UA44709C2 - Спосіб oдержання пеніциліну чи цефалоспорину - Google Patents

Abstract

Спосіб ферментативного oдержання пеніцилінів чи цефалоспоринів шляхом взаємодії бета-лактамових циклів із амідами. Реакція каталізується ферментом пеніцилін-ацилазою і проходить за наявності інгібіторів ферментів.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение касается усовершенствованного ферментативного способа получения 2 пенициллинов и цефалоспоринов формулі и ЇЇ то єр 5 - рий Н .

Я о -ке ! я (1)

Мне сч й ду о (о) зо о М де р о « 35 0 Н «І в которьїх Х обозначаєт З или СНо, К является 6б--ленньім необязательно замещенньім углеводороднь!м -о с кольцом, а гі является атомом водорода, атомом галогена, метильной группой, метокси-группой,

С.-С,-алкенильной группой, или метиленовой группой, связанной с органическим радикалом атомами 1754 :з» кислорода, серь! или азота. в О5-А-3816253 описьіваєтся способ получения пенициллинов или цефалоспоринов путем взаймодействия у-замещенной ос-аминокислоть с производньм 7-аминоцефалоспорановой или їз 7-амино-дезацетокси-цефалоспорановой кислотьі в присутствиим активньїх микроорганизмов или фермента в водном растворе, при температуре от -5"С до 50"С, предпочтительно между ї20"С и 140"С. Обнаружено, что пи при проведений процесса как описано в патенте США вьїход желаемого целевого продукта сильно понижен -І из-за сопутствующих параллельньх реакций, образующих побочнье продукть!, которье трудно вьіделить из реакционной смеси. о В ЕР-А-0473008 предлагается метод получения пенициллинов и цефалоспоринов формуль! І или Ії, которьй

Ге; предназначен для того, чтобьі устранить или, по крайней мере, уменьшить вьішеупомянутье недостатки.

Согласно зтому методу, б-аминопенициллановая или 7-аминоцефалоспорановая кислота взаймодействует с о-замещенной о-аминокислотой формуль! К-СН(МН»)-СООН или ее реакцион-носпособньм производньім в присутствий иммобилизованной пенициллин-ацилазьї, причем реакция проводится в вздной среде при температуре между -57С и 420"7С, и предпочтительно при температуре около 4760. іФ) Условия реакции ясно изложеньії в ЕР-А-0473008, где также подробно описаньі 25 примеров получения ко желаемьїх конечньїх продуктов с очень хорошими вніходами (9095 или более).

В связи с зтим следует отметить, что способ может бьіть промьішленно внедрен, только если вьіходь бо достаточно вьісоки (около 9090) и конечньїй продукт легко очищается. ос-замещеннье о-аминокислотьі и их реакционно-способнье производнье для использования в качестве исходньїх веществ упоминаются в ЕР-А-0473008 в общих фразах, а единственной конкретно упомянутой аминокислотой является лишь метиловьій зфир Ю-фенилглицина.

Заявители провели многочисленнье тщательнье зкспериментальнье исследования, следуя методике, 65 описанной в примерах, данньх в ЕР-А-0473008. Однако, полученнье результатьь оказались полностью обескураживающими.

В зтом отношений, бьіло подтверждено, что, если в реакционной среде молярное отношение упомянутьх аминокислот составляет менее чем 4 моля на моль используемой б-аминопенициллановой или 7-аминоцефалоспорановой кислоть!, вьіїход желаемого конечного продукта оказьівается очень низким (менее чем приблизительно 6055), и, по существу, является промьішленно неприемлемьм.

Хорошие, промьшленно приемлемье вьходь получень), только если количество метилового зфира

ЮО-фенилглицина в реакции находится в отношений от 4 до б молей на моль используемой б-аминопенициллановой или 7-аминоцефалоспорановой кислоть.

Однако, в зтом случае имеет место не только неприемлемое повьішение стоимости (цена метилового зфира 7/0 ЮВ-фенил-глицина очень вьісока), но, кроме того, образование побочньх продуктов, которье трудло или невозможно удалить из желаемьїх конечньїх продуктов реакции - пенициллинов или цефалоспоринов.

Бьіли предпринять! попьіїтки использования различньїх зфиров Ю-фенилглицина или зфиров различньх аминокислот. Однако, все зти попьітки оказались безуспешньми.

Столь же отрицательнье результать! бьіли полученьї при использований различньїх реакционно-способньх /5 производньх аминокислот.

В заявке на патент Германий 0О5 2214444 сообщаєтся о ферментативном синтезе цефалоспоринов (в частности, цефа-лексина) путем взаймодействия 7-АЮСА (7-аминодезацетокси-цефалоспорановой кислоть!) с амидом фенилглицина в присутствий фермента пенициллин-ацилазьї. Полученньсе вьіходь! очень низки.

В РСТ/ОК9У1/00188 (УУ092/01061) и РСТ/ОКО2/00388 (УУ093/12250) сообщаеєтся о способах получения р-лактамовьїх антибиотиков путем ферментативного ацилирования, в соответствий с коториіми амид формульї (І)

МН» К т

З

І о)

М з, (ІІІ) я » Ко: о ча (0 « « взаймодействует с б-аминопенициллановой или 7-амино-цефалоспорановой кислотой в присутствий иммобилизованного фермента пенициллин-ацилазь. «

Зти методь! могут бьіть внедреньі. Обнаружено, однако, что заметное количество амида (ІІ) гидролизуется самим ферментом, увеличивая, таким образом, количество примесей в желательньїх конечньїх продуктах. о, с Небольшое количество конечного продукта также гидролизуется тем же ферментом. "» Еще при первоначальном применении пенициллин-ацилазь (Е.б.3.5.1.11) стало известно, что зтот фермент " ингибируется в присутствий фенилуксусной кислотьї, фенокси-уксусной кислоть! и/или других ингибиторов, в присутствий которьїх фермент утрачиваєт активность, и катализ имеет тенденцию к прекращению. Зто является проблемой при ацилирований р-лактамовьїх циклов, которьіе могут содержать следь! фенилуксусной кислоть, ве феноксиуксусной кислотьї или других ингибиторов. ї» Вплотную встала проблема поиска ферментов,для которьїх не проявляется зтот тип ингибирования (см.

О0.О.М. Куц еї аї., Віоїесппоїоду апа Віоепдіпеегіпд 1985, мої. ХХМІІ, радез 953-960; А.М.ВііпКомузКу еї аї., - Епгуте Місгоріа! Тесппоіоду 1993, мої. 15, радез 965-973). Бьіли отобраньї ферменть! (часто именуемье как о 20 ампициллин-ацилаза или амидаза, цефалоспорин-ацилаза или амидаза, цефалексин-синтезирующий фермент и т.п.), имеющие происхождение из различньїх микробиологических источ-ников (видь! Асейфобасіег, видь ср Хапіотопаз). Однако, ни один из зтих ферментов не имеется в продаже, они также не производятся в больших масштабах, как бьло бь необходимо для промьшленного применения. Таким образом, зтот подход оказьівается непригодньїм из-за того факта, что требуются значительнье инвестиции в исследования с целью 22 завершения разработки конкретного катализатора для синтеза р-лактамовьх антибиотиков.

ГФ) Другой метод преодоления ингибирования фермента состоит в том,чтобьї удалить названнье ингибиторь! до оказания ими воздействия на ферментативное ацилированиєе, например, путем зкстракции органическим о растворителем, как описано в РСТ/ОКОУ1/00188. Основньм недостатком зтого метода является именно использование органических растворителей. Так как ферментативное ацилирование бо р-лактамовьїх ядер вводится именно для того, чтобьі обойтись без указанньїх растворителей и, следовательно, добиться, чтобь! процессь! бьіли зкологически безопасньми, то из зтого следует, что такой подход все еще не дает удовлетворительньзх результатов.

При проведений конкретньїх исследований реакций, катализируемьх пенициллин-ацилазой, заявители неожиданно открьгли, что указанного ингибирования можно избежать и, слндова- бо тельно, провести синтез Д-лактамовьїх антибиотиков в присутствий даже больших количеств вьішеупомянутьїх ингибиторов. В некоторьїх случаях оказьваєтся даже возможньм использовать ингибирование фермента в полезном для синтеза отношений, как описано ниже, путем введения определенного количества ингибитора, которьїй изначально отсутствует или присутствует лишь в мальїх количествах.

Следовательно, настоящее изобретение относится к усовершенствованному ферментативному процессу получения пенициллинов и цефалоспоринов формул (І) и (І) соответственно, определяемьх как и ранее, в котором б-аминопенициллановая или 7-аминоцефалоспорановая кислота формули (ІМ) или (М) ; ший Н до о о

Н а о |: ( І у )

СХ. в которьїх Х и гі имеют значения, определеннье вьіше, взаимодействуют при температуре между -5"С и с -35"С, в присутствий фермента пенициллин-ацилазьі в свободной или иммобилизованной форме, с амидом о формульї (І)

МН Кз ' Ф 30 . | , . (ав) к щ І ча

КЕ Ще ( ) ві 35 . «І дю в которой К имеют значения, определеннье вьіше, Ко и Кз являются каждьй независимо атомом водорода -о или линейной либо разветвленной С.4-Сз алкильной группой, или с его солями, в молярном отношений от 1 до 6 с моль указанного амида (ІІ) на моль кислоть! (ІМ) или (М), заключающимся в том, что в реакционную смесь :з» добавляют ингибитор фермента формуль!

Кг, -и-сСН- Ко ї» | (УТ ) ї Ке -І Й Й Й Й Й

К; является линейной либо разветвленной С 4-С5ь алкильной группой, замещенньм или незамещенньм о ароматическим кольцом, галогеном или протоном, у может отсутствовать или, в случає присутствия, (Че) обозначать О, 5, СНо, фенил или галоген; г5 является карбоксильной группой, линейньм либо разветвленньім С4-С; зфиром или -СОМН» группой;

КЕ представляет Н, ОН, ОСНО или СНУ»; при зтом ингибитор присутствует в молярной концентрации от 0,0001 до 0,5.

В частности, указанньй ингибитор (МІ) присутствует в молярной концентрации от 0,0005 до 0,2 и внібираєтся іФ) из числа фенилуксусной кислоть, феноксиуксусной кислотьі и миндальной кислоть, и (линейньх или ко разветвленньїх) Сі-Св5 амидов и зфиров зтих кислот.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим пенициллинь! или бо цефалоспоринь, полученнье описанньім в настоящем изобретениий способом, и фармацевтически приемлемьсе разбавители или носители.

Фармацевтические составьї, содержащие пенициллиньії или цефалоспориньі, обьічно готовятся стандартньіми методами и вводятся в организм в подходящих фармацевтических формах.

Что касается формул (І) и (ІІ), К может бьіть, например, фенильной группой, циклогексадиенильной группой б5 Мли циклогексенильной группой, незамещенной или замещенной гидро-ксилом, галогеном, алкилом, алкоксигруппой, карбоксилом, нитро-или -аминогруппой.

Ку может бьіть атомом водорода, атомом галогена, метиль-ной группой или метиленовой группой, связанной с органической группой, в особенности с алкоксигруппой или алкоксикарбонильной группой или 5- или б--ленной гетероциклической группой, содержащей от 1 до 4 гетероатомов из числа О, 5 и М, присоединенной к

Метиленовой группе атомом О, З или М и необязательно замещенной одной или более группами из числа следующих: гидро-ксил, галоген, алкил, алкокси, карбонил, карбокси, циано, амино и т.п.

Мспользованнье здесь терминьї алкил и алкокси относятся к группам, включающим от 1 до б атомов углерода, и предпочтительно, от 1 до 4 атомов углерода. о-аминокислоть, имеющие амидь! формуль! (ПІ, включают, например,О-фенилглицин, 70. О-пара-гидроксифенилглицин и 0-1,4-циклогексадиен-1-ил-глицин.

Подходящими солями амидов являются соли неорганических кислот, таких как соляная, плавиковая, бромистоводородная, серная или азотная кислота, или органических кислот, таких как уксусная, муравьиная или малеиновая кислота.

Из соединений формул (М) и (М) особьй интерес представляют следующие 7/5 Кислоть:б-аминопенициллановая кислота (6-АРА), 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота (7-АОСА), 7-амино-цефалоспорановая кислота, 7-амино-3-хлорцефало-спорановая кислота, 7-амино-З-метоксицефалоспорановая кислота, 7-амино-фенацетилдезацетоксицефалоспорановая кислота, 7-аминофенокси-ацетилдезацетоксицефалоспорановая кислота, 7-амино-3-хлор-карбацефем, пенициллин о и пенициллин У.

Пенициллин С или М и 7-аминофенацетилдезацетоксицефало-спорановая кислота обьічно используются как сьірье для получения 6-АРА и 7-АЮСА соответственно, которне далее используются для получения ампициллина,амоксициллина, цефалексина и цефадро-ксила. Вплоть до настоящего времени бьіло необходимо удалять фрєнилуксусную или феноксиуксусную кислоту из зтих промежуточньїх соединений (6-АРА и 7-АОРА), для того чтобьї иметь возможность использовать их в реакциях ферментативного ацилирования, как описано в Га РСТ/ОКО1/00188. Возможность синтезировать зти соединения в присутствий ингибиторов обозначаєт, что синтез может успешно протекать без необходимости очистки промежуточньїх продуктов, что приводит к о большой зкономичности способа и возможности избежать использования органических растворителей.

Ингибитор фермента может либо присутствовать в реакционной смеси в начале синтеза, либо добавляться в любой момент во время протекания реакции. Указанньій ингибитор может бьть также добавлен в конце Ге»! ферментативной реакции, чтобьії облегчить вьіделение продукта и последующую обработку в целом.

Ферментом, используемьм в качестве катализатора в настоящем способе является о пенициллин-амидогидролаза, классифицируемая как Е.С.3.5.1.11 (известная также как пенициллин-ацилаза, ч- пенициллин-гидролаза ампициллин-ацилаза и т.д.) полученная из любьїх микробиологических источников и, в частности, из штаммов Хапіотопавз, Рзейдотопаз, Агіпгорасіег, Кісумега, Асефобрасіег, Евзспегіспіа, Васіййв или З Асготопаз. Ферментьі), полученнье из естественньїх или искусственньїх штаммов Езспегіспіа сої особенно «Ж предпочтительньї. Некоторье из них имеются в продаже в больших количествах и в иммобилизованной форме.

Фермент может бьіть использован в свободной форме (т.е. растворимой) или может бьіть иммобилизован на твердой матрице. Из числа последних особенно предпочтительньі! подложки, специально предназначеннье для « иммобилизации биомолекул, такие как синтетические зпоксиднье или азлактоновье смольі.

Пример!1 - с Синтез цефалексина путем ферментативного ацилирования 7-АЮСА О(-)фенилглицинамидом. ц 9г (42ммоль) 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислотьі и 15,7г (10О0ммоль) 0Б(-)фенилглицинамида "» растворяли в воде (конечньій обьем З0Омл). Раствор охлаждали до приблизительно 4"С и доводили рН до 6,8, затем перемещали в охлаждаєемьй реактор, связанньій с регулирующей системой (далее назьваемой здесь рН-стат), поддерживающий рН постоянньім путем автоматического добавления 4 н серной кислоть. ьч 540010) фермента пенициллин-амидогидролазьі в иммобилизованной форме (на азлактоновой или зпоксидной смоле) добавляли к вьішеуказанному раствору, поддерживая постояннье значения 4"Си рн 6,8. т Спустя приблизительно 75 минут фермент вьіделяли из раствора путем фильтрации. К раствору добавляли -І около 4 г р-нафтола, растворенного в разбавленном растворе каустической содь (едкого натра). Бьіло о 50 Вьіделено 16,6бг продукта в виде комплекса цефалексин/р-нафтол с молярньїм вьіходом 7495 от исходного цикла. Из комплекса с рД-нафтолом 3е) бьл затем получен (согласно известньім методикам) вьісококачественньій моногидрат цефалексина.

Пример2 Синтез цефалексина в присутствий фенилуксусной кислоть. 17г (0,077моль) загрязненной 7-аминодезацетокси-цефалоспорановой кислотьї, содержащей в качестве примеси 1,1895 фенилуксусной кислоть! и 1,6395 7-аминофенацетилдезацетокси-цефа-лоспорановой кислоть,и о 42,68г (0,28моль) Б(-)фенилглицинамида растворяли в воде до конечного обьема бООмл.

Устанавливали рН-стат на рН 7,6, а термостат на 2"С, использовали 756010) иммобилизованного фермента и їмо) затем проводили реакцию как описано в Примереї. Реакцию прерьшвали Через 5 часов ЗО минут и отфильтровьівали пенициллин-ацилазу. Продукт осаждали бг р-нафтола, получая молярньй вьїход 87,595. 60 Затем получали моногидрат цефалексина как описано в Примере 1.

Примерз

Синтез цефалексина из 7-аминофенацетилдезацетоксицефало-спорановой кКИслОтЬІ и

Б(-)фенилглицинамида. 16г (0,04вмоль) 7-аминофенацетилдезацетокси-цефало-спорановой кислоть! растворяли в воде, добавляя 65 достаточное |количество)| разбавленного Маон, чтобь! достичь рН 8,0, после чего раствор нагревали до 28"С и разбавляли водой до конечного обьема 320мл, а затем перемещали в подходящий реактор, связанньй с рН-статом и погруженньй в баню с регулируемой температурой.

Около 140001) фермента пенициллин-ацилазьї в иммобилизованной форме добавляли к зтому раствору (раствор А), поддерживая при зтом постоянньй рн 6,8 (путем добавления 2 н Маон) и постоянную температуру.

Водньй раствор Д(-)фенилглицинамида при концентрации около 180г/л (раствор В) готовили отдельно.

После приблизительно двух часов протекания реакции к раствору А добавляли около 190мл раствора В, корректируя при необходимости рН и температуру. Значение рН поддерживали постоянньім путем добавления 4 н серной кислоть.

Семь часов спустя фермент удаляли фильтрования под вакуумом. Цефалексин вьіделяли из полученного /о раствора путем осаждения комплекса цефалексин/р-нафтол в количестве, соответствующем молярному вьїходу 80,80.

Моногидрат цефалексина достаточного для продажи качества вьіделяли из комплекса цефалексин/Я-нафтол согласно известньїм методикам.

Примері использование ингибиторов в ферментативном ацилирований 7-амино-3-хлорцефалоспорановой кислоть.

Реакцию проводили как в Примере!, однако использовали 9,85г (0,04 Моль) 7-амино-3-хлорцефалоспорановой кислотьі. По окончании реакции добавляли 1,5г фенилуксусной кислоть, растворенной в разбавленном Маон, после чего осаждали комплекс цефаклор/Я-нафтол, как зто описано в Примерах 1-3 в отношений цефалексина.

Молярньїй вьїход 7-амино-3-хлорцефалоспорановой кислотьі составил 70956. Моногидрат цефаклора бьл получен разложением комплекса цефаклор/Я-нафтол (согласно известньім методам).

Примербо

Ферментативное ацилирование б-аминопенициллановой кислоть! в присутствийи ингибиторов. б-аминопенициллановую кислоту (обозначаемую здесь далее как 6-АРА) получали из пенициллина о сч ферментативньм гидролизом, используя известнье методь, и вьіделяли из водного раствора путем осаждения кислотами. Полученньй таким образом продукт содержит примеси 20,8г влажной загрязненной 6-АРА с і) содержанием основного вещества 8095 (0,077 бмоль) орастворяли в воде и смешивали с

Б(-)фенил-глицинамидом как описано в Примере2, с получением раствора, содержащего около 0,7г/л фенилуксусной кислотьі. Добавляли 6670 единиц пенициллин-ацилазьь и проводили реакцию как описано в б зо Примерег. Степень конверсии 6-АРА составила 82490.

Примерб о

Гидролитическое ингибирование (пенициллин б)-ацилазьі в процессе синтеза цефалексина в присутствий фенилуксусной кислоть. 13г (60,7ммоль) 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислотьі (7-АЮОСА), 46,5г (230,84ммоль) « зв Гидрохлорида метилового зфира О(-)фенилглицина и 140мг (1,03ммоль) фенилуксусной кислоть! растворяли в «Е воде до конечного обьема 1000мл.

Ацилирование проводили при помощи 17,5г (300013) (пенициллин С)-ацилазьі, в условиях начального рн 7,25 и температурь! З3"С.ОЧерез приблизительно З часа 9395 7-АЮОСА превратилось в це-фалексин.

При степени конверсии 7-АЮОСА в цефалексин 9396 молярное отношение произведенного синтетического « Чефалексина к образованному гидролитически О-фенилглицину составило 2,15 в сравнениий с отношением 1,44, пт) с полученньїм без ингибитора.

Claims (1)

1. ;» Формула винаходу їз 1. Способ получения пенициллина или цефалоспорина формульї (І) или (І): » чн, М МН, Н - М 5 а СН ан Х («в) 3 (че) (о) Кен о ло р о, ОН | о Кк, о; (Ф, (І) о он , (1) іме) где Х обозначает З или СН», К является б--ленньмм необязательно замещенньім углеводородньім кольцом, а Кі, является атомом водорода, атомом галогена, метильной группой, метоксигруппой, Со 4-С;-алкенильной 60 группой или метиленовой группой, связанной с органическим радикалом атомами кислорода, серь! или азота, в котором б-аминопенициллановая или 7-аминоцефалоспорановая кислота формули (ІМ) или (М) б5

   НОМ І , Ши о ОН о І 7 о о он (М) що о о о о которой Х и К) имеют значения указаннье вьіше, взаймодействует при температуре между -570 и 35-С, в присутствий фермента пенициллинацилазь! в свободной или иммобилизованной форме, с амидом формульі (ПІ) м МН, В, М ? с з (0; о в которой К имеет значения указаннье вьіше, Ко» и Кз являются каждьій независимо атомом водорода или линейной либо разветвленной С.1-Сз алкильной группой или с его солями, в молярном отношений от 1 до 6 моль указанного амида (Ії) на моль кислотиь (ІМ) или (М), отличающийся тем, что в реакционную смесь добавляют Ге! зо ингибитор фермента формуль! (МІ): «в) в; -СН-В, в ій

   Е. « бо (МІ) где Ку. является линейной либо разветвленной С 41-С5 алкильной группой, замещенньім или незамещенньм « дю ароматическим кольцом, галогеном, протоном; У может отсутствовать или, в случае присутствия, являться о, 5, -о СН», фенилом или галогеном; с К5 вьібирается из числа карбоксильной группьї, линейньїх либо разветвленньїх С4-С. зфиров или -СОМН» :з» группь; Ке вьібираєтся из Н, ОН, ОСНО или СН»; 15 при зтом ингибитор присутствует в молярной концентрации от 0,0001 до 0,5. їз 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что молярная концентрация указанного ингибитора предпочтительно составляєт от 0,0001 до 0,2. т» 3. Способ по любому из пп. 1 и 2, отличающийся тем, что указанньйй ингибитор (МІ) внібирается из группь! -1 соединений, состоящей из фенилуксусной кислоть!, феноксиуксусной кислотьї, миндальной кислоть и (линейньх или разветвленньйх) С4-Сз амидов и зфиров зтих кислот. (ав) 4. Способ по любому из пп. 1 и 2, отличающийся тем, что указанньій амид (І) вьібирается из группь! с соединений, содержащей Ю-фенилглицин и его соли с органическими или неорганическими кислотами. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2002, М З, 15.03.2002. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. іме) 60 б5