TWI900064B - 染色條件評價方法及電腦可讀取之程式 - Google Patents

Abstract

本發明之染色條件評價方法包括：於第1染色條件下對試驗標本賦予第1初級抗體之步驟(步驟S11)；拍攝試驗標本而獲取第1影像之步驟(步驟S13)；於第2染色條件下對試驗標本賦予第2初級抗體之步驟(步驟S15)；拍攝試驗標本而獲取第2影像之步驟(步驟S17)；及基於第1影像及第2影像中之染色細胞之檢測結果，判定第1染色條件及第2染色條件是否合適之步驟(步驟S18)。步驟S18中，於第1影像中，試驗標本上之細胞被特異性地染色，且於第2影像中，試驗標本上之與第1影像不同之細胞被特異性地染色，且第1影像中經染色之試驗標本上之細胞於第2影像中為未染色之情形時，判定為第1染色條件及第2染色條件合適。

Description

染色條件評價方法及電腦可讀取之程式

本發明係關於一種評價免疫染色法中之標本之染色條件的技術。 [相關申請之參照] 本申請主張基於2023年6月21日提出申請之日本專利申請JP2023-101954之優先權之權益，將該申請之全部揭示內容組合融入至本申請中。

近年來，於醫學研究或生物學研究中，以闡明疾病機制或闡明生物機制、闡明藥劑作用機轉等為目的，對組織標本或細胞標本等源自生物之標本之單細胞單位實施了解析。例如，於免疫染色解析中，對蛋白質等源自生物之物質進行染色，並對染色狀態進行計測，藉此進行定量定性解析。

上述免疫染色解析中，需要使標本之染色狀態適於解析。例如，日本專利特開2011-185895號公報(文獻1)之血液塗抹標本製作裝置中，為了減少染色液原液每批次之差異或製造商之差異而使標本之染色狀態均等化，於更換染色液原液時，基於經測試染色之標本中之白血球之平均核G值與目標核G值之差異，變更染色條件(例如染色液原液之稀釋率或染色時間等)。

又，日本專利特表2020-523614號公報(文獻2)中，提出有於免疫染色用之過程記錄載玻片中設置檢測區域及對照區域，上述檢測區域係用於基於免疫染色進行檢測之空間，上述對照區域係用以定性或定量地決定經染色之組織等之顏色密度之參照用空間。

另外，於免疫染色解析中，已知有多重免疫染色法，其係針對同一標本，一面變更用於免疫染色之抗體等，一面反覆進行數次免疫染色、拍攝及顏色去除。於多重免疫染色法中，在使用一抗體之免疫染色中該抗體之濃度或由該抗體引起之反應時間等染色條件不合適之情形時，不僅會對使用該抗體之免疫染色產生不良影響，而且亦會對其後進行之使用其他抗體之免疫染色產生不良影響，有解析精度降低之虞。

本發明之目的在於容易地判定染色條件是否合適。

本發明之態樣1係一種染色條件評價方法，其係評價免疫染色法中之標本之染色條件者，且包括：a)於第1染色條件下對試驗標本賦予第1初級抗體之步驟；b)於前述a)步驟之後，對前述試驗標本賦予二級抗體及顯色劑之步驟；c)於前述b)步驟之後，拍攝前述試驗標本而獲取第1影像之步驟；d)於前述c)步驟之後，使前述試驗標本上之前述第1初級抗體失活或去除之步驟；e)於前述d)步驟之後，於第2染色條件下對前述試驗標本賦予第2初級抗體之步驟；f)於前述e)步驟之後，對前述試驗標本賦予前述二級抗體及前述顯色劑之步驟；g)於前述f)步驟之後，拍攝前述試驗標本而獲取第2影像之步驟；及h)於前述g)步驟之後，基於前述第1影像及前述第2影像中之染色細胞之檢測結果，判定前述第1染色條件及前述第2染色條件是否合適之步驟。使用前述第1初級抗體進行染色之細胞與使用前述第2初級抗體進行染色之細胞不同。前述h)步驟中，於前述第1影像中，前述試驗標本上之細胞被特異性地染色，且於前述第2影像中，前述試驗標本上之與前述第1影像不同之細胞被特異性地染色，且前述第1影像中經染色之前述試驗標本上之細胞於前述第2影像中為未染色之情形時，判定為前述第1染色條件及前述第2染色條件合適。

根據本發明，能夠容易地判定染色條件是否合適。

本發明之態樣2係如態樣1之染色條件評價方法，其中，於前述h)步驟中，前述第1影像中之染色細胞之檢測、及前述第2影像中之染色細胞之檢測係分別使用藉由機器學習所製作之已學習模型來進行。

本發明之態樣3係如態樣1或2之染色條件評價方法，其中，於前述a)步驟之前，準備配置有前述試驗標本及另一試驗標本之載玻片。前述a)步驟中，於第3染色條件下對前述另一試驗標本賦予前述第1初級抗體。前述b)步驟中，亦對前述另一試驗標本賦予前述二級抗體及前述顯色劑。前述c)步驟中，拍攝前述另一試驗標本而獲取第3影像。前述d)步驟中，亦使前述另一試驗標本上之前述第1初級抗體失活或去除。前述e)步驟中，於第4染色條件下對前述另一試驗標本賦予前述第2初級抗體。前述f)步驟中，亦對前述另一試驗標本賦予前述二級抗體及前述顯色劑。前述g)步驟中，拍攝前述另一試驗標本而獲取第4影像。前述h)步驟中，亦基於前述第3影像及前述第4影像中之染色細胞之檢測結果，判定前述第3染色條件及前述第4染色條件是否合適。前述h)步驟中，於前述第3影像中，前述另一試驗標本上之細胞被特異性地染色，且於前述第4影像中，前述另一試驗標本上之與前述第3影像不同之細胞被特異性地染色，且前述第3影像中經染色之前述另一試驗標本上之細胞於前述第4影像中未染色之情形時，判定為前述第3染色條件及前述第4染色條件合適。

本發明之態樣4係如態樣1或2(亦可為態樣1至3中之任一項)之染色條件評價方法，其中，前述第1初級抗體及前述第2初級抗體係於對一標本之連續多重免疫染色中使用。於前述連續多重免疫染色中，使用前述第2初級抗體之染色係於使用前述第1初級抗體之染色之後進行。

本發明之態樣5係一種電腦可讀取之程式，其係使電腦評價免疫染色法中之標本之染色條件者，且使電腦執行如下步驟：i)記憶經染色之試驗標本之影像即第1影像、及於與前述第1影像不同之條件下被染色之前述試驗標本之影像即第2影像；及j)基於前述第1影像及前述第2影像中之染色細胞之檢測結果，判定染色條件是否合適。前述第1影像係於對前述試驗標本在第1染色條件下賦予第1初級抗體，進而賦予二級抗體及顯色劑之狀態下拍攝而得者。前述第2影像係於進行前述第1影像之獲取、及前述試驗標本上之前述第1初級抗體之失活或去除之後，對前述試驗標本在第2染色條件下賦予第2初級抗體，進而賦予前述二級抗體及前述顯色劑之狀態下拍攝而得者。使用前述第1初級抗體進行染色之細胞與使用前述第2初級抗體進行染色之細胞不同。前述j)步驟中，於前述第1影像中，前述試驗標本上之細胞被特異性地染色，且於前述第2影像中，前述試驗標本上之與前述第1影像不同之細胞被特異性地染色，且前述第1影像中經染色之前述試驗標本上之細胞於前述第2影像中為未染色之情形時，判定為前述第1染色條件及前述第2染色條件合適。

上述目的及其他目的、特徵、態樣及優點係藉由以下參照隨附圖式而進行之本發明之詳細說明即可明瞭。

圖1係表示本發明之第1實施形態之染色條件評價方法中之評價流程的圖。該染色條件評價方法係於對免疫染色法中之標本(例如源自生物之標本)之染色條件進行評價時利用。

該染色條件評價方法例如用於對連續多重免疫染色法中之染色條件進行評價。連續多重免疫染色法係指一面變更用於免疫染色之抗體等一面反覆進行數次對同一標本之免疫染色、觀察(例如拍攝)及顏色去除的多重免疫染色法。以下，說明對藉由連續多重免疫染色法所實施之數次免疫染色中第N次(N為1以上之整數)及第N＋1次免疫染色中之染色條件是否合適進行評價時之流程。

該染色條件評價方法中，首先，準備用於評價染色條件之試驗標本。該試驗標本例如係自與藉由上述連續多重免疫染色法進行染色及解析之預定標本相同之組織獲取者。繼而，於研究出在上述連續多重免疫染色法之第N次免疫染色中實施之染色條件下，對該試驗標本進行抗原活化處理(例如熱處理或酵素處理)及初級抗體之賦予(步驟S11)。該初級抗體係於上述第N次免疫染色中使用之初級抗體，以下亦稱為「第1初級抗體」。又，以下，將步驟S11中之染色條件亦稱為「第1染色條件」或「第1初級染色條件」。

第1初級抗體係與特定之抗原(例如蛋白質、肽、小分子等)結合之免疫球蛋白，以較高之親和性及特異性與該抗原結合。作為第1初級抗體，例如可使用源自小鼠、兔子、山羊或雞等各種動物種之抗體。關於後述第2初級抗體亦同樣如此。

第1初級染色條件例如包含對試驗標本賦予之第1初級抗體之濃度及對試驗標本賦予第1初級抗體之時間(即反應時間)中之至少一者。第1初級染色條件例如亦可包含抗原活化處理之處理條件。於抗原活化處理為熱處理之情形時，該處理條件例如包含抗原活化處理中之抗原活化液之pH值、以及試驗標本之加熱溫度及加熱時間中之至少一者。關於後述第2初級染色條件亦同樣如此。

若步驟S11結束，則於上述第N次免疫染色中實施之預定染色條件(以下，亦稱為「二級染色條件」)下對試驗標本進行二級抗體及顯色劑之賦予(步驟S12)。藉此，於試驗標本中，初級抗體所結合之特定細胞等被染色。該二級抗體及顯色劑係於上述第N次免疫染色中使用之二級抗體及顯色劑。

二級抗體係與初級抗體結合之抗體，係與產生該初級抗體之動物種對應之抗體。例如，於步驟S11中使用之第1初級抗體源自小鼠之情形時，步驟S12中使用之二級抗體為抗小鼠抗體。顯色劑可利用對應二級抗體之標記而顯色之各種顯色劑(例如AEC(3-amino-9-ethyl-carbazole，3-胺基-9-乙基-咔唑)等)。

其後，拍攝步驟S11～S12中經染色之試驗標本之一部分或全部而獲取染色影像(以下，亦稱為「第1影像」)(步驟S13)。圖2係表示第1影像91之一例之圖。於圖2所例示之第1影像91中，對經染色之區域92(即染色細胞集合之區域，以下亦稱為「染色區域92」)標註平行斜線。

再者，於第1影像91中未能確認到染色細胞之情形、及第1影像中之染色細胞之分佈不具有特異性之情形時，認為上述第1初級染色條件不合適。於此情形時，亦可重新實施步驟S11～S12。具體而言，將試驗標本洗淨，去除試驗標本上之初級抗體、二級抗體及顯色劑。又，亦可於將試驗標本洗淨後，進行試驗標本上之初級抗體及二級抗體之失活。其後，變更第1初級染色條件，進行步驟S11～S13。

若步驟S13結束，則洗淨試驗標本，去除試驗標本上之第1初級抗體、二級抗體及顯色劑。又，亦可進行試驗標本上之第1初級抗體及二級抗體之失活(步驟S14)。亦即，於步驟S14中，針對試驗標本上之第1初級抗體進行失活及去除中之至少一者。試驗標本之洗淨例如使用磷酸緩衝生理鹽水(PBS)或Tris緩衝生理鹽水(TBS)進行。試驗標本之洗淨亦可進行數次。第1初級抗體及二級抗體之失活例如藉由將試驗標本浸漬於沸水中之熱處理等來進行。第1初級抗體及二級抗體之失活亦可藉由其他各種方法來進行。顯色劑之去除(準確而言，源自顯色劑之顯色沉澱物所導致之顏色之去除)亦可藉由各種方法來進行。於顯色劑為AEC之情形時，例如藉由將試驗標本浸漬於數個濃度之乙醇等醇中進行洗淨而進行顯色劑之去除。步驟S14中之試驗標本之洗淨以及第1初級抗體及二級抗體之去除及/或失活係於與上述第N次免疫染色和第N＋1次免疫染色之間實施之預定之洗淨或失活相同之處理條件下進行。

若步驟S14結束，則於研究出在上述連續多重免疫染色法之第N＋1次免疫染色中實施之染色條件下，對試驗標本進行抗原活化處理及初級抗體之賦予(步驟S15)。步驟S15中賦予之初級抗體係於上述第N＋1次免疫染色中使用之初級抗體，以下亦稱為「第2初級抗體」。又，以下亦將步驟S15中之染色條件稱為「第2染色條件」或「第2初級染色條件」。第2初級抗體係源自與上述第1初級抗體同動物種之抗體，係與第1初級抗體不同種類之抗體。第2初級染色條件可與上述第1初級染色條件相同，亦可不同。再者，於步驟S15中之抗原活化處理及步驟S14中之初級抗體及二級抗體之失活均為熱處理之情形時，亦可藉由1次熱處理並行地進行初級抗體及二級抗體之失活(步驟S14)與抗原活化處理(步驟S15)。

若步驟S15結束，則於上述第N＋1次免疫染色中實施之預定之二級染色條件下，對試驗標本進行二級抗體及顯色劑之賦予(步驟S16)。步驟S16中使用之二級抗體及顯色劑係於上述第N＋1次免疫染色中使用之二級抗體及顯色劑，係與步驟S12中使用之二級抗體及顯色劑相同種類者。步驟S16中之二級染色條件可與步驟S12中之二級染色條件相同，亦可不同。

於試驗標本上，步驟S11中賦予之第1初級抗體所結合之細胞(亦即使用第1初級抗體進行染色之細胞)與步驟S15中賦予之第2初級抗體所結合之細胞(亦即使用第2初級抗體進行染色之細胞)不同。因此，於良好地進行步驟S14中之第1初級抗體之去除及/或失活之情形時，步驟S16中之藉由賦予二級抗體及顯色劑而被染色之細胞所存在之區域與步驟S12中之藉由賦予二級抗體及顯色劑而被染色之細胞所存在之區域不同而不重疊。另一方面，於未良好地進行步驟S14中之初級抗體之去除及/或失活之情形時，步驟S16中之藉由賦予二級抗體及顯色劑而被染色之細胞所存在之區域之一部分與步驟S12中之藉由賦予二級抗體及顯色劑而被染色之細胞所存在之區域重疊。

若步驟S16結束，則拍攝步驟S15～S16中經染色之試驗標本之一部分或全部而獲取染色影像(以下亦稱為「第2影像」)(步驟S17)。圖3係表示第2影像93之一例之圖。於圖3所例示之第2影像93中，對經染色之區域94(亦即染色細胞集合之區域，以下亦稱為「染色區域94」)標註平行斜線。

其後，於第1影像91及第2影像93各者中檢測染色細胞。然後，基於染色細胞之檢測結果，判定步驟S11中之第1初級染色條件及步驟S15中之第2初級染色條件各者是否合適(步驟S18)。

步驟S18中，例如藉由作業者對第1影像91及第2影像93進行目視觀察，而確認(即檢測)第1影像91及第2影像93各者中之染色細胞之分佈。具體而言，確認於第1影像91中細胞是否被特異性地染色，又，確認於第2影像93中細胞是否被特異性地染色。進而，將第1影像91與第2影像93進行比較，確認第1影像91中經染色之細胞於第2影像93中是否未染色。

然後，於確認第1影像91及第2影像93各者中細胞被特異性地染色(亦即染色細胞特異性地分佈)，且第1影像91中之染色細胞於第2影像93中未染色之情形時，判定為步驟S11中之賦予第1初級抗體之第1初級染色條件、及步驟S15中之賦予第2初級抗體之第2初級染色條件合適。

另一方面，於其他情形時，判斷為第1初級染色條件及/或第2初級染色條件不合適。例如，於第1影像91中幾乎不存在染色細胞之情形時，認為步驟S11中賦予之第1初級抗體之濃度不足及/或反應時間不足。又，於第2影像93中幾乎不存在染色細胞之情形時，認為步驟S15中賦予之第2初級抗體之濃度不足及/或反應時間不足。於第1影像91及第2影像93之比較中，在第1影像91中之染色細胞之一部分或全部於第2影像93中亦被染色之情形時(亦即第1影像91之染色區域92與第2影像93之染色區域94至少一部分重疊之情形時)，認為步驟S11中賦予之第1初級抗體及/或步驟S15中賦予之第2初級抗體之濃度過大及/或反應時間過多。

於步驟S18中判斷為第1初級染色條件不合適之情形時，例如準備新的試驗標本，在變更第1初級染色條件後進行步驟S11～S18。又，於步驟S18中判斷為第2初級染色條件不合適之情形時，例如準備新的試驗標本，在變更第2初級染色條件後進行步驟S11～S18。然後，一面更換試驗標本一面反覆進行步驟S11～S18，直至獲取合適之第1初級染色條件及第2初級染色條件。再者，亦可不準備新的試驗標本，例如仔細地對步驟S18中判斷為不合適之試驗標本進行洗淨及熱處理(即失活處理)，在使該試驗標本上之初級抗體、二級抗體及顯色劑幾乎完全去除及/或失活後，進行步驟S11～S18。

於步驟S18中，當獲取上述第N次及第N＋1次免疫染色中之合適之染色條件時，例如使用獲取該染色條件所使用之試驗標本，評價連續多重免疫染色法中實施之數次免疫染色中之第N＋1次及第N＋2次免疫染色中之染色條件是否合適。具體而言，對結束步驟S18之試驗標本進行例如洗淨及/或熱處理而使初級抗體、二級抗體及顯色劑去除及/或失活，其後，於第N＋1次及第N＋2次免疫染色中實施之預定之染色條件下進行步驟S11～S18。

於上述染色條件評價方法中，可針對連續多重免疫染色法中實施之數次免疫染色之全部依次進行染色條件是否合適之評價，亦可針對該數次免疫染色中之一部分免疫染色依次進行染色條件是否合適之評價。或者，亦可針對上述數次免疫染色中之一部分免疫染色，使用一試驗標本進行染色條件是否合適之評價，針對另一部分免疫染色，使用另一試驗標本進行染色條件是否合適之評價。

步驟S18中，例如亦可藉由利用電腦5執行圖4所示之程式572，判定步驟S11中之第1初級染色條件及步驟S15中之第2初級染色條件是否合適。

電腦5具有一般電腦系統之構成，包含中央處理單元(CPU，Central Processing Unit)51、唯讀記憶體(ROM，Read Only Memory)52、隨機存取記憶體(RAM，Random Access Memory)53、固定磁碟54、顯示器55、輸入部56、讀取裝置57、通信部58、圖形處理器(GPU，Graphics Processing Unit)59、及匯流排50。CPU51進行各種運算處理。GPU59進行關於影像處理之各種運算處理。ROM52記憶基本程式。RAM53記憶各種資訊。固定磁碟54進行資訊記憶。顯示器55係進行影像等各種資訊之顯示之顯示部。

輸入部56具備受理來自操作者之輸入之鍵盤56a及滑鼠56b。讀取裝置57自光碟、磁碟、磁光碟、記憶卡等電腦可讀取之記錄媒體571進行資訊之讀取。顯示器55、鍵盤56a、滑鼠56b及讀取裝置57經由介面I/F而連接於匯流排50。通信部58於與電腦5之外部之裝置等之間收發信號。匯流排50係將CPU51、GPU59、ROM52、RAM53、固定磁碟54、顯示器55、輸入部56、讀取裝置57及通信部58連接之信號電路。

電腦5中，預先經由讀取裝置57自記錄媒體571讀出程式572並記憶於固定磁碟54。程式572亦可經由網路而記憶於固定磁碟54。CPU51及GPU59依照染色條件評價用程式572一面利用RAM53或固定磁碟54一面執行運算處理。CPU51及GPU59於電腦5中作為運算部發揮功能。除CPU51及GPU59以外，亦可採用作為運算部發揮功能之其他構成。

圖5係表示藉由電腦5執行步驟S18之情形時之具體流程的圖。首先，將步驟S13中獲取之第1影像91及步驟S17中獲取之第2影像93記憶於藉由RAM53及固定磁碟54等而實現之記憶部(步驟S181)。

繼而，藉由利用CPU51、GPU59、ROM52、RAM53、固定磁碟54及該等之周邊構成所實現之判定部，於第1影像91及第2影像93各者中檢測染色細胞，基於染色細胞之檢測結果判定第1初級染色條件及第2初級染色條件是否合適(步驟S182)。

具體而言，藉由上述判定部，確認於第1影像91中細胞是否被特異性地染色，又，確認於第2影像93中細胞是否被特異性地染色。進而，藉由該判定部將第1影像91與第2影像93進行比較，確認第1影像91中經染色之細胞於第2影像93中是否未染色。

第1影像91及第2影像93各者中細胞是否被特異性地染色之確認(亦即第1影像91及第2影像93中之染色細胞之檢測)例如係使用藉由機器學習所製作之已學習模型來進行。該已學習模型係藉由使用學習用影像之集合即學習用資料集對染色細胞分佈之特異性檢測用初期模型進行機器學習而製作。該學習用資料集包含特異性地分佈有染色細胞之標本之影像、及未特異性地分佈染色細胞之標本之影像。該機器學習例如係使用神經網路之深度學習。利用該深度學習之學習例如係使用U-Net來進行。再者，該機器學習亦可藉由深度學習以外之方法來進行。

再者，步驟S182中，第1影像91及第2影像93各者中細胞是否被特異性地染色之確認未必使用已學習模型來進行，亦可藉由利用電腦5執行之其他方法來進行。

於進行上述第1影像91與第2影像93之比較時，藉由上述判定部進行第1影像91與第2影像93之位置校正。第1影像91與第2影像93之位置校正例如可藉由公知之影像校準技術自動地進行，亦可由作業者手動進行。

上述中，使用第1初級抗體之染色(步驟S11～S12)及使用第2初級抗體之染色(步驟S15～S16)係與連續多重免疫染色法中實施之數次免疫染色中連續之2次(例如第N次及第N＋1次)免疫染色對應並以此進行了說明，但並不限定於此。該連續多重免疫染色法中，只要使用第2初級抗體之染色於使用第1初級抗體之染色之後進行即可，亦可於使用第1初級抗體之染色與使用第2初級抗體之染色之間進行使用另一初級抗體之免疫染色。於此情形時，在上述染色條件評價方法中，亦同樣地於步驟S14與步驟S15之間進行另一初級抗體之賦予、與該另一初級抗體對應之二級抗體及顯色劑之賦予、以及該另一初級抗體等之去除及/或失活。再者，該另一初級抗體例如係源自與第1初級抗體及第2初級抗體不同之動物種之抗體。

如以上所說明，評價免疫染色法中之標本之染色條件的染色條件評價方法包括：於第1染色條件(即第1初級染色條件)下對試驗標本賦予第1初級抗體之步驟(步驟S11)；於步驟S11之後，對試驗標本賦予二級抗體及顯色劑之步驟(步驟S12)；於步驟S12之後，拍攝試驗標本而獲取第1影像91之步驟(步驟S13)；於步驟S13之後，使試驗標本上之第1初級抗體失活或去除之步驟(步驟S14)；於步驟S14之後，於第2染色條件(即第2初級染色條件)下對試驗標本賦予第2初級抗體之步驟(步驟S15)；於步驟S15之後，對試驗標本賦予上述二級抗體及上述顯色劑之步驟(步驟S16)；於步驟S16之後，拍攝試驗標本而獲取第2影像93之步驟(步驟S17)；及於步驟S17之後，基於第1影像91及第2影像93中之染色細胞之檢測結果，判定第1染色條件及第2染色條件是否合適之步驟(步驟S18)。

試驗標本中，使用第1初級抗體染色之細胞與使用第2初級抗體染色之細胞不同。步驟S18中，於第1影像91中，試驗標本上之細胞被特異性地染色，且於第2影像93中，試驗標本上之與第1影像91不同之細胞被特異性地染色，且第1影像91中經染色之試驗標本上之細胞於第2影像93中未染色之情形時，判定為第1染色條件及第2染色條件合適。藉此，如上所述，能夠容易地判定依次實施之2次免疫染色中之第1染色條件及第2染色條件是否合適。

如上所述，步驟S18中，第1影像91中之染色細胞之檢測及第2影像93中之染色細胞之檢測較佳為分別使用藉由機器學習所製作之已學習模型來進行。藉此，能夠自動且精度良好地確認第1影像91及第2影像93中之染色細胞之有無。

如上所述，第1初級抗體及第2初級抗體係於對一標本之連續多重免疫染色中使用，該連續多重免疫染色中，較佳為使用第2初級抗體之染色於使用第1初級抗體之染色之後進行。藉此，能夠於設定為合適之第1染色條件及第2染色條件下實施連續多重免疫染色。

上述程式572係使電腦評價免疫染色法中之標本之染色條件的電腦可讀取之程式。程式572係使電腦執行如下步驟：記憶經染色之試驗標本之影像即第1影像91、及於與第1影像91不同之條件下被染色之試驗標本之影像即第2影像93的步驟(步驟S181)；及基於第1影像91及第2影像93中之染色細胞之檢測結果，判定第1染色條件及第2染色條件(即第1初級染色條件及第2初級染色條件)是否合適之步驟(步驟S182)。第1影像91係於對試驗標本在第1染色條件下賦予第1初級抗體，進而賦予二級抗體及顯色劑之狀態下拍攝而得者。第2影像93係於進行第1影像91之獲取及試驗標本上之第1初級抗體之失活或去除之後，對該試驗標本於第2染色條件下賦予第2初級抗體，進而賦予上述二級抗體及上述顯色劑之狀態下拍攝而得者。

於試驗標本中，使用第1初級抗體進行染色之細胞與使用第2初級抗體進行染色之細胞不同。步驟S182中，於第1影像91中，試驗標本上之細胞被特異性地染色，且於第2影像93中，試驗標本上之與第1影像91不同之細胞被特異性地染色，且第1影像91中經染色之試驗標本上之細胞於第2影像93中未染色之情形時，判定為第1染色條件及第2染色條件合適。藉此，如上所述，能夠容易地判定依次實施之2次免疫染色中之第1染色條件及第2染色條件是否合適。

其次，對本發明之第2實施形態之染色條件評價方法進行說明。圖6係表示第2實施形態之染色條件評價方法中使用之載玻片81之俯視圖。該染色條件評價方法中，關於步驟S11及步驟S15中之初級染色條件之組合，使用1個載玻片81並行地判定2組組合之各者是否合適。

如圖6所示，於載玻片81配置上述試驗標本82及另一試驗標本83。試驗標本83係與試驗標本82同樣地自與藉由上述連續多重免疫染色法進行染色及解析之預定標本相同之組織獲取者。再者，亦可於載玻片81上配置3個以上之試驗標本。

以下，參照圖1對使用載玻片81進行之染色條件評價流程進行說明。首先，於步驟S11之前，藉由製作圖6所例示之1個載玻片81而準備。繼而，於步驟S11中，與對試驗標本82之抗原活化處理及第1初級抗體之賦予大致並行地，亦進行對試驗標本83之抗原活化處理及第1初級抗體之賦予。對試驗標本83賦予之第1初級抗體與對試驗標本82賦予之第1初級抗體相同。步驟S11中，於第3初級染色條件下對試驗標本83賦予第1初級抗體。第3初級染色條件可與對試驗標本82賦予第1初級抗體時之第1初級染色條件相同，亦可不同。第3初級染色條件例如亦可為自第1初級染色條件中使既定之參數(例如第1初級抗體之濃度或反應時間)偏移既定量而得者。

其次，於步驟S12中，與對試驗標本82賦予二級抗體及顯色劑大致並行地，亦對試驗標本83賦予二級抗體及顯色劑。藉此，於試驗標本83中，第1初級抗體所結合之特定細胞等亦被染色。對試驗標本83賦予之二級抗體及顯色劑與對試驗標本82賦予之二級抗體及顯色劑相同。步驟S12中，例如於與對試驗標本82之二級染色條件相同之染色條件下對試驗標本83進行二級抗體及顯色劑之賦予。

步驟S13中，與第1影像91之獲取大致並行地，拍攝試驗標本83而獲取第3影像。步驟S14中，與試驗標本82上之初級抗體、二級抗體及顯色劑之去除及/或失活大致並行地，亦進行試驗標本83上之初級抗體、二級抗體及顯色劑之去除及/或失活。

繼而，步驟S15中，與對試驗標本82之抗原活化處理及第2初級抗體之賦予大致並行地，亦進行對試驗標本83之抗原活化處理及第2初級抗體之賦予。對試驗標本83賦予之第2初級抗體與對試驗標本82賦予之第2初級抗體相同。步驟S15中，於第4初級染色條件下對試驗標本83賦予第2初級抗體。第4初級染色條件可與對試驗標本82賦予第2初級抗體時之第2初級染色條件相同，亦可不同。第4初級染色條件例如亦可為自第2初級染色條件中使既定參數(例如第2初級抗體之濃度或反應時間)偏移既定量而得者。

再者，於第4初級染色條件與第2初級染色條件相同之情形時，第3初級染色條件與第1初級染色條件不同。又，於第3初級染色條件與第1初級染色條件相同之情形時，第4初級染色條件與第2初級染色條件不同。亦即，至少第3初級染色條件與第1初級染色條件不同，第4初級染色條件與第2初級染色條件不同。

其次，於步驟S16中，與對試驗標本82賦予二級抗體及顯色劑大致並行地，亦對試驗標本83賦予二級抗體及顯色劑。對試驗標本83賦予之二級抗體及顯色劑與對試驗標本82賦予之二級抗體及顯色劑相同。步驟S16中，例如於與對試驗標本82之二級染色條件相同之染色條件下，對試驗標本83進行二級抗體及顯色劑之賦予。步驟S17中，與第2影像93之獲取大致並行地，拍攝試驗標本83而獲取第4影像。

其後，步驟S18中，與判定試驗標本82之第1及第2初級染色條件是否合適大致並行地，基於第3影像及第4影像中之染色細胞之檢測結果，判定試驗標本83之第3及第4初級染色條件是否合適。具體而言，確認第3影像中細胞是否被特異性地染色，又，確認第4影像中細胞是否被特異性地染色。進而，將第3影像與第4影像進行比較，確認第3影像中經染色之細胞於第4影像中是否未染色。

然後，於確認第3影像及第4影像各者中細胞被特異性地染色(亦即染色細胞特異性地分佈)，且第3影像中之染色細胞於第4影像中未染色之情形時，判定為對試驗標本83賦予第1初級抗體之第3初級染色條件、及對試驗標本83賦予第2初級抗體之第4初級染色條件合適。另一方面，於其他情形時，與上述同樣地，判斷為第3初級染色條件及/或第4初級染色條件不合適。再者，上述試驗標本82及試驗標本83亦可分別設置於不同之載玻片81上。

如以上所說明般，於第2實施形態之染色條件評價方法中，在步驟S11之前，準備配置有試驗標本82及另一試驗標本83之載玻片81。步驟S11中，於第3染色條件下對另一試驗標本83賦予第1初級抗體。步驟S12中，亦對另一試驗標本83賦予二級抗體及顯色劑。步驟S13中，拍攝另一試驗標本83而獲取第3影像。步驟S14中，亦使另一試驗標本83上之第1初級抗體失活或去除。步驟S15中，於第4染色條件下對另一試驗標本83賦予第2初級抗體。步驟S16中，亦對另一試驗標本83賦予二級抗體及顯色劑。步驟S17中，拍攝另一試驗標本83而獲取第4影像。

步驟S18中，亦基於第3影像及第4影像中之染色細胞之檢測結果，判定第3染色條件及第4染色條件是否合適。步驟S18中，於第3影像中，另一試驗標本83上之細胞被特異性地染色，且於第4影像中，另一試驗標本83上之與第3影像不同之細胞被特異性地染色，且第3影像中經染色之另一試驗標本83上之細胞於第4影像未染色之情形時，判定為第3染色條件及第4染色條件合適。藉此，關於步驟S11及步驟S15中之初級染色條件之組合，能夠並行地判定2組組合之各者是否合適。

又，亦可於載玻片81配置3個以上之試驗標本。而且，關於步驟S11及步驟S15中之初級染色條件之組合，亦可以互不相同之組合對該3個以上之試驗標本賦予第1及第2初級抗體。藉此，關於步驟S11及步驟S15中之初級染色條件之組合，能夠並行地判定3組以上之組合各者是否合適。

於上述染色條件評價方法及程式中，能夠進行各種變更。

亦可省略步驟S11、S15中之抗原活化處理。

上述染色條件評價方法未必用於連續多重免疫染色法中之染色條件之評價，亦可用於其他免疫染色法中之染色條件之評價。又，上述標本及試驗標本未必為源自生物之標本，亦可為其他標本。

上述實施形態及各變形例中之構成可在互不矛盾之範圍內適當組合。

雖然已對本發明詳細地描寫並加以說明，但上述說明係例示性而非限定性者。因此，可謂只要不脫離本發明之範圍，則能夠實現多種變形或態樣。

5:電腦 50:匯流排 51:CPU 52:ROM 53:RAM 54:固定磁碟 55:顯示器 56:輸入部 56a:鍵盤 56b:滑鼠 57:讀取裝置 58:通信部 59:GPU 81:載玻片 82,83:試驗標本 91:第1影像 92,94:染色區域 93:第2影像 571:記錄媒體 572:程式 S11～S18,S181～S182:步驟

圖1係表示第1實施形態之染色條件評價流程之圖。 圖2係表示第1影像之一例之圖。 圖3係表示第2影像之一例之圖。 圖4係表示電腦構成之圖。 圖5係表示染色條件評價方法中之評價流程之一部分之圖。 圖6係表示第2實施形態之染色條件評價方法中使用之載玻片之俯視圖。

Claims (5)

1. 一種染色條件評價方法，其係評價免疫染色法中之標本之染色條件者，且包括： a)於第1染色條件下對試驗標本賦予第1初級抗體之步驟； b)於前述a)步驟之後，對前述試驗標本賦予二級抗體及顯色劑之步驟； c)於前述b)步驟之後，拍攝前述試驗標本而獲取第1影像之步驟； d)於前述c)步驟之後，使前述試驗標本上之前述第1初級抗體失活或去除之步驟； e)於前述d)步驟之後，於第2染色條件下對前述試驗標本賦予第2初級抗體之步驟； f)於前述e)步驟之後，對前述試驗標本賦予前述二級抗體及前述顯色劑之步驟； g)於前述f)步驟之後，拍攝前述試驗標本而獲取第2影像之步驟；及 h)於前述g)步驟之後，基於前述第1影像及前述第2影像中之染色細胞之檢測結果，判定前述第1染色條件及前述第2染色條件是否合適之步驟； 使用前述第1初級抗體進行染色之細胞與使用前述第2初級抗體進行染色之細胞不同， 前述h)步驟中，於前述第1影像中，前述試驗標本上之細胞被特異性地染色，且於前述第2影像中，前述試驗標本上之與前述第1影像不同之細胞被特異性地染色，且前述第1影像中經染色之前述試驗標本上之細胞於前述第2影像中為未染色之情形時，判定為前述第1染色條件及前述第2染色條件合適。
2. 如請求項1之染色條件評價方法，其中， 前述h)步驟中，前述第1影像中之染色細胞之檢測及前述第2影像中之染色細胞之檢測係分別使用藉由機器學習所製作之已學習模型來進行。
3. 如請求項1或2之染色條件評價方法，其中， 於前述a)步驟之前，準備配置有前述試驗標本及另一試驗標本之載玻片， 前述a)步驟中，於第3染色條件下對前述另一試驗標本賦予前述第1初級抗體， 前述b)步驟中，亦對前述另一試驗標本賦予前述二級抗體及前述顯色劑， 前述c)步驟中，拍攝前述另一試驗標本而獲取第3影像， 前述d)步驟中，亦使前述另一試驗標本上之前述第1初級抗體失活或去除， 前述e)步驟中，於第4染色條件下對前述另一試驗標本賦予前述第2初級抗體， 前述f)步驟中，亦對前述另一試驗標本賦予前述二級抗體及前述顯色劑， 前述g)步驟中，拍攝前述另一試驗標本而獲取第4影像， 前述h)步驟中，亦基於前述第3影像及前述第4影像中之染色細胞之檢測結果，判定前述第3染色條件及前述第4染色條件是否合適， 前述h)步驟中，於前述第3影像中，前述另一試驗標本上之細胞被特異性地染色，且於前述第4影像中，前述另一試驗標本上之與前述第3影像不同之細胞被特異性地染色，且前述第3影像中經染色之前述另一試驗標本上之細胞於前述第4影像中為未染色之情形時，判定為前述第3染色條件及前述第4染色條件合適。
4. 如請求項1或2之染色條件評價方法，其中， 前述第1初級抗體及前述第2初級抗體係於對一標本之連續多重免疫染色中使用， 前述連續多重免疫染色中，使用前述第2初級抗體之染色係於使用前述第1初級抗體之染色之後進行。
5. 一種電腦可讀取且使電腦評價免疫染色法中之標本之染色條件之程式，其係使電腦執行如下步驟： i)記憶屬於經染色之試驗標本之影像的第1影像、及屬於與前述第1影像不同之條件下被染色之前述試驗標本之影像的第2影像；及 j)基於前述第1影像及前述第2影像中之染色細胞之檢測結果，判定染色條件是否合適； 前述第1影像係於對前述試驗標本在第1染色條件下賦予第1初級抗體，進而賦予二級抗體及顯色劑之狀態下拍攝而得者， 前述第2影像係於進行前述第1影像之獲取及前述試驗標本上之前述第1初級抗體之失活或去除之後，對前述試驗標本在第2染色條件下賦予第2初級抗體，進而賦予前述二級抗體及前述顯色劑之狀態下拍攝而得者， 使用前述第1初級抗體進行染色之細胞與使用前述第2初級抗體進行染色之細胞不同， 前述j)步驟中，於前述第1影像中，前述試驗標本上之細胞被特異性地染色，且於前述第2影像中，前述試驗標本上之與前述第1影像不同之細胞被特異性地染色，且前述第1影像中經染色之前述試驗標本上之細胞於前述第2影像中為未染色之情形時，判定為前述第1染色條件及前述第2染色條件合適。