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TWI834368B - 白楊梅萃取物用於抵抗老化或減重的用途 - Google Patents

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TWI834368B TW111141268A TW111141268A TWI834368B TW I834368 B TWI834368 B TW I834368B TW 111141268 A TW111141268 A TW 111141268A TW 111141268 A TW111141268 A TW 111141268A TW I834368 B TWI834368 B TW I834368B
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Abstract

一種白楊梅萃取物之用途，其是用於製備抗肌膚老化或減重的組合物之用途。其中，白楊梅萃取物是以水為溶劑提取自白色的楊梅果實。

Description

白楊梅萃取物用於抵抗老化或減重的用途
本發明涉及一種白楊梅萃取物的用途，特別是關於白楊梅萃取物用於製備抵抗肌膚老化或減重組合物。
楊梅（學名： Myrica rubra）是楊梅科 Myricaceae楊梅屬 Myrica亞熱帶的喬木植物。喜濕，耐陰寒，生長於溫帶、亞熱帶。一般的楊梅是紅色果實，具有白色果實的白楊梅是屬於楊梅內較稀少的品種。
楊梅在本草綱目記載：「鹽藏食，去痰止嘔噦，消食下酒。乾作屑，臨飲酒時服方寸匕，止吐酒。止渴，和五臟，能滌腸胃，除煩憒惡氣。燒灰服，斷下痢，甚驗。鹽者常含一枚，咽汁，利五臟下氣。」。
有鑑於此，為了更積極了解白楊梅的應用，故而提出一種白楊梅萃取物，其可應用於製備抵抗肌膚老化或減重組合物。
在一些實施例中，一種白楊梅萃取物的用途，其是用於製備抗肌膚老化的組合物，白楊梅萃取物是以水為溶劑提取自白色的楊梅果實。
在一些實施例中，白楊梅萃取物可以促進膠原蛋白分泌。
在一些實施例中，白楊梅萃取物可以減少肌膚泛紅。
在一些實施例中，白楊梅萃取物可以減少肌膚皺紋。
在一些實施例中，白楊梅萃取物可以減少肌膚紋理。
在一些實施例中，一種白楊梅萃取物的用途，其是用於製備減重的組合物，白楊梅萃取物是以水為溶劑提取自白色的楊梅果實。
在一些實施例中，白楊梅萃取物可以減少脂肪細胞內油滴堆積。
在一些實施例中，白楊梅萃取物可以減少體重。
在一些實施例中，白楊梅萃取物可以減少體脂肪。
在一些實施例中，組合物為食品組合物，且組合物內至少包含白楊梅萃取物0.4mL/日。
在一些實施例中，一種楊梅苷(Myricitrin)的用途，其是用於製備提升新陳代謝的組合物。
在一些實施例中，楊梅苷可以提升粒線體活性。
綜上所述，任一實施例的白楊梅萃取物可用以製備抵抗肌膚衰老的組合物。任一實施例的白楊梅萃取物可用以製備促進膠原蛋白分泌、減少肌膚泛紅、減少肌膚皺紋、減少肌膚紋理的組合物。任一實施例的白楊梅萃取物可用以製備減重的組合物。任一實施例的白楊梅萃取物可用以製備減少脂肪細胞內油滴堆積、減少體重、減少體脂肪的組合物。
如本文中所使用，術語“萃取物”係指藉由萃取作用所製備之產物。該萃取物可以溶於溶劑中之溶液形式呈現，或萃取物可為不含或大體上不含溶劑之濃縮物或精華呈現。
如本文所用“白楊梅原料”通常係指白楊梅植物的全果實，果實包括球形果核，果核外部密生多數囊狀體果肉，其中果肉顏色為淡粉色至白色的淺色。果實可包含原始、冷凍、冷藏、乾燥或以其他物理方式加工以利於處理之果實，其可進一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式經加工以影響原物料之大小及實體完整性之果實。
在一些實施例中，白楊梅原料是指將白楊梅果實(含果核及果肉)攪打至分裂為粉狀以製得。舉例而言，粉碎可以採用果汁機、調理機或均質機。在一些實施例中，白楊梅原料是指將白楊梅果實(含果核及果肉)粉碎後以12mm網目（mesh）篩網將其過篩以製得。
在一些實施例中，白楊梅萃取物是以水為溶劑對白楊梅原料進行萃取所製得。在一些實施例中，白楊梅萃取物是以水為溶劑對白楊梅原料進行加熱萃取所製得，加熱萃取是指將水與白楊梅原料混合後加熱到85±5℃之間維持60分鐘。在一些實施例中，水與白楊梅原料的重量比為1~3：5~20。在一些實施例中，水與白楊梅原料的重量比為1：5。
在一些實施例中，白楊梅萃取物是以水為溶劑對白楊梅原料進行萃取後，通過篩網以將溶劑內的固體濾除所製得。舉例而言，篩網可以是400網目（mesh）的篩網。
在一些實施例中，白楊梅萃取物是以水為溶劑對白楊梅原料進行萃取後，通過篩網以將溶劑內的固體濾除，再進行減壓濃縮以製得。舉例而言，減壓濃縮是指在60℃±5℃下進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值（Degrees Brix，°Bx）為8±0.5°Bx時停止濃縮以製得白楊梅萃取物。
在一些實施例中，白楊梅萃取物至少包含活性成分楊梅苷（Myricitrin）35.4ppm。
楊梅苷之結構式如下式I所示： 式I。
在一些實施例中，白楊梅萃取物可以製備抗肌膚老化的組合物。在一些實施例中，白楊梅萃取物經由促進膠原蛋白分泌達成抗肌膚老化。在一些實施例中，白楊梅萃取物經由減少肌膚泛紅達成抗肌膚老化。在一些實施例中，白楊梅萃取物經由減少肌膚皺紋達成抗肌膚老化。在一些實施例中，白楊梅萃取物經由減少肌膚紋理達成抗肌膚老化。
於此，所指的老化（Aging）是指肌膚隨著時間變化而發生各種機能下降或變化的過程。
在一些實施例中，一種白楊梅萃取物可以製備減重的組合物。在一些實施例中，白楊梅萃取物經由減少脂肪細胞內油滴堆積達成減重。在一些實施例中，白楊梅萃取物可以減少體重。在一些實施例中，白楊梅萃取物可以減少體脂肪。
在一些實施例中，上述組合物為食品組合物，且組合物內至少包含白楊梅萃取物0.4mL/日。
在一些實施例中，一種楊梅苷(Myricitrin)的用途，其是用於製備提升新陳代謝的組合物。在一些實施例中，白楊梅萃取物經由提升粒線體活性達成減重。
在一些實施例中，前述之組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的白楊梅萃取物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道或口服的投藥劑型。這些投藥劑型包括，但不限於：錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）以及類似之物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道（parenterally）或局部地（topically）投藥的劑型，這些投藥劑型包括，但不限於：注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）以及類似之物。在一些實施例中，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑（parenteral routes）來投藥：皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）以及病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，醫藥品可進一步包含有被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列的試劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝生理鹽水（phosphate buffered saline, PBS）、含有醇的水性溶液（aqueous solution containing alcohol）。
在一些實施例中，前述之組合物可為可食用組合物。在一些實施例中，此可食用組合物可以製成食品產品或可為食品添加物（food additive），意即藉由習知方法於食材製備時添加而製得食品產品，或是於食品產品的製作過程中添加。於此，食品產品可以是與可食性材料配製成供人類或動物攝食的產品。
在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）以及膳食補充品（dietary supplements）。
例一：測試樣品的製備
1-1製備白楊梅萃取物：將白楊梅（學名： Myrica rubra）的白色果實(含果核及果肉，產地為中國的烘乾果實全果)攪打至分散為粉狀後，以12mm網目（mesh）篩網將其過篩以製得白楊梅原料。於此，採用osterizer品牌的10 speed blender進行粉碎。接著，以水為溶劑，將白楊梅原料與水以1：5的重量比例混合後在85℃下萃取1小時。於此，萃取是將白楊梅原料浸泡在水中。後續，將萃取完成的白楊梅原料及水通過400網目的篩網以形成過濾液。接著，於60℃下對過濾液進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值為8±0.5°Bx時停止濃縮以製得白楊梅萃取物。於此，採用廠牌/型號：BUCHI -Rotavapor R-100的減壓濃縮設備。
1-2製備紅楊梅萃取物：將一般楊梅（學名： Myrica rubra）的紅色果實(含果核及果肉，產地為台灣的烘乾果實全果)攪打至分散為粉狀後，以12mm網目（mesh）篩網將其過篩以製得紅楊梅原料。接著，以水為溶劑，將紅楊梅原料與水以1：5的重量比例混合後在85℃下萃取1小時。於此，萃取是將紅楊梅原料浸泡在水中。後續，將萃取完成的紅楊梅原料及水通過400網目的篩網以形成過濾液。接著，於60℃下對過濾液進行減壓濃縮至溶液的白利糖度值為8±0.5°Bx時停止濃縮以製得紅楊梅萃取物。
例二：白楊梅萃取物促進膠原蛋白分泌測試
材料與設備說明：
細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966Sk (Human skin fibroblast CCD-966Sk)，取自美國標準生物品收藏中心(簡稱ATCC)保存編號Cat. CRL-1881，以下簡稱纖維母細胞。
細胞培養基：為添加有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS；Gibco公司，編號10437-028）、1%的青黴素-鏈黴素（Antibiotic-Antimycotic）（Gibco公司，Cat.15140122）及1mM的丙酮酸鈉（sodium pyruvate，Gibco公司，編號11360-070）的最低限度必需培養基（Minimum essential medium，簡稱MEM，以下稱MEM培養基）（Gibco公司，編號11095080）。
可溶性膠原蛋白檢測套組 (Biocolor公司；編號Cat. S1000)。
溶劑：1XDPBS（Gibco公司，Cat. 14200-075）。
測試流程：
首先，以2Í10 4個纖維母細胞的密度植入至24孔細胞培養盤中，每孔含有0.5毫升細胞培養基的，於37℃下的二氧化碳培養箱中培養24小時。待纖維母細胞貼附於細胞培養盤的底部後，以1XDPBS清洗一次。
將纖維母細胞分為實驗組、對照組及空白組。移除各組別的細胞培養基並更換為500 μl/well測試培養基，然後置於37℃下分別接續培養48小時。
其中，實驗組的測試培養基為含有0.125%的例一中所得到的白楊梅萃取物的細胞培養基。對照組的測試培養基為含有0.125%的例一中所得到的紅楊梅萃取物的細胞培養基。空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基。
收集1mL的上述各組的測試培養基，並以可溶性膠原蛋白檢測套組處理以形成各組的待測溶液，接著以分光光度計測量其在555nm下之各組吸光值，測試結果如圖1所示。
圖式中顯示的膠原蛋白分泌量採相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗（Student t-test）分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
請參閱圖1。將空白組的數值視為100%。相較於空白組，實驗組的膠原蛋白的相對分泌量為131%，具有統計學上的顯著差異。而對照組的膠原蛋白的相對分泌量為118.7%，雖然也有增加，但並未達到統計學上的顯著差異。
換言之，白楊梅萃取物能顯著促進人類皮膚纖維母細胞分泌膠原蛋白，並顯著的提高達31%。由此可知，白楊梅萃取物能使人類肌膚細胞能有效地分泌膠原蛋白，進而改善肌膚狀態，使肌膚更具彈性及保持濕度，達到肌膚光滑透亮年輕化的狀態。
例三：白楊梅萃取物促進脂肪分解測試
三酸甘油脂的利用是藉由脂肪分解(lipolysis)作用，將三酸甘油脂分解為脂肪酸及甘油。基此，本次試驗分析處理後細胞內游離甘油的含量，藉以確認脂肪是否被分解，意即所量測到的游離甘油量愈高則其促進脂肪分解的效果愈好。
材料與設備說明：
細胞株：小鼠骨髓基質細胞（後續簡稱OP9細胞），OP9細胞購自美國典型培養物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC ®）之OP9細胞株（ATCC CRL-2749）。
培養基：90%之MEMAM（Minimum Essential Medium Alpha Medium，購自Gibco，美國）細胞培養液、20%之胎牛血清（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，美國，Cat#10437-028），且加入0.1%之青黴素/鏈黴素（Penicillin-streptomycin，購自Gibco，美國）。
甘油檢測套組（Glycerol cell-based assay kit，購自Caymano）。
ELISA讀取儀（廠牌：BioTek）。
測試流程：
首先，取24孔培養盤將每孔接種8×10 4個OP9細胞及500μL培養基，在37℃下培養7天。此7天的細胞培養期間每隔3天更換培養基。7天後，以顯微鏡（ZEISS；放大倍率400x）觀察細胞內油滴形成，藉以確認細胞已完全分化為脂肪細胞。
然後，將分化完成的脂肪細胞分為三組：實驗組、對照組與空白組。
實驗組：依照每孔500μL培養基含有62.5μL的例一製得的白楊梅萃取物的比例（即，濃度為0.125%）將白楊梅萃取物添加至培養基中，在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
對照組：依照每孔500μL培養基含有62.5μL的例一製得的紅楊梅萃取物的比例（即，濃度為0.125%）將白楊梅萃取物添加至培養基中，在37℃下培養7天。在7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
空白組：不作任何處理，即不額外添加其他化合物至培養基中，在37℃下培養7天。此7天的細胞處理期間每隔3天更換培養基。
接下來，收集每孔上述各組的測試培養基，並以甘油檢測套組處理以形成各組的待測溶液，接著以ELISA讀取儀測量其在540nm下之各組吸光值，測試結果如圖2所示。
其中，利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖2所示（圖式中「*」代表p值小於0.05，代表統計上的具有顯著差異）。
參考圖2。將空白組的游離甘油量視為100%時，相較於空白組，實驗組的游離甘油量為113.6%，具有統計學上的顯著差異。而對照組的游離甘油量為100.7%，雖然也有增加，但並未達到統計學上的顯著差異。意即經由白楊梅萃取物處理之後能顯著地提升13.6%的脂肪分解量。此結果顯示，白楊梅萃取物能有效協助促進脂肪分解的進行，進而協助減重的進行。
例四：人體實驗
樣品：採用例一所製備的白楊梅萃取物。
受試者：8位受試者。各受試者年齡層為20歲以上，55歲以下。其中，男性體脂大於25%，女性體脂大於30%。
測試項目包括：肌膚皺紋、肌膚泛紅、體重、BMI指數、全身體脂肪率、軀幹體脂肪率。
其中，肌膚皺紋是以高階肌膚分析儀(VISIA Complexion Analysis System 品牌Canfield scientific, USA)的可見光(白光)拍攝受試者面部的肌膚高解析度之肌膚圖像，並以內建軟體根據皺紋之長度與深度進行分析計算。
其中，肌膚泛紅是以高階肌膚分析儀(VISIA Complexion Analysis System 品牌Canfield scientific, USA)的RBX偏振光技術進行臉拍攝受試者面部的肌膚，偵測肌膚深層血管或血紅素。測量數值越高，說明肌膚泛紅狀況越嚴重。
其中，體重、BMI指數、全身體脂肪率、軀幹體脂肪率是以身體組成分析儀（型號：InBody 770）進行量測。
測試流程：
令8位受試者每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物，並每天持續攝入四周。於開始攝入前（即第0周，又稱對照組）及飲用四周後（即第4周，又稱為實驗組）分別進行以上述設備進行量測。
於此，於飲用前、後進行儀器檢測時，受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致，以減少外界的溫濕度等因素會對肌膚所造成的影響。
測試結果：
請參閱圖3。經過四周的每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物後，8位受試者的平均肌膚皺紋量從100%（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況下降至89.4%（第4周）。使用本發明之白楊梅萃取物僅四周，其前後的平均肌膚皺紋量可以減少10.6%。意即，每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物可以有減少面部肌膚皺紋。
請參閱圖4。經過四周的每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物後，8位受試者的平均肌膚泛紅量從100%（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況下降至91%（第4周）。其中，改善人數比例為75%，意即。8位受試者中，有6位的肌膚泛紅量明顯下降。使用本發明之白楊梅萃取物僅四周，其前後的平均肌膚泛紅量可以減少9%。意即，每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物可以有改善面部肌膚泛紅的狀況。
請參閱圖5。經過四周的每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物後，8位受試者的平均體重從78.1kg（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況下降至76.4kg（第4周）。其中，改善人數比例為75%，意即。8位受試者中，有6位的體重明顯下降。使用本發明之白楊梅萃取物僅四周，其前後的平均體重差異達1.7kg。意即，每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物可以有效降低體重。
請參閱圖6。經過四周的每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物後，8位受試者的平均BMI指數從26.9（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況下降至26.3（第4周）。其中，改善人數比例為75%，意即。8位受試者中，有6位的BMI指數明顯下降。使用本發明之白楊梅萃取物僅四周，其前後的平均BMI指數可以減少0.6。意即，每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物可以有效降低身體BMI指數。
請參閱圖7。經過四周的每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物後，8位受試者的平均全身體脂肪率從31.5%（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況下降至30.6%（第4周）。其中，改善人數比例為87.5%，意即。8位受試者中，有7位的全身體脂肪率明顯下降。使用本發明之白楊梅萃取物僅四周，其前後的平均全身體脂肪率差異達0.9%。意即，每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物可以有效降低體脂肪。
請參閱圖8。經過四周的每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物後，8位受試者的平均軀幹體脂肪率從32.9%（第0周）在維持日常飲食與運動量的情況下降至31.7%（第4周）。其中，改善人數比例為87.5%，意即。8位受試者中，有7位的軀幹體脂肪率明顯下降。使用本發明之白楊梅萃取物僅四周，其前後的平均軀幹體脂肪率差異達1.2%。意即，每日攝取0.4mL的白楊梅萃取物可以有效降低軀幹體脂肪。
由上述數據可知，第0周受試者的平均體重是78.1kg，並且平均全身體脂肪率從31.5%，其可換算出第0周時受試者是體脂重量約為24.6kg，第4周受試者的平均體重是76.4kg，並且平均全身體脂肪率從30.6%，其可換算出第4周時受試者是體脂重量約為23.4 kg，意即第0周到第4周受試者的體脂重量減少1.2kg。而，第0周到第4周受試者的體減少1.7kg，可見所減少的體重中，有70%以上是脂肪重量，而非肌肉重量，明顯達成增肌減脂的效能。
例五：白楊梅萃取物的生物活性物質成分分析及指紋圖譜 HPLC 分析
天然植物的萃取物通常包含多種成分，非屬純物質。不同的化合物在不同的溶劑中溶解度具有差異性，本試驗利用相互不相溶的溶劑，將白楊梅萃取物中的某一特定成分轉移到另一溶劑中。
設備儀器、設定方式與設備來源說明如下：
核磁共振光譜儀（Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer, NMR）。1D與2D光譜使用Ascend 400 MHz, Bruker Co., Germany，以δ表示化學位移 （chemical shift），單位為 ppm。
質譜儀 （Mass Spectrometer, MS）串聯質譜-二維離子阱串聯傅立葉轉換質譜及ESI-MS/MS：使用Bruker amaZon SL system測定，單位為 m/z。
中壓液相層析儀（Medium pressure liquid chromatography, MPLC）： CombiFlash ®Rf +, Teledyne ISCO, Lincoln, NE，高效能液相層析儀 （High Performance Liquid Chromatography, HPLC）：高效液相層析儀（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）係Agilent 1200系列：脫氣裝置係Agilent 真空脫氣裝置 1322A；沖提溶劑輸送係Agilent四元幫浦G1311A；可變波長偵測器係（Multiple Wavelength Detector, MWD）Agilent G1314B；光二極體陣列偵測器（Diode Array Detector, DAD）係Agilent 1260 Infinity DAD VL G1315D，偵測波長為210 nm，280 nm，320 nm，365 nm （Agilent Germany）。
分析管柱：Luna®5μm C18（2） 100 Å （250 x 10 mm, Phenomenex, USA）。
管柱層析 （Column Chromatography） 填充材料：Sephadex LH-20 （Pharmacia, Piscataway, NJ, USA）. Diaion HP-20 （Mitsubishi Chemical Co., Japan） Merck Kieselgel 60 （40-63 um, Art. 9385） Merck LiChroprep® RP-18 （40-63 um, Art. 0250）。
薄層色層分析 （Thin-Layer Chromatography）採用TLC aluminium sheets（Silica gel 60 F254, 0.25 mm, Merck, Germany）及TLC aluminium sheets（RP-18 F254-S , 0.25 mm, Merck, Germany）。
採用溶劑（solvent）及其來源說明：正己烷（n-hexane）、乙酸乙酯（ethyl acetate）、丙酮（acetone）、甲醇（methanol）、乙醇（ethanol）、乙腈（acetonitrile）（採購至默克台灣）、氯仿-d1（deuteration degree 99.5%）、甲醇-d4（deuteration degree 99.5%）、重水deuterium oxide（deuteration degree ＞ 99.8％）、Dimethyl sulfoxide-d6 （deuteration degree ＞ 99.9%）（默克台灣）。
分析流程：
首先，取例一製得的白楊梅萃取物10公升（L）經由正丁醇與水等比例液相分配的方式進行分離，分別取得正丁醇層萃取液與水層萃取液。於此，高極性物質在正丁醇層萃取液，水溶性物質就留在水層萃取液。
接著，將正丁醇層萃取液經減壓濃縮乾燥可得正丁醇萃取物28.5克。水層萃取液經減壓濃縮乾燥可得水萃取物892.2克。
後續，依據生物活性導引分離方法（Bioassay guided fractionation），擇Diaion HP-20為層析材料，起始沖提液為純水，爾後增加甲醇比例至100%甲醇，總共分離得到3個劃分層，分別為MRB-F1分層、MRB-F2分層以及MRB-F3分層。
其中，MRB-F3分層進一步以中壓管柱層析儀(MPLC)分離後，再經薄層層析片(TLC)點片合併，得到7個劃分層(MRB-F3-1~7)。7個劃分層中的MRBF3-1利用RP-HPLC純化，以甲醇與水(3：2)移動相得到化合物TCI-MR-01，經氫-核磁共振光譜( 1H-NMR)與電噴灑離子化質譜(ESIMS)分析其化學結構後，確認其為楊梅苷(Myricitrin)。於此，TCI-MR-01的氫-核磁共振光譜如圖9所示。
楊梅苷之結構式如下式I所示： 式I。
後續，再進一步利用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）來對例1所製得的白楊梅萃取物進行分析。
上述液相色譜的相關設定：使用以甲醇和水並額外添加0.1%的甲酸為溶劑，流速為1 ml/min，沖提條件：0分鐘時甲醇：水=2：98；10分鐘時甲醇：水=2：98；40分鐘時甲醇：水=70：30；50分鐘時甲醇：水=100：0；60分鐘時甲醇：水=100：0，樣品濃度為50 mg/ml，注射量為10µL，測試時，管柱溫度為40 oC。
液相色譜法得到結果如圖10，圖10為對例一所製得的白楊梅萃取物的HPLC圖譜。其中，在時間為33分附近解析出TCI-MR-01生物活性物質的波峰。同時，根據層析圖中出現的峰值時間，以及其面積值，對分析物種作出定量與定性分析，得到TCI-MR-01生物活性物質含量達35.4ppm。
例六：楊梅苷促進粒線體活性測試
為探討楊梅苷對皮膚細胞粒線體功能的影響，本例以流式細胞儀評估人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk經楊梅苷處理後，其粒線體活性的變化。測試中以JC-1聚集能力作為粒線體活性之指標，在膜電位正常的健康粒線體中，JC-1以多聚體(polymer)形式存在，而當粒線體膜電位降低時，JC-1會變成單體(monomer)，其可當作粒線體活性評估的指標。
材料與設備：
細胞株：人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk（BCRC No. 60153），後續簡稱纖維母細胞。
細胞培養基：含有10 vol% FBS（購自Gibco）之基礎培養基。。其中，基礎培養基是由Eagle’s最低限度基本培養基（Eagle’s minimum essential medium（MEM），購自Gibco，產品編號15188-319）額外添加成分使其含有1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma）及0.1 mM非必需胺基酸（non-essential amino acid solution，購自Gibco）所配製而成。
磷酸緩衝鹽溶液（PBS溶液）：購自Gibco。
粒線體膜電位偵測套組（BDTM MitoScreen （JC-1） kit，型號551302）。其中，粒線體膜電位偵測套組具有JC-1染料（凍乾）及10X分析緩衝液。於使用前，以1X PBS將10X分析緩衝液稀釋10倍，以形成1X分析緩衝液。加入130 μL DMSO至JC-1染劑（凍乾）中，以形成JC-1儲備溶液。然後，再以1X分析緩衝液稀釋JC-1儲備溶液，以形成JC-1工作試劑（JC-1 working solution；即JC-1粒線體特異性染劑）。稀釋倍率為JC-1儲備溶液比1X分析緩衝液為1：100。
胰蛋白酶：10X Trypsin-EDTA（購自Gibco）以1X PBS溶液稀釋10倍。
流式細胞儀：購自BD Pharmingen公司，型號BDTM Accuri C6 Plus。
測試流程：
首先，將纖維母細胞以每孔1×10 5個的方式，接種於每孔含2 mL細胞培養基之6孔培養盤中，培養24小時後分為二組。
將各組孔中的培養基更換成2 mL實驗培養基。其中，實驗組的實驗培養基為含有5μL的楊梅苷之細胞培養基(意即楊梅苷濃度為0.25%)。空白組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含楊梅苷）。並且將更換實驗培養基後的培養盤置於環境含5%CO 2、溫度37℃下，培養24小時。
接下來，移除培養盤中的實驗培養基並以1 mL的1X PBS溶液潤洗2次後，將200μL胰蛋白酶加至每孔中並在暗處反應5分鐘。反應後，添加細胞培養基終止反應。將各孔中之細胞與細胞培養基收集至個別對應的1.5 mL離心管內，並將含有細胞與細胞培養基之離心管以400 xg離心5分鐘。
後續，於離心後移除上清液，再以1 mL的1X PBS溶液沖洗纖維母細胞，再次將含有細胞懸浮液的離心管以400 xg離心5分鐘。
於離心後移除各離心管中的上清液並加入100 μL的JC-1工作試劑至各離心管，並將各離心管中的細胞沉澱物與JC-1工作試劑渦旋均勻並在避光處理下靜置15分鐘。
15分鐘後，將各離心管以400 xg離心5分鐘，並於離心後，移除各離心管中的上清液、以1 mL的1X PBS溶液回溶各試管中的細胞沉澱物並以400 xg離心5分鐘。接著，再次移除各離心管中的上清液、以1 mL的1X PBS溶液回溶各離心管中的細胞沉澱物並以400 xg離心5分鐘。最後，移除各離心管中的上清液、以500 μL的1X PBS重新懸浮細胞，以得到待測細胞液。
後以流式細胞儀量測各孔的待檢測細液中細胞粒線體的膜電位，以進行粒線體活性分析。因實驗係進行三重複，故將各組的三重複實驗之結果平均以得平均值，然後以空白組的平均值為100%之相對JC-1聚集量，將實驗組的平均值換算為相對JC-1聚集量，如圖11所示。其中，利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異（圖式中「*」代表p值小於0.05意即統計上具有顯著差異）。
測試結果：
參閱圖11，其為經楊梅苷處理之實驗組與未經處理之空白組之JC-1聚集相對量比較長條圖。由該圖可知，實驗組之相對JC-1聚集量約為121.9%。換言之，與空白組相較之下，實驗組的人類皮膚纖維母細胞的粒線體活性提升21.9%。顯示楊梅苷可提升纖維母細胞之粒線體活性，而達到提升皮膚細胞活性之效果。
綜上所述，本發明任一實施例的白楊梅萃取物可用以製備抵抗肌膚衰老的組合物。任一實施例的白楊梅萃取物可用以製備促進膠原蛋白分泌、減少肌膚泛紅、減少肌膚皺紋、減少肌膚紋理的組合物。任一實施例的白楊梅萃取物可用以製備減重的組合物。任一實施例的白楊梅萃取物可用以製備減少脂肪細胞內油滴堆積、減少體重、減少體脂肪的組合物。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
TCI-MR-01:生物活性物質
圖1是白楊梅萃取物促進膠原蛋白分泌量測試結果圖。 圖2是白楊梅萃取物減少脂肪油滴含量測試結果圖。 圖3是白楊梅萃取物人體測試減少肌膚皺紋測試結果圖。 圖4是白楊梅萃取物人體測試減少肌膚泛紅測試結果圖。 圖5是白楊梅萃取物人體測試減少體重測試結果圖。 圖6是白楊梅萃取物人體測試減少BMI指數測試結果圖。 圖7是白楊梅萃取物人體測試減少全身體脂肪率測試結果圖。 圖8是白楊梅萃取物人體測試減少軀幹體脂肪率測試結果圖。 圖9是一實施例的活性化合物TCI-MR-01之指紋分析圖譜。 圖10是一實施例的白楊梅萃取物之指紋分析圖譜。 圖11是楊梅苷促進粒線體活性測試結果圖。

Claims (8)

  1. 一種白楊梅萃取物的用途，其是用於製備促進膠原蛋白分泌的組合物，該白楊梅萃取物是將水與白色的楊梅Myrica rubra的果實以該果實與該水的重量比為1~3：5~20的比例混合後加熱到85±5℃之間維持60分鐘以製得白楊梅萃取物。
  2. 如請求項1所述的用途，其中該白楊梅萃取物可以減少肌膚泛紅。
  3. 如請求項1所述的用途，其中該白楊梅萃取物可以減少肌膚皺紋。
  4. 如請求項1所述的用途，其中該白楊梅萃取物可以減少肌膚紋理。
  5. 一種白楊梅萃取物的用途，其是用於製備增肌減脂的組合物，該白楊梅萃取物是將水與白色的楊梅Myrica rubra的果實以該果實與該水的重量比為1~3：5~20的比例混合後加熱到85±5℃之間維持60分鐘以製得白楊梅萃取物。
  6. 如請求項5所述的用途，其中該白楊梅萃取物可以減少脂肪細胞內油滴堆積。
  7. 如請求項5所述的用途，其中該白楊梅萃取物可以減少體脂肪。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的用途，其中該組合物為一食品組合物，且該組合物內至少包含該白楊梅萃取物0.4mL/日。
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