TWI909660B - 包含間充質幹細胞球體的皮膚傷口或疤痕治療用組合物 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種皮膚傷口或疤痕治療用藥物組合物，其包含在治療上有效的量的間充質幹細胞球體，上述間充質幹細胞球體被局部塗覆在目標部位或者通過皮下或皮內注射而給藥。

Description

包含間充質幹細胞球體的皮膚傷口或疤痕治療用組合物

本發明關於皮膚傷口或疤痕治療用組合物，詳細而言，關於包含被局部塗覆或通過皮下或皮內注射給藥的間充質幹細胞球體作為有效成分的用於皮膚傷口或疤痕治療的藥物組合物或填料組合物。

皮膚是身體抵禦物理性和環境性攻擊的第一道防線，皮膚受損時，傷口可以啟動傷口癒合過程而形成疤痕。在理想情況下，傷口癒合過程應形成幾乎沒有疤痕的皮膚，但部分個體可能會經歷過度纖維化或萎縮，導致疤痕疙瘩、肥厚或萎縮性疤痕。與包含組織增生的疤痕疙瘩和肥厚性疤痕不同，萎縮性疤痕產生凹陷的疤痕。萎縮性疤痕的地形凹陷被認為是由於受傷後真皮膠原蛋白和結締組織的不當補償導致的。萎縮性疤痕可以由於硬皮病、懷孕期間的妊娠紋、痤瘡、手術、事故等各種原因而發生。病理性疤痕特別是在位於身體的可見部位時，可以大幅降低生命的品質並且誘發心理壓力。本發明提供了一種利用自組裝脂肪來源間充質幹細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）的新型治療方法，在疤痕治療中，可以有助於提高生命的品質。

為了改善疤痕外觀，使用了各種治療法。這樣的治療法中包括切口、雷射和皮膚填料注射。作為皮膚填料，廣泛使用有透明質酸（Hyaluronic acid，HA）、膠原蛋白（Collagen）、聚L-乳酸（Poly-L-lactic acid）、羥基磷灰石鈣（Calcium hydroxylapatite）等。但是，透明質酸和膠原蛋白是具有短期效果且只能維持幾個月的填料。相反，聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethylmethacrylate）、聚矽氧烷（Silicone）等永久填料雖然持續時間長，但肉芽腫、聚矽氧烷栓塞症候群、結節形成等併發症的風險較高。

為了克服這樣的人工填料的局限性，需要新的途徑，而幹細胞的使用正在成為新的替代方案。作為成體幹細胞的間充質幹細胞（Mesenchymal stem cell，MSC）由於自身再生能力、促進再生的因子的分泌、免疫調節能力，已被確認在促進傷口癒合方面表現出優異的潛力。可以從骨髓（Bone marrow）、脂肪組織等各種組織中獲得。目前，大部分的細胞治療劑的給藥是以單細胞形態注入或移植。單細胞的MSC存活率低，移植時的移植成活率非常低。因此，在使用MSC作為皮膚再生治療劑時，需要改善移植後的存活率和移植成活率增加的形態，特別是，作為用於結締組織的減少引起的萎縮性疤痕的治療劑，開發一種富含結締組織的成分的形態的細胞治療劑非常重要。

對此，本發明的發明人們為了解決上述的問題，通過確立對皮膚再生最佳的物理培養條件，製作包含富含細胞外基質並同時能夠移植和長期體積維持的幹細胞的組合物，從而完成了本發明。此外，本發明的發明人們製造間充質幹細胞球體，從而確認了移植到皮膚的MSC長期維持皮膚體積。經此，確認了間充質幹細胞球體克服了現有的細胞基礎治療法的局限性，作為皮膚填料，具有更持續的效果。

本發明的目的在於提供一種皮膚傷口或疤痕治療用藥物組合物，包含在治療上有效的量的間充質幹細胞球體，上述間充質幹細胞球體被局部塗覆在目標部位或者通過皮下或皮內注射。

另外，本發明提供包含間充質幹細胞球體和藥學上可接受的載體的皮膚傷口或疤痕治療用藥物組合物。

另外，本發明提供包含間充質幹細胞球體的皮膚再生用填料組合物。

另外，本發明提供用於製造被局部塗覆於目標部位或通過皮下或皮內注射給藥的皮膚傷口或疤痕治療用藥物的根據本發明的間充質幹細胞球體的用途。

另外，本發明提供被局部塗覆在目標部位或通過皮下或皮內注射給藥而用於皮膚傷口或疤痕治療的間充質幹細胞球體。

另外，本發明提供將間充質幹細胞球體的治療有效量局部塗覆或通過皮下或皮內注射給藥到需要皮膚傷口或疤痕的治療的受試者的目標部位而治療皮膚傷口或疤痕的方法。

除非另有定義，否則本發明中使用的所有用語（包括技術和科學用語）具有與本領域技術人員通常理解的含義相同的含義。還應理解：諸如在通常使用的詞典中所定義的用語應當被解釋為具有與它們在相關技術領域的上下文中的含義相同的含義，除非在本發明中明確地那樣定義了，否則不應解釋為理想化或過於形式化的含義。

本發明中使用的用語只用於描述特定的實施方式而並不旨在限定。在本發明中使用時，單數形式也旨在包括複數形式，除非上下文中有明確不同的表示。此外，“包含的/包括的”“包含/包括”“具有的（Having）”、“具有”、“帶有（With）”這些用語或它們的變形被用於詳細的說明和/或申請專利範圍中的任一處時，如上所述的用語旨在以類似於“包含/包括（Comprising）”這一用語的方式的概括。

除非本發明中另有表示，否則對於數值範圍的描述在本發明中只作為單獨描述其範圍所屬的各單獨的值的簡寫方法，各單獨的值如其在本發明中被單獨提及那樣被併入說明書中。本發明中提供的任何的所有的例子或代表性的語言（例如，“如~所示的”）的使用單純旨在更好地說明本發明，除非另有主張，否則並不限制本發明的範圍。說明書中的語言不應被解釋為表示任何的未要求保護的要素對於本發明的實施是必需的。

本發明的發明人們確認了將脂肪組織來源的間充質幹細胞進行三維培養而製造的間充質幹細胞球體的膠原蛋白I型（Type I collagen，ColI）、纖連蛋白（Fibronectin，FN1）、透明質酸（Hyaluronic acid，HA）、糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）、肌腱蛋白（Tenascin，TNC）和蛋白聚糖（Proteoglycan-4，PRG4）的表達量或產生能力優異。因此，根據本發明的間充質幹細胞球體在皮膚再生、皮膚傷口和疤痕的治療中具有優異的效果，特別是確認了在治療上表現出效果的最佳的用量和用法。

本發明涉及皮膚傷口或疤痕治療用藥物組合物，包含在治療上有效的量的間充質幹細胞球體，該間充質幹細胞球體被局部塗覆在目標部位或者皮下或皮內注射而進行給藥。

間充質幹細胞球體

本發明的間充質幹細胞球體可以將間充質幹細胞（hMSCs）二維培養並使用三維培養技術製造。

在一實施例中，本發明的間充質幹細胞球體（本說明書中也命名為MiB）可以是將間充質幹細胞（hMSCs）從人類的脂肪中分離後，進行二維培養並使用三維培養技術而製造的。

上述“二維培養”是指將細胞在細胞培養瓶或平坦的培養皿等所有類型的培養容器中單層培養。

上述“三維培養”是細胞與圍繞自身的三維全體相互作用的同時培養的，具有細胞可以向所有的方向生長的特徵。

上述“間充質幹細胞球體（MiB）”是指各種大小的單位球體，為細胞的自組裝形態。

在本發明中，上述間充質幹細胞球體是培養間充質幹細胞而製造的間充質幹細胞的三維細胞聚集體，是指細胞沒有解離，而是聚集在一起以三維細胞組織形態存在。更較佳為脂肪來源間充質幹細胞的三維細胞聚集體。

上述間充質幹細胞球體可以通過培養成體幹細胞而獲得，上述成體幹細胞可以利用市售的幹細胞或從活體組織中分離的幹細胞二者。

上述間充質幹細胞球體可以有效地誘導皮膚再生和皮膚傷口及疤痕的癒合，如上所述的間充質幹細胞球體處理引起的與皮膚再生和皮膚傷口及疤痕的癒合效果有關的生長因子表達或膠原蛋白產生與間充質幹細胞單細胞（MSC single cell）處理相比，顯著高。

在本發明中，上述間充質幹細胞球體的直徑可以為10至800μm，較佳地可以為20至600μm，更較佳可以為30至400μm，更較佳可以為60至300μm，更較佳可以為80至200μm。

在本發明中，1個上述間充質幹細胞球體中所包含的間充質幹細胞的數量可以為200至800個細胞，較佳可以包含250至750個細胞，更較佳可以包含300至700個細胞，更較佳可以包含400至600個細胞的間充質幹細胞。

在本發明中，上述間充質幹細胞球體的濕重（Wet weight）可以為1至6μg，較佳可以為2至5μg，更較佳可以為2.5至4μg，更較佳可以為3.19±0.5μg。上述間充質幹細胞球體的濕重涉及1個間充質幹細胞球體的濕重。

在本發明中，上述間充質幹細胞球體的乾重（Dry weight）可以為250至500ng，較佳可以為280至450ng，更較佳可以為300至400ng，更較佳可以為303至370ng。上述間充質幹細胞球體的乾重涉及1個間充質幹細胞球體的乾重。

在本發明中，上述間充質幹細胞可以為選自脂肪來源間充質幹細胞、骨髓來源間充質幹細胞、臍帶血來源間充質幹細胞、臍帶來源間充質幹細胞和外周血來源間充質幹細胞中的任一種或更多種。較佳可以為脂肪來源間充質幹細胞，更較佳可以為人類脂肪來源間充質幹細胞。

在本發明中，上述間充質幹細胞球體可以包含間充質幹細胞（MSC）和細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）。具體而言，上述細胞外基質可以包含膠原蛋白（Collagen）、纖連蛋白（Fibronectin）、透明質酸（Hyaluronic acid，HA）、彈性蛋白（Elastin，EL）或糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）等。

另外，上述膠原蛋白較佳可以為1型膠原蛋白。

更具體而言，根據本發明的間充質幹細胞球體可以是膠原蛋白（Collagen）、纖連蛋白（Fibronectin）、透明質酸（Hyaluronic acid，HA）、彈性蛋白（Elastin，EL）或糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）等的表達與單個間充質幹細胞或真皮成纖維細胞（dermal fibroblast）等的表達相比，更高。

在本發明中，上述間充質幹細胞球體可以是選自成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor 2，FGF2）、血小板來源生長因子（Platelet-derived growth factor subunit A，PDGFA）、血管內皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）和胰島素樣生長因子1（Insulin-like growth factor 1，IGF-1）中的任一種或更多種的表達增加。

較佳地，上述間充質幹細胞球體可以是血管內皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）或它們二者的表達增加。

另外，較佳地，上述間充質幹細胞球體可以是成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor 2，FGF2）或血小板來源生長因子（Platelet-derived growth factor subunit A，PDGFA）的表達維持。

更具體而言，根據本發明的間充質幹細胞球體可以是選自血管內皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）和胰島素樣生長因子1（Insulin-like growth factor 1，IGF-1）中的任一種或更多種的表達與間充質幹細胞或真皮成纖維細胞（dermal fibroblast）等的表達相比，更高。

另外，根據本發明的間充質幹細胞球體可以是成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor 2，FGF2）或血小板來源生長因子（Platelet-derived growth factor subunit A，PDGFA）的表達與間充質幹細胞或真皮成纖維細胞（dermal fibroblast）等的表達是相同的水平。

在本發明中，上述間充質幹細胞球體對於選自CD29、CD44、CD73、CD90和CD105中的1種以上的標誌物為陽性，對於選自CD31、CD45、CD79a、CD117和HLA-DR中的1種以上的標誌物為陰性。

間充質幹細胞球體具有對於選自CD29、CD44、CD73、CD90和CD105中的任一種或更多種的標誌物至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上陽性表達的細胞。此外，間充質幹細胞球體具有對於選自CD31、CD45、CD79a、CD117和HLA-DR中的任一種或更多種的標誌物至少10%、9%、8%、7%、6%、5%、3%、2%或其以下陰性表達的細胞。

更具體而言，間充質幹細胞球體具有將CD29、CD44、CD73、CD90和CD105至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上陽性表達的細胞。此外，間充質幹細胞球體具有將CD31、CD45、CD79a、CD117和HLA-DR至少10%、9%、8%、7%、6%、5%、3%、2%或其以下陰性表達的細胞。

另外，間充質幹細胞球體具有將CD29、CD44、CD73、CD90和CD105至少95%、96%、97%、98%或99%以上陽性表達的細胞。此外，間充質幹細胞球體具有將CD31、CD45、CD79a、CD117和HLA-DR至少2%、1.5%、1%或其以下陰性表達的細胞。

本發明的間充質幹細胞球體由於來源於脂肪，對於CD29、CD44、CD73、CD90、CD105標誌物陽性表達，對於CD31、CD45、CD79a、CD117和HLA-DR標誌物陰性表達。

本發明的間充質幹細胞球體可以表達選自肌腱蛋白（Tenascin，TNC）、纖連蛋白（Fibronectin，FN1）、蛋白聚糖（Proteoglycan-4，PRG4）、COL5A3（Collagen Type V Alpha 3 Chain，V型膠原蛋白α-3鏈）、COL7A1（Collagen Type VII Alpha 1 Chain，VII型膠原蛋白α-1鏈）、EVPL（Envoplakin，包斑蛋白）、EFEMP2（Fibulin-4，纖維蛋白原-4）、MFAP2（Microfibril Associated Protein 2，微纖絲關聯蛋白2）、FBLN2（Fibulin-2，纖維蛋白原-2）、HSPG2、FBLN1（Fibulin-1，纖維蛋白原-1）和COL6A3（Collagen alpha-3（VI）chain，VI型膠原蛋白α-3鏈）中的任一種或更多種蛋白質。

具體而言，本發明的間充質幹細胞球體相對於單個間充質幹細胞，肌腱蛋白（Tenascin，TNC）和纖連蛋白（Fibronectin，FN1）的表達量顯著高。

另外，本發明的間充質幹細胞球體特異性表達蛋白聚糖（Proteoglycan-4，PRG4），與單細胞相比，可以重新表達COL5A3（Collagen Type V Alpha 3 Chain，V型膠原蛋白α-3鏈）、COL7A1（Collagen Type VII Alpha 1 Chain，VII型膠原蛋白α-1鏈）、EVPL（Envoplakin，包斑蛋白）、EFEMP2（Fibulin-4，纖維蛋白原-4）、MFAP2（Microfibril Associated Protein 2，微纖絲關聯蛋白2）等蛋白質。

上面提到的表達水平的增加例如可以是指與一般的間充質幹細胞相比，至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或其以上的上面提到的任意的蛋白質本身或其基因水平增加。

在一部分實施方式中，治療中使用的間充質幹細胞球體也可以命名為TRTP-101。

包含間充質幹細胞球體的傷口或疤痕治療用組合物

本發明提供包含在治療上有效的量的間充質幹細胞球體的皮膚傷口或疤痕治療用藥物組合物或細胞治療劑組合物。

上述藥物組合物可以局部塗覆或通過皮下或皮內注射給藥到需要皮膚再生、具體到真皮或皮下層的皮膚全層的恢復的部位，從而治療皮膚傷口或疤痕。

在本發明中，上述藥物組合物可以劑型化為注射劑型、注入劑型、噴霧劑型、液體劑型、懸浮劑型、外用劑型或貼片劑型等各種劑型，較佳可以劑型化為注射劑型、注入劑型、懸浮劑型或外用劑型。

上述“治療”是指通過根據本發明的間充質幹細胞球體的給藥，上述疾病的症狀好轉或有利地改變的所有行為。例如，與自然癒合相比，可以是提供在縮短的時間內的皮膚再生或者傷口或疤痕的癒合。上述治療可以包括傷口或疤痕的改善和/或緩解。傷口或疤痕的改善是指降低傷口或疤痕的程度。此外，上述治療可以包括治療傷口和/或與傷口有關的疾病二者。上述治療可以是指由傷口誘發的受損的組織的癒合和/或再生。上述傷口治療可以是指皮膚再生，具體而言，可以是指恢復皮膚內真皮。此外，上述治療可以維持上述受損的組織的原始組成。此外，上述治療可以使與傷口有關的疾病的併發症和/或疤痕最小化，同時促進上述受損的組織的癒合和/或再生。

另外，本發明提供包含間充質幹細胞球體和藥學上可接受的載體的皮膚再生、皮膚傷口或疤痕治療用藥物組合物。

上述皮膚再生、皮膚傷口和疤痕治療用藥物組合物可以包括藥學上可接受的常規的非活性載體或稀釋劑。可以包含在本發明的藥物組合物中的藥學上可接受的載體和稀釋劑包括：賦形劑，諸如澱粉、糖和甘露醇；填充劑和增量劑，諸如磷酸鈣等；纖維素衍生物，諸如羧甲基纖維素、羥丙基纖維素等；結合劑，諸如明膠、海藻酸鹽和聚乙烯吡咯烷酮等；潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、氫化蓖麻油和聚乙二醇，崩解劑，諸如聚維酮、交聯聚維酮；表面活性劑，諸如聚山梨酸鹽、十六醇和甘油等，但並不限定於此。上述藥學上可接受的載體和稀釋劑對於接受其移植的受試者可以是生物和生理親和的。作為稀釋劑，並不限定於此，但可以舉出鹽水、水溶性緩衝液、溶劑、懸浮劑和/或分散劑（Dispersion media）。除此以外，例如，注射劑可以進一步包括保鮮劑、無痛化劑、增溶劑、懸浮劑或穩定劑等，局部給藥用製劑可以進一步包括基劑（Base）、賦形劑、潤滑劑、懸浮劑或保鮮劑等。另外，在一實施例中，進一步包含的懸浮劑包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium，杜氏改良伊格爾培養基）、MEM（Minimal Essential Medium，最低必需培養基）、BME（Basal Medium Eagle，基礎伊格爾培養基）、RPMI 1640、F-10、F-12、DMEM/F12、α-MEM（α-Minimal Essential Medium，α-最低必需培養基）、G-MEM（Glasgow's Minimal Essential Medium，格拉斯哥極限必需培養基）、IMDM（Iscove's Modified Dulbecco's Medium，Iscove改良杜氏培養基）、MacCoy's 5A培養基、AmnioMax complete培養基、AminoMax±complete培養基、EBM（Endothelial Basal Medium，內皮細胞基礎培養基）培養基、Chang's Medium、MesenCult-XF、DMEM/HG（Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose，杜氏改良伊格爾-高葡萄糖）培養基或MCDB+DMEM/LG（MCDB+Dulbecco's Modified Eagle's Medium low glucose，MCDB+杜氏改良伊格爾培養基-低葡萄糖）等，但並不限定於此。本發明的組合物可以在不冷凍的狀態下使用，或者可以冷凍以供以後使用。在必須冷凍時，可以在冷凍前向細胞群中添加標準冷凍保鮮劑（例如，DMSO、甘油、Epilife®細胞冷凍培養基（Cascade Biologics））。另外，在一實施例中，局部給藥用製劑可以為乳膏劑、凝膠劑、軟膏劑、皮膚乳化劑、皮膚懸浮劑、透皮性貼劑、含藥物繃帶、乳劑或其組合。上述局部給藥用製劑可以根據需要而適當地混合常規醫藥品等的局部給藥用製劑中使用的成分，例如水性成分、油性成分、粉末成分、醇類、保濕劑、增稠劑、紫外線吸收劑、增白劑、防腐劑、抗氧化劑、表面活性劑、香料、著色劑、各種皮膚營養劑等。上述局部給藥用製劑也可以適當地混合乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸三鈉、檸檬酸鈉、多聚磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡萄糖酸等金屬掩蔽劑、咖啡因、單寧、維拉帕米、甘草提取物、光甘草定、卡林果實的熱水提取物、各種草藥、醋酸生育酚、甘草酸、氨甲環酸及其衍生物或其鹽等藥物、維生素C、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡萄糖苷、熊果苷、曲酸、葡萄糖、果糖、海藻糖等糖類等。

本發明的一具體例的藥物組合物的混合比例可以根據如上所述的附加成分的類型、量、形態等而適當地進行選擇。

用於皮膚傷口或疤痕治療的間充質幹細胞球體的給藥方法和給藥劑量

本發明提供將間充質幹細胞球體的治療有效量局部塗覆或通過皮下或皮內注射給藥到需要皮膚傷口或疤痕治療的受試者的目標部位以治療皮膚傷口或疤痕的方法。

本發明的間充質幹細胞球體通過將在治療上有效的量給藥到需要皮膚傷口或疤痕治療的受試者，從而可以治療皮膚再生、皮膚傷口或疤痕。

本發明的間充質幹細胞球體或包含其的藥物組合物可以利用本技術領域中通常使用的給藥方法間接或直接進行給藥。在本發明的實施方式中，上述間充質幹細胞球體可以通過皮下給藥、經皮給藥（塗覆）或皮內給藥進行給藥。此外，上述給藥可以是向為了皮膚傷口或疤痕治療而需要通過膠原蛋白生成來進行皮膚再生的目標部位直接進行給藥。

在本發明中，上述目標部位可以包括表皮層、真皮層、皮下層等構成皮膚的細胞層被損壞或凹陷的部分。較佳地，上述目標部位可以包括皮膚的真皮層被損壞或凹陷的部分，或者上述目標部位可以包括皮膚的皮下層被損壞或凹陷的部分。具體而言，真皮層損壞或凹陷可以是指從構成皮膚的表皮層到真皮層的損壞或凹陷，皮下層損壞或凹陷可以是指構成皮膚的表皮層、真皮層和皮下層即皮膚全層的損壞或凹陷。

上述塗覆是一種經皮給藥，是指通過適當的方法使上述間充質幹細胞球體或包含其的藥物組合物與目標部位接觸的所有方法，通過該方法，可以將上述組合物吸收到皮膚內部。

在本發明中，上述間充質幹細胞球體可以給藥一次或多次。

在本發明中，上述間充質幹細胞球體可以給藥一次、給藥2次、給藥3次、給藥4次、給藥5次或給藥其以上的次數。較佳地，可以給藥1次、2次或3次。更較佳地，可以給藥1次。本發明的間充質幹細胞球體即使給藥1次，也具有治療皮膚再生、皮膚傷口或疤痕的效果。

上述“在治療上有效的量”是指為向需要使皮膚再生或皮膚傷口或疤痕的治療的受試者給藥時，足以表現出治療效果的量。

在為受試者給藥的給藥劑量中，單位給藥量（Unit dosage）內可以包含1至2×10 ⁵個上述間充質幹細胞球體，例如，下限可以為1個以上、或2個以上，上限可以為2×10 ⁵個以下、1.8×10 ⁵個以下、1.6×10 ⁵個以下、1.4×10 ⁵個以下、1.2×10 ⁵個以下、1×10 ⁵個以下、9.5×10 ⁴個以下、9×10 ⁴個以下、8.5×10 ⁴個以下、8×10 ⁴個以下、7.5×10 ⁴個以下、7×10 ⁴個以下、6.5×10 ⁴個以下、6×10 ⁴個以下、5.5×10 ⁴個以下、5×10 ⁴個以下、4.5×10 ⁴個以下、4×10 ⁴個以下、3.5×10 ⁴個以下、3×10 ⁴個以下、2.5×10 ⁴個以下、2×10 ⁴個以下、1.5×10 ⁴個以下、1×10 ⁴個以下、9.5×10 ³個以下、9×10 ³個以下、8.5×10 ³個以下、8×10 ³個以下、7.5×10 ³個以下、7×10 ³個以下、6.5×10 ³個以下、6×10 ³個以下、5.5×10 ³個以下、5×10 ³個以下、4.5×10 ³個以下、4×10 ³個以下、3.5×10 ³個以下、3×10 ³個以下、2.5×10 ³個以下、或2×10 ³個以下。其中，1個上述間充質幹細胞球體中包含的間充質幹細胞的數量可以為200至800個細胞，較佳可以包含250至750個細胞，更較佳可以包含300至700個細胞，更較佳可以包含400至600個細胞的間充質幹細胞。

具體而言，單位給藥量（Unit dosage）內包含的間充質幹細胞的數量可以為1×10 ²個細胞至8×10 ⁷個細胞，例如，下限可以為1.0×10 ²個細胞以上、1.2×10 ²個細胞以上、1.4×10 ²個細胞以上、1.6×10 ²個細胞以上、1.8×10 ²個細胞以上、2.0×10 ²個細胞以上、2.2×10 ²個細胞以上、2.4×10 ²個細胞以上、2.6×10 ²個細胞以上、2.8×10 ²個細胞以上、3.0×10 ²個細胞以上、3.2×10 ²個細胞以上、3.4×10 ²個細胞以上、3.6×10 ²個細胞以上、3.8×10 ²個細胞以上、4.0×10 ²個細胞以上、4.2×10 ²個細胞以上、4.4×10 ²個細胞以上、4.6×10 ²個細胞以上、4.8×10 ²個細胞以上、5.0×10 ²個細胞以上、6.0×10 ²個細胞以上、8.0×10 ²個細胞以上、1.0×10 ³個細胞以上、1.2×10 ³個細胞以上、1.4×10 ³個細胞以上、1.6×10 ³個細胞以上、1.8×10 ³個細胞以上、2.0×10 ³個細胞以上、2.2×10 ³個細胞以上、2.4×10 ³個細胞以上、2.6×10 ³個細胞以上、2.8×10 ³個細胞以上、3.0×10 ³個細胞以上、3.2×10 ³個細胞以上、3.4×10 ³個細胞以上、3.6×10 ³個細胞以上、或3.8×10 ³個細胞以上，上限可以為8×10 ⁷個細胞以下、8.6×10 ⁷個細胞以下、8.4×10 ⁷個細胞以下、8.2×10 ⁷個細胞以下、8×10 ⁷個細胞以下、7.8×10 ⁷個細胞以下、7.6×10 ⁷個細胞以下、7.4×10 ⁷個細胞以下、7.2×10 ⁷個細胞以下、7×10 ⁷個細胞以下、6.8×10 ⁷個細胞以下、6.6×10 ⁷個細胞以下、6.4×10 ⁷個細胞以下、6.2×10 ⁷個細胞以下、6×10 ⁷個細胞以下、5.5×10 ⁷個細胞以下、5×10 ⁷個細胞以下、4.5×10 ⁷個細胞以下、4×10 ⁷個細胞以下、3.5×10 ⁷個細胞以下、3×10 ⁷個細胞以下、2.5×10 ⁷個細胞以下、2×10 ⁷個細胞以下、1.5×10 ⁷個細胞以下、1×10 ⁷個細胞以下、9×10 ⁶個細胞以下、8×10 ⁶個細胞以下、7×10 ⁶個細胞以下、6×10 ⁶個細胞以下、5×10 ⁶個細胞以下、4×10 ⁶個細胞以下、3×10 ⁶個細胞以下、2.0×10 ⁶個細胞、或1.5×10 ⁶個細胞以下。

在本發明中，上述單位給藥量可以為50uL、60uL、70uL、80uL、90uL、100uL、125uL、150uL、175uL、200uL、225uL、250uL、275uL、300uL、325uL、350uL、375uL、400uL、425uL、450uL、475uL、或500uL。

在一實施例中，以目標部位的每體積單位給藥量為基準，可以包含1至2×10 ⁵個上述間充質幹細胞球體，例如，下限可以為1個以上、或2個以上，上限可以為2×10 ⁵個以下、1.8×10 ⁵個以下、1.6×10 ⁵個以下、1.4×10 ⁵個以下、1.2×10 ⁵個以下、1×10 ⁵個以下、9.5×10 ⁴個以下、9×10 ⁴個以下、8.5×10 ⁴個以下、8×10 ⁴個以下、7.5×10 ⁴個以下、7×10 ⁴個以下、6.5×10 ⁴個以下、6×10 ⁴個以下、5.5×10 ⁴個以下、5×10 ⁴個以下、4.5×10 ⁴個以下、4×10 ⁴個以下、3.5×10 ⁴個以下、3×10 ⁴個以下、2.5×10 ⁴個以下、2×10 ⁴個以下、1.5×10 ⁴個以下、1×10 ⁴個以下、9.5×10 ³個以下、9×10 ³個以下、8.5×10 ³個以下、8×10 ³個以下、7.5×10 ³個以下、7×10 ³個以下、6.5×10 ³個以下、6×10 ³個以下、5.5×10 ³個以下、5×10 ³個以下、4.5×10 ³個以下、4×10 ³個以下、3.5×10 ³個以下、3×10 ³個以下、2.5×10 ³個以下、或2×10 ³個以下。

上述目標部位的體積可以為0.2至500mm ³，較佳地，可以為0.3至500mm ³、0.4至500mm ³。根據目標部位的面積，將單位給藥量以規定間隔給藥。此外，1個上述間充質幹細胞球體中包含的間充質幹細胞的數量可以為200至800個細胞，較佳地，可以包含250至750個細胞，更較佳地，可以包含300至700個細胞，更較佳地，可以包含400至600個細胞的間充質幹細胞。

具體而言，以目標部位的每體積單位給藥量為基準，可以給藥1×10 ²個細胞至8×10 ⁷個細胞的細胞數量，例如，下限可以為1.0×10 ²個細胞以上、1.2×10 ²個細胞以上、1.4×10 ²個細胞以上、1.6×10 ²個細胞以上、1.8×10 ²個細胞以上、2.0×10 ²個細胞以上、2.2×10 ²個細胞以上、2.4×10 ²個細胞以上、2.6×10 ²個細胞以上、2.8×10 ²個細胞以上、3.0×10 ²個細胞以上、3.2×10 ²個細胞以上、3.4×10 ²個細胞以上、3.6×10 ²個細胞以上、3.8×10 ²個細胞以上、4.0×10 ²個細胞以上、4.2×10 ²個細胞以上、4.4×10 ²個細胞以上、4.6×10 ²個細胞以上、4.8×10 ²個細胞以上、5.0×10 ²個細胞以上、6.0×10 ²個細胞以上、8.0×10 ²個細胞以上、1.0×10 ³個細胞以上、1.2×10 ³個細胞以上、1.4×10 ³個細胞以上、1.6×10 ³個細胞以上、1.8×10 ³個細胞以上、2.0×10 ³個細胞以上、2.2×10 ³個細胞以上、2.4×10 ³個細胞以上、2.6×10 ³個細胞以上、2.8×10 ³個細胞以上、3.0×10 ³個細胞以上、3.2×10 ³個細胞以上、3.4×10 ³個細胞以上、3.6×10 ³個細胞以上、或3.8×10 ³個細胞以上，上限可以為8×10 ⁷個細胞以下、8.6×10 ⁷個細胞以下、8.4×10 ⁷個細胞以下、8.2×10 ⁷個細胞以下、8×10 ⁷個細胞以下、7.8×10 ⁷個細胞以下、7.6×10 ⁷個細胞以下、7.4×10 ⁷個細胞以下、7.2×10 ⁷個細胞以下、7×10 ⁷個細胞以下、6.8×10 ⁷個細胞以下、6.6×10 ⁷個細胞以下、6.4×10 ⁷個細胞以下、6.2×10 ⁷個細胞以下、6×10 ⁷個細胞以下、5.5×10 ⁷個細胞以下、5×10 ⁷個細胞以下、4.5×10 ⁷個細胞以下、4×10 ⁷個細胞以下、3.5×10 ⁷個細胞以下、3×10 ⁷個細胞以下、2.5×10 ⁷個細胞以下、2×10 ⁷個細胞以下、1.5×10 ⁷個細胞以下、1×10 ⁷個細胞以下、9×10 ⁶個細胞以下、8×10 ⁶個細胞以下、7×10 ⁶個細胞以下、6×10 ⁶個細胞以下、5×10 ⁶個細胞以下、4×10 ⁶個細胞以下、3×10 ⁶個細胞以下、2.0×10 ⁶個細胞、或1.5×10 ⁶個細胞以下。

其中，上述目標部位的體積可以為0.2至500mm ³，較佳地，可以為0.3至500mm ³、0.4至500mm ³。根據目標部位的面積，將單位給藥量以規定間隔給藥。

在本發明中，給藥上述組合物後，目標部位得到治療或恢復，從而可以治療皮膚再生、傷口和疤痕。單次給予本發明的組合物後，可以在給藥之後的很長時間內表現出皮膚再生、傷口和疤痕治療效果。

在本發明中，皮膚再生可以改善由時間的流逝、光、化妝品、肥皂、公害、灰塵、乾燥、吸煙、生活習慣等引起的皮膚的深層或淺層皺紋之類的變化。

在本發明中，上述疤痕可以為選自褥瘡導致的疤痕、燒傷導致的疤痕、脫毛導致的疤痕、腺性硬皮病導致的疤痕、創傷導致的疤痕、糖尿病足潰瘍導致的疤痕、萎縮性疤痕（atrophic scar）和妊娠紋（stretch marks）中的任一種或更多種。此外，上述疤痕的一個例子可以為皮膚的表皮（epidermis）；真皮（dermis）；皮下（subcutaneous）；表皮和真皮；真皮和皮下；或表皮、真皮和皮下層受損的疤痕，較佳地，可以是受損到真皮部分的皮膚全層疤痕、或受損到表皮、真皮和皮下層的皮膚全層疤痕。

在本發明中，上述傷口（wound）是指由於組織割傷（cut）、撕裂（torn）、折斷（broken）、燒傷（burned）、或外傷（traumatized）、或由誘發這種損傷的障礙或疾病發生的人體損傷（injury）。上述傷口可以是表面開放的傷口（open wound）、或表面不開放的閉合傷口（closed wound）。上述傷口的一個例子可以是皮膚上的開放傷口。上述傷口的一個例子可以是皮膚的表皮（epidermis）；真皮（dermis）；表皮和真皮；或表皮、真皮和皮下脂肪層受損的傷口，較佳地，可以是受損到真皮部分的皮膚全層傷口或受損到表皮、真皮和皮下層的皮膚全層傷口。

另外，上述傷口的例子可以包括割傷（cut）、切口（incisions）（例如手術切口）、創傷、擦傷（abrasions）、挫傷（contusions）、刺傷、折傷、裂傷或撕裂傷（lacerations）、骨折（fracture）、燒傷（burns）、或切割（amputations）。

更具體而言，根據本發明的間充質幹細胞球體可以是以單次給藥劑量直接1次給藥到疤痕部位或傷口部位，上述給藥劑量如上所述。

本發明提供包含間充質幹細胞球體的皮膚再生用填料組合物。

本發明提供間充質幹細胞球體的用途，用於製造對目標部位局部塗覆或通過皮下或皮內注射給藥的皮膚傷口或疤痕治療用藥物。

本發明提供間充質幹細胞球體，用於局部塗覆或通過皮下或皮內注射給藥到目標部位以用於皮膚傷口或疤痕治療。

本發明提供將間充質幹細胞球體的治療有效量局部塗覆或通過皮下或皮內注射給藥到需要皮膚傷口或疤痕治療的受試者的目標部位以治療皮膚傷口或疤痕的方法。

本發明的包含間充質幹細胞球體的組合物通過向在需要真皮或皮下恢復和皮膚再生的傷口或疤痕或皮膚凹陷部位以在治療上有效的量直接給藥，從而可以促進傷口癒合，並且可以通過誘導皮膚內真皮和皮下的恢復而促進皮膚再生，促進疤痕癒合/恢復和皮膚體積維持。

為了實現上述目的，本發明提供將從脂肪細胞分離的間充質幹細胞製造成間充質幹細胞球體的方法。

下面，參照附圖並以本領域技術人員可以容易地實施的方式對本發明的實施例詳細地進行說明。但是，本發明可以以各種大小來實現，並且不限定於在這裡說明的實施例。

下面，通過實施例對本發明更詳細地進行說明，但下述的實施例只是用於說明的目的，不意圖限定本發明發明的範圍。

實施例 1. 脂肪來源間充質幹細胞球體（ MiB ）製造和特性確認

實施例 1-1. 脂肪組織中的間充質幹細胞（ hMSCs ）的分離

作為用於製造本發明的間充質幹細胞球體（Microblock，MiB）的細胞源，使用了相對容易分離且具有高生長率的人類脂肪來源間充質幹細胞（Human mesenchymal stem cells，hMSCs）。hMSCs的分離是在首爾大學牙科醫院機構審查委員會的批准後進行的。

將準備好的人源脂肪組織置於含有0.1%膠原蛋白分解酶I（Collagenase I）的Hanks®平衡鹽溶液（Balanced Salt solution）（HBSS）中，在37℃振盪30分鐘將細胞分離後，將其進行洗滌，用100μm尼龍網篩過濾。然後，用加入了10%的胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）和1X抗生素抗真菌溶液（Antibioticantimycotic solution，AA）的Dulbecco改良的Eagle培養基（Dulbecco's modified Eagles medium，DMEM）提供養分，並在37℃的5%CO ₂培養器中進行培養。

實施例 1-2. 分離的間充質幹細胞（ hMSCs ）的驗證

實施例1-1中分離的hMSCs具有附著形態、多分化能力、表面特異性抗原的表達等特徵，通過確認這樣的特徵，從而驗證了上述實施例1-1中分離的細胞為hMSCs。

確認上述細胞的形態和分佈特性的結果，顯示了該細胞在塑膠培養皿中以諸如均質紡錘（pindle）模樣的形態附著生長的樣子（圖1），並以指數（exponentially）方式良好增殖到第7傳代為止，確認了細胞分裂一次花費2~3天左右（圖2）。

另外，作為確認重複傳代下hMSCs的特性是否良好維持的方法，通過流式細胞術（Flow cytometry）確認了幹細胞表面標誌物的表達。將培養的MSC用PBS洗滌，用胰蛋白酶（Trypsin）、膠原酶（collagenase）等蛋白質分解酶在37℃處理5分鐘而以單細胞回收。使細胞與針對螢光標記的各CD14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD73、CD90、HLA-DR、CD45、CD79α、CD105、CD117的抗體在4℃反應1小時。然後，利用含有2%的FBS的Dulbecco's phosphate buffered saline（DPBS）進行洗滌，用FACS分析了同型小鼠（isotype mouse）IgG相對於對照組的表達量。

分析結果，細胞的95%以上對陽性標誌物CD29、CD44、CD73、CD90和CD105的表達為陽性，陰性標誌物CD31、CD45、CD79a、CD117和HLA-DR的表達小於2%，確認了細胞是以高純度分離的MSC（圖3）。

實施例 1-3. 通過染色確認分離的間充質幹細胞（ hMSCs ）的脂肪細胞分化能力

為了確認脂肪細胞分化能力，將9.5x10 ⁴個細胞置於6孔（6-well）板中，用在高葡萄糖（high glucose）DMEM 中加入0.5mM的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、100nM的地塞米松（dexamethasone）、100μm的吲哚美辛（Indomethacin，INDO）、10μg/mL的胰島素（Insulin）、10%FBS和1X AA而製造的培養基，1周更換2次培養基，在37℃的5%CO ₂培養器中培養14天。為了確認分化，去除分化結束的板的培養液，用DPBS洗滌1次後，在常溫下用4%PFA固定。

然後，為了肉眼確認分化，將0.2g油紅（oil red）O粉末溶解在40mL的異丙醇（Isopropanol）中，滴加1mL的用0.22μm篩檢程式過濾而製造的溶液，在常溫下反應15分鐘，用DW洗滌5次後，確認了分化為脂肪細胞（Adipogenic differentiation）（圖4）。

實施例 1-4. 通過染色確認分離的間充質幹細胞（ hMSCs ）的骨細胞分化能力

為了確認hMSCs的骨細胞分化能力，通過與上述實施例1-3相同的方法，將9.5x10 ⁴個細胞加入6孔（6-well）板，在將10nM的地塞米松（Dexamethasone）、50μg/mL抗壞血酸（Ascobic acid）、10mM的β-甘油磷酸酯（β-glycerolphosphate）、1mM的二丁醯基-cAMP（Dibutyryl-cAMP）、10%FBS和1X AA等加入到α最低必需培養基（alpha minimum essential medium）（α MEM）培養基中而製造的培養基中進行培養。4天後，將培養基全部去除，用沒有二丁醯基-cAMP的培養基，1周2次更換培養基，在37℃的5%CO ₂培養器中培養14天，從而誘導了向hMSCs的骨細胞的分化。

然後，為了用肉眼確認骨細胞分化，進行了茜素紅（alizarin red）S染色。將分化結束的板的培養液去除，用DPBS洗滌1次後，添加1mL的4%多聚甲醛（paraformaldehyde）（PFA），在常溫下固定了細胞。將固定液去除，用DPBS洗滌，將利用蒸餾水（distrilled water）（DW）稀釋成1%的茜素紅S溶液每次分注2mL，在常溫下反應15分鐘。然後，用DW洗滌5次後，在分注1mL的DW的狀態下用顯微鏡（Olympus）確認了分化為骨細胞（Osteogenic differentiation）（圖4）。

實施例 1-5. 通過染色確認分離的間充質幹細胞（ hMSCs ）軟骨細胞分化能力

為了確認軟骨細胞分化能力，通過與上述實施例1-3相同的方法，將9.5x10 ⁴個細胞置於6孔（6-well）板中，在將1X胰島素轉鐵蛋白硒預混料（Insulin transferrin selenium premix，ITS）、50ng/mL的抗壞血酸（ascorbic acid）、40μg/mL的L-脯氨酸（L-proline）、100nM的地塞米松（dexamethasone）等成分和10%FBS、1X AA加入到α MEM中而製造的培養基中加入10ng/mL的轉化生長因子（Transforming growth factor，TGF-β3），在37℃的5%CO ₂培養器中培養21天。然後，將分化結束的板的培養液去除，利用4%PFA在常溫下固定了細胞。

細胞固定後，用DPBS洗滌，將固定的細胞置於OCT化合物（compound）中，在超低溫冰箱（-80℃）中冷凍一天。冷凍的細胞利用冷凍切片機（cryocut microtome）製成8μm厚度的切片，用DW洗滌。向該切片添加利用阿新藍（alcian blue）試劑而製作的1%阿新藍（alcian blue）溶液，在常溫下染色30分鐘後，用以0.1N製造的HCl溶液洗滌，用DW洗滌後，確認了分化為軟骨細胞（Chondrogenic differentiation）（圖4）。

實施例 1-6. 通過 RT-PCR 驗證作為間充質幹細胞的特性的向脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞的分化能力

使用氯仿（chloroform）和TRI试剂，分離了细胞的總RNA。使用Prime Script RT Master Mix由1μg總RNA合成了cDNA。將合成的cDNA在PCR機（生命科學公司（Bio-Rad Laboratories），赫拉克勒斯市（Hercules），CA，USA）中使用AccuPower PCR PreMix（Bioneer）進行PCR反應。將PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行了分析（圖5）。使用的引子（primer）組如表1所示。

[表1]

基因	序列	℃ （迴圈）	大小（bp）
GAPDH	正向；5'- ATG GGG AAG GTG AAG GTC G -3' （SEQ ID NO:1）	60 （26）	119
反向；5'- TAA AAG CAG CCC TGG TGA CC -3' （SEQ ID NO:2）
LPL	正向；5'- TAC AGG GCG GCC ACA AGT TTT -3' （SEQ ID NO:3）	60 （30）	299
反向；5'- ATG GAG AGC AAA GCC CTG CTC -3' （SEQ ID NO:4）
FABP4	正向；5'- CAT CAG TGT GAA TGG GGA TG -3' （SEQ ID NO:5）	56 （30）	252
反向；5'- GTG GAA GTG ACG CCT TTC AT -3' （SEQ ID NO:6）
PPARG2	正向；5'- GAC CAC TCC CAC TCC TTT GA -3' （SEQ ID NO:7）	60 （30）	257
反向；5'- CGA CAT TCA ATT GCC ATG AG -3' （SEQ ID NO:8）
RUNX2	正向；5'- TAT GAA AAA CCA AGT AGC AAG GTT C -3' （SEQ ID NO:9）	58 （35）	336
反向；5'- GTA ATC TGA CTC TGT CCT TGT GGA T -3' （SEQ ID NO:10）
BGLPA	正向；5'- GTG CAG AGT CCA GCA AAG GT -3' （SEQ ID NO:11）	56 （32）	175
反向；5'- CTA GCC AAC TCG TCA CAG TC -3' （SEQ ID NO:12）
ACAN	正向；5'- TTC AGT GGC CTA CCA AGT GGC ATA -3' （SEQ ID NO:13）	60 （30）	165
反向；5'- AGC CTG GGT TAC AGA TTC CAC CAA -3' （SEQ ID NO:14）
COL2	正向；5'- TTT CCC AGG TCA AGA TGG TC -3' （SEQ ID NO:15）	56 （29）	377
反向；5'- CTG CAG CAC CTG TCT CAC CA -3' （SEQ ID NO:16）
COL10	正向；5'- ATG ACC CAA GGA CTG GAA TCT TTA -3' （SEQ ID NO:17）	58 （31）	276
反向；5'- CTG AGA AAG AGG AGT GGA CAT AC -3' （SEQ ID NO:18）

通過上述實施例1-3至1-6確認分化能力的結果，確認了通過本發明的方法而從人類脂肪分離的細胞的純度非常高，即使長時間培養也具有作為幹細胞的特徵。

實施例 1-7. 通過間充質幹細胞（ MSC ）的自組裝的間充質幹細胞球體（ MiB ）製造

為了MSC的自組裝，用PBS洗滌在培養器中培養的MSC，用胰蛋白酶（Trypsin）、膠原酶（collagenase）等蛋白質分解酶處理，並以單細胞回收。將細胞種植在孔（well）中，進行離心分離，施加物理壓力後，在37℃培養器中三維培養1、2、3和7天。隨著時間推移，產生了具有一定大小的圓形細胞結構即間充質幹細胞球體（本說明書中也命名為MiB）（圖6）。使間充質幹細胞球體通過孔徑為70μm和300μm的雙層細胞篩檢程式（strainer），收集均勻大小的間充質幹細胞球體。間充質幹細胞球體使用JuLi stage系統進行了成像，MiB直徑使用ImageJ軟體進行了測定。間充質幹細胞球體的直徑在供體和傳代數差別下沒有觀察到大的差異，各孔產生最小40μm到最大260μm直徑的間充質幹細胞球體，平均直徑顯示為98.74μm~116.81μm（圖7）。

實施例 1-8. 間充質幹細胞球體（ MiB ）的供體和傳代差別下的細胞存活力

為了研究間充質幹細胞球體中的活細胞，使用LIVE/DEAD™活力/細胞毒性試劑盒（Viability/Cytotoxicity Kit）和MTT細胞增殖測定試劑盒（MTT Cell Proliferation Assay kit）測定了細胞存活率。通過LIVE/DEAD活力/細胞毒性試劑盒染色，活細胞被螢光染色成綠色，死細胞被螢光染色成紅色，結果，構成間充質幹細胞球體的大部分的細胞是活的，沒有良好結合且較弱結合在間充質幹細胞球體外的細胞被染色成紅色（圖8）。與二維培養時相比，活細胞使用傳代3的MSC時，顯示出84%的存活率，並且傳代之間細胞存活率沒有大變化（圖8）。這表明存在於三維環境內的細胞更穩定地存活。

實施例 1-9. 通過間充質幹細胞球體（ MiB ）的 DNA 含量分析確認細胞生長

間充質幹細胞球體的DNA含量使用Quant-iT™ PicoGreen™ dsDNA檢測試劑盒進行了測定。間充質幹細胞球體的DNA含量在第1天到第7天的培養期間沒有大變化（圖9）。

這樣的結果表明在間充質幹細胞球體培養期間沒有檢測到顯著的細胞增殖。

實施例 1-10. 用 掃描 電子顯微鏡（ Scanning electron microscopy ， SEM ）觀察的間充質幹細胞球體

將間充質幹細胞球體固定後，用HCl-EtOH溶液進行了處理。將處理的間充質幹細胞球體試樣用1%四氧化鋨（osmium tetroxide）後固定後，脫水，使用六甲基二矽氮烷（hexamethyldisilazane，HMDS）進行了化學乾燥。使用Q150TS並用鉑金（platinum）層塗覆。使用10kV的電壓下的Apreo S獲得了SEM圖像。利用SEM觀察間充質幹細胞球體的結果，間充質幹細胞球體顯示出非常緻密的球形的結構，並且顯示出表面非常粗糙，細胞表面形成大量的水泡的特徵（圖10）。

實施例 1-11. 構成所製作的間充質幹細胞球體的細胞的間充質幹細胞特性確認

為了確認構成間充質幹細胞球體（MiB）的細胞是否仍然維持MSC的特性，將間充質幹細胞球體用PBS洗滌，用胰蛋白酶（Trypsin）、膠原酶（collagenase）等蛋白質分解酶處理，分離為單細胞。分離的細胞使用上述提到的流式細胞術研究了間充質幹細胞表面蛋白質的表達。

研究結果，構成間充質幹細胞球體的細胞表達了95%以上的CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等MSC的陽性表面標誌物，陰性表面標誌物CD31、CD45、CD79a、CD117、HLA-DR的表達為2%以下（圖11）。

另外，使用Image-iT固定/通透試劑盒（Fixation/Permeabilization Kit）固定間充質幹細胞球體（MiB）而不使其分解，提高細胞膜通透性後，在室溫（RT）下，3%牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）在PBS中與針對MSC標誌物（CD73、CD90、CD105）的抗體一同培養18小時。用PBS洗滌後，將MiB與螢光標記的二抗一同在室溫下培養6小時。在室溫下，進行5分鐘的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）處理，對核（藍色）進行了染色。確認了螢光染色的間充質幹細胞球體中大部分的細胞表達MSC標誌物CD73（紅色）、CD90（綠色）、CD105（綠色）（圖12）。

實施例 1-12. 通過定量 RT-PCR 分析間充質幹細胞球體的細胞外基質表達量

MSC經三維培養而在形態學上變為間充質幹細胞球體時，通過定量即時RT-PCR（Quantitative real-time RT-PCR）研究了細胞外基質基因表達如何變化。如實施例1-6那樣，使用TRI試劑（reagent）從間充質幹細胞（SC）或從第1天到第7天培養的間充質幹細胞球體（MiB）中分離RNA，使用Prime Script RT Master Mix合成例cDNA。PCR反應使用2X qPCRBIO SyGreen MiX Hi-ROX進行。COL1A1（I型膠原（collagen type I））、COL3A1（3型膠原（collagen type 3））、ELN（彈性蛋白（Elastin））、FN1（纖連蛋白（Fibronectin））的引子（primer）使用了QuantiTect primer Assays （Qiagen）製品，GAPDH用作表達量校正。分析結果如圖13所示。

從圖13可以確認，纖連蛋白（Fibronectin）表達隨著間充質幹細胞球體培養時間延長而迅速增加，與2D培養的間充質幹細胞相比，1型膠原蛋白在培養第1天增加了。此外，本發明的間充質幹細胞球體中與ECM相關的基因表達增加，並且預期即使在給藥最少7天後，也可能由間充質幹細胞球體內的MSC產生ECM。

實施例 1-13. 通過酶聯免疫吸附分析間充質幹細胞球體的細胞外基質表達量

本發明的間充質幹細胞或間充質幹細胞球體用含有1mM的苯甲磺醯氟（phenylmethanesulfonyl fluoride）和蛋白酶抑制劑混合物（Protease inhibitor cocktail）的哺乳動物蛋白質提取試劑（Mammalian protein extraction reagent）進行了分解。在4°C以16000xg離心分離20分鐘後，使用ELISA（酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay））試劑盒分析了1型膠原蛋白、纖連蛋白、透明質酸。在間充質幹細胞球體（MiB）中，積累了1型膠原蛋白、纖連蛋白、透明質酸（圖14）。

實施例 1-14. 通過螢光免疫染色確認間充質幹細胞球體的膠原蛋白表達

為了確認本發明的間充質幹細胞球體（MiB）的膠原蛋白表達，將石蠟包埋的間充質幹細胞球體切割成4μm厚度，製作了載玻片。將載玻片脫蠟並水化後，用螢光標記的1型膠原蛋白抗體對間充質幹細胞球體（MiB）免疫染色，從而分析了膠原蛋白表達，其結果如圖15所示。

從圖15可以確認，與單細胞相比，1型膠原蛋白的表達在間充質幹細胞球體（MiB）中的表達顯著高（圖15）。

實施例 1-15. 通過組織學分析確認間充質幹細胞球體的膠原蛋白表達

為了通過組織學分析確認本發明的間充質幹細胞球體（MiB）的膠原蛋白表達，如實施例1-14那樣，將石蠟包埋的間充質幹細胞球體切割成4μm厚度，從而製作了載玻片。將載玻片脫石蠟及水化後，使用針對1型膠原蛋白的一抗和生物素化的（Biotinylated）二抗體進行免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）染色時，確認了間充質幹細胞球體中膠原蛋白被染成棕色（圖16A）。

另外，使用三色染色試劑盒（trichrome staining kit）染色時，確認了被染色成藍色的部位，確認了間充質幹細胞球體中存在膠原蛋白（圖16B）。

實施例 1-16. 通過定量 RT-PCR 分析間充質幹細胞球體的生長因子表達

分析了本發明的間充質幹細胞球體（MiB）的生長因子表達。具體而言，為了研究間充質幹細胞球體（MiB）中成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor 2，FGF2）、血小板來源生長因子（Platelet-derived growth factor subunit A，PDGFA）、血管內皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）、胰島素樣生長因子1（Insulin-like growth factor 1，IGF-1）的基因表達，如實施例1-12那樣，進行了定量RT-PCR。引子（primer）如表2那樣設計並進行了上面提到的定量RT-PCR，其結果如圖17所示。

[表2]

基因	序列	產物大小
GAPDH	正向；5'- CCA CTC CTC CAC CTT TGA CG -3' （SEQ ID NO:19）	107 bp
反向；5'- CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG -3' （SEQ ID NO:20）
VEGFA	正向；5'- TGC AGA TTA TGC GGA TCA AAC C -3' （SEQ ID NO:21）	81 bp
反向；5'- TGC ATT CAC ATT TGT TGT GCT GTA G -3' （SEQ ID NO:22）
IGF1	正向；5'- TGT GGA GAC AGG GGC TTT TA -3' （SEQ ID NO:23）	245 bp
反向；5'- CCT GCA CTC CCT CTA CTT GC -3' （SEQ ID NO:24）
HGF	正向；5'- TCA CGA GCA TGA CAT GAC TCC -3' （SEQ ID NO:25）	69 bp
反向；5'- AGC TTA CTT GCA TCT GGT TCC -3' （SEQ ID NO:26）
FGF2	正向；5'- TCA AAG GAG TGT GTG CGA AC -3' （SEQ ID NO:27）	161 bp
反向；5'- CAG GGC CAC ATA CCA ACT G -3' （SEQ ID NO:28）
PDGFA	正向；5'- TCC ATG CCA CTA AGC ATG TG -3' （SEQ ID NO:29）	108 bp
反向；5'- CGT AAA TGA CCG TCC TGG TCT T -3' （SEQ ID NO:30）

分析結果顯示，多個生長因子的表達對皮膚再生有積極的效果。如圖17所示，確認了間充質幹細胞球體（MiB）的FGF2和PDGFA的表達量減少，但VEGFA和HGF的表達量增加，這表明間充質幹細胞球體對新生血管形成和受損組織的再生有貢獻。

實施例 2. 利用了動物模型的功效試驗

實施例 2-1. 利用了創傷誘導動物模型的皮膚再生、皮膚傷口或疤痕治療效果確認

（ 1 ） Masson’s Trichrome （ MT ）膠原蛋白產生能力評價

使用手術刀（Scalpel）製作了全層傷口誘導創傷模型，其中，以大鼠的脊柱線為中心對稱，將皮下組織鈍性分離以使肌肉層不受損傷，直至去除真皮部分。對如表3所示製造的創傷誘導大鼠，分別皮內給藥、皮下給藥和塗覆給藥低（0.5x10 ⁶個細胞）、中（1.0x10 ⁶個細胞）、高（2.0x10 ⁶個細胞）劑量的TRTP-101和TRTP-101的賦形劑。然後，貼上3M公司的Tegaderm保護傷口部位後，第21天確認膠原蛋白面積等。

將皮膚組織樣品用Masson’s Trichrome（MT）染色後，對相應組織中隨機選擇的3個不同的圖像使用分析軟體ZEN測定藍色區域的膠原蛋白面積，以膠原蛋白染色面積相對於圖像的總面積的百分比表示，其結果如圖18所示。圖18（A）表示皮內給藥時的結果，圖18（B）表示塗覆給藥時的結果。

[表3]

給藥途徑	給藥組	給藥物質	給藥量（ cells/site ）
皮內給藥	G1 （對照組）	賦形劑（DMEM）	0.2mL
G2	脂肪來源間充質幹細胞球體	0.5Х10 6（低劑量）
G3	脂肪來源間充質幹細胞球體	1.0Х10 6（中劑量）
塗覆給藥	G1 （對照組）	賦形劑（DMEM）	0.2mL
G2	脂肪來源間充質幹細胞球體	0.5Х10 6（低劑量）
G3	脂肪來源間充質幹細胞球體	1.0Х10 6（中劑量）
G4	脂肪來源間充質幹細胞球體	2.0x10 6（高劑量）
皮下給藥	G1 （對照組）	賦形劑（DMEM）	0.2mL
G2	脂肪來源間充質幹細胞球體	1.0Х10 6（中劑量）

從圖18（A）可以確認，在通過皮內給藥方法給藥時，就膠原蛋白面積而言，與賦形劑給藥組的44%相比，本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體給藥組在低劑量組中顯著增加至51%、在中劑量組中顯著增加至50%。由此確認了，在重塑步驟開始的第21天給予本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體的試驗組中，統計學上顯著多地產生了膠原蛋白。

另外，從圖18（B）可以確認，通過塗覆給藥方法給藥時，就膠原蛋白面積而言，與賦形劑給藥組的40%相比，本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體給藥組在低劑量組中顯著增加至53%、在高劑量組中顯著增加至50%，在中劑量組中，顯示增加至47%的趨勢。因此，顯示出與對照組相比，給予本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體的試驗組產生了更多的膠原蛋白。

下述表4通過表整理了對正常大鼠皮膚膠原蛋白量和創傷誘導大鼠皮內給藥或塗覆給藥本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體時的結果。從表4可以確認，在比較大鼠中的正常膠原蛋白量和TRTP-101給藥下的膠原蛋白量時（單位：%），與10周齡正常大鼠的皮膚膠原蛋白含量為62%左右（Song等）相比，確認了本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體在創傷的第21天膠原蛋白恢復50%發生了高達81%的顯著組織重建。

[表4]

大鼠
正常大鼠皮膚膠原蛋白量（Song等） （單位:%）	皮內給藥（單位:%）	塗覆給藥（單位:%）
10周齡	54周齡	對照組 （21天）	試驗組 （21天）	對照組 （21天）	試驗組 （21天）
62	54	44	50	40	50

（ 2 ）皮內和皮下給藥時皮膚再生和傷口癒合程度評價

為了評價皮內給藥試驗中皮膚再生和傷口癒合程度，在蘇木精和曙紅（Hematoxylin and Eosin）（H&E）染色的組織載玻片中評價了炎症水平、壞死、上皮化、膠原蛋白化4個指標，在MT染色的載玻片中評價了膠原蛋白纖維密度和膠原蛋白纖維排列的2個指標，總共6個指標。在隨著皮膚再生和傷口癒合程度變好而給出低的分數的0-5分的尺度評價中，計算每隻大鼠的總分，從而評價了顯著性。綜合皮膚再生和傷口癒合指標而評分的結果如下述表5和圖19所示。參考表5和圖19，顯示出當通過皮內給藥方法給藥時，與賦形劑給藥組相比，中劑量組顯著發生皮膚再生和傷口癒合。

[表5]

	賦形劑給藥組	低劑量組 （ TRTP-101 ）	中劑量組 （ TRTP-101 ）
平均	9.99	8.22	5.75*
S.E.	1.52	1.85	0.62

各時間點表示為平均值（mean）+S.E.（n=10）

*p＜0.05，通過Student's t-test檢測與正常對照組（G1）的明顯差異

另外，為了評價皮下給藥試驗中皮膚再生和傷口癒合程度而分析創傷面積比率的結果，TRTP-101 1.0x10 ⁶個細胞/頭（head）給藥組（G2）給藥後第2天到第4天的創傷面積比率與誘導對照組（G1）相比，觀察到降低的趨勢，特別是，確認了第3天的創傷面積與賦形劑給藥組相比明顯縮小（圖20）。鑒於上述結果，認為在創傷部位給藥TRTP-101有助於創傷恢復的早期階段的恢復。

另外，評價炎症水平、壞死、上皮化、膠原蛋白化4個指標並打分的組織病理學檢測結果如圖21所示。從圖21可以確認，炎症和壞死水平降低，觀察到皮下給藥方法的TRTP-101給藥組（G2）中的上皮化促進和膠原蛋白產生促進與賦形劑給藥組相比明顯增加。

實施例 2-2. 利用了正常裸鼠的功效試驗

（ 1 ）根據給藥量分析膠原蛋白陽性面積（ collagen positive area ）和 1 型膠原蛋白陽性面積（ type 1 collagen positive area ）

在只缺乏成熟T cell而免疫功能並未完全受抑制的BALB/c裸（nude）鼠背部左/右側，將低（0.25x10 ⁶）（G2）、中（0.5x10 ⁶）（G3）、高（1.0x10 ⁶）（G4）劑量的TRTP-101和賦形劑（G1）各自以0.1mL/位點（site）單次皮內給藥到共2個部位，從而評價了體內持續性。其結果如圖22和圖23所示。

從圖22可以確認，在給藥後4周，與對照組相比，起到結構支撐作用的膠原蛋白和1型膠原蛋白的合成在給予本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體的試驗組中顯示出明顯增加（各點表示為平均值（mean）+S.E.（n=3~6）；* p＜0.05，** p＜0.01，通過Student's t-test檢測出與賦形劑給藥組有明顯差異）。

（ 2 ）體內持續性評價

如圖23所示，在第8周，實際小鼠的真皮厚度與對照組相比，明顯增加。此外，中劑量組的真皮層變成最厚，與對照組相比，也具有顯著性。

實施例 3. 通過體外（ in vitro ）實驗的功效試驗

實施例 3-1. ECM 產生能力確認

為了確認作為體外（ in vitro）功效（efficacy）的ECM相關物質的產生程度，通過ELISA分析法，將本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體（TRTP-101）的I型膠原蛋白（Type I collagen）、FN的產生能力分別與HDF（人真皮成纖維細胞（Human dermal fibroblast））、MSC單細胞（single cell）（SC）的相同數量的細胞進行了比較。量化其結果的結果如圖24所示。

如圖24所示，與HDF（人真皮成纖維細胞（Human dermal fibroblast））和SC相比，I型膠原蛋白（Type I collagen）和FN的量在本發明的間充質幹細胞球體中明顯增加。與HDF相比，I型膠原（collagen type I）和通過組合ECM的構成成分而製造支承網路的纖連蛋白（Fibronectin）的表達水平顯示出分別高約7倍、約11倍。本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體在體外（ in vitro）HDF（人真皮成纖維細胞（Human dermal fibroblast））相比，產生更多的ECM。

通過這樣的結果，將本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體適用於體內（ in vivo）和人體時，產生真皮組織的最大構成成分即I型膠原（collagen type I）而支承皮膚和結締組織，通過細胞附著、生長、傷口癒合的FN，通過治療和再生，預計對萎縮性疤痕具有體積構建效果。

實施例 3-2. 生長因子分泌能力確認

利用qRT-PCR分析了VEGFA和HGF的基因表達水平（expression level），確認了在體外（in vitro），本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體與HDF（人真皮成纖維細胞（Human dermal fibroblast））和MSC單細胞（single cell）（SC）相比，生長因子高表達，其結果如圖25所示。

如圖25所示，顯示出本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體的VEGF和HGF的蛋白質表達水平分別高約9.5倍、約75倍。因此，確認了在體內（in vivo）創傷模型中適用本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體時，在作為創傷癒合初始階段的第3天觀察到快速恢復是由於本發明的脂肪來源間充質幹細胞球體中與傷口癒合相關的生長因子高表達。

實施例 4. 萎縮性疤痕（ Atrophic scar ）患者的耐藥性、穩定性、有效性試驗

以滿19歲以上的患有萎縮性疤痕的患者中希望疤痕修復的患者為對象，1次給藥TRTP-101（脂肪來源間充質幹細胞球體）後確認了有效性。以具有4處以上0.4mm ³以上體積的萎縮性疤痕的患者為對象進行了處置。試驗物件可以包括可以用KCD疾病代碼L90分類的患者。

利用從受試者的腹部或大腿部採集的脂肪製作TRTP-101（脂肪來源間充質幹細胞球體），對受試者本人1次給藥後，在規定時間內確認了穩定性、耐藥性、有效性。

對患者本人的腹部或大腿部用1%利多卡因（lidocaine）進行局部麻醉後，使用套管（Canula）注入60~100mL的腫脹溶液（tumescent solution）（0.9%生理鹽水（normal saline）、2%利多卡因（lidocaine）、0.1%腎上腺素（epinephrine）、8.4%碳酸氫鈉（sodium bicarbonate）），進行吸脂術（liposuction），收集了60mL以上的脂肪。在該脂肪處篩選並大量增殖自體脂肪來源間充質幹細胞後，通過三維培養製造了TRTP-101（脂肪來源間充質幹細胞球體）使其存在0.5~4.0×10 ⁷個細胞/mL。

將填充在注射器中的細胞以懸浮在培養基上的方式緩慢搖動使其懸浮後，對給藥部位進行消毒，利用29或30號針（gauge needle）進行單次皮內注射。以使萎縮性疤痕部位緊繃的方式給藥，且每個部位給藥最少0.4Х10 ³個細胞、最多2Х10 ⁶個細胞。

對給藥臨床試驗用醫藥品後可獲得探索性有效性評價變數資料的受試者分析了探索性有效性。利用Antera 3D ^®拍攝了TRTP-101（脂肪來源間充質幹細胞球體）給藥前/後的疤痕部位的照片（圖27），測定了萎縮性疤痕的體積（Volume of depression），其結果顯示萎縮性疤痕的部位減少（圖28）。為了記錄臨床試驗用醫藥品給藥部位，拍攝了顯示給藥部位的照片，並與證明檔一起保存。通過測定的各時間點的萎縮性疤痕的體積，測定了臨床試驗用醫藥品給藥部位的給藥前/後的變化率。

參照圖28，患者給藥8周後，疤痕的大小與給藥前相比，顯示出明顯減少。

為了確認耐藥性和穩定性，TRTP-101給藥後4周期間沒有發生不良事件通用術語標準（Common Terminology Criteria for Adverse Events）（CTCAE）Ver. 5.0基準3級（Grade）以上的藥物異常反應（Adverse drug reaction，ADR）中相應的劑量限制毒性（Dose Limiting Toxicity，DLT）。所有的異常反應均按MedDRA最新版本的SOC（系統器官類別，System Organ Class）和PT（首選術語，Preferred Term）分解分類分析。

實施例4的臨床試驗結果如在利用了動物模型的功效試驗中所示的結果那樣，對於萎縮性疤痕的治療具有明顯或顯著的效果。具體而言，本發明的包含脂肪來源間充質幹細胞球體的藥物組合物的TRTP-101給藥組中，萎縮性疤痕的體積減少到顯示出治療效果的明顯的程度。

實施例 5. 本發明的間充質幹細胞球體（ MiB ）的物理特性確認

（ 1 ）濕重（ Wet weight ）分析

為了確認根據實施例1製造的間充質幹細胞球體（本發明中稱為MiB或TRTP-101）在體外的特性，進行了濕重（Wet weight）分析。具體而言，為了確認根據本發明的間充質幹細胞球體的重量，測定了作為生產量的1200個的總重量，以推測每個的重量，其結果如下述表6。

[表6]

MiBs 重量（濕重）
No.	1200 ea （ mg ）	1 ea （ µg ）
1	4.40	3.67
2	5.90	4.92
3	2.00	1.67
4	3.30	2.75
5	3.80	3.17
平均	3.83	3.19
標準差	0.55	0.46

測定結果確認了，根據本發明的間充質幹細胞球體的濕重（Wet weight）每個約為3.19±0.46μg。

（ 2 ）乾重（ Dry weight ）分析

為了測定排除了培養基或緩衝溶液（Buffer）等溶劑的影響的根據本發明的間充質幹細胞球體的準確重量，利用冷凍乾燥方法進行了測定乾重（Dry weight）的實驗。

① 乾重（ dry weight ）測定實驗流程（ workflow ）

為了確認體外間充質幹細胞球體（MiB）的特性之一即乾重（dry weight），進行的實驗的流程（workflow）如下所示。針對根據本發明的間充質幹細胞球體（MiB），2名實驗者分別進行實驗，以確認實驗者之間的偏差。細胞在70%匯合（confluency）時回收，0.5K間充質幹細胞球體（MiB）用加入了10%的胎牛血清和1X抗生素抗真菌溶液的DMEM供應營養並在37℃的5%CO ₂培養器中培養2天。如下述表7所示分組。

[表7]

組	組資訊（Group info）	N
1	0 MiB, 200μL DPBS懸浮液 （空白對照）	3
2	4800 MiB, 200μL DPBS懸浮液	3
3	9600 MiB, 200μL DPBS懸浮液	3

在間充質幹細胞球體（MiB）培養期間，回收使用的5mL管（tube）和封口膜（parafilm）在回收前使用電子稱測量了重量。每組用電子秤測定3次重量後，求3次測定值的平均以計算重量。每次測定前，將電子稱歸零後再測定重量，若確認與上次重量存在0.2μg以上的重量差，則清零後測定重量。

將以製作時間點為基準培養了48小時的間充質幹細胞球體（MiB）分別以0個、4800個、9600個重複3次回收到5mL管（tube）後，懸浮在200μL的DPBS中。將5mL管（tube）的開口用封口膜（parafilm）密封後，用30號針（gauge needle）打孔，並利用冷凍乾燥器乾燥2天。冷凍乾燥完成的樣品同樣利用電子稱測定3次重量後，求測定值的平均以算出重量。從冷凍乾燥結束的樣品的重量中減去先前測定的5mL管（tube）和封口膜（parafilm）的重量，分別確認了4800個、9600個間充質幹細胞球體（MiB）的乾重（dry weight），將計算的乾重（dry weight）再次分別除以各個間充質幹細胞球體（MiB）個數，從而求出了1個間充質幹細胞球體（MiB）的重量。

② 間充質幹細胞球體（ MiB ）和間充質幹細胞球體（ MiB ）單體（ singlet ）的乾重（ dry weight ）測定結果

根據乾重（Dry weight）測定實驗流程（workflow）測定的4800個/9600個間充質幹細胞球體（MiB）乾重（dry weight）、以及間充質幹細胞球體（MiB）的乾重（dry weight）的測定結果如下述表8和所示，兩個實驗者之間的單個間充質幹細胞球體（MiB）乾重（dry weight）測定偏差如圖29所示，間充質幹細胞球體（MiB）重量的線形趨勢結果如圖30所示。

[表8]

MiB的重量（Weight）
實驗者	組	MiB 乾重（μg）	每1個MiB的乾重（ng）
實驗者1	1	0	0
0	0
0	0
2	1666.7	347.2
1733.3	361.1
1800.0	375.0
3	2933.3	305.6
3166.7	329.9
2866.7	298.6
實驗者2	1	0	0
0	0
0	0
2	1700	354.2
1566.7	326.4
1466.7	305.5
3	3133.3	326.4
2966.7	309.0
3033.3	316.0

參考上述表8和圖29，實驗者1和實驗者2測定的本發明的間充質幹細胞球體（MiB）的重量分別為336.2±30.5ng、322.9.2±17.6ng（平均值±S.D.），沒有統計學上的明顯差異。

另外，將兩個實驗者的0個、4800個、9600個間充質幹細胞球體的乾重（dry weight）數據（data）整合後，用其求出線性趨勢線的結果以R ²=0.9917顯示出該實驗具有統計學上的顯著性（圖30）。

另外，可以通過趨勢線計算的1個間充質幹細胞球體（MiB）的乾重（dry weight）317ng顯示出包含在表8的測定的間充質幹細胞球體（MiB）的重量範圍中。

實施例 6. 本發明的間充質幹細胞球體（ MiB ）的蛋白質組學分析

（ 1 ）單細胞和根據本發明的間充質幹細胞球體構成蛋白質數分析

為了確認根據本發明的間充質幹細胞球體相較於單細胞具有的特性，進行了製作的間充質幹細胞球體和單細胞的蛋白質組學分析。

為了該分析，根據Lee, Jangho, et al.的方法，將樣品置於含有4%SDS的裂解（lysis）緩衝液中，在100℃煮沸10分鐘後，在18000rpm下離心分離10分鐘，從而提取了蛋白質。將其用二辛可寧酸（Bicinchoninicacid）分析法（BCA）測定，用SDS-PAGE凝膠（gel）分離，並進行凝膠內消化（in-gel digestion）。根據Lee, Sang-Yeop, et al.的方法，按分子量將凝膠（gel）分級，並用由30%甲醇和10mM碳酸氫銨（Ammonium bicarbonate）和50%乙腈（Acetonitrile）製造的溶液洗滌凝膠（gel）。洗滌後，凝膠（gel）進行乾燥，用10mM二硫蘇糖醇（Dithiothreitol）和55mM碘乙醯胺（Iodoacetamide）還原後，在37℃用50mM碳酸氫銨（Ammonium bicarbonate）進行胰蛋白酶消化（Tryptic digestion）12-16小時。用包含5%三氟乙醯酸（Trifluoroacetylacid，TFA）和50%乙腈（Acetonitrile）的50mM碳酸氫銨（Ammonium bicarbonate）溶液提取胰蛋白酶肽（Tryptic peptide），並在4°C保存。

將根據上述方法保存的溶液溶解於0.5%TFA中，並使用串聯質譜法進行液相色譜串聯質譜（Liquidchromatography with tandem mass spectrometry，LC–MS/MS）分析。將5μL溶出的試樣利用100μm×2cm大小的nanoviper trap column和75μm×15cm大小的nanoviper analysis column （Thermo Fisher Scientific）在5%–40%的乙腈（Acetonitrile）中以300nL/min的流即溶出95分鐘。所有的MS和MS/MS光譜資料通過QExactive Plus質譜儀（mass spectrometer）（Thermo Fisher Scientific）進行分析。

蛋白質鑒定（Identification）是基於單同位素品質選擇（Monoisotopic mass selection）、前體質量公差（Precursor mass tolerance）±5Da、片段品質公差（Fragment mass tolerance）±0.8Da、2次錯誤切割和修飾的尿素甲基半胱氨酸（Carbamidomethylcysteine）確認的。個別光譜通過各資料庫搜索，具體而言，以計算的0.05的Mascot離子臨界值分數為基準被收容。利用肽有效性驗證器（Peptide validator）來匹配分析超過臨界值的肽和蛋白質，並適用1.0%的錯誤發現率（False discovery rates，FDR）。

單細胞和本發明的間充質幹細胞球體（MiB）以每組3個樣品進行實驗，其結果如圖31所示。

從圖31可以確認，分析單細胞和本發明的間充質幹細胞球體（MiB）構成蛋白質數的結果，確認了構成間充質幹細胞球體（MiB）和單細胞的總蛋白質的個數小幅增加約3%。

（ 2 ）單細胞和根據本發明的間充質幹細胞球體的主要成分分析

為了利用構成樣品的蛋白質來確認組之間關聯性和蛋白質構成差異，進行了主要成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和熱圖（Heatmap）分析。在顯示構成的蛋白質的關聯性的PCA分析分佈圖表中，確認了單細胞和間充質幹細胞球體位於相反方向，構成蛋白質的種類明顯不同，其結果如圖32所示。此外，同樣地，在用行、列和顏色表示組之間關聯性的熱圖分析中，確認了單細胞和間充質幹細胞球體之間的蛋白質構成和含量的差異，其結果如圖33所示。

（ 3 ）根據本發明的間充質幹細胞球體的蛋白質的增加減少分佈圖分析

分析了相對於單細胞的本發明的間充質幹細胞球體（MiB）的蛋白質的增加減少分佈。蛋白質的增加減少分佈圖示於圖34，確認相對於單細胞的本發明的間充質幹細胞球體（MiB）中增加的結構蛋白質的結果示於表9。

[表9]

基因	相對於單細胞的間充質幹細胞球體中的增加 （倍數變化）
肌腱蛋白（TNC）	68
纖維蛋白原-2（FBLN2）	17
基底膜特異性硫酸肝素蛋白聚糖核心蛋白 （HSPG2）	14
纖維蛋白原-1（FBLN1）	13
纖連蛋白（FN1）	11
膠原蛋白α-3（VI）鏈（COL6A3）	8

作為直觀顯示蛋白質構成變化的統計學顯著性的火山圖（Volcano plot）的分析結果（圖34），與單細胞相比，本發明的間充質幹細胞球體（MiB）中顯示出最大變化的是肌腱蛋白（Tenascin，TNC）。肌腱蛋白是在組織受損或發炎時表達的蛋白質，已知通過啟動表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）和炎症性訊號傳遞通路來參與細胞增殖反應並促進癒合。

另外，同樣地，纖連蛋白（Fibronectin，FN1）是被確認大幅增加的蛋白質之一，纖連蛋白已知是通過參與細胞的附著、生長、遷移和分化而在傷口癒合和組織重塑過程中發揮重要作用的蛋白質。

如上所述相對於單細胞的本發明的間充質幹細胞球體（MiB）中增加的蛋白質在功能上分為結構蛋白質、酶、核糖體蛋白質、組蛋白質、訊號傳遞蛋白質、細胞凋亡和分化相關蛋白質等，特別是，與結構有關的蛋白質增加，推測其由於本發明的間充質幹細胞球體（MiB）的生成原理即自組裝誘導而發生變化。

另外，蛋白聚糖（Proteoglycan-4，PRG4）顯示出是一種只在間充質幹細胞球體（MiB）中特異性表達的蛋白質。已知PRG4通過調節與傷口癒合有關的分子途徑以誘導脂肪細胞到傷口部位，從而通過纖維化減少、血管新生強化幫助傷口癒合。

此外，確認了在皮膚之類的組織中提供結構支承的蛋白質即COL5A3（Collagen Type V Alpha 3 Chain，V型膠原蛋白α-3鏈）、COL7A1（Collagen Type VII Alpha 1 Chain，VII型膠原蛋白α-1鏈）、EVPL（Envoplakin，包斑蛋白）、EFEMP2（Fibulin-4，纖維蛋白原-4）、MFAP2（Microfibril Associated Protein 2，微纖絲關聯蛋白2）等與單細胞相比，在間充質幹細胞球體（MiB）中新生。

通過這樣的蛋白質分析法，確認了多種結構蛋白質在本發明的間充質幹細胞球體（MiB）中特異性表達，並且細胞外基質蛋白質也增加。

無

圖1表示了用顯微鏡觀察從脂肪組織分離的間充質幹細胞的形態。

圖2表示了從脂肪組織分離的間充質幹細胞的細胞生長率。

圖3表示了用流式細胞術確認的間充質幹細胞的純度，並顯示了陰性標誌物和陽性標誌物。

圖4表示了用染色驗證作為間充質幹細胞的特性的向脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞的分化能力的結果。

圖5表示了用RT-PCR驗證作為間充質幹細胞的特性的向脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞的分化能力的結果。

圖6按天表示了通過自組裝形成的間充質幹細胞的圓形細胞結構即間充質幹細胞球體的培養的顯微鏡圖像。

圖7按供體和傳代表示了間充質幹細胞球體的大小分佈。

圖8按供體和傳代表示了間充質幹細胞球體的細胞存活。

圖9按培養時間表示間充質幹細胞球體的DNA量。

圖10顯示了間充質幹細胞球體的電子顯微鏡照片圖像。

圖11顯示了用流式細胞術確認的構成間充質幹細胞球體的細胞的間充質幹細胞標誌物的表達。

圖12按間充質幹細胞球體的供體顯示了將間充質幹細胞標誌物進行免疫螢光染色的顯微鏡圖像。

圖13顯示了用定量RT-PCR法分析間充質幹細胞球體的細胞外基質表達量的結果。

圖14顯示了用酶聯免疫吸附測定間充質幹細胞球體內細胞外基質表達的圖表。

圖15顯示了用螢光免疫染色確認間充質幹細胞球體的膠原蛋白表達的圖像。

圖16顯示用組織學分析確認間充質幹細胞球體的膠原蛋白表達的圖像。

圖17顯示了用即時（real-time）RT-PCR分析間充質幹細胞球體的生長因子表達的結果。

圖18是對創傷誘導動物模型給藥間充質幹細胞球體的試驗組和對照組的膠原蛋白面積分析結果，圖18（A）是皮內注入間充質幹細胞球體的結果，圖18（B）是塗覆給藥間充質幹細胞球體的結果。

圖19顯示了將對創傷誘導動物模型皮內給藥間充質幹細胞球體的試驗組和對照組的穩定性和有效性指標綜合評分的結果。

圖20顯示了對創傷誘導動物模型皮下給藥間充質幹細胞球體的試驗組和對照組中的創傷面積比率分析結果。

圖21顯示了對創傷誘導動物模型皮下給藥間充質幹細胞球體的試驗組和對照組中的組織病理學分析結果。

圖22顯示了對正常裸鼠給藥間充質幹細胞球體的試驗組和對照組的膠原蛋白和1型膠原蛋白的面積分析結果。

圖23顯示了對正常裸鼠給藥間充質幹細胞球體的試驗組和對照組的真皮厚度分析結果。

圖24顯示了用體外（ in vitro）實驗分析比較間充質幹細胞球體（TRTP-101）、HDF和MSC單細胞（single cell）（SC）中的1型膠原蛋白、FN的產生能力的結果。

圖25顯示了用體外（ in vitro）實驗分析比較間充質幹細胞球體（TRTP-101）、HDF和MSC單細胞（single cell）（SC）中的生長因子的蛋白質表達量的結果。

圖26用示意圖顯示了本發明的間充質幹細胞球體在皮膚傷口或疤痕上適用和恢復形態。

圖27顯示了本發明的間充質幹細胞球體給藥前和給藥後（1周、4周、8周後）萎縮性疤痕部位的Antera 3D ^®拍攝圖像。

圖28是本發明的間充質幹細胞球體給藥前和給藥後（1周、4周、8周後）萎縮性疤痕的體積測定結果。

圖29顯示了本發明的間充質幹細胞球體（MiB）的實驗者之間的乾重（dry weight）測定結果的偏差。

圖30顯示了本發明的間充質幹細胞球體（MiB）的乾重（dry weight）的線性趨勢線。

圖31顯示了本發明的間充質幹細胞球體和單細胞的總蛋白質的個數分析結果。

圖32顯示了本發明的間充質幹細胞球體和單細胞的主要成分分析結果。

圖33顯示了本發明的間充質幹細胞球體和單細胞的熱圖分析結果。

圖34顯示了本發明的間充質幹細胞球體和單細胞的蛋白質增加減少分佈圖。

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Claims (15)

1. 一種間充質幹細胞球體的用途，其用於皮膚傷口或疤痕治療用藥物的製造，所述間充質幹細胞球體被局部塗覆在目標部位或者通過皮下或皮內注射給藥， 所述間充質幹細胞球體為細胞的自組裝形態， 所述間充質幹細胞球體為間充質幹細胞的三維細胞聚集體， 所述間充質幹細胞球體的直徑為10至800μm， 所述間充質幹細胞球體的濕重為1至6μg或者乾重為250至500ng， 在所述間充質幹細胞球體中，選自成纖維細胞生長因子（FGF2）和血小板來源生長因子（PDGFA）中的至少一種的生長因子的表達減少，且選自血管內皮生長因子A（VEGFA）和肝細胞生長因子（HGF）中的至少一種的生長因子的表達增加， 所述間充質幹細胞球體表達選自肌腱蛋白（TNC）、纖連蛋白（FN1）、蛋白聚糖（PRG4）、V型膠原蛋白α-3鏈（COL5A3）、VII型膠原蛋白α-1鏈（COL7A1）、包斑蛋白（EVPL）、纖維蛋白原-4（EFEMP2）、微纖絲關聯蛋白2（MFAP2）、纖維蛋白原-2（FBLN2）、HSPG2、纖維蛋白原-1（FBLN1）和VI型膠原蛋白α-3鏈（COL6A3）中的至少一種蛋白質。
2. 如請求項1所述之用途，其中，所述間充質幹細胞為選自脂肪來源間充質幹細胞、骨髓來源間充質幹細胞、臍帶血來源間充質幹細胞、臍帶來源間充質幹細胞和外周血來源間充質幹細胞中的任一種。
3. 如請求項1所述之用途，其中，所述間充質幹細胞球體包含間充質幹細胞（MSC）和細胞外基質（ECM）， 所述細胞外基質包含選自膠原蛋白、纖連蛋白、透明質酸（HA）和彈性蛋白（EL）中的任一種或更多種。
4. 如請求項3所述之用途，其中，所述膠原蛋白為1型膠原蛋白。
5. 如請求項1所述之用途，其中，所述間充質幹細胞球體包含將CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽性表達至少85%以上且將CD31、CD45、CD79a、CD117和HLA-DR陰性表達至少10%以下的細胞。
6. 如請求項1所述之用途，其中，所述間充質幹細胞球體被單次、2次或3次給藥。
7. 如請求項1所述之用途，其中，向需要通過膠原蛋白產生進行皮膚再生的目標部位直接給藥時，所述間充質幹細胞球體誘導皮膚內真皮恢復而使皮膚再生，或者誘導皮膚內皮下恢復而使皮膚再生。
8. 如請求項1所述之用途，其中，所述目標部位包括皮膚的真皮層被損壞或凹陷的部分，或者所述目標部位包括皮膚的皮下層被損壞或凹陷的部分。
9. 如請求項1所述之用途，其中，單位給藥量內包含1至2×10⁵個所述間充質幹細胞球體。
10. 如請求項1所述之用途，其中，所述疤痕為選自褥瘡導致的疤痕、燒傷導致的疤痕、脫毛導致的疤痕、腺性硬皮病導致的疤痕、創傷導致的疤痕、糖尿病足潰瘍導致的疤痕、萎縮性疤痕和妊娠紋中的任一種或更多種。
11. 如請求項1所述之用途，其中，所述傷口為皮膚的表皮；真皮；皮下；表皮和真皮；真皮和皮下；或者表皮、真皮和皮下層損傷的傷口。
12. 如請求項1所述之用途，其中，所述傷口為選自割傷、切口、創傷、擦傷、挫傷、刺傷、裂傷、撕裂傷、燒傷和切割中的任一種或更多種。
13. 一種組合物，其包含被局部塗覆在目標部位或者通過皮下或皮內注射給藥的間充質幹細胞球體， 所述間充質幹細胞球體為細胞的自組裝形態， 所述間充質幹細胞球體為間充質幹細胞的三維細胞聚集體， 所述間充質幹細胞球體的直徑為10至800μm， 所述間充質幹細胞球體的濕重為1至6μg或者乾重為250至500ng， 在所述間充質幹細胞球體中，選自成纖維細胞生長因子（FGF2）和血小板來源生長因子（PDGFA）中的至少一種的生長因子的表達減少，且選自血管內皮生長因子A（VEGFA）和肝細胞生長因子（HGF）中的至少一種的生長因子的表達增加， 所述間充質幹細胞球體表達選自肌腱蛋白（TNC）、纖連蛋白（FN1）、蛋白聚糖（PRG4）、V型膠原蛋白α-3鏈（COL5A3）、VII型膠原蛋白α-1鏈（COL7A1）、包斑蛋白（EVPL）、纖維蛋白原-4（EFEMP2）、微纖絲關聯蛋白2（MFAP2）、纖維蛋白原-2（FBLN2）、HSPG2、纖維蛋白原-1（FBLN1）和VI型膠原蛋白α-3鏈（COL6A3）中的至少一種蛋白質。
14. 如請求項13所述之組合物，其中，所述間充質幹細胞球體包含間充質幹細胞（MSC）和細胞外基質（ECM）， 所述細胞外基質包含選自膠原蛋白、纖連蛋白、透明質酸（HA）和彈性蛋白（EL）中的任一種或更多種。
15. 如請求項13所述之組合物，其中，所述間充質幹細胞球體包含將CD29、CD44、CD73、CD90和CD105陽性表達至少85%以上且將CD31、CD45、CD79a、CD117和HLA-DR陰性表達至少10%以下的細胞。