відомим методом. Потім вектор виділяється з 195 агарозного гелю.

Використовується послідовність ОМА, що кодує повне антитіло 1-12, наприклад, ЗЕО ІЮ МОБ: ІМ5ЕКТ

МАВ АА 5ЕО ІО 1, та ІМ5ЕКТ МАВ АА 5ЕО ІО МО2, відповідно до варіабельний регіонів НС та І С антитіла

І/-12 даного винаходу, відповідними відомими методами. Віділення нуклеїнової кислоти, що кодує придатний константний регіон людини (напр., регіони НС та ІС) також використовуються для цього конструкту Інапр., як у векторі р 1351: ІМБЕНТ АТСС АССЕББІОМ МОМВЕА АМО АООІТІОМАГ НСЛ С плазмід).

Виділені ОМА, що кодують варіабельні та константні регіони, та дефосфорильований вектор потім лігуються Т4 ОМА лігазою. Клітини Е. соїї НВ 101 чи ХІ-1 Віе потім трансформують та ідентифікують бактерії, котрі містять фрагмент, вставлений в плазміну рС4 за допомогою, наприклад, аналізу рестрикцій ними ферментами.

Для трансфекції використовуються яєчникові клітини китайського хомяка (СНО), позбавлені активного гену ОНЕК. 594 плазміни експресії рС4 котрансфекуються з 0,59 плазміди реМ2пео, за допомогою ліпофесцину. Плазміда реМ2пео містить домінантний селектабельний маркер, ген пео з Тп5 кодує фермент, який призводить до резистентності до групи антибіотиків включаючи 0418. Після 2 днів, клітини трипсинізують й висівають на платівки клонування гібридом (сгеїпег, бегптапу) в альфа мінус МЕМ із доданням 10, 25, чи 5бпд/ті метотрексату з Ттд/ті 5418. після приблизно 10-14 днів поодинокі клони трипсинізують й висівають в б-лункові чашки Петрі чи 10ті! колби з використанням різних концентрацій метотрексату 50пМ, 100пМ, 200пМ, 400пМ, 800пМ). Клони, що росли з найвищими концентраціями метотрексату потім було перенесено в нові б-лункові чашки з ще більшим вмістом метотрексату (1тМ, 2тМ, 5тМ, 10тМ, 20тМ). Така ж процедура повторялася, поки не були одержані клони котрі росли при концентрації 100-200тМ. Експресія бажаного генного продукту вивчалася, наприклад, за допомогою 505-

РАСЕ та Ууевіет Бріої за допомогою реверсивно фазного НРІ С-аналізу.

Приклад 2: Одержання,за допомогою трансгенних мишей, високоафінних моноклональних антитіл (дО людини, що реагують з І-12 людини

Стисле викладення

Для одержання високоафінних, повністю людських, моноклональних антитіл, котрі можуть бути терапевтично застосовані для інгібування дії І/-12 для лікування одного чи більше захворювань опосередкованих 1І--12, було використано трансгенних мишей, котрі мали гени легкого та важкого ланцюгів імуноглобуліну людини. Гібридні миші (СВА/) х С57/8ВІ6/У) Е, які мали трансгени варіабельного та константного регіонів важкого та легкого ланцюгів людини, були імунізовані рекомбінантним 1-12 людини

ІТаупог еї аї., Іпі). Іттипо)ї. 6: 579-591 (1993); І опрего, еї а!., Майшге 368: 856-859 (1994); Мейибрегоетг, М., Майте

Віоїтесн. 14: 826 (1996); Різпмд, еї аі!., Маштге Віосесппоїоду 14: 845-851 (1996)). Декілька злиттів дали одне чи більше панелей повністю людських ІЇ/-12 реактивних моноклональних антитіл дО. Повністю людські анти-І-12 антитіла буде описано далі. Усі вони є дО. Було визначено, що такі антитіла мають константу афінності десь між 1х109 та 9х1012, неочікувано високі афінності цих повністю людських моноклональних антитіл робить їх придатними кандидатами для терапевтичних застосувань в захворюваннях, патологіях чи розладах пов'язаних з 1-12.

Скорочення

ВЗА - бичачий сироваточний альбумін

СО2 - диоксид вуглецю

ОМ5О - диметисульфоксид

ЕІА - ферментативний імуноаналіз

ЕВ5 - ембріональний бичача сироватка

Нг02-пероксид водню

НРР - пероксидаза хріну

ІО - інтрадермальний

Ід - імуноглобулін

І/-12 - інтерлейкин-12

ІР - внутрішньоочеревинний

ІМ - внутрішньовенний

Маб - моноклональні антитіла

ОО - оптична щільність

ОРО-о - фенілендиамін дихлорид

РЕ - поліетиленгліколь

РБЗА - пеніцилін, стрептоміцин, амфотеріцин

ВТ - кімнатна температура 5О - підшкірний м/м - об'єм на об'єм м/м - вага на об'єм

Матеріали та методи

Тварини

Добре відомими з літератури є трансгенні миші, здатні експресувати антитіла людини, котрі експресують імуноглобуліни людини, але не мишачий ІдМ чи Ід, вони також є комерційно доступними Інапр., від сепРПагт Іпіегпайіопаї, Зап дуозе, СА; Ардепіх, Егеетопі, СА, та інших). Наприклад, такі трансгенні миші мають послідовність трансгенів людини, котрі було піддано М(0)У введенню, перемикача класу важкого ланцюга, та соматичним мутаціям для одержання переліку імуноглобулінів з людською послідовністю

ІГопбего, еї аї., Майте 368: 856-859 (1994)). Трансген легкого ланцюга може бути отриманий, наприклад, частково з клону штучної хромосоми дріжджів, котрий включає приблизно половину регіону М геметних ліній людини. Додатково, трансген важкого ланцюга може кодувати як й так і | (Різпм/йа, еї аї., Маїшге

Віоїесппоіюду 14: 845-851 (1996)| та/"або З константні регіони людини. Миші отримані з відповідних генотипових ліній можуть бути використані в імунізаційних процесах та процесах злиття для одержання моноклональних антитіл людини до 1-12.

Імунізація

Один чи більше імунізаційних регламентів можуть бути використані для одержання гібридом анти-1І/-12 людини, перші декілька злиттів можуть бути виконані після наступного зразкового протоколу імунізації, але можуть також бути використані й інші відомі подібні протоколи. Декілька 14-20-и тижневих самок та/або хірургічно кастрованих трансгенних самців мишей імунізовано ІР та/або ІО з 1-1000н9 рекомбінантних 1-12 людини емульсованих з рівним об'ємом ТІТЕЕМАХ чи повного адюванту Фройнда з остаточним об'ємом 100-400 (напр., 200). Кожна миша може також необов'язково отримати 1-10ц9 в 100щі фізіологічного розчину на кожний з двох 50 сайтів. Миші потім можуть бути імунізовані на 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 та/або 21- 34 день після ІР (1-400д9) та 5О (1-400ддхг2) емульгованими 1-12 з рівним об'ємом ТІТЕКМАХ чи неповним адювантом Фройнда. У мишей може бути взята кров на 17-25 та 25-40 дні після ретро-орбітальної пунктири без антикоагулянта. Потім кров може бути залишена для зсідання при КТ на одну годину, а сироватка зібрана й титрована 1-12 ЕІА пробою відповідно до відомих методів. Злиття виконуються коли повторювані ін'єкції не призводять до підвишення титру. В цей час, можуть бути передані в фінальну ІМ посилену ін'єкцію 1-400рн49 11-12 розсинених в Тобі фізиологічного розчину.

Трьома днями пізніше, миші можуть бути евтаназовані шийною дислокацією та асепрично видалено селезінку та поміщено в 10ті холодного фосфатного буферного розчину (РВ5), котрий містив 100Ш/ті. пеніциліну, 100дд/ті. стрептоміцину, та 0.25нд4/ті. амфотеріцину В (РБЗА). Клітини селезінки збиралися стерильною перфузією селезінки РБА-РВ5. Клітини відмивалися одноразово в холодному РБА-РВБ5, підраховувалися ексклюзією з використанням барвнику Трипану синього та ресуспендувалися в середовищі

ЕРМІ 1640, яке містило 25тМ Нерез.

Злиття клітин

Злиття проводилося при відношенні від 1:11 до 1:10 клітин мишачої мієломи до життєздатних клітин селезінки, відповідно до відомих методів, тобто методів відомих з літератури. Як не обмежуючий приклад, клітини селезінки та клітини мієломи можуть бути пелетовані разом. Пелети потім можуть бути повільно ресуспендовані, за 30 секунд, в тт. 5095 (м/у) розчину РЕС/РВЗ (молекулярна маса РЕС 1.450, 5ідта) аї 37"С. Злиття потім може бути зупинено повільним додаванням 10.5тп!. середовища КЕРМІ 1640, яке містить 25М Нерез (37"С) на протязі 1 хвилини. Злиті клітини центрифугуються на протязі 5 хвилин при 500- 1500об/хв. клітини потім ресуспендуються в середовищі НАТ (ЕРМІ 1640, яке містить 25тМ Неревз, 1095 сироватки Ембріонального Клону І (Нусіопе), 1тМ пирувату натрію, 4тМ І--глютаміну, 1Одд/ті. гентаміцину, 2.590 культуральної добавки Огідеп (Різпег), 1095 653-стандартизованого ЕРМІ 1640/середовища Нерев,

БОМ 2-меркаптоетанолу, 100фМ гіпоксантину, 0.4дМ аміноптерину, та 16дМ тимідину) та потім поміщені в г00ш лмеї!! в п'ятнадцяти 96-луночних платівках з плоским дном для тканинної культури. Платівки потім поміщали у зволожений інкубатор при 37"С з 595 СО» та 9595 повітря на 7-10 днів.

Визначення до Анти-1ІІ-12антитіл людини в сироватці миші

Для скринінгу мишиних сироваток на Ідо антитіла специфічні до І--12 людини може бути використано твердофазну ЕІА"5. Коротко, платівки можуть бути вкриті ІЇ/-12 в кількості 2нд/ті. в РВ5 на ніч. Після відмивання в 0,15М сольовому розчині, котрий містить 0.02905 (м//) Твин 20, лунки можуть бути блоковані 1905 (м/у) ВБА в РВ5. 200щші/лунку на 1 годину при КТ. Платівки можуть використовуватися негайно чи заморожені при -207"С для подальшого використання. Розведена мишина сироватка інкубується на вкритих

І/-12 платівках з 50 /лунку при КТ на протязі одного часу. Платівки відмиваються й тестуються 50ді /лунку

НАР -міченими козячими дос до людини, Ес специфічно розведених 1:30,000 в 1906 ВБА-РВ5 на протязі 1 години при КТ. Платівки знову можуть бути промиті та додаванням 100ці/лунку розчином цитрат- фосфатним субстрату (0.1М лимонної кислоти та 0.2М фосфату натрію, 0.019565 Нг2О» апа 1тад/т/. ОРО) на протязі 15 хвилин при КТ. Потім додається стоп-розчин (4Н сірчана кислота) в кількості 25йі /лунку та вимірюється 005 при 490пт на автоматизованому пластинчастому спектрофотометрі.

Визначення повністю людських імуноглобулінів в гібридом них супернатантах

Декретування ріст-позитивними гібрид омами повністю людських імуноглобулінів може бути визначено придатним ЕІА. Коротко, 96-лункові платівки з виступами (МУ, 610744) можуть бути вкриті 1Орна/ті. козячими до Ес до людини в буфері карбонату натрію на ніч при 4"С. Платівки відмивають та блокують 195

ВЗА-РВ5 на протязі 1 години при 37"С й можуть використовуватися негайно чи заморожуватися при -20"С.

Нерозведені супернатанти гібридоми інкубуються в платівках на протязі однієї години при 37"С. Платівки відмивали та тестували НЕР-міченими козячими дос каппа до людини розведеними 1:10,000 в 1956 ВБА-РВ5 на протязі однієї години при 37"С. Платівки потім інкубували як описано вище.

Визначення реактивності повністю людських Анти-1Ї -12

Гібридоми, такі як вище описано, можуть бути одночасно опротестовані на реактивність до 1-12 з використанням КІА чи іншого тесту. Наприклад, супернатанти інкубуються козячими ДС Ес до людини платівках, як зазначено вище, відмито і потім випробувано радіоміченим 1-12 з відпорною кількістю на лунку на протязі однієї години при КТ. Лунки промивали двічі РВ5 та зв'язаний радіомічений 1-12 підраховевався відповідним лічильником.

Гібридоми, що секретували анти-ІЇ-12 Іде! людини можуть бути розвинені в клітинній культурі та послідовно субклоновані в лімітуючому розведенні. Одержані клон альні популяції можуть бути розширені та кріоконсеквовані в заморожуючому середовищі (9595 ЕВ5, 5956 ОМ5О) й збережені в рідкому азоті.

Ізотипування

Визначення ізотипу антитіл може бути проведено з використанням ЕЇА у спосіб подібний до того, який було застосовано для скринування імунних сироваток мишей на специфічні тітри. І--12 може бути нанесений на 96-лункові платівки, як описано вище, та очищені антитіла 2дд/ті. можуть бути інкубовані на платівках на протязі однієї години при КТ. Платівки відмиваються та тестуються козячими до до людини чи

НЕР міченими козячими ІдОЗ до людини розведеними 1:4000 в 195 ВБА-РВ5З на протязі однієї години при

ЕТ. Платівку знову відмивають й інкубують з субстратним розчином як показано вище.

Кінетика зв'язування антитіл людини до 1-12 людини з 1-12 людини

Характеристики зв'язування антитіл можуть бути прийнятно оцінено за допомогою, наприклад, 1-12 захвату ЕЇА та ВіАсоге їесппоІоду. Ступінчасті концентрації очищених антитіл до 1-12 людини можуть бути протестестовані на зв'язування на платівках ЕЇІА, вкритих 2рдад/ті. антитіл І-12 за методом, описаним вище.

Оптичтична щільність може бути представлена як напівлогарифмічний графік, який відображає відносну ефективність зв'язування.

Може бути отримана кількісна константа зв'язування, наприклад, як показано далі, чи будь-яким іншим придітним методом. Чіп ВідАсоге СМ-5 (карбоксиметил) поміщують в ВіАсоге 2000. Буфер НВ5 (0.01М

НЕРЕЗ, 0.15М Масі, ЗтМ ЕОТА, 0.005965 м/м Р2О сурфактант, рН 7.4) пропускається через потік клітин чіпу із швидкістю бні/хв до досягнення вихідного рівня. Розчин (10041) 5тд ЕС (М-етил-М'-(З-диметил- амінопропіл)-карбодиїмід гідрохлорид) в 200ціЇ води додається до 100! розчину 2.3т9 ої МН (М- гідроксисукцинимід) в 200йіЇ води. Сорок (40) ші! одержаного розчину ін'єктується на чіп. Шість ші розчину

І--12 людини (15дд/ті. в 10тМ ацетату натрію, рН 4.8) ін'єктується на чіп, що призводить до збільшення са. 500 КО. Буфер замінюють на ТВ5/Са/Ма/В5А проточний буфер (20тМ Трис, 0.15М хлориду натрію, 27М хлориду кальцію, 27 М ацетату магнію, 0.595 Тгтйоп Х-100, 25на/т!. ВЗА, рН 7.4) та протікає через чіп на протязі ночі для його зрівноваження та гідролізу або блокування будь-яких непрореагованих естерів сукциніміду.

Антитіла розводять в проточному буфері при 33.33, 16.67, 8.33 та 4.17пМ. Швидкість потоку доводиться до ЗОді/хв., а температура приладу до 25"С. Дві проточні комірки використовуються для кінетичних досліджень, на одній з яких були імобілізовані І/-12 (зразок), а друга була чистою. На 12041 кожної концентрації антитіло інєктувалося при потоці клітин ЗО /хв. (асоційовна фаза), що виконувалося при безперервному потоці буферу Зб0Осек (дисоційовна фаза). Поверхню чіпу регенерували (дисоційований комплекс Інтерлейкін-12/антитіло) двома послідовними нанесеннями Збді 2М тіоціанату гуанідіну.

Аналіз даних проводили з використанням оцінювання ВІА 3.0 або СІ АМР 2.0, як відомо з рівня техніки.

Для кожних концентрацій антитіла чисті сенсограми віднімалися від сенсограм зразків. Глобальні вирівнювання виконувалися як для дисоціацій (Ка зес"), так і для асоціацій (Ка то!" вес") та була визначена константа дисоціації (Ко, тої) (Ка/ка). Де афінність антитіл була високою настільки, що КО захоплених антитіл були »100, проводилися додаткові розбавлення антитіл.

Результати та обговорення

Вироблення 1-12 моноклональних антитіл людини

Було виконано декілька злиттів і кожне злиття висівалося в 15 платівок (1440лунок/злиття), що дало декілька дюжин антитіл до 1-12 людини. З них було виявлено деякі, що мали ланцюги Ід людини та миші.

Всі інші гібридомні секрети анти-1І--12 антитіл містили лише важкі та легкі ланцюги людини. Усі гібридоми людини мали бути Ід.

Кінетика зв'язування антитіл проти 1-12 людини

Аналіз ЕГІЗБА підтвердив, що очищені антитіла більшості з цих гібридом зв'язують І/-12 у спосіб, залежний від концентрації. Фігури 1-2 демонструють результати відносної ефективності зв'язування цих антитіл. В цьому випадку, вимірювалася авидність антитіл до їх спорідненого антигену (епітопу). Має бути відзначено, що зв'язування 1//-12 безпосередньо з платівками ЕІА може бути спричинено денатурацією протеїну, і такі афінності зв'язування не можуть бути відображенням зв'язування не денатурованого протеїну. 1595 зв'язування було відмічено в ряді концентрацій.

Чисельна константа зв'язування антитіл людини одержувалася за допомогою тесту ВіАсоге та показала, що деякі моноклональні антитіла людини мали дуже високу афінністю зі значенням Ко в межах від 1х10 до 7х10-12,

Заключання

Деякі злиття виконуванися з використанням клітин селезінки з гібридних мишей, які були імунізовані ІІ. - 12 людини, котрі мали трансгени варіабельного та константного регіонів антитіл. Було одержано набір моноклональних антитіл реактивного (ДО до повністю людських 1-12 антитіл з ізотипу (91. Далі буде описано повністю людські анти-1ІЇ-12 антитіла людини. Деякі з одержаних антитіл мали константи афінності від 1х109 апа 9х1012, Неочікувано високі афінності цих повністю людських моноклональних антитіл роблять їх придатними для терапевтичного застосування при захворюваннях, патологіях чи подібних станах, пов'язаних з 1І--12.

Приклад 3: С340 нейтралізує моноклональні антитіла людини

Було показано, що біологічна активність 1-12 може бути нейтралізована на різних тестах, пов'язаних з активністю 1-12. Оскільки І--12 підсилює вироблення ІЕМ САММА МК-клітинами та Т-лімфоцитами, було вивчено дію антитіл С340 на підсилюючу регуляцію ІЕМ САММА та дію антитіл С340 на вироблення протеїну ІЕМ САММА Пііпепієті, (х., Сштепі Оріпіоп іп Іттипоіоду, 9: 17-23 (1997), Могтів, 5. С, вї аї., дошпаї! ої Іттипоіоду, 152: 1047-1056 (1994)). Здатність С340 нейтралізувати І--12 спрямоване індукування клітин- кілерів активованих лімфокіном (ГАК), також була досліджена в цих роботах |Киїга, У. апа Мигазко, 0. М.,

Меспапівтв ої Адеїпд апа ОємеІортепі, 90: 209-222 (1996), 5ієет, А. 5., єї а)., Ргосеєдіпдз ої Ше Майопаї!

Асадету ої бЗсіепсе5 ої їйпе у. 5. А., 87 : 6308-6812 (1990)). На закінчення, було протестовано на Т- та МК- клітинах вплив С340 на підсилюючу регуляцію поверхневої клітинної експресії СО95, опосередкованої ІІ. -12.

ІМедмедем, А. Е., єї аі!., Суїокіпе, 9: 394404 (1997)|.

Інгібування транскрипції ТЕМА ІЕМ датта

Було виконано аналіз оберненою РСК-транскрипцією, для визначення того, чи С340 інгібує 11-12, транскрипцію гену ІЕМ САММА індукованого 1--2 в РВІ. людини. Були застосовані специфічні праймери р- актину (контроль цілісності та вмісту тЕМА) та ІЕМ САММА для ампліфікації СОМА одержаної із стимульованих РВІ людини. Фігура З показує, що С340 негативно регулює ІЕМ САММА тЕМА в РВМО активованих 1--12/1І -2 (2 години).

Інгібування внутрішньоклітинного ІЕМ САММА визначене проточною цитометрією

У відповідь на різноманітні сигнали та як показник активації Т- та МК-клітини можуть бути індуковані до секреції цитокінів. Більш докладно, РВІ., оброблені 1-2 та 1-12 ініціюють значне вироблення ІЕМ САММА на протязі 4-8 годин після стимуляції. Продукування в цитоплазмі може бути визначене проточною цитометрією РВІ, оброблених ВгетеІдіп-А. Фігура 4 показує 6095 зниження вироблення ІЕМ САММА в культурах, де було додано С340 ІІ -12 в поєднанні з 1-12 на протязі п'яти годин.

Інгібування секреції ІЕМ САММА індукованої 1-12

Фігура 5 ясно показує, що два різні зразки С340 інгібують секрецію ІЕМ САММА лімфоцитами периферичної крові у залежний від дози спосіб. 400 пікограм було додано до різних кількостей С340 та потім додано до культури РВІ,, стимульованої 1-12. коли визначали ІЕМ САММА за допомогою ЕЇА через 18-24 години інкубування, було виявлено значне зниження кількості ІЕМ САММА із вмістом антитіл С340 менше ніж 1 ?д/ті.

Інгібування цитотоксичності І АК-клітин, індукованої 1-12

Клітини Каї), клітинна лінія чутлива до 1-12, одержана з лімфоми Буркіта, що є резистентними МК- клітинами. Клітинні лінії чутливі до ГАК-клітин. Клітини Каїї, в триплеті. Було культивовано на протязі чотирьох годин з ГАК-клітинами, котрі були активовані 400рда/ті. 1-12 та 10ШО/т/. 1-2 в присутності чи відсутності моноклональних антитіл людини С340 (5000пад/ті. ог 50пд/т/). Фігура 6 показує результати від тьох нормальних здорових донорів. Активація 1 -12--ІЇ -2 разом, ефекторних клітин призвела до підвищення цитотоксичної активності більше ніж активація одним 1І--2. антитіла С340 інгібували цей, залежний від 1І--12, ефект. Потужність підсилення залежала від концентрації антитіл, при найвищій концентрації цитотоксичність повернулася до фонових значень.

Інгібування регуляції стимулювання С0У5

Доклад описує регуляцію підвищення СО95 на поверхні високо очищених СО56-РВІ.. Як видно з фігур 7А та 7В, розподільний проточний цитометричний аналіз виявив, що експресія СО95 була в значній мірі стимульована на СОЗ«Т-клітинах апа СО56-МК-клітинахпісля оброблення їх 1-12 плюс 1-2 на протязі 72 годин. Супутнє оброблення анти-1Ї-12 інгібувало експресію СО0О95 як в СОЗ- та і в СО5б популяціях.

СОЗхклітини було інгібовано на 5095, тоді як СО56 - було інгібовано на 8595 (Фігура 7В), що підтверджується показником МРЇ (процент більший у нестимульованого контролю).

Приклад 4: Клонування генів та ідентифікація

Геномні фрагменти ОМА, котрі містили ген важкого ланцюга С340 або легкого ланцюга С340 було клоновано та очищено. Геном на ОМА очищена з гібридом них клітин С340 була частково оброблена рестрикцій ним ферментом заизА та розділена за розмірами центрифугуванням в 10-4095 сахарозному градієнті. Фрагменти ОМА із розмірами в межех 15-23Кр біли клоновані в бактеріофапговий вектор, ЕМВІ 3, (комерційно доступний 7) та упаковано в бактеріофагові частки. Деякі реакцій пакування дали в результаті бібліотеку в 1 мільйон клонів бактеріофагу.

Приблизно 600,000 клонів з бібліотеки було скриновано бляшковою гібридизацією із застосуванням фрагментів геномної ОМА міченої 32Р, котрі включали як послідовність константного регіону важкого ланцюга ІДС1 людини або послідовність константного регіону легкого ланцюга карра людини як зразок.

Було знайдено тринадцять клонів важких ланцюгів та девять легких ланцюгів. З них, три клони важких ланцюгів та два з клонів легких ланцюгів було виділено додатковими двома циклами скринінгу. За допомогою РСК-аналізу ОМА бактеріофагу, було показано, що один з клонів важкого ланцюга та два клони легкого ланцюга містили 5' та 3' кінці кодуючої послідовності. Вставка ОМА у клон НА важкого ланцюга (НС) мала розмір 16Кр та включала 3.6КБЬ 5'-кінцевої та як мінімум 2КЬ 3'-кінцевої послідовності. Вставка ОМА у клон НА легкого ланцюга (І С) мала розмір 15КЬ та включала 4.4КЬ 5'-кінцевої та як мінімум 6.ОКЬ 3'-кінцевої послідовності. Вставки повністю було видалено з вектору бактеріофагу як ЗаіІІ-фрагменти та клоновані між сайтами Хпої! та Заї! вектору експресії плазміди р1351, котрий має селективний маркерний ген орі. Оскільки вони були зовнішніми ЗаїІ-сайтами у послідовності, що кодує варіабельний регіон важкого ланцюга, два

ЗаіІІ-фрагменти мали бути перенесені з бактеріофагу НА до вектору експресії рі351. Одержані плазміди експресії важкого ланцюга та легкого ланцюга було названо ріб5б60О та рі558, відповідно. Орієнтація генів важкого та легкого ланцюгівв цих двох плазмідахвідносно до послідовності вектору рі351 було визначено за допомогою аналізу ферментами рестрикції та РСЕ, відповідно. В обох випадках орієнтація була такою, що 5-кінець гену АБ був наближений до 3'-кінця гену дрі. Обидва напрямки кодуючи регіонів клонованих генів було секвеновано. Послідовності плазмід рі560 та ріІ558 представлено на Фігурах 11А-11К та Фігурах 1ЗА-13, відповідно.

Приклад 5: Одержання рекомбінантних клітинних ліній

Плазміда рі560 важкого ланцюга була лінеаризована обробкою ферментом рестрикції Руці та плазміда рі558 лінеаризована обробкою ферментом рестрикції За. рахб3зА9д8. 653 (653) та 5Р2/0-Адії (5Р2/О0) клітини були окремо трансфектовані додаванням лінеаризованиз плазмід електропорацією, клітини культивувалися та трансфектанти селектувлися із застосуванням мікофенольної кислоти, як описано в

ІКпідні, еї аЇ. Моїіесшаг Іттипоіоду 30: 1443 (1993)). Клітинні супернатанти Х колоній, резистентних до мікофенольної кислоти тестувалися на протязі двох тижнів на (до людини (напр., рекомбінантний С340 (пї5340)). Для цього, клітинні супернатанти інкубували в 96-луносних платівках ЕГІБА, котрі були вкриті антитілами козла специфічними до Ес частини (Дб людини. ЇДб людини, котрий зв'язувався з вкритими платівками визначався за допомогою лужної фосфатази, конюгованої з антитілами козла до (до людини (важкий ланцюгнлегкий ланцюг) та субстратом лужної фосфатази як описано ІКпідні, еї а!., Моїесшаг

Іттипоїіоду 30: 1443 (1993)). Клітини з високо продукуючи клонів було перенесено в 24-лункові культуральні чашки в стандартному середовищі та збільшено (селективна суміш ІМОМ, 595 ЕВ5, 2тМ глютаміну, мікофенольна кислота).

Кількість вироблених антитіл (напр., секретованих в середовище відпрацьованих культур) точно підраховувалося за допомогою ЕГІЗА, з використанням С340 тАбБ, як стандарту. Відібрані клони потім розширювали у колбах 175 і вироблення до людини цими клонами підраховувалося за допомогою ЕГІЗА.

Грунтуючись на цих значеннях, шість незалежних трансфектантів 653 та три незалежних трансфектантів 5Р2/0 було субклоновано (висіюванням в середньому однієї клітини в кожну лунку в 96б-лункових планшетах), Кількість антитіл вироблених субклонами підраховувалася за аналізом ЕГІ5А супернатантів з індивідуальних колоній субклонів. Було відібрано три субклони: трансфектант 653 19-20 (С3798) та трансфектант ЗР2/О 84-81 (С3814А) та 22-56 (СЗ89А), для подальшого аналізу.

Аналіз зв'язування антигену гС340

Перед субклонуванням відібраних клітинних ліній, як описано вище, клітинні супеннатанти з трьоз батьківських ліній (трансфектант 653 клон 2 та клон 18 та трансфектант 5Р2/0 клон 1) були використані для тесту на зв'язування гС340. Спочатку за допомогою ЕГІЗА було визначено концентрації "С340 в трьох зразках супернатантів. Титровані кількості зразків супернатантів, або очищеного С340 контролю, потім інкубували в 96-луносних планшетах вкритих 2на/т! І/-12 людини. Зв'язок тАр потім детектували за допомогою лужної фосфатази конюгованої з антитілами до до людини (важкий ланцюгилегкий ланцюг) та відповідним субстратом лужної фосфатази. Як показано на Фігурі 8, "2340 специфічно зв'язується з 1-12 людини таким самим способом як і оригінальні С340 тАб.

Ідентифікація відібраних клітинних ліній

Аналіз кривої росту було виконано на С3798, СЗ814А, та СЗ89А, висіюванням у колби 175 із початковою щільністю клітин 2Х105клітин/т!І в стандартному середовищі або безсироватковому ЗЕМ-5 середовищі й подальшим щоденним моніторингом кількості клітин та концентрації /Сб340 до виснаження клітин.

Результати культур на стандартному середовищі представлено на Фігурах 9А-96.

Максимальні рівні вироблення С340 тА для С379В, С381А, та СЗ89А були 135на/ті, 150рна/ті, та 110дд/ті, відповідно. Спроби адаптувати клітини С379В до середовища 5ЕМ-5 не дістали успіху. Клітини

С381А виробляли таку саму кількість "С340 в середовищі ЗЕМ-5, як і на стандартному середовищі.

Стабільність вироблення "27340 тА в часу для трьох субклонів оцінювалася культивуванням в 24- лункових планшетах із стандартним середовищем або із стандартним середовищем без селекції мікофенольною кислотою в різні періоди часу. Лінії С379В та С381А виявили стабільне вироблення /гС340 в присутності та відсутності селектору на протязі 30 днів (максимальний час тестування) та 75 днів відповідно. Лінія СЗ89А була нестабільною й після 43 днів культури виробляла лише максимум 2095 антитіл від початку вивчення.

Стає зрозумілим, що винахід може бути здійснений інакшим способом ніз частково описано в приведеному описі та прикладах.

Можливі численні модифікації та варіанти даного винаходу в світлі показаного вище, а також в межах приведеної формули.

. ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «ІН: Шилі, Девід: Найт, Девід; Скеллон, Берні; Готес-Комар, Джіля; Перріт, Девід «іже АНТИ 12 АНТИТІЛА, КОМПОЗИЦІЇ, СПОСОБИ ТА ВИКОРИСТАННЯ «1305 СЕМО45 «1650» 15 «170» Рея ет 70 «10 1 «В «10 РЕТ «Тіз» Нощо варієре «Ас 1

Ті Тук Яр Ти (У 1 Е «5» «і» Ії «І» РЕТ «132 Мото вареов «А

Пе Меєег Рто УЗ Авр бат зр Це ге Тут Чех Ро Мех Рре сни 1 5 ни 15 су «210» 3 І «іх юЮ «Зм РЕТ «23» Ношще зарієне «Ак 3

Дек Ав то Су Сів Су Тук Рів Аяр БВ 1й 5 16 «ох «11» її «17» РЕГ «21325 Бошо варівня «ох 4

Ат Аїв бех Спа ЗІУ Пе бек Заг тр Гей Ав і 5 юю «10» 5 «І 7 «рій» ВВЕ «213» Нопо зарісце «дО 5

Ав Аза Бех Зех Це іп 5ех 1 5 «10 6 «І» 9 - «122» РЕТ «2132 Ното вапівва «А» 6

Сів Сію Тух Ап Де Кук Рго Тут ТЕ 1 5 ох 7 «из Нео «12» ВРЕТ «із Ното вивісву «ад» 7

Св Уві сів еи Уві Сп ет Су Ада Он Уа! Туя Був Ро ЗУ С

Н 5 10 15

Бек Гей Був Пе бет Суб уз Су Зег Су Тут Бех Роде Те ТВ Тух

КІ

Теріа У Тер Уа Ате сів Ме Рго СПУ уз Су Ген Аяр Тер Те 33 40 45

Оу Це Мас бст Рго Уві Авр Зех Ар Пе Аху Тух Бех Ріо ет Ве 50 55 50 сів слу ін Уа! ТЕ Меї Бех Уві Аяр їгує Зех Це Тк ТОК Ав Ту 55 70 7 80

Соч Зі Тер Асп Бег їі Гуз Ада ет Ар Тв АВ Ме тую Тух Сук 55 59 95

Ав Ат Ахе Ату Ріо пу бів Су Тут Ре дер Те Тур ЛУ Св СТУ 100 105 їЮю

Твсіси уві є Мі Бог Вег 115 «МО» 8 «іх 108 «ие РЕЖ «3» Ното зарієпе «ох

Авр ті бів Ме Твт бір бек хо бек дек пеп Веж Аза бек уві СІ1уУ 1 а 160 ї8 дАвр Акта Ууаї ТАЖ І1е Тк Су АкЯ Він Бех Зір Зіу їіїє Чек йех Тх» 20 28 зо

Бема вла Тер тух бів зіп бує Рхо Зі» пув Аза Рко Був бех Пви її «0 і5

ТУух вів Аів бек бек іс сів бек со1у Уаїі Ро Зек йде Вб Вех 01у ва 55 І-1

Бек СІ1У Бак біу ТІ дДлр Ре Тк Гей Тк їЗа бах бах Пец біп Бо 65 70 75 на

ФІо дар о рРВе Аза Тих Тук Тук був сіп біп Тук Ап ї1ї6 Тут РуОо Тух 85 20 Зв

Так де піу піп Ту ТВх Пує цей біз ї3Зе Гув Ах 109 105 «2102 а «і» 303 «12» РЕТ «3». Ношо зарієні «ох В вхо дв обец ко Ууаі Аза Тс Ртго Агро Ехо біу Ме ББе рхо Сув Пе ії 5 Що ї8

БКів Нів бех Зіп АБ би гез Ака Аза уаї Бек дви Мес Пе іп Мув 2 25 30

Аа Ах бій Так опе) зій не тТук Ро Сув ТВЖ Бех біз зЗіз їТе Дар

ЗЕ 35 45

Нів біз дер ї1е Тпс буз Авр о Був Так Бех ТЬжх Уа 91 Аза Сув беч во 25 БО хо ей 41 беб о їйк був Ввп осі бат був Бей дво бек Ах біз Тв. 70 75 80

Зек Рпе їЛе ТБЕ Авпосіу Бех Су Пец Аіїа Бех Аке був Так Бек Вде ва 98 55

Мес Мен о діва Бей Суб Їнех Зеж бек Іїфе ТУкК іч бер рев Був меж Тук а 105 115 бів Чві сі вБе пуз Тк Меб Авп Аія Був пед без Меб Аврорхо Пув 115 120 125 вга бід І1є Ве пео дяр бів Ави Мес їнмі Аза Уаі Те дар 3 цей

Жао і35 134

Мей сів ва Бей двп оре Ав Бех Сій Та Маї ко їй Був дек беж 145 150 їі58 160

Беца бій Що хо др о Рве Тух Мув Тнж Був Її Мув пей Сун Ті Бей ї55 29 75 їви Нія дія Ре дку ІТ1є Аку діа уаі лпж Т1іє Авно йку уні Меб беє жаб їв 185 тТук їву дей Аїа Бек їЗе Тхр січ Бей Був цув Авроуаі Тук чаї Чаї 155 250 898 біз їева АвроТкротух Ро Авродіз вхо Зіу бів мес УуУаії Маї пеп Ту 210 215 Неяи спуя вив ТВт бкс віч іч Авросіу Т1з тТрх тТкроТат ей вро біп бек аа ав 235 29 беж Яїй Маї їв) 01У бех п1у Був Тих Пе ТК ї1е Збій Уа) пуб І:

245 850 255

Зме 01у Авр одіз 01іу 515 Тух ЖБх Суб нів пув сту 01уУ сій уаї їв 285 265 270

Бек Вів Бех Пе) ев рей Бе) нів Ппує пуз бі дя» Зіу хів тТжв Бех 275 4385 285

Так днр їїе паз Був Аврозів був їй ко Муз Ав ув Жак Ве їх 235 285 305

Ака Сув сіш Аза цув дев Тут Бех Сіу Аку Ре ТНХ Сує Тер Тр рей зов зло зії за тТвх тах їІЗе бау ТВжЖ о Абр обез тре Рйа бек Чаї Був бех Бех Ака БіуУ з25 За з дек бек дер рко біп 0іУу Уві ТВх Сув піу Віа Аза лу їви бек іа 340 за5 зо

Зі дк уаї ву Б3іу Авр ода пу уч тТук біз тТух Веж узі с Мі Сун 355 360 з55 сій біз дар Бех Аза Сув Бо діа Аза 1 біз бек бей ро Т1е Піч 170 375 380 чаї Ме чаї АБр діа Чаї Нів Був Пец бує Тух бі) лад Тух ЖК бек 385 394 395 оо

Бах Бе На 1128 ДК Авороїіє тї1є Був РЕ Аврорхо рт Ппув дви їв 05 410 415 «ій вч був РО ек Буя Ав) бек Ахо іп уаї зі Уву беж Тхр б жа же 430

Тук Рго Авр оту Ткр Бех Тнх Бго йід Бех Ту РБа бак ей Тпж Ве «35 «40 448

Сув уві 10 Уві біз зі цу Зег Бу Аха Зій був Пув Аво Джо чаї 455 455 чей вне ТІ Ав цув Тпх Бек Атїа ТБх Заз її був ху дує дввоАіз бек «в ато «78 ад їїе Вех Уаї Ахо Аїа зів Авр о Ахоа Тук Тут Бех Беж бех Тхр Бех 1 «85 439 2955 ткр'Аїа Бех Маії Рко Суб вах 50о0 «0: юЮ «і» я «міх ДНК «1» КНоло зарікая «Ае 1 вевівізсія Сас 15 «ІН 1 «1» 2135 ДНК

«13» «Ното варієтя «нах Лі рова са анар спжванає всвіанасі ссетованнв с зі «210 15 «211» 30 «2122 ДНК «215» Нощо зарієвх «щю» кевнссовтє пасе с Ниряс Ко «ре 13 «І» 33 «о» ДНК «213» Нато вабієйе «ах 3 силової вевссаріса рарівцвре вистав; сс 33 «Зх й «4 21 «312» ДНК «із /Номю варікоє «аю М атесвісох асавоксе 18 «Зх 15 «аБім 27 «22» ДНК «132: Ното зврісхів «цю 5 саксадсвіа ясавсівисої 21 25 . поіжті -О341 2.0 ес: лЬЯ --02 5340 н- о А | --С2333 сх "а ся» 0883 х й

Е зв. ще: - 331

З ке Ж --0330 з В Ша ЧИ: --0329 0.5. с Б на 00 ОТ ня 10.000 .000 0190 0010 в.О0

Код мк мл очищених мат

Фіг А ої 4 і -- СБ

ЖЕ зо --- св п й пнів а 05 Сб дол -ее :

ОБО 0о500 00050 00005

Концентрація антитіл (мкг/мл)

Фіг. 18

ГУ г в

Е 8 : 2 Е ї г ч а а що т 5 - т ШЕ

Ук ж : і

Ж хх а 8 Е Є ч я я З - Ге щ

М о

Се о ре ! появ зе жа

КК Кт 5 Шннй

ТК З ШЩИЙ Ї

Укр уве о: 00 това оЕатв БУШНЙ

ЕЛЕКТ ор кВ яви тий я шли лу, НН 4

В кН ! чи ик тирсу ЗДА п і и НН зі о и В и УТ вк рос лесинх ти я супи Б сер фл вит нн Й ;

Фіг, 2А 5 Е гЗ я

Ж Ю

« 2 і 4 Е г кі - Е їі

ВХ є вх т шо З х ж ХЕ Ж щ хх й й я 5

ЗЕ г. З с - В ж 5

КУН и о Я

НА

ПО пЬ хи к "ей соди ване ну а М ЕН

ТЕКИ сту ВН сум екв нене ект о з ШИ й м

Бен и

Ша ик и зд я: кн - яЯх ад «ра у

ШТ ту ст КИ М

Оп ен

ТОК, ав о

ПК кет їх хи зх НИ ово пи а са І

Б хи ШЕ бля ев нар АВ :

Фіг. 28

Донор 141 Понор 1457 пев ОВа о ПО ВН ОК Кс В доби и зве ни о МК А Сан й ен ан а и КБ Веде пане в НА Ваш и НН с

В вн Екон у І. Контроль

ДАНО о КРУ СО ВК КВ ЕН Я 2. цх 3. А пвх пут то ВН ся ОД я. певні

В ОМ я поки ні В

ПО Ах ПЕН ВН о 5. ПАН. 126340 вна р А ов 6. ПАС а о Ва и о СИ тк м иа о в (ізотиповий контроль для СЗ340 се ня В З я п т. оон тво о п ни КН НУК вже Ми, Е - ша в Ж. СОНАТА жен в ізотиповий контроль для 8.8.2) и іч ти Р ! пн КИ о р КЕ КИ ща НЕ

Фіг. З г

З о. - х

Е.А т що в во

У 8 гЯ гЗ 70

Х во ж

Ж тв х еЕ 1 г ща 8 зв ко 20 р во о їх ж в пан МИ

МАЛІ ПАТ -2 -С340

Характеристикі культур. .

Фіг. 4

«вка. : я ЗО Со у - аг 3064 кА у, У зксою ЦДнЕ

Е зате зов Бек чне еф зх й ни ов ли жо ях ою вв як дю» чо вх ж чик ою жи з сво же де і ин

В ; З г, с щ р

Ж ло. :

Е ї ; ш ай наван и и

Концентрація антитій (пгмп)

Фіг. 5

Щ 5000 нгіми

ШАБО -чнс/мя - «0

Б

Ге я х з 30 е - о ЗИ

Б. ЗИ 1035 . о Їй Кк "И Ди

Фіг. 6

У д х

Бу 2 шо ве я а 1 | ІА т: Шиж оСтимо 340 АВ

Я з хх ет : 25 8 о

ЕК оо. 55 шах 7 55

ЇХ я

Ге г 5

ЗЕ 9

Характеристикі

Фіг. 7А

Б

5 ж

Е зо. га в

Е Е 375

В Б жо.

Е ї сна зн? аж з25. 9 шт з СЗАб тА

Її є

ЕЕ з Ще

У

Зх в 50

ЕВ х е Ех

ВЕ Характеристикі

Фіг. 78

І -- очищ; (5340 ва --5Б5З клон 2 078 --653 клон 18 а -сю- БРОЮ «клон З їі а56 025 ао уперта : ! тп таз тал 102 КТеВ мксіма 1340

Фіг. 8 ша | 160 снів КліТИНІМА с379в 140 я мкг/мл о зво тя 126 2 зо я

Ж їдою о є

З | 80 5.окчо ; б

Обктоа ся хни и вик й 01238567 8 о 01119134

Днів Й

Фіг. ЗА "Тез. зо й 140 и ідо. І 420

З . : 100

Б зомоз б Е м й охо т охо : нт ; 1234887 8 8з01119544

Днів

Фіг. 98

ЗДО мент тот тт тттн зво. Кпітин/мл

СЗ8ЗА зїа0 007 мкг/ми 1.Бкідря- ї2а

Е той є -8. р 5 1010 а Е а 50 й і І в оо нт - гомо ї т 12345579 101112153154

Днів .

Фіг. 90

Claims (6)

1. Ізольоване моноклональне антитіло людини, що зв'язується з І/-12, яке має варіабельний регіон важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 7, та варіабельний регіон легкого ланцюга, що містить 5ЕО ІЮ МО: 8.

2. Ізольована нуклеїнова кислота, яка кодує ізольоване моноклональне антитіло людини, що зв'язується з ІЇ-12, яке має варіабельний регіон важкого ланцюга, що містить ХЕО ІО МО: 7, та варіабельний регіон легкого ланцюга, що містить зБЕО ІЮ МО: 8.

3. Прокаріотична або еукаріотична клітина-хазяїн, яка містить ізольовану нуклеїнову кислоту за п. 2.

4. Фармацевтична композиція, яка містить ізольоване моноклональне антитіло людини, що зв'язується з ІЇ-12, яке має варіабельний регіон важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 7, та варіабельний регіон легкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮО МО: 8, та принаймні один фармацевтично прийнятний носій або дилюент.

5. Спосіб діагностування станів, пов'язаних з 1-12, який включає контактування композиції, яка містить ефективну кількість ізольованого моноклонального антитіла людини, що зв'язується з ІЇ-12, яке має варіабельний регіон важкого ланцюга, що містить ЗЕО ІЮ МО: 7, та варіабельний регіон легкого ланцюга, що містить ЖЕО ІО МО: 8, з досліджуваним матеріалом.

6. Спосіб лікування станів, пов'язаних з ІІ -12, який включає введення пацієнту, що потребує такого лікування, композиції, яка містить ефективну кількість ізольованого моноклонального антитіла людини, що зв'язується з ІЇ- 12, яке має варіабельний регіон важкого ланцюга, що містить 5ЕО ІС МО: 7, та варіабельний регіон легкого ланцюга, що містить ХЕО ІЮ МО: 8.