UA119026C2 - Нуклеотидна послідовність, яка кодує укорочений білок олеат-десатурази соняшника з низькою ферментативною активністю - Google Patents

Abstract

Винахід стосується виділеної нуклеотидної послідовності, яка містить передчасний стоп-кодон в SEQ ID NO: 5, і кодує укорочений білок олеат-десатурази соняшника, що має низьку ферментативну активність, рослини соняшника, здатного виробляти насіння із вмістом олеїнової кислоти від 80 до 95 % відносно сумарного процентного вмісту жирних кислот насіння, насіння вказаної рослини соняшника; способу одержання вказаної рослини; застосування вказаного насіння для одержання олії та способу одержання олії.

Description

Даний винахід стосується виділених нуклеотидних послідовностей, які кодують мутантний білок олеат-десатурази соняшника, мутантного білка, рослин, що виробляють білок, насіння і олій, що виробляються рослиною, способів отримання мутантних послідовностей і застосувань білка і рослини.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Кислий фермент олеат-десатурази (ОО) залучений до ферментативного перетворення олеїнової кислоти в лінолеву кислоту. Мікросомний ОО клонували і охарактеризовували з використанням маркерної технології за допомогою Т-ДНК (Т-ОМА іаддіпо, ОКиїєу, еї аї. (1994)

Ріапі СеїІ 6:147-158). Нуклеотидні послідовності вищих рослин, кодуючі мікросомний ОЇ 0, були описані в документі МО94/11516 РСТ І ідніпег еї аї.

Соняшник, як правило, культивується для отримання насичених жирних кислот (пальмітинової і стеаринової) і ненасичених жирних кислот (олеїнової і лінолевої). Вміст стеаринової кислоти завжди нижче ніж 10 95 ((3ивіоп єї аї. (1986) Тне Ігрій напабоок, Спартап апа наї Сгеаї Війаїп), звичайно від З до 7 95. Що стосується вмісту ненасичених жирних кислот, то існує два типи насіння соняшника: звичайний соняшник, який має вміст линолевої кислоти від 5095 до 70 95 (Кпом/ез (1988) Кесепі адмапсез іп оїЇ сгор5 Бгеєдіпд, ЛОС5 Ргосееєадіпоб5), і соняшник з високим вмістом олеїнової кислоти, який має вміст лінолевої кислоти 2-10 95 і олеїнової кислоти від 75 95 до 90 95 (БоЇдайм (1976) Спетіса! тиїадепевів іп зип'омег Ббгеєаіпа,

Ргосеєдіпд5 ої Ше 7 Іпієгпайопа! ЗипПоуег Сопієгепсе, 352-357). Також існує лінія соняшника, яка має високий вміст пальмітинової кислоти від 22 до 40 95 (Імапом єї аї. (1988) З!ипПомег

Вгеєдіпду Тог Нідп Раїтйіс Асій Сопіепі іп їШїе ОЇ, Ргосеєдіпд5 ої Ше 12іп Іпіегпіопа! ЗипіПомег

Сопіегепсе, Мої ІІ, 453-465), і інша лінія соняшника з низьким вмістом насичених жирних кислот (менше ніж 6 95) (ЕР-А-0496504).

З метою реагування на потреби в рослинних оліях, які цікавлять, як для промисловості, так і для харчового споживання людиною, були зроблені зусилля з поліпшення сортів насіння олійних культур, сфокусовані на модифікації жирнокислотного складу насіння, наприклад, за допомогою стандартних програм схрещування, мутагенезу або трансгенозу.

Мутації, як правило, індукуються за допомогою дуже високих доз радіації або хімічним мутагенезом (Саші (1964) Кадіаноп Воїапу 4:155-232). Високі дози, що перевищують летальну

ЗО дозу 5095 (І Ово), ії, як правило, летальні дози 90 95 (І ЮОвео) максимізують процентний вміст можливих мутацій.

Мутагенез, проведений Солдатовим у 1976 в популяції соняшника, дозволив отримати популяцію так званих мутантів "Первісток". Середній вміст олеїнової жирної кислоти (18:1) насіння даного сорту складає вище, ніж 65 95, індивідуальний вміст складає від 60 до 80 95, в той час як в звичайних сортах (низький вміст олеїнової кислоти, ГО) цей вміст становить приблизно 20 95. Популяція "Первісток" поширена по всьому світу і використовується в багатьох програмах схрещування з метою перетворення певних генотипів з низьким вмістом 18:1 в генотипи з високим вмістом 18:1 в їх насінні.

Акумуляція 18:11 в насінні залежить від двох ферментних реакцій: десатурація 18:0 (стеаринова кислота) до 18:1 і подальша десатурація 18:1 до 18:2 (лінолева кислота). Фермент олеат-десатураза (ОЇ 0) каталізує десатурацію 18:11 до 18:2 (ОпПігодде апа Вгомузе (1995) Те

Ріапі СеїІ, 7:957-970, бБотегуиШе апа Вгомуве (1996) Ттепаз Сеї! Віо!ї 6148-1535 5спулапгреск (2001) Рнуїоспетівігу, 57:643-652).

Соняшникова олія за своєю природою багата 18:2 (55-70 95) і відповідно бідна 18:1 (20- 25 90). Традиційні сорти класифікуються як маючі низький вміст олеїнової кислоти (низькоолійні,

ГО). Оскільки існує високий запит серед споживачів на отримання більш здорової їжі у вигляді олій з високим вмістом олеїнової кислоти, то також існує запит на розробку рослин соняшника з високим вмістом олеїнової кислоти, які переважно приводять до отримання культур з таким же високим виходом, як і у звичайних сортів соняшника.

Дослідження, що проводяться Сагсез еї аї. в 1989 і 1991 (Сагсез еї а. (1989) Рпуоспетівігу 28:2597-2600; Сагсез апа Мапсна (1991) Рнуїоспетівігу 30:2127-2130), продемонстрували, що фенотип з високим вмістом олеїнової кислоти (високоолійні, НО) асоційований з помітним зниженням активності ферменту ОЇ 0, який каталізує десатурацію 18:1 до 18:2 в НО-насінні під час критичних стадій синтезу ліпідного запасу, що пояснює акумуляцію 18:1.

Було продемонстровано, що мутація "Первісток" асоційована з генними дуплікаціями всередині гена ОГО, що приводять до сайленсингу гена. Це зменшення в транскрипції ОГО пояснює зменшення кількості ферменту і, таким чином, низьку продемонстровану активність

ОГО (Ноподігаки! еї аІ. (1998) Стор 5сі 381245-1249), що узгоджується з акумуляцією 18:1 в насінні соняшника. Це відкриття привело до розробки молекулярних маркерних характеристик мутації, які можуть використовуватися в програмах схрещування для полегшення селекції НО- генотипів (М/О2005/106022; І асотре еї аї. (2001) І їе 5сі 324:839-845).

Традиційна соняшникова олія з високим вмістом 18:2 розглядається як здорова рослинна олія, яка має правильний смак, і розглядається як олія, що має перший клас якості на світовому ринку завдяки високому процентному вмісту в ньому поліненасичених жирних кислот. Вона використовується як салатна олія, кулінарна олія або для отримання маргарину.

Шляхом модифікації профілю жирних кислот в соняшниковій олії може бути розроблена нова соняшникова олія, що має більш високу стійкість до окиснення в порівнянні із звичайною олією. Ця олія повинна містити рівень щонайменше 18:1 55-65 96 відносно сумарного вмісту жирних кислот. Користь даної олії в її високій стійкості до окиснення після процесу екстракції і стабільність смаку смажених продуктів. Соняшникова олія з високою концентрацією 18:1 не має потреби в гідрогенізації для підвищення стабільності і не утворює транс-жирних кислот.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Метою даного винаходу є пропозиція виділеної нуклеотидної послідовності, що кодує мутантний білок олеат-десатурази (ОО), що володіє низькою ферментною активністю. Ця більш низька ферментна активність при експресії в рослині, конкретно в рослині соняшника, спричиняє підвищення кількості олеїнової кислоти в рослинній олії або в рослинній олії з насіння в порівнянні з існуючими рослинами.

Таким чином, винахід додатково стосується виділеної нуклеотидної послідовності, що включає вставку, яка змінює рамку зчитування, чия нуклеотидна послідовність кодує укорочений білок ОГО соняшника. У переважному втіленні вставлена нуклеотидна послідовність включає передчасний стоп-кодон і кодує укорочений білок олеат-десатурази соняшника, який включає амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО:1 або 5ЕО ІЮ МО:2. Кодуюча послідовність укороченого білка олеат-десатурази може являти собою нуклеотидну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ

МО:З або 5ЕО ІЮ МО 4.

Згідно з наступним аспектом в даному винаході пропонується укорочений білок олеат- десатурази, що включає не більш ніж 110 амінокислот з М-кінцевої області. У переважному втіленні амінокислотна послідовність складається з 5ЕО ІЮ МО:1 або 5ЕО ІЮ МО:2.

Згідно з іншим аспектом даний винахід стосується рослини соняшника, що включає два

Зо алелі ОГО з вставкою, що кодує укорочений білок ОО. Кожний алель включає нуклеотидну послідовність, яка має вставку, що включає передчасний стоп-кодон, і де вказана послідовність кодує укорочений білок ОГО. У переважному втіленні нуклеотидна послідовність являє собою

ЗЕБЕО ІЮ МОЗ або 5ЕО ІЮ МО:4. Мутантна рослина виробляє насіння із вмістом олеїнової кислоти від 80 95 до 9595 по відношенню до сумарного процентного вмісту жирних кислот в насінні.

У наступному втіленні винахід стосується рослини соняшника, здатної виробляти насіння, із вмістом олеїнової кислоти від 80 до 9595 по відношенню до сумарного процентного вмісту жирних кислот в насінні, причому рослину отримують шляхом схрещування рослини лінії 29065, яка має реєстраційний номер МСІМВ 41733, або лінії 29066, яка має реєстраційний номер

МСІМВ 41734, з іншою рослиною, і шляхом селекції в Е2 з отриманням рослин, які виробляють насіння, що мають вміст олеїнової кислоти від 80 до 9595 по відношенню до сумарного процентного вмісту жирних кислот в насінні.

У винаході також пропонується насіння соняшника, яке включає два алелі ОГО з вставкою, що кодує укорочений білок олеат-десатурази. Кожний алель включає нуклеотидну послідовність, яка має вставку, що включає передчасний стоп-кодон, і де вказана послідовність кодує укорочений білок олеат-десатурази. Нуклеотидна послідовність може являти собою послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО:З або 5ЕО ІЮ МО:4. Амінокислотна послідовність білка олеат-десатурази може являти собою послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО:1 або

ЗЕО ІЮ МО:2. У переважному втіленні насіння являє собою насіння лінії 29065, характерний зразок насіння, який був депонований під реєстраційним номером МСІМВ 41733, або насіння лінії 29066, характерний зразок насіння, який був депонований під реєстраційним номером

МСІМВ 41734.

Згідно з іншим аспектом даного винаходу пропонується соняшникова олія, яка має вміст олеїнової кислоти від 80 95 до 95 956 по відношенню до сумарного вмісту жирних кислот в олії, яку можна отримати або отримують з насіння соняшника, яке включає два алелі О10О, які містять вставку і кодують укорочений білок олеат-десатурази. У переважному втіленні олію отримують з насіння лінії 29065, характерного зразка насіння, яке було депоноване під реєстраційним номером МСІМВ 41733, або з насіння лінії 29066, характерного зразка насіння, яке було депоноване під реєстраційним номером МСІМВ 41734.

У даному винаході додатково пропонується застосування насіння соняшника для екстракції олії. У переважному втіленні насіння являє собою насіння лінії 29065, характерний зразок насіння, який був депонований під реєстраційним номером МСІМВ 41733, або насіння лінії 29066, характерний зразок насіння, який був депонований під реєстраційним номером МСІМВ (41734.

Винахід додатково стосується потомства заявленого насіння, де вказане потомство включає вставку в гені, який кодує білок олеат-десатурази, в якому така вставка приводить до синтезу укороченого білка олеат-десатурази.

Винахід додатково стосується способу отримання рослини соняшника з високим вмістом олеїнової кислоти, який включає наступні стадії: а) мутагенез частини рослини соняшника;

Юр) отримання щонайменше одного потомства мутантної рослини, і с) ідентифікація і селекція щонайменше однієї рослини, отриманої в стадії Б), що включає нуклеотидну послідовність, яка має вставку, що включає передчасний стоп-кодон, і де вказана нуклеотидна послідовність кодує укорочений білок олеат-десатурази. В одному втіленні укорочений білок олеат-десатурази включає послідовність, що складає не більш ніж 110 амінокислот з М-кінцевої області олеат-десатурази соняшника, наприклад, білок, представлений в ЗЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІО МО:2.

Згідно з іншим аспектом у винаході пропонується спосіб отримання високоолійної соняшникової олії, що включає екстракцію олію з насіння, характерний зразок насіння був депонований під реєстраційним номером МСІМВ 41733 або МСІМВ 41734.

ОПИС ФІГУР

На Фіг. 1 представлений графік процентного вмісту олеїнової кислоти по відношенню до всіх основних жирних кислот для гомозиготних рослин для високоолійної мутації "Первісток", для ліній 29065 і 29066, отриманих в схрещуваннях 20342 х 29065; 20342 х 29066; 20340 х 29065 і 20340 х 29066. У всіх випадках процентні вмісту олеїнової кислоти в рослинах РЕ2, які несуть мутації за даним винаходом в гомозиготному статусі (тиї 29065 Нт і тиї 29066 Нт, відповідно) порівнюються з рослинами Е2, які несуть мутацію "Первісток" в гомозиготному статусі (тиї "Первісток" Нт). Точки характеризують значення і сегменти всередині боксів характеризують середні значення.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Даний винахід стосується мутантної нуклеотидної послідовності, що кодує олеат- десатуразу, яка має вставку, де вставлена послідовність включає передчасний стоп-кодон і, таким чином, білок олеат-десатурази соняшника є укороченим. Кодований укорочений білок олеат-десатурази має більш низьку ферментну активність, що приводить до отримання рослини або частин рослини, такої як насіння, яке акумулює велику кількість олеїнової кислоти.

Укорочена амінокислотна послідовність може являти собою будь-яку послідовність, яка включає не більш ніж перші 110 амінокислот з М-кінцевої області білка олеат-десатурази соняшника. У переважному втіленні укорочена амінокислотна послідовність може являти собою послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО:1, або послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО:2.

Нуклеотидні послідовності, піддані мутації за допомогою вставки, включають передчасний стоп-кодон, який приводить до синтезу укороченого білка ОО соняшника. Потрібно розуміти, що будь-яка нуклеотидна послідовність, яка кодує білок олеат-десатурази, який включає не більш ніж перші 110 амінокислот М-кінцевої області ОГО соняшника дикого типу, наприклад, один з лінії НА8О, знаходиться в рамках даного винаходу.

Нуклеотидні послідовності, які включають вставку, яка містить передчасний стоп-кодон, наприклад, послідовності, представлені в БЕО ІЮ МО:З і 5ЕО ІЮ МО:4, знаходяться в рамках даного винаходу.

Різні лінії соняшника були піддані мутації, наприклад, лінії НА8О і 29010, для отримання насіння з високим вмістом олеїнової кислоти. Відібрані мутації в кодуючій послідовності гена олеат-десатурази соняшника, являють собою мутації, шляхом вставки послідовностей, які включають передчасний стоп-кодон, причому вказані нуклеотидні послідовності кодують укорочені білки олеат-десатурази.

Мутантне насіння за винаходом депонували згідно з Будапештською угодою в колекцію

Національної Бібліотеки Промислових, Харчових і Морських Бактерій (МСІМВ) 20.07.2010 під наступними реєстраційними номерами: лінія 29065 відповідає реєстраційному номеру МСІМВ 41733, і лінія 29066 відповідає реєстраційному номеру МСІМВ 41734.

Даний винахід стосується всього насіння і рослин, конкретно, насіння соняшника і рослин, які несуть в своєму геномі мутацію, яка приводить до отримання укороченого білка олеат- бо десатурази, що має ферментну активність, яка є зниженою в порівнянні з існуючими ферментами олеат-десатурази, що приводить до більш високого вмісту олеїнової кислоти в олії з насіння. В одному втіленні мутація являє собою вставку, яка несе стоп-кодон. Інші мутації, які приводять до отримання укорочення олеат-десатурази максимум до 110 амінокислот, також знаходяться в рамках даного винаходу. Такі рослини і насіння, які мають більш високий вміст олеїнової кислоти в олії, можуть бути отримані шляхом схрещування з рослинами депонованих ліній 29065 (МСІМВ 41733) або 29066 (МСІМВ 41734) і селекції потомства рослин, які мають більш високий вміст олеїнової кислоти. Селекція здійснюється відповідним чином в Е2, оскільки мутація, що приводить до укорочення, повинна переважно бути присутньою гомозиготно для більш низької ферментної активності, щоб приводити до більш високого вмісту олеїнової кислоти. Альтернативно, мутантний ген може бути привнесений в рослину соняшника за допомогою генетичної інженерії, конкретно, з використанням мутантного гена олеат-десатурази, описаного в даному документі, або з використанням будь-якого іншого гена, що приводить до отримання такого ж укороченого продукту експресії довжиною не більш ніж 110 амінокислот.

Мутантні рослини і насіння за винаходом можуть бути отримані з використанням різних схем мутагенезу. У переважному втіленні мутагенний агент, такий як ЕМ5, в концентрації від 5 до 15 95 ін'єктується в квіткові головки рослин, насіння збирає і потім застосовує рентгенівське випромінювання.

Після мутагенезу аналізували жирнокислотний профіль мутантного насіння М2 і батьківського насіння, і відбирали ті, які демонстрували високий вміст олеїнової кислоти, наприклад, вище 80 95 в порівнянні із вмістом жирних кислот насіння, переважно приблизно 90 95 в порівнянні з сумарним вмістом жирних кислот насіння.

В іншому переважному втіленні мутантні рослини і насіння отримували за допомогою застосування рентгенівського випромінювання. Потім жирнокислотний профіль насіння М2 порівнювали з жирнокислотним профілем батьківського насіння, і відбирали те, яке демонструвало високий вміст олеїнової кислоти, наприклад, що має вище 80 95 по відношенню до сумарного вмісту жирних кислот в насінні, переважно, приблизно 90 95 в порівнянні з сумарним вмістом жирних кислот в насінні.

Олія, отримана з будь-якого насіння соняшника за винаходом, має вміст олеїнової кислоти вище, ніж 80 96 по відношенню до сумарного вмісту жирних кислот в насінні, переважно, вище

Зо ніж 85 95 і більш переважно, вище ніж 90 95.

Здійснювали направлені схрещування між лініями, які належать Аймапіа Зетійав, з високоолійним фенотипом, які є носіями мутації "Первісток" (20342 і 20340), і високоолійними мутантами 29065 і 29066 за винаходом: 20342 х 29065; 2042 х 29066; 20340 х 29065 і 20340 х 29066. Рослини Н1, отримані в кожному схрещуванні, були самозапилюваними, і їх насіння (Е2) збирали. Насіння Е2 з кожного схрещування висаджували в полі в Балькарсе в сезон 2008/2009.

За допомогою застосування специфічних молекулярних маркерів, гомозиготні рослини ідентифікували на предмет мутації "Первісток" і мутацій 29065 і 29066, отриманих в кожному схрещуванні. Вказані рослини були самозапилюваними, і насіння збирали індивідуально. Групу з 30 насінин відбирали з кожної рослини, висівали в блок і визначали жирнокислотний склад олії за допомогою газової хроматографії.

У всіх випадках гомозиготні рослини з мутаціями 29065 і 29066 демонстрували середні процентні вмісту олеїнової кислоти, що перевищують їх відповідні значення у рослин з мутацією "Первісток" (див. Таблицю З і Ффіг.1).

Нуклеотидні і амінокислотні послідовності порівнювали з відповідними послідовностями лінії

НАВ8ОУ соняшника дикого типу (ЗЕО ІЮ МО:5 і 5ЕО ІО МО:6). Ці послідовності були ідентичні відповідним послідовностям лінії 29010 соняшника дикого типу.

Винахід ілюструється наступними прикладами, які не треба розглядати як обмеження рамок винаходу. Навпаки, потрібно з всією ясністю розуміти, що для фахівця в даній галузі можливо після прочитання даного опису застосувати інші втілення, модифікації і еквіваленти винаходу, не виходячи при цьому за рамки даного винаходу і/або прикладеної формули винаходу.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1 1.1 Мутагенез за допомогою рентгенівського випромінювання (отримання лінії 29065)

Насіння МО лінії 29010, власність Адмапіа Зетійаз ЗАС, піддавали мутагенезу за допомогою застосування рентгенівського випромінювання. Випромінювання проводили в

Інституті Генетики "Еджага А. Рамгеї", СІСМУА-СМІА, ІМТА-СавіеїЇаг, Аргентина. Пристрій для рентгенівського випромінювання РПійр5 МО 160, 4АКМУ/ з максимальною потужністю 160 кВ, 19 мА і з споживанням енергії 120 кВ, 15 мА. Використовувані час експонування і дози становили 7 хв. 55 сек і 144 Гр, відповідно, з відстанню між фокусом джерела і об'єктом (насіння) 40 бо сантиметрів.

Опромінене насіння висівали 12 грудня 2005 в 12 рядів по 100 метрів довжиною в Балкарці з номером партії САО5-6347. Квіткові головки отриманих 1606 рослин упаковували в мішечки перед цвітінням з метою отримання насіння з допомогою самозапилення, Ма. Квіткові головки в кожному ряду збирали і обмолочували індивідуально. Насіння М2 з 1606 рослин аналізували за допомогою газової хроматографії (5С) для визначення жирнокислотного складу в 30 індивідуальних насінинах М2 на рослину. Мутантна рослина САО5-6347-725 демонструвала фенотип з високим вмістом олеїнової кислоти, і була названа 29065. 1.2 Мутагенез за допомогою ін'єкції ЕМ5 і подальшого опромінення за допомогою рентгенівського випромінювання (отримання лінії 29066)

Сімдесят п'ять рядів насіння лінії НА8ВО висівали в Біотехнологічному Дослідницькому Центрі

Адуапіа Зетійа5 5АЇС в Балькарсе (Буенос-Айрес, Аргентина) в сезон 2004/5 і ідентифікували під номером партії САО4-3, і 40 рядів під номером партії САО4-1501. Кожний ряд становив 6 метрів в довжину.

Квіткові головки піддавали мутагенезу за допомогою ін'єкції ЕМ5 (етиловий ефір метансульфокислоти) в дозах 5, 10 ї 15 95 з використанням відповідного протоколу мутагенезу.

Кожну рослину МО упаковували в мішечки перед цвітінням з метою отримання самозапилюваного насіння М'. Квіткові головки рослин кожної обробки ЕМ5 збирали, обмолочували і зберігали. Квіткові головки рослин піддавали мутагенезу за допомогою ін'єкції з використанням ЕМ5 (етиловий ефір метансульфокислоти) в дозах 5, 10 і 15 95 з використанням протоколу, описаного в ММО2006/024351 і УМО2008/071715. ЕМ5 являє собою мутагенний агент, який індукує транзиції 5/С в А/Т (Чапдег еї аїЇ. (2003) Ріапі Рпузіої. 131:139-146). З метою отримання самозапилюваного насіння МІ кожну рослину МО покривали нейлоновою сіткою перед цвітінням. Квіткові головки рослин кожної 595 обробки ЕМ5 збирали, обмолочували і ідентифікували (партія САО4-3).

Вказане насіння М1 потім піддавали мутагенезу за допомогою застосування рентгенівського випромінювання. Опромінення проводили в Інституті Генетики "Едугага А. Рамгеї", СІСМУА-СМІА,

ІМТА-Сазгеїаг, Аргентина. Пристрій для рентгенівського випромінювання РПйїрх Мо 160, 4КУМ з максимальною потужністю 160 кВ, 19 мА і з споживанням енергії 120 кВ, 15 мА. Використовувані час експонування і дози становили 7 хв. 55 сек. і 144 Гр, відповідно, з відстанню між фокусом

Зо джерела і об'єктом (насіння) 40 сантиметрів.

Опромінене насіння висівали 12 грудня 2005 в 16 рядів по 100 метрів довжиною в Балькарсе з номером партії САО5-6362. Квіткові головки отриманих 555 рослин упаковували в мішечки перед цвітінням з метою отримання насіння з допомогою самозапилення, Ма2. Квіткові головки в кожному ряду збирали і обмолочували індивідуально. Насіння М2 з 555 рослин аналізували за допомогою газової хроматографії (5С) для визначення жирнокислотного складу в 30 індивідуальному насінні М2 на рослину. Мутантна рослина САО5-6362-263 демонструвала фенотип з високим вмістом олеїнової кислоти, і була названа 29066.

Таблиця 1

Демонструє метод мутагенезу, що використовується для кожної мутантної лінії за винаходом, нуклеотидна послідовність і амінокислотна послідовність укороченого білка олеат-десатурази

Розмір Нуклеотидне Мутантна Послідовність с. положення нуклеотидна передбаченого

Лінія | Метод мутагенезу| вставки в й й й парах основ вставки в о 0- послідовність за | укороченого білка кодуючій ділянці винаходом (е)щв;

Рентгенівське 29065 |опромінення для 785 310 ЗЕО ІО МО:З ЗЕО ІО МО: насіння 5 6 ЕМ5-ін'єкція в квіткові головки з подальшим , , 29066 рентгенівським 4872 201 ЗЕО І МО ЗЕО І МОСг2 опроміненням зібраного насіння

Приклад 2

Аналіз жирнокислотного складу жирних кислот олії з насіння за допомогою газової хроматографії

Насіння соняшника розрізали по сагітальній осі і вміщували в 2-мл скляні пробірки, що містять метанол, толуол, диметоксипропан і сірчану кислоту в співвідношенні 66:28:4:2.

Пробірки закривали і інкубували протягом однієї години при 80 "С. їм давали можливість охолодитися при кімнатній температурі і потім додавали 1 мл гептану (Сагсе5 апа Мапспа (2003) Апапуїїса! Віоспетівігу 317:247-254). Метилові ефіри жирних кислот, присутні у верхній фазі (гептан) відділяли на газовому хроматографі Адіепі 6890 за допомогою автоматичного пристрою для відбору зразків Моде! 7683В. Температура ін'єкції становила 240 "С, а також використали хроматографічну колонку Юигаропа 15 метрів довжиною з внутрішнім діаметром 250 мкМ і 250 мкМ плівку (У 5 ММ Зсіепійіс) при 200 "С. Газ Не використали як робочий газ під тиском 9,56 фунтів/кв. дюйм, з швидкістю потоку 1,7 мл/хв., і з середньою швидкістю 69 см/сек.

Метиловий ефір детектували за допомогою детектора іонізації полум'я (БІБ) при 300 с.

Результати інтегрували і аналізували з використанням програмного забезпечення Спет32

Адіепі Тесппоіодіеєб5. Відносні кількості кожної жирної кислоти вимірювали по відношенню до стандартного розчину метилованих жирних кислот (АїКесп).

У Таблиці 2 представлені аналізи жирнокислотного складу, що проводяться за допомогою газової хроматографії на зразках насіння з мутантних рослин за винаходом.

Таблиця 2 ці т р---6-85ИИИЙ5--- 29065 29066 744137 1 906 2 щЩ | 73

Р: пальмітинова кислота; 5: стеаринова кислота; 0: олеїнова кислота; І: лінолева кислота

Таблиця 3. Порівняння рівня олеїнової кислоти (905) насіння соняшника з гомозиготних рослин Е2 (Нт) для мутацій 29065 і 29066 в порівнянні з гомозиготними рослинами Е2 (Нт) для мутації "Первісток". Процентний вміст для обох, Нт 29065 і 29066, був значно вищим, ніж відповідні значення для Нт "Первісток".

Таблиця З оопемеяи | вкоюютму | пешеиттйтки ЗИМИ п

Популяція високого вмісту процентний вміст . п - - . . відхилення олеїнової кислоти олеїнової кислоти 29065 87,50 д05ло х евово 82,86 29066 87,91 д0вло х евоб 8626. 1264 | 90 29065 89,08 дових евова 7Б,ВІ тив 29066 88,90 дових вобо ви п: кількість рослин Е2, чий жирнокислотний склад аналізували за допомогою газової хроматографії

Приклад З

Секвенування генів соняшника, які кодують поліпептид, який має активність олеат- десатурази

Для аналізу секвенування зразки тканини брали з кожного мутанта з високим вмістом олеїнової кислоти, виділяли геномну ДНК і розводили до базової концентрації 100 нг/мкл. З метою отримання кодуючої послідовності повнорозмірної олеат-десатурази мутантів з високим вмістом олеїнової кислоти 29065 і 29066 і початкових ліній 29010 ї НА8ВО (дикий тип),

Зо використали специфічні праймери, сконструйовані для гена. Їх використали для ампліфікації за допомогою ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) і отримання двох ДНК сегментів (амплікони), що перекриваються, які перекривали весь ген ОО. Послідовність сконструйованих праймерів показана нижче: 1-ий амплікон ОЇ 01-Е2 СААДААдИТСТааТтСАААСАсатТСААСАТ (5ЕО ІЮ МО:7) (705 п.о.) 0 01-82 ССаАТатТСасАСАТОАСТАТОС (5ЕО ІЮО МО:8)

2-ий амплікон ОЇ ОТадху-г2 ААДАТАСТТТААСААСАСАИатасас (5ЕО ІО МО:9) (733 п.о.) ОІ 01-83 ССАСААССАасаАСААСАаСсСАТТИатс (5ЕО ІО МО:10)

Всі праймери є специфічними для гена олеат-десатурази. Наступні концентрації використали для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в кінцевому об'ємі 25 мкл: 1Х буфер (Іпмігодеп), 0,2 мм аМТР (СЕ Неаївсаге), 2,5 мМ МаосІіг» (Іпмігодеп), 0,2 мкМ кожного праймера, 0,5 мкл Ріайпит Тад (5 Од/мкл) (Іпмігодеп) і 100 нг геномної ДНК. КІ А-реакцію за допомогою

ПЛР здійснювали на комп'ютерній системі СепеАтр РОСА бувієт 9700 (Реткіп-ЕЇІтег). Умови циклу: початкова стадія денатурації при 94 "С протягом 1 хвилини з подальшими 35 циклами, що складаються з 94 "С протягом 45 секунд, 57 "С протягом 45 секунд і 72 "С протягом 70 секунд, і кінцева стадія елонгації 72 "С протягом 10 хвилин.

У випадку двох мутантів, що виявили високий вміст олеїнової кислоти (29065 і 29066), продукт ампліфікації не можна було отримати з використанням праймерів ОЇ 01-Е2 і ОЇ 01-22.

Це приводило до твердження, що мутанти мають великі сегменти ДНК, вставленої в ділянку, поміщену між цими праймерами, внаслідок мутагенної обробки за допомогою рентгенівського випромінювання. Це буде означати, що завдяки великому сегменту, фланкованому праймерами

О 01-Е2 і 0 01-К2, продукту ампліфікації не отримають.

З метою встановлення нуклеотидної послідовності вставлених сегментів, генерували геномні бібліотеки для кожного з мутантів (29065 і 29066) з метою здійснення "хромосомної прогулянки" за допомогою ПЛР з використанням системи СепотеуУмаїкКегтМ Опімегза! Кії

Ргоїосо!-аї-а-СіІапсе (Сіопіесі), відповідно до інструкцій виробника.

Використовуючи нуклеотидну послідовність гена олеат-десатурази ліній НА8У і 29010 як еталон, "хромосомну прогулянку" здійснювали як в 5'-напрямку, так і в 3'--нсапрямку смислового ланцюга кожного мутанта. Наступні специфічні праймери використовувалися для кожного з мутантів:

Мутант 29065 . , ААССАСССТТСАССАТССОСИСО

Перший раз ОГ01-ММаІк3-Е1 (ЗЕ 10 МО-11) , АсССсСсаттоаТаттСсТосСтТАССИТ 0 01-ММаІк3-Е2 (ОО МО-12) , датассдассСсаАААСаатсСА 0 01-мМаїІк5 -В81 (5ЕО 10 МО-13) , дассададатосдадатадса 0 01-ММаІк5 -Н2 (БО 10 МО: 14) . й АТОАТСаСАаТоСССАдААС

Другий раз Ммит29010НО-М/2-5-1 (5ЕО 10 МО-15) ' ССААТСАаССТАСААТААСАА мМит29010НО-М/2-5-2 (5ЕО 10 МО-16) ' ААдсСапАСаАаТАААпАСаАс

Ммит29010НО-М/2-3'-1 (ЗЕ 10 МО-17) ' тата АСССАТТОАТААТС мМит29010НО-М/2-3-2 (5ЕО ІО МО-18)

Мутант 29066 . , ААССАСССТТСАССАТССОСИСО

Перший раз ОГ01-мМаїк3-Е1 (ЗЕ 10 МО-11) , АсССсСсаттоаТаттСсТосСтТАССИТ

О 01-умМаІік3-Е2 (ОО МО-12) , датасСсдасСсаАААСаатсСА

О 01-умМаІк5 -81 (ОО МО 13) , дассададатосдадатадса

О 01-уМаІік5 -Н2 (БО 10 МО: 14) . ' ваАААдАСАаасТТАТТааСА

Другий раз МиИТНАВОНО-МУ2-5-1 (5ЕО 1О МО-19)

НІ СААСААДАдаСАСасАСССАСА

МиИТНАВОНО-МУ2-5-2 (5ЕО 10 МО:20) не тТесАТОИаТАаЙТтТСААСТОССТОо

Третій раз МиИТНАВЗНО-М/52-1 (5ЕО О МО21)

МутнАВОНО-М/52-2 мо (ЗЕО І

МиИТНАВОНО-МУ/32-1 ССТААТССТОаАТССАСАИаИС

(ЗЕО І МО 23)

ССССАССОСАСАСТТАССАСА

МИиИТНАВОНО-Му32-2 (5ЕО 10 МО:24) . СССААСТСТАТАТТТТСААС

Четвертий раз МиИТНАВЗНО-М/53-1 (БО 10 МО:25)

АСТТОАААСТТ ТОИСТТТООаа

МИиИТНАВОНО-МУ53-2 (5ЕО О МО226)

АдаапААдСс,саспаСААСАТТТОа

МиИТНАВОНО-МУ33-1 (5ЕО 10 МО:27) воСасССстТААСОадалдсАСТТ

МИиИТНАВОНО-Му33-2 (5ЕО 10 МО:28)

Два мікролітри кожного продукту, які отримували в результаті кожної ПЛР, аналізували за допомогою електрофорезу на агарозному гелі, і концентрацію ДНК оцінювали шляхом порівняння з маркером молекулярної маси ом ОМА Маз5 І адаег (Іпийгодеп). Залишковий продукт ПЛР очищали з використанням Се! УмігагаФф 5М (Рготеда) і Системи РОК Сівап-Ор зузівт (Рготеда). Очищені ПЛР-продукти секвенували з використанням системи циклічного секвенування Відбуеф Тегптіпацог м3.1 (Арріїєа Віозувіетв), відповідно до інструкцій виробника.

Файли секвенування олеат-десатурази, отримані для кожного амплікона, збирали з використанням Програми збирання послідовності САРЗ (пПЕр//ррії.ипім-Іуоп!.п/сарЗ.рпр).

Отримані внаслідок ДНК-послідовності олеат-десатурази порівнювали з послідовностями олеат- десатурази лінії НА8ФУ, депонованими в СепВапкК (реєстраційний номер АУ802989) з використанням програми Сіиеа! М/ версії 2.1 (пер:/Лимли. січета!.ого), ідентифікуючої нуклеотидні вставки, присутні в мутантах 29065 і 29066, які, як було продемонстровано, мають розмір 785 пар основ (п.о.) і 4872 п.о., відповідно. Крім того, аналіз мутантних послідовностей ОІ/0О і відповідної послідовності дикого типу продемонстрував, що у випадку мутанта лінії 29065 вставка 785-п.о. була локалізована в нуклеотидному положенні 310 кодуючої ділянки гена ОГО, в той час як вставка мутантної лінії 29066 розміром 4872 п.о. була локалізована в нуклеотидному положенні 201.

спибожЖ пОоссІДОВВОСТЕЙ из АйУВвисв пет лад яепоехіХ, віха «180 НУКЛЕОТИДНІ ПОСЛІДОВНОСТІ, ПІНДАНІ МУТАЙТІІ ЗА ПОПОМОГОЮ ВСТАВКИ, ВКА

КОДУЄ УКОРОЧЕНІ БІЛКИ СЛЕВТ-ДЕСАТУВаАВМ, БЛЕМ, СПОСОВИ Її ЗвотОоСУВАННЯ «ТЛ» схгоапсвсей оі2евсо дЗеезєцкаве «1бй» В «із» Бахсеп)псій УуУсераеїсп о 5. «г1їйх 1 «в1ї2 104 «12» ВІЛДОК «їж нвІідасІних ялдіия «ож і має бі діа сі бі Туг ТПУ беж о Уаї Топ АввобБі Ап двОа Еко Цей 1 5 Ії 15

Аза дка Уві Ето БІВ А)в о був РІю Бех рне лах лі З1Уу АВ без гук то ж ЗИ рух Ага їїв бко Бто Ка Сув де зіп;рАка ох геї Сл оАжоа дви рре ї5 15 5

Чех тТух Маії цви Бак Авроїзи їн Тіе Тл АБа Уві ей Тух Нів Те

А вд, сг во За ак іа тТйх ТБ Тук бе пів Ні Пер о Вуо ТЕ Вус бебс бех Бет 18 Аїх сова та та ва

ТІр Аів Кек Тук Ткр Уві Маї Сів бу був Мяі Пед Тйс бі Уаї ТКо о за

Чаї ТВ Аза Яїз піс Сув сб1іу пе х05 «ій» вно ИН «віз БІЛОК «гій» беїкальйив «дане «ах ой

Меє бЗіу дів віт біз ТУ тн Бек Ууаї Тьс Ап са йЕ Та Депо Бк тай ї їх їо 15

Ав» АкЗ Маї Ро нів Аза був о вЖоОо Рхо Рпе отпх ХЕ б1у АвЕ о Пей дув я; 25 30 пив Аза тів Бко Бк Ні був о вБе сіл Аж дви оБеб ТВІ йхо бек о Бле

За по 4 жк Тут мМаї пеїм бах Ав ев ТУ її Тахо Ажїа ві пей Тук нів бів

Б І нс 50

Аіїв ТЕК Таж Суд ув Бе Тер пе З

«ЦИ 3 «81їз 1898

АЖ1оз ДИКЕ «з неВіїзпслиав апа: «ай» З взЕдесдсозсва чазаабасвс досхзеЧясс азвсувяавої зоссвокода сецазесосве що сасосаззяс сасосттсас сассзвесатє ссогавазау сеассссвоссо звсесопосовс х2О садсоосує пещоссотєс чіссвоогео деоесдсстя асововсеве зассотепей 182 сЕстассаса сптдссвесай ствсотосас сасстосога ссопессахто всссасоосв що сасисвссл асссозчеашо ссвасассос уссстсзоса оачЕссацчЯє сСатодоснас БО) чаакзЕдціс сасуазваазаї пусасозаса сСбсдасзсяа васссазаца аглзасатада Зо всасвазсазча засзвсзаза всугововша азаскссвсо асетвасстса дассавваах во твсзсессосве ассосіваато ссападцеаЗак зЗзвсасстзта свасасавасу васаватяєх За зевцессачс зазасстаєо уассовуеаза асвевасвав ссавлейсве асзсауатах Баг звсаачтукст стузазсаса взсспевахве стасваачЧаза ссазстаззає гассапстоа во часаеасвсесй чосазвоааса зпсазсвассо зайзсвзасад сааєсвзаєсвс созуарацоу БО зсуві свса сцвоааасе ссавствІцаа нессгявесо восКосвавсв асасевоачаса то йпассзвазаса гтваатеоссая зсацсавсва ссотачасаза асп дачає суласвасах тва апдассасас цопсваєває сплаплактай псахасаває абєссадаасй сепоатеока Вжб савседлЕсоЕ їззасааавє асастстадт ссвасдацатв ск Часоає парспоаате а спебсававазуь усасайасса ссоссасвсо ссобзуствеЄ всаассоваєт сасовасвза За счазкавгсваєс себасасаяс зассваоесса сазаваасвгз ссогазацасу бабвессвао ог сесасстваата йзуаєаессая позтавсасо ссоцсавостЗ Часпасвасс свашесоцає ІйвО ашхкжіанса гсттсассак спасає вЕбассваєч сопсодвосспає «середо 149 шжесестеста сесассвска скодоототе зпшивсшосбл сзвавтатази састессвос і ассеаїскссаз свзесстоазаєса сстссвасчас ведвадевІо сасссосава сссосаєста Ма5О засксссзса Япжскосана бассисавса всасвусоЯє ссасассаєсс засасякесо 1390 ссзстсксас собспостаа сесобагасо Своасостсав кЧспрсосос соаасесставу Іа зшеЧчісссЯає содосассас уссоосзасся осссскаваба сазассовасує зазапаєсвасо 1450 зздасацеісавє чсссовсаєс Ззудастяеса ссасаєсяєь свбосбссве сасасецеба 15'Ю «чисСаваяззу чісочесева чечввссасу собака собосссвко ЗЕбусовас пет споабжесгус зпссВксясе гагесбссазво асвббсасос педетсцосоа свбтаєзвея 162 чсксцовасо дсавсчагса акодоачсає казссзсває здасодсзає басочкакоє їв сгааасвасозє ссбссесевс ассвоессасз сасасусопЯс евсосавсбо спосозасаа Я пзсетосеса гвесчестасст чвадсвсаца ауссчссЯазо зссласУуєт зопчааа КВ. с. : - ОО З с: я зве ялЕн м чан зкЕссоствЕча баловисеосст ссстасоавач сагоабодавч зцацаєссвзо чати 185561 : дане а и ті ккд ков я шт поро ун фе гук стві др ік рум рин те ря ик тоне зді - Али акт Кс фс сс пік Кк па сх ША КМ сер о ек п ній я Я саке тюки А В

Екоассцедива вуасоассаа утувавоово ЗедЕЧЕЄссо дтассясаво задчаєдайеє ва на 1555. «ек ов «ей ДНК «й аж Вегруапертв. вигода «Ед» «01 У їінні озная «же сб ЕшЬ.. 408) «коа3» п одвляє собою а, с, зу або «Оп» й - КОХ т Ме ше а т сон ще пи заоч ку - е КК уж тк кА асгасусасзу задзасзсаєс чксодесЧасо зассавазата зосстасссода бсцпадбососх о спаєцтаваас сасостссас сатслусуає сізааазсвуа созбсосасс зсавсосстієо 159 сасвспассчєе бпайсосуктєс чессссесассокоороціова асстсвосвзї євсшоасьчго КВО сестаєсаса КЕсосвесає ссзквавтвс судкаасово адасастави Босвевкке ДУЙ ктстасгбас сататгасзов всозсасаєс ваватодавє возсасдаса свосваачай зай ль - пк пвараунчи при ее лоту тре ж - у Модест фон чик ззаваазссо заставссст аасзвсасава прссазаєсст азасвазоес вапіспавез зв щ- я зу, ї - и з паст ожотуінт вти я 7 рот - АС зввасзаєтла ззазсадста аасусуасоз Чодавсааст ссавізктас состав ей попдасослса затсссосвт сесссзасссї аслазтваацо сосЧваззото бспвасресе 35 васазбсссаса Сізосаствий застасссст зсссрозах сзабасузає задавав за сект стласт ставоздсаеосо педавесвавах вазсваксєвв. Єспоесасвлеа Секс пию Б тсесСстзазав сацузссвсов Ззсвасуєче бопосусов зчсвоссзса азакатевся 55 чесссассак бесосасеве абспвавскої оссввасааво сабсчсвсвовз садвавеокосг Тай ставстцссоае яссцосатсцо состав адексстаса часазоассаз аевсвассов тва сксотвоссЕ басбіссвата авагацесос ссссосавче адсавіовач аалзесчезия ва рана а Кві ик веж ро оц, еощощож ріж ук ин пика в г вод дов пу вс кур вні зах загзчочессо заспаввоцад савоссвасс засокасасс збззусасзає ассвассосго засо - тр ін вежу ух су кру ик я пружний що фауни ор дк пу ух Ер Б кпососпос сект осває вецаткосье зоспшссобаз псозошсссва сао аце 50 ях те ее ясних ки жваво ан - Свт - 5 У тин т ож тег асссдчзасоссп сачсависсав завше соч сесасзвасох сскайаЗвеВ ібхо - о и оди и па пе пор якою у реч шу кю ау . хр п

Кегасодває «адсаввисис сЯксяетьк остео саАЧЯЕ зсвавсвассї ссбаяоєае ПО вес рчової паксосеовиєс запаквееях ссбоспесса сКЕсасзаза осв 15

-ркспаєву давасессосї половодастаєт ссасуачвєс сапавгосстсо садваасаєсд Де «зсисатагс соссБсчосо вачеансвачяа ссесбсьсскч сстсассве пон оОюоо Ева зайаачівсу ссвасодасо слачессесо ебдссувасє сассаесаза стовавео Іо зсавазссва ссзесосасо всвВксзссот зсовсовІза зас сево чтаавакгтнйх хво

Чссцскасат асЧЕссодес ссткттсєва збозаслату закяассоце секелактов 1445 чаваакссоста згдствасат соусеєскосв вассгцтаУує вссачесбдса совадопове ува пковцаессяс абвсєдесКЕ Богавзоссоо сасвесодад ссссадестс кокоуваває їББО сессшсоадва зсстсовсасва сассюеової сойвачЕсає саєдсаядня пастка їб52О зсрассаввокі зукабасаат ссачссЕск Сібаодоусов засіладцсвад зрассшсасв. їепо чесвасваої сгдозасстуо засазасосс ссаподчовас савстососсо сзастеасату 179 авосссіттеа сзвпсодасст пассовогас согпсдавссх Чассзубсчс стватасоєв 1800 аспстогата ссоезттсовз ассаассусс стссЕЕсств соалоосвасіт ггорадссоов 1850 сзодссосат спец тсосав спсссетась ссостжсссяа ттоссогоссос псасетоїса ця косістоєтва сслусстава аактксстода стосассаєтос засусувсво ссосаадсвйа ІчЗво ацобтсатот ствІстсчава всевсісате восаедатуєт зеесеєвата тавпасассое 2043 гацаччавусс сСедатосдлаво спесаччеота сасаагдає совсчивова востспаєсче М спкастссстт азассовуєє зосадавсїс дссавсоссству спваздасусодс засахтсодас еТБй гсостаціта Ссссгосачс ксапссопп есладосеоас агогтсесвасє зассеатогоа 2220

Бексласклоа сжсістодцеіса сезЕрагуєо сасецсскс зпеавсівса Ффастотаєтта пово дсосавеаус вбсзтсесво хозадассва гсеЕсозттод дсссавссся абаттткова яко дасаассаєс спссвастов ссср суас свсєстбсас згооссвЕста рсасдвосва аю екктсбозтє Екусжкодано ссаствтаара КЕбсртсавс кссаотабца сгбзаваде тво адсссодце спвааесоуза взасоессомо савсовасех забаїссопа севабвнавав 258 веЕжсестесв жкесвавкіся вав ЕсУє асссскКОощЕ сссвазайца габсссвасав вно звсатпсевсвс кеЕТКессо Ячацедавов абессодає сестро аеесесавааа в54й савеЧЕсваці всссвазваЄ ссусвсясоуя бозсвавова зок езКех вавваєдаєсе ато квакастучоо ЕКО виСЕ деззастео пасоуксавес састовичає асадчсечес 258 зІісвачасав есспссосрсв завссвсасс засвазосву срсстааасу ваасасосцЕ нев усаакстста завочЕсссва дове едвс сесаотасес састееоско садчстчєос аВяа шасевацеся ксосдазчстс ватспссоосув гсбастуєавна вЕцеЕттсає зесассоУуво ез4 зЕчаастсвс сссосуссяє босатоїцат себе онся сЕСЕПлОСТЯЄ вЕпасавокИ зп чвттачассоу Сселаваасрса псзаававаєст асісцесісшн ОС атвзоо Сталева зай засссаадся дсссзассаа вас свас сасупідаса ваасавстос сасозуєцяй хо сзвазвассась стаїввссяс спссвеаєзЕс гсадкусатс збусозазас вапсастаце АЕНО. стквВастааа сесловєцаа акозслаїсу зассатсеза осот пасас зсоааксвса ко завуцааєтчє сссаззсоо сасствсдлазт Зсиптазавсва пузатвозс: всассовтаєи 3305 зІссузетаЯ госссозачоо сессастоса чосасстува сссостосаа ссасвуєскх зіва кспастьси блбрбасцзчстс бсассотаня ваубесєсев седевокрає севЕкессава заха ксСсевасісс сЕсосссацас сс віцас азауаватсвз здозавааагсот сЧасассаиа 3480 стасбазлесв псссцебадчс ячеставечтса савзасахко саскствааваї свосзсвсана 2540 задаасоссоі бівасЕсваа сесссоскеЄ сазсааавак спососсоЕс сскгавасву зп часСзасоєо сескасрадзчв есеставнсво піз ссвсВио дід сспац задав ЗЕ сзайедатсс сезавсасаї десасаваєх сСсаубооасосои сеспвЕссвса абсосвесоае За згашожсас: Засснзозосю поса сосьоачус пссзстоаЕ Есе Вспах зло саксекочшек зесазасачш БОсшсазаса готсасаєвЗ сисасевасєс аакесапчта зно

Ессе дчуссавотося аспавсзУусеє сссссоасес кеабсзееов Ева 3395 вслеччоса совет есузв гассссасса соєсгавзваса сеоссбсСсасува зсабдеосак а580 ссеспссоовса асоспічсвВа совсоссоКек Зздсавачівео пес сів саосазвеса 4095 сссавоЗ КЕ спря сусо басзуцакєсаєс звипачевоч создоесваазчсх подавав 050 сспсекктосов сесадсзаса дфесссжсевес содгвусоає пассоцоевоає ссссдбскео 4149 сппстассала зссастподет жетсссовосоа везссасвоє соссвраЗоЯ збаагсгсащ 4249 спосдовсцяс зозлааввст зсасскеіваос сосвквбазава Кссзпвначо ссср 428о пгжставизко соспасосове спасе соєвегтаса заасеспсає ссдовспеа 3358 чЧазасодосвв дсассдваро савссеяксс сесаавуєсяас ссазебсзас озвасавуєє аа чааваєцеавнсї авесссіссво асосокавіЯ зевассаясг зсстозастс деаватессо ВЕНЕЧЕ сучас сЕ оКЕстссаз засустісвся садазсссаскс сечасстссяа деососсекх 500 кзсаїасесс абасстасєде зба еске соссачосу зЗсачдссзаст всссеивгає лька саксседеса садечсассос зоссасттята всусттассв о ЗзкЕссатсоз Есе Яаес Ера аЗзрЕссвиовз аслвесрова сесьавЕсх сосазелазу аавесечеса коро ссдавиЕ ев стсаасоесиса завссзссає садова весУссрасу єшдауасьв сеосасаде 74 сзассацаєсус заЧіводсаод ссевастсаб десводвссє совссостсоє сцудвадавоє зва здакЕчессо сседдисасде СоссоїтЧее айсдестлаєс севассовеча всевксквоєсе зво зроре лу уже т ве пох шко - ще - - че ще - гри год я окон овен ол стчасассаєЄ ЧдоавагитвО сЧЕосвассаєча звовствас пассесотЕнг сс ссолВЕЕ тео спапасаосгвча зоепасвсваЄбст ввавтсизвас щшизс:ссасаве васплайлвлпа папа па 5 шекаслпсвчш зссасастах взвадсославо йповеоекасас зусСкайовта палива сича З сут й оду уявно дю ло род утру о ву с вза слу туюк оси ф-ту ут ухи го віпвдм ут зд ту В ву тоди дов вол по азставссеса с«сСеатасава ососваассса дасзаспчосв аСесвавсаз васзарсава й парон рр чн ри а до пекрмдаа ре пора п пора пи ку п ее ие пр ач завсвнства «сто ссає сЯеавасєавоссс саасасьтос аосаообесо свасссссктУ щшО тивтссвксч сага втаскцеата укссавучеє чел есесває сповасесеце ЗБ) тосвкссгесс аспввтосатч Сезоозепсед тут с аїсавзрчаву впасдасасх Вахо ун и ие - па и шофер пором и нн их рони - шрЯо во ера сн що атацисссся скокссасос ЗеосЕсвсо чдсссссеасі кссесчсочаз зрахацесаве Би сассоабсасо астсосяавсасє сазассвсис чассчзчасо зве сод ссссвависе За сосатсоззаве поссчсоччсва сксзчваавтас Ссставсавса сесоусссп сСсабедевсвох вечо ще.

Кз ера и кро нич чн при а ем ція хром оенлу ть их тричі - ди зсзссочесза стсссассст созссасос сток асеоач сготевасав чЕсЗпасеоа 459 гссосаєцасе бсЕсСсЗсста ббаставосс ссавосачес сівбу свсвв гчавсоіана вВижо я г у - ряд, тк пу ТЕ реа кв 5 реко хх гору ши сет ассеяча гадісвеуо созсаєоосу веластаєсза сассусусає сссттахкоспе БНО - н при пр ки кож ре пе - рух ям - ие уч ща чІсдсвзоза сзазаососьт частезевсо абсгсоасчтс апссЗуєсов чекдасудив за ск пкт кор ф киев дою улдутич не кущ ад цін рю рані ну ер еіррвия нена чиспваєвссаї Ессе пвосешстає соссазвсаса спсасссізо ссоузшелове РО чтассаказсо поЗавзеоссой ахточссазао зчадсевсоча счасвусезча ссесзаах ви г. г - ік - ії -- га - У еще я грат ре і их тт. 5 о недо нн пессесасссе всавочиЯКе сезссаевсх ассодвсзсСає абЯспесцевя поеатевчвиє ВО туди па Ж дя - зе - Щщ-ноц ас г з щи щ р шия яд лчя, Кан и ри и од сснасвапсцає спссасбасаа сусЯдасЯзваа пдсасазазЯаз сессуайасс часа есксоу ЗО чзагпастагє зчисзасня чЕсссочеЕо гараосвосса гсоудсаздаца Звизавачахя зо тех рот Зевзана тин гавсу дадевтае каретка до сила дан пп уп ждавчсвацяа соувічаєсаи завада со паза кавоу виш апцдалт ав ап кети т

«ІП 5 «тії АКВ7

«ги» ДНК ях І по якос дю ря чивіаР Нназіавстовчв аплишв

«00» 8 зсзпаасочсва чЧесаасастас зпсесщоласс звоспзазаса асссасссов копа есо БИ сік т дя ен туя єди дод сві єзетук т дує думав и ти хасасаавас сасссоесає сагсчеосцає сстлазаваєу стгасрссясс асасцсує 14 паяссачесоо Бавсоакоєсс дооксобас Федосов Уу асосбсвосаї васооссоєс ї55 ; че че а ТОБ г. чес федри ту вику одо - пон кан и п а п у дичину туда сптстаєсєсвса сподсовссво стаспоссас састетососв сисссстУувс асвсассшев 4 пасасевсЄ астоучсачо ссеаачасотоє чбоссосвсооа чпазчсстчаао паспесисає зай чаасчосчиє асовсаспес сСласдаєтає бсавзсЧавтея почасвстяг судесееаее 35 стбсазитесд сілтІвосСсЯаи сссосзсстб ссасУучаває асзессасся ссассассве о песвасасі часов сЕсаа дсоучовсЗаз зп свасосє всавассесо агсдавачоє ря сечічатасс совшЕетасіс сазаовастаса Згопооссося бпзссаувах пса ево в стЕсСасістоц зосоадоссвх ЧФесастрадев ссзвакчЕоас сподссцпасс совичасояе БО ттсдЧсептост зетаслоизсо вассвиссотї абуеасавсу аведесавався стассвадев вай

Зссасадтсся асасспопоаас поссасосасв кезссовксв сстассотУє постсакастив та дайте вс Ввепопеинще в; евак паля ееоєсов ся зе ія садили за запачасоче пососопсдас босу сссвь доазассосое бччасазчссус савиопоссек 780 стачЧсЗсгЧа боасовасцеє ссавсатасї сасссктадчее Кдосчсвсєта бсвеєвосстоо па чазгсотловас здогтавасос воасвісадсо всачедчасс асдассасоя кабувтоаво КК васцісотсе ахсагастає созсасвсяє почабдаосасс воссоскско засавичесх БО саттаствато сзасторааос всзааачава соцадатеза тпексзлеозча певсаксо ТПпаО екол щи с г: а чия ет Я їх хх Пон жди фото я жук от щити о рен - потуг сттагсзаса сесосаксісв сЧовзоссаса Соудасасавуа сдазазавва сеЕБЯоссуЄо Уп85 зчассзачаєсс зсдпазвзоуосав ацчвлеясасоа кІссЗобасз сзпавсадавк пава Вал «2102 8 кФ11 378 «ій БІЛОК «8132 Яазїтапспив випив «щк є

Ммек біу діа ссіу Біз Тую Тпу бек Мві Тйх Ап са Ап Аа Рео їжу ії В 13 їх

ВввоАко Уві ржо Ніз хів руз бо хо Бе три їі ЗрУу Азв о Бей Буг 2 «5 зо пу вла бів Бо РешоМів Суб не біт Ага беж Бех ТБ Ат Вед БКе п д й о 55

Пек тух Маї сви Шегк Аз Шеш Тпс її Бтвковіа УЮ бе Тук НПь- бше 5 УВ, во

Хтіа ТЕ твЕ Тук вна снів Ні їю Рей оліЧую то Бе деї Бек сів Азії бе то Те но

Тхкровіа зе Ту То УМаї тУаї ЗМР ді бух Маі Пез ївЕ піу Уаї тТЕв се що ке 85 ЗО 5

Зтаїі тів Аза Ніж бівссСуз бі Ні Ні дів Бре бек Азр отут бій тор об 125 1 чаї ВзО Аве ТБ Уаії бу вЗе туаї раб Нія Бек ем Бей Бей уві со її5 ї2о ти

Тук не Бех ТкКробуз Тук 5еж Вів Нів Акч Ні Вів о бек Ава отак БІ їла вес що зе рез іш КО Аврошех Уяі бле уві ко Був беховку веж пув уві 145 М 155 хо ко Ткр Тут Бек Був тує Ве дБ Азп Ти Уві бБіу йуЗ Гі уві Бех ке ї17О 175

Мет впе бві тТнжЖ Себ ТЕ Бей осіб ТЕроббо без ТУє бе) Аха Бйе лап вич ще т 189 і95 чо

Ж ла І х йони т й Дюк й От що й год ху зи юну ПИ таі вес бі всз Ржо Тут Авзоодка глеодіа Су вв Тую шві ла Ле

Із що 2п5

Бек Рро Мес Тут бзпосзій ту Муз Ага Тух біп ТР Узі Меїх ех Авр

ЩО 5 чеО и Ин ЧА я. У Зоо Я сте . щ - кош з ж. жу х її фу Пів Уві 138 Тк Беє Бе ТЗіе їз Тук ко Уві Аза Мей 818 тутнт Бе пт ях

ЗЕ ЖИ 235 жа шо ри їжу с геї ча низи не. 1 ще я Машею їй пу оаіу пем уві Тко Уві її Сув Уаї Туг Бім Уві Ро цем Мек Узі 285 ЗО В їх дещо до сно тод щі што Та тіж Бчуу: Ж ма її Я шо тя Мі щ ув

Уві Аве Аза с Врж Ге Маї Ббец їїе тТнЕ тую Бей ось Чі ТТН Бі ро

Я дек пря

Бо 253 ВЖК

Зі пев Бго Біз Тут дар обек Вех 516 Тхробва Тїкр оцей Був біУ Аа г схот --и ша 285 55 їіев іа ТЕ Чаї Аробто Авзроїхк б5іУу Уві Гео Азпоцуз Уві Рве Нв їсти туя зт ща 285 ЗО нія Тів таж йвер ток Піх Улі Уаї Нів о Нія Бей Рпе Бех ТпроМеб рко жкож ю. очи тА проку

Зав 319 315 о вів'тут айва діа мМеб біб Аївосзіп буяє дів бео Акту Вко Уді мец сіу

Зх 530 35 сх їх т: дл яв Тк гоже ОМ, деки пари ПА коту т ді т я До сі Тук Тух дхо вне дяр був Таж Ехо Брпєе Тук Мазі Аїа Мехс Тто Аа 345 За ВУ - е лях йсрая тю ша пр жо етчя Т г х 2 мишко ш яз й зим Мет цу за Су пес Рне Узі Су» зб АвроАврозій сі Пув Біу 355 360 385 сіу ді Ре о Ткр тує Пув Аяг цу Меб дал за ТІ5 «й 7 ками аб хорт тих «же ДНК. «й Штучна послідовність «ех долу ук пи и, хх я От кита» прюВимемп ЗБЕ

Яанує 7 чЧазвашеско зЗсазасаде Сапа : я кеїуж З уч . хлівм 84 «їй ДАК сті Штучна послідавність сУЕлея . «ших пфайшеевр ЛЬШЕ «в» В аква квота на нини кан тв нем тя сказтассзв аБакчашіах с о чеках З «те» ий «Ей ДНК 2132 Штучна послідовність. коня «ие рити -х т дов кл «йи3» праймев Обртрафйучкх «Офо. яотрв пра с ря протя яцрічр Я с ие ТЕ аватастота всазвсасауєю ча «Я «Ром 1 «вії дБ «ей ДНК ше Штусйниа лпоспійовність сут «ших «ТИМ праймер ОБ - БІ «ап» 10 с мує сесавцавссво сасвасвчосо ве: 25 суїах 11 : «тії» хх я пня: «иїй» дик «213з ШруУчЧнаА послідавнуств кевух сша» праймаю сЬОі-паїка -гї «а Ті сддю В ря зассастоте сассвоссос т кі хе квРух о «2122 ДНК «ка1ї- ШЩеучна послідовність ших шиття - са кеша потАту Ше «ти3» праймеюв ПОшь- маїка ек чайпов 12 звиссукссци гетссивеце в хеій 13 - сржія ні сто туту яп ли, - «15 «М «ре ДНК «13» Шенчна послідовнаств шкі ка

«йЖЕае праймев ОСрі-йвіка -К зап 3 ота етан З тещі ие заспссвоуу дЧевавсочссв У р НН чат ру їм 80 «ій ДНК «вій» Штучна послідовність «ХВ «иБов праймер ОдохеквІкА а «апох Тй р дж тю вет. дих ниє пі кчсесчазлацу Зачаледвов З сита 15 «вІїів Я «3» Штучна послідовність «Ох сутутх ще їх ЕТ ит ж ту ит «232 пВаймею МОТО НО- Мана «Аа 15 г. - тут випактосєвт песссававу ра. «вл їй ше т шкі кї «125 ДНК вт дить гуеутЯ перрі ем аа» Штучна послідсвнисть «ат» «ла» праймер МОТО ТОНОМИ- 5-Й «ах 16 іга ич ауто З де дах Ба ппвассбасцео сасзавгавса а в «103 17 «її йо «ві2» ДНК

Ії Штучна послідовність «ово» «й праймер МОТО У

Ди хтавах я й й Я рок заддшчсдиня свалевоссті жо «ВК а «ев о «дій» ВЕ киїї» Щеучна посліцевніссе шив «та» праймав МОТияО10нО-ии но хаООм Ей тсчссуасоо агтрлдавравтс що «51пх 18 е1ік о «Феї2м ШК «кій» Штучна поолідовнесте ул й .

Мини ст» поаймев мМмутнАВанОо-маяаи 1 - каййх 9 ч«чазгасаца Усова «У «піп дО дет: ЬІ вия киїї- о ткали тру «їй НЕ -рійж Штучна послідовність «ши. сала праймер МИТНАЯаНО-на Ви «Чоп а дея хар ж ди соку т МУ пивпізвавгиа пасвосошаса ро хитро |: «|» 21 «1» во «геї ДНК «13» БУчЧНа пОослідовийсті стутук ве ий що руту ту кО я зе Ех «гаї» праймем МИТКАЦаНОЗиоЕн А «аби ВА пор ни пу ен ря тсєзкчусатче савссксево р «віп» й «811» ві «й1ї2» днк тій» Штучна послідовність «й? дату шт зу ів св «еп і1х поайшею МПТНАНЯНОСщнатя «апо» ша за я рю у в ик нт рек им -к туз пошеЕхтеето спосо Ооцев ов шої «105 3 «ввів о 0. трат сте 21.5 пе кеї1йз СДН «ВМ» шана послідовність «Ей ект судо з пк иуалмтюя сш праймав МИОТНАВиНОМ Зої «пох в пи

Я пре мае не нини щоерития ВО сегнассцозо еспеасаищи «ТО» та «її 15

Кеш МК кеїй» ЦК «2135 Штучна послісовністіь. : «ву»

На шаканів АВУЕХ зи. М «жа» праймер МОТНАВЗНО-иЗиня

ГАК РЕЯ ацтя я т деспасавса ссівспвая їх «ши и «еїїз й «їй» ДНК есеї: Штучна пасдідсвніств «Ой х . «23» праймер МОТНАВОНИ-щОні «аг» яв . ях тат ун че м м м в чи за чссвасссба Сешоовоа дуУзах 26 сш жа кише» ДНК си» Штучна послідовну сть «Ши я с удрльнуеи ВИК Туристи я «хвЕЗ» праймер МОЖНА Ван «квапУ иб увів дріт Злити в рих й писав поши ст гц «ім кі «1» й «аа ЛЕК «-к1ї3з Штучна послідевнієтіи «ит» че пк доню В зклщт АК «ийах праймею МОТНАЯЗнНОнИЯИІ «ас в ще зо зодчавосдае пав сеЕСКо стики шити, нин «кий» еВ «ії З

У Ко вуркеж сих ДЕ «213» Штучна посліпзаніств

«ВЕУ кт» праймер МИТНАНУВО-ТЯХ3-а «ау» 8 1 зссчсствас даедадувоссе

Claims (21)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Виділена нуклеотидна послідовність, яка містить передчасний стоп-кодон в ЗЕО ІЮО МО: 5, при цьому нуклеотидна послідовність кодує укорочений білок олеат-десатурази соняшника, що має низьку ферментативну активність.

2. Послідовність за п. 1, де послідовність кодує укорочений білок олеат-десатурази соняшника, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮО МО: 1 і ЗЕО І МО: 2.

З. Послідовність за п. 1 або 2, де вказана нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО: З ії БЕО ІЮО МО: 4.

4. Укорочений білок олеат-десатурази соняшника, що містить не більш ніж 110 перших амінокислот М-кінцевої ділянки олеат-десатурази дикого типу, при цьому олеат-десатурази дикого типу ЗЕО ІО МО: 6.

5. Білок за п. 4, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з ЗЕОІЮ МО: 1 і ЗЕО ІЮ МО: 2.

6. Рослина соняшника, здатна виробляти насіння із вмістом олеїнової кислоти від 80 до 95 95 відносно сумарного процентного вмісту жирних кислот насіння, при цьому рослина соняшника включає ген олеат-десатурази, який має нуклеотидну послідовність, визначену в п. 1, при цьому нуклеотидна послідовність кодує укорочений білок олеат-десатурази соняшника, що має низьку ферментативну активність.

7. Рослина за п. 6, де нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: Зі5ЕОІО МО: 4.

8. Насіння соняшника, що має вміст олеїнової кислоти від 80 до 9595 відносно сумарного процентного вмісту жирних кислот в насінні, при цьому насіння соняшника включає ген олеат- десатурази, що включає нуклеотидну послідовність, визначену в п. 1, при цьому нуклеотидна послідовність кодує укорочений білок олеат-десатурази соняшника, що має низьку ферментативну активність.

9. Насіння за п. 8, де нуклеотидна послідовність вибрана з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: Зі5ЕОІО МО: 4.

10. Насіння за п. 8, де укорочений білок олеат-десатурази включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО: 1 і ЗЕО ІЮ МО: 2.

11. Застосування насіння соняшника за будь-яким з пп. 8-10 для отримання олії.

12. Застосування за п. 11, де вказане насіння вибране з групи, яка складається з: а) лінії 29065, яка має реєстраційний номер МСІМВ 41733, і Б) лінії 29066, яка має реєстраційний номер МСІМВ 41734.

13. Потомство насіння за будь-яким з пп. 8-10, яке відрізняється тим, що воно продукує вміст олеїнової кислоти від 80 до 95905 відносно сумарного процентного вмісту жирних кислот в насінні і включає передчасний стоп-кодон в гені, що має ЗЕО ІЮ МО: 5, де вказаний передчасний стоп-кодон приводить до синтезу укороченого білка олеат-десатурази, що має низьку ферментативну активність.

14. Спосіб отримання рослини соняшника з високим вмістом олеїнової кислоти, який включає наступні стадії: а) здійснення мутагенезу частини рослини соняшника; Юр) отримання щонайменше одного потомства мутантної рослини, і с) ідентифікація і селекція щонайменше однієї рослини, отриманої на стадії Б), яка включає нуклеотидну послідовність, визначену в п. 1, при цьому нуклеотидна послідовність кодує укорочений білок олеат-десатурази соняшника, що має низьку ферментативну активність.

15. Спосіб за п. 14, де стадію мутагенезу здійснюють шляхом ін'єкції мутагенного агента в квіткову головку рослини.

16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що він додатково включає стадію опромінення насіння рентгенівськими променями.

17. Спосіб за п. 15, де мутагенний агент являє собою етиловий ефір метансульфокислоти в концентрації від 5 до 15 95.

18. Спосіб за п. 15, де стадію мутагенезу проводять шляхом опромінення насіння рентгенівськими променями.

19. Спосіб за п. 15, де укорочений білок олеат-десатурази включає послідовність, що складає не більш ніж 110 амінокислот М-кінцевої ділянки.

20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що послідовність укороченого білка олеат- десатурази вибрана з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 1 і 5ЕО ІЮ МО: 2.

21. Спосіб отримання соняшникової олії з високим вмістом олеїнової кислоти, що включає екстракцію олії з насіння соняшника, вибраного з групи, яка складається з лінії 29065, яка має реєстраційний номер МСІМВ 41733, і лінії 29066, яка має реєстраційний номер МСІМВ 41734. І рисосевся астнні і дерен ин пон ї тт ! 2 Н й киш и НИ ' ле ; та КО є - 804 | ні ко 5 | сш ! ща тя їй

5 В. ще во. й - на Ж |на, етери - нин о п нини с я С Ї : т ї оп птн - сн «ой В то дення нин Енн, ши пончо ЕЕ, ш Я З шк і й шиичнн ів 8 і й Ї ї | в 5 ! во В м ій М е і 0 г 5 й ей Ї бо ! Ні : в

Бо. я сво іі : | ян и подана апа а ооо во ввююво Ви еВ В В а ВО В В Ваня тп дчове тв ти «Первісток»Ни плекає вт пі «Первістокюєи

Фіг. 1