TWI904701B

TWI904701B - 抗ceacam5/6雙結合抗體

Info

Publication number: TWI904701B
Application number: TW113120466A
Authority: TW
Inventors: 鄔俊; 汪皛皛; 龔星群; 項自来; 王迪; 康昭; 吳蕾; 徐佳儀; 侯建豪; 張博文; 禮樂劉
Original assignee: 中國商諾納生物（蘇州）有限公司
Priority date: 2023-06-05
Filing date: 2024-06-03
Publication date: 2025-11-11

Abstract

本文公開了與CEACAM5和CEACAM6都結合的抗體及其抗原結合片段及其用途，編碼該等抗體和抗原結合片段的核酸，包含該等核酸的載體以及包含該等核酸或載體的宿主細胞。本文還公開了包含該等抗體的藥物組成物和軛合物，以及藉由施用該等抗體的治療方法。

Description

抗CEACAM5/6雙結合抗體

本發明關於與CEACAM5和CEACAM6都結合的抗體及其抗原結合片段及其用途。

癌胚抗原（CEA）係一種參與細胞黏附的糖蛋白。CEA於1965年首次被鑒定（Gold和Freedman, J Exp Med[實驗醫學雜誌], 121, 439, 1965）為一種在妊娠的最初六個月由胎兒腸道正常表現的蛋白質，並在胰臟癌、肝癌和大腸癌中發現。CEA家族屬於免疫球蛋白超家族。CEA家族由18個基因組成，細分為兩個蛋白質亞組：癌胚抗原相關細胞黏附分子（CEACAM）亞組和妊娠特異性糖蛋白亞組（Kammerer和Zimmermann, BMC Biology[BMC生物學] 2010, 8:12）。在人中，CEACAM亞組由7個成員組成：CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8。

CEACAM5（癌胚抗原相關細胞黏附分子5），也稱為CEA或CD66e，係一種眾所周知的腫瘤相關抗原，多年來一直被用作癌症診斷的生物標誌物。CEACAM5的表現與某些癌症高度相關。它在大腸癌、直腸癌、肺癌、胰臟癌和胃癌中上調，與正常組織相比，變化高達數百倍。CEACAM5的分佈特徵使其成為如抗體和ADC（抗體藥物軛合物）等治療藥物的良好靶標。例如，賽諾菲（Sanofi）的SAR408701（瑞沃特賽妥單抗（tusamitamab ravtansine））包含藉由N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯（SPDB）連接子（linker）與細胞毒性劑DM4（一種有效的微管去穩定美登素）共價連接的抗CEACAM5抗體SAR408377（特賽妥單抗（tusamitamab）；也稱為huMab2-3）。

CEACAM6（癌胚抗原相關細胞黏附分子6），也稱為NCA90或CD66c，也是一種眾所周知的腫瘤相關抗原，並已被用作癌症診斷中的生物標誌物。CEACAM6的表現也與某些癌症（例如大腸癌、直腸癌、肺癌、胰臟癌和胃癌）高度相關。由於其分佈特徵，CEACAM6也是如抗體和ADC等治療藥物的非常好的靶標。

在CEACAM5和CEACAM6共表現的癌症中，一種可能比另一種具有甚至更高的表現。因此，靶向CEACAM5和CEACAM6的抗體可能覆蓋異質性腫瘤微環境中的更多癌細胞，從而覆蓋更大的患者群體。因此，在腫瘤免疫治療中，開發同時靶向CEACAM5和CEACAM6的抗體係重要的。

本發明提供與CEACAM5和CEACAM6都結合的抗體及其抗原結合片段。

在第一方面，本發明提供了與CEACAM5和CEACAM6都結合的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），並且其中 (1) 該VH包含具有SEQ ID NO: 26中所示的胺基酸序列的VH的HCDR 1-3，以及該VL包含具有SEQ ID NO: 27中所示的胺基酸序列的VL的LCDR 1-3； (2) 該VH包含具有SEQ ID NO: 7中所示的胺基酸序列的VH的HCDR 1-3，以及該VL包含具有SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列的VL的LCDR 1-3； (3) 該VH包含具有SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列的VH的HCDR 1-3，以及該VL包含具有SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列的VL的LCDR 1-3；或 (4) 該VH包含具有SEQ ID NO: 31中所示的胺基酸序列的VH的HCDR 1-3，以及該VL包含具有SEQ ID NO: 32中所示的胺基酸序列的VL的LCDR 1-3。

在一些實施方式中，本發明提供了與CEACAM5和CEACAM6都結合的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），並且其中 (1) 該VH包含分別包含SEQ ID NO: 21、22和23中所示的胺基酸序列的HCDR 1-3，以及該VL包含分別包含SEQ ID NO: 24、5和25中所示的胺基酸序列的LCDR 1-3； (2) 該VH包含分別包含SEQ ID NO: 1、2和3中所示的胺基酸序列的HCDR 1-3，以及該VL包含分別包含SEQ ID NO: 4、5和6中所示的胺基酸序列的LCDR 1-3； (3) 該VH包含分別包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列的HCDR 1-3，以及該VL包含分別包含SEQ ID NO: 14、15和16中所示的胺基酸序列的LCDR 1-3；或 (4) 該VH包含分別包含SEQ ID NO: 1、30和3中所示的胺基酸序列的HCDR 1-3，以及該VL包含分別包含SEQ ID NO: 4、5和6中所示的胺基酸序列的LCDR 1-3。

在一些實施方式中，本發明提供了與CEACAM5和CEACAM6都結合的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），並且其中 (1) 該VH包含與SEQ ID NO: 26具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該VL包含與SEQ ID NO: 27具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列； (2) 該VH包含與SEQ ID NO: 7具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該VL包含與SEQ ID NO: 8具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列； (3) 該VH包含與SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該VL包含與SEQ ID NO: 18具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列；或 (4) 該VH包含與SEQ ID NO: 31具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該VL包含與SEQ ID NO: 32具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列。

在較佳的實施方式中，本發明提供了與CEACAM5和CEACAM6都結合的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），並且其中 (1) 該VH包含SEQ ID NO: 26中所示的胺基酸序列，以及該VL包含SEQ ID NO: 27中所示的胺基酸序列； (2) 該VH包含SEQ ID NO: 7中所示的胺基酸序列，以及該VL包含SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列； (3) 該VH包含SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列，以及該VL包含SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列；或 (4) 該VH包含SEQ ID NO: 31中所示的胺基酸序列，以及該VL包含SEQ ID NO: 32中所示的胺基酸序列。

在一些實施方式中，該抗體包含重鏈（HC）和輕鏈（LC），其中： (1) 該HC包含與SEQ ID NO: 28具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該LC包含與SEQ ID NO: 29具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列； (2) 該HC包含與SEQ ID NO: 9具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該LC包含與SEQ ID NO: 10具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列； (3) 該HC包含與SEQ ID NO: 19具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該LC包含與SEQ ID NO: 20具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列；或 (4) 該HC包含與SEQ ID NO: 33具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該LC包含與SEQ ID NO: 34具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列。

在較佳的實施方式中，該抗體包含重鏈（HC）和輕鏈（LC），其中： (1) 該HC包含SEQ ID NO: 28中所示的胺基酸序列，以及該LC包含SEQ ID NO: 29中所示的胺基酸序列； (2) 該HC包含SEQ ID NO: 9中所示的胺基酸序列，以及該LC包含SEQ ID NO: 10中所示的胺基酸序列； (3) 該HC包含SEQ ID NO: 19中所示的胺基酸序列，以及該LC包含SEQ ID NO: 20中所示的胺基酸序列；或 (4) 該HC包含SEQ ID NO: 33中所示的胺基酸序列，以及該LC包含SEQ ID NO: 34中所示的胺基酸序列。

在一些實施方式中，抗體係鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。

在一些實施方式中，抗體係選自由IgG、IgA、IgM、IgE和IgD組成之群組的同種型。

在一些實施方式中，抗體係選自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4組成之群組的亞型。

在一些實施方式中，抗原結合片段選自由Fab、Fab’、F(ab') ₂、Fd、Fd’、Fv、scFv、ds-scFv和dAb組成之群組。

在一些實施方式中，抗體係單株抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。

在一些實施方式中，抗體係單價、二價或多價的。

在一些實施方式中，抗體或抗原結合片段連接到螢光標記、放射性標記或藥物部分。

在一些實施方式中，抗體或抗原結合片段連接到藥物部分，並且該藥物部分選自由微管抑制劑、抗生素、DNA合成抑制劑、拓撲異構酶抑制劑、RNA聚合酶II抑制劑和RNA剪接體抑制劑組成之群組。

在較佳的實施方式中，藥物部分選自由MMAE、MMAF、倍癌黴素、DM1、DM4、SN-38、Dxd、卡奇黴素、阿黴素和PBD（苯二氮呯類藥物）組成之群組。

在一些實施方式中，抗體或抗原結合片段藉由連接子連接到藥物部分。

在一些實施方式中，連接子包含可切割連接子或不可切割連接子。

在一些實施方式中，可切割連接子選自由酸不穩定連接子、親水連接子、蛋白酶敏感連接子、光不穩定連接子、腙連接子、二甲基連接子和含二硫化物連接子組成之群組。

在較佳的實施方式中，連接子選自由MC（6-馬來醯亞胺基己醯基）、Val-Cit（纈胺酸-瓜胺酸）、PABC（對胺基苄氧羰基）、DMEA（二甲基乙胺）、Val-Cit-PABC、MC-Val-Cit-PABC、MC-Val-Cit-PABC-DMEA、GGFG（甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸）、MC-GGFG-胺甲基、AcBut（4-(4-乙醯基苯氧基)-丁酸）和AcBut-二甲基肼組成之群組，較佳的是MC-Val-Cit-PABC。

在第二方面，本發明提供了雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含本發明第一方面的抗體或其抗原結合片段，和特異性結合腫瘤相關抗原、免疫細胞抗原或免疫檢查點分子的第二抗原結合區。

在第三方面，本發明提供了核酸，該核酸包含編碼本發明第一方面的抗體或其抗原結合片段，或本發明第二方面的雙特異性抗體的核苷酸序列。

在第四方面，本發明提供了包含本發明第三方面的核酸的載體。

在第五方面，本發明提供了宿主細胞，該宿主細胞包含本發明第三方面的核酸或本發明第四方面的載體。

在第六方面，本發明提供了抗體-藥物軛合物（ADC），其中該ADC包含本發明第一方面的抗體或其抗原結合片段或本發明第二方面的雙特異性抗體，以及藉由連接子與其軛合的藥物部分。

在一些實施方式中，藥物部分選自由微管抑制劑、抗生素、DNA合成抑制劑、拓撲異構酶抑制劑、RNA聚合酶II抑制劑和RNA剪接體抑制劑組成之群組。

在第七方面，本發明提供了藥物組成物，該藥物組成物包含（i）本發明第一方面的抗體或其抗原結合片段、或本發明第二方面的雙特異性抗體、或本發明第三方面的核酸、或本發明第四方面的載體、或本發明第五方面的宿主細胞、或本發明第六方面的抗體-藥物軛合物；和視需要（ii）藥學上可接受的載劑或賦形劑。

在一些實施方式中，組成物進一步包含第二治療劑。較佳的是，第二治療劑選自由抗體、化療劑、siRNA、反義寡核苷酸、多肽和小分子藥物組成之群組。

在第八方面，本發明提供了治療受試者癌症之方法，該方法包括向受試者施用有效量的本發明之抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體、核酸、載體、宿主細胞、抗體-藥物軛合物或藥物組成物。

在一些特別實施方式中，癌症係與CEACAM5和/或CEACAM6表現相關的癌症。在較佳的實施方式中，癌症選自由小腸癌、大腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌、前列腺癌和皮膚癌組成之群組。

在一些實施方式中，該方法進一步包括向受試者施用第二治療劑。較佳的是，第二治療劑選自抗體、化療劑、siRNA、反義寡核苷酸、多肽和小分子藥物。

在第九方面，本發明提供了本發明之抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體、核酸、載體、宿主細胞、抗體-藥物軛合物或藥物組成物在製造用於治療受試者癌症的藥物中之用途。

在一些實施方式中，癌症係與CEACAM5和/或CEACAM6表現相關的癌症。在較佳的實施方式中，癌症選自由小腸癌、大腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌、前列腺癌和皮膚癌組成之群組。

在一些實施方式中，藥物進一步包含第二治療劑。較佳的是，第二治療劑選自抗體、化療劑、siRNA、反義寡核苷酸、多肽和小分子藥物。

在一些實施方式中，藥物與第二治療劑組合施用。較佳的是，第二治療劑選自抗體、化療劑、siRNA、反義寡核苷酸、多肽和小分子藥物。

在第十方面，本發明提供了本發明之抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體、核酸、載體、宿主細胞、抗體-藥物軛合物或藥物組成物，用於在治療受試者癌症之方法中使用。

在一些實施方式中，向受試者進一步施用第二治療劑。較佳的是，第二治療劑選自抗體、化療劑、siRNA、反義寡核苷酸、多肽和小分子藥物。

在第十一方面，本發明提供了一種用於檢測樣品中CEACAM5和/或CEACAM6的存在或水平之方法，該方法包括： (a) 使該樣品與如請求項1-10中任一項所述之抗體或其抗原結合片段接觸，以及 (b) 藉由檢測該抗體與該樣品的結合來確定該樣品中CEACAM5和/或CEACAM6的存在或水平。

在較佳的實施方式中，該方法用於非診斷目的。

在第十二方面，本發明提供了一種用於診斷受試者中與CEACAM5和/或CEACAM6表現相關的癌症之方法，該方法包括： (a) 從該受試者獲得生物樣品， (b) 將該樣品與本發明之抗體或其抗原結合片段接觸，以及 (c) 檢測該抗體與該樣品的結合，其中相比於抗體或其抗原結合片段與對照樣品的結合，抗體或其抗原結合片段與該樣品的結合增加將該受試者鑒定為患有癌症。

在第十三方面，本發明提供了一種用於對受試者中與CEACAM5和/或CEACAM6表現相關的癌症成像之方法，該方法包括： (a) 向該受試者施用本發明之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體與可檢測的標誌物軛合，以及 (b) 檢測該標誌物的存在。

在一些實施方式中，可檢測的標誌物為 ¹¹¹In，並且較佳的是，藉由單光子發射電腦體層攝影來檢測標誌物。在其他實施方式中，可檢測的標誌物為 ⁸⁹Zr，並且較佳的是，藉由正電子發射體層攝影來檢測標誌物。

藉由結合附圖對以下實施方式進行詳細描述，本發明之上述特徵和優點以及其另外的特徵和優點將在下文中更清楚地理解。

本文參考附圖描述的實施方式係解釋性的、說明性的，並且用於總體理解本發明。實施方式不應被解釋為限制本發明之範圍。在整個說明書中，相同或相似的元件以及具有相同或相似功能的元件由類似的附圖標記表示。

除非另有說明或定義，否則所使用的所有術語在本領域中具有其通常含義，這對熟悉該項技術者來說是清楚的。例如，參考標準手冊，例如Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. 和Klbl, H.編輯, 「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)[生物技術術語的多語言詞彙表：（IUPAC建議）]」, Helvetica Chimica Acta[瑞士化學學報] (1995), CH-4010瑞士巴塞爾；Sambrook等人, 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊]" (第2版), 第1-3卷, 冷泉港實驗室出版社(1989)；F. Ausubel等人編輯, 「Current protocols in molecular biology[分子生物學的當前方案]」, Green Publishing and Wiley InterScience, 紐約(1987)；Roitt等人, 「Immunology[免疫學] (第6版), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001)；以及Janeway等人, 「Immunobiology[免疫生物學] 」 (第6版), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, 紐約(2005)，以及上面引用的一般背景領域。

如本文所用，單數形式「一個/種（a/an）」以及「該（the）」包括複數指示物，除非上下文清楚地另外指明。因此，例如，提及「抗體」包括多種抗體。

除非另有說明或定義，否則術語「包括（comprise）」及其變體，如「包括（comprises）」和「包括（comprising）」，應理解為包括所述元素或步驟或一組元素或步驟，但不排除任何其他元素或步驟或一組元素或步驟。術語「包括（comprising）」涵蓋「包含（including）」和「組成（consisting）」，例如，「包括」X的組成物可以完全由X組成或可以包括其他項，例如X + Y。

與數值x相關的術語「約」係視需要的，例如意指x ± 10%或x ± 5%。

如本文所用，術語「抗體」係指具有特異性結合特定抗原的能力的免疫球蛋白分子。抗體通常在重鏈和輕鏈中的每一個中包括可變區和恒定區。抗體重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，該等宿主組織或因子包括免疫系統的多種細胞（如效應細胞）和補體系統的成分（如C1q，這係補體活化的經典途徑中的第一個成分）。大多數抗體具有重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），它們一起形成抗體中與抗原結合的那部分。

「輕鏈可變區」（VL）或「重鏈可變區」（VH）由被三個「互補決定區」或「CDR」間隔開的四個「框架」區組成。框架區的作用係排列CDR以便特異性結合抗原的表位。CDR包括主要負責抗原結合的抗體的胺基酸殘基。從胺基末端到羧基末端，VL和VH結構域都包含以下框架（FR）區和CDR區：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。VL結構域的CDR 1、2和3在本文中也分別稱為LCDR1、LCDR2和LCDR3；VH結構域的CDR 1、2和3在本文中也分別稱為HCDR1、HCDR2和HCDR3。

胺基酸對每個VL和VH結構域的分配根據CDR的任何常規定義。常規定義包括Kabat定義（Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫學感興趣的蛋白的序列] (National Institutes of Health[美國國立衛生研究院], 馬里蘭州貝塞斯達, 1987和1991）、Chothia定義（Chothia和Lesk, J. Mol. Biol[分子生物學雜誌]. 196:901-917, 1987；Chothia等人, Nature[自然] 342:878-883, 1989）；Chothia Kabat CDR複合物（也稱為Chothia和Kabat組合CDR），其中每個CDR係Chothia和Kabat CDR的複合物；Oxford Molecular的抗體建模軟體使用的AbM定義；以及Martin等人（萬維網bioinfo.org.uk/abs）的contact定義。Kabat提供了一種廣泛使用的編號約定（Kabat編號系統），其中不同重鏈之間或不同輕鏈之間的相應殘基被分配相同的編號。

本公開關於根據該等編號系統中的任一個定義的CDR，儘管較佳的實施方式關於Chothia和Kabat組合定義的CDR。 [表3].抗體CDR的定義方法（參見http://bioinf.org.uk/abs/）

在表3中，Laa-Lbb可以指從抗體輕鏈的N末端開始從位置aa（根據Chothia編號系統）到位置bb（根據Chothia編號系統）的胺基酸序列；Haa-Hbb可以指從抗體重鏈的N末端開始的從位置aa（根據Chothia編號系統）到位置bb（根據Chothia編號系統）的胺基酸序列。例如，L24-L34可以指從抗體輕鏈的N末端開始的從位置24到位置34的胺基酸序列（根據Chothia編號系統）；H26-H32可以指從抗體重鏈的N末端開始的從位置26到位置32的胺基酸序列（根據Chothia編號系統）。

如本文所用，術語「抗體」應按其最廣泛的含義理解，並包括單株抗體（包括全長單株抗體）、多株抗體、抗體片段和含有至少兩個不同抗原結合區的多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）。抗體可能含有另外的修飾，例如非天然存在的胺基酸、Fc區的突變、和糖基化位點的突變。抗體還包括翻譯後修飾的抗體、含有抗體的抗原決定簇的融合蛋白、和含有抗原識別位點的任何其他修飾的免疫球蛋白分子，只要該等抗體表現出所需的生物活性即可。

如本文所用，術語抗體的「抗原結合片段」係指抗體的一個或多個片段，其保留與抗原（例如，CEACAM5或CEACAM6）特異性結合的能力。已經表明，抗體的抗原結合功能可以藉由全長抗體的片段來執行。

抗體的抗原結合片段的實例包括（i）Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；（ii）F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區的二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；（iii）Fab'片段，其本質上係具有部分鉸鏈區的Fab（參見FUNDAMENTALIMMUNOLOGY[基礎免疫學]（Paul編輯, 3.sup.rd ed. 1993））；（iv）由VH和CH1結構域組成的Fd片段；（v）Fd’片段，其具有VH和CH1結構域以及在CH1結構域的C末端的一個或多個半胱胺酸殘基；（vi）由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段，（vii）由VH結構域組成的dAb片段（Ward等人, (1989) Nature[自然] 341:544-546）；（viii）分離的互補決定區（CDR）；以及（ix）奈米抗體，包含單個可變結構域和兩個恒定結構域的重鏈可變區。此外，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨的基因編碼，但它們可以使用重組方法藉由合成連接子連接，使它們能夠製成單個蛋白鏈，其中VL區和VH區進行配對形成單價分子（稱為單鏈Fv（scFv）；參見例如，Bird等人 (1988) Science[科學] 242:423-426；和Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊] 85:5879-5883）。這種單鏈抗體也旨在涵蓋在抗體的術語「抗原結合片段」中。此外，該術語還包括包含一對串聯Fd片段（VH-CH1-VH-CH1）的「線性抗體」，其與互補輕鏈多肽一起形成抗原結合區，以及上述任何片段的修飾形式，其保留抗原結合活性。

該等抗原結合片段可以使用熟悉該項技術者已知的常規技術獲得，並且以與完整抗體相同的方式篩選片段的實用性。

如本文所用，術語「結合」或「特異性結合」係指兩個分子之間的非隨機結合反應，例如抗體與其靶抗原之間。抗體的結合特異性可以基於親和力和/或親合力來確定。親和力由抗原與抗體解離的平衡常數（KD）表示，係抗原決定簇（表位）與抗體上抗原結合位點之間結合強度的量度：KD值越小，抗原決定簇（表位）與抗體之間的結合強度越強。可替代地，親和力也可以表示為親和常數（KA），即1/KD。

親合力係抗體與相關抗原之間結合強度的量度。親合力與抗原決定簇（表位）及其在抗體上的抗原結合位點之間的親和力以及抗體上存在的相關結合位點的數量有關。通常，抗體將以10 ^-5至10 ^-12M或更低，較佳的是10 ^-7至10 ^-12M或更低，更較佳的是10 ^-8至10 ^-12M的解離常數（KD），和/或以至少10 ⁷M ^-1，較佳的是至少10 ⁸M ^-1，更較佳的是至少10 ⁹M ^-1，例如至少10 ¹²M ^-1的結合親和力結合。任何大於10 ^-4M的K _D值通常被認為表明非特異性結合。抗體與抗原或抗原決定簇的特異性結合可以以任何本身已知的合適方式確定，該等方式包括例如Scatchard分析和/或競爭性結合測定，例如放射免疫測定（RIA）、酶免疫測定（EIA）、生物層干涉測定（BLI）測定和夾心競爭測定，以及本領域本身已知的其不同變體。

術語「表位」係指抗原上抗體結合的位點。表位可以由藉由一種或多種蛋白質的三級折疊並置的連續胺基酸或非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成的表位（也稱為線性表位）通常在暴露於變性溶劑時保留，而藉由三級折疊形成的表位（也稱為構象表位）通常在用變性溶劑處理時丟失。表位通常在獨特的空間構象中包括至少3個，更通常至少5個或8-10個胺基酸。表位定義抗體的最小結合位點，因此係抗體或其抗原結合片段的特異性靶標。

如本文所用，術語「序列同一性」係指兩個序列（胺基酸）在比對中的相同位置具有相同殘基的程度。例如，「胺基酸序列與SEQ ID NO: Y X%相同」係指胺基酸序列與SEQ ID NO: Y的同一性%，並被闡述為胺基酸序列中X%的殘基與SEQ ID NO: Y中公開的序列殘基相同。通常，電腦程式用於這樣的計算。比較和比對序列對的示例性程式包括ALIGN（Myers和Miller, 1988）、FASTA（Pearson和Lipman, 1988；Pearson, 1990）和空位BLAST（Altschul等人, 1997）、BLASTP、BLASTN或GCG（Devereux等人, 1984）。

此外，在確定兩個胺基酸序列之間的序列同一性程度時，熟悉該項技術者可以考慮所謂的「保守」胺基酸取代，其通常可以描述為其中胺基酸殘基被另一個胺基酸殘基替換的胺基酸取代，該另一個胺基酸殘基具有相似的化學結構並且對多肽的功能、活性或其他生物特性幾乎或基本上沒有影響。

這種保守取代較佳的是以下組(a)-(e)中的一個胺基酸被同一組內的另一個胺基酸殘基取代的取代：(a)小的脂肪族、非極性或微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)帶負電荷的極性殘基及其（不帶電的）醯胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)帶正電荷的極性殘基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(e)芳香族殘基：Phe、Tyr和Trp。

特別較佳的保守取代如下：Ala取代為Gly或Ser；Arg取代為Lys；Asn取代為Gln或His；Asp取代為Glu；Cys取代為Ser；Gln取代為Asn；Glu取代為Asp；Gly取代為Ala或Pro；His取代為Asn或Gln；Ile取代為Leu或Val；Leu取代為Ile或Val；Lys取代為Arg、Gln或Glu；Met取代為Leu、Tyr或Ile；Phe取代為Met、Leu或Tyr；Ser取代為Thr；Thr取代為Ser；Trp取代為Tyr；Tyr取代為Trp；和/或Phe取代為Val、Ile或Leu。

如本文所用，術語「單株抗體」係指從基本上均質的抗體群體中獲得的抗體。也就是說，構成群體的每種抗體皆為相同的，除了少量可能自然發生突變。單株抗體具有高度特異性，並且針對單一抗原。本文中的術語「單株抗體」不限於藉由雜交瘤技術產生的抗體，並且不應被解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。

術語「雙特異性抗體」在本發明之上下文中被理解為具有由不同抗體序列定義的兩個不同抗原結合區的抗體。這可以理解為不同的靶標結合，但也包括與一個靶標中的不同表位結合。

如本文所用，術語「腫瘤相關抗原」係指與正常細胞相比在癌細胞中差異表現的抗原，因此可用於靶向癌細胞。

如本文所用，術語「載體」意在指能夠轉運與其連接的另一種核酸的核酸分子。

如本文所用，術語「宿主細胞」係指已將表現載體引入其中的細胞。

術語「藥學上可接受的」係指載劑或佐劑與組成物的其他成分相容，並且對其接受者沒有實質性的危害和/或該載劑或佐劑被批准或可批准包含在用於人胃腸外施用的藥物組成物中。

如本文所用，術語「治療（treatment/treating）」等係指為獲得效果而施用藥劑或執行程序。該效果就完全地或部分地預防疾病或其症狀而言可以是預防性的，和/或就實現疾病和/或疾病症狀部分或完全治癒而言可能是治療性的。如本文所用，「治療」可以包括對哺乳動物，特別是人中的疾病或病況（例如癌症）的治療，並且包括：(a) 防止疾病或疾病症狀發生在可能易患該疾病但尚未被診斷為患有該疾病的受試者身上（例如，包括可能與原發性疾病相關或由原發性疾病引起的疾病）；(b) 抑制疾病，即阻止其發展；以及 (c) 緩解疾病，即使疾病消退。治療可以指在癌症治療或改善或預防中成功的任何指標，包括任何客觀或主觀參數，例如減輕；緩解；減少症狀或使患者更耐受疾病病症；退化或衰退速度減慢；或者使退化的最終點不那麼令人衰弱。症狀的治療或改善基於一個或多個客觀或主觀參數；包括醫生的檢查結果。因此，術語「治療」包括施用本文公開的抗體或組成物或軛合物，以預防或延遲、減輕、或阻止或抑制與疾病（例如癌症）相關的症狀或病症的發展。術語「治療效果」係指減少、消除或預防受試者的疾病、疾病症狀或疾病的副作用。

如本文所用，術語「有效量」係指當施用給受試者以治療疾病時，足以對該疾病進行治療的量。

如本文所用，術語「受試者」係指需要診斷、治療或療法的任何哺乳動物受試者。用於治療的「哺乳動物」係指任何被歸類為哺乳動物的動物，包括人、家畜和農場動物，以及實驗室動物、動物園動物、競賽動物或寵物動物，例如狗、馬、貓、牛、綿羊、山羊、豬、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等。

術語「cyno CEACAM5」、「石蟹獼猴CEACAM5（cynomolgus CEACAM5）」和「石蟹獼猴CEACAM5（Cynomolgus macaques CEACAM5）」在文中可互換使用，並指石蟹獼猴CEACAM5。該術語包括由石蟹獼猴細胞自然表現的任何CEACAM5變體、亞型和物種同源物，或在用編碼石蟹獼猴CEACAM5的基因或cDNA轉染的細胞上表現，該等基因或cDNA在石蟹獼猴細胞上自然表現。

術語「cyno CEACAM6」、「石蟹獼猴CEACAM6（cynomolgus CEACAM6）」和「石蟹獼猴CEACAM6（Cynomolgus macaques CEACAM6）」在文中可互換使用，並指石蟹獼猴CEACAM6。該術語包括由石蟹獼猴細胞自然表現的任何CEACAM6變體、亞型和物種同源物，或在用編碼石蟹獼猴CEACAM6的基因或cDNA轉染的細胞上表現，該等基因或cDNA在石蟹獼猴細胞上自然表現。抗 CEACAM5/6 雙結合抗體

在第一方面，本發明提供了與CEACAM5和CEACAM6都結合的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），並且其中(1)該VH包含具有SEQ ID NO: 26中所示的胺基酸序列的VH的HCDR 1-3，以及該VL包含具有SEQ ID NO: 27中所示的胺基酸序列的VL的LCDR 1-3；(2)該VH包含具有SEQ ID NO: 7中所示的胺基酸序列的VH的HCDR 1-3，以及該VL包含具有SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列的VL的LCDR 1-3；(3)該VH包含具有SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列的VH的HCDR 1-3，以及該VL包含具有SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列的VL的LCDR 1-3；或(4)該VH包含具有SEQ ID NO: 31中所示的胺基酸序列的VH的HCDR 1-3，以及該VL包含具有SEQ ID NO: 32中所示的胺基酸序列的VL的LCDR 1-3。

在一些實施方式中，LCDR 1-3和HCDR 1-3由EU Kabat定義/編號系統定義。在一些實施方式中，LCDR 1-3和HCDR 1-3由Chothia定義/編號系統定義。在一些實施方式中，LCDR 1-3和HCDR 1-3由AbM定義/編號系統定義。在一些較佳的實施方式中，LCDR 1-3和HCDR 1-3由Kabat和Chothia組合編號系統定義。

在一些實施方式中，抗體包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），其中 (1) 該VH包含分別包含SEQ ID NO: 21、22和23中所示的胺基酸序列的HCDR 1-3，以及該VL包含分別包含SEQ ID NO: 24、5和25中所示的胺基酸序列的LCDR 1-3；(2) 該VH包含分別包含SEQ ID NO: 1、2和3中所示的胺基酸序列的HCDR 1-3，以及該VL包含分別包含SEQ ID NO: 4、5和6中所示的胺基酸序列的LCDR 1-3；(3) 該VH包含分別包含SEQ ID NO: 11、12和13中所示的胺基酸序列的HCDR 1-3，以及該VL包含分別包含SEQ ID NO: 14、15和16中所示的胺基酸序列的LCDR 1-3；或 (4) 該VH包含分別包含SEQ ID NO: 1、30和3中所示的胺基酸序列的HCDR 1-3，以及該VL包含分別包含SEQ ID NO: 4、5和6中所示的胺基酸序列的LCDR 1-3。

在一些實施方式中，CDR由Kabat和Chothia組合系統確定。

在一些實施方式中，抗體包含重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），其中 (1) 該VH包含與SEQ ID NO: 26具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該VL包含與SEQ ID NO: 27具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列；(2) 該VH包含與SEQ ID NO: 7具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該VL包含與SEQ ID NO: 8具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列；(3) 該VH包含與SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該VL包含與SEQ ID NO: 18具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列；或 (4) 該VH包含與SEQ ID NO: 31具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該VL包含與SEQ ID NO: 32具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方式中，VH包含藉由在其中插入、缺失和/或取代一個或多個胺基酸形成的SEQ ID NO: 26、7、17和31中任一個所示的胺基酸序列的功能變體，條件係包含含有功能變體的VH的抗體保留與CEACAM5和CEACAM6都結合的能力。在一些實施方式中，VL包含藉由在其中插入、缺失和/或取代一個或多個胺基酸形成的SEQ ID NO: 27、8、18和32中任一個所示的胺基酸序列的功能變體，條件係包含含有功能變體的VL的抗體保留與CEACAM5和CEACAM6都結合的能力。

功能變體包含或由與親本多肽的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.1%、至少99.2%、至少99.3%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%或至少99.9%序列同一性的胺基酸序列組成。

在功能變體的上下文中，插入、缺失和/或取代的胺基酸的數量較佳的是不超過親本胺基酸序列中胺基酸總數的40%，更較佳的是不超過35%，更較佳的是1%-33%，更較佳的是5%-30%，更較佳的是10%-25%，更較佳的是15%-20%。例如，插入、缺失和/或取代的胺基酸的數量可以是1-20個，較佳的是1-10個，更較佳的是1-7個，仍更較佳的是1-5個，最較佳的是1-2個。在較佳的實施方式中，插入、缺失和/或取代的胺基酸的數量為1、2、3、4、5、6或7個。

在一些實施方式中，插入、缺失和/或取代可以在框架（FR）區進行，例如，FR1、FR2、FR3和/或FR4。

在一些實施方式中，一個或多個胺基酸的取代可以是一個或多個胺基酸的保守取代。這種保守取代較佳的是以下組 (a)-(e) 中的一個胺基酸被同一組內的另一個胺基酸殘基取代的取代：(a) 小的脂肪族、非極性或微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b) 帶負電荷的極性殘基及其（不帶電的）醯胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c) 帶正電荷的極性殘基：His、Arg和Lys；(d) 大的脂肪族非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和 (e) 芳香族殘基：Phe、Tyr和Trp。

在一些實施方式中，抗體包含重鏈可變區（HC）和輕鏈可變區（LC），其中 (1) 該HC包含與SEQ ID NO: 28具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該LC包含與SEQ ID NO: 29具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列；(2) 該HC包含與SEQ ID NO: 9具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該LC包含與SEQ ID NO: 10具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列；(3) 該HC包含與SEQ ID NO: 19具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該LC包含與SEQ ID NO: 20具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列；或 (4) 該HC包含與SEQ ID NO: 33具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該LC包含與SEQ ID NO: 34具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方式中，重鏈包含藉由在其中插入、缺失和/或取代一個或多個胺基酸形成的SEQ ID NO: 28、9、19和33中任一個所示的胺基酸序列的功能變體，條件係包含含有功能變體的重鏈的抗體保留與CEACAM5和CEACAM6都結合的能力。在一些實施方式中，輕鏈包含藉由在其中插入、缺失和/或取代一個或多個胺基酸形成的SEQ ID NO: 29、10、20和34中任一個所示的胺基酸序列的功能變體，條件係包含含有功能變體的輕鏈的抗體保留與CEACAM5和CEACAM6都結合的能力。

在一些實施方式中，插入、缺失和/或取代的胺基酸的數量較佳的是不超過親本胺基酸序列中胺基酸總數的40%，更較佳的是不超過35%，更較佳的是1%-33%，更較佳的是5%-30%，更較佳的是10%-25%，更較佳的是15%-20%。例如，插入、缺失和/或取代的胺基酸的數量可以是1-50個，較佳的是1-20個，更較佳的是1-10個，仍更較佳的是1-5個。在較佳的實施方式中，插入、缺失和/或取代的胺基酸的數量為1、2、3、4、5、6或7個。

在一些實施方式中，插入、缺失和/或取代可以在框架（FR）區進行，例如，FR1、FR2、FR3和/或FR4；和/或恒定區，例如CL、CH1、CH2和/或CH3。

在一些實施方式中，一個或多個胺基酸的取代可以是一個或多個胺基酸的保守取代。保守取代的實例如上所述。

根據抗體重鏈恒定區的胺基酸序列，免疫球蛋白分子可分為五類（同種型）：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並可進一步分為不同的亞型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等。根據輕鏈的胺基酸序列，抗體的輕鏈可分為λ（lambda）鏈或κ（kappa）鏈。本文公開的抗體可以是上述任何類別或亞型。

在一些實施方式中，抗體可以是選自由IgG、IgA、IgM、IgE和IgD組成之群組的同種型。在一些實施方式中，抗體可以是選自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4組成之群組的亞型。在較佳的實施方式中，抗體係IgG1抗體。

本文公開的抗體可以是完整抗體或其抗原結合片段。抗原結合片段可以是保留與CEACAM5和CEACAM6都結合能力的任何抗體片段。抗原結合片段的實例包括但不限於Fab片段；F(ab')2片段；Fab'片段；Fd片段；Fd’片段；Fv片段；scFv片段；dAb片段；分離的互補決定區（CDR）；奈米抗體；包含一對串聯Fd片段（VH-CH1-VH-CH1）的線性抗體，以及上述任何片段的修飾形式，其保留抗原結合活性。

在一些實施方式中，抗原結合片段可以選自由Fab、Fab’、F(ab') ₂、Fv、scFv和ds-scFv組成之群組。在較佳的實施方式中，抗原結合片段為Fab或scFv。

在一些實施方式中，抗體包含Fc區。在一些實施方式中，Fc區可以是任何同種型，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，並且可以包含一個或多個突變或修飾。在一個實施方式中，Fc區係IgG1同種型或由其衍生，視需要具有一個或多個突變或修飾。在一個實施方式中，Fc區係人IgG1 Fc。

在一個實施方式中，Fc區係效應物功能缺陷的。例如，Fc區可以是IgG1同種型，或非IgG1類型，例如IgG2、IgG3或IgG4，其突變使得介導效應物功能（如ADCC）的能力已經降低或甚至消除。例如，在Dall'Acqua WF等人, J Immunol.[免疫學雜誌] 177(2):1129-1138 (2006)和Hezareh M, J Virol.[病毒學雜誌]; 75(24):12161-12168 (2001)中描述了該等突變。在一些實施方式中，抗體的Fc區包含具有L234A、L235A和G237A突變的野生型IgG1 Fc。

在一些實施方式中，抗體在一個或多個翻譯後修飾位點發生突變。在一個實施方式中，Fc區包含去除Asn連接的糖基化的受體位點的突變或被操縱以消除抗體的效應物功能。

翻譯後修飾（PTM）在哺乳動物細胞中表現的蛋白質中廣泛觀察到。除了抗體中保守的PTM位點，例如IgG1抗體CH2結構域上的保守N-糖基化位點外，抗體的抗原結合位點（即CDR區）內發生的其他PTM位點可能降低抗原結合活性或降低化學穩定性。例如，脫醯胺或異構化可能使分子不穩定和異質。為了減少序列責任，可以藉由突變去除PTM模體。VH或VL序列藉由PTM模體的存在進行掃描，例如異構化模體（例如DG）。然後，將「熱點」殘基（例如，DG模體中的D或G）突變為種系序列中的對應殘基或具有相似生物物理特性的其他殘基。

在一些實施方式中，抗體係單株抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。在一些實施方式中，抗體係單價、二價或多價的。 雙特異性抗體

在第二方面，本申請提供了雙特異性或多特異性抗體。在一些實施方式中，抗體係雙特異性抗體，其進一步包含與第二抗原結合的第二抗原結合區。在一些實施方式中，第二抗原可以是腫瘤相關抗原、免疫檢查點分子或免疫細胞抗原。

本領域已經鑒定出許多與特定癌症相關的腫瘤相關抗原。在一些實施方案中，腫瘤相關抗原係可以潛在地刺激明顯的腫瘤特異性免疫反應的抗原。其中一些抗原由正常細胞編碼，但不一定由正常細胞表現。該等抗原可以被表徵為那些在正常細胞中通常緘默（即不表現）的抗原，那些僅在分化的某些階段表現的抗原，以及那些隨時間表現的抗原，例如胚胎抗原和胎兒抗原。其他癌症抗原由突變細胞基因編碼，例如癌基因（例如活化的ras癌基因）、抑制基因（例如突變p53）和由內部缺失或染色體易位產生的融合蛋白。其他癌症抗原可以由病毒基因編碼，例如那些RNA和DNA腫瘤病毒上攜帶的病毒基因。許多其他腫瘤相關抗原和針對它們的抗體係已知的和/或可商購的，並且也可以由熟悉該項技術者生產。

腫瘤相關抗原的實例包括但不限於5T4、甲胎蛋白、CA-125、間皮素、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD40、CD56、CD79、CD78、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、IgM、C型凝集素樣分子1（CLL-1）、EGFR、EGFRvIII、上皮腫瘤抗原、ERBB2、FLT3、葉酸結合蛋白、GD2、GD3、HIV-1包膜糖蛋白gp41、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、黑色素瘤相關抗原、CD200R1、MUC-1、突變的p53、突變的ras、ROR1、VEGFR2及其組合。

在一些實施方式中，第二抗原係T細胞抗原。在一些實施方式中，T細胞抗原可以選自由T細胞受體（TCR）、CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD28、CD44、CD62L、CD69、ICOS、41-BB（CD137）和NKG2D或其任何組合組成之群組。8、CD44、CD62L、CD69、ICOS、41-BB（CD137）和NKG2D或其任何組合。

在一些實施方式中，第二抗原係免疫檢查點分子。在一些實施方式中，免疫檢查點分子可以選自由PD-1、PD-L1、CTLA-4等組成之群組。

在一些實施方式中，雙特異性抗體包含單條多肽鏈或多條（例如兩條或四條）多肽鏈，其包含第一抗原結合區和第二抗原結合區，以及視需要Fc區。

Fc區可以是任何同種型，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，並且可以包含一個或多個突變或修飾。在一個實施方式中，Fc區係IgG1同種型或由其衍生，視需要具有一個或多個突變或修飾。在一個實施方式中，Fc區係人IgG1 Fc。

在一個實施方式中，Fc區係效應物功能缺陷的。例如，Fc區可以是IgG1同種型，或非IgG1類型，例如IgG2、IgG3或IgG4，其突變使得介導效應物功能（如ADCC）的能力已經降低或甚至消除。例如，在Dall'Acqua WF等人, J Immunol.[免疫學雜誌] 177(2):1129-1138 (2006)和Hezareh M, J Virol.[病毒學雜誌]; 75(24):12161-12168 (2001)中描述了該等突變。

在一個實施方式中，Fc區包含去除Asn連接的糖基化的受體位點的突變或以其他方式被操縱以改變糖基化特性。例如，在IgG1 Fc區中，N297Q突變可用於去除Asn連接的糖基化位點。因此，在特別實施方式中，Fc區包含具有N297Q突變的IgG1野生型序列。例如，在IgG1 Fc區中，N297Q突變可用於去除Asn連接的糖基化位點。因此，在特別實施方式中，Fc區包含具有N297Q突變的IgG1野生型序列。

在進一步的實施方式中，Fc區被糖工程化以減少岩藻糖，從而增強ADCC，例如，藉由在抗體生產過程中向培養基中添加化合物，如US2009317869所述或van Berkel等人 (2010) Biotechnol. Bioeng[生物技術與生物工程]. 105:350中所述或藉由使用FUT8敲除細胞，例如，如Yamane-Ohnuki等人 (2004) Biotechnol. Bioeng[生物技術與生物工程] 87:614中所述。可替代地，ADCC可以使用Umaña等人 (1999) Nature Biotech[自然生物技術] 17:176中所述之方法進行優化。在進一步的實施方式中，Fc區已被工程化以增強補體活化，例如，Natsume等人 (2009) Cancer Sci.[癌症科學] 100:2411中所述。核酸

在第三方面，本發明提供了核酸，該核酸包含編碼本文公開的抗CEACAM5/6雙結合抗體或其抗原結合片段或本文公開的雙特異性抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。

術語「多核苷酸」或「核酸」包括單股和雙股核苷酸聚合物。包含核酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型的核苷酸的修飾形式。所述修飾包括鹼基修飾，例如溴尿苷和肌苷衍生物，核糖修飾，例如2',3'-二去氧核糖，以及核苷酸間連接修飾，例如硫代磷酸、二硫代磷酸、硒代磷酸、二硒代磷酸、硫代縮苯胺磷酸、縮苯胺磷酸和胺基磷酸。

例如，本發明提供了編碼本文公開的任一種重鏈可變區序列的核酸分子。本發明還提供了與編碼本文公開的任一種重鏈可變區序列的核酸至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的核酸分子。

例如，本發明提供了編碼本文公開的任一種輕鏈可變區序列的核酸分子。本發明還提供了與編碼本文公開的任一種輕鏈可變區序列的核酸至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的核酸分子。

例如，本發明提供了核酸分子，該核酸分子編碼：（i）本文公開的任一種重鏈可變區序列和（ii）本文公開的任一種輕鏈可變區序列。本發明還提供了與編碼：（i）本文公開的任一種重鏈可變區序列和（ii）本文公開的任一種輕鏈可變區序列的核酸至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的核酸分子。

例如，本發明提供了編碼重鏈可變區序列的核酸分子，該重鏈可變區序列包含本文公開的任一種重鏈可變區序列的CDR序列。

在一些實施方式中，本發明提供了編碼重鏈可變區序列的核酸分子，該重鏈可變區序列包含本文公開的三個CDR序列的組中的任一個。

本發明還提供了編碼重鏈可變區序列的核酸分子，該重鏈可變區序列包含與本文公開的任一種重鏈可變區序列的CDR序列至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR序列。

在一些實施方式中，本發明提供了編碼重鏈可變區序列的核酸分子，該重鏈可變區序列包含分別與本文公開的三個CDR序列的組中的任一個的CDR1、CDR2和CDR3至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列。

例如，本發明提供了編碼輕鏈可變區序列的核酸分子，該輕鏈可變區序列包含本文公開的任一種輕鏈可變區序列的CDR序列。

在一些實施方式中，本發明提供了編碼輕鏈可變區序列的核酸分子，該輕鏈可變區序列包含本文公開的三個CDR序列的組中的任一個。

本發明還提供了編碼輕鏈可變區序列的核酸分子，該輕鏈可變區序列包含與本文公開的任一種輕鏈可變區序列的CDR序列至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR序列。

在一些實施方式中，本發明提供了編碼輕鏈可變區序列的核酸分子，該輕鏈可變區序列包含分別與本文公開的三個CDR序列的組中的任一個的CDR1、CDR2和CDR3至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列。

例如，本發明提供核酸分子，該核酸分子編碼：（i）重鏈可變區序列，其包含本文公開的任一種重鏈可變區序列的CDR序列，以及（ii）輕鏈可變區序列，其包含本文公開的任一種輕鏈可變區序列的CDR序列。在一些實施方式中，本發明提供核酸分子，該核酸分子編碼（i）重鏈可變區序列，其包含本文公開的三個CDR序列的組中的任一個，以及（ii）輕鏈可變區序列，其包含本文公開的三個CDR序列的組中的任一個。本發明還提供核酸分子，該核酸分子編碼：（i）重鏈可變區序列，其包含與本文公開的任一種重鏈可變區序列的CDR序列至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR序列，以及（ii）輕鏈可變區序列，其包含與本文公開的任一種輕鏈可變區序列的CDR序列至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR序列。在一些實施方式中，本發明提供核酸分子，該核酸分子編碼（i）重鏈可變區序列，其包含分別與本文公開的三個CDR序列的組中的任一個的CDR1、CDR2和CDR3至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及（ii）輕鏈可變區序列，其包含分別與本文公開的三個CDR序列的組中的任一個的CDR1、CDR2和CDR3至少90%、至少95%、至少98%或至少99%相同的CDR1、CDR2和CDR3序列。

在一些實施方式中，核酸係核糖核酸（RNA）或去氧核糖核酸（DNA）。在一些實施方式中，本發明提供了核糖核酸（RNA），該核糖核酸包含編碼本文公開的抗CEACAM5/6雙結合抗體或其抗原結合片段或本文公開的雙特異性抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。在一些實施方式中，本發明提供了去氧核糖核酸（DNA），該去氧核糖核酸包含編碼本文公開的抗CEACAM5/6雙結合抗體或其抗原結合片段或本文公開的雙特異性抗體或其抗原結合片段的去氧核苷酸序列。

在一些實施方式中，去氧核糖核酸（DNA）可以在體內被引入人體的細胞中。在一些實施方式中，本發明之去氧核糖核酸（DNA）包含在載體或遞送劑中。在一些實施方式中，本發明之去氧核糖核酸（DNA）被整合到細胞的基因組中。

在一些實施方式中，核糖核酸（RNA）可以在體內被引入人體的細胞中。在一些實施方式中，本發明之核糖核酸（RNA）包含在載體或遞送劑中。

在一些特別實施方式中，包含編碼本文公開的抗CEACAM5/6雙結合抗體或其抗原結合片段或本文公開的雙特異性抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列的核糖核酸（RNA）為mRNA。在一些實施方式中，本發明之mRNA包含在載體或遞送系統（例如脂質體）中。在一些實施方式中，mRNA可以藉由載體或遞送系統（例如脂質體）在體內引入人體的細胞中，並在體內表現本發明之CEACAM5抗體。載體

在第四方面，本發明進一步提供了載體，該載體包含核酸，該核酸包含編碼本文公開的抗CEACAM5/6雙結合抗體或其抗原結合片段或本文公開的雙特異性抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。

在一些實施方式中，載體係能夠表現包含抗CEACAM5/6雙結合抗體的重鏈或輕鏈可變區的多肽的重組表現載體。例如，本發明提供了包含上述任何核酸分子的重組表現載體。

任何載體都可能適用於本公開。在一些實施方式中，載體係病毒載體。在一些實施方式中，載體為逆轉錄病毒載體、DNA載體、鼠白血病病毒載體、SFG載體、質體、RNA載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、EB（Epstein Barr）病毒載體、乳多空病毒載體、痘苗病毒載體、單純皰疹病毒載體、腺病毒相關載體（AAV）、慢病毒載體或其任何組合。合適的示例性載體包括例如pGAR、pBABE-puro、pBABE-neo largeTcDNA、pBABE-hygro-hTERT、pMKO.1 GFP、MSCV-IRES-GFP、pMSCV PIG（Puro IRES GFP空質體）、pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE、MSCV IRES螢光素酶、pMIG、MDH1-PGK-GFP_2.0、TtRMPVIR、pMSCV-IRES-mCherry FP、pRetroX GFP T2A Cre、pRXTN、pLncEXP和pLXIN-Luc。

重組表現載體可以是任何合適的重組表現載體。合適的載體包含那些設計用於繁殖和擴增或用於表現或兩者兼而有之的載體，例如質體和病毒。例如，載體可以選自pUC系列（Fermentas Life Sciences, 馬里蘭州葛籣伯尼（Glen Burnie, Md.））、pBluescript系列（Stratagene, 加利福尼亞州拉荷亞（LaJolla, Calif.））、pET系列（Novagen, 威斯康辛州麥迪森（Madison, Wis.））、pGEX系列（Pharmacia Biotech, 瑞典烏普薩拉（Uppsala, Sweden））和pEX系列（Clontech, 加利福尼亞州帕羅奧圖（Palo Alto, Calif.））。也可以使用噬菌體載體，例如λGT10、λGT11、λZapII（Stratagene）、λEMBL4和λNM1149。在本公開的上下文中有用的植物表現載體的實例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19（Clontech）。在本公開的上下文中有用的動物表現載體的實例包括pcDNA、pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo（Clontech）。

重組表現載體可以使用以下中所述之標準重組DNA技術製備：例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊] 第3版, 冷泉港出版社, 冷泉港, 紐約 2001；和Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學現代方法], Greene Publishing Associates和John Wiley & Sons, 紐約, 1994。可以製備圓形或線性表現載體的構建體，以包含在原核或真核宿主細胞中起作用的複製系統。複製系統可以衍生自例如ColEl、2μ質體、λ、SV40、牛乳頭瘤病毒等。

可以將本發明之載體引入細胞中。在一些實施方式中，可以將本發明之載體引入體外或離體細胞中。視需要，隨後可以將引入載體的細胞施用到受試者體內。在一些實施方式中，可以將本發明之載體引入體內細胞中。

例如，載體可以是腺病毒載體，其包含編碼本文公開的抗CEACAM5/6雙結合抗體或其抗原結合片段或本文公開的雙特異性抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。可以將載體施用到受試者體內，然後在體內進入受試者的細胞，從而編碼本文公開的抗CEACAM5/6雙結合抗體或其抗原結合片段或本文公開的雙特異性抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列整合到細胞的基因組中，隨後該細胞表現本文公開的抗CEACAM5/6雙結合抗體或其抗原結合片段。 宿主細胞

在第五方面，本發明進一步提供了包含本文公開的核酸或本文公開的載體的宿主細胞。

任何細胞都可以用作本公開的核酸或載體的宿主細胞。在一些實施方式中，細胞可以是原核細胞、真菌細胞、酵母細胞或高等真核細胞，例如哺乳動物細胞。合適的原核細胞包括但不限於真細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，例如埃希氏菌屬，例如大腸桿菌；腸桿菌屬；歐文氏菌屬；克雷伯菌屬；變形桿菌；沙門氏菌，例如鼠傷寒沙門氏菌；沙雷氏菌，例如黏質沙雷氏菌和志賀氏菌；芽孢桿菌例如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌；假單胞菌屬，例如銅綠假單胞菌；和鏈黴菌。在一些實施方式中，細胞係人細胞。在一些實施方式中，細胞係免疫細胞。在一些實施方式中，宿主細胞包括例如CHO細胞，例如CHOS細胞和CHOK1細胞，或HEK293細胞，例如HEK293A、HEK293T和HEK293FS。

本發明之宿主細胞藉由在體外或離體引入本文公開的載體或本文公開的核酸來製備。可以將本發明的宿主細胞施用到受試者體內，並且宿主細胞在體內表現本文公開的抗CEACAM5/6雙結合抗體或其抗原結合片段，從而治療本文公開的疾病。

本發明進一步提供了宿主細胞，其中已引入上述任何載體。本發明進一步提供了藉由在允許產生抗體或抗體片段的條件下培養宿主細胞，並回收由此產生的抗體和抗體片段來產生本發明之抗體和抗體片段之方法。 軛合物和抗體 - 藥物軛合物

本發明之抗體或抗原結合片段可以連接到化學部分以形成軛合物。

在本公開的上下文中，「軛合物」係與化學部分共價連接的抗體或抗體片段（例如抗原結合片段）。化學部分可以是，例如，藥物、毒素、治療劑、可檢測標記、蛋白質、核酸、脂質、奈米顆粒、碳水化合物或重組病毒。抗體軛合物通常被稱為「免疫軛合物」。當軛合物包含與藥物（例如細胞毒性劑）連接的抗體時，該軛合物通常被稱為「抗體-藥物軛合物」或「ADC」。

術語「軛合的」或「連接的」可以指將兩個多肽製成一個連續的多肽分子。在一個實施方式中，將抗體連接到化學部分。在另一個實施方式中，連接到化學部分的抗體進一步與脂質或其他分子連接到蛋白質或肽，以增加其在體內的半衰期。這種連接可以藉由化學或重組方式進行。在一個實施方式中，連接係化學的，其中抗體部分和化學部分之間的反應產生了在兩個分子之間形成的共價鍵以形成一個分子。肽連接子（短肽序列）可以視需要包括在抗體和化學部分之間。

化學部分可以使用熟悉該項技術者已知的任意數量的手段連接到本發明之抗體。可以使用共價和非共價連接手段。將化學部分連接到抗體的程序根據化學部分的化學結構而變化。多肽通常含有多種官能基；例如羧酸（COOH）、游離胺（-NH2）或巰基（-SH）基團，它們可用於與抗體上合適的官能基反應以導致化學部分的結合。可替代地，將抗體衍生化以暴露或連接另外的反應性官能基。衍生化可能涉及連接許多已知連接子分子中的任一種。連接子可以是用於將抗體連接到化學部分的任何分子。連接子能夠與抗體和化學部分形成共價鍵。合適的連接子係熟悉該項技術者所熟知的，並包括但不限於直鏈或支鏈碳連接子、雜環碳連接子或肽連接子。當抗體和化學部分係多肽時，連接子可以藉由它們的側基（例如藉由二硫鍵與半胱胺酸連接）連接到組成胺基酸或連接到末端胺基酸的α-碳胺基和羧基。

在某些情況下，當免疫軛合物到達其靶位點時，希望從抗體中釋放化學部分。因此，在該等情況下，免疫軛合物將包含可在靶位點附近切割的連接。

連接子的切割以從抗體中釋放化學部分可能藉由酶活性或免疫軛合物在靶細胞內或靶位點附近所經受的條件促進。

鑒於已經報導了用於將多種放射診斷化合物、放射治療化合物、標記（如酶或螢光分子）、藥物、毒素和其他試劑連接到抗體的多種方法，熟悉該項技術者將能夠確定將給定試劑連接到抗體或其他多肽的合適方法。

本文公開的抗體可以衍生化或與另一種分子（例如另一種肽或蛋白質）連接。通常，抗體或其部分被衍生化，使得與靶抗原的結合不會受到衍生化或標記的不利影響。例如，抗體可以在功能上（藉由化學偶聯、基因融合、非共價締合或其他方式）與一個或多個其他分子實體連接，例如另一種抗體（例如，雙特異性抗體或雙抗體）、檢測試劑、藥物試劑和/或可以介導抗體或抗體部分與另一種分子（例如鏈黴親和素核心區或多聚組胺酸標籤）締合的蛋白質或肽。

一種類型的衍生化抗體係藉由使兩種或多種抗體（相同類型或不同類型）交聯產生的。合適的交聯劑包括那些具有被合適的間隔物分開的兩個明顯反應性基團的異雙官能（例如間馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯）或同雙官能（例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯）的交聯劑。這種連接子係可商購的。

在本文公開的軛合物的一些實施方式中，化學部分選自由治療劑、可檢測部分和免疫刺激分子組成之群組。

在一些實施方式中，治療劑包括但不限於免疫調節劑、放射性化合物、酶（例如穿孔素）、化療劑（例如順鉑）或毒素。在一些實施方式中，治療劑可以是例如美登素、格爾德黴素、微管蛋白抑制劑例如微管蛋白結合劑（例如，奧瑞斯他汀）、或小溝結合劑例如卡奇黴素。

其他合適的治療劑包括例如小分子細胞毒性劑，即具有殺死哺乳動物細胞的能力的分子量小於700道耳頓的化合物。該等化合物還可能含有能夠具有細胞毒性作用的有毒金屬。此外，應當理解，該等小分子細胞毒性劑還包括前驅藥，即在生理條件下衰變或轉化以釋放細胞毒性劑的化合物。這樣的藥物的實例包括順鉑、美登素衍生物、拉奇黴素、卡奇黴素、多西他賽、依託泊苷、吉西他濱、異環磷醯胺、伊立替康、美法侖、米托蒽醌、卟吩姆鈉光敏素II、替莫唑胺、拓撲替康、葡萄糖醛酸曲美沙特、澳瑞斯他汀E長春新鹼和阿黴素；肽細胞毒素，即具有殺死哺乳動物細胞能力的蛋白質或其片段，例如蓖麻毒素、白喉毒素、假單胞菌細菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，即隨著一個或多個a或β粒子或γ射線的同時發射而衰變的元素的不穩定同位素，例如碘-131、錸-186、銦-111、釔-90、鉍-210、鉍-213、錒-225和砹-213；螯合劑可用於促進該等放射性核素與分子或其多聚體的締合。

在一些實施方式中，可檢測部分可以選自由生物素、鏈黴親和素、酶或其催化活性片段、放射性核素、奈米顆粒、順磁性金屬離子或螢光、磷光或化學發光分子組成之群組。用於診斷目的的可檢測部分包括例如螢光標記、放射性標記、酶、核酸探針和對比試劑等。

抗體可以與可檢測的標誌物軛合；例如，能夠藉由ELISA、分光光度法、流動式細胞分析術、顯微鏡或診斷成像技術（例如電腦體層攝影（CT）、電腦軸向體層攝影（CAT）掃描、磁共振成像（MRI）、核磁共振成像（NMRI）、磁共振體層攝影（MTR）、超音波、光纖檢查和腹腔鏡檢查）檢測的可檢測的標誌物。可檢測的標誌物的特別非限制性實例包括螢光團、化學發光劑、酶鍵、放射性同位素和重金屬或化合物（例如用於藉由MRI檢測的超順磁性氧化鐵奈米晶體）。例如，有用的可檢測的標誌物包括螢光化合物，包括螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明（rhodamine）、5-二甲基胺-l-萘磺醯氯、藻紅蛋白、鑭系磷光體等。生物發光標誌物也是有用的，例如螢光素酶、綠色螢光蛋白（GFP）和黃色螢光蛋白（YFP）。

抗體或抗原結合片段還可以與可用於檢測的酶軛合，例如辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。當雙特異性抗體或抗原結合片段與可檢測的酶軛合時，可以藉由添加酶用於產生可識別的反應產物的其他試劑來檢測。例如，當存在辣根過氧化物酶試劑時，過氧化氫和二胺基聯苯胺的加入導致有色反應產物，其係可目測的。雙特異性抗體或抗原結合片段也可以與生物素軛合，並藉由親和素或鏈黴親和素結合的間接測量進行檢測。應當注意，親和素本身可以與酶或螢光標記軛合。

抗體可以融合到自標記蛋白質標籤（例如HaloTag）。例如，蛋白質標籤可以在恒定區的末端選殖。HaloTag係一種源自細菌酶（鹵代烷烴脫鹵酶）的自標記蛋白質標籤，被設計以與合成配體共價結合。在一些情況下，合成配體包含連接到螢光團（例如近紅外螢光團）的氯烷烴連接子（Los等人 (2008) ACS Chem Biol[ACS化學生物學]. 3(6):373-82）。

抗體可以用磁性試劑（例如釓）標記。抗體也可以用鑭系元素（例如銪和鏑）和錳標記。

順磁性顆粒（例如超順磁性氧化鐵）也可用作標籤。雙特異性抗體也可以用二級報告子（例如白胺酸拉鍊對序列、二抗結合位點、金屬結合結構域、表位標籤）識別的預定多肽表位進行標記。在一些實施方式中，標籤藉由各種長度的間隔臂連接，以減少潛在的空間位阻。

抗體也可以用放射性標記的胺基酸標記。放射性標記可用於診斷和治療目的。例如，放射性標記可用於藉由x射線、發射光譜或其他診斷技術檢測靶抗原的表現。多肽標記的實例包括但不限於以下放射性同位素或放射性核苷酸： ³H、 ¹⁴C、 ¹⁵N、 ³⁵S、 ⁹⁰Y、 ⁹⁹Tc、 ¹¹¹In、 ¹²⁵I、 ¹³¹I。

在一些實施方式中，免疫刺激分子係刺激免疫反應的免疫效應分子。例如，免疫刺激分子可以是細胞介素如IL-2和IFN-γ、趨化因子如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生長刺激蛋白、補體活化物；病毒/細菌蛋白結構域或病毒/細菌肽。

在一些實施方式中，本發明之抗體或抗原結合片段連接到螢光標記、放射性標記或藥物部分。在一些實施方式中，本發明之抗體或抗原結合片段連接到藥物部分以形成抗體-藥物軛合物（ADC）。

因此，在第六方面，本發明提供了抗體-藥物軛合物（ADC），其中該ADC包含本發明第一方面的抗體或其抗原結合片段或本發明第二方面的雙特異性抗體，以及藉由連接子與其軛合的藥物部分。

本文可互換使用的術語「藥物部分」、「藥物有效載荷」、「治療分子」、「治療有效載荷」、「治療劑」、「治療部分」係指與結合CEACAM5和CEACAM6的雙結合抗體或其抗原結合片段軛合的化學或生物部分。

下文提供了可用於ADC的藥物的實例，即可與抗體軛合的藥物，並包括抗生素、DNA合成抑制劑、RNA聚合酶II抑制劑和RNA剪接體抑制劑、微管抑制劑、抗腫瘤抗生素、免疫調節劑、基因治療載體、烷基化劑、抗血管生成劑、抗代謝物、含硼藥劑、化學保護劑、激素藥劑、糖皮質激素、光活性治療劑、寡核苷酸、放射性同位素、放射增敏劑、拓撲異構酶抑制劑（例如拓撲異構酶I抑制劑）、酪胺酸激酶抑制劑及其組合。

在一些實施方式中，藥物部分係微管抑制劑。在一些特別實施方式中，藥物部分係奧瑞斯他汀。在一些特別實施方式中，藥物部分係美登素。在一些特別實施方式中，藥物部分係微管溶素。在一些特別實施方式中，藥物部分係大環內酯。在一些特別實施方式中，藥物部分係根瘤菌素。

在一些實施方式中，藥物部分係抗生素。在一些特別實施方式中，藥物部分係卡奇黴素。在一些特別實施方式中，藥物部分係阿黴素。在一些特別實施方式中，藥物部分係蒽環類。

在一些實施方式中，藥物部分係DNA合成抑制劑。在一些特別實施方式中，藥物部分係倍癌黴素。在一些特別實施方式中，藥物部分係PBD（吡咯并苯并二氮呯）。在一些特別實施方式中，藥物部分係IGN（吲哚啉並苯并二氮呯）。

在一些實施方式中，藥物部分係拓撲異構酶抑制劑。在一些特別實施方式中，藥物部分係喜樹鹼類似物。

在一些實施方式中，藥物部分係RNA聚合酶II抑制劑。在一些特別實施方式中，藥物部分係瓢菌素。

在一些實施方式中，藥物部分係選自由司普利斯斯他汀和泰蘭斯斯他汀組成之群組的RNA剪接體抑制劑。

在一些實施方式中，美登素類化合物（DM1、DM2、DM3、DM4、美登素和安絲菌素）及其類似物係較佳的。

在一些實施方式中，奧瑞斯斯他汀（MMAE、MMAF、MMAD和安絲菌素）及其類似物係較佳的。

在一些實施方式中，PBD（吡咯并苯并二氮呯，或吡咯并[2,l-c][l,4]-苯并二氮呯，例如SG3199）係較佳的。PBD係一種序列選擇性DNA烷基化抗生素，具有顯著的抗腫瘤特性。PBD具有識別並結合DNA中特定序列的能力；一個這樣的序列係PuGPu（嘌呤-鳥嘌呤-嘌呤）。PBD也可以與PuGPy（嘌呤-鳥嘌呤-嘧啶）或PyGPu序列結合，而不是與PyGPy序列結合。

在一些實施方式中，PBD藥物部分係SG3199，其係一種細胞毒性DNA小溝股間交聯吡咯并苯并二氮呯（PBD）二聚體。

在一些實施方式中，喜樹鹼類似物係較佳的。喜樹鹼類似物係一種DNA拓撲異構酶I抑制劑。與單甲基奧瑞斯他汀E不同，基於喜樹鹼的療法在臨床上不會引起周圍神經病變，這表明SGN-CD30C可能具有避免與BV相關的最常見的不良事件之一的潛力。

在一些特別實施方式中，喜樹鹼藥物部分係7-乙基-10-羥基喜樹鹼（也稱為SN38）。

在一些特別實施方式中，喜樹鹼藥物部分係Dxd，一種有效的拓撲異構酶I抑制劑，或其類似物或衍生物。

在一些特別實施方式中，喜樹鹼藥物部分係依喜替康（也稱為DX-8951）。

在一些實施方式中，卡奇黴素係較佳的，其係一種抗腫瘤抗生素和引起雙股DNA斷裂的細胞毒性劑。N-乙醯基卡奇黴素係卡奇黴素的衍生物，並係一種有效的烯二炔類抗腫瘤抗生素。在其他實施方式中，藥物部分係阿黴素或其類似物或衍生物。

一個或多個藥物部分（例如，治療劑和/或診斷劑）可以間接軛合到抗CEACAM5/6雙結合抗體（例如，藉由具有直接共價或非共價相互作用的連接子）。連接子可以是化學連接劑，例如可從許多商業來源獲得的同雙官能和異雙官能交聯劑。

在化合物或抗體保持活性的條件下，連接子容易發生切割（可切割連接子），例如酸誘導的切割、光誘導的切割、肽酶誘導的切割、酯酶誘導的切割和二硫鍵切割。可替代地，連接子可以基本上抵抗切割（例如，穩定連接子或不可切割連接子）。

在一些實施方式中，連接子係酸不穩定連接子。在一些實施方式中，連接子係光不穩定連接子。在一些實施方式中，連接子係蛋白酶敏感連接子。在一些實施方式中，連接子係腙連接子。在一些實施方式中，連接子係酯酶可切割連接子。在一些實施方式中，連接子係二甲基連接子。在一些實施方式中，連接子係含二硫化物連接子。在一些實施方式中，連接子係親水性連接子。在一些實施方式中，連接子係預充電連接子。在一些實施方式中，連接子係基於酸的連接子。

在一些實施方式中，連接子包含酸不穩定連接子。在一些實施方式中，連接子包含親水性連接子。在一些實施方式中，連接子包含蛋白酶敏感連接子。在一些實施方式中，連接子包含光不穩定連接子。在一些實施方式中，連接子包含腙連接子。在一些實施方式中，連接子包含二甲基連接子。在一些實施方式中，連接子包含含二硫化物連接子。

在一些實施方式中，連接子可包含胺基酸單元。在一個這樣的實施方式中，胺基酸單元允許蛋白酶切割連接子，從而在暴露於細胞內蛋白酶如溶酶體酶時促進藥物從抗體藥物軛合物中釋放。示例性胺基酸單位包括但不限於二肽、三肽、四肽和五肽。示例性二肽包括：纈胺酸-瓜胺酸（vc或val-cit）、丙胺酸-苯丙胺酸（af或ala-phe）；苯丙胺酸-離胺酸（fk或phe-lys）：或N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸（Me-valcit）。示例性三肽包括：甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸（gly-val-cit）和甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸（gly-gly-gly）。在一些實施方式中，包含vc（纈胺酸-瓜胺酸）單元的連接子係較佳的。胺基酸單元可以被設計並優化其對特定酶（例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C和D或纖溶酶蛋白酶）酶切的選擇性。

在一方面，本公開中使用的連接子衍生自交聯試劑，例如MC（6-馬來醯亞胺基己醯基）、Val-Cit（纈胺酸-瓜胺酸）、PABC（對胺基苄氧羰基）、DMEA（二甲基乙胺）、Val-Cit-PABC、MC-Val-Cit-PABC、MC-Val-Cit-PABC-DMEA、CL2A、Mal-PEG8-Val-Ala-PABC、GGFG（甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸）、MC-GGFG-胺甲基、AcBut（4-(4-乙醯苯氧基)-丁酸）、二甲基肼（3-甲基-3-巰基丁烷肼）、AcBut-二甲基肼、SPDP（N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯）、SPP（4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀醯亞胺基酯）、SPDB（4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯）、磺基-SPDB（N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯）、SIA（N-琥珀醯亞胺基碘乙酸酯）、SIAB（(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺基酯）、馬來醯亞胺PEG NHS、SMCC（4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸N-琥珀醯亞胺基酯）、磺基-SMCC（4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸N-磺基琥珀醯亞胺基酯）或17-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四側氧基-4,7,10,13-四氮雜十七烷-1-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯（CX1-1）。

在另一方面，本公開中使用的連接子衍生自交聯試劑，例如磺基-SPDB（N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)-2-磺基-丁酸酯）、mc（6-馬來醯亞胺基己醯基）、Val-Cit（纈胺酸-瓜胺酸）、PABC（對胺基苯甲醇）、Val-Cit-PABC、mc-Val-Cit-PABC、CL2A、mal-PEG8-Val-Ala-PABC、GGFG（甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸）、mc-GGFG-胺甲基、AcBut（4-(4-乙醯苯氧基)-丁酸）、二甲基肼（3-甲基-3-巰基丁烷肼）、AcBut-二甲基肼或SMCC（4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷羧酸N-琥珀醯亞胺基酯）。

在較佳的實施方式中，連接子選自由MC（6-馬來醯亞胺基己醯基）、Val-Cit（纈胺酸-瓜胺酸）、PABC（對胺基苄氧羰基）、DMEA（二甲基乙胺）、Val-Cit-PABC、MC-Val-Cit-PABC、MC-Val-Cit-PABC-DMEA、GGFG（甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸）、MC-GGFG-胺甲基、AcBut（4-(4-乙醯基苯氧基)-丁酸）和AcBut-二甲基肼組成之群組。在一個更較佳的實施方式中，連接子為MC-Val-Cit-PABC。 藥物組成物

在第七方面，本發明提供了藥物組成物，該藥物組成物包含（i）本發明第一方面的抗體或其抗原結合片段，或本發明第二方面的雙特異性抗體，或本發明第三方面的核酸，或本發明第四方面的載體，或本發明第五方面的宿主細胞，或本發明第六方面的ADC；和視需要（ii）藥學上可接受的載劑或賦形劑。

本發明提供了包含本發明抗體的藥物組成物。在一些實施方式中，藥物組成物進一步包含藥學上可接受的載劑。術語「藥學上可接受的載劑」包括任何和所有生理上相容的溶劑、緩衝劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。較佳的是，載劑適用於靜脈、肌內、皮下、胃腸外、脊髓或表皮施用（例如藉由注射或輸注）。例如，在一些實施方式中，用於靜脈施用的組成物通常是無菌等滲水性緩衝液中的溶液。

本發明之抗體或試劑（本文也稱為「活性化合物」）及其衍生物、片段、類似物和同源物可以摻入適合施用的藥物組成物中。這種組成物通常包含抗體或試劑和藥學上可接受的載劑。如本文所用，術語「藥學上可接受的載劑」旨在包括與藥物施用相容的任何和全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。合適的載劑在最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明頓藥物科學]中進行了描述，這係該領域的標準參考文本，其藉由引用併入本文。這種載劑或稀釋劑的較佳的實例包括但不限於水、鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可以使用脂質體和非水性媒介物，例如固定油。使用這種介質和試劑用於藥物活性物質在本領域係眾所周知的。除非任何常規介質或試劑與活性化合物不相容，否則考慮在組成物中使用它們。還可以將補充性活性化合物摻入組成物中。

本發明之藥物組成物被配製成與其預期的施用途徑相容。施用途徑的實例包括胃腸外施用，例如靜脈、皮內、皮下、口服（例如吸入）、透皮（即局部）、經黏膜和直腸施用。用於胃腸外、皮內或皮下應用的溶液或懸浮液可以包括以下組分：無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸（EDTA）；緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用於調節張力的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。pH可以用酸或鹼調節，例如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外製劑可以封裝在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑膠製成的多劑量小瓶中。

適合注射使用的藥物組成物包括無菌水溶液（其中水溶性）或分散液和用於臨時製備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。對於靜脈施用，合適的載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL™（巴斯夫（BASF），新澤西州帕西帕尼）或磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）。在所有情況下，組成物必須是無菌的，並且應該係流動的，以達到易於注射的程度。它必須在製造和儲存條件下保持穩定，並且必須防止微生物如細菌和真菌的污染作用。該載劑可以是含有以下物質的溶劑或分散介質：例如，水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇等），以及其適合的混合物。恰當的流動性可以（例如）藉由使用包衣（如卵磷脂）來維持，在分散體的情況下藉由維持所需的顆粒大小來維持，以及藉由使用表面活性劑來維持。可以藉由多種抗菌劑和抗真菌劑（例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等）來防止微生物的作用。在許多情況下，較佳的是在組成物中包括等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化鈉。可注射組成物的延長吸收可以藉由在組成物中包括延遲吸收的試劑來實現，例如單硬脂酸鋁和明膠。

無菌可注射溶液可以藉由將所需量的活性化合物與上述一種或多種成分的組合（視需要而定）摻入適當的溶劑中，然後進行過濾滅菌來製備。通常，分散液藉由將活性化合物摻入無菌媒介物中來製備，該無菌媒介物含有基礎分散介質和來自以上列舉的那些的其他所需成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，製備方法係真空乾燥和冷凍乾燥，從其先前無菌過濾的溶液中產生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。

口服組成物通常包含惰性稀釋劑或可食用載劑。可以將口服組成物封裝在明膠膠囊中或壓縮成片劑。出於口服治療施用的目的，活性化合物可以與賦形劑一起摻入，並以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。口服組成物也可以使用用作漱口水的液體載劑製備，其中口服流體載劑中的化合物並漱口和咳痰或吞咽。藥學相容的結合劑和/或佐劑材料可以作為組成物的一部分包括在內。片劑、藥丸、膠囊、錠劑等可以含有以下任何成分或類似性質的化合物：黏合劑，例如微晶纖維素、黃茋膠或明膠；賦形劑，例如澱粉或乳糖，崩解劑，例如褐藻酸、Primogel或玉米澱粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，例如膠體二氧化矽；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或調味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或柳橙調味劑。

對於藉由吸入施用，化合物以氣溶膠噴霧的形式從含有合適推進劑（例如，諸如二氧化碳的氣體）的壓力容器或分配器或噴霧器中遞送。

全身施用也可以藉由經黏膜或透皮方式進行。對於經黏膜或透皮施用，在配製物中使用適合於要滲透的屏障的滲透劑。這種滲透劑在本領域中通常是已知的，並且包括，例如用於經黏膜施用的洗滌劑、膽汁酸和夫西地酸衍生物。經黏膜施用可以藉由使用鼻腔噴霧劑或栓劑來完成。對於透皮施用，活性化合物被配製成本領域中通常已知的軟膏、藥膏、凝膠或乳膏。

化合物也可以以栓劑（例如，使用常規栓劑基質，例如可可脂和其他甘油酯）或用於直腸遞送的保留灌腸劑的形式製備。

在一個實施方式中，活性化合物與載劑一起製備，該載劑將保護化合物免於從體內快速消除，例如控釋配製物，包括植入物和微膠囊化遞送系統。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、以及聚乳酸。製備這種配製物之方法對於熟悉該項技術者來說係顯而易見的。材料也可以從阿爾紮公司（Alza Corporation）和Nova Pharmaceuticals, Inc.商購獲得。脂質體懸浮液（包括靶向感染細胞的脂質體，其具有針對病毒抗原的單株抗體）也可以用作藥學上可接受的載劑。該等可以根據熟悉該項技術者已知之方法製備，例如，美國專利案號4,522,811中所述。

以劑量單位形式配製口服或胃腸外組成物係特別有利的，以便於施用和劑量均勻。本文所用的劑量單位形式係指適合作為待治療受試者的單一劑量的物理上離散的單位；每個單位含有預定量的活性化合物，經計算以產生與所需藥物載劑相關的所需治療效果。本發明之劑量單位形式的規格由活性化合物的獨特特徵和要達到的特定治療效果以及在將這種活性化合物複合用於治療個體的領域中固有的限制所決定並直接取決於它們。

藥物組成物可以同施用說明書一起包括在容器、包裝或分配器中。

本發明提供了包含本發明的抗CEACAM5/6雙結合抗體或其抗原結合片段的治療組成物。根據本發明之治療組成物將與合適的載劑、賦形劑和摻入配製物中的其他試劑一起施用，以提供改進的轉移、遞送、耐受性等。在所有藥物化學家知道的處方集中都可以找到許多合適的配製物：Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明頓藥物科學], Mack Publishing Company, 賓夕法尼亞州伊斯頓。該等配製物包括，例如粉末、糊狀物、軟膏、啫喱膏、蠟、油、脂質、含有脂質（陽離子或陰離子）的囊泡（例如LIPOFECTIN™）、DNA軛合物、無水吸收糊狀物、水包油和油包水乳液、乳液carbowax（各種分子量的聚乙二醇）、半固體凝膠和含有carbowax的半固體混合物。另參見Powell等人「Compendium of excipients for parenteral formulations[胃腸外配製物賦形劑綱要]」PDA (1998) J Pharm Sci Technol[藥物科學與技術雜誌] 52:238-311。 生產方法

單株抗體可以使用雜交瘤方法製備，例如Kohler和Milstein, Nature[自然], 256:495 (1975)描述的那些。在雜交瘤方法中，小鼠、倉鼠或其他合適的宿主動物通常用免疫劑進行免疫接種，以引發產生或能夠產生抗體的淋巴細胞，該等抗體將與免疫劑特異性結合。可替代地，淋巴細胞可以在體外免疫接種。

免疫劑通常包括蛋白質抗原、其片段或其融合蛋白。通常，如果需要人源細胞，則使用外周血淋巴細胞，或者如果需要非人哺乳動物來源，則使用脾細胞或淋巴結細胞。然後使用合適的融合劑（例如聚乙二醇）將淋巴細胞與永生細胞系融合，以形成雜交瘤細胞（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice[單株抗體：原理與實踐], 學院出版社, (1986) 第59-103頁）。永生化細胞系通常是轉化的哺乳動物細胞，特別是齧齒動物、牛和人來源的骨髓瘤細胞。通常，採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。雜交瘤細胞可以在合適的培養基中培養，該培養基較佳的是含有一種或多種抑制未融合的永生化細胞的生長或存活的物質。例如，如果親代細胞缺少酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT或HPRT），雜交瘤的培養基典型地包含次黃嘌呤、胺蝶呤和胸苷（HAT培養基），該等物質預防HGPRT缺陷型細胞的生長。

較佳的永生化細胞系係有效融合、支持選擇的產生抗體的細胞穩定高水平表現抗體、並且對培養基（如HAT培養基）敏感的那些。更較佳的永生化細胞系係鼠骨髓瘤系，其例如可以從加利福尼亞州聖地牙哥的索爾克研究所細胞分佈中心（Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.）和維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection, Manassas, Va）獲得。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系也被描述用於生產人單株抗體。（參見Kozbor, J. Immunol.[免疫學雜誌], 133:3001 (1984)；Brodeur等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications[單株抗體生產技術和應用], Marcel Dekker, Inc., 紐約, (1987) 第51-63頁）。

然後可以測定培養雜交瘤細胞的培養基中是否存在針對抗原的單株抗體。較佳的是，由雜交瘤細胞產生的單株抗體的結合特異性藉由免疫沈澱或藉由體外結合測定來確定，例如放射免疫測定（RIA）或酶聯免疫吸附測定（ELISA）。這樣的技術和測定在本領域中是已知的。單株抗體的結合親和力可以例如藉由Munson和Pollard, Anal. Biochem.[分析生物化學雜誌], 107:220 (1980)的斯卡查德分析來確定。此外，在單株抗體的治療應用中，鑒定對靶抗原具有高度特異性和高結合親和力的抗體係重要的。

在鑒定出所需的雜交瘤細胞後，可以藉由限制稀釋程序對殖株進行亞選殖，並藉由標準方法生長。（參見Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice[單株抗體：原理與實踐], 學院出版社, (1986) 第59-103頁）。用於此目的的合適培養基包括例如杜氏改良Eagle培養基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI-1640培養基。可替代地，雜交瘤細胞可以在哺乳動物體內作為腹水生長。

亞殖株分泌的單株抗體可以藉由常規的免疫球蛋白純化程序（例如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法）從培養基或腹水液中分離或純化。

單株抗體也可以藉由重組DNA方法來製備，例如美國專利案號4,816,567中描述的那些。使用常規的程序（例如，藉由使用能夠與編碼鼠類抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針），可以容易地對編碼本發明之單株抗體的DNA進行分離和定序。本發明之雜交瘤細胞用作這種DNA的較佳的來源。一旦被分離，可以將DNA置於表現載體中，然後將該等載體轉染到不另外產生免疫球蛋白的宿主細胞（如猿COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO）細胞或骨髓瘤細胞）中，以便在重組宿主細胞中獲得單株抗體的合成。還可以如下來修飾DNA：例如藉由用人重鏈和輕鏈恒定結構域的編碼序列代替同源鼠序列（參見美國專利案號4,816,567；Morrison, Nature[自然] 368, 812-13 (1994)），或藉由共價結合非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列到免疫球蛋白編碼序列。這種非免疫球蛋白多肽可以取代本發明之抗體的恒定結構域，或者可以取代本發明之抗體的一個抗原結合位點的可變結構域以產生嵌合二價抗體。

完全人抗體係其中輕鏈和重鏈的整個序列（包括CDR）都來自人基因的抗體分子。這樣的抗體在本文中稱為「人源化抗體」、「人抗體」或「全人抗體」。人單株抗體可藉由採用三瘤技術；人B細胞雜交瘤技術（參見Kozbor,等人, 1983 Immunol Today[當代免疫] 4: 72）；以及產生人單株抗體的EBV雜交瘤技術（參見Cole,等人, 1985 於: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY[單株抗體和癌症治療], Alan R. Liss, Inc., 第77-96頁）製備。可以使用人單株抗體，並且可以藉由使用人雜交瘤（參見Cote,等人, 1983.Proc Natl Acad Sci USA[美國國家科學院院刊] 80: 2026-2030）或藉由在體外用EB病毒轉化人B細胞（參見Cole,等人, 1985 於: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY[單株抗體和癌症治療], Alan R. Liss, Inc., 第77-96頁）來產生。

此外，人源化抗體可以在轉基因植物中產生，作為現有哺乳動物系統的廉價產生替代品。例如，轉基因植物可以是煙草植物，即本氏煙草和普通煙草。抗體係從植物葉子中純化的。植物的穩定轉化可以藉由使用根癌農桿菌或粒子轟擊來實現。例如，至少含有重鏈和輕鏈序列的核酸表現載體藉由轉化在細菌培養物（即根癌農桿菌BLA4404）中表現。植物的滲透可以藉由注射來實現。可溶性葉提取物可以藉由在研缽中研磨葉組織並離心來製備。抗體的分離和純化可以容易地藉由熟悉該項技術者已知的許多方法進行。在植物中產生抗體的其他方法在，例如，Fischer等人, Vaccine[疫苗], 2003, 21:820-5；和Ko等人, Current Topics in Microbiology and Immunology[微生物學和免疫學的當前主題], 第332卷, 2009, 第55-78頁中描述。因此，本發明進一步提供包含編碼本發明抗體或產生本發明抗體的載體的任何細胞或植物。

此外，可以在真菌中產生感興趣的（人）抗體。例如，真菌可以是嗜熱毀絲菌（例如，嗜熱毀絲菌菌株C1；Visser等人 (2011) Industrial Biotechnology[工業生物技術] 7(3):214-223）。其他實例包括麯黴屬（例如米麯黴（Huynh等人 (2020) Fungal Biology and Biotechnology[真菌生物學與生物技術] 7:7）、黑麯黴（Ward等人 (2004) Environ. Microbiol[環境微生物學]. 70:2567-76）或泡盛麯黴（Joosten等人 (2003) Microb.Cell Fact[微生物細胞工廠] 2:1））和木黴屬（例如裡氏木黴（Nyyssönen等人 (1993) Biotechnology[生物技術] 11:591-595））。在其他情況下，真菌可以是酵母，例如釀酒酵母、博伊丁假絲酵母、多形漢遜酵母、畢赤嗜甲醇酵母、畢赤酵母、解脂亞羅酵母、乳酸克魯維酵母或甲醇誘導型酵母（Joosten等人 (2003)；Suzuki等人 (2017) J Biosci Bioeng[生物科學與生物工程雜誌].124:156-63）。

此外，還可以使用另外的技術（包括噬菌體展示文庫）產生人抗體。（參見Hoogenboom和Winter, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌], 227:381 (1991)；Marks等人, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌], 222:581 (1991)）。類似地，可以藉由將人免疫球蛋白基因座引入轉基因動物中來製備人抗體，該等轉基因動物例如是已經使內源免疫球蛋白基因部分地或完全地失活的小鼠。在激發後，觀察到人抗體的產生，這在所有方面都緊密地類似於在人中所見，包括基因重排、組裝及抗體庫。例如，在WO 2006/008548、WO 2007/096779、WO 2010/109165、WO 2010/070263、WO 2014/141189和WO 2014/141192中描述了這種方法。

一種用於產生感興趣的抗體（例如人抗體）之方法在美國專利案號5,916,771中公開。該方法包括將含有編碼重鏈的核苷酸序列的表現載體引入培養中的一個哺乳動物宿主細胞中，將含有編碼輕鏈的核苷酸序列的表現載體引入另一個哺乳動物宿主細胞，並將這兩個細胞融合以形成雜交細胞。雜交細胞表現含有重鏈和輕鏈的抗體。

在對該程序的進一步改進中，PCT公開WO 99/53049中公開了一種用於鑒定免疫原上臨床相關表位之方法，以及一種用於選擇以高親和力與相關表位免疫特異性結合的抗體的相關方法。

抗體可以藉由含有編碼上述單鏈抗體的DNA片段的載體表現。

該等可以包括載體、脂質體、裸DNA、佐劑輔助的DNA、基因槍、導管等。載體包括化學軛合物，如WO 93/64701中描述的，其具有靶向部分（例如，細胞表面受體的配體）和核酸結合部分（例如，聚離胺酸）、病毒載體（例如，DNA或RNA病毒載體）、融合蛋白，例如PCT/US 95/02140（WO 95/22618）中描述的，其係含有靶部分（例如，靶細胞特異性抗體）和核酸結合部分（例如魚精蛋白）的融合蛋白、質體、噬菌體等。載體可以是染色體的、非染色體的或合成的。

較佳的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學軛合物。逆轉錄病毒載體包括Moloney鼠白血病病毒。DNA病毒載體係較佳的。該等載體包括痘載體，例如正痘或禽痘載體、皰疹病毒載體，例如單純皰疹I型病毒（HSV）載體（參見Geller, A. I.等人, J. Neurochem[神經化學雜誌], 64:487 (1995)；Lim, F.,等人, 於DNA Cloning: Mammalian Systems[DNA選殖：哺乳動物系統], D. Glover, Ed. (牛津大學出版社, 英國牛津) (1995)；Geller, A. I.等人, Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.[美國國家科學院院刊] 90:7603 (1993)；Geller, A. I.,等人, Proc Natl. Acad. Sci USA[美國國家科學院院刊] 87:1149 (1990)）、腺病毒載體（參見LeGal LaSalle等人, Science[科學], 259:988 (1993)；Davidson,等人, Nat. Genet[自然遺傳] 3:219 (1993)；Yang,等人, J. Virol[病毒學雜誌]. 69:2004 (1995)）和腺相關病毒載體（參見Kaplitt, M. G.等人, Nat. Genet[自然遺傳].8:148 (1994)）。

痘病毒載體將基因引入細胞質。禽痘病毒載體僅導致核酸的短期表現。腺病毒載體、腺相關病毒載體和單純皰疹病毒（HSV）載體較佳的是用於將核酸引入神經細胞。腺病毒載體導致比腺相關病毒（約4個月）更短期的表現（約2個月），而腺相關病毒又比HSV載體更短。所選擇的特定載體將取決於靶細胞和正在治療的病症。可以藉由標準技術引入，例如感染、轉染、轉導或轉化。基因轉移模式的實例包括例如裸DNA、CaPO4沈澱、DEAE葡聚糖、電穿孔、原生質體融合、脂質轉染、細胞顯微注射和病毒載體。

載體可用於靶向基本上任何所需的靶細胞。例如，立體定位注射可用於將載體（例如腺病毒、HSV）引導至所需位置。此外，可以使用微型泵輸注系統（例如SynchroMed輸注系統）藉由側腦室內（icv）輸注來遞送顆粒。基於整體流動（稱為對流）之方法也已證明有效地將大分子遞送到大腦的擴展區域，並且可用於將載體遞送到靶細胞。（參見Bobo等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊] 91:2076-2080 (1994)；Morrison等人, Am. J. Physiol[美國生理學雜誌].266:292-305 (1994)）。可以使用的其他方法包括導管、靜脈注射、胃腸外注射、腹膜內注射和皮下注射，以及口服或其他已知施用途徑。 治療方法

本文提供的抗體可以施用以減緩或抑制與CEACAM5和/或CEACAM6表現相關的癌症的進展。在該等應用中，將治療有效量的組成物施用於受試者，其量足以抑制癌細胞的生長、複製或轉移，或抑制癌症的體征或症狀。合適的受試者可包括那些被診斷患有表現CEACAM5和/或CEACAM6的癌症的受試者，例如小腸癌、大腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌、前列腺癌和皮膚癌。

本文提供了一種藉由向受試者施用治療有效量的本文所述之抗體來治療受試者中與CEACAM5和/或CEACAM6表現相關的癌症之方法。在一些實施方式中，癌症係小腸癌、大腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌、前列腺癌和皮膚癌。

本文公開的抗體的施用還可以伴隨其他抗癌劑或治療性治療（如腫瘤的手術切除）的施用。任何合適的抗癌劑都可以與本文公開的抗體組合施用。示例性抗癌劑包括但不限於化療劑，例如有絲分裂抑制劑、烷基化劑、抗代謝物、插入抗生素、生長因子抑制劑、細胞週期抑制劑、酶、拓撲異構酶抑制劑、抗存活劑、生物反應調節劑、抗激素（例如抗雄激素）和抗血管生成劑。其他抗癌治療包括放射療法和其他特異性靶向癌細胞的抗體。

某些類型癌症的另一種常見治療係手術治療，例如轉移性腫瘤的手術切除。治療的另一個實例係放射療法，例如在手術切除之前向腫瘤部位施用放射性物質或能量（例如外束療法），以幫助根除腫瘤或縮小腫瘤。 診斷和檢測方法

本文提供了用於在體外或體內檢測CEACAM5和/或CEACAM6蛋白之方法。在某些情況下，在生物樣品中檢測CEACAM5和/或CEACAM6表現。樣品可以是任何樣品，包括但不限於血液樣品、活檢組織、屍檢和病理標本。生物樣品還包括組織切片，例如，用於組織學目的的冷凍切片。生物樣品還包括體液，例如血液、血清、血漿、痰液、脊髓液或尿液。生物樣品通常獲自哺乳動物，例如人或非人靈長類動物。在較佳的實施方式中，該方法用於非診斷目的。

本文提供了一種確定受試者是否患有與CEACAM5和/或CEACAM6表現相關的癌症之方法，其藉由使來自受試者的樣品與本文公開的抗CEACAM5/6雙結合抗體接觸；以及檢測抗體與樣品的結合。相比於抗體與對照樣品的結合，抗體與樣品的結合的增加將受試者鑒定為患有癌症。

在另一個實施方式中，提供了一種確認受試者中與CEACAM5和/或CEACAM6表現相關的癌症的診斷之方法，其藉由使來自被診斷患有與CEACAM5和/或CEACAM6表現相關的癌症的受試者的樣品與本文公開的抗CEACAM5/6雙結合抗體接觸；以及檢測抗體與樣品的結合。相比於抗體與對照樣品的結合，抗體與樣品的結合的增加確認了受試者中癌症的診斷。

在所公開之方法的一些實例中，單株抗體被直接標記。

在其他實例中，方法進一步包括使特異性結合單株抗體的第二抗體與樣品接觸；以及檢測第二抗體的結合。相比於第二抗體與對照樣品的結合，第二抗體與樣品的結合的增加檢測到受試者中與CEACAM5和/或CEACAM6表現相關的癌症或確認受試者中與CEACAM5和/或CEACAM6表現相關的癌症的診斷。

在一些實例下，癌症係小腸癌、大腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌、前列腺癌和皮膚癌。

在一些實例中，對照樣品係來自沒有癌症的受試者的樣品。在特定實例中，樣品係血液或組織樣品。

在診斷和檢測方法的一些實施方式中，抗CEACAM5/6雙結合抗體用可檢測標記直接標記。在另一個實施方式中，抗CEACAM5/6雙結合抗體（第一抗體）未標記，並且可結合第一抗體的第二抗體或其他分子被標記。如熟悉該項技術者所熟知的，選擇能夠特異性結合第一抗體的特定種類和類別的第二抗體。例如，如果第一抗體係人IgG，則第二抗體可以是抗人IgG。可以與抗體結合的其他分子包括但不限於蛋白A和蛋白G，這兩種都可商購。

抗體或第二抗體的合適標記包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料、磁性試劑和放射性材料。合適酶的非限制性實例包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶。合適的輔基複合物的非限制性實例包括鏈黴親和素/生物素和親和素/生物素。合適的螢光材料的非限制性實例包括傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三𠯤胺螢光素、丹醯氯或藻紅蛋白。非限制性示例性發光材料係魯米諾；非限制性示例性磁性試劑係釓，以及非限制性示例性放射性標記包括 ¹²⁵I、 ¹³¹I、 ³⁵S或 ³H。

在一個替代性實施方式中，CEACAM5和/或CEACAM6可以藉由競爭免疫測定利用標記有可檢測物質的CEACAM5和/或CEACAM6蛋白標準品和未標記的抗CEACAM5/6雙結合抗體在生物樣品中測定。在該測定中，將生物樣品、標記的CEACAM5和/或CEACAM6蛋白標準品和抗CEACAM5/6雙結合抗體組合，並測定與未標記的抗體結合的標記的CEACAM5和/或CEACAM6蛋白標準品的量。生物樣品中CEACAM5和/或CEACAM6的量與結合抗CEACAM5/6雙結合抗體的標記的CEACAM5和/或CEACAM6蛋白標準品的量成反比。

本文公開的免疫測定和方法可用於多種目的。在一個實施方式中，抗CEACAM5/6雙結合抗體可用於檢測細胞培養中細胞中CEACAM5和/或CEACAM6的產生。在另一個實施方式中，抗體可用於檢測生物樣品中CEACAM5和/或CEACAM6的量，例如組織樣品，或血液或血清樣品。在一些實例中，CEACAM5和/或CEACAM6係細胞表面CEACAM5和/或CEACAM6。在其他實例中，CEACAM5和/或CEACAM6蛋白係可溶的（例如在細胞培養上清液或體液樣品中，例如血液或血清樣品）。

在一個實施方式中，提供了用於檢測生物樣品中的CEACAM5和/或CEACAM6的套組，例如血液樣品或組織樣品。例如，為了確認受試者的癌症診斷，可以進行活檢以獲得組織樣品進行組織學檢查。用於檢測多肽的套組通常包括單株抗CEACAM5/6雙結合抗體，例如本文公開的任何單株抗體。在進一步的實施方式中，抗體被標記（例如，用螢光標記、放射性標記或酶標記）。

在一個實施方式中，套組包括公開抗CEACAM5/6雙結合抗體的使用方法的說明材料。說明材料可以以電子形式（例如電腦軟碟或光碟）寫入，或可以是可視的（例如視頻檔）。套組還可以包括另外的元件，以促進設計該套組所要實現的特定應用。因此，例如，套組可以另外地包含檢測標記的手段（例如用於酶標記的酶底物、用於檢測螢光標記的濾光片組、適當的第二標記例如第二抗體等）。套組可以另外地包括通常用於特定方法實踐的緩衝液和其他試劑。這種套組和適當的內容物係熟悉該項技術者所熟知的。

在一個實施方式中，診斷套組包括免疫測定。儘管免疫測定的細節可能隨所採用的特定形式而變化，但檢測生物樣品中CEACAM5和/或CEACAM6之方法通常包括將生物樣品與抗CEACAM5/6雙結合抗體接觸的步驟。允許抗體在免疫反應條件下特異性結合以形成免疫複合物，並且直接或間接檢測免疫複合物（結合抗體）的存在。

本文公開的抗體也可用於免疫測定，例如但不限於放射免疫測定（RIA）、ELISA或免疫組織化學測定。抗體還可用於螢光活化細胞分選（FACS）。FACS採用多個顏色通道、低角度和鈍角光散射檢測通道以及阻抗通道，以及其他更複雜的檢測水平來分離或分類細胞（參見美國專利案號5,061,620）。如本文所公開的，任何結合CEACAM5和/或CEACAM6的單株抗體都可用於該等測定。因此，抗體可用於常規免疫測定，包括但不限於ELISA、RIA、FACS、組織免疫組織化學、蛋白質印跡或免疫沈澱。實例

藉由以下實例進一步說明本發明，該等實例並不旨在限制本發明。以下實例中沒有特定條件的實驗程序係根據常規程序和條件或根據說明進行的。實例 1. 抗 CEACAM5/6 雙結合抗體的免疫接種策略和單個 B 細胞選殖篩選 免疫接種

使用重組人CEACAM5（Uniprot P06731）Fc標籤蛋白、人CEACAM5 A3B3 His標籤片段或CHO-K1-huCEACAM5過表現細胞系作為免疫原以在使用Harbour H2L2小鼠的免疫接種中產生抗CEACAM5抗體（WO 2010/070263 A1）。免疫接種計畫在表4中列出。 [表4]

對於蛋白質免疫接種，每隻小鼠藉由s.c.和i.p.與佐劑（Sigma，S6322）一起施用50 μg蛋白質進行第一次加強，25 μg用於隨後的加強免疫。這種免疫接種每兩週進行，共5次。對於細胞免疫接種，每隻小鼠用PBS中的1 x 10 ⁷個細胞每隔三週施用，共5次。最終免疫接種係藉由i.p.用PBS中稀釋的免疫原進行的。使用ELISA和FACS針對重組人CEACAM5 His標籤、重組cyno CEACAM5（XP_005589491.1）His標籤和重組人CEACAM1（Uniprot P13688）His標籤蛋白（內部）測試血清滴定度。選擇對人CEACAM5和cyno CEACAM5具有高血清滴定度而對人CEACAM1具有低滴定度的小鼠用於隨後的單個B細胞選殖篩選。單個 B 細胞選殖篩選 基於 Beacon® Optofluidic （單細胞光導）系統的單個 B 細胞篩選

Beacon® Optofluidic（單細胞光導）系統使用光電定位（OEPTM）技術來移動單個細胞。Beacon光電系統係一種自動化的生物儀器和設備，可以在細胞培養條件下同時進行生物功能測試、實驗分析、陽性殖株選擇和其他操作。Beacon平臺可以在數千個細胞上以大規模並行、自動化的方式執行該等任務。

在該應用中，使用漿細胞發現工作流程。在每個實驗中，可以篩選多達14k個單個漿細胞，以選擇陽性漿細胞分泌的抗原特異性抗體。然後，將該等分泌特異性抗體的漿細胞輸出到含有細胞裂解物的96孔板中，用於隨後的單個B細胞定序，以鑒定單個B細胞（單株）產生的抗體的重鏈和輕鏈。整個篩選策略和進展如圖1所示。單個 B 細胞定序

採用單個B細胞定序方法從單個漿細胞中回收抗體重鏈和輕鏈序列。單個B細胞定序已成為獲得抗體序列的有力工具。一般程序包括從單個漿細胞裂解物中純化RNA、cDNA的逆轉錄合成、cDNA的擴增和純化、重鏈和輕鏈的擴增、選殖和轉染以及Sanger定序。對獲得的序列進行唯一性和聚類分析，然後合成成對的重鏈和輕鏈DNA序列。實例 2. 抗 CEACAM5/6 雙結合抗體的產生和純化

使用PEI（Polyscience，24885）將編碼靶抗體的重組質體瞬時共轉染到HEK293-6E或293-F細胞培養物中。轉染後，將細胞在37°C和5% CO2下孵育，並以120 rpm振盪。在第6-7天收集的細胞培養上清液用於純化。使用蛋白A磁珠（AmMag蛋白A磁珠，Genscript，L00695）純化單株抗體。

藉由SEC-HPLC（Agilent 1260 Infinity II HPLC，Welch Xtimate SEC-300柱，1 X PBS pH 7.4作為流動相）和SDS-PAGE（SurePAGE，Bis-Tris，10x8，4-12%，12孔，Genscript，M00653）檢測抗體純度。4種重組抗體（稱為PR304169、PR304171、PR304294和PR304713）成功表現和純化用以表徵。4種抗體的胺基酸序列列於表1中。

同時，抗CEACAM5抗體特賽妥單抗（SAR408377）也按照上述程序產生，序列資訊來自SAR408377，建議的INN清單123第34卷, 第2期, 2020。此外，抗CEACAM6抗體替奴瑞利單抗（BAY-1834942）也按照上述程序產生，序列資訊來自建議的INN清單83第34卷, 第1期, 2020。該等抗體用作對照，並分別分配了PR003561（對於特賽妥單抗）和PR303563（對於替奴瑞利單抗）的代碼。該等抗體的胺基酸序列在表2中列出。實例 3. 抗 CEACAM5/6 雙結合單株抗體結合特性的表徵 與人和石蟹獼猴 CEACAM5 和人 CEACAM 6 、 1 、 3 和 8 蛋白的結合

藉由ELISA檢測重組抗CEACAM5/6雙結合單株抗體針對人和石蟹獼猴CEACAM5和人CEACAM6（Uniprot P40199）、人CEACAM 1、3（NP_001806.2，北京義翹神州科技股份有限公司（Sino Biological）11933-H08H）和8（NP_001807.2，北京百普賽斯生物科技股份有限公司（Acro Bio）CE8-H5224）的結合。將抗CEACAM5/6雙抗體在染色緩衝液（含有2% FBS的PBS）中連續稀釋。抗CEACAM5抗體PR003561（特賽妥單抗）、抗CEACAM6抗體PR303563（替奴瑞利單抗）、抗CEACAM1抗體CEACAM1PC（北京義翹神州科技股份有限公司（SinoBiological），Cat：10822-MM02，小鼠單株）、抗CEACAM3抗體CEACAM3PC（北京義翹神州科技股份有限公司（SinoBiological），Cat：11933-MM03，小鼠單株）和抗CEACAM8抗體CEACAM8PC（北京義翹神州科技股份有限公司（SinoBiological），Cat：11729-MM04，小鼠單株）作為對照。使用ELISA來測試含有抗體的上清液或純化的抗體與抗原之間的結合。簡言之，將抗原在4°C下包被在96孔高結合板上過夜。用PBST洗滌板3次，用封閉緩衝液（2%牛血清白蛋白）在37°C孵育1小時，用PBST洗滌3次，並在37°C下用含有抗體的上清液或所需稀釋度或濃度的純化抗體孵育1小時。第二抗體，抗人Fc-HRP（傑克遜實驗室（Jackson Laboratory），109-035-097）用於檢測靶向抗體。使用TMB和終止溶液檢測HRP信號。在SPECTRAMAX平板讀取器上讀取HRP信號。EC50係根據ELISA測試結果確定的（參見表5和圖2-圖7）。

如表5和圖2-圖7所示，四種抗體PR304169、PR304171、PR304713和PR304294顯示出對人和cyno CEACAM5蛋白的良好結合活性，並且與CEACAM1、CEACAM3和CEACAM8沒有結合。一個顯著的特性係，所有四種抗體也顯示出與人CEACAM6的良好結合活性，而對照抗體PR303561（特賽妥單抗）不與CEACAM6交叉反應。當應用於治療時，這可能會轉移到更大的覆蓋範圍。到目前為止還沒有這種抗體的報導。這種結合特性提供了癌細胞的更廣泛的覆蓋範圍。 [表5].抗CEACAM5/6雙結合抗體與各種CEACAM蛋白的ELISA結合

Ab	ELISA
EC50 (nM)
huCEACAM5	cyno CEACAM5	huCEACAM6	huCEACAM1	huCEACAM3	huCEACAM8
PR304169	0.09	0.12	0.077	沒有結合	沒有結合	沒有結合
PR304171	0.15	1.25	24.13	沒有結合	沒有結合	沒有結合
PR304713	0.01	0.021	0.004	沒有結合	沒有結合	沒有結合
PR304294	0.04	0.09	0.22	沒有結合	沒有結合	沒有結合
PR303561	0.02	0.01	沒有結合	沒有結合	沒有結合	沒有結合
PR303563	沒有結合	沒有結合	0.01	沒有結合	沒有結合	沒有結合

與人或石蟹獼猴 CEACAM5/6 穩定細胞系的結合

藉由流動式細胞分析術檢測重組抗CEACAM5/6雙結合抗體對人或石蟹獼猴CEACAM5或CEACAM6穩定細胞的結合。穩定細胞系包括已被轉染以在表面上過表現人CEACAM5（293T-huCEACAM5細胞）或CEACAM6（293T-huCEACAM6細胞）的293T細胞系和已被轉染以在表面上過表現石蟹獼猴CEACAM5（CHOK1-cyno CEACAM5細胞）或CEACAM6（CHOK1-cyno CEACAM6細胞）的CHO-K1細胞系。將抗CEACAM5/6雙結合抗體與穩定細胞系一起孵育。將抗CEACAM5/6雙結合抗體在染色緩衝液（含有2% FBS的PBS）中連續稀釋。將50 μL稀釋的抗體溶液加入50 μL含有1-2×10 ⁵個細胞的細胞懸浮液中，並在4°C下孵育1小時。用染色緩衝液洗滌細胞兩次，並加入100 μL/孔1 : 1000稀釋的螢光標記的抗人IgG抗體（Alexa Fluor® 488 AffiniPure山羊抗人IgG（H+L），Jackson Cat 109-545-088）。在4°C下孵育1小時後，洗滌細胞兩次並在流式細胞儀上運行。PR303561和非相關IgG同種型對照（Crownbio，hIgG1）分別作為陽性對照和陰性對照。結果如下圖8-圖10和表6所示。

結果表明，抗CEACAM5/6雙結合抗體對細胞膜上人和石蟹獼猴CEACAM5和CEACAM6都具有非常好的結合活性。 [表6].藉由FACS檢測的抗CEACAM5/6雙結合抗體與細胞表面結合的CEACAM5/6的結合EC50

Ab		FACS結合
	EC50 (nM)
293T-huCEACAM5	293T-huCEACAM6	CHOK1-cynoCECAM5	CHOK1-cynoCECAM6	LS 174T	BxPC3	A549
PR304169	3.39	2.74	2.20	15.04	13.64	16.1	8.57
PR304171	3.64	10.59	14.88	4.58	8.92	45.3	ND
PR304713	6.44	3.43	3.19	9.50	10.75	12.92	9.02
PR304294	1.26	1.325	2.51	0.88	3.87	6.98	1.49
PR303561	1.04	沒有結合	33.40	沒有結合	1.74	3.06	沒有結合

與表現 CEACAM5 和 CEACAM6 的內源性細胞系 LS 174T 和 BxPC3 的結合

按照如上所述之類似程序，僅將穩定細胞系替換為LS 174T（ATCC CL-188）、BxPC3（ATCC CRL-1687）和A549細胞系，它們同時表現不同水平的膜結合內源性CEACAM5和CEACAM6。結合結果如上圖11和表6所示。

圖11和表6顯示了抗CEACAM5/6雙結合抗體與LS 174T、BxPC3和A549細胞系上膜結合的內源性人CEACAM5和CEACAM6的良好結合能力。雙結合抗體顯示出比對照抗體PR303561大得多的飽和結合能力。實例 4. 藉由 Octet 測定抗 CEACAM5/6 雙結合抗體與可溶性 CEACAM5 和 CEACAM6 的結合親和力

藉由Octet分析重組抗CEACAM5/6抗體與CEACAM5和CEACAM6的結合動力學。在Octet分析中，用1×動力學緩衝液（Fortebio）連續稀釋重組人CEACAM5 Fc標籤蛋白（#Uniprot P06731）或CEACAM6 Fc標籤蛋白（Uniprot P40199）。將抗CEACAM5/6雙結合抗體稀釋至5 μg/mL。然後將稀釋的抗體、抗原和再生緩衝液（10 mM甘胺酸pH 1.75）加入96孔板（Greiner）中。使用AHC感測器（Fortebio）測量締合和解離的速率常數。每次結合實驗後，用再生緩衝液再生感測器表面。使用ForteBio數據分析軟體（8.0版，Pall ForteBio，美國加利福尼亞州）處理跡線。

抗CEACAM5/6雙結合抗體的KD值總結在表7中。 [表7].藉由Octet檢測的抗體KD值

Ab	Octet 親和力
K _D(M)
huCEACAM5	huCEACAM6
PR304169	1.69E-09	3.49E-09
PR304713	2.50E-09	7.70E-09
PR304294	5.48E-09	1.99E-08
PR303561	6.00E-09	沒有結合

實例 5. Octet 對抗 CEACAM5/6 雙結合抗體的表位分組（ epitope binning ）

在使用Octet的表位分組分析中，以成對方式測試抗體與其他抗體，以查看抗體是否阻斷彼此與抗原表位的結合。將第一抗體和第二抗體稀釋到相同的濃度，該濃度可以使固定抗原的結合飽和。重組CEACAM5-his蛋白被生物素化，然後用作抗原並固定在SA感測器上。第一抗體與抗原締合，然後與第二抗體締合。藉由ForteBio數據分析軟體（8.0版，Pall ForteBio）對數據進行分析。計算第二抗體相同的抗體與第一抗體相同的抗體的RU值的比率計算為該抗體與其他抗體的共結合率。一般來說，＞ 50%和接近100%的比率表明兩種抗體與不同的表位組（epitope bin）結合；＜ 20%的比率表示兩種評估抗體的重疊組（overlapping bin）。共結合率如表8所示。

如表8所示，所有抗CEACAM5/6雙結合抗體都屬於同一表位組（epitope bin），這與對照抗體PR303561不同。 [表8].藉由Octet測定的抗CEACAM5/6雙結合抗體的表位分組結果

Ab	PR304169	PR304171	PR304294	PR303561
PR304169	-2.50%	-4.99%	8.75%	105.68%
PR304171	20.41%	13.71%	24.37%	101.26%
PR304294	1.02%	-4.88%	1.80%	101.93%
PR303561	109.51%	101.15%	98.53%	8.80%

實例 6. 抗 CEACAM5/6 雙結合抗體的可溶性 CEACAM5 或 CEACAM6 干擾測定

然後，在存在或不存在100 nM可溶性CEACAM5或CEACAM6下，測試該等抗CEACAM5/6雙結合抗體與表現CEACAM5和CEACAM6的293T-huCEACAM5、293T-huCEACAM6、LS 174T和BxPC3細胞的結合。實驗按照實例3中所示的類似程序進行（與表現CEACAM5和CEACAM6的內源性細胞系LS 174T和BxPC3結合），但將100 nM可溶性CEACAM5或CEACAM6添加到系列稀釋抗體中。

結果表明，當加入100 nM可溶性CEACAM5或CEACAM6時，該等抗體的結合均降低，但大多數EC50變化在5倍以內，表明可溶性CEACAM5或CEACAM6對抗CEACAM5/6抗體的干擾最小。這表明該等抗體對可溶性蛋白質干擾具有良好的抗性。 [表9].在100 nM可溶性蛋白存在下EC50的倍數變化

	293T-huCEACAM5	293T-huCEACAM6	LS174T (CEACAM5++, CEACAM6+)	BxPC3 (CEACAM5++, CEACAM6+++)
PR304169+CEACAM5	6.8		5.2	5.6
PR304169+CEACAM6		11.1	2.8	7.7
PR304713+CEACAM5	3.9		5.2	4.8
PR304713+CEACAM6		8.2	5.2	5.5
PR304294+CEACAM5	4.1		5.4	11.0
PR304294+CEACAM6		2.1	1.1	1.2
PR303561+CEACAM5	3.9		7.3	6.9
PR303563+CEACAM6		7.3	6.9	4.1

實例 7. 藉由 pHAb 胺反應性染料的抗體在 293T-huCEACAM5 、 293T-huCEACAM6 、 LS 174T 、 HPAC 或 BxPC3 上的內化

pHAb胺反應性染料（Promega，Cat # G9841）用於測定抗CEACAM5/6雙結合抗體在293T-huCEACAM5、293T-huCEACAM6、LS 174T、HPAC或BxPC3細胞上的基於抗原的內化。

pHAb染料係pH感測器染料，在pH ＞ 7下具有非常低的螢光，並且隨著溶液的pH變成酸性，螢光顯著增加。在這種情況下，當用pHAb染料標記的抗體在中性pH下結合細胞外部時，沒有監測到螢光或螢光非常低。但在內化後，在內體和溶酶體的較低pH環境中，螢光會變得更強。

用pHAb染料標記抗體，並按照套組說明計算DAR。將標記的抗體與293T-huCEACAM5和LS 174T在4°C（理論上該溫度具有非常低的內化活性，因此將用作背景對照）或37°C下孵育6小時。然後檢測在532 nm處具有激發最大值（Ex）和在560 nm處具有發射最大值（Em）的螢光。最終歸一化結果將是37°C的螢光強度減去4°C的背景，然後除以抗體的pHAb染料的DAR。值越高表示內化活性越高。

內化結果如圖12和表10所示。

如圖12所示，抗CEACAM5/6雙結合抗體具有良好的內化活性。良好的內化將有助於提高ADC中使用的抗體的功效，因為大多數ADC需要內化來釋放毒素，並且對抗體藥物也很有用，因為它可以幫助減少細胞膜上的CEACAM5或CEACAM6數量。 [表10].在293T-huCEACAM5、293T-huCEACAM6、LS174T、HPAC和BxPC3上的內化

抗體名稱	MFI (37°C-4°C) / DAR
293T-huCEACAM5	293T-huCEACAM6	LS174T	HPAC	BxPC3
PR304169	8987	19258	2078	112658	30709
PR304713	16613	35633	3348	135448	55186
PR304294	11260	14733	2327	129768	23048
PR303561	8722	1256	1319	91001	8231
IgG1	888	975	468	3014	0

實例 8. 在可溶性蛋白干擾下抗 CEACAM5/6 雙結合抗體在 LS 174T 、 A549 、 BxPC3 和 HPAC 上的內化

在可溶性蛋白干擾下抗CEACAM5/6雙結合抗體在LS 174T、A549、BxPC3和HPAC細胞系上的內化按照實例7所示的類似程序進行，但向系統中加入100 nM可溶性CEACAM5或CEACAM6。實驗結果如圖13所示。

結果表明，抗CEACAM5/6雙結合抗體的內化活性不受可溶性CEACAM5或CEACAM6蛋白干擾。實例 9. 抗 CEACAM5/6 雙結合抗體 -MMAE 軛合的 ADC 的體外細胞毒性

對293T-huCEACAM5、293T-huCEACAM6、LS 174T和BxPC3細胞進行體外細胞毒性研究。將抗CEACAM5/6雙結合抗體與MC-Val-Cit-PABC-MMAE軛合，形成DAR =約4的ADC。MC-Val-Cit-PABC-MMAE可商購（MedChemExpress，HY-15575），並如下進行軛合。藉由在4°C下透析過夜，將含有抗體的樣品緩衝液調節至所需pH，並調節至5 mg/ml的濃度。將相對當量的TCEP（與蛋白質相比）加入樣品緩衝液中，振盪並在室溫下孵育3小時。然後將溶解在DMSO中的相對當量的（與蛋白質相比）MC-Val-Cit-PABC-MMAE直接加入反應樣品中，並在室溫下孵育2~6小時。然後向反應樣品中加入10當量的半胱胺酸（與蛋白質相比）以淬滅反應。藉由透析去除過量的小分子，獲得包含與MC-Val-Cit-PABC-MMAE軛合的抗CEACAM5/6抗體的ADC。對於細胞毒性實驗，將細胞與連續稀釋的ADC一起孵育6天。藉由CellTiter-Glo套組（Promega，G7572）測量活力。在GraphPad Prism中分析數據以獲取不同ADC的IC50。

表11中的結果表明，基於PR304169、PR304713和PR304294的ADC在CEACAM5過表現的293T細胞以及LS 174T和BxPC3細胞上顯示出與基於PR303561的ADC相當或更好的體外細胞毒性，並且在人CEACAM6過表現的293T細胞中也顯示出非常好的體外細胞毒性，表明細胞系覆蓋範圍更廣。 [表11].抗CEACAM5/6雙結合抗體-MMAE軛合的ADC在不同細胞系上的IC50

ADC 名稱	293T-huCEACAM5	293T-huCEACAM6	LS 174T	BxPC3
PR304169-MMAE	0.24	0.43	~35	2.38
PR304294-MMAE	0.032	0.46	~100	0.57
PR304713-MMAE	0.64	0.75	~100	3.09
PR303561-MMAE	0.016	-	~100	1.8
MMAE	0.001	0.005	0.5	0.03
IgG-MMAE	66	72	700	~100

實例 10. 抗 CEACAM5/6 抗體 -MMAE 軛合的 ADC 的體內功效

為了評估抗CEACAM5/6 ADC的抗腫瘤活性，對具有MKN45胃腫瘤和LS 174T大腸癌腫瘤細胞系的CDX小鼠模型進行體內功效研究。使用卡尺每週兩次在兩個維度上測量腫瘤體積，並使用以下公式表示體積（單位mm ³）：V = 0.5 ax b ²，其中 a和 b分別是腫瘤的長徑和短徑。腫瘤生長抑制（TGI）：TGI% = (1-T _i/C _i) × 100。T _i和C _i分別是治療組和對照組在給定日的平均腫瘤體積。

給藥方案和結果如圖14（A和B）、表12、圖15（A和B）和表13中所示。如圖和表所示，基於PR304169、PR304713和PR304294的ADC在抗腫瘤活性方面與基於PR303561的ADC相當或更好。 [表12].ADC對MKN45胃癌腫瘤的抗腫瘤活性評估

ADC 名稱	劑量	第 35 天的 TGI （ % ）
PR304169-MMAE	10 mpk, QW x 3劑	99.74
PR304713-MMAE	10 mpk, QW x 3劑	96.73
PR304294-MMAE	10 mpk, QW x 3劑	98.75

[表13].ADC對LS 174T大腸癌腫瘤的抗腫瘤活性評估

ADC 名稱	劑量	第 9 天的 TGI （ % ）
PR304169-MMAE	10 mpk, QW x 3劑	56.82
PR304713-MMAE	10 mpk, QW x 3劑	75.72
PR304294-MMAE	10 mpk, QW x 3劑	70.12
PR303561-MMAE	10 mpk, QW x 3劑	60.67

無

[圖1]說明瞭產生抗CEACAM5/6抗體的免疫接種和單個B細胞選殖的程序。

[圖2]說明瞭抗CEACAM5/6雙結合抗體與人CEACAM5蛋白的結合。

[圖3]說明瞭抗CEACAM5/6雙結合抗體與cyno CEACAM5蛋白的結合。

[圖4]說明瞭抗CEACAM5/6雙結合抗體與人CEACAM6蛋白的結合。

[圖5]說明瞭抗CEACAM5/6雙結合抗體沒有與人CEACAM1蛋白結合。

[圖6]說明瞭抗CEACAM5/6雙結合抗體沒有與人CEACAM3蛋白結合。

[圖7]說明瞭抗CEACAM5/6雙結合抗體沒有與人CEACAM8蛋白結合。

[圖8]說明瞭抗CEACAM5/6雙結合抗體與過表現人CEACAM5的293T細胞的結合。

[圖9]說明瞭抗CEACAM5/6雙結合抗體與過表現人CEACAM6的293T細胞的結合。

[圖10]說明瞭抗CEACAM5/6雙結合抗體與過表現cyno CEACAM5或cyno CEACAM6的CHO-K1細胞的結合。

[圖11]說明瞭抗CEACAM5/6雙結合抗體與癌細胞系LS 174T、BxPC3和A549的結合。

[圖12]說明瞭抗CEACAM5/6雙結合抗體在過表現人CEACAM5或人CEACAM6的293T細胞系以及癌細胞系LS 174T、HPAC（胰臟癌）和BxPC3上的內化。

[圖13]說明瞭在100 nM具有可溶性蛋白干擾的可溶性人CEACAM5或人CEACAM6存在下，抗CEACAM5/6雙結合抗體在癌細胞系LS 174T、A549（肺癌）、BxPC3和HPAC上的內化。

[圖14]說明瞭抗CEACAM5/6 ADC在CDX小鼠模型中對MKN45胃癌的抗腫瘤活性的評估。

[圖15]說明瞭抗CEACAM5/6 ADC在CDX小鼠模型中對LS 174T大腸癌的抗腫瘤活性的評估。序列

本發明的抗CEACAM5/6抗體PR304169、PR304171、PR304294和PR304713的CDR（根據Kabat和Chothia組合系統）、重鏈可變區（VH）、輕鏈可變區（VL）、整個重鏈（HC）和輕鏈（LC）的胺基酸序列如表1所示。抗CEACAM5參考抗體PR303561（特賽妥單抗）和抗CEACAM6參考抗體PR303563（Tinurilimab（替奴瑞利單抗））的CDR（根據Kabat和Chothia組合系統）、重鏈可變區（VH）、輕鏈可變區（VL）、整個重鏈（HC）和輕鏈（LC）的胺基酸序列如表2所示。 [表1].本發明抗體的胺基酸序列

描述	序列	SEQ ID NO
PR304169
HCDR1	GFTFSSYGMH	1
HCDR2	IIWYDGSNKNYADSVKG	2
HCDR3	DVNWGNWYFDL	3
LCDR1	RASQSVSSNLA	4
LCDR2	GASTRAT	5
LCDR3	QQYNTWIT	6
VH	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA IIWYDGSNKNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DVNWGNWYFDLWGRGTLVTVSS	7
VL	EVVMTQSPATLSVSPGERATLSC RASQSVSSNLAWYQLKPGQAPRLLIY GASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFALYYC QQYNTWITFGQGTRLEIK	8
HC	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWYDGSNKNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVNWGNWYFDLWGRGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	9
LC	EVVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQLKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFALYYCQQYNTWITFGQGTRLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	10

PR304171
HCDR1	DFTFSSYAMS	11
HCDR2	AISGSGGSTYYADSVKG	12
HCDR3	GIAVAGLYYYGMDV	13
LCDR1	RASQNVISNLA	14
LCDR2	TTSTRAT	15
LCDR3	QQYNNWPLT	16
VH	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS DFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS AISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GIAVAGLYYYGMDVWGQGTTVTVSS	17
VL	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC RASQNVISNLAWHQQKPGQAPRLLIY TTSTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC QQYNNWPLTFGGGTKVEIK	18
HC	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASDFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGIAVAGLYYYGMDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	19
LC	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQNVISNLAWHQQKPGQAPRLLIYTTSTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPLTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	20

PR304294
HCDR1	GFTFSSYAMS	21
HCDR2	AISGTTYNTYYAGSVKG	22
HCDR3	GISVAGYYYYGMDV	23
LCDR1	RASQSVISNLA	24
LCDR2	GASTRAT	5
LCDR3	HQYNNWPLT	25
VH	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS AISGTTYNTYYAGSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK GISVAGYYYYGMDVWGQGTTVTVSS	26
VL	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC RASQSVISNLAWYQQKPGQAPRLLIY GASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC HQYNNWPLTFGGGTKVEIK	27
HC	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGTTYNTYYAGSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGISVAGYYYYGMDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	28
LC	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVISNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCHQYNNWPLTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	29

PR304713
HCDR1	GFTFSSYGMH	1
HCDR2	IIWYDGSNRDYADSVKG	30
HCDR3	DVNWGNWYFDL	3
LCDR1	RASQSVSSNLA	4
LCDR2	GASTRAT	5
LCDR3	QQYNTWIT	6
VH	QAQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVA IIWYDGSNRDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DVNWGNWYFDLWGRGTLVTVSS	31
VL	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC RASQSVSSNLAWYQLKPGQAPRLLIY GASTRATGVPARVSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAAYYC QQYNTWITFGQGTRLEIK	32
HC	QAQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWYDGSNRDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVNWGNWYFDLWGRGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	33
LC	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQLKPGQAPRLLIYGASTRATGVPARVSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAAYYCQQYNTWITFGQGTRLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	34

[表2].參考抗體的胺基酸序列

描述	序列	SEQ ID NO
PR303561
HCDR1	GFVFSSYDMS	35
HCDR2	WVAYISSGGGITYAPSTVKG	36
HCDR3	HYFGSSGPFAY	37
LCDR1	RASENIFSYLA	38
LCDR2	NTRTLAE	39
LCDR3	QHHYGTPFT	40
VH	EVQLQESGPGLVKPGGSLSLSCAAS GFVFSSYDMSWVRQTPERGLE WVAYISSGGGITYAPSTVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCAA HYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSS	41
VL	DIQMTQSPASLSASVGDRVTITC RASENIFSYLAWYQQKPGKSPKLLVY NTRTLAEGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYC QHHYGTPFTFGSGTKLEIK	42
HC	EVQLQESGPGLVKPGGSLSLSCAASGFVFSSYDMSWVRQTPERGLEWVAYISSGGGITYAPSTVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLTSEDTAVYYCAAHYFGSSGPFAYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG	43
LC	DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASENIFSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNTRTLAEGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	44

PR303563
HCDR1	GFSLSTYGIGVG	45
HCDR2	HIWWNDNKYYSTSLKT	46
HCDR3	ISLPYFDY	47
LCDR1	KASQNVGTAVA	48
LCDR2	SASNRYT	49
LCDR3	QQYSSYPLT	50
VH	QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFS GFSLSTYGIGVGWIRQPPGKALEWLA HIWWNDNKYYSTSLKTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR ISLPYFDYWGQGTTLTVSS	51
VL	DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIY SASNRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC QQYSSYPLTFGGGTKVEIK	52
HC	QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTYGIGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWNDNKYYSTSLKTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARISLPYFDYWGQGTTLTVSS ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG	53
LC	DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSYPLTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	54

無

TWI904701B_113120466_SEQL.xml

Claims

一種與CEACAM5和CEACAM6都結合的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，並且其中(1)該VH分別包含SEQ ID NO：21、22和23中所示的HCDR 1-3，以及該VL分別包含SEQ ID NO：24、5和25中所示的LCDR 1-3；(2)該VH分別包含SEQ ID NO：1、2和3中所示的HCDR 1-3，以及該VL分別包含SEQ ID NO：4、5和6中所示的LCDR 1-3；或(3)該VH分別包含SEQ ID NO：1、30和3中所示的HCDR 1-3，以及該VL分別包含SEQ ID NO：4、5和6中所示的LCDR 1-3。
如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其中：(1)該VH包含與SEQ ID NO：26具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該VL包含與SEQ ID NO：27具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列；(2)該VH包含與SEQ ID NO：7具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該VL包含與SEQ ID NO：8具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列；或(3)該VH包含與SEQ ID NO：31具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該VL包含與SEQ ID NO：32具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列。
如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含重鏈 (HC)和輕鏈(LC)，並且其中：(1)該HC包含與SEQ ID NO：28具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該LC包含與SEQ ID NO：29具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列；(2)該HC包含與SEQ ID NO：9具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該LC包含與SEQ ID NO：10具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列；或(3)該HC包含與SEQ ID NO：33具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列，以及該LC包含與SEQ ID NO：34具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的胺基酸序列。
如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係鼠抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係選自由IgG、IgA、IgM、IgE和IgD組成之群組的同種型。
如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係選自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4組成之群組的亞型。
如請求項1-2中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段選自由Fab、Fab’、F(ab')₂、Fd、Fd’、Fv、scFv、ds-scFv和dAb組成之群組。
如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係單株抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係單價、二價或多價的。
如請求項1所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段連接到螢光標記、放射性標記或藥物部分。
如請求項10所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段連接到藥物部分，並且該藥物部分選自由微管抑制劑、抗生素、DNA合成抑制劑、拓撲異構酶抑制劑、RNA聚合酶II抑制劑和RNA剪接體抑制劑組成之群組。
如請求項11所述之抗體或其抗原結合片段，其中該藥物部分選自由MMAE、MMAF、倍癌黴素、DM1、DM4、SN-38、Dxd、卡奇黴素、阿黴素和PBD(苯二氮呯類藥物)組成之群組。
如請求項10至12中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段藉由連接子連接到該藥物部分。
如請求項13所述之抗體或其抗原結合片段，其中該連接子包含可切割連接子或不可切割連接子。
如請求項14所述之抗體或其抗原結合片段，其中該可切割連接子選自由酸不穩定連接子、親水連接子、蛋白酶敏感連接子、光不穩定連接子、腙連接子、二甲基連接子和含二硫化物連接子組成之群組。
如請求項14所述之抗體或其抗原結合片段，其中該連接子選自由MC(6-馬來醯亞胺基己醯基)、Val-Cit(纈胺酸-瓜胺酸)、PABC(對胺基苄氧羰基)、DMEA(二甲基乙胺)、Val-Cit-PABC、MC-Val-Cit-PABC、MC-Val-Cit-PABC-DMEA、GGFG(甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸)、MC-GGFG-胺甲基、AcBut(4-(4-乙醯基苯氧基)-丁酸)和AcBut-二甲基肼組成之群組。
如請求項16所述之抗體或其抗原結合片段，其中該連接子是 MC-Val-Cit-PABC。
一種雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含如請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，和特異性結合腫瘤相關抗原、免疫細胞抗原或免疫檢查點分子的第二抗原結合區。
一種核酸，該核酸包含編碼如請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項18所述之雙特異性抗體的核苷酸序列。
一種載體，該載體包含如請求項19所述之核酸。
一種宿主細胞，該宿主細胞包含如請求項19所述之核酸或如請求項20所述之載體。
一種抗體-藥物軛合物(ADC)，該抗體-藥物軛合物包含如請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項18所述之雙特異性抗體，以及藉由連接子與其軛合的藥物部分。
如請求項22所述之抗體-藥物軛合物，其中該藥物部分選自由微管抑制劑、抗生素、DNA合成抑制劑、拓撲異構酶抑制劑、RNA聚合酶II抑制劑和RNA剪接體抑制劑組成之群組。
如請求項23所述之抗體-藥物軛合物，其中該藥物部分選自由MMAE、MMAF、倍癌黴素、DM1、DM4、SN-38、Dxd、卡奇黴素、阿黴素和PBD(苯二氮呯類藥物)組成之群組。
如請求項22-24中任一項所述之抗體-藥物軛合物，其中該連接子包含可切割連接子或不可切割連接子。
如請求項25所述之抗體-藥物軛合物，其中該可切割連接子選自由酸不穩定連接子、親水連接子、蛋白酶敏感連接子、光不穩定連接子、腙連接子、二甲基連接子和含二硫化物連接子組成之群組。
如請求項25所述之抗體-藥物軛合物，其中該連接子選自由MC (6-馬來醯亞胺基己醯基)、Val-Cit(纈胺酸-瓜胺酸)、PABC(對胺基苄氧羰基)、DMEA(二甲基乙胺)、Val-Cit-PABC、MC-Val-Cit-PABC、MC-Val-Cit-PABC-DMEA、GGFG(甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸)、MC-GGFG-胺甲基、AcBut(4-(4-乙醯基苯氧基)-丁酸)和AcBut-二甲基肼組成之群組。
如請求項27所述之抗體-藥物軛合物，其中該連接子是MC-Val-Cit-PABC。
一種藥物組成物，該藥物組成物包含如請求項1-17中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，或如請求項18所述之雙特異性抗體，或如請求項19所述之核酸，或如請求項20所述之載體，或如請求項21所述之宿主細胞，或如請求項22-28中任一項所述之抗體-藥物軛合物。
如請求項29所述之藥物組成物，還包含藥學上可接受的載劑或賦形劑。
如請求項30所述之藥物組成物，其中該組成物進一步包含第二治療劑。
如請求項31所述之藥物組成物，其中該第二治療劑選自由抗體、化療劑、siRNA、反義寡核苷酸、多肽和小分子藥物組成之群組。
一種如請求項1-17中任一項所述之抗體或其抗原結合片段，或如請求項18所述之雙特異性抗體，或如請求項19所述之核酸，或如請求項20所述之載體，或如請求項21所述之宿主細胞，如請求項22-28中任一項所述之抗體-藥物軛合物，或如請求項29-32中任一項所述之藥物組成物在製造用於治療受試者癌症的藥物中之用途。
如請求項33所述之用途，其中該癌症係與CEACAM5和/或CEACAM6表現相關的癌症。
如請求項34所述之用途，其中該癌症選自由小腸癌、大腸直腸癌、胃癌、肺癌、子宮頸癌、胰臟癌、食道癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、乳癌、肝癌、前列腺癌和皮膚癌組成之群組。
如請求項33至35中任一項所述之用途，其中該藥物進一步包含第二治療劑。
如請求項36所述之用途，其中該第二治療劑選自抗體、化療劑、siRNA、反義寡核苷酸、多肽和小分子藥物。
一種用於檢測樣品中CEACAM5和/或CEACAM6的存在或水平之方法，該方法包括：(a)使該樣品與如請求項1-9中任一項所述之抗體或其抗原結合片段接觸，以及(b)藉由檢測該抗體與該樣品的結合來確定該樣品中CEACAM5和/或CEACAM6的存在或水平。