TWI820088B - 麥角硫因的製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種麥角硫因的製造方法及使用於該方法的細菌，該方法能夠廉價且大量地製造麥角硫因。本發明是一種製造麥角硫因或其相關物質、或者該等之混合物的方法，其特徵在於，包含下述步驟：利用培養基來培養具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科的細菌；以及，從該培養基或藉由該培養所獲得的菌體中採集麥角硫因或其相關物質、或者該等之混合物；並且，前述細菌是以包含核心序列區域之蛋白質的活性下降的方式來改造後的菌株，該核心序列區域具有Ser-Arg-Gly-Arg-Thr(序列編號7)這樣的5個胺基酸；以及，一種具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科的細菌，其以包含核心序列區域之蛋白質的活性下降的方式來改造，該核心序列區域具有Ser-Arg-Gly-Arg-Thr(序列編號7)這樣的5個胺基酸。
Description
本發明有關一種製造麥角硫因或其相關物質、或者該等之混合物的方法，該方法使用了屬於腸內細菌科的細菌。本發明是藉由下述方式來提高麥角硫因生產能力：改造具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科的細菌，來使規定的蛋白質的活性下降。
麥角硫因，是一種含硫胺基酸，已知具有以抗氧化能力為首的各種生理活性。又，已教示其抗氧化能力比維生素C、維生素E、半胱胺酸、穀胱甘肽(Glutathione)更高。亦顯示麥角硫因具有紫外線吸收效果、抑制黑色素產生的作用、去除活性氧物種(active oxygen species)的能力、彈性蛋白酶活性抑制作用、酪胺酸酶活性抑制作用，該彈性蛋白酶活性抑制作用能夠抑制皺紋或鬆弛的形成、該酪胺酸酶活性抑制作用能夠抑制斑點的形成。因此，麥角硫因是在美容、食品業界格外受到矚目的化合物之一。
部分微生物尤其是擔子菌類中包含大量麥角硫因，動植物中亦包含微量的麥角硫因。已教示雖然哺乳動物無法生合成麥角硫因，但是能夠藉由攝食包含擔子菌類之蕈類等，來將其攝入體內，且麥角硫因會累積於表皮、腦、肝臟、腎臟、脊髓、眼睛等許多的臟器或器官中，並保護細胞。作為麥角硫因的製造方法，已知擔子菌等的微生物的培養/萃取法和有機合成法(參照專利文獻1、2等)。然而，從擔子菌類等萃取的方法，由於下述理由而尚未普及：生產性較低、要長期培養微生物、因為累積於菌體內所以從菌體內萃取的製程較複雜、微生物的改良較困難等。有機合成法亦由於下述理由而尚未普及：反應為多階段且複雜、有時使用有害原料、因為使用昂貴的原料所以費用較高等。又，亦已開發一種發酵生產法，其使用了下述微生物：過度表現麥角硫因生合成基因之微生物；或，減少或消除組胺酸解氨酶(histidine ammonia‐lyase)活性後的具有麥角硫因生產能力的微生物、或是降低或消除組胺酸解氨酶基因表現後的具有麥角硫因生產能力的微生物；但是期望一種進一步有效率的麥角硫因的製造方法(專利文獻3)。 [先前技術文獻] (專利文獻)
專利文獻1：日本特開2006-160748號公報 專利文獻2：日本特開2007-300916號公報 專利文獻3：WO2017150304
[發明所欲解決的問題] 如上所述，現狀下，麥角硫因的價格高，且其供給存在問題。因此，尋求一種廉價且大量地製造麥角硫因的方法。 [解決問題的技術手段]
本發明人為了解決上述問題而專心研究，結果發現，令人驚訝的是，藉由改造具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科的細菌，來使規定的蛋白質的活性下降，能夠使麥角硫因的生產量顯著增加，從而完成本發明。
亦即，本發明提供一種製造麥角硫因或其相關物質、或者該等之混合物的方法，該方法使用了屬於腸內細菌科的細菌，並且本發明藉由下述方式來提高麥角硫因生產能力：改造具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科的細菌，來使規定的蛋白質的活性下降。
因此，本發明提供以下技術。 [1]一種製造麥角硫因或其相關物質、或者該等之混合物的方法，其特徵在於，包含下述步驟：利用培養基來培養具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科的細菌；以及，從該培養基或藉由該培養所獲得的菌體中採集麥角硫因或其相關物質、或者該等之混合物；並且，前述細菌是以包含核心序列區域之蛋白質的活性下降的方式來改造後的菌株，該核心序列區域的一部分包含Ser-Arg-Gly-Arg-Thr即序列編號7這樣的5個胺基酸。 [2]如[1]所述之方法，其中，前述核心序列區域是以Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg即序列編號8表示的序列，且X15aa、X16aa及X17aa設為任意的胺基酸。 [3]如[2]所述之方法，其中，前述核心序列區域是具有選自下述(1)～(3)的胺基酸之序列： (1)X15aa為白胺酸(Leu)或異白胺酸(Ile)； (2)X16aa為異白胺酸或纈胺酸(Val)； (3)X17aa為異白胺酸或纈胺酸。 [4]如[1]所述之方法，其中，包含前述核心序列區域之蛋白質是BetT蛋白或CaiT蛋白中的任一方或雙方，前述BetT蛋白是下述(a)、(b)或(c)所記載之蛋白質，前述CaiT蛋白是下述(d)、(e)或(f)所記載之蛋白質： (a)包含序列編號10所示的胺基酸序列之蛋白質； (b)包含胺基酸序列之蛋白質，該胺基酸序列包含在序列編號10所示的胺基酸序列中取代、缺失、插入或附加1～數個胺基酸殘基； (c)包含相對於序列編號10所示的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列之蛋白質； (d)包含序列編號11所示的胺基酸序列之蛋白質； (e)包含胺基酸序列之蛋白質，該胺基酸序列包含在序列編號11所示的胺基酸序列中取代、缺失、插入或附加1～數個胺基酸殘基； (f)包含相對於序列編號11所示的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列之蛋白質。 [5]如[1]～[4]中任一項所述之方法，其中，前述具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科的細菌，是以增強麥角硫因合成基因的表現的方式來改造後的細菌。 [6]如[5]所述之方法，其中，前述麥角硫因合成基因包含下述基因中的任1種或1種以上：與恥垢分枝桿菌即Mycobacterium smegmatis的egtA、egtB、egtC、egtD或egtE相當的基因；與粟酒裂殖酵母即Schizosaccharomyces pombe的Egt1或Egt2相當的基因；與紅麵包黴即Neurospora crassa的Egt1或Egt2相當的基因；與泥生綠菌即Chlorobium limicola的eanA或eanB相當的基因。 [7]如[1]～[6]中任一項所述之方法，其中，前述具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科的細菌是埃希氏菌即Escherichia屬的細菌。 [8]如[7]所述之方法，其中，前述具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科的細菌是大腸桿菌。 [9]一種具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科的細菌，其以包含核心序列區域之蛋白質的活性下降的方式來改造，該核心序列區域的一部分包含Ser-Arg-Gly-Arg-Thr即序列編號7這樣的5個胺基酸。 [10]如[9]所述之細菌，其中，前述核心序列區域是以Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg即序列編號8表示的序列，且X15aa、X16aa及X17aa設為任意的胺基酸。 [11]如[10]所述之細菌，其中，前述核心序列區域是具有選自下述(1)～(3)的胺基酸之序列： (1)X15aa為白胺酸或異白胺酸； (2)X16aa為異白胺酸或纈胺酸； (3)X17aa為異白胺酸或纈胺酸。 [12]如[9]所述之細菌，其中，包含前述核心序列區域之蛋白質是BetT蛋白或CaiT蛋白中的任一方或雙方，前述BetT蛋白是下述(a)、(b)或(c)所記載之蛋白質，前述CaiT蛋白是下述(d)、(e)或(f)所記載之蛋白質： (a)包含序列編號10所示的胺基酸序列之蛋白質； (b)包含胺基酸序列之蛋白質，該胺基酸序列包含在序列編號10所示的胺基酸序列中取代、缺失、插入或附加1～數個胺基酸殘基； (c)包含相對於序列編號10所示的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列之蛋白質； (d)包含序列編號11所示的胺基酸序列之蛋白質； (e)包含胺基酸序列之蛋白質，該胺基酸序列包含在序列編號11所示的胺基酸序列中取代、缺失、插入或附加1～數個胺基酸殘基； (f)包含相對於序列編號11所示的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列之蛋白質。 [13]如[9]～[12]所述之細菌，其中，該細菌是以增強麥角硫因合成基因的表現的方式來改造後的細菌。 [14]如[13]所述之細菌，其中，前述麥角硫因合成基因包含下述基因中的任1種或1種以上：與恥垢分枝桿菌即Mycobacterium smegmatis的egtA、egtB、egtC、egtD或egtE相當的基因；與粟酒裂殖酵母即Schizosaccharomyces pombe的Egt1或Egt2相當的基因；與紅麵包黴即Neurospora crassa的Egt1或Egt2相當的基因；與泥生綠菌即Chlorobium limicola的eanA或eanB相當的基因。 [15]如[9]～[14]中任一項所述之細菌，其中，該細菌是埃希氏菌即Escherichia屬的細菌。 [16]如[15]所述之細菌，其中，該細菌是大腸桿菌。 [發明的功效]
本發明能夠廉價且大量地製造具有以抗氧化作用為首的各種生理活性的麥角硫因。
本發明，在第1態樣中，是有關一種製造麥角硫因(在本說明書中有時簡稱為EGT)或其相關物質、或者該等之混合物的方法，其特徵在於，包含下述步驟：利用培養基來培養具有EGT生產能力且屬於腸內細菌科的細菌；以及，從該培養基或藉由該培養所獲得的菌體中採集EGT或其相關物質、或者該等之混合物；並且，前述細菌是以規定的蛋白質的活性下降的方式來改造後的菌株。依據本發明，在具有EGT生產能力且屬於腸內細菌科的細菌中，以規定的蛋白質的活性下降的方式來實施改造，藉此能夠使EGT的生產量飛躍地增加。
在本發明中，為了藉由培養具有EGT生產能力且屬於腸內細菌科的細菌來使EGT生產量增加，而實行該細菌的改造，具體而言，是以包含核心序列區域之蛋白質的活性下降的方式來進行改造，該核心序列區域的一部分包含Ser-Arg-Gly-Arg-Thr(序列編號7)這樣的5個胺基酸。
包含前述核心序列區域之蛋白質，可以是包含作為核心序列區域的以Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg- Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg(序列編號8，X15aa、X16aa及X17aa設為任意的胺基酸)表示的序列之蛋白質。此處，前述核心序列區域，較佳是具有選自下述(1)～(3)的胺基酸之序列： (1)X15aa為白胺酸或異白胺酸； (2)X16aa為異白胺酸或纈胺酸； (3)X17aa為異白胺酸或纈胺酸。
進一步，包含前述核心序列區域之蛋白質，可以是包含作為核心序列區域的以X1aa-Trp-Thr-X2aa-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Trp-Trp-X6aa-X7aa-X8aa-X9aa-X10aa-X11aa-X12aa-X13aa-X14aa-Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg-X18aa-X19aa(序列編號9，X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa、X6aa、X7aa、X8aa、X9aa、X10aa、X11aa、X12aa、X13aa、X14aa、X15aa、X16aa、X17aa、X18aa及X19aa設為任意的胺基酸)表示的序列之蛋白質。此處，前述核心序列區域，較佳是具有選自下述(1)～(19)的胺基酸之序列： (1)X1aa是麩胺酸(Glu)、絲胺酸(Ser)或甘胺酸(Gly)； (2)X2aa是白胺酸、纈胺酸或絲胺酸； (3)X3aa是苯丙胺酸(Phe)或白胺酸； (4)X4aa是苯丙胺酸或酪胺酸(Tyr)； (5)X5aa是丙胺酸(Ala)或甘胺酸； (6)X6aa是纈胺酸、白胺酸或異白胺酸； (7)X7aa是丙胺酸、絲胺酸或異白胺酸； (8)X8aa是色胺酸(Trp)或酪胺酸； (9)X9aa是絲胺酸或丙胺酸； (10)X10aa是脯胺酸(Pro)或異白胺酸； (11)X11aa是苯丙胺酸或麩胺醯胺(Gln)； (12)X12aa是纈胺酸或蛋胺酸(Met)； (13)X13aa是甘胺酸或絲胺酸； (14)X14aa是白胺酸、蛋胺酸或異白胺酸； (15)X15aa為白胺酸或異白胺酸； (16)X16aa為異白胺酸或纈胺酸； (17)X17aa為異白胺酸或纈胺酸； (18)X18aa是麩胺醯胺或麩胺酸； (19)X19aa是苯丙胺酸或白胺酸。
作為包含前述核心序列區域之蛋白質的具體例，可列舉BetT蛋白和CaiT蛋白，前述BetT蛋白是下述(a)、(b)或(c)所記載之蛋白質，前述CaiT蛋白是下述(d)、(e)或(f)所記載之蛋白質： (a)包含序列編號10所示的胺基酸序列之蛋白質； (b)包含胺基酸序列之蛋白質，該胺基酸序列包含在序列編號10所示的胺基酸序列中取代、缺失、插入或附加1～數個胺基酸殘基； (c)包含相對於序列編號10所示的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列之蛋白質； (d)包含序列編號11所示的胺基酸序列之蛋白質； (e)包含胺基酸序列之蛋白質，該胺基酸序列包含在序列編號11所示的胺基酸序列中取代、缺失、插入或附加1～數個胺基酸殘基； (f)包含相對於序列編號11所示的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列之蛋白質。
包含前述核心序列區域之蛋白質，較佳是：包含相對於序列編號10所示的胺基酸序列具有90%以上、95%以上或98%以上的同一性的胺基酸序列之BetT蛋白、包含相對於序列編號10所示的胺基酸序列具有90%以上、95%以上或98%以上的同一性的胺基酸序列之CaiT蛋白。
在本發明中，所謂「取代、缺失、插入或附加1～數個胺基酸殘基」，意指取代、缺失、插入或附加1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸殘基，較佳是意指取代、缺失、插入或附加1個、2個、3個、4個、5個或6個胺基酸殘基，進一步更佳是意指取代、缺失、插入或附加1個、2個、3個或4個胺基酸殘基。
在本發明中，所謂「EGT的相關物質」，意指EGT的類似物(analog)，包括EGT氧化物和烷基化物等。作為EGT氧化物的具體例，可列舉：麥角硫因次磺酸(Ergothioneine sulfenic acid)、麥角硫因亞磺酸(Ergothioneine sulfinic acid)、麥角硫因磺酸(Ergothioneine sulfonic acid)、二硫接合物、混合二硫化物、組胺酸甜菜鹼(Hercynine)等。作為烷基化物，可列舉S-甲基麥角硫因(S-Methyl-Ergothioneine)等。已有報告指出，上述氧化物和烷基化物是由麥角硫因藉由細胞內的代謝反應、或因培養液中的氧或氧化劑導致的氧化反應來產生(記載於L. Servillo et al., Free. Radic. Biol. Med., 2015, 79, 228-36、及R. M. Y. Tang, et al., Sci. Rep., 2018, 8(1), 1601中)。又，作為類似物，亦可列舉麥角硒因(selenoneine)等。
藉由對具有EGT生產能力且屬於腸桿菌細菌科的細菌實行上述改造，亦即以包含規定的核心序列區域之蛋白質的活性下降的方式來實行改造，能夠使EGT的生產量飛躍地增加。
用於本發明中的具有EGT生產能力且屬於腸桿菌細菌科的細菌，是下述細菌：以包含核心序列區域且該核心序列區域的一部分包含Ser-Arg-Gly-Arg-Thr(序列編號7)這樣的5個胺基酸之蛋白質的活性下降的方式來改造後的細菌、以包含以Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg(序列編號8，X15aa、X16aa及X17aa設為任意的胺基酸)表示的核心序列區域之蛋白質的活性下降的方式來改造後的細菌、或以包含以X1aa-Trp-Thr-X2aa-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Trp-Trp-X6aa-X7aa-X8aa-X9aa-X10aa-X11aa-X12aa-X13aa-X14aa-Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg-X18aa-X19aa(序列編號9，X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa、X6aa、X7aa、X8aa、X9aa、X10aa、X11aa、X12aa、X13aa、X14aa、X15aa、X16aa、X17aa、X18aa及X19aa設為任意的胺基酸)表示的核心序列區域之蛋白質的活性下降的方式來改造後的細菌，較佳是以BetT蛋白或CaiT蛋白、或是與這些蛋白質的胺基酸序列的同一性為90%以上的蛋白質的活性下降的方式來改造後的細菌。BetT蛋白活性或CaiT蛋白活性的下降的比例，較佳是低於其母株的50%，更佳是低於25%，進一步更佳是低於10%。所謂消除BetT蛋白活性或CaiT蛋白活性後的細菌，是指完全沒有偵測到BetT蛋白活性或CaiT蛋白活性的細菌。或者，減少或消除BetT蛋白活性或CaiT蛋白活性後的細菌，亦能夠稱為降低或消除BetT蛋白基因表現或CaiT蛋白基因表現後的細菌。BetT蛋白基因表現或CaiT蛋白基因表現的降低的比例，較佳是低於其母株的50%，更佳是低於25%，進一步更佳是低於10%。最佳是消除BetT蛋白基因表現或CaiT蛋白基因表現後的細菌。所謂消除BetT蛋白基因表現或CaiT蛋白基因表現後的細菌，是指完全沒有偵測到BetT蛋白基因表現或CaiT蛋白基因表現的細菌。再者，BetT蛋白活性或CaiT蛋白活性、及BetT蛋白基因表現或CaiT蛋白基因表現，能夠利用下述公知的方法來進行測定：北方墨點法、反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)法、即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)法、西方墨點法等。
減少或消除BetT蛋白活性或CaiT蛋白活性的方法、以及降低或消除BetT蛋白基因表現或CaiT蛋白基因表現的方法亦為公知，可列舉例如：藉由同源重組(homologous recombination)、突變處理、基因組編輯(genome editing)等來剔除(knockout)或減弱(knockdown)BetT蛋白基因或CaiT蛋白基因的方法、或對細菌投予能夠抑制BetT蛋白或CaiT蛋白的物質的方法等；但是不限定於這些方法。又，用於本發明中的細菌，可以是作為自然突變的結果而減少或消除BetT蛋白活性或CaiT蛋白活性後的細菌。
用於本發明中的具有EGT生產能力且屬於腸桿菌細菌科的細菌，較佳是以增強EGT合成基因的表現的方式來改造後的細菌。
EGT生合成基因，是編碼參與EGT的生合成的酵素之基因。參與EGT的生合成的酵素和EGT生合成基因為公知，若干基因的核苷酸序列亦為公知。本發明所屬技術領域中具有通常知識者，能夠適當選擇所述EGT生合成基因。例如，較佳是增強：與恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)的egtA、egtB、egtC、egtD或egtE相當的基因中的任1種或1種以上的表現；與粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的Egt1或Egt2相當的基因中的任一方或雙方的表現；與紅麵包黴(Neurospora crassa)相當的Egt1或Egt2的基因中的任一方或雙方的表現；與泥生綠菌 (Chlorobium limicola)相當的eanA或eanB的基因中的中的任一方或雙方的表現。但是不限定於這些微生物的基因。關於分枝桿菌屬的EGT生合成基因，可參照F. P. Seebeck, J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 6632-6633。關於裂殖酵母屬的EGT生合成基因，可參照T. Pluskal et al, PLOS ONE., 2014, 9(5), e97774。關於紅黴屬的EGT生合成基因，可參照W. Hu et al., Org. Lett., 2014, 16, 5382-5385。又，關於鏈黴(Streptomyces)屬的EGT生合成基因，可參照S. Nakajima et al., J. Biosci. Bioeng., 2015, 120, 294-298。又，關於綠菌屬的EGT生合成基因，可參照R. Burn, et al., Angew. Chem. Int. Edit., 2017, 56, 12508-12511.。關於各種微生物中的EGT生合成基因，可參照G. W. Jones et al, Gene, 2014, 549, 161-170。
所謂「增強基因的表現」，意指與母株相比，該基因的表現量較多。較佳是母株或野生株的2倍以上的表現量，更佳是5倍以上的表現量，進一步更佳是10倍以上的表現量。基因表現的定量，能夠利用北方墨點法和即時聚合酶連鎖反應等的公知的方法來實行。
所謂「相當的基因」，是指相對於編碼了能夠在某個微生物的EGT生合成路徑中催化某個反應的酵素之基因，編碼了能夠在其他微生物的EGT生合成路徑中催化與該酵素相同或類似的反應的酵素之基因。某個基因、及與該基因相當的基因，可具有相同的核苷酸序列，亦可具有不同的核苷酸序列。例如，某個基因及與該基因相當的基因的核苷酸序列的同一性，可以是50%以上，亦可以是70%以上、80%以上、或90%以上。進一步，由某個基因所編碼的酵素蛋白、及由與該某個基因相當的基因所編碼的酵素蛋白，可具有相同的胺基酸序列，亦可具有不同的胺基酸序列。由某個基因所編碼的酵素蛋白及由與該某個基因相當的基因所編碼的酵素蛋白的胺基酸序列同一性，可以是50%以上，亦可以是70%以上、80%以上、或90%以上。
EGT生合成基因的表現的增強，能夠使用公知的基因表現增強方法來實行。一般是將EGT生合成基因置於表現較強的啟動子(promoter)的控制下的方法。例如，可藉由將插入有適合於EGT生合成基因的表現的啟動子與EGT生合成基因之表現載體導入微生物中、或藉由利用同源重組等來將EGT生合成基因插入宿主的基因組中，來增加EGT生合成基因的表現。作為載體，能夠使用質體載體或病毒載體。建構載體時，能夠適當選擇下述載體的構成要素來使用：啟動子、終止子(terminator)；抗藥性基因和代謝酵素基因等的標識基因等。對細菌導入基因的方法亦為公知。能夠將所欲導入的基因直接導入細菌中，或將所欲導入的基因插入載體，然後導入細菌中。作為基因導入方法的例子，存在有脂質轉染 (lipofection)法、磷酸鈣法、使用了聚合物的方法、電穿孔法(electroporation)、粒子槍(particle gun)法等，能夠根據要導入基因的細菌種類或要導入的基因，來適當選擇這些方法。又，EGT生合成基因的表現的增強，可藉由使基因組上的特定基因或區域缺失，來誘發內源性的EGT生合成基因的表現。
EGT生合成基因的表現的增強方法，不限定於上述方法。又，用於本發明中的細菌，可以是作為自然突變的結果而增強EGT生合成基因的表現後的細菌。EGT生合成基因的表現的增強，能夠利用北方墨點法和即時聚合酶連鎖反應等的公知的方法來確認。或者，亦能夠藉由實際培養細菌，並將生產於菌體內或菌體外(培養液中)的EGT定量，來確認EGT生合成基因的表現增強的情形。
能夠在細菌中增強表現的EGT生合成基因，可以是1種，亦可以是2種以上。可將編碼參與EGT生合成的複數種酵素的基因，以基因簇(gene cluster)的方式導入細菌。可將源自異屬或異種微生物的EGT生合成基因導入來增強表現，亦可將源自同屬或同種微生物的EGT生合成基因導入來增強表現。較佳是將源自同屬或近緣屬的EGT生合成基因導入來增強表現，更佳是將源自同種或近緣種的EGT生合成基因導入來增強表現。進一步更佳是將源自同種的EGT生合成基因導入來增強表現。
作為用於本發明的具有EGT生產能力且屬於腸桿菌細菌科的細菌，可例示：埃希氏菌(Escherichia)屬、腸桿菌(Enterobacter)屬、泛菌(Pantoea)屬、克雷白氏菌(Klebsiella)屬、及沙門氏菌(Salmonella)屬的細菌；但是不限定於這些細菌。作為特佳的腸桿菌，可列舉下述腸桿菌：大腸桿菌(Escherichia coli)等的埃希氏菌屬、菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)等的泛菌屬等。
本發明的EGT製造方法中的屬於腸內細菌科的細菌的培養，能夠利用通常的方法來實行。具體而言，能夠使用溶菌肉湯(LB)培養基、2倍酵母菌萃取物-胰化蛋白(2×YT)培養基、NZY培養基、M9培養基、SOC培養基或酵母菌萃取物-蛋白腖-葡萄糖(YPD)培養基等。能夠使用上述培養基來生產EGT，但是所使用的培養基不限定於這些培養基。又，所生產的EGT，可累積於菌體內，亦可分泌、累積於菌體外(培養液中)。
菌體內或從菌體中游離出來的EGT的回收，能夠根據公知的方法來實行。例如，能夠將培養物提供用於離心分離或過濾等的固液分離，並藉由溶劑萃取、熱水萃取、破碎處理等來從菌體內取得EGT萃取液。能夠提供用於離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾層析等公知的層析，來從EGT萃取液或培養上清液中獲得EGT。
本發明，在第2態樣中，有關一種具有EGT生產能力且屬於腸內細菌科的細菌，該細菌是依據本發明而以規定的蛋白質的活性下降的方式來改造。
依據本發明而以規定的蛋白質的活性下降的方式來改造後的具有EGT生產能力且屬於腸內細菌科的細菌，是以包含核心序列區域且該核心序列區域的一部分包含Ser-Arg-Gly-Arg-Thr(序列編號7)這樣的5個胺基酸之蛋白質的活性下降的方式來改造後的具有EGT生產能力且屬於腸內細菌科的細菌、以包含以Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly- Arg-Thr-X17aa-Arg(序列編號8，X15aa、X16aa及X17aa設為任意的胺基酸)表示的核心序列區域之蛋白質的活性下降的方式來改造後的具有EGT生產能力且屬於腸內細菌科的細菌、或以包含以X1aa-Trp-Thr-X2aa-X3aa-X4aa-Trp-X5aa-Trp-Trp-X6aa-X7aa-X8aa-X9aa-X10aa-X11aa-X12aa-X13aa-X14aa-Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg-X18aa-X19aa(序列編號9，X1aa、X2aa、X3aa、X4aa、X5aa、X6aa、X7aa、X8aa、X9aa、X10aa、X11aa、X12aa、X13aa、X14aa、X15aa、X16aa、X17aa、X18aa及X19aa設為任意的胺基酸)表示的核心序列區域之蛋白質的活性下降的方式來改造後的具有EGT生產能力且屬於腸內細菌科的細菌，較佳是以BetT蛋白或CaiT蛋白、或是與這些蛋白質的胺基酸序列的同一性為90%以上的蛋白質的活性下降的方式來改造後的具有EGT生產能力且屬於腸內細菌科的細菌。關於BetT蛋白或CaiT蛋白的活性下降，如上文所說明。
依據本發明而以規定的蛋白質的活性下降的方式來改造後的具有EGT生產能力且屬於腸內細菌科的細菌，較佳是以增強EGT合成基因的表現的方式來改造後的細菌。
以增強EGT合成基因的表現的方式來改造後的細菌，是依據本發明而以規定的蛋白質的活性下降的方式來改造後的具有EGT生產能力且屬於腸內細菌科的細菌，作為該細菌，較佳是經藉由增強下述基因的表現來增強EGT生合成基因的表現後的細菌：與恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)的egtA、egtB、egtC、egtD或egtE相當的基因中的任1種或1種以上；與粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的Egt1或Egt2相當的基因中的任一方或雙方；與紅麵包黴(Neurospora crassa)的Egt1或Egt2相當的基因中的任一方或雙方。但是不限定於這些細菌。
依據本發明而以規定的蛋白質的活性下降的方式來改造後的具有EGT生產能力且屬於腸內細菌科的細菌，可以是埃希氏菌(Escherichia)屬、腸桿菌(Enterobacter)屬、泛菌(Pantoea)屬、克雷白氏菌(Klebsiella)屬、及沙門氏菌(Salmonella)屬的細菌，但是不限定於這些細菌，特佳是下述細菌：大腸桿菌(Escherichia coli)等的埃希氏菌屬、菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)等的泛菌屬等。
以下示出實施例來進一步詳細且具體地說明本發明，但是實施例並不限定本發明的範圍。再者，當沒有特別說明時，是使用與分子生物學、應用微生物學有關的標準實驗手冊中記載的方法、或將其加以修飾、改變後的方法，來實施實驗。又，只要未特別載明，%表示w/v%。 [實驗例1]
＜建構EGT生產用載體(egt1-2)＞ 為了在大腸桿菌中生產EGT，建構下述EGT生產載體。作為EGT生合成基因，是使用源自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的egt1(SPBC1604.01：序列編號1)、egt2(SPBC660.12c：序列編號2)。將包含序列表記載的EGT生合成基因egt1、egt2之載體作為模板，並使用表1記載的引子(primer)，來分別放大egt1、egt2。
[表1]
表現載體，是使用pACG，其是將具有p15A複製起點之表現載體的啟動子改造成大腸桿菌的gapA基因的啟動子，進一步將藥物標記變更成四環黴素抗性基因而得。使用In-Fusion HD cloning Kit(寶生物公司製造)來將上述egt1、egt2的PCR產物，連接於pACG的啟動子正下方的HindIII-BamHI部位上，來建構作為EGT的生產用載體的pACG-EGT。In-Fusion反應，是依據寶生物公司提供的實驗手冊來實行。
使用作為大腸桿菌的野生株的MG1655株(ATCC寄存編號：700926)，並使用所建構的pACG-EGT，來實行形質轉換，而獲得EGT生產株(MG1655/pACG-EGT)。 [實施例2]
＜以大腸菌來進行EGT生產試驗＞ 使用實施例1中建構的EGT生產株MG1655/pACG-EGT，來實行EGT的發酵生產試驗。將對MG1655株導入空白載體pACG而得的MG1655/pACG設為對照株。將MG1655/pACG、MG1655/pACG-EGT各自的甘油凍存菌添加至包含3mL的LB培養基(10g聚蛋白腖(polypeptone)、5g酵母菌萃取物、10g NaCl/1L培養基)與四環黴素(最終濃度為10μg/mL)之試驗管中，並以37℃、200rpm的條件進行振盪培養15～18小時，直到達到穩定期(stationary phase)為止，而獲得前培養液。進一步，在500mL容量的附有擋板之燒瓶中的50mL的2×TY培養基(16g聚蛋白腖、10g酵母菌萃取物、5g NaCl、5%葡萄糖、5mM左旋組胺酸、2.5mM左旋胱胺酸、5mM左旋甲硫胺酸、10μg/mL四環黴素/1L培養基)中，以成為光密度(OD)＝0.4的方式來添加前培養液，並以37℃、160rpm的條件進行振盪96小時，藉此實行本培養。
EGT的定量，是如下所述地實行。在本培養之間、培養開始後24、48、72、96小時採集1mL培養液，來評估培養試樣。測定所採集的培養液的菌體濁度(OD600)後，以14000rpm進行離心分離10分鐘，來將其分離成菌體外培養液與沉澱物(菌體)。沉澱物，是藉由熱水萃取(60℃、10分鐘)來萃取細胞內成分，並作為菌體內試樣。藉由高效液相層析(HPLC)來測定菌體內試樣和分離後的菌體外培養液(菌體外試樣)中的EGT含量。HPLC測定條件，如以下表2所述，是根據在保持時間為10分鐘附近產生的EGT峰，來實行定量。
[表2]
培養試驗的結果，在培養72小時後，從對照組MG1655/pACG中未確認到EGT生產，但是在MG1655/pACG-EGT的培養液和菌體內萃取物中確認到EGT峰，從而確認到EGT合成基因依賴性的EGT生產(第1圖)。 [實施例3]
＜ΔbetT、ΔcaiT中的EGT生產試驗＞ 繼而，實行EGT的發酵生產試驗，該發酵生產試驗使用了betT、caiT各自的基因破壞株。betT基因破壞株(ΔbetT)、caiT基因破壞株(ΔcaiT)，是利用下述以往公知的方法來建構：藉由使用了反向篩選載體(counter-selection vector，包含sacB基因、抗藥性基因)的同源重組法，來使大腸桿菌MG1655株的各基因區域缺失，該反向篩選載體包含betT基因、caiT基因各自的上游序列與下游序列。上述破壞株的建構，可參照M. S. Donnenberg and J. S. Kaper, Infect. Immun., 1991, 4310-4317、和H. Mizoguchi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2007, 71 (12), 2905-2911等。以pACG-EGT來對所建構的ΔbetT、ΔcaiT進行形質轉換，而獲得ΔbetT/pACG-EGT、ΔcaiT/pACG-EGT。作為對照株，是將實施例2中建構的MG1655/pACG-EGT使用於下述培養試驗。
培養方法和EGT的分析方法，是如實施例2所記載地實行。培養試驗的結果，相對於野生株，培養開始96小時後的培養液中的EGT生產量，在ΔbetT/pACG-EGT中提升約8.6倍(在菌體內則提升12.3倍)，在ΔcaiT/pACG-EGT中提升約4.6倍(在菌體內則提升3.75倍)，因而在兩基因破壞株中細胞內外的EGT生產量驚人地顯著提升(第2圖、第3圖)。 [實施例4]
＜建構EGT生產用載體(egtD-eanB)＞ 建構使用了源自厭氧性細菌的EGT合成基因之生產用載體。藉由使egtD基因所編碼的酵素、以及在厭氧性細菌中發現的eanB基因所編碼的酵素在大腸桿菌中表現，能夠利用源自硫代硫酸的硫來進行EGT的生合成。egtD基因是設為使用對源自藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)的胺基酸序列進行密碼子最佳化而得的基因序列(序列編號12)，該藍色鏈黴菌被分類在與恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)相同的放線菌目；eanB基因是設為使用對源自厭氧性細菌的泥生綠菌(Chlorobium limicola)的胺基酸序列進行密碼子最佳化而得的基因序列(序列編號13)。人工合成上述2個基因。載體，是利用實施例1中建構的pACG-EGT。利用限制酶HindIII-BamHI對pACG-EGT進行處理，來切出egt1基因，並利用接合(ligation)來將人工合成的egtD基因連接在HindIII-BamHI部位。藉由對選殖egtD基因後的載體進一步以NheI-XbaI酶進行處理，來切出egt2，並利用接合來將eanB基因連接在NheI-XbaI部位，藉此建構在gapA啟動子的下游選殖有egtD-eanB之pACG_egtD-eanB。 [實施例5]
＜使用EGT生產用載體(egtD-eanB)來實行的EGT生產試驗＞ 以實施例4中建構的pACG_egtD-eanB來對MG1655、以及實施例3中作成的ΔbetT、ΔcaiT的3株大腸桿菌進行形質轉換，並將所獲得的菌株使用於以下的EGT生產試驗。 使用所作成的3個菌株來實行的生產試驗，是使用10mM硫代硫酸鈉取代實施例2所記載的本培養條件的2.5mM胱胺酸來實施。其結果，即便在將egtD-enaB基因使用於EGT生產載體中的情況下，於培養開始48小時後的時候，在ΔbetT、ΔcaiT株中EGT生產性比野生株更顯著地提升(第4圖)。
序列編號：1是源自粟酒裂殖酵母的egt1基因(SPBC1604.01)的鹼基序列。 序列編號：2是源自粟酒裂殖酵母的egt2基因(SPBC660.12c)的鹼基序列。 序列編號：3是用以放大源自粟酒裂殖酵母的egt1基因(SPBC1604.01)的順向引子(forward primer)的鹼基序列。 序列編號：4是用以放大源自粟酒裂殖酵母的egt1基因(SPBC1604.01)的反向引子(reverse primer)的鹼基序列。 序列編號：5是用以放大源自粟酒裂殖酵母的egt2基因(SPBC660.12c)的順向引子的鹼基序列。 序列編號：6是用以放大源自粟酒裂殖酵母的egt2基因(SPBC660.12c)的反向引子的鹼基序列。 序列編號：7是核心序列區域所共通的胺基酸序列。 序列編號：8是核心序列區域的胺基酸序列。 序列編號：9是核心序列區域的胺基酸序列。 序列編號：10是BetT蛋白的胺基酸序列。 序列編號：11是CaiT蛋白的胺基酸序列。 序列編號：12是對源自藍色鏈黴菌的EgtD蛋白的胺基酸序列進行密碼子最佳化成大腸桿菌用而得的鹼基序列。 序列編號：13是對源自泥生綠菌的EanB蛋白進行密碼子最佳化成大腸桿菌用而得的鹼基序列。 [產業上的可利用性]
根據本發明的製造麥角硫因或其相關物質、或者該等之混合物的方法，能夠用來廉價且大量地製造具有以抗氧化作用為首的各種生理活性的麥角硫因。
無
第1圖是繪示使用生產麥角硫因的大腸桿菌、MG1655/pACG-EGT來實行麥角硫因的發酵生產試驗的結果(培養72小時後)的圖；out表示培養液中各自的EGT含量，in表示菌體內的各自的EGT含量。 第2圖是繪示使用導入有pACG-EGT之betT基因破壞株、caiT基因破壞株來實行麥角硫因的發酵生產試驗的結果(培養96小時後)的圖；out表示培養液中各自的EGT含量，in表示菌體內的各自的EGT含量。 第3圖是繪示使用導入有pACG-EGT之betT基因破壞株、caiT基因破壞株來實行麥角硫因的發酵生產試驗的結果(培養液中的EGT生產量的經時變化)的圖。 第4圖是繪示使用導入有pACG_egtD-eanB之betT基因破壞株、caiT基因破壞株來實行麥角硫因的發酵生產試驗的結果的圖，繪示以pACG_egtD-eanB進行形質轉換後的MG1655、ΔbetT、ΔcaiT各株的培養液中的EGT累積量(培養48小時)。
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Claims (12)
- 一種製造麥角硫因或其相關物質、或者該等之混合物的方法，其特徵在於，包含下述步驟：利用培養基來培養具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科(Enterobacteriaceae)的細菌；以及，從該培養基或藉由該培養所獲得的菌體中採集麥角硫因或其相關物質、或者該等之混合物；並且，前述細菌是以包含核心序列區域之蛋白質的活性下降的方式來改造後的菌株，該核心序列區域的一部分包含Ser-Arg-Gly-Arg-Thr即序列編號7這樣的5個胺基酸；其中，包含前述核心序列區域之蛋白質是BetT蛋白或CaiT蛋白中的任一方或雙方，前述BetT蛋白是下述(a)或(c)所記載之蛋白質，前述CaiT蛋白是下述(d)或(f)所記載之蛋白質：(a)包含序列編號10所示的胺基酸序列之蛋白質；(c)包含相對於序列編號10所示的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列之蛋白質；(d)包含序列編號11所示的胺基酸序列之蛋白質；(f)包含相對於序列編號11所示的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列之蛋白質。
- 如請求項1所述之方法，其中，前述核心序列區域是以Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg- Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg即序列編號8表示的序列，且X15aa、X16aa及X17aa設為任意的胺基酸。
- 如請求項2所述之方法，其中，前述核心序列區域是具有選自下述(1)~(3)的胺基酸之序列：(1)X15aa為白胺酸或異白胺酸；(2)X16aa為異白胺酸或纈胺酸；(3)X17aa為異白胺酸或纈胺酸。
- 如請求項1~3中任一項所述之方法，其中，前述具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科(Enterobacteriaceae)的細菌，是以增強麥角硫因合成基因的表現的方式來改造後的細菌。
- 如請求項4所述之方法，其中，前述麥角硫因合成基因包含下述基因中的任1種或1種以上：與恥垢分枝桿菌即Mycobacterium smegmatis的egtA、egtB、egtC、egtD或egtE相當的基因；與粟酒裂殖酵母即Schizosaccharomyces pombe的Egt1或Egt2相當的基因；與紅麵包黴即Neurospora crassa的Egt1或Egt2相當的基因；與泥生綠菌即Chlorobium limicola的eanA或eanB相當的基因。
- 如請求項1~3中任一項所述之方法，其中，前述具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科 (Enterobacteriaceae)的細菌是埃希氏菌即Escherichia屬的細菌。
- 如請求項6所述之方法，其中，前述具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科(Enterobacteriaceae)的細菌是大腸桿菌。
- 一種具有麥角硫因生產能力且屬於腸內細菌科(Enterobacteriaceae)的細菌，其以包含核心序列區域之蛋白質的活性下降的方式來改造，該核心序列區域具有Ser-Arg-Gly-Arg-Thr即序列編號7這樣的5個胺基酸；其中，該細菌是以增強麥角硫因合成基因的表現的方式來改造後的細菌，前述麥角硫因合成基因包含下述基因中的任1種或1種以上：與恥垢分枝桿菌即Mycobacterium smegmatis的egtA、egtB、egtC、egtD或egtE相當的基因；與粟酒裂殖酵母即Schizosaccharomyces pombe的Egt1或Egt2相當的基因；與紅麵包黴即Neurospora crassa的Egt1或Egt2相當的基因；與泥生綠菌即Chlorobium limicola的eanA或eanB相當的基因；包含前述核心序列區域之蛋白質是BetT蛋白或CaiT蛋白中的任一方或雙方，前述BetT蛋白是下述(a)或(c)所記載之蛋白質，前述CaiT蛋白是下述(d)或(f) 所記載之蛋白質：(a)包含序列編號10所示的胺基酸序列之蛋白質；(c)包含相對於序列編號10所示的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列之蛋白質；(d)包含序列編號11所示的胺基酸序列之蛋白質；(f)包含相對於序列編號11所示的胺基酸序列具有90%以上的同一性的胺基酸序列之蛋白質。
- 如請求項8所述之細菌，其中，前述核心序列區域是以Phe-X15aa-Ala-Arg-X16aa-Ser-Arg-Gly-Arg-Thr-X17aa-Arg即序列編號8表示的序列，且X15aa、X16aa及X17aa設為任意的胺基酸。
- 如請求項9所述之細菌，其中，前述核心序列區域是具有選自下述(1)~(3)的胺基酸之序列：(1)X15aa為白胺酸或異白胺酸；(2)X16aa為異白胺酸或纈胺酸；(3)X17aa為異白胺酸或纈胺酸。
- 如請求項8~10中任一項所述之細菌，其中，該細菌是埃希氏菌即Escherichia屬的細菌。
- 如請求項11所述之細菌，其中，該細菌是大腸桿菌。
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