UA129189C2 - Застосування інгібіторів казеїнкінази 1 для лікування судинних захворювань - Google Patents

Abstract

Винахід стосується застосування PF-670462 для запобігання і/або лікування серцевої недостатності у пацієнта, який страждає від зазначеної серцевої недостатності. 1

Description

Даний винахід відноситься до застосування інгібіторів казеїнкінази 1 для лікування судинних захворювань, переважно захворювань периферичних кровоносних судин і серцево-судинних захворювань. Даний винахід також відноситься до відповідних способів лікування.

Незважаючи на значні вкладення коштів у фундаментальні та клінічні дослідження серцево- судинної системи, серцево-судинні захворювання залишаються найважчою і найскладнішою проблемою охорони здоров'я в усьому світі: щорічно від них помирає більше 17500000 людей (що становить 47 95 всіх випадків смерті, викликаних неінфекційними захворюваннями). До 2030 року глобальні витрати на лікування серцево-судинних захворювань зростуть до 1,04 трильйона доларів, тим самим перетворивши дане порушення здоров'я в серйозну загрозу для світової економіки.

Гіпертензія являє собою фактор ризику номер один для всіх серцево-судинних захворювань: вона збільшує ризик серцевого нападу, серцевої недостатності (СН), інсульту і ниркової недостатності. Кожна третя людина страждає підвищеним артеріальним тиском.

Однак, оскільки у гіпертензії мало ознак або симптомів, більшість випадків залишається невиявленими. Залишається неясною причина розвитку гіпертензії у людей: можна пояснити тільки 10 95 випадків гіпертензії. Розуміння гіпертензії є ключем до запобігання та лікування серцево-судинних захворювань.

Мікросудинні дослідження вивчають структуру і функцію найдрібніших кровоносних судин (прекапілярних артеріол і посткапілярних венул) в здоровому стані і при захворюваннях.

Резистивні артерії являють собою "гарячі точки" в серцево-судинній системі, які регулюють як середній артеріальний тиск (САТ), так і перфузію тканин, і відповідають за створення найбільшої частини загального периферичного опору судин (ТРК). Отже, зміни їх структури і функцій (наприклад, через хвороби або старіння) негайно впливають на перфузію тканин і САТ.

Резистивні артерії являють собою невикористану можливість поліпшити здоров'я серцево- судинної системи. Розуміння структурних і молекулярних основ функції мікросудин в здоровому стані і при захворюваннях відкриє ряд нових терапевтичних стратегій.

Сучасні способи лікування, націлені на мікросудини, не відповідають стандартам, оскільки вони не покращують функцію органів і з їх допомогою важко підбирати ефективні дози без значних побічних ефектів. Наприклад, підвищений міогенний тонус при СН підвищує ТРК і викликає "дисбаланс постнавантаження", який призводить до згубних довгострокових впливів на топографію шлуночків і серцеву функцію. Фактично, навіть короткочасне збільшення постнавантаження викликає значне поширення інфаркту. Отже, оцінювали декілька стратегій, які знижують постнавантаження серця при СН, однак, з обмеженим успіхом. Хоча зниження постнавантаження на серце може принести користь для серця, судинорозширювальні засоби (наприклад, оксид азоту) несуть ризик усунення міогенної реактивності і небезпечного зниження

ТРК і артеріального тиску.

Міогенна реактивність і вплив на системну гемодинаміку: у 1902 році сер Вільям Бейлісс (МУШіат Вауїїз5) виявив, що підвищення трансмурального тиску змушує резистивні артерії "крутитися, подібно хробаку" (тобто звужуватися). Це спостереження, пізніше назване міогенною відповіддю?2?, описує таке динамічне регулювання діаметра кровоносних судин до зміни перфузійного тиску. Як випливає з етимології його назви (міо - м'яз, генний - утворений), міогенна відповідь створюється шаром гладких м'язів судинної стінки?8; анатомічно міогенна відповідь є властивістю прекапілярних дрібних артерій і артеріол (тобто "резистивні артерії" малого діаметра функціонально відрізняються від провідних артерій великого діаметру).

На системному рівні закон Ома вказує, що міогенна реактивність резистивних артерій матиме значний вплив на ТРЕ і САТ». 10, Це позиціонує резистивні артерії як "функціональні гарячі точки" в декількох патологічних процесах, які характеризуються змінами перфузії тканин і лабо системної гемодинаміки, включаючи кардіоміопатію!!, СІН'2З, діабет! 15 і гіпертензію 5. Їй мімо, резистивні артерії скелетних м'язів помітно модулюють ТРК, оскільки дане судинне русло формує найбільшу мережу кровообігу в організмі 7.

Зворотна сигналізація ТМЕ як регулятор міогенної реактивності: раніше, в дослідженні, присвяченому вивченню резистивних артерій скелетних м'язів'ї, авторами винаходу було продемонстровано, що фактор некрозу пухлини (ТМ), а точніше його мембранозв'язана версія (птТМЕ), є конститутивним механосенсором, який керує міогенними реакціями в резистивних артеріях скелетних м'язів при непатологічних умовах. Відповідно, повна делеція гена ТМЕ в гладком'язових клітинах або блокування ТМЕ за допомогою етанерцепту послаблює міогенну реактивність резистивних артерій скелетних м'язів і, отже, знижує системний кров'яний тиск.

Примітно, що інгібуюча дія етанерцепту на міогенну реактивність артерій скелетних м'язів зберігається у п'яти різних видів, включаючи людину. Механістично, тТМЕ перетворює 60 механічне навантаження, яке накладається на судинні гладком'язові клітини, в сигнал ззовні-

всередину (тобто "зворотний сигнал" через ТМЕ), який з'єднується з встановленими внутрішньоклітинними міогенними сигнальними елементами (наприклад, ЕКК 1/2 і сфінгозинкіназа 1). Такий неканонічний механізм зворотної сигналізації ттТМЕ, мабуть, унікальний для резистивних артерій скелетних м'язів'8,

Казеїнкіназа 1 являє собою модулятор зворотної сигналізації ТМЕ: цитоплазматичний домен

ТМЕ не має помітної ферментативної функції і, отже, передає сигнали через пов'язані білки, включаючи казеїнкіназу 1 (СК1). Примітно, що еволюційний тиск зберіг сайт фосфорилювання

СКІ ТМЕ у декількох видів, припускаючи, що він виконує ключову функцію У. У цьому відношенні фосфорилювання ТМЕ діє як "перемикач активності" і забезпечує гнучкий механізм модуляції функцій зворотної сигналізації ТМ.

СК'І являє собою сімейство з 7 універсально експресованих мономерних серин/греонінових протеїнкіназео.

Хоча всі ізоформи СК! мають висококонсервативний домен кінази, вони значно розрізняються за своїми некаталітичними М- і С-кінцевими доменамиг-" 22: ці домени відіграють вирішальну роль в регуляції активності кінази, локалізації кінази і субстратної специфічності іп мімо2!23, Оскільки ізоформи сімейства СК1І проявляють подібну субстратну специфічність іп мійко?Я, їх різні біологічні функції іп мімо (наприклад, сегрегація хромосом, формування веретена, циркадні ритми, ядерний імпорт, сигналізація УУпі шляху і виживання/апоптоз клітин) майже повністю виникають через відмінності в локалізації, стикувальних послідовностях і партнерах по взаємодії??,

Усі ізоформи СК! є конститутивно активними і тому класифікуються як "кінази, які не залежать від вторинного месенджера". Встановлено, що СК! фосфорилює "приміровану" (попередньо фосфорильовану) консенсусну послідовність 5(Р)-Х-Х-5, де "(Р)" являє собою "примірований" фосфосерин, "Х" являє собою будь-яку амінокислоту, і "5" являє собою цільовий серин, який фосфорилює СК120. Оскільки ефективне розпізнавання субстрату потребує фосфорильованого серинового залишку, СКТІ часто фосфорилює субстрати разом з іншими кіназами?о, що узгоджується з механізмом ієрархічного фосфорилювання»,

Технічна проблема, яка лежить в основі цього винаходу, полягає в забезпеченні нового режиму для поліпшення міогенної реактивності в периферичній системі кровоносних судин.

Згідно з цим винаходом термін "поліпшення міогенної реактивності в периферичній системі кровоносних судин", означає поліпшення міогенної реактивності, особливо при захворюванні або стані, відповідно, при якому міогенна реактивність погіршується, зокрема, в контексті специфічного захворювання і стану, відповідно, як більш детально описано нижче. У здорового суб'єкта, порівняно з міогенною реактивністю в периферичній системі кровоносних судин суб'єктів, які демонструють погіршену міогенну реактивність в периферичній системі кровоносних судин, зазначена міогенна реактивність нормалізується або щонайменше змінюється в напрямку нормалізованого значення.

Рішення зазначеної вище технічної проблеми забезпечено варіантами здійснення цього винаходу, розкритими у формулі винаходу, цьому описі і супровідних графічних матеріалах.

Авторами винаходу виявлені чудові засоби для зниження ТРК шляхом вибіркового впливу на механізми, які модулюють окремі частини міогенної реактивності. Специфічна модуляція судинного русла міогенної реакції покращує кровотік і функцію органів при повному збереженні нормальних фізіологічних регуляторних механізмів.

Згідно з цим винаходом сполуки, які змінюють активність експресії СК! гладком'язових судин, впливають на зворотну сигналізацію ттТМЕ ії міогенну реактивність і, як наслідок, на загальний периферичний опір судин, кровотік в тканинах і системний кров'яний тиск. Оскільки змінена міогенна реактивність є ознакою багатьох захворювань (наприклад, серцевої недостатності, субарахноїдального крововиливу, діабету, інсульту, сепсису), націлювання на активність/експресію мікросудинного СК! може поліпшити мікросудинну міогенну реактивність і системну гемодинаміку при різних захворюваннях.

Більш конкретно, даний винахід відноситься до застосування інгібіторів казеїнкінази 1 (СК), тобто один або більше інгібіторів СК! можна застосовувати для запобігання і/або лікування судинних і/або серцево-судинних захворювань (СС3), таких як ішемічна хвороба серця (ІХС) (стенокардія та інфаркт міокарда (загальновідомі як серцевий напад), інсульт, серцева недостатність, гіпертонічна хвороба серця, ревматична хвороба серця, кардіоміопатія, порушення серцевого ритму, вроджений порок серця, пороки клапана серця, кардит, аневризми аорти, захворювання периферичних артерій, тромбоемболічне захворювання, венозний тромбоз, субарахноїдальний крововилив і гіпертензія, при цьому особливо переважні серцева недостатність, субарахноїдальна кровотеча і гіпертензія. 60 Згідно з цим винаходом, інгібітор СК! являє собою сполуку, яка знижує експресію і/або активність СК.

Переважні інгібітори СК! для застосування в цьому винаході являють собою інгібітори, селективні відносно ізоформ б СК1 (СК15, в інших випадках також згадувані як "СК10О") і/або є (СК1є, в інших випадках також згадувані як "СКТЕ"). У деяких варіантах здійснення переважно, коли інгібітор СК1 надає більш сильну інгібуючу дію на СК15, ніж на СКТє. Особливо придатні інгібітори СК1 для застосування в цьому винаході є інгібітори СК1, описані в М/О 2014/023271, більш переважно інгібітори СК! 04476, РЕ670462, ІС261 і РЕ4800567. Найбільш переважні інгібітори СКІ1 для застосування в цьому винаході являють собою РЕ-670462 і РЕ-4800567, які також можна застосовувати в комбінації. Іншими корисними інгібіторами СК! в контексті цього винаходу є селективні інгібітори СК15б, описані в публікації Заїадо еї аї. (2014 9). Мед. Спет. 2014, 57, 2755-2772, особливо ті, які представлені на фіг. 1, таблиці 1 і фіг. 2, причому сполука

М3-15 є найбільш переважною. Слід розуміти, що даний винахід також відноситься до застосування фармацевтично прийнятних солей, сольватів, складних ефірів, солей таких складних ефірів, а також будь-якого іншого аддукта або похідного, які при введенні пацієнту, який потребує цього, здатні прямо або побічно забезпечувати інгібітор СК1 для застосування за цим винаходом або його метаболіт або залишок.

Згідно з цим винаходом інгібітори СК! пригнічують експресію/активність СКІ1 ї знижують зворотню сигналізацію тТМЕ в судинних гладком'язових клітинах периферичних резистивних артерій, зокрема у пацієнтів, які страждають такими захворюваннями, як судинні та серцево- судинні захворювання (ССЗ), такі як ішемічна хвороба серця (ІХС) (стенокардія та інфаркт міокарда (загальновідомі як серцевий напад)), інсульт, серцева недостатність, гіпертонічна хвороба серця, ревматична хвороба серця, кардіоміопатія, порушення серцевого ритму, вроджений порок серця, порок клапана серця, кардит, аневризми аорти, захворювання периферичних артерій, тромбоемболічне захворювання, венозний тромбоз, субарахноїдальна кровотеча і гіпертензія, при цьому особливо переважні серцева недостатність, субарахноїдальна кровотеча і гіпертензія.

Згідно з цим винаходом інгібітори СКІ знижують фосфорилювання ЕгК1/2 гладких м'язів і сигналізацію сфінгозин-1-фосфату при таких захворюваннях, як серцева недостатність, зокрема, у пацієнтів, які страждають такими захворюваннями, як судинні та серцево-судинні захворювання (ССЗ), такі як ішемічна хвороба серця (ІХС) (стенокардія та інфаркт міокарда (загальновідомі як серцевий напад)), інсульт, серцева недостатність, гіпертонічна хвороба серця, ревматична хвороба серця, кардіоміопатія, порушення серцевого ритму, вроджений порок серця, порок клапана серця, кардит, аневризми аорти, захворювання периферичних артерій, тромбоемболічне захворювання, венозний тромбоз, субарахноїдальна кровотеча і гіпертензія, при цьому особливо переважні серцева недостатність, субарахноїдальна кровотеча і гіпертензія.

Згідно з цим винаходом інгібітори СК! пригнічують експресію/активність СКІ1 ї знижують периферичну міогенну реактивність, зокрема, у пацієнтів, які страждають такими захворюваннями, як судинні та серцево-судинні захворювання (ССЗ), такими як ішемічна хвороба серця (ІХС) (стенокардія та інфаркт міокарда (загальновідомі як серцевий напад)), інсульт, серцева недостатність, гіпертонічна хвороба серця, ревматична хвороба серця, кардіоміопатія, порушення серцевого ритму, вроджений порок серця, порок клапана серця, кардит, аневризми аорти, захворювання периферичних артерій, тромбоемболічне захворювання, венозний тромбоз, субарахноїдальна кровотеча і гіпертензія, при цьому особливо переважні серцева недостатність, субарахноїдальний крововилив і гіпертензія.

Згідно з цим винаходом інгібітори СКІ знижують загальний периферичний опір судин, зокрема, у пацієнтів, які страждають такими захворюваннями, як судинні та серцево-судинні захворювання (ССЗ), такі як ішемічна хвороба серця (ІХС) (стенокардія та інфаркт міокарда (загальновідомі як серцевий напад)), інсульт, серцева недостатність, гіпертонічна хвороба серця, ревматична хвороба серця, кардіоміопатія, порушення серцевого ритму, вроджений порок серця, порок клапана серця, кардит, аневризми аорти, захворювання периферичних артерій, тромбоемболічне захворювання, венозний тромбоз, субарахноїдальна кровотеча і гіпертензія, при цьому особливо переважні серцева недостатність, субарахноїдальна кровотеча і гіпертензія.

Згідно з цим винаходом інгібітори СКТІ знижують системний артеріальний тиск, зокрема, у пацієнтів, які страждають такими захворюваннями, як судинні та серцево-судинні захворювання (ССЗ), такі як ішемічна хвороба серця (ІХС) (стенокардія та інфаркт міокарда (загальновідомі як серцевий напад)), інсульт, серцева недостатність, гіпертонічна хвороба серця, ревматична хвороба серця, кардіоміопатія, порушення серцевого ритму, вроджений бо порок серця, порок клапана серця, кардит, аневризми аорти, захворювання периферичних артерій, тромбоемболічне захворювання, венозний тромбоз, субарахноїдальна кровотеча і гіпертензія, при цьому особливо переважні серцева недостатність, субарахноїдальна кровотеча і гіпертензія.

Згідно з цим винаходом інгібітори СК1 збільшують кровоток у скелетних м'язах, брижових, ниркових і коронарних судинах, зокрема у пацієнтів, які страждають такими захворюваннями, як судинні та серцево-судинні захворювання (ССЗ), такі як ішемічна хвороба серця (ІХС) (стенокардія та інфаркт міокарда (загальновідомі як серцевий напад)), інсульт, серцева недостатність, гіпертонічна хвороба серця, ревматична хвороба серця, кардіоміопатія, порушення серцевого ритму, вроджений порок серця, порок клапана серця, кардит, аневризми аорти, захворювання периферичних артерій, тромбоемболічне захворювання, венозний тромбоз, субарахноїдальний крововилив і гіпертензія, при цьому особливо переважні серцева недостатність, субарахноїдальна кровотеча і гіпертензія.

Згідно з цим винаходом дія інгібіторів СК! обмежена міогенним тонусом; звуження судин, викликане катехоламінами, не впливає на такі захворювання, як серцева недостатність, субарахноїдальний крововилив і гіпертензія.

Згідно з цим винаходом дія інгібіторів СК! обмежена периферичним і коронарним кровообігом; цереброваскулярна гемодинаміка не порушується при таких захворюваннях, як описані вище, зокрема при серцевій недостатності, субарахноїдальному крововиливі і гіпертензії.

Даний винахід також відноситься до інгібітора СК, переважно інгібітора СК, вибраного з тих, які більш детально описані вище, для застосування для запобігання і/або лікування судинних і/або серцево-судинних захворювань, як описано вище.

Даний винахід, також відноситься до способу запобігання і/або лікування судинного захворювання і/або серцево-судинного захворювання, як описано вище, що включає введення ефективної кількості щонайменше одного інгібітора СК!І, переважно щонайменше одного інгібітора СКІ1, вибраного з тих, що вказані більш детально вище, пацієнту, переважно який є ссавцем, зокрема людиною, яка потребує цього.

У цьому винаході показано, що дія селективного інгібування СК1б/є стабілізується, і, таким чином, зроблено висновок про теє, що максимальне інгібування СК1 здатне тільки частково зменшувати міогенне звуження судин. У відповідь на цей висновок, авторами винаходу був проведений додатковий експеримент для підтвердження ефективності інгібування СКІ при серцевій недостатності (СН) як приклад стану, який піддається лікуванню згідно з цим винаходом із застосуванням інгібіторів СК.

Згідно з цим винаходом можна застосовувати один або більше інгібітор(ів) СК! в його/їх вільній формі. В інших варіантах здійснення інгібітор(и) СК1 (тобто щонайменше один інгібітор

СК), який застосовується в цьому винаході, присутній у фармацевтичній композиції, яка містить зазначений щонайменше один інгібітор СК1, як правило, в комбінації щонайменше з одним фармацевтично прийнятним ексципієнтом, розріджувачем, наповнювачем і/або носієм.

Ефективна кількість інгібітора СК1, необхідна для застосування в способі застосування за цим винаходом, тобто конкретний рівень ефективної дози для будь-якого конкретного пацієнта або організму, буде залежати від множини факторів, включаючи захворювання, що підлягає лікуванню, і тяжкість захворювання; активність конкретної сполуки, яка використовується; конкретну композицію, яка використовується; вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать і дієту пацієнта; час введення, спосіб введення та швидкість виведення конкретної сполуки, яка використовується; тривалість лікування; лікарські засоби, які застосовуються в комбінації або одночасно з конкретною сполукою, яка використовується, і подібні фактори, добре відомі в області медицини.

Переважні дози в контексті цього винаходу, зокрема, переважних сполук, які згадуються в даному документі, більш конкретно РЕ-4800567 і РЕ-670462, становлять приблизно від 1 до приблизно 300 мг на кг маси тіла (далі позначення "мг/кг"), переважно приблизно від 10 до приблизно 100 мг/кг, більш переважно приблизно від 20 до 70 мг/кг, особливо переважно від приблизно 25 до приблизно 45 мг/кг, наприклад 30 мг/кг. Дозу можна вводити один або більше разів, наприклад, два або три рази на день. Переважно дози вводять один або два рази на день. Переважне введення одного або більше інгібіторів СК! здійснюють один раз на день.

Відомо, що багато серцево-судинних захворювань регулярно відбуваються в стані спокою, тобто вночі, коли пацієнти висловлюють занепокоєння. Таким чином, щонайменше один інгібітор СК! переважно вводять відповідно до режиму, який забезпечує максимальну фармакологічну дію щонайменше одного СКІ1 під час стану спокою суб'єкта, який піддається лікуванню, більш переважно в або приблизно в середині фази спокою, при цьому "приблизно в 60 середині фази спокою" переважно становить приблизно в проміжку від приблизно -2 до приблизно ї2 годин від середини фази спокою, більш переважно приблизно в проміжку від приблизно -1 до приблизно 41 години від середини фази спокою, навіть більш переважно в проміжку від приблизно -0,5 до приблизно 10,5 години від середини фази спокою. Для фахівця в даній області техніки очевидно, що режим, який забезпечує максимальний фармакологічний ефект щонайменше одного інгібітора СК1, залежить від вибраного інгібітора СК1. Наприклад, інгібітор СК, який демонструє порівняно швидке розкладання активної сполуки, можна вводити один раз на день у придатний час перед фазою спокою (тобто перед відходом до сну пацієнтів), наприклад, за 3, 4, 5 або б годин до фази спокою пацієнта. В альтернативних варіантах здійснення, де вибраний інгібітор СК! являє собою сполуку, яка демонструє повільне розкладання, інгібітор СК! можна вводити за допомогою композиції з контрольованим вивільненням, що забезпечує максимальний ефект, зазвичай максимальну біодоступну концентрацію у пацієнта, який отримує лікування, під час фази спокою, переважно в або приблизно в середині фази спокою (переважно відповідно до визначення, даним вище).

Фахівцю в даній області техніки відомі відповідні фармацевтичні композиції і/або режими дозування і введення, наприклад, конкретні інгібітори СК!І, більш детально описані в даному документі, для забезпечення вищеописаного максимального ефекту під час фази спокою.

Шлях введення інгібітора СКІ1 не має вирішального значення, і вибраний шлях залежить від індивідуальної сполуки, яка застосовується, або сполук інгібітора СК! і суб'єкта, який підлягає лікуванню. Переважно інгібіторби) СК! вводять системно, наприклад, перорально або внутрішньовенно, особливо переважно перорально.

Терміни "пацієнт" і "суб'єкт" застосовуються в цьому документі взаємозамінно і кожен означає тварина, переважно ссавець і найбільш переважно людина.

Щонайменше один інгібітор СК1, переважно в складі фармацевтичної композиції, описаної вище, для застосування за цим винаходом можна вводити із застосуванням будь-якої кількості і будь-якого шляху введення, ефективних для лікування цереброваскулярного стану. Відповідно до цього винаходу слід розуміти, що термін "обробка" або "лікування " означає, що тяжкість стану щонайменше не прогресує порівняно зі станом, для якого лікування не проводили, переважно тяжкість стану не прогресує, більш переважно тяжкість стану зменшується, ще більш переважно істотно зменшується, і, особливо переважно стан в значній мірі виліковується.

Переважно, тяжкість стану відповідно до цього винаходу знижується щонайменше на 30 95, більш переважно щонайменше на 50 95, ще більш переважно щонайменше на 70 95, особливо переважно щонайменше на 90 95, до повного виліковування стану, що являє собою найбільш переважний результат лікування відповідно до цього винаходу.

ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

Фіг. 1: (А) Перед лікуванням міогенний тонус в артеріях кремастера, виділених від мишей з

СН (п-б), збільшується в порівнянні з артеріями, виділеними від псевдооперованих контрольних тварин (п--8). (В) Після обробки 550 нМ РЕб670462 іп міго (30 хвилин) міогенний тонус в обох групах знижується до однакового рівня. Таким чином, збільшення міогенного тонусу, опосередковане СН, усувається (тобто криві після лікування накладаються одна на одну), і новий рівень тонусу лише незначно знижується в порівнянні з псевдооперованим контролем.

Фіг. 2: показує, що цитозольна частина тТМЕ регулює зворотну сигналізацію.

Фіг. 3: показує, що казеїнкіназа 1 регулює опосередковану тТМЕ міогенну реактивність.

Фіг. 4: показує, що казеїнкіназа 1 дельта регулює міогенну реактивність.

Фіг. 5: показує, що СК1ТО регулює циркадні осциляції міогенної реактивності.

Фіг. 6: показує, що інгібування СКІО покращує мікросудинну дисфункцію і роботу серця при СН.

Даний винахід додатково проілюстровано наступними прикладами.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Інгібування СК1 знижує міогенну реактивність іп міїго та іп мімо

Звертаючись до фіг. 1, мікросудинні гладком'язові клітини культивували з брижових артерій миші, і фосфорилювання ЕКК1/2 оцінювали за допомогою стандартного вестерн-блотингу.

Резистивні артерії скелетних м'язів кремастера мишей оцінювали за допомогою міографії із застосуванням тиску. Зворотна Сигналізація тТМЕ індукувалася внутрішньо активною конструкцією рецептора ТМЕ типу І, 6ТМЕК1-Ес.

У мікросудинних гладком'язових клітинах 5ТМЕК1-Ес збільшує фосфорилювання ЕККТ1/2. 5ТМЕВ1-Ес-індуковане фосфорилювання ЕККТ/2 скасовується як інгібітором пан-СКІ СКІ-7, так і специфічним інгібітором СКІб РЕ-670462. Ці результати були підтверджені на резистивних артеріях скелетних м'язів кремастера. Застосування СКІ-7 іп міго скасовує індуковану 5ТМЕК1-

Ес зворотну сигналізацію тТМЕ і знижує міогенну реактивність. Інгібування СК! не впливало на 60 міогенну реактивність в артеріях ТМЕ-. Іп міго РЕ-670462 також знижує міогенну реактивність, а при застосуванні іп мімо РЕ-67062 знижує міогенну реактивність у виділених артеріях кремастера. Важливо відзначити, що жоден з перерахованих вище способів лікування не впливав на викликане агоністами звуження судин.

Приклад 2: Цитозольна частина ттТМЕ регулює зворотну сигналізацію.

Звертаючись до фіг. 2, клітини ембріональної нирки людини (НЕК) тимчасово трансфікували протягом 24 годин і стимулювали антитілом до ТМЕ адалімумабом (Нитіга"М) протягом 5 хвилин. На зворотну сигналізацію тТМЕ вказує фосфорилювання ЕККТ/2, що оцінюється за допомогою вестерн-блотингу. Зворотна Сигналізація т МЕ не стимулюється, якщо клітини НЕК не експресують плазмідну конструкцію фактора некрозу пухлини (ТМЕ) (МТ - нетрансфікований); усічення внутрішньоклітинного домену ТМЕ (амінокислоти з 2 по 25) скасовує зворотну сигналізацію (Ттипс ТМЕ). Важливо відзначити, що цитоплазматичний хвіст тТТМЕ містить сайт розпізнавання казеїнкінази 1 (СК) (5(Р)-Х-Х-5), який видаляється в Тгипс

ТМЕ, що вказує на необхідність зв'язування СК! в зворотній сигналізації т МЕ. " на фіг. 2 позначає Р«0,05 за допомогою непарного І-критерію Стьюдента, п- від б до 12 біологічних повторів.

Приклад 3: казеїнкіназа 1 регулює опосередковану тТМЕ міогенну реактивність

Звертаючись до фіг. З, резистивні артерії скелетних м'язів кремастера миші виділяли і канюлювали для міографії із застосуванням тиску. Поетапне підвищення трансмурального тиску (від 20 до 100 мм рт. ст. з кроком 20 мм рт. ст.) викликає міогенне звуження судин. (Фіг. За)

Інгібітор пан-казеїнкінази 1 (СК1) СКІ-7 (10 мкМ іп міїго) знижує міогенну реактивність. (Фіг. ЗБ)

СКІ-7 не ставить під загрозу здоров'я судин, оскільки звуження судин, викликане фенілефрином, залишається незмінним. (Фіг. Зс) СКІ-7 викликає дозозалежне зниження міогенної реактивності (п- від 4 до б судин). (Фіг. ЗА) СКІ-7 не ефективний при відсутності сигналізації ТМЕ (тобто артерії, нокаутні по ТМЕ, ТМЕ КО). (Фіг. Зе) СКІ-7 не впливає на індуковане фенілефрином звуження судин в артеріях ТМЕ КО. (Фіг. ЗІ) Короткочасне введення тТМЕ-стимулюючого злитого білка 5ТМЕНІТ-Рс (100 нг/мл) стимулює звуження судин, яке запобігається за допомогою СКІ-7, вказуючи на те, що зворотний сигнальний шлях тТМЕ потребує функціонального СК. (Фіг. Зд) Всі судини були здоровими до експерименту, на що вказує сильна вазоконстрикція до фенілефрину (ФЕ). (п) Виділені резистивні артерії кремастера піддавали міографії із застосуванням тиску і подальшого вестерн-блотингу для фосфорилювання ЕККТ/2, молекулярного зчитування зворотної сигналізації т МЕ. 5 ТМЕК1-Ес стимулює підвищене фосфорилювання ЕККІ1/2, яке інгібується СКІ-7. (ї) Ілюстративне зображення вестерн-блотингу. (|) Гладком'язові клітини брижових судин демонструють стійке фосфорилювання ЕККТ1/2 у відповідь на 5 ТМЕК1-Ес, яке інгібується СКІ-7 (1 мкМ). (Фіг. За, Б, й, є) " на фіг. За, Б, с, а і е позначає Р«е0,05 за допомогою непарного І-критерію

Стьюдента. (Фіг. Зс, 1-9) " на фіг. Зс, їі д позначає Р«е0,05 за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу і в порівнянні з реакціями контролю без обробки за допомогою апостеріорного критерію Даннета. " позначає Р«0,05 за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу і в порівнянні з контролем (Контр), і - позначає Р « 0,05 в порівнянні з одним ТМЕК1-Ес (0 моль/л СКІ-7) за допомогою апостеріорного критерію Бонферроні. Кількість біологічних повторів вказано на фіг. З в дужках.

Приклад 4: Казеїнкіназа 1 дельта регулює міогенну реактивність

Звертаючись до фіг. 4, резистивні артерії скелетних м'язів кремастера миші виділяли і канюлювали для міографії із застосуванням тиску. Поетапне підвищення трансмурального тиску (від 20 до 100 мм рт. ст. з кроком 20 мм рт. ст.) викликає міогенне звуження судин. (Фіг. 4а)

Селективний інгібітор СКТЕ РЕ-4800567 усуває міогенну реактивність (30 мкМ іп міїго). (Фіг. 45)

РЕ-4800567 викликає дозозалежне зниження міогенної реактивності (п - від 4 до 5 на кожну дозу), хоча і при концентраціях, які значно перевищують ІСво (32 НМ), що дозволяє припустити, що таке зниження тонусу може бути пов'язане з ненаправленою дією інгібітора. (Фіг. 4с)

Викликане фенілефрином звуження судин знижується в артеріях, оброблених РЕ-4800567. (Фіг. 44) Зменшення викликаного фенілефрином звуження судин зберігається після коригування до базового тонусу, що вказує на неспецифічний інгібуючий ефект РЕ-4800567 в дозі 30 мкм.

Разом ці дані вказують на те, що СКТЕ навряд чи опосередковує міогенну реактивність, оскільки інгібування реакцій відбувається тільки при концентраціях РЕ-4800567 приблизно в 1000 разів вище, ніж ІСво, а РЕ-4800567 інгібує загальну скоротність судин (на що вказують притуплені реакції на фенілефрин). (Фіг. 4є) Інгібітор СКІБ/Е РЕ-670462 знижує міогенну реактивність (550 нМ іп міїго), даний ефект звернений шляхом багаторазових замін інкубаційного буфера в судині. (Фіг. 43 РЕ-670462 викликає дозозалежне зниження міогенної реактивності при концентраціях, які наближаються до опублікованих ІСв5о (від 7,7 до 14 нМ), що дозволяє 60 припустити, що зниження тонусу, ймовірно, специфічно для СК1О або СК1Е (п: від 4 до 5 на кожну дозу). Оскільки селективний інгібітор СКТЕ РЕ-4800567 був ефективний тільки далеко за межами діапазону специфічності для СКТЕ, авторами винаходу зроблено припущення, що більш потужний інгібуючий ефект РЕ-670462 обумовлений націлюванням на СК10. (Фіг. 49)

СКІО передає сигнали через ТМЕ, оскільки РЕ-670462 інгібує міогенну реактивність в артеріях дикого типу (МУТ), але не в артеріях мишей з нокаутом ТМЕ (ТМЕ-). (Фіг. 4п) РЕ-670462 не впливає на здоров'я судин, оскільки звуження судин, викликане фенілефрином, не порушено. (Фіг. 4а, с, 4) " на фіг. 4а, с і 4 позначає Р«е0,05 за допомогою непарного І-критерію

Стьюдента. (Фіг. 46, ) " на фіг.4Б ії ї позначає Р«е0,05 за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу і в порівнянні з 0 дозою за допомогою апостеріорного критерію Даннета. (Фіг. 4е) " на фіг. 4е позначає Р«0,05 за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу і в порівнянні з РЕ-670462 за допомогою апостеріорного критерію Даннета. (Фіг. 49, М) " на Фіг. 4д і п позначає Р«е0,05 за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу і в порівнянні з реакцією М/Т на РЕ-670462 за допомогою апостеріорного критерію Даннета. Кількість біологічних повторів вказано в дужках на фіг.4.

Приклад. 5: СК1О регулює циркадні осциляції міогенної реактивності.

Звертаючись до фіг. 5, резистивні артерії скелетних м'язів кремастера мишей виділяли в середині фази спокою (2717) або в середині активної фази (7119) і канюлювали для міографії із застосуванням тиску. Одноступінчате підвищення трансмурального тиску (від 60 до 100 мм рт. ст.) викликає міогенне звуження судин. (Фіг. за) РЕ-670462 (10 мкМ, іп міго) знижує міогенну реактивність тільки під час фази спокою (2717), а не під час активної фази (7119). (Фіг. 55)

Обробка РЕ-670462 не впливає на розширення судин, що вказує на те, що базовий тонус судини постійний до стимуляції тиском. (Фіг. 5с) Резистивні артерії м'язів кремастера піддавали міографії із застосуванням тиску, а потім вестерн-блотингом оцінювали фосфорилювання

ЕВКТ/2. РЕ-670462 знижує фосфорилювання ЕККТ1/2 більшою мірою під час фази спокою (2717). (Фіг. 5а) Ілюстративне зображення вестерн-блотингу. (Фіг. зе) РЕ-670462 не впливає на діаметр судин у спокою. (Фіг. 523 Перед введенням РЕ-670462 стан судин не порушено, про що свідчить сильне звуження судин, викликане фенілефрином. (Фіг. 59) РЕ-670462 дозозалежно знижує міогенний тонус в середині фази спокою (2717), щоб досягти максимального зниження, досягнутого в середині активної фази (27119) (п: від 4 до 7 судин на дозу). (Фіг. 5п) Введення

РЕ-67/0462 не впливає на здоров'я судин, на що вказує сильне звуження судин, викликане фенілефрином. (Фіг. 5а-й) " на фіг. ба, Бр, с і й позначає Р«е0,05 за допомогою непарного І-критерію

Стьюдента протягом того самого періоду часу (717 або 27119, відповідно). (Фіг. 5е, ї) " на фіг. 5е і ї позначає Р«0,05 за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу. (Фіг. 59) " на фіг. 59 позначає Р«0,05 за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу і в порівнянні з відсутністю обробки лікарським засобом (0 мкмоль/л) протягом того самого періоду часу (717 або 7119, відповідно) за допомогою апостеріорного критерію Даннета. (Фіг. 5) " на фіг. 5п позначає Р«0,05 за допомогою непарного І-критерію Стьюдента. Кількість біологічних повторів вказано в дужках на фіг. 5.

Приклад 6: Інгібування СК1О покращує дисфункцію мікросудин і роботу серця при СН

Звертаючись до фіг. ба-с, миші перенесли інфаркт міокарда (перев'язку лівої передньої низхідної коронарної артерії) або псевдо операцію. Через 8 тижнів після інфаркту міокарда у мишей розвивалася серцева недостатність (СН). Резистивні артерії скелетних м'язів кремастера виділяли і канюлювали для міографії із застосуванням тиску. Поетапне підвищення трансмурального тиску (від 20 до 100 мм рт. ст. з кроком 20 мм рт. ст.) викликало міогенне звуження судин, яке було значно сильніше в групі СН, ніж в групі псевдооперованих тварин. (Фіг. ба) Обробка РЕ-670462 (550 НМ іп міїго) нормалізує міогенну реактивність в артеріях мишей з СН (тобто рівень міогенної реактивності аналогічний значенням псевдооперованих тварин). (Фіг. 65) РЕ-670462 не впливає на міогенний тонус у псевдооперованих мишей. (Фіг. бс) Судини демонструють надійну функцію, оскільки викликане фенілефрином звуження судин не порушено.

Звертаючись до фіг. ба-ї, наївних мишей обробляли РЕ-670462 (від 30 до 50 мг/кг, розчинені в 200 мкл води, внутрішньочеревна ін'єкція) або носієм (200 мкл води). Через 24 години, в середині фази спокою (217), резистивні артерії скелетних м'язів кремастера піддавали міографії із застосуванням тиску. (Фіг. ба) РЕ-670462 в кількості і 30 мг/кг, ії 50 мг/кг знижує міогенну реактивність, що дозволяє припустити, що лікарський препарат діє іп мімо. (Фіг. бе) Спричинене фенілефрином звуження судин не змінюється при застосуванні РЕ-670462 іп мімо. (Фіг. 6)

Відповідно до зниження міогенного тонусу, короткочасна ін'єкція РЕ-670462 (30 мг/кг внутрішньочеревно) знижує середній артеріальний кров'яний тиск (САТ) (п-З на групу). 60 Звертаючись до фіг. бд-і, після інфаркту міокарда або псевдо операції мишей тривало обробляли РЕ-670462 (30 мг/кг, внутрішньочеревна ін'єкція) або носієм (ДМСО) протягом 7 тижнів (5 днів на тиждень). Резистивні артерії скелетних м'язів кремастера виділяли для міографії із застосуванням тиску. (Фіг. бд) Експресія МРНК СКТ10О і СКТЕ в резистивних артеріях кремастера не розрізняється в групі з СН їі групі псевдооперованих тварин (п-18 зразків на групу), це дозволяє припустити, що відмінності в міогенному тонусі обумовлені посттрансляційними механізмами. (Фіг. бі) Підвищення міогенного тонусу, індуковане СН, нормалізується при тривалій обробці РЕ-670462. (Фіг. бі) Викликане фенілефрином звуження судин не порушується при тривалій обробці РЕ-670462. Зниження тонусу при більш низьких концентраціях фенілефрину в групі, яка отримувала РЕ-670462, є результатом змін міогенного тонусу в стані спокою. (Фіг. б)) Серцевий викид, кількісна оцінка відтоку крові з серця, яка оцінюється за допомогою ехокардіографії, збільшується при тривалій обробці РЕ-670462. (Фіг. ба, Б і 9-)) " на фіг. ба, Ь і 9-| позначає Р « 0,05 за допомогою непарного І-критерію

Стьюдента. (Фіг. бс-е) " на фіг. бс-е позначає Р « 0,05 за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу і порівняння з контролем за допомогою апостеріорного критерію Даннета.

Кількість біологічних повторів вказано в дужках на фіг.6.

Даний винахід показує, що СК1 діє як регулятор зворотної сигналізації тТМЕ їі, отже, міогенної реактивності. Продемонстрована здатність інгібіторів СК! знижувати міогенну реактивність, не впливаючи на викликане агоністами звуження судин, забезпечує значний запас безпеки для клінічного застосування при захворюваннях, при яких підвищений тонус мікросудин.

ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ: 1. Вауїїх5. Оп Ше оса! геасіпв ої Ше апегіа! маї! то спапдез ої іпіегтпа! ргеззиге. ) РНузіо|. 1902:28:220-231. 2. НІЇ еї аї. Іпийей геміем/: апегіоїаг втооїй тизсіє теспапоїгапзаисійоп: Са(2-) 5ідпаїїту раїйулауз ипаепуіпуд туодепіс геасіїміту. У Аррі Рпузіо!ї (1985). 2001:91:973-983.

З. Зспибрегі еї аі. Те етегдіпд гоїе ої Саг-зепвзіймнйу гедшайнйоп іп рготоїйпуд туодепіс мазосопвігісіоп. Сагаіомаз5с Вев. 2008;77:8-18. 4. СоїІе еї аІ. Воїе ої туозіп ІдніІ спаіп Кіпазе апа туозіп дні спаіп рпозрНаїазе іп Ше гезібїапсе апегпа! туодепіс гтезропбе 0 іпігтамазсціаг ргеззиге. Агспй Віоспет Віорнпуз. 0 2011:;510:160-173. 5. Паіпдіоп еї аї. Саріаїїгіпд оп аїмегейу: ап іпівдгайме арргоасі їоулагаз Ше типйіріїсну ої сеїШіаг тесНнапізітв ипадепуїпуд туодепіс гезропзімепез5. Сагаіомазс ВНез. 2013:97:404-412. б. Кио еї аї. Согопагу апегіоїаг туодепіс гезропзе і5 іпдерепаеєпі ої епаоїнеїїшт. Сігс Везв. 1990;66:860-866. 7. РаІсопе еї аІ. Епаоїтеїа! іпадерепаєпсе ої туодепіс гезропзе іп ізоїаїед 5Кеїєеїа! тивсіє апетгіоіе5. Ат У Рпузіо!. 1991;260:Н130-НІ135. 8. Меїпіпдег єї аї. СеПшШаг тесНапізтве іпмоїмейд іп Ше мазсшаг туодепіс гезропзе. Ат ./

РАузіої. 1992;263:Нб647-Н6б59. 9. Меціпа еї аЇ. 5узіетіс мазсшаг ашогеашіацоп атрійіе5 ргеззог гезропзез 0 мазосопвігісіог адепів. Ат У РНузіо!. 1989:256:898-105. 10. Меціпуд еї а). Опцапійайме сопігіршііоп ої зузієтіс мазсшаг ашогедшіанйоп іп асше пурепепзіоп іп сопзсіоив додв. у Сіїп Іпмезі. 1989;84:1900-1905. 11. Реївгїзеп еї аІ. Согопагу апйегу туодепіс гезропзе іп а депеїїс тоаеє! ої Нурепгорніс сагаїотуораїну. Ат .) Рнузіо! Неаай Сігс РНузіої. 2002:283:Н2244-Н2249. 12. Ноегег єї аі. 5рпіпдозіпе-1-рпозрНаїе-дерепаепі асіїмайноп ої рЗ3в МАРК птаїпіаіїп5 еіІємаїєй регірпега! гезізіапсе іп Неагі Таїйцте їтоцоай іпстеазед туодепіс мазосопвігісйоп. Сігс Вез. 2010:107:923-933. 13. сзспмепа єї аі. Муодепіс соп5інісійоп і5 іпстеазей іп тезепівгіс гезізїапсе апепез їгот гаїв мйй сПпгопіс Неапй Тайшиге: іпеїапіапеоси5 соипіегасіоп ру асше АТІ гесеріог ріосКаде. Ве У 5О0 Рпаптасої. 2003;139:1317. 14. Зацйме сеї а). Титог Месговіз Расіог/5рпіпдозіпе-1-Рпозрпайе 5Зідпаїйпуд А!йпдтепів

Везізїапсе Апегу Муодепіс Топе іп Оіабеїез. Оіареїе5. 2016;65:1916-1928. 15. Опдмагі еї аї. Іпстеазей туодепіс (опе іп 5Кеїеїа!| тивсіе апегіо!е5 ої аіабеїйс гаїв. Роззіріе гоЇїеє ої іпстеазей асіїмйу ої 5тооїй тивзсіє Саг--спаппеї!5 апа ргоївіп Кіпазе С. Сагаіомаз5с Везв. 1999;43:1018-1028. 16. Маїтоицадиі еї а. Нідп зодіит іпіаКе дестеазез ргез5иге-іпаисей (туодепіс) опе апа Пом/- іпдисеа айайоп іп гезібтапсе апегієз їтот Ппурепепвіме гаїв. Нуредепзіоп. 1998;32:1 776-179. 17. ВоумеїІ. Нитап сагаіомазсшіаг адіивітепів їо ехегсізе апа ІНПептаї! зіге55. РНузіо! Веу. 1974;54:75-159. 60 18. Кгоеївсп еї аІ. Сопвійшіме 5тооїй тивсіє ІШштоиг песговів Тасіог гедшаїез тістгомазсшаг туодепіс гезропзімепев55 апа зузієтіс ріоса ргеззиге. Маї Соттип. 2017;8:14805. 19. Майв еї а. А сазеїп Кіпазе І тоїйї ргезепі іп Ше суїоріазтіс дотаїп ої тетбрегв5 ої Те

Ттоиг песговзів Тасіог Іїщдапа Гатійу із ітріїсаїей іп гемегзе зідпаїїпа. ЕМВО 4). 1999;18:2119-2126. 20. Мепегапао еї аї. Сазеїп Кіпазе: Ше іріє теапіпу ої а тізпотег. Віоспет у). 2014:460:141- 156. 21. Сго55 вї а). Сазеїп Кіпазе !: зрайа! огдапігайоп апа розйіопіпуд ої а тийтпсійопаї! ргоївїп

Кіпазе Гатіїу. Сеї! ЗБідпа!. 1998;10:699-711. 22. КпіррзспПа еї аІ. Те сазеїп Кіпазе 1 Тату: рапісірайоп іп тийПіріе сеїІшіаг ргосез5ез іп еиКагуоіев5. Сеї! Зідпаї. 2005;17:675-689. 23. Спеопа еї а. Сазеїп Кіпазе 1: Сотріехйу іп їйПе Татіу. Іпі У Віоспет Сеїї Вісі. 2011;:43:465- 469. 24. Риїдаг єї а). Оріїта! зедоепсез Тог поп-рпозрНаїе-аїгесієа рпозрпогуїаїоп Бу ргоївіп Кіпазе

СК (сазвіп Кіпазе-1)--а ге-емаІнайоп. Єиг ) Віоспет. 1999:260:520-526. 25. Воасп. Мийізіте апа НієгагсНаї ргоївіп рпозрпогуїайоп. У Віо!ї Снет. 1991266:14139-14142.

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Застосування РЕ-670462 для запобігання і/або лікування серцевої недостатності у пацієнта, який страждає від зазначеної серцевої недостатності. 20

2. Застосування РЕ-670462 за п. 1, де РЕ-670462 вводять пацієнту один, два або три рази на день.

3. Застосування РЕ-670462 за п. 2, де РЕ-670462 вводять пацієнту один раз на день за 3-6 годин перед відходом пацієнта до сну.

4. Застосування РЕ-670462 за будь-яким одним з попередніх пунктів, де пацієнтом є ссавець. 25 5. Застосування РЕ-670462 за п. 4, де ссавцем є людина. як псевдооперовані но Є контрольні 8). : Щ як жЖсНконтрольніЇ о Же а псевдооперовані РЕ-8704682 (550НМ) (8) Ж у х во - 001 ОСНРЕ-670462 (55ОНМІ (7) о ж З У ЗЕ Ка ЙО ее к Ка х. ре м о я ме Ж повних ж ве ке - х М ОЬ Я -2 ей а дю : же а шЕ 2 й о гз я де - Хе Я в ск 4 ї б вен В а, жа ча ча ЩЕ ще я М о що ще кю трансмуральний тиск (мм рт. ст.) трансмуральний тиск (мм рт. ст.) Фіг, 1А Фіг. 18 ах: а ж х 5 ж в кантроль і

8. . зо ІА ПОНМНВ) аж а х 5 я - тей з Ж 5 хх ки 545 о 5 М Еї га БЕ 5 2 ІЗ 2 5 ж т Оце Е Ку й що Го с я Я х ЕЕ де д КУ х Ж г» я й Еш ке 8 Б длллям ї- ; ВО що о Бо о Ж У Кантроль Адапімумаб я я ок 5 трансмуральний тиск (мм рт. ст.) к !

ь. о «Б а З я Фор ковтуеть о

ЕЕ. : ОЖЕ? ОН) шо ве є во ресклемеися Ї о Ка дш х Н у ї с 5 я є БЕ В 2 в : х ; їх ско я ї- ї х З - КЕ х 34 ! | 5 Ееи НВ: ї | х о Же ГЕ: ї ; У са і Ге: х Я "шк Є с ЖЕ БЕ і що р В вва долуєтов лю і . а 5 т ; А - р 5 с 5 Контраль Адалімумай Кантроль Адалімумає Е ей в -Е - «5 С пи: ХМ ТУ А ден. е- : й з Жаве ТНК фенілефрив (бу моль я)

Фіг. 2 «Фіг. З б. дом Я МЕ КО контрольчя р Я ЕЕ КО ОК ЗОН

Ж ї. к Ж ж же Га х Ф

С. З - Ж да - п зв що , А 8 ; Ж их « Ж Ж чо 5 як «ХХХ не м дал дала ЕН ба ов ож ке . . ха в за і фенілефрив Под моль) КУ Що С-й ж З з Б яантраль ОХ х Її с Ж с я слоти Ж СК - Ф необроблений (8) й Под вени З Ф МОРІ к Е я ПКМТІНВВИНВ Фома ні ї зд ме Іа ними

Фе .. ке з ю «хх БУ а. ов: ро ТМЕ КО контро (ЛІ ам пря - ж МЕ КО СКАТ ПОМ СЮ 5 пе ; : Ж. Ї ж абем ЩЕ НИИ Х я он ; її з ш ч МЕЖ Бо : ЕЕ ле ОЗ БМ САН 5 ШЕ пе Їоннюеннн» 5 ; Е сх й Ж К що г

5 ЩЕ 5 я я 2 ууннннопрепеноо дроотовттранноннно хо я а вояж : чає (сек) трансмуральний тиск імм рт. ст.) їх Ж

Фіг. З (продовження) Фіг. З (продовження)