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TWI839002B - 光動力環境消毒的方法、用於光動力環境消毒之水溶性光敏組成物及其用於製備環境消毒組成物之用途 - Google Patents

光動力環境消毒的方法、用於光動力環境消毒之水溶性光敏組成物及其用於製備環境消毒組成物之用途 Download PDF

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TWI839002B
TWI839002B TW111146535A TW111146535A TWI839002B TW I839002 B TWI839002 B TW I839002B TW 111146535 A TW111146535 A TW 111146535A TW 111146535 A TW111146535 A TW 111146535A TW I839002 B TWI839002 B TW I839002B
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余俊強
林明彥
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Abstract

本發明是有關於一種光動力環境消毒的方法、用於光動力環境消毒之水溶性光敏組成物及其用於製備環境消毒組成物之用途。在此方法中，對由水、低濃度的甲烯藍及過氧化氫所組成之水溶性光敏組成物進行短時間的霧化步驟及低光劑量的白光的光照步驟後，此二步驟可依序進行或同時並行，以獲得光活化霧化微粒。獲得之光活化霧化微粒可有效抑制環境中病毒的致病性及/或感染性，因此可應用於光動力環境消毒的方法及於製備環境消毒組成物之用途。

Description

光動力環境消毒的方法、用於光動力環境消毒之水溶性光敏組成物及其用於製備環境消毒組成物之用途
本發明是有關於一種環境消毒的方法及組成物，特別是關於一種光動力環境消毒的方法、用於光動力環境消毒之水溶性光敏組成物及其用於製備環境消毒組成物之用途。
現代生活中，人們及貨物的運輸變得更加快速而便利，但也加速了病原菌的傳播。近年來一波波的嚴重傳染病爆發說明傳染病仍威脅著人們的生活。空氣傳染疾病及/或接觸傳染疾病之爆發，如於2019年爆發的嚴重特殊傳染性肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)，更凸顯了環境消毒的需求。
環境消毒的習知方法包含化學清洗法、燻蒸法及/ 或光照法，其中化學清洗法包含使用化學藥品(如：界面活性劑、漂白水、酒精、過氧化氫、過氧乙酸及季胺鹽)清洗環境表面，燻蒸法包含暴露環境表面於環氧乙烷(ethylene oxide，EtO)及/或臭氧中，且光照法包含暴露環境表面於短波長的光(如：伽馬射線及/或紫外線)。然而，上述習知方法可能會傷害人體及/或環境。
光動力療法(photodynamic therapy，簡稱PDT)是一種光照治療(phototherapy)，其係將無毒性的光敏劑全身性給予或施予身體特定小區域患部後，再暴露於特定波長的光下，其中光敏劑吸收足夠的光劑量，可產生活性含氧物(reactive oxygen species，簡稱ROS)及單價氧(singlet oxygen)，對特定小區域的癌細胞或病原體具有光毒性，從而達到治療效果。然而，對於大面積的環境消毒而言，若要產生足夠劑量的ROS及單價氧，需要提供足夠劑量的光敏劑、高光劑量及特定波長的光，這提高光敏劑應用於環境消毒的難度。
因此，亟需一種光動力環境消毒的方法及組成物，以解決上述問題。
本發明之一態樣是提供一種光動力環境消毒的方法，其係對水溶性光敏組成物進行霧化步驟及光照步驟後，將獲得之光活化霧化微粒於施用環境中的物體表面或空氣，從而降低環境中的物體表面或空氣的病毒之致病性及/或 感染性。
本發明之又一態樣是提供一種光動力環境消毒之水溶性光敏組成物，其係由甲烯藍、過氧化氫及水所組成。
本發明之再一態樣是有關於一種水溶性光敏組成物用於製備環境消毒組成物之用途，其中水溶性光敏組成物經霧化步驟及光照步驟後，獲得之光活化霧化微粒可降低環境中物體表面或空氣病毒之致病性及/或感染性。
根據本發明之上述態樣，提出一種光動力環境消毒的方法。首先，對水溶性光敏組成物以每分鐘0.1mL至150mL之速率進行霧化步驟達1秒至300秒，以於空間中形成霧化微粒。上述水溶性光敏組成物可例如係由大於0mM至小於50mM之甲烯藍、大於0重量%至1重量%之過氧化氫(H2O2)及平衡量之水所組成。
接著，利用0.01J/cm2至300J/cm2之白光對霧化微粒進行光照步驟達一光照時間，以形成光活化霧化微粒。然後，施用光活化霧化微粒於空間之物體表面或空氣，其中相較於未施用光活化霧化微粒的空間之物體表面或空氣，施用光活化霧化微粒的空間之物體表面或空氣的病毒之致病性及/或感染性係降低至少99.99%。
在本發明的一實施例中，霧化微粒的粒徑係0.1μm至100μm。在本發明的一實施例中，空間與霧化微粒的總體積比例為1：0.0001至1：0.01。在本發明的一實施例中，白光之光源係選自於由自然光、發光二極體、日光燈、鹵素燈、白熾燈、雷射及上述任意組合所組成之 一族群。在本發明的一實施例中，白光的波長包含400nm至760nm。
根據本發明之又一態樣，提出一種用於光動力環境消毒之水溶性光敏組成物，其中此水溶性光敏組成物係由大於0mM至小於50mM之甲烯藍，大於0重量%至1重量%之過氧化氫及平衡量之水所組成。
根據本發明之再一態樣，提出一種水溶性光敏組成物用於製備環境消毒組成物之用途，其中水溶性光敏組成物係由大於0mM至小於50mM之甲烯藍、大於0重量%至1重量%之過氧化氫及平衡量之水所組成，水溶性光敏組成物經霧化步驟及光照步驟後，所獲得之光活化霧化微粒係施用於空間中的物體表面或空氣。相較於未施用光活化霧化微粒的空間中之物體表面，施用光活化霧化微粒於空間中的物體表面的病毒之致病性及/或感染性係降低至少99.99%，且光照步驟係以0.01J/cm2至300J/cm2之白光進行一光照時間。
在本發明的一實施例中，相較於未施用光活化霧化微粒的空間中之空氣，施用光活化霧化微粒的空間中之空氣的病毒之致病性及/或感染性係降低至少99.99%。在本發明的一實施例中，上述病毒係選自於由黃病毒科(Flaviviridae)、菲爾斯病毒科(Fiersviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)及上述任意組合所組成之一族群。在本發明的一實施例中，上述病毒可例如為選自於由C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、登革熱 病毒(dengue virus，DENV)、噬菌體MS2(MS2 bacteriophage)、嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)及上述任意組合所組成之一族群。
應用本發明之光動力環境消毒的方法，其使用水溶性且為低劑量之光敏劑，因此不易殘留而危害人體及/或環境。其次，將水溶性光敏組成物應用於光動力環境消毒之方法，可在短時間及低光劑量的白光條件下，有效抑制環境物體表面或空氣中病毒的致病性及/或感染性，且不需使用特定波長的光，對光源設備的要求低，而可廣泛應用。
100:方法
110,130,150:步驟
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：[圖1]係繪示根據本發明之一實施例之光動力環境消毒的方法之流程圖。
[圖2]係根據本發明之一實施例之20J/cm2光照步驟進行與否及過氧化氫添加與否所形成之霧化微粒及/或光活化霧化微粒對HCV的相對毒力之直條圖。
[圖3]係根據本發明之一實施例之20J/cm2光照步驟進行與否及過氧化氫添加與否所形成之霧化微粒及/或光活化霧化微粒對DENV的相對毒力之直條圖。
[圖4]係根據本發明之一實施例之不同光劑量對HCV的相對毒力之直條圖。
[圖5]係根據本發明之一實施例之不同光劑量對DENV的相對毒力之直條圖。
[圖6]係根據本發明之一實施例之低光劑量之光照步驟的有無及不同霧化時間對噬菌體MS2的毒力之直條圖。
[圖7]係根據本發明之一實施例之噬菌體MS2在空氣中經霧化微粒處理或光活化霧化微粒處理的毒力之直條圖。
[圖8A]、[圖8B]、[圖9A]、[圖9B]、[圖10A]、[圖10B]、[圖11A]及[圖11B]分別顯示根據本發明之空白組(圖8A、圖8B)、甲烯藍未添加黑暗組(圖9A、圖9B)、甲烯藍添加黑暗組(圖10A、圖10B)、甲烯藍添加光照組(圖11A、圖11B)的宿主細胞的可見光(圖8A、圖9A、圖10A及圖11A)及螢光(圖8B、圖9B、圖10B及圖11B)之顯微影像。
[圖12]係根據量化圖9B、圖10B及圖11B之宿主細胞的相對螢光強度之直條圖。
[圖13]係根據本發明之一實施例之噬菌體MS2在不同組別的手套上經低光劑量的光照步驟後的毒力之直條圖。
承上所述，本發明提供光動力環境消毒的方法、用於光動力環境消毒之水溶性光敏組成物及其用於製備環境消毒組成物之用途，其中水溶性光敏組成物經霧化步驟 及光照步驟後，所形成之光活化霧化微粒具有良好的環境消毒功效。
上述水溶性光敏組成物可例如為由光敏劑、過氧化氫(H2O2)及水所組成。光敏劑的種類無特別限制，較佳為水溶性光敏劑，可包含但不限於甲烯藍(methylene blue，MB)、結晶紫(crystal violet)、甲苯胺藍(toluidine blue)、吖啶橙(acridine orange)、伊紅(eosin)、孟加拉玫瑰紅(rose bengal)及/或靛氰綠(indocyanine green)等常見於光動力療法的水溶性光敏劑。如果使用油溶性光敏劑，如：8-甲氧基補骨脂素(8-methoxypsoralen)，需使用有機溶劑溶解光敏劑，反而會傷害人體及/或環境，因此本案排除使用油溶性光敏劑。
基於水溶性光敏組成物為100重量%，光敏劑的含量可例如為大於0mM至小於50mM。如果光敏劑的含量過高，在製作成本大幅提升之情況下，製得之水溶性光敏組成物所形成之光活化霧化微粒的環境消毒功效未再有顯著的提升。其次，光敏劑通常有顏色，如果光敏劑的含量過多，導致製得之水溶性光敏組成物的顏色太深，不僅會在後續光照步驟中，阻擋之光線的穿透，從而影響環境消毒功效，所形成之光活化霧化微粒沾附於物品表面(如：衣服及/或紙張)後，還會產生污漬的問題，雖然污漬在光照後會逐漸退去，但仍會造成使用上的不便。在一具體例中，水溶性光敏組成物之甲烯藍含量為0.001 mM至10mM，或0.001mM至1mM，抑或0.002mM至0.004mM。補充說明的是，甲烯藍的人體安全注射劑量上限為2mg/kg/單一劑量，以60公斤成人體重來算，每次可以使用120mg仍然在安全範圍，隔4小時可重複施予，但不超過7mg/kg為限，因此上述水溶性光敏組成物需數萬公升才會超過甲烯藍之最高安全劑量，表示水溶性光敏組成物使用的甲烯藍之劑量確實極低。
基於水溶性光敏組成物為100%，過氧化氫的含量可例如為大於0重量%至1重量%。過氧化氫為強氧化劑，因此如果過氧化氫的含量過高，製得之水溶性光敏組成物所形成之光活化霧化微粒接觸人體後，可能刺激人體的皮膚、眼睛及/或呼吸道等部位的黏膜。然而，如果過氧化氫的含量過低，製得之水溶性光敏組成物所形成之光活化霧化微粒的環境消毒功效不佳。在一具體例中，過氧化氫的含量可例如為0.025重量%至0.035重量%，較佳為0.03重量%。
過氧化氫為強氧化劑，與空氣接觸後容易降解，因此市售之3%雙氧水產品可選擇性添加穩定劑。在一些實施例中，基於雙氧水為100%，雙氧水可選擇性包含0.05重量%至1.00重量%的穩定劑，以提高過氧化氫的安定性。穩定劑的種類無特別限制，可例如為選自於由乙醯胺酚(acetaminophen)、乙醯苯胺(acetanilide)、非那西丁(phenacetin)、聚乙烯醇[poly(vinyl alcohol)，PVA]及上述組合所組成之一族群，或其他市 售用於傷口消毒之雙氧水中所含之穩定劑。本發明之水溶性光敏組成物的過氧化氫的含量低，因此水溶性光敏組成物可不添加或可選擇性添加上述穩定劑。
上述水溶性光敏組成物可應用於光動力環境消毒的方法。請參與圖1，其係繪示根據本發明之一實施例之光動力環境消毒的方法100之流程圖。如圖1之步驟110所示，對上述水溶性光敏組成物進行霧化步驟，以於空間形成霧化微粒。霧化步驟使用之設備無特別限制，可例如為霧化器或噴霧器。在一具體例中，霧化步驟使用超音波霧化器，以形成粒徑為0.1μm至100.0μm的霧化微粒，如：0.5μm至50μm，藉以增加霧化微粒的表面積。
霧化步驟的速率並無特別限制，可依需求調整，如：依據霧化步驟的時間。霧化步驟的速率可例如為每分鐘0.1mL至150mL，如：每分鐘15mL至25mL，抑或20mL。如果霧化步驟的速率過慢，短時間(如：50秒至100秒)內提供的霧化微粒將不足，環境消毒功效不佳。如果霧化步驟的速率過快，在製作成本大幅提升之情況下，環境消毒功效未再有顯著的提升。
接著，如圖1之步驟130所示，以可見光(如：紅光)、紅外線或白光對霧化微粒進行光照步驟達一光照時間，以形成光活化霧化微粒，其中光照步驟的光劑量可例如為0.01J/cm2至300J/cm2，或0.5J/cm2至50J/cm2，抑或2.5J/cm2至20J/cm2。如果可見光、 紅外線或白光的光劑量係小於上述範圍，環境消毒功效不佳。如果可見光、紅外線或白光的光劑量係大於上述範圍，於時間成本大幅提升之情況下，環境消毒功效亦未再有顯著的提升。
上述白光是連續光譜，或由至少兩種顏色(波長)的光所組成的連續光譜。在一些實施例中，白光的波長包含400nm至760nm。在一些實施例中，白光可例如為由紅光(波長為630nm至760nm)、綠光(波長為495nm至570nm)及藍光(波長為450nm至475nm)所組成。在另一些實施例中，白光可包含紅外線，其中紅外線的波長可例如為大於760nm至1mm。在一些實施例中，白光是由互補色的光所組成，如：紅光及青光(波長為475nm至495nm)。相較於習知光動力療法需使用特定的光源設備，以提供特定波長且高光劑量的光，上述光動力環境消毒的方法所需的光之光能量低，且不限制特的波長，因此對光源設備的要求較低。白光的光源種類無特別限制，可例如為選自於由自然光、發光二極體(light-emitting diode，LED)、日光燈、鹵素燈、白熾燈及上述任意組合所組成之一族群。
白光對霧化微粒之光照強度及光照時間無特別限制，可視光照設備及所需的光劑量而定。在一些實施例中，白光對霧化微粒之光照強度可例如為0.1mW/cm2至70mW/cm2，30mW/cm2至70mW/cm2，或者20mW/cm2至40mW/cm2，抑或60mW/cm2至70 mW/cm2。在一具體例中，當白光之光照強度為70mW/cm2時，光照時間為0.14秒至1.2小時，以提供霧化微粒約0.01J/cm2至約300J/cm2的光劑量。在一具體例中，當白光之光照強度為20mW/cm2至40mW/cm2時，光照時間為約1分鐘至2分鐘，以提供霧化微粒約2.5J/cm2的光劑量。在一具體例中，當白光之光照強度為67mW/cm2時，光照時間為37秒、2.5分鐘或5分鐘，以提供霧化微粒2.5J/cm2、10J/cm2或20J/cm2的光劑量。在另一具體例中，當白光包含光照強度為32.8mW/cm2且波長為32.8mW/cm2的紅光時，光照時間為9秒至19秒，以提供霧化微粒0.3J/cm2至0.6J/cm2的光劑量。
上述霧化微粒經光照步驟後，霧化微粒的光敏劑被激化，使得所形成之光活化霧化微粒產生活性含氧物，如：單價氧及自由基。因此，如圖1之步驟150所示，施用光活化霧化微粒於環境的物體表面或空氣，環境消毒功效佳。值得注意的是，經體外實驗證實，當對不含過氧化氫的霧化微粒提供0.3J/cm2的光劑量時，病毒的致病性及/或感染性降低99.9%(相當於3個對數，3 logs)，且當對不含過氧化氫的霧化微粒提供0.6J/cm2的光劑量時，病毒的致病性及/或感染性降低99.999999%至99.9999999%(相當於8個至9個對數，8 logs至9 logs)。其次，經體外實驗證實，含有過氧化氫之水溶性光敏組成物經霧化步驟後，所形成之霧 化微粒在未經光照步驟前，就可使病毒的致病性及/或感染性下降40%。由此可推論，當使用本發明之水溶性光敏組成物(含有過氧化氫)時，以更低光劑量之白光進行光照步驟，可使病毒的致病性及/或感染性降低至少99.99%。
本文所述之「環境」係指個體活動及/或物體擺放的空間。空間的地點無特別限制，可例如開放、半開放或密閉的空間，可包含但不限於疾病採檢站、實驗室門口、醫院、旅館、病房、運輸工具車廂、教室、辦公室、電梯、電影院、包廂、餐廳及/或機場。施用的空間對霧化微粒的總體積比例無特別限制，可例如為1：0.0001至1：0.01，以確使霧化微粒可充分接觸此空間的物體表面或空氣，從而到較佳的環境消毒功效。在一些實施例中，施用的空間之體積為1m3時，形成霧化微粒之水溶性光敏組成物的體積為1mL至500mL，或300mL至400mL(如：358mL)，抑或70mL至80mL(如：71.6mL)。在一具體例中，當霧化微粒之水溶性光敏組成物的體積為1mL時，空間之體積為1000mL至2000mL，如：1397mL。
本文所述之「環境消毒」係指使環境中的物體表面或空氣中病原體的傳染力降低，可包含但不限於降低病原體的致病性(pathogenicity)、感染性(infectivity)、生長活性及/或數量。本文所述之「環境消毒功效佳」係指相較於未施用光活化霧化微粒的環境 之物體表面或空氣，施用光活化霧化微粒的環境之物體表面上或空氣中的病原體之致病性及/或感染性降低至少99.9%(相當於3個對數，3 logs，美國對於消毒劑有效殺滅病毒的標準)或99.99%(相當於4個對數，4 logs，歐盟對於消毒劑有效殺滅病毒的標準)。在一較佳實施例中，施用光活化霧化微粒的環境之物體表面上或空氣中的病原體之致病性及/或感染性降低至少99.999%(相當於5個對數，5 logs)。
本文所述之「致病性」係指病原體在宿主體內引起疾病的能力，其中致病性的強弱程度可以相對病毒量及/或毒力(virulence)表示。相對病毒量是空間中的物體表面上或空氣(下簡稱為環境中)經光活化霧化微粒處理後的病毒量與未經處理的病毒量的百分比，其中病毒量可例如利用即時定量聚合酶連鎖反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，簡稱Q-PCR)評估。毒力可例如為利用溶斑試驗(plague assay)所產生的溶菌數量評估，並以每單位體積之病毒溶液產生的溶斑數(plaque forming unit，PFU/mL)表示病毒的毒力。
本文所述之「感染性」係指病原體進入細胞的難易度。感染性的評估方法無特別限制，可例如為例用可表現病毒之棘蛋白(spike protein，S蛋白)及報告基因之假病毒感染宿主細胞，並以宿主細胞之報告基因表現量評估感染性。報告基因的種類無特別限制，可例如為綠色螢 光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、β-半乳糖苷酶基因及/或螢光素酶(luciferase)。
上述病原體係指可致病的微生物或媒介物(agent)，可包含但不限於錯誤摺疊的蛋白質(普利昂，或稱為普恩蛋白，prion)、病毒、細菌、真菌及/或原生生物。依據病毒的結構，病毒可分為有套膜(envelope)病毒及無套膜病毒。值得注意的是，先前研究證實，相對於有套膜病毒，無套膜病毒對光動力環境消毒的方法有比較高的耐受性。由此可推論，如果光動力環境消毒的方法可有效抑制無套膜病毒，其可更有效的抑制有套膜病毒。
在一些實施例中，上述病毒可例如為病毒選自於由黃病毒科(Flaviviridae)、菲爾斯病毒科(Fiersviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)及上述任意組合所組成之一族群。在一些實施例中，黃病毒科(Flaviviridae)可包含但不限於C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)及/或登革熱病毒(dengue virus，DENV)，其為有套膜病毒，菲爾斯病毒科(Fiersviridae)可包含但不限於噬菌體MS2(MS2 bacteriophage)，其為無套膜病毒，且冠狀病毒科(Coronaviridae)可包含但不限於嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，其為有套膜病毒。
補充說明的是，上述步驟110、步驟130及步驟150的順序僅為一示例，可為依序進行及/或同時並行， 如：同時進行步驟110(即霧化步驟)及步驟130(即光照步驟)。在一實施例中，是先將霧化微粒施用於環境中的物體表面或空氣後，再進行光照步驟。
本發明之光動力環境消毒的方法僅需低劑量的甲烯藍、過氧化氫、低光劑量且非特定波長的光源，而可簡易的應用於生活中。舉例而言，可於出入口設置噴射裝置，以對水溶性光敏組成物進行霧化作用，從而施用霧化微粒於進出的物體及/或生物表面上。這些霧化微粒可在日光及/或任何人造白光下進行光照步驟，從而形成光活化霧化微粒。在另一實施例中，上述光動力環境消毒的方法可應用於攜式噴霧裝置，其中此可攜式噴霧裝置包含溶液裝置、霧化裝置及光源裝置，溶液裝置連接霧化裝置，且光源裝置是電性或機械性連接霧化裝置。溶液裝置是用以容置水溶性光敏組成物，霧化裝置是用以將溶液裝置中的水溶性光敏組成物進行霧化作用，以形成霧化微粒，且光源裝置是用以對霧化微粒進行光照步驟，以形成光活化霧化微粒。
以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
實施例一、製備水溶性光敏組成物
製備例1的水溶性光敏組成物是由0.004mM之甲烯藍、0.03重量%之過氧化氫及水所組成。製備例2 的水溶性光敏組成物是由0.004mM之甲烯藍及水所組成(不含過氧化氫)。
實施例二、評估水溶性光敏組成物所形成之光活化霧化微粒的環境消毒功效
1.建立實驗模型
在一個43cm×58cm×28cm的密閉空箱中進行測試。將96孔細胞培養盤及超音波霧化器(型號：北極熊超音波三頭霧化器UT-3，霧化速率為1.2L/小時)置於密閉空箱中。在96孔細胞培養盤的每孔預先加入0.1mL的病毒溶液，其中病毒溶液是以無菌磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline，PBS)配製，且病毒溶液含有108PFU/mL的病毒。超音波霧化器是設置於密閉空箱的底層部分，並利用超音波霧化器對水溶性光敏組成物進行霧化步驟達霧化時間，從而形成霧化微粒於此密閉空箱中，且此些霧化微粒之一部分會落入96孔細胞培養盤的病毒溶液中。
接著，取出96孔細胞培養盤，放置於光照強度為67mW/cm2的白色LED上100公分處，以控制96孔細胞培養盤底部接收到的光劑量(以下簡稱為盤底光劑量)。接下來，利用如序列識別號(SEQ ID NO)：1及SEQ ID NO：2所示的核酸片段分別作為上游引子及下游引子，以Q-PCR檢測HCV的病毒量，並利用如SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所示的核酸片段分別作為上游引子及下游引子，以Q-PCR檢測DENV的病毒量， 其中Q-PCR係以係使用習知方式進行，且不影響後續評估，不再贅述。
2.光照步驟及過氧化氫對環境消毒功效的影響
以光照步驟(盤底光劑量為20J/cm2)是否進行及水溶性光敏組成物是否添加過氧化氫(添加量為0.03重量%)為測試條件，評估光照步驟及過氧化氫對所形成之光活化霧化微粒之環境消毒功效的影響。過氧化氫未添加黑暗組使用製備例2的水溶性光敏組成物(不含過氧化氫)，但不進行光照步驟。過氧化氫添加黑暗組使用製備例1的水溶性光敏組成物(含過氧化氫)，但不進行光照步驟。過氧化氫未添加光照組使用製備例2的水溶性光敏組成物(不含過氧化氫)，但進行光照步驟。過氧化氫添加光照組使用製備例1的水溶性光敏組成物(含過氧化氫)，且進行光照步驟。過氧化氫未添加黑暗組、過氧化氫添加黑暗組、過氧化氫未添加光照組及過氧化氫添加光照組之霧化步驟的時間是150秒。
請參閱圖2及圖3，其中圖2係根據本發明之一實施例之光照步驟進行與否及過氧化氫添加與否所形成之霧化微粒及/或光活化霧化微粒對HCV的相對毒力之直條圖，且圖3係根據本發明之一實施例之光照步驟進行與否及過氧化氫添加與否所形成之霧化微粒及/或光活化霧化微粒對DENV的相對毒力之直條圖。圖2及圖3的橫軸表示組別，由左至右分別為過氧化氫未添加黑暗組、過氧化氫添加黑暗組、過氧化氫未添加光照組及過氧化氫添加 光照組，且縱軸表示相對病毒量(單位：%)，其中相對病毒量係過氧化氫添加黑暗組、過氧化氫未添加光照組及過氧化氫添加光照組的DNA定量與過氧化氫未添加黑暗組的DNA定量的百分率。
如圖2所述，相較於過氧化氫未添加黑暗組，過氧化氫添加黑暗組的HCV之相對病毒量降低約40%，顯示不進行光照步驟的條件下，水溶性光敏組成物添加0.03重量%過氧化氫，形成之霧化微粒可有限地抑制HCV的致病性。其次，過氧化氫未添加光照組及過氧化氫添加光照組的相對病毒量幾乎為0%，證實不論是否添加0.03重量%過氧化氫，當光劑量高(20J/cm2)時，水溶性光敏組成物經光照步驟形成之光活化霧化微粒可使HCV幾乎失去致病性。
如圖3所述，相較於過氧化氫未添加黑暗組，過氧化氫添加黑暗組的DENV之相對病毒量降低約50%，顯示水溶性光敏組成物添加0.03重量%過氧化氫在不進行光照步驟的條件下，形成之霧化微粒可有限地抑制DENV的致病性。其次，過氧化氫未添加光照組及過氧化氫添加光照組的相對病毒量幾乎為0%，證實不論是否添加0.03重量%過氧化氫，當光劑量高(20J/cm2)時，水溶性光敏組成物經光照步驟形成之光活化霧化微粒可使DENV幾乎失去致病性。
3.光劑量的對環境消毒功效之影響
對製備例2之水溶性光敏組成物(不含過氧化氫) 進行150秒的霧化步驟，以形成霧化微粒，再以不同光劑量(0J/cm2、10J/cm2、20J/cm2)對霧化微粒進行光照步驟，從而形成光活化霧化微粒，其中以0J/cm2表示不進行光照步驟。然後，利用Q-PCR檢測相對病毒量。
請參閱圖4及圖5，其中圖4係根據本發明之一實施例之不同光劑量對HCV的相對毒力之直條圖，圖5係根據本發明之一實施例之不同光劑量對DENV的相對毒力之直條圖。圖4及圖5中，橫軸表示光劑量(單位：J/cm2)，縱軸表示相對病毒量(單位：%)，其中相對病毒量係以未經光照步驟(光劑量為0J/cm2)的霧化微粒處理的病毒溶液中病毒DNA定量為100%，且以N.D.表示低於偵測極限(non-detectable)者。
如圖4所示，以光劑量為10J/cm2及20J/cm2的白光進行光照步驟，形成之光活化霧化微粒可大幅降低HCV的相對病毒量。如圖5所示，以光劑量為10J/cm2及20J/cm2的白光進行光照步驟，形成之光活化霧化微粒可使DENV的相對病毒量幾乎為0。由圖4及圖5可知，以光劑量為10J/cm2及20J/cm2的白光進行光照步驟，可有效降低有套膜病毒的致病性。
4.低光劑量與不同霧化時間對環境消毒功效的影響
評估製備例2(不含過氧化氫)之水溶性光敏組成物經不同霧化時間的霧化步驟及低光劑量(2.5J/cm2)之光照步驟後，形成之光活化霧化微粒對環境中無套膜病毒的消毒功效，其中霧化時間為15秒、30秒、75秒或 150秒。然後，利用溶斑試驗檢測噬菌體MS2之致病性，簡述如下：在細菌培養皿培養宿主細胞[大腸桿菌(Escherichia coli)]，再將病毒溶液與宿主細胞加入洋菜膠培養皿中混合，以共培養病毒與宿主細胞1天。然後，計算洋菜膠培養皿上的溶斑數量，以評估病毒的毒力，其中溶斑數量越多，表示病毒的毒力越高，即致病性越高。
請參閱圖6，其係根據本發明之一實施例之低光劑量之光照步驟的有無及不同霧化時間對噬菌體MS2的毒力之直條圖，其中橫軸表示光劑量(單位：J/cm2)，縱軸表示噬菌體MS2的毒力[單位：溶斑形成單位(plaque forming units，PFU)/mL]，且直條由左至右分別表示15秒、30秒、75秒或150秒。
如圖6所示，未經光照步驟(即光劑量為0J/cm2)，不論霧化步驟係進行達15秒、30秒、75秒或150秒，噬菌體MS2的毒力皆為約108PFU/mL。其次，相較於未經光照步驟，經光照步驟及霧化步驟15秒的光活化霧化微粒可顯著降低噬菌體MS2的毒力。再者，霧化時間越長，所形成之光活化霧化微粒降低噬菌體MS2的毒力的功效越佳，其中經霧化步驟75秒的光活化霧化微粒可降低105PFU/mL(相當於5個對數，5 logs)的噬菌體MS2的毒力。由此可知，霧化步驟達2分鐘以內，所形成之光活化霧化微粒可降低噬菌體MS2之99.999%(相當於5個對數，5 logs)的致病性，所形成之光活化霧化微粒遠大於本文所述之「環境消毒功效佳」 的標準[病原體之致病性降低至少99.9%(美國標準)或99.99%(歐盟標準)]。
一般而言，光動力消毒法對抑制無套膜病毒的致病性及/或感染性之功效較對有套膜病毒的效果較差。然而，上述實驗結果證實，經75秒霧化步驟的光活化霧化微粒可抑制99.999%的無套膜噬菌體MS2之致病性，說明上述方法對抑制具有套膜病毒(例如：引起COVID-19之SARS-CoV-2病毒)的功效應更佳(推測可抑制超過99.999%的具有套膜病毒)。
5.霧化微粒及光活化霧化微粒對環境的空氣中的病毒的消毒功效
將含有108PFU/mL(未處理組)的MS2病毒之空氣壓縮後，加入上述密閉空箱中達30分鐘。然後，以超音波霧化器對製備例1(含過氧化氫)的水溶性光敏組成物進行霧化作用，以利用霧化微粒處理空氣中的MS2病毒。收集此時密閉空箱中的MS2病毒，以檢測霧化微粒處理組的MS2病毒之毒力。接著，開啟距離密閉空箱30公分處的LED紅光(波長：644nm；光照強度：30mW/cm2)，以對霧化微粒進行光照步驟，以施予光劑量為10J/cm2的光於霧化微粒，從而獲得光活化霧化微粒。然後，利用光活化霧化微粒處理空氣中的MS2病毒。收集此時密閉空箱中的MS2病毒，以檢測光活化霧化微粒處理組的MS2病毒之毒力。
請參閱圖7，係根據本發明之一實施例之噬菌體 MS2在空氣中經霧化微粒處理或光活化霧化微粒處理的毒力之直條圖，其中橫軸表示組別，由左向右分別為未處理組、霧化微粒處理組及光活化霧化微粒處理組，且縱軸表示毒力(單位：log PFU/mL)。如圖7所示，相對於未處理組，霧化微粒處理組的毒力降低104PFU/mL，表示霧化微粒可使空氣中的病毒之致病性降低約99.99%。其次，光活化霧化微粒處理組的毒力幾乎為0，表示光活化霧化微粒可使空氣中的病毒之致病性降低約99.999999%，對環境的空氣中病毒之消毒功效佳。
6.光活化霧化微粒抑制SARS-CoV-2之環境消毒功效
研究發現，SARS-CoV-2是藉由利用次突醣蛋白(spike glycoprotein，S protein，以下簡稱為S蛋白)與宿主細胞的人體細胞的血管張力素轉化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)2受體結合，以感染宿主細胞。因此，下述實驗利用慢病毒(lentivirus)表現SARS-CoV-2的S蛋白做為SARS-CoV-2的偽病毒[購自泓佑生物，ACE BIOLABS，台灣；貨號：PV031]，以模擬光動力消毒法對SARS-CoV-2之感染性的抑制功效，其中SARS-CoV-2的偽病毒可表現綠色螢光蛋白(green fluorescence protein，GFP)的基因片段，使得受感染的宿主細胞在藍光(波長488nm)下表現綠色螢光。計算表現綠色螢光的宿主細胞之數量，可評估SARS-CoV-2的偽病毒的感染性。補充說明的是，下述實驗使用的宿 主細胞係可表現ACE2的HEK293細胞，即ACE2-3xFLAG-HEK293T細胞，購自泓佑生物；產品編號：CL0021。
以細胞培養液培養宿主細胞，以獲得200個細胞/μL的細胞培養物。在黑色的96孔細胞培養盤的每孔加入50μL的細胞培養物。上述細胞培養係含有10體積%之胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、1體積%之青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin，P/S)溶液、3μg/mL之嘌呤黴素(puromycin)但不含酚紅之杜爾貝寇氏必需基本培養基(Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM)。
接著，在96孔細胞培養盤的每孔中加入病毒溶液，以於37℃進行共培養達48小時。空白組的宿主細胞未以病毒溶液處理。甲烯藍未添加黑暗組的病毒溶液未經霧化微粒或光活化霧化微粒處理。甲烯藍添加黑暗組的病毒溶液係以霧化微粒進行處理，其中霧化微粒係水溶性光敏組成物(不含過氧化氫)經75秒的霧化步驟後製得。甲烯藍添加光照組的病毒溶液係以光活化霧化微粒進行處理，其中光活化霧化微粒係製備例2的水溶性光敏組成物(不含過氧化氫)經75秒的霧化步驟及2.5J/cm2之光照步驟後製得。
請參閱圖8A、圖8B、圖9A、圖9B、圖10A、圖10B、圖11A及圖11B，其係分別顯示根據本發明之空白組(圖8A、圖8B)、甲烯藍未添加黑暗組(圖9A、 圖9B)、甲烯藍添加黑暗組(圖10A、圖10B)、甲烯藍添加光照組(圖11A、圖11B)的宿主細胞的可見光(圖8A、圖9A、圖10A及圖11A)及螢光(圖8B、圖9B、圖10B及圖11B)之顯微影像。
如圖9B及圖10B所示，甲烯藍未添加黑暗組及甲烯藍添加黑暗組的宿主細胞表現綠色螢光，但如圖11B所示，甲烯藍添加光照組的宿主細胞不表現綠色螢光，證實水溶性光敏組成物經75秒的霧化步驟及2.5J/cm2之光照步驟後，獲得之光活化霧化微粒處理可有效降低SARS-CoV-2的偽病毒的感染性。
請參閱圖12，其係根據量化圖9B、圖10B及圖11B之宿主細胞的相對螢光強度之直條圖，其中橫軸表示組別，且縱軸表示以甲烯藍未添加黑暗組為100%之相對螢光強度(單位：%)。
如圖12所示，相較於甲烯藍未添加黑暗組及甲烯藍添加黑暗組，甲烯藍添加光照組的宿主細胞幾乎不表現綠色螢光，表示甲烯藍添加光照組的宿主細胞幾乎沒有被SARS-CoV-2的偽病毒感染，證實水溶性光敏組成物經75秒的霧化步驟且經2.5J/cm2之光照步驟，所形成之光活化霧化微粒可有效降低SARS-CoV-2的偽病毒的感染性。
7.極低光劑量對環境消毒功效之影響
將手套消毒，並在手套的表面上塗布90μL的病毒溶液，其中病毒溶液是以PBS配製，且含有108PFU 的噬菌體MS2。將手套分為甲烯藍未處理組及甲烯藍處理組，其中不對甲烯藍未處理組的手套上進行任何處理，但將10μL的製備例2之水溶性光敏組成物塗布於甲烯藍處理組的手套上。接著，分別以光照強度為32.8mW/cm2的紅光照射手套表面達0秒(光劑量為0J/cm2)、9秒(光劑量為0.3J/cm2)及19秒(光劑量為0.6J/cm2)，再利用上述溶斑試驗檢測噬菌體MS2之致病性。
請參閱圖13，係根據本發明之一實施例之噬菌體MS2在不同組別的手套上經低光劑量的光照步驟後的毒力之直條圖，其中橫軸表示組別及光劑量(單位：J/cm2)，符號「-」表示甲烯藍未處理組，符號「+」表示甲烯藍處理組，縱軸表示毒力(單位：log PFU/mL)，且N.D.表示低於偵測極限者。
如圖13所示，甲烯藍未處理組的手套經光劑量為0.3J/cm2的紅光之光照步驟後，噬菌體MS2的毒力降低99.9%(相當於3個對數，3 logs)，且當提供霧化微粒0.6J/cm2的光劑量時，噬菌體MS2的毒力降低99.999999%至99.9999999%(相當於8個至9個對數，8 logs至9 logs)，證實以較低光劑量亦可有效進行環境消毒。
補充說明的是，如圖1所述，製備例1的水溶性光敏組成物所形成之霧化微粒在未經光照步驟前，就可使相對病毒量降低約40%，因此由圖1及圖13可推論，本 發明之光動力環境消毒的方法以較低光劑量進行，所獲得之光活化霧化微粒應可使病毒之致病性及/或感染性降低至少99.99%。
綜上所述，本發明之光動力環境消毒的方法之優點在於，使用之水溶性光敏組成物係由低劑量(大於0mM至小於0.005mM)的甲烯藍及低劑量(大於0重量%至0.05重量%)的過氧化氫及水所組成，其經短時間(50秒至100秒)之霧化步驟及低光劑量(0.01J/cm2至300J/cm2)後，獲得之光活化霧化微粒可使病毒之致病性及/或感染性降低至少99.99%。
綜言之，本發明雖以特定的組成物、特定的病毒、特定的設備、特定的消毒流程及特定的評估方法做為例示，說明本發明之光動力環境消毒的方法、用於光動力環境消毒之水溶性光敏組成物及其用於製備環境消毒組成物之用途，惟本發明所屬技術領域中具有通常知識者應可理解，本發明不限於此，在不脫離本發明的精神及範圍內，本發明亦可使其他的組成物、其他的病毒、其他的設備、其他的消毒流程及其他的評估方法進行。
雖然本發明已以數個特定實施例揭露如上，但可對前述揭露內容進行各種潤飾、各種更動及替換，而且應可理解的是，在不脫離本發明之精神和範圍內，某些情況將採用本發明實施例之某些特徵但不對應使用其他特徵。因此，本發明的精神和權利要求範圍不應限於以上例示實施例所述。
A0101_OR_PSEQ_Readable.pdf
100:方法
110,130,150:步驟

Claims (10)

  1. 一種光動力環境消毒的方法，包含：對一水溶性光敏組成物以每分鐘0.1mL至150mL之速率進行一霧化步驟達1秒至300秒，以於一空間形成一霧化微粒，其中該水溶性光敏組成物係由大於0mM至小於50mM之甲烯藍、大於0重量%至1重量%之過氧化氫(H2O2)及一平衡量之水所組成；利用0.01J/cm2至300J/cm2之白光對該霧化微粒進行一光照步驟達一光照時間，以形成一光活化霧化微粒；以及施用該光活化霧化微粒於該空間之一物體表面或空氣，其中相較於未施用該光活化霧化微粒的該空間之該物體表面或該空氣，施用該光活化霧化微粒的該空間之該物體表面或該空氣的病毒之一致病性及/或一感染性係降低至少99.99%。
  2. 如請求項1所述之光動力環境消毒的方法，其中該霧化微粒的一粒徑係小於0.1μm至100μm。
  3. 如請求項1所述之光動力環境消毒的方法，其中該空間與該霧化微粒的一總體積比例為1：0.0001至1：0.01。
  4. 如請求項1所述之光動力環境消毒的方法， 其中該白光之一光源係選自於由自然光、發光二極體、日光燈、鹵素燈、白熾燈、雷射及上述任意組合所組成之一族群。
  5. 如請求項1所述之光動力環境消毒的方法，其中該白光的一波長包含400nm至760nm。
  6. 一種用於光動力環境消毒之水溶性光敏組成物，係由大於0mM至小於50mM之甲烯藍，大於0重量%至1重量%之過氧化氫及一平衡量之水所組成。
  7. 一種水溶性光敏組成物用於製備環境消毒組成物之用途，其中該水溶性光敏組成物係由大於0mM至小於50mM之甲烯藍、大於0重量%至1重量%之過氧化氫及一平衡量之水所組成，該水溶性光敏組成物經一霧化步驟及一光照步驟後，所獲得之一光活化霧化微粒係施用於一空間中的一物體表面或空氣，相較於未施用該光活化霧化微粒的一空間中之一物體表面，施用該光活化霧化微粒於該空間中的該物體表面的病毒之一致病性及/或一感染性係降低至少99.99%，且該光照步驟係以0.01J/cm2至300J/cm2之白光進行一光照時間。
  8. 如請求項7所述之水溶性光敏組成物用於製備環境消毒組成物之用途，其中相較於未施用該光活化霧 化微粒的該空間中之一空氣，施用該光活化霧化微粒的該空氣的病毒之一致病性及/或一感染性係降低至少99.99%。
  9. 如請求項7所述之水溶性光敏組成物用於製備環境消毒組成物之用途，其中該病毒係選自於由黃病毒科(Flaviviridae)、菲爾斯病毒科(Fiersviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)及上述任意組合所組成之一族群。
  10. 如請求項7所述之水溶性光敏組成物用於製備環境消毒組成物之用途，其中該病毒係選自於由C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、登革熱病毒(dengue virus，DENV)、噬菌體MS2(MS2 bacteriophage)、嚴重急性呼吸綜合症冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)及上述任意組合所組成之一族群。
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