TWI820041B

TWI820041B - 新型抗CD3ε抗體

Info

Publication number: TWI820041B
Application number: TW107133192A
Authority: TW
Inventors: 競李; 芹梅
Original assignee: 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2023-11-01
Also published as: SG11202001358RA; US12485298B2; JP7737193B2; US20200299384A1; MX2020003087A; US20230192850A1; AU2018336519A1; SA523440043B1; WO2019057099A1; AU2025201457A1; NZ762170A; EP3684806A4; KR102785140B1; JP2020534830A; JP7305624B2; EA202090800A1; CN115991777A; IL273393A; MY199530A; EP3684806A1

Abstract

本發明提供一種分離之抗CD3ε之單株抗體或其抗原結合片段、編碼其之分離之多核苷酸、包括其之藥物組合物、及其用途，上述抗體或其抗原結合片段包含一個或多個選自下組之重鏈CDR序列：SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47，及/或一個或多個選自下組之κ輕鏈CDR序列：SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46及48。

Description

新型抗CD3ε抗體

本發明總體上係關於一種新型抗CD3ε抗體及其用途。

CD3(分化簇3)T細胞共受體係一種蛋白複合體，由四條不同之鏈組成：CD3γ鏈、CD3δ鏈及兩條CD3ε鏈。該等鏈與稱為T細胞受體(TCR)之分子以及ζ鏈結合，以在T淋巴細胞中產生活化信號。TCR、ζ鏈及CD3分子共同組成了TCR複合體，其中作為次單元之TCR識別抗原並與抗原連結，並且作為次單元之CD3將抗原刺激轉移並傳遞至信號通路，並且最終調節T細胞活性。CD3蛋白存在於幾乎所有之T細胞中。

CD3與TCR共同形成CD3-TCR複合體，其在調節T細胞先天性與獲得性免疫應答之大多數功能、以及細胞免疫功能與體液免疫功能方面起到關鍵作用。該等作用包括消除病原體、以及藉由多種細胞毒性作用控制腫瘤生長。

特異性針對人CD3之小鼠單株抗體，如OKT3(Kung等(1979)Science 206：347-9)係第一代用於治療之CD3抗體。儘管OKT3具有很強之免疫抑制效力，但與其免疫原性之與有絲分裂之潛能有關之嚴重之副作用阻礙了其臨床使用(Chatenoud(2003)Nature Reviews 3：123-132)。OKT3誘導抗球蛋白反應，促進其自身之迅速清理及中和作用(Chatenoud等(1982)Eur.J.Immunol.137：830-8)。又，OKT3誘導T細胞增殖以及細胞因子之體外產生，並且引起大規模之細胞因子之體內釋放 (Hirsch等(1989)J.Immunol 142：737-43,1989)。細胞因子之釋放(亦稱為「細胞因子風暴」)轉而引起「流感樣」之症狀，其特徵為發熱、寒戰、頭痛、噁心、嘔吐、腹瀉、呼吸困難、膿毒性腦膜炎及低血壓(Chatenoud，2003)。該等嚴重副作用限制了OKT3在移植中更廣泛之使用，並且限制了其擴展至其他臨床領域(如自身免疫)之使用(參考文獻同上)。

對新型抗CD3抗體存在很大之需求。

本申請全文中之冠詞「一種」、「一個」及「上述」在此用於指代一個或多於一個(即至少一個)該冠詞之語法對象。舉例而言，「一種抗體」指一種抗體或多於一種抗體。

本申請提供一種新型抗CD3ε單株抗體、其胺基酸及核苷酸序列、以及其用途。

在一個方面，本申請提供一種分離之抗體或其抗原結合片段，其包括1、2或3個選自下組之CDR序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47，及/或1、2或3個選自下組之κ輕鏈CDR序列：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46及48。

在某些實施形態中，上述之抗體或其抗原結合片段包括1、2或3個與SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45或47所示之序列具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之重鏈CDR序列。在某些實施形態中，上述之抗體或其抗原結合片段包括1、2或3個與SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46或48具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之輕鏈CDR序列。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區，上述重鏈可變區選自下組：a)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：5之CDR序列；b)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：11之CDR序列；c)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：17之CDR序列；d)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：23之CDR序列；e)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：29之CDR序列；f)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：35之CDR序列；g)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：41之CDR序列；及h)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：47之CDR序列。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括κ輕鏈可變區，上述κ輕鏈可變區選自下組：a)κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：6之CDR序列；b)κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：12之CDR序列；c)κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：18之CDR序列；d)κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：24之CDR序列；e)κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：30之CDR序列；f)κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：36之CDR序列；g)κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：42之CDR序列；及h)κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：48之CDR序列。

在某些實施形態中，上述抗體或其抗原結合片段包括選自下組之重鏈CDR3序列：SEQ ID NO：5、11、17、23、29、35、41及47。

在某些實施形態中，上述抗體或其抗原結合片段包括： a)選自下組之重鏈CDR1序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：43；b)選自下組之重鏈CDR2序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：45；及c)選自下組之重鏈CDR3序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：47。

在某些實施形態中，上述抗體或其抗原結合片段包括：a)選自下組之輕鏈CDR1序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：44；b)選自下組之輕鏈CDR2序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：46；及c)選自下組之輕鏈CDR3序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：48。

在某些實施形態中，上述抗體或其抗原結合片段包括：a)選自下組之重鏈CDR1序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：43； b)選自下組之重鏈CDR2序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：45；c)選自下組之重鏈CDR3序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：47；d)選自下組之輕鏈CDR1序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：44；e)選自下組之輕鏈CDR2序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：46；及f)選自下組之輕鏈CDR3序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：48。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括：a)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：5之CDR序列；以及κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：6之CDR序列；b)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：11之CDR序列；以及κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：12之CDR序列； c)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：17之CDR序列；以及κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16及SEQ ID NO：18之CDR序列；d)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：23之CDR序列；以及κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：24之CDR序列；e)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：29之CDR序列；以及κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：30之CDR序列；f)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：35之CDR序列；以及κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：36之CDR序列；g)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：41之CDR序列；以及κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：42之CDR序列；及h)重鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：47之CDR序列；以及κ輕鏈可變區，其包括1、2或3個選自SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：48之CDR序列。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段進而包括：1、2、3或4個選自下組之重鏈框架區(FR)序列：SEQ ID NO：57、59、61、63、73、75、77及79，及/或1、2、3或4個選自下組之輕鏈框架區(FR)序列：SEQ ID NO：58、60、62、64、74、76、78及80。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段進而包括：重鏈FR1序列，上述重鏈FR1選自SEQ ID NO：57及73；重鏈FR2序列，上述重鏈FR2選自SEQ ID NO：59及75；重鏈FR3序列，上述重鏈FR3選自SEQ ID NO：61及77；以及重鏈FR4序列，上述重鏈FR4選自SEQ ID NO：63及79。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段進而包括：輕鏈FR1序列，上述輕鏈FR1選自SEQ ID NO：58及74；輕鏈FR2序列，上述輕鏈FR2選自SEQ ID NO：60及76；輕鏈FR3序列，上述輕鏈FR3選自SEQ ID NO：62及78；以及輕鏈FR4序列，上述輕鏈FR4選自SEQ ID NO：64及80。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括：重鏈可變區，上述重鏈可變區選自下組：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117及與其具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之同源序列。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括：輕鏈可變區，上述輕鏈可變區選自下組：SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119及與其具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之同源序列。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括選自下組之重鏈可變區序列之全部或一部分：SEQ ID NO：81、85、89、93、97、101、105、109、113及117；及/或選自下組之輕鏈可變區序列之全部或一部分：SEQ ID NO：83、87、91、95、99、103、107、111、115及119。在一個實施形態中，上述抗體或其抗原結合片段係由選自下組之重鏈可變區序列之全部或一部分組成之單域抗體：SEQ ID NO：81、85、89、93、97、101、105、109、113及117。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括：a)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：81；以及κ輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：83；b)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：85；以及κ輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：87；c)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：89；以及κ輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：91；d)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：93；以及κ輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：95； e)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：97；以及κ輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：99；f)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：101；以及κ輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：103；g)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：105；以及κ輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：107；h)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：109；以及κ輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：111；i)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：113；以及κ輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：115；及j)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：117；以及κ輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：119。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括一個或多個胺基酸殘基置換，但仍然保持與CD3ε之特異性結合親和力。

在某些實施形態中，上述置換在一個或多個CDR序列裏、或在一個或多個FR序列裏、或在一個或兩個可變區序列裏、或在Fc區。在某些實施形態中，在CDR序列裏、在FR序列裏、在可變區序列裏或在Fc區之上述置換中之至少一個(或全部)包括保守性置換。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段在選自SEQ ID NO：1-48之一個或多個CDR序列中包括不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基置換。在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段在選自SEQ ID NO：57-80之一個或多個FR序列中包括不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基置換。在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段在選自SEQ ID NO：81、85、89、93、97、101、105、109、113及117之重鏈可變區序列之CDR序列及/或FR序列中包括總共不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個置換。在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段在選自SEQ ID NO：83、87、91、95、99、103、107、111、115及119之輕鏈可變區序列之所有FR序列中包括不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基置換。

在某些實施形態中，上述置換賦予一種或多種需要之性質，上述需要之性質選自：a)提高與CD3ε之結合親和力，b)引入或移除糖基化位點，c)引入游離之半胱胺酸殘基，d)提高或降低ADCC或CDC，e)增加血清半衰期，及f)增加FcRn結合。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段進而包括免疫球蛋白恆定區。在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括IgG之恆定區。在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段包括人IgG1之恆定區。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段為鼠科抗體或人源化抗體。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段為駱駝化單域抗體(camelized single chain domain antibody)、雙功能抗體(diabody)、scFv、scFv二聚體、BsFv、dsFv、(dsFv)₂、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')₂、雙特異性抗體、ds雙功能抗體(ds diabody)、奈米抗體、域抗體或雙價域抗體。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段具有雙特異性。在某些實施形態中，上述抗體或其抗原結合片段具有針對CD3ε之第一抗原特異性及第二抗原特異性。在某些實施形態中，上述第二抗原特異性針對不同於CD3ε之第二抗原，其中上述第二抗原存在於表現CD3ε之T細胞附近，此為免疫系統識別上述第二抗原所需。在某些實施形態中，上述第一抗原特異性針對CD3ε，並且上述第二抗原特異性針對與腫瘤相關之抗原。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段與一種或多種結合物連接。在某些實施形態中，上述結合物可為化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素、發光標記、螢光標記、或酶受質標記。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段能夠特異性地與CD3ε結合。在某些實施形態中，上述CD3ε源自小鼠、大鼠、猴或人。在某些實施形態中，上述CD3ε係重組CD3ε或表現在細胞表面上之CD3ε。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段能夠以不超過5×10^-9M、不超過4×10^-9M、不超過3×10^-9M、不超過2×10^-9M、不超過10^-9M、不超過5×10^-10M、不超過4×10^-10M、不超過3×10^-10M、不超過2×10^-10M、不超過10^-10M之K_D、不超過5×10^-11M、不超過4×10^-11M、不超過3×10^-11M、不超過2×10^-11M或不超過10^-11M值特異性地與表現在細胞表面上之人CD3ε結合，上述K_D值係藉由流式細胞術測定。在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段能夠以不超過0.50nM或不超過1.10nM之EC₅₀值特異性地與表現在細胞表面上之人CD3ε結合，上述EC₅₀值係藉由流式細胞術測定。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段能夠以不超過0.001nM、不超過0.005nM、不超過0.01nM、不超過0.02nM或不超過0.03nM、不超過0.04nM或不超過0.05nM之EC₅₀值特異性地與重組食蟹猴CD3ε結合，上述EC₅₀值係藉由ELISA測定。

在某些實施形態中，上述抗體或其抗原結合片段能夠以不超過0.01nM、不超過0.02nM、不超過0.03nM、不超過0.04nM、不超過0.05nM、不超過0.06nM、不超過0.07nM或不超過0.08nM之EC₅₀值特異性地與重組人CD3ε結合，上述EC₅₀值係藉由ELISA測定。

在某些實施形態中，上述抗體或其抗原結合片段能夠以不超過0.5nM、不超過0.6nM、不超過0.7nM、不超過0.8nM、不超過0.9nM、不超過1nM、不超過2nM、不超過3nM、不超過4nM、不超過5nM、不超過6nM、不超過7nM、不超過8nM、不超過9nM或不超過10nM之EC₅₀值特異性地與表現在表現CD3之細胞表面上之人CD3ε結合，上述EC₅₀值係藉由流式細胞術測定。

在某些實施形態中，上述抗體或其抗原結合片段係人源化抗體，其能夠以不超過0.50nM或不超過1.10nM之EC₅₀值特異性地與表現在表現CD4之細胞表面上之人CD3ε結合，上述EC₅₀值係藉由流式細胞術測定。

在一個方面，本申請提供一種抗體或其抗原結合片段，其與本申請提供之抗體或其抗原結合片段競爭相同之表位。

在一個方面，本申請進而提供一種藥物組合物，其包括本申請所述之抗體或其抗原結合片段以及藥學上容許之載劑。在某些實施形態中，上述藥物組合物進而包括第二藥劑，其能夠提高上述抗體或其抗原結合片段之治療效果，及/或能夠降低上述抗體或其抗原結合片段之副作用。

在一個方面，本申請進而提供一種分離之多核苷酸，其編碼本申請所述之抗體或其抗原結合片段。在某些實施形態中，上述分離之多核苷酸包括選自下組之核苷酸序列：SEQ ID NO：82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118及120。

在一個方面，本申請進而提供一種包括上述分離之多核苷酸之載體。

在一個方面，本申請進而提供一種包括上述載體之宿主細胞。

在一個方面，本申請進而提供一種表現本申請所述之抗體或其抗原結合片段之方法，其包括在表現上述多核苷酸之條件下培養上述宿主細胞。

在一個方面，本申請進而提供一種在會從對CD3ε活性之調節中受益之受試者中治療疾病或狀況之方法，其包括向上述受試者施用治療有效量之本申請所述之抗體或其抗原結合片段或本申請所述之藥物組合物。在某些實施形態中，上述受試者為人類。在某些實施形態中，上述疾病或狀況為與CD3相關之疾病或狀況。在某些實施形態中，上述疾病或狀況為癌症、自體免疫疾病、炎性疾病或感染性疾病。

在一個方面，本申請進而提供一種在體內或在體外活化表現CD3ε之T細胞之方法，其包括將上述表現CD3ε之T細胞與本申請提供之抗體或其抗原結合片段接觸。

在一個方面，本申請進而提供一種在表現CD3ε之細胞中之調節CD3活性之方法，其包括將上述表現CD3ε之細胞暴露於本申請所述之抗體或其抗原結合片段。

在一個方面，本申請進而提供一種藉由表現CD3ε之T細胞來促進第二抗原之體內或體外加工之方法，上述方法包括將上述表現CD3ε之T細胞與本申請所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段接觸，其中上述雙特異性抗體或抗原結合片段能夠與上述表現CD3ε之T細胞及第二抗原特異性地結合，從而使兩者接近。

在一個方面，本申請進而提供一種檢測樣品中CD3ε之存在或含量之方法，其包括將上述樣品與本申請所述之抗體或其抗原結合片段接觸，以及確定樣品中CD3ε之存在或含量。

在一個方面，本申請進而提供一種在受試者中診斷與CD3相關之疾病或狀況之方法，其包括：a)獲取來自上述受試者之樣品；b)將上述樣品與本申請所述之抗體或其抗原結合片段接觸；c)確定在上述樣品中CD3ε之存在或含量；及d)將上述CD3ε之存在或含量與上述受試者之疾病或狀況相關聯。

在一個方面，本申請進而提供一種本申請所述之抗體或其抗原結合片段在製備用於治療受試者中與CD3相關之疾病或狀況之藥物中之用途。

在一個方面，本申請進而提供一種本申請所述之抗體或其抗原結合片段在製備用於診斷與CD3相關之疾病或狀況之診斷試劑中之用途。

在一個方面，本申請進而提供一種套組，上述套組包含本申請提供之抗體或其抗原結合片段，上述套組用於檢測CD3ε。在某些實施形態中，上述套組包含抗體或其抗原結合片段，上述抗體或其抗原結合片段用於檢測重組CD3ε、表現在細胞表面上之CD3ε、或者表現CD3ε之細胞。

圖1表示單株抗體WBP3311_2.166.48-uIgG1K、WBP3311_2.306.4-uIgG1K及WBP3311_2.166.48與重組食蟹猴CD3ε蛋白之結合，其藉由ELISA測定。

圖2表示單株抗體WBP3311_2.166.48-uIgG1K、WBP3311_2.306.4-uIgG1K、WBP3311_2.166.48及WBP3311_2.306.4與人CD4 T細胞之結合，其藉由流式細胞術測定。

圖3表示8個小鼠抗體(W3311-2.166.48、W3311-2.306.4、W3311-2.383.47、W3311-2.400.5、W3311-2.482.5、W3311-2.488.33、W3311-2.615.8及W3311-2.844.8)與表現人CD3之細胞(Jurkat細胞)之結合親和力，其藉由流式細胞術測定。

圖4A表示人源化抗體WBP3311_2.166.48-z1-uIgG1K與表現人CD3之細胞(Jurkat細胞)之結合親和力，其藉由流式細胞術測定。

圖4B表示人源化抗體WBP3311_2.306.4-z1-uIgG1K與表現人CD3之細胞(Jurkat細胞)之結合親和力之結果，其藉由流式細胞術測定。

圖4C表示陽性對照OKT3與表現人CD3之細胞(Jurkat細胞)之結合親和力之結果，其藉由流式細胞術測定。

圖5表示8個小鼠抗體(W3311-2.166.48、W3311-2.306.4、W3311- 2.383.47、W3311-2.400.5、W3311-2.482.5、W3311-2.488.33、W3311-2.615.8及W3311-2.844.8)對表現人CD3之細胞(Jurkat細胞)之細胞內化率，其藉由流式細胞術測定。

圖6表示8個小鼠抗體(W3311-2.166.48、W3311-2.306.4、W3311-2.383.47、W3311-2.400.5、W3311-2.482.5、W3311-2.488.33、W3311-2.615.8及W3311-2.844.8)對人T細胞活化之結果，其藉由細胞內細胞因子TNFα及IFNγ染色測得。

圖7表示兩個人源化抗體(WBP3311_2.166.48-z1-uIgG1K及WBP3311_2.306.4-z1-uIgG1K)對人T細胞活化之結果，其藉由細胞內細胞因子TNFα及IFNγ染色測得。

圖8表示7個小鼠抗體(W3311-2.166.48、W3311-2.306.4、W3311-2.400.5、W3311-2.482.5、W3311-2.488.33、W3311-2.615.8及W3311-2.844.8)針對純系WBP3311_2.383.47之表位分組之結果。

本申請之以下描述僅為說明本申請之多種實施形態。因此，此處討論之具體修改形態不應理解為對申請範圍之限制。本領域之技術人員在不偏離本申請範圍之情況下即可很容易地得出多種等同形態、變化及修改，應理解此種等同實施形態包括在本發明範圍內。在本申請中引用之所有文獻，包括公開出版物、專利及專利申請均藉由引用之方式全文併入。

定義

本發明中之「抗體」一詞包括任意可結合某特定抗原之免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多價抗體、雙價抗體、單價抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體。一個天然之完整抗體包含兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈。哺乳動物之重鏈可分為α、δ、ε、γ及μ，每條重鏈由一個可變區(V_H)以及第一、第二及第三恆定區(分別為C_H1、C_H2、C_H3)組成；哺乳動物之輕鏈可分為λ或κ，每條輕鏈由一個可變區(分別為λ輕鏈之V_L或κ輕鏈之V_K)以及一個恆定區(分別為λ輕鏈之C_L或κ輕鏈之C_K)組成。抗體呈「Y」型，「Y」型結構之頸部由兩條重鏈之第二及第三恆定區組成，其藉由二硫鍵結合。「Y」型結構之每條臂包括其中一條重鏈之可變區及第一恆定區，其與一條輕鏈之可變區及恆定區結合。輕鏈及重鏈之可變區決定抗原之結合。每條鏈之可變區均含有三個高變區，稱互補決定區(CDR)(輕鏈之CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重鏈之CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本發明中公開之抗體及抗原結合片段之CDR邊界可藉由Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或識別。(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，273(4)，927(1997)；Chothia,C.等，J Mol Biol.Dec 5；186(3)：651-63(1985)；Chothia,C.與Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，196,901(1987)；Chothia,C.等，Nature.Dec 21-28；342(6252)：877-83(1989)；Kabat E.A.等，National Institutes of Health，馬里蘭貝塞斯達(1991))。其中，三個CDR由被稱為框架區(FR)之側面連續部分間隔開，框架區比CDR更加高度保守並形成一個支架支持超變環。重鏈及輕鏈之恆定區與抗原結合無關，但具有多種效應功能。抗體依據重鏈恆定區之胺基酸序列可分成幾類。根據是否含有α、δ、ε、γ及μ重鏈，抗體可分別分為五個主要之分類或異構體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。幾個主要之抗體分類亦可分為亞類，如IgG1(γ1重鏈)、IgG2(γ2重鏈)、IgG3(γ3重鏈)、IgG4(γ4重鏈)、IgA1(α1重鏈)或IgA2(α2重鏈)等。

本申請中之「二價」一詞係指具有兩個抗原結合位點之抗體或抗原結合片段；「單價」一詞係指僅具有一個單一抗原結合位點之抗體或抗原結合片段；「多價」一詞係指具有多個抗原結合位點之抗體或抗原結合片段。在一些實施形態中，本申請所述之抗體或其抗原結合片段為二價。

在本申請中，「雙特異性」抗體係指具有源自兩個不同之單株抗體之片段，並且能夠與兩個不同之表位結合之人造抗體。上述兩個表位可存在於同一個抗原，或者其可存在於兩個不同之抗原。

本申請中之「抗原結合片段」一詞係指由含有1、2或3個CDR之抗體部分或者任何其他結合抗原但不具有完整抗體結構之抗體片段所形成之一種抗體片段。抗原結合片段之例包括但不限於，如雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定之雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價之雙功能抗體)、雙價單鏈抗體(BsFv)、雙特異性抗體、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體、域抗體及雙價域抗體。抗原結合片段可與母體抗體結合相同之抗原。

抗體之「Fab」片段係指由一條輕鏈(包括可變區及恆定區)與一條重鏈之可變區及恆定區經二硫鍵結合而成之那部分抗體分子。

「Fab'」片段係指包含了部分鉸鏈區之Fab片段。

「F(ab')₂」係指Fab'之二聚體。抗體之「Fv」係指含有完整抗原結合位點之最小抗體片段。Fv片段由一條輕鏈之可變區及一條重鏈之可變區組成。

「dsFv」係指二硫鍵穩定之Fv片段，其單條輕鏈之可變區與單條重鏈之可變區之間之連接為二硫鍵。在一些實施形態中「(dsFv)₂」或「(dsFv-dsFv')」含有三條肽鏈：兩個V_H部分藉由肽接頭(例如較長之彈性接頭)相連，並藉由二硫鍵分別與兩個V_L部分結合。在一些實施形態中，dsFv-dsFv'具有雙特異性，其中每對藉由二硫鍵配對之重鏈輕鏈具有不同之抗原特異性。

「單鏈Fv抗體」或「scFv」係指由輕鏈可變區與重鏈可變區直接相連或藉由一個肽鏈連接而成之工程抗體(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA、85：5879(1988))。

抗體之「Fc」係指由第一重鏈之第二及第三恆定區經由二硫鍵與第二重鏈之第二及第三恆定區連接組成之那部分抗體。抗體之Fc段負責多種不同之效應功能，如抗體依賴之細胞介導之細胞毒性(ADCC)及補體依賴之細胞毒性(CDC)，但在抗原結合中不起作用。

「單鏈抗體Fv-Fc」或「scFv-Fc」係指由連接至某抗體Fc段之scFv組成之工程抗體。

「駱駝化單域抗體(Camelized single domain antibody)」、「重鏈抗體」或「HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)」均係指含有兩個V_H域而不含有輕鏈之抗體(Riechmann L.與Muyldermans S.，J Immunol Methods.Dec 10；231(1-2)：25-38(1999)；Muyldermans S.，J Biotechnol.Jun；74(4)：277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美國專利號6,005,079)。重鏈抗體最初源自駝科(駱駝、單峰駝及美洲駝)。雖然缺失輕鏈，但駱駝化抗體(camelized antibodies)有確證之抗原結合全部功能(Hamers-Casterman C.等，Nature.Jun 3；363(6428)：446-8(1993)；Nguyen VK.等，「Heavy-chain antibodies in Camelidae；a case of evolutionary innovation」Immunogenetics.Apr；54(1)：39-47(2002)；Nguyen VK.等，Immunology.May；109(1)：93-101(2003))。重鏈抗體之可變區(VHH域)為最小之已知之獲得性免疫產生之抗原結合單位(Koch-Nolte F.等，FASEB J.Nov；21(13)：3490-8.Epub 2007 Jun 15(2007))。

「奈米抗體」係指一種抗體片段，其由一個來自重鏈抗體之VHH域及兩個恆定區CH2與CH3組成。

「雙功能抗體(diabody)」或「dAb」包括帶有兩個抗原結合位點之小抗體片段，其中該片段含有在同一條多肽鏈上相連之V_H域與V_L域(V_H-V_L或V_H-V_L)(請參見Holliger P.等，Proc Natl Acad Sci USA.，7月15日；90(14)：6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。兩個域之間銜接物很短，使同一條鏈上之兩個域不能互相配對，從而迫使兩個域與另一條鏈之互補域配對，形成兩個抗體結合位點。該兩個抗體結合位點可靶向結合相同或不同之抗原(或抗原表位)。在某些實施形態中，「雙特異性ds雙功能抗體」係靶向兩個不同之抗原(或抗原表位)之雙功能抗體。在某些實施形態中，「scFv二聚體」係雙價雙功能抗體或雙價單鏈抗體(BsFv)，含有二聚化之兩個V_H-V_L(由多肽銜接物連接)基，其中一個基之V_H與另一個基之V_L協作形成兩個結合位點，該兩個結合位點可靶向結合相同抗原(或抗原表位)或不同抗原(或抗原表位)。在另一些實施形態中，「scFv二聚體」係雙特異性雙功能抗體，含有相互連接之V_L1-V_H2(由多肽銜接物連接)與V_H1-V_L2(由多肽銜接物連接)，其中V_H1與V_L1協作，V_H2與V_L2協作，且每個協作之配對具有不同之抗原特異性。

「域抗體」係指僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區之抗體片段。在某些情況下，兩個或多個V_H域由肽連接子共價結合形成雙價域或多價域抗體。雙價域抗體之兩個V_H域可靶向作用於相同或不同之抗原。

本申請中使用之術語「嵌合」係指具有源自一種物種之重鏈及/或輕鏈之一部分，與上述重鏈及/或輕鏈其餘部分源自不同物種之抗體或抗原結合片段。在一個示例性之實例中，嵌合抗體可包括源自人之恆定區及源自非人動物(例如小鼠)之可變區。在一些實施形態中，上述非人動物為哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豚鼠或倉鼠。

本申請中使用之術語「人源化」係指包括源自非人動物之CDR、源自人之FR區、以及源自人之恆定區(當適用時)之抗體或抗原結合片段。

本申請中使用之「CD3」係指源自任何脊椎動物來源之分化簇3蛋白，包括哺乳動物，如靈長類動物(例如人、猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在哺乳動物中，CD3分子係六條鏈之多蛋白質複合體，包括：CD3γ鏈、CD3δ鏈、兩條CD3ε鏈及CD3ζ鏈之同源二聚體，其中CD3ζ鏈係CD3分子之細胞內尾巴，並且CD3γ鏈、CD3δ鏈及CD3ε鏈全部含有表現在T細胞表面上之胞外域(ECD)。人CD3之示例性之序列包括人CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_000724)、人CD3δ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_000723)及人CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_000064)。非人CD3之示例性之序列包括食蟹猴(Macaca fascicularis)(猴)CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001270544)、食蟹猴(Macaca fascicularis)(猴)CD3δ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001274617)、食蟹猴(Macaca fascicularis)(猴)CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001270839)；小鼠CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_031674)、小鼠CD3δ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_038515)、小鼠CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.AAA37400)；褐家鼠(大鼠)CD3ε蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001101610)、褐家鼠(大鼠)CD3δ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_037301)、褐家鼠(大鼠)CD3γ蛋白(NCBI Ref Seq No.NP_001071114)。在某些實施形態中，用於本申請之CD3亦可為重組CD3，例如，包括重組CD3ε蛋白、重組CD3δ蛋白與重組CD3γ蛋白，其能夠可選地表現為重組CD3複合體。重組CD3複合體可在細胞表面上表現，或者可表現為不結合在細胞表面上之可溶形式。

本申請中使用之術語「CD3ε」旨在包含任何形式之CD3ε，例如，1)天然未經加工之CD3ε分子，「全長」CD3ε鏈或天然存在之CD3ε變體，包括例如剪接變體或等位基因變體；2)由在細胞中之加工產生之任何形式之CD3ε；或3)藉由重組方法產生之CD3ε亞單位之全長、片段(例如截短之形式、胞外域/跨膜域)或修飾之形式(例如突變之形式、糖基化/聚乙二醇化之、組胺酸-標記/免疫螢光融合之形式)。

術語「抗CD3ε抗體」係指能夠與CD3ε(例如人或猴CD3ε)特異性結合之抗體。

本申請中之「特異性結合」或「特異性之結合」係指兩分子間之非隨機結合反應，如抗體與抗原間之反應。在某些實施形態中，本申請之抗體或其抗原結合片段與人及/或猴CD3ε特異性結合，並且其結合親和力(K_D)

10^-6M(如：

5×10^-7M、

2×10^-7M、

10^-7M、

5×10^-8 M、

2×10^-8M、

10^-8M、

5×10^-9M、

4x10^-9M、

3x10^-9M、

2×10^-9M或

10^-9M)。本申請中之K_D係指解離速度與結合速度之比值(k_off/k_on)，其可藉由使用任何本領域公知之傳統方法測定，包括但不限於表面電漿共振法、微量熱泳法、HPLC-MS方法及流式細胞術(例如FACS)方法。在某些實施形態中，藉由使用流式細胞術可適當地確定K_D值。

本申請中之「阻斷結合」或「競爭性同樣之表位」之能力係指抗體或其抗原結合片段將兩個分子間結合(例如人CD3ε與抗CD3ε抗體)之相互作用抑制至任何可檢測之程度之能力。在某些實施形態中，阻斷兩個分子間結合之抗體或抗原結合片段可將兩個分子間結合之相互作用抑制至少85%或至少90%。在某些實施形態中，此種抑制作用可大於85%或大於90%。

本申請中使用之「表位」係指抗原分子中與抗體結合之那部分胺基酸或原子基。若兩種抗體表現出對抗原之競爭性結合，則可能結合抗原上相同或密切相關之表位。例如，若抗體或其抗原結合片段對參照抗體結合至抗原(例如本申請所述之重組人/猴CD3ε或表現在細胞表面上之CD3ε)之阻斷達到至少85%或至少90%，則上述抗體或其抗原結合片段可被認為與上述參照抗體結合相同/密切相關之表位。

本領域之技術人員將認識到，無需過度之實驗即可判斷人單株抗體是否與本申請所述之抗體(例如小鼠單株抗體WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP331_2.488.33、WBP3311_2.615.8、WBP3311_2.844.8、以及人源化抗體WBP3311_2.166.48-z1及WBP3311_2.306.4-z1)結合至相同之表位，藉由確定前者是否阻止後者與 CD3ε抗原多肽結合。若待測抗體與本申請所述之抗體競爭，顯示為本申請所述之抗體與CD3ε抗原多肽之結合減少，則該兩種抗體與相同或密切相關之表位結合。或者若本申請所述之抗體抑制待測抗體與CD3ε抗原多肽之結合，則該兩種抗體與相同或密切相關之表位結合。

本申請使用之抗體名稱中之符號具有不同代表意義：「mIgG2」係指具有小鼠IgG2同種型恆定區之抗體；「uIgG1」係指具有人IgG1同種型恆定區之抗體；「K」或「L」係指上述抗體使用κ輕鏈或λ輕鏈。

在本申請中當「保守置換」用於胺基酸序列時，係指將一個胺基酸殘基用另一個具有相似理化性質之側鏈之胺基酸殘基置換。例如，可在疏水側鏈胺基酸殘基間(例如Met、Ala、Val、Leu及Ile)、中性親水側鏈殘基間(例如Cys、Ser、Thr、Asn及Gln)、酸性側鏈殘基間(例如Asp、Glu)、鹼性側鏈胺基酸間(例如His、Lys及Arg)或方向側鏈殘基間(例如Trp、Tyr及Phe)進行保守置換。本領域已知保守置換通常不會引起蛋白構象結構之顯著變化，因此能夠保留蛋白質之生物活性。

本申請所述之術語「同源」與「同源之」可互換使用，係指當最佳比對時核酸序列(或其互補鏈)或胺基酸序列具有與另一條序列至少80%(如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之同一性。

當「百分比序列同一性」用於胺基酸序列(或核酸序列)時，係指在進行序列比對，並且必要時引入間隔使相同胺基酸(或核酸)數目達到最多後，在候選序列中，與參比序列相同之胺基酸(或核酸)殘基占上述候選序列之胺基酸(或核酸)殘基之百分比。上述胺基酸殘基之保守置換可認為或可不認為係相同殘基。可藉由本領域公開之工具，例如BLASTN、BLASTp(美國國家生物技術資訊中心網站(NCBI)，亦可參見Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))、ClustalW2(歐洲生物資訊研究所網站，可參見Higgins D.G.等，Methods in Enzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(英國牛津)，23(21)：2947-8(2007))及ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體，對序列進行比對以確定胺基酸(或核酸)序列之百分比序列同一性。本領域技術人員可使用上述工具之默認參數或根據比對之需要適當調整參數，例如藉由挑選合適之算法。

本申請中使用之「效應功能」係指抗體之Fc區與其效應器例如C1複合體及Fc受體結合之生物活性。示例性之效應功能包括抗體與C1複合體上之C1q相互作用誘導之補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體之Fc區與效應細胞上之Fc受體結合誘導之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)以及吞噬。

對某種狀況之「治療」或「療法」包括預防或減輕某種狀況、降低某種狀況興起或發展之速度、減少發展出某種狀況之風險、預防或延遲與某種狀況相關之症狀發展、減少或終止與某種狀況相關之症狀、產生某種狀況之完全或部分之逆轉、治癒某種狀況、或以上之組合。

「被分離」之物質已被人工由自然狀態改變。若自然界中出現某種「被分離」之物質或成分，則其已被改變或脫離其原始狀態，或二者均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在之多核苷酸或多肽未被分離，但若該等多核苷酸或多肽與之在天然狀態下共存之物質足夠分離並以足夠純之狀態存在，則可認為「被分離」。「分離之核酸」序列係指被分離之核酸分子之序列。在某些實施形態中，「分離之抗體或其抗原結合片段」係指純度為至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之抗體或抗原結合片段，其由電泳方法(如SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳)、或層析法(如離子交換層析或反相HPLC)確定。

本發明中「載體」係指可將編碼某蛋白之多核苷酸操作性地插入其中並使該蛋白獲得表現之一種運載工具。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶之遺傳物質元件在宿主細胞內得以表現。舉例而言，載體包括：質粒、噬菌粒、柯斯質粒、人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生之人工染色體(PAC)、噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體、以及動物病毒等。用作載體之動物病毒種類有逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(如單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。載體可含有多種控制表現之元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。又，載體亦可含有複製起始位點。載體亦可包括協助其進入細胞之成分，包括但不限於病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼。載體可為表現載體或選殖載體。本申請提供之載體(例如表現載體)含有本申請所述之編碼抗原或其抗原結合片段之核酸序列、至少一個可操作地連接至上述核酸序列之啟動子(例如SV40、CMV、EF-1α)、以及至少一個選擇標記。載體之實例包括但不限於逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(例如單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌體與M13噬菌體、質粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

本發明中「宿主細胞」係指導入外源多核苷酸及/或載體之細胞。

本申請中使用之「與CD3相關之疾病或狀況」係指由CD3提高或減少之表現或活性引起、惡化，或藉由其他方式產生聯繫之任何疾病或狀況。在一些實施形態中，與CD3相關之狀況為與免疫相關之病症，例如癌症、自體免疫疾病、炎性疾病或感染性疾病。

本申請中使用之「癌症」係指以惡性細胞生長或腫瘤、異常增生、浸潤或轉移為特徵之任何醫學狀況，並且包括實體腫瘤及例如白血病之非實體癌症(血液惡性腫瘤)。本申請中使用之「實體瘤」係指腫瘤及/或惡性細胞之實體團塊。

「藥用容許之」係指所指之載劑、溶劑、稀釋劑、賦形劑及/或鹽，總體而言在化學上及/或在物理上與製劑中之其他配料相容，並在生理上與接受者相容。

抗CD3ε抗體

本申請提供一種包含選自下組之抗CD3ε抗體之一個或多個(例如1、2、3、4、5或6個)CDR序列之抗CD3ε抗體及其抗原結合片段：WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP331_2.488.33、WBP3311_2.615.8或WBP3311_2.844.8。在本申請全文中，當提及抗體名稱時，術語「WBP3311」與「W3311」可互換使用。例如，抗體WBP3311_2.166.48亦被指代為W3311_2.166.48，並且該名稱指代同一抗體。

本申請中使用之「WBP3311_2.166.48」係指具有如SEQ ID NO：81所示之重鏈可變區、以及如SEQ ID NO：83所示之κ輕鏈可變區之小鼠單株抗體。

本申請中使用之「WBP3311_2.306.4」係指具有如SEQ ID NO：85所示之重鏈可變區、以及如SEQ ID NO：87所示之κ輕鏈可變區之小鼠單株抗體。

本申請中使用之「WBP3311_2.383.47」係指具有如SEQ ID NO：89所示之重鏈可變區、以及如SEQ ID NO：91所示之κ輕鏈可變區之小鼠單株抗體。

本申請中使用之「WBP3311_2.400.5」係指具有如SEQ ID NO：93所示之重鏈可變區、以及如SEQ ID NO：95所示之κ輕鏈可變區之小鼠單株抗體。

本申請中使用之「WBP3311_2.482.5」係指具有如SEQ ID NO：97所示之重鏈可變區、以及如SEQ ID NO：99所示之κ輕鏈可變區之小鼠單株抗體。

本申請中使用之「WBP331_2.488.33」係指具有如SEQ ID NO：101所示之重鏈可變區、以及如SEQ ID NO：103所示之κ輕鏈可變區之小鼠單株抗體。

本申請中使用之「WBP3311_2.615.8」係指具有如SEQ ID NO：105所示之重鏈可變區、以及如SEQ ID NO：107所示之κ輕鏈可變區之小鼠單株抗體。

本申請中使用之「WBP3311_2.844.8」係指具有如SEQ ID NO：109所示之重鏈可變區、以及如SEQ ID NO：111所示之κ輕鏈可變區之小鼠單株抗體。

表1表示該8個抗CD3ε抗體之CDR序列。以下亦提供重鏈及輕鏈之可變區序列。

以下提供WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP331_2.488.33、WBP3311_2.615.8及WBP3311_2.844.8、以及人源化之WBP3311_2.166.48及WBP3311_2.306.4抗體之重鏈或κ輕鏈可變區序列。

WBP3311_2.166.48-VH

胺基酸序列(SEQ ID NO：81)：

核酸序列(SEQ ID NO：82)：

WBP3311_2.166.48-VK

胺基酸序列(SEQ ID NO：83)：

核酸序列(SEQ ID NO：84)：

WBP3311_2.306.4-VH

胺基酸序列(SEQ ID NO：85)：

核酸序列(SEQ ID NO：86)：

WBP3311_2.306.4-VK

胺基酸序列(SEQ ID NO：87)：

核酸序列(SEQ ID NO：88)：

WBP3311_2.383.47-VH

胺基酸序列(SEQ ID NO：89)：

核酸序列(SEQ ID NO：90)：

WBP3311_2.383.47-VK

胺基酸序列(SEQ ID NO：91)：

核酸序列(SEQ ID NO：92)：

WBP3311_2.400.5-VH

胺基酸序列(SEQ ID NO：93)：

核酸序列(SEQ ID NO：94)：

WBP3311_2.400.5-VK

胺基酸序列(SEQ ID NO：95)：

核酸序列(SEQ ID NO：96)：

WBP3311_2.482.5-VH

胺基酸序列(SEQ ID NO：97)：

核酸序列(SEQ ID NO：98)：

WBP3311_2.482.5-VK

胺基酸序列(SEQ ID NO：99)：

核酸序列(SEQ ID NO：100)：

WBP331_2.488.33-VH

胺基酸序列(SEQ ID NO：101)：

核酸序列(SEQ ID NO：102)：

WBP331_2.488.33-VK

胺基酸序列(SEQ ID NO：103)：

核酸序列(SEQ ID NO：104)：

WBP3311_2.615.8-VH

胺基酸序列(SEQ ID NO：105)：

核酸序列(SEQ ID NO：106)：

WBP3311_2.615.8-VK

胺基酸序列(SEQ ID NO：107)：

核酸序列(SEQ ID NO：108)：

WBP3311_2.844.8-VH

胺基酸序列(SEQ ID NO：109)：

核酸序列(SEQ ID NO：110)：

WBP3311_2.844.8-VK

胺基酸序列(SEQ ID NO：111)：

核酸序列(SEQ ID NO：112)：

已知CDR負責抗原結合，然而已發現6個CDR並不均為不可缺少或不可改變之。換言之，可替換或改變或修飾抗CD3ε抗體WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP331_2.488.33、WBP3311_2.615.8或WBP3311_2.844.8中之一個或多個CDR，而基本上保持與CD3ε特異性結合之親和力。

在某些實施形態中，本申請所述之抗CD3ε抗體及其抗原結合片段包含抗CD3ε抗體WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP331_2.488.33、WBP3311_2.615.8及WBP3311_2.844.8之一之重鏈CDR3序列。在某些實施形態中，本申請所述之抗CD3ε抗體與抗原結合片段包含選自由SEQ ID NO：5、11、17、23、29、35、41及47組成之群之重鏈CDR3序列。重鏈CDR3區位於抗原結合位點之中心，並因此被認為與抗原接觸最多，而且對抗體與抗原之親和力提供最多之自由能。此外亦認為重鏈CDR3由於多種多樣化機制在長度、胺基酸組成及構象方面係目前抗原結合位點最多樣化之CDR(Tonegawa S.，Nature.302：575-81)。重鏈CDR3之多樣化足以產生多數抗體特異性(Xu JL,Davis MM.Immunity.13：37-45)以及所需之抗原結合親和力(Schier R等，J Mol Biol.263：551-67)。

在某些實施形態中，只要本申請所述之抗體及其抗原結合片段可特異性地結合至CD3ε，則上述之抗體及其抗原結合片段包含框架區(FR)序列。表1中所示之CDR序列獲取自小鼠抗體，但其可使用本領域公知之合適方法(如重組技術)移植至任何合適物種(如小鼠、人、大鼠、兔以及其他)之任何合適之FR序列。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體及其抗原結合片段人源化。人源化之抗體或抗原結合片段理想地在人體具有降低之免疫原性。人源化之抗體或其抗原結合片段在其可變區嵌合，其原因在於非人CDR序列移植至人或基本上為人之FR序列中。抗體或抗原結合片段之人源化基本上可藉由在人免疫球蛋白基因上將非人(如小鼠)CDR基因替換為對應之人CDR基因來完成(參見例如Jones等(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239：1534-1536)。

可使用本領域公知之方法選擇合適之人重鏈及輕鏈可變域，以達到該目的。在一個示例性之實例中，可使用最佳擬合之方法，其中對非人(例如嚙齒動物)抗體可變域序列進行篩選，或者將其與已知之人可變域序列之資料庫進行BLAST比對，並且識別出最接近非人查詢序列之人序列，用作用於移植非人CDR序列之人框架(參見例如Sims等(1993)J.Immunol.151：2296；Chothia等(1987)J.Mot.Biol.196：901)。或者，可將源自所有人抗體之共有序列之框架用於移植非人CDR(參見例如Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285；Presta等(1993)J.Immunol.，151：2623)。

在某些實施形態中，本申請所述之人源化抗體或抗原結合片段除了非人之CDR序列以外，基本上全部由人序列組成。在一些實施形態中，可變區FR與恆定區(若存在)全部或基本上來自人免疫球蛋白序列。人FR序列與人恆定區序列可源自不同之人免疫球蛋白基因，例如，FR序列源自一個人抗體，恆定區來自另一個人抗體。在一些實施形態中，人源化抗體或抗原結合片段包含人FR1-4以及人JH與Jκ。

在某些實施形態中，本申請所述之人源化抗體及其抗原結合片段包含WBP3311_2.166.48-z1或WBP3311_2.306.4-z1之一個或多個FR序列。下文之表2表示WBP3311_2.166.48-z1或WBP3311_2.306.4-z1之FR序列。天然小鼠FR序列亦列於表2。下文亦提供重鏈及輕鏈可變區序列。

本申請中使用之「WBP3311_2.166.48-z1」係指基於WBP3311_2.166.48之人源化抗體，其包含如SEQ ID NO：113所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO：115所示之κ輕鏈可變區。WBP3311_2.166.48-z1具有與其親本抗體WBP3311_2.166.48相當之針對抗原之親和力。

本申請中使用之「WBP3311_2.306.4-z1」係指基於WBP3311_2.306.4之人源化抗體，其包含如SEQ ID NO：117所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO：119所示之κ輕鏈可變區。WBP3311_2.306.4-z1 具有與其親本抗體WBP3311_2.306.4相當之針對抗原之親和力。

WBP3311_2.166.48-z1-VH

胺基酸序列(SEQ ID NO：113)：

核酸序列(SEQ ID NO：114)：

WBP3311_2.166.48-z1-VK

胺基酸序列(SEQ ID NO：115)：

核酸序列(SEQ ID NO：116)：

WBP3311_2.306.4-z1-VH

胺基酸序列(SEQ ID NO：117)：

核酸序列(SEQ ID NO：118)：

WBP3311_2.306.4-z1-VK

胺基酸序列(SEQ ID NO：119)：

核酸序列(SEQ ID NO：120)：

該兩個示例性之人源化抗CD3ε抗體WBP3311_2.166.48-z1或WBP3311_2.306.4-z1均保持與表現CD3之細胞(例如CD4 T細胞)特異性結合之親和力，並且在該方面至少可與親本小鼠抗體相當，甚至優於親本小鼠抗體。該兩個示例性之人源化抗體均保持其與表現CD3之細胞之功能性相互作用，體現為其均可活化人T細胞並且引起TNFα與IFNγ之細胞因子釋放。

在一些實施形態中，源自人之FR區可包含與其所源自之人免疫球蛋白相同之胺基酸序列。在一些實施形態中，人FR之一個或多個胺基酸殘基由來自親本非人抗體之對應殘基取代。此於某些實施形態中為必需，以使人源化抗體或其片段密切接近非人親本抗體結構。在某些實施形態中，本申請所述之人源化抗體或抗原結合片段包含在各個人FR序列中不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基取代，或者在重或輕鏈可變域之所有FR不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基取代。在一些實施形態中，此種胺基酸殘基之變化可能僅存在於重鏈FR區、僅存在於輕鏈FR區、或在兩條鏈上均存在。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體及其抗原結合片段包含選自下組之重鏈可變域序列：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117。在某些實施形態中，本申請所述之抗體及其抗原結合片段包含選自下組之輕鏈可變域序列：SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119。

在一些實施形態中，本申請所述之抗CD3ε抗體與抗原結合片段包含重鏈可變域之全部或部分、及/或輕鏈可變域之全部或部分。在一個實施形態中，本申請所述之抗CD3ε抗體與抗原結合片段為由本申請所述之重鏈可變區域之全部或部分組成之單域抗體。此種單域抗體之更多資訊可在先前技術中得到(參見例如美國專利號6,248,516)。

在某些實施形態中，本申請所述之抗CD3ε抗體及其抗原結合片段進而包含免疫球蛋白恆定區。在一些實施形態中，免疫球蛋白恆定區包含重鏈及/或輕鏈恆定區。重鏈恆定區包含CH1、鉸鏈及/或CH2-CH3區。在某些實施形態中，重鏈恆定區包含Fc區。在某些實施形態中，輕鏈恆定區包含Cκ。

在一些實施形態中，上述抗CD3ε抗體及其抗原結合片段具有IgG1或IgG2a同種型之恆定區，其具有可使用各種測定來評價之減少之或耗竭之效應功能(如ADCC或CDC)，例如Fc受體結合測定、C1q結合測定及細胞裂解測定。

本申請所述之抗體與抗原結合片段之結合親和力可由K_D值表示，其表示當抗原與抗原結合分子之間之結合達到平衡時解離速率與結合速率之比值(k_off/k_on)。使用本領域公知之合適之方法，包括例如流式細胞術測定，可恰當地確定抗原結合親和力(例如K_D)。在一些實施形態中，可藉由流式細胞術確定不同濃度下抗體與抗原之結合，可首先將確定之平均螢光強度(MFI)對抗體濃度製圖，此時藉由使用Prism第5版本(GraphPad Software，聖地牙哥，CA)，將特異性結合螢光強度(Y)與抗體濃度(X)之相關性擬合至單址飽和等式：Y=B_max*X/(K_D+X)，可計算出K_D值，其中B_max係指待測抗體與抗原之最大特異性結合。

在某些實施形態中，本申請所述之抗CD3ε抗體及其抗原結合片段能夠特異性地與表現在細胞表面上之人CD3ε或者重組人CD3ε結合。CD3ε係表現在細胞上之受體。重組CD3ε係重組表現，並且不與細胞膜結合之可溶性CD3ε。重組CD3ε可藉由各種重組技術製備。在一個實例中，編碼人CD3ε胞外域(NP_000724.1)(Met1-Asp126)之CD3ε DNA序列可在表現載體中在C末端處與多組胺酸標記融合，並且隨後轉染並在293E細胞中表現，並且藉由鎳親和層析純化。

在一些實施形態中，本申請所述之抗CD3ε抗體及其抗原結合片段能夠以不超過5×10^-9M、不超過4×10^-9M、不超過3×10^-9M、不超過2×10^-9M、不超過10^-9M、不超過5×10^-10M、不超過4×10^-10M、不超過3×10^-10M、不超過2×10^-10M、不超過10^-10M、不超過5×10^-11M、不超過4×10^-11M、不超過3×10^-11M、不超過2×10^-11M或不超過10^-11M之結合親和力(K_D)特異性地與表現在細胞表面上之人CD3ε結合，上述K_D值係藉由流式細胞術測定。

在某些實施形態中，本申請所述之抗CD3ε抗體及其抗原結合片段與食蟹猴CD3ε(例如表現在細胞表面上之食蟹猴CD3ε或可溶性重組食蟹猴CD3ε)交叉反應。

抗體與重組CD3ε或表現在細胞表面上之CD3ε之結合亦可利用「半最大效應濃度」(EC₅₀)值表示，其係指觀察到其最大效應(例如結合或抑制等)之50%時抗體之濃度。EC₅₀值可藉由本領域公知之方法測得，例如夾心法(如ELISA)、Western印記、流式細胞術、以及其他結合試驗。在某些實施形態中，本申請所述之抗體及其片段以不超過0.01nM、不超過0.02nM、不超過0.03nM、不超過0.04nM、不超過0.05nM、不超過0.06nM、不超過0.07nM、不超過0.08nM之EC₅₀值(即50%結合濃度)特異性地與重組人CD3ε結合，上述EC₅₀值係藉由ELISA測定。在某些實施形態中，本申請所述之抗體及其片段以不超過0.5nM、不超過0.6nM、不超過0.7nM、不超過0.8nM、不超過0.9nM、不超過1nM、不超過2nM、不超過3nM、不超過4nM、不超過5nM、不超過6nM、不超過7nM、不超過8nM、不超過9nM或不超過10nM之EC₅₀值特異性地與表現在細胞表面上之人CD3ε結合，上述EC₅₀值係藉由流式細胞術測定。

在某些實施形態中，抗體及其抗原結合片段以與人CD3ε相似之結合親和力與食蟹猴CD3ε結合。例如，示例性抗體WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP3311_2.488.33、 WBP3311_2.615.8、WBP3311_2.844.8以與人CD3ε相似之親和力或EC₅₀值與食蟹猴CD3ε結合。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體及其抗原結合片段以不超過0.001nM、不超過0.005nM、不超過0.01nM、不超過0.02nM、不超過0.03nM、不超過0.04nM或不超過0.05nM之EC₅₀值特異性地與重組食蟹猴CD3ε結合，上述EC₅₀值係藉由ELISA測定。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體及其片段具有足以用於診斷及/或治療用途之與人CD3ε特異結合之親和力。許多治療方案藉由靶向TCR信號轉導，特別係藉由臨床使用之抗人CD3單株抗體，來調節T細胞免疫。

本申請所述之抗體或其片段可為單株抗體、多株抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、雙特異性抗體、標記抗體、二價抗體或抗獨特型抗體。重組抗體係在體外而非在動物體內使用重組方法製備之抗體。

抗體變體

本申請亦涵蓋本申請所述之抗體及其片段之多種變體。在某些實施形態中，本申請涵蓋本申請所述之示例性抗體之多種變體，即WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4、WBP3311_2.383.47、WBP3311_2.400.5、WBP3311_2.482.5、WBP331_2.488.33、WBP3311_2.615.8及WBP3311_2.844.8之變體。

在某些實施形態中，抗體變體在表1所示之一個或多個CDR序列中、一個或多個表2所示之FR序列中、本申請所述之重或輕鏈可變區序列中、及/或恆定區(例如Fc區)中包含一個或多個修飾或取代。該等變體保持其親本與CD3ε特異結合之親和力，但具有一種或多種上述修飾或取代帶來之所需要之特性。例如抗體變體可具有改進之抗原結合親和力、改進之糖基化模式、減少之糖基化風險、減少之脫胺基作用、減少之或耗竭之效應功能、改進之FcRn受體結合、提高之藥代動力學半衰期、pH值敏感性、及/或對共軛之兼容性(例如一個或多個引入之半胱胺酸殘基)。

可使用本領域公知之方法，例如「丙胺酸掃描誘變」，篩選親本抗體序列以識別合適之或較佳之待修飾或取代之殘基(參見例如Cunningham與Wells，(1989)Science，244：1081-1085)。簡要而言，可識別靶標殘基(例如帶正電之殘基，如Arg、Asp、His、Lys及Glu)並由不帶電之或帶負電之胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)取代，產生被修飾之抗體，並且針對目標特性對其進行篩選。若在一個特定之胺基酸位置上之取代表現出目標功能性改變，則該位置可被識別為潛在之用於修飾或取代之殘基。可藉由用另一種殘基(例如半胱胺酸殘基、帶正電荷之殘基等)取代來進一步評價上述潛在之殘基。

親和力變體

親和力變體可含有如表1所示之一個或多個CDR序列、表2所示之一個或多個FR序列、或者本申請所述之重鏈或輕鏈可變區序列中之修飾或取代。上述親和力變體保持親本抗體之與CD3ε特異性結合之親和力，或者甚至相對於親本抗體具有改進之與CD3ε特異性結合之親和力。在某些實施形態中，CDR序列、FR序列或可變區序列中之至少一個(或全部)取代包含保守取代。

本領域技術人員應理解，在表1與表2所示之CDR序列與FR序列中，一個或多個胺基酸殘基可被取代，而得到之抗體或抗原結合片段仍然保持與CD3ε結合之親和力，或甚至具有改進之結合親和力。可使用本領域公知之各種方法來達到該目的。例如，可生成抗體變體庫(如Fab或scFv變體)，並利用噬菌體展示技術表現，隨後針對與人CD3ε結合之親和力對其進行篩選。又例如，可使用電腦軟體虛擬抗體與人CD3ε之結合，並識別抗體上形成結合界面之胺基酸殘基。在取代中可避開該等殘基以防止結合親和力之降低，或者可作為取代之靶標以獲得更強之結合。

在某些實施形態中，本申請所述之人源化抗體或抗原決定片段在一個或多個CDR序列及/或一個或多個FR序列中包含一個或多個胺基酸殘基取代。在某些實施形態中，親和力變體在CDR序列及/或FR序列中包含總共不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個取代。

在某些實施形態中，上述抗CD3ε抗體及其抗原結合片段包含1、2或3個與表1中列出之序列具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之序列同一性之CDR序列，而同時保持相對於其親本抗體水平相似或更高之與CD19結合之親和力。

在某些實施形態中，上述抗CD3ε抗體及其抗原結合片段包含一個或多個與表2中列出之序列具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之序列同一性之FR序列，而同時保持相對於其親本抗體水平相似或更高之與CD3ε結合之親和力。

在某些實施形態中，上述抗CD3ε抗體及其抗原結合片段包含一個或多個與下列序列具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之序列同一性之可變區序列：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119，而同時保持相對於其親本抗體水平相似或更高之與CD3ε結合之親和力。在一些實施形態中，在選自SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119之序列中，總共有1至10個胺基酸被取代、插入或缺失。在一些實施形態中，上述取代、插入或缺失發生在CDR之外之區域(即在FR)。

糖基化變體

本申請所述之抗CD3ε抗體與抗原結合片段亦包含糖基化變體。可獲取該糖基化變體以提高或降低抗體或抗原結合片段糖基化之程度。

上述抗體或其抗原結合片段可包括一個或多個帶有側鏈之胺基酸殘基，碳水化合物部分(例如寡糖結構)可附接至上述側鏈。抗體之糖基化通常為N連接或O連接。N連接係指碳水化合物部分附接至天冬胺酸殘基之側鏈，例如，三肽序列中之天冬胺酸殘基，如天冬胺酸-X-絲胺酸及天冬胺酸-X-蘇胺酸，其中X係除脯胺酸以外之任何胺基酸。O連接之糖基化係指N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一之糖附接至羥基胺基酸，最常見為附接至絲胺酸或蘇胺酸。對天然糖基化位點之移除可方便地完成，例如藉由改變胺基酸序列，使得存在於該序列中之上述三肽序列(對於N連接之糖基化位點)或者絲胺酸或蘇胺酸殘基(對於O連接之糖基化位點)中之一個被取代。用相似之方式，可藉由引入此種三肽序列或者絲胺酸或蘇胺酸殘基，產生新的糖基化位點。

半胱胺酸工程化之變體

本申請所述之抗CD3ε抗體與抗原結合片段亦涵蓋半胱胺酸工程化之變體，其包括一個或多個引入之游離半胱胺酸胺基酸殘基。

游離半胱胺酸殘基係不為二硫鍵之一部分之半胱胺酸殘基。半胱胺酸工程化之變體可用於藉由例如馬來醯亞胺或鹵乙醯基，在工程化之半胱胺酸之位點與例如細胞毒性及/或成像化合物、標籤或放射性同位素、以及其他物質共軛。用於改造抗體或抗原結合片段以引入游離半胱胺酸殘基之方法為本領域公知，參見例如WO2006/034488。

Fc變體

本申請所述之抗CD3ε抗體與抗原結合片段亦包括Fc變體，其包括一個或多個在其Fc區及/或鉸鏈區之胺基酸殘基修飾或取代。

在某些實施形態中，上述抗CD3ε抗體或抗原結合片段包含一個或多個胺基酸取代，上述胺基酸取代改進與新生兒Fc受體(FcRn)pH值依賴性之結合。此種變體在酸性pH值下與FcRn結合，使其得以免於在溶酶體中降解，並且隨後被轉移並釋放至細胞外，因此，此種變體可具有更長之藥代動力學半衰期。工程化抗體及其抗原結合片段以提高與FcRn之結合親和力之方法為本領域公知，參見例如Vaughn,D.等，Structure，6(1)：63-73，1998；Kontermann,R.等，Antibody Engineering，第1卷第27章：Engineering of the Fc region for improved PK，Springer出版，2010；Yeung,Y.等，Cancer Research，70：3269-3277(2010)；及Hinton,P.等，J.Immunology，176：346-356(2006)。

在某些實施形態中，上述抗CD3ε抗體或抗原結合片段包含一個或多個改變抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之胺基酸取代。在Fc區之CH2域之某些胺基酸殘基可被取代以提高ADCC活性。可替代地或額外地，可改變上述抗體上之碳水化合物結構，以提高ADCC活性。藉由抗體工程化改變ADCC活性之方法已記述於先前技術中，參見例如Shields RL等，J Biol Chem.2001.276(9)：6591-604；Idusogie EE等，J Immunol.2000.164(8)：4178-84；Steurer W.等，J Immunol.1995，155(3)：1165-74；Idusogie EE.等，J Immunol.2001，166(4)：2571-5；Lazar GA.等，PNAS，2006，103(11)：4005-4010；Ryan MC.等，Mol.Cancer Ther.，2007，6：3009-3018；Richards JO.等，Mol Cancer Ther.2008，7(8)：2517-27；Shields R.L.等，J.Biol.Chem，2002，277：26733-26740；Shinkawa T.等，J.Biol.Chem，2003，278：3466-3473。

在某些實施形態中，上述抗CD3ε抗體或抗原結合片段包含一個或多個改變補體依賴毒性(CDC)之胺基酸取代，例如藉由增強或減弱C1q結合及/或CDC(關於其他Fc區變體之實例，參見例如WO99/51642；Duncan & Winter Nature 322：738-40(1988)；美國專利號5,648,260；美國專利號5,624,821；以及WO94/29351)。

在某些實施形態中，上述抗CD3ε抗體或抗原結合片段包含一個或多個位於Fc區界面之胺基酸取代，以便於及/或促進異二聚體化。該等修飾包含將突起引入第一Fc多肽，以及將腔引入第二Fc多肽，其中上述突起可位於上述空腔內，以促進上述第一與第二Fc多肽之相互作用，以形成異二聚體或複合體。生成具有該等修飾之抗體之方法為本領域公知，例如，如美國專利號5,731,168所述。

抗原結合片段

本申請亦提供一種抗CD3ε抗原結合片段。抗原結合片段之多種類型為本領域公知，並且可基於本申請所述之抗CD3ε抗體進行研發，包括例如其CDR與FR序列示於表1與表2之示例性抗體、及其不同之變體(如親和力變體、糖基化變體、Fc變體、半胱胺酸工程化抗體等等)。

在某些實施形態中，本申請所述之抗CD3ε抗原結合片段係駱駝化單域抗體(camelized single chain domain antibody)、雙功能抗體(diabody)、單鏈Fv片段(scFv)、scFv二聚體、BsFv、dsFv、(dsFv)₂、dsFv-dsFv' Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')₂、雙特異性抗體、雙功能抗體(ds diabody)、奈米抗體、域抗體、單域抗體或雙價域抗體。

多種技術可用於此種抗原結合片段之生產。示例性之方法包括對完整抗體進行酶消化(參見例如Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)；以及Brennan 等，Science，229：81(1985))、由宿主細胞(如大腸桿菌)重組表現(例如對於Fab、Fv及ScFv抗體片段)、如上文討論之噬菌體展示文庫篩選(例如對於ScFv)、以及化學耦合兩個Fab'-SH片段以形成F(ab')₂片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。生產抗體片段之其他技術對於本領域技術人員而言顯而易見。

在某些實施形態中，上述抗原結合片段係scFv。scFv之生成記述於例如WO 93/16185；美國專利號5,571,894；及5,587,458。scFv可在胺基末端或羧基末端與效應蛋白融合以獲得融合蛋白(參見例如Antibody Engineering，Borrebaeck編)。

雙特異性抗體、多價抗體

在某些實施形態中，本申請所述之抗體及其抗原結合片段為二價、四價、六價或多價。在某些實施形態中，本申請所述之抗體及其抗原結合片段為單特異性或雙特異性。

本申請中使用之術語「價」係指特定分子中存在特定數量之抗原結合位點。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」分別表示抗原結合分子中存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。若兩個結合位點均用於與同一抗原或同一表位特異性結合，則二價分子可為單特異性。同樣，三價分子可為雙特異性，例如當兩個結合位點係針對第一抗原(或表位)為單特異性，而第三個結合位點係針對第二抗原(或表位)為特異性。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體及其抗原結合片段可為單特異性，然而係二價、三價或係多價，其具有至少兩個對相同抗原或表位具有特異性之結合位點。在某些實施形態中，與單價之對應抗體相比，此具有與抗原或表位更強之結合。在某些實施形態中，在二價抗原結合部分中，結合位點之第一價與結合位點之第二價結構上相同(即具有相同序列)或結構上不同(即具有不同序列但特異性相同)。

在某些實施形態中，本申請所述之抗體及其抗原結合片段為雙特異性。在一些實施形態中，本申請所述之抗體及其抗原結合片段具有針對CD3ε之第一特異性、以及第二特異性。在一些實施形態中，上述第二特異性針對CD3ε，但針對不同之表位。在一些實施形態中，上述第二特異性針對不同於CD3ε之第二抗原，而且上述第二抗原存在於表現CD3ε之T細胞附近，此為免疫系統識別上述第二抗原所需。例如，將表現CD3ε之T細胞與腫瘤抗原或病原體抗原密接，藉此促進免疫系統對該抗原之識別或消除。

在某些實施形態中，上述第二特異性針對與腫瘤相關之抗原或其表位。術語「與腫瘤相關之抗原」係指在腫瘤細胞表面上呈遞，或可在腫瘤細胞表面上呈遞，並且位於腫瘤細胞上或腫瘤細胞內之抗原。在一些實施形態中，與腫瘤相關之抗原僅可由腫瘤細胞呈遞，而不能由正常細胞，即非腫瘤細胞呈遞。在另一些實施形態中，與腫瘤相關之抗原可唯一地在腫瘤細胞上表現，或者與非腫瘤細胞相比可顯示出腫瘤特異性之突變。在另一些實施形態中，在腫瘤細胞與非腫瘤細胞中均可存在與腫瘤相關之抗原，但與非腫瘤細胞相比，與腫瘤相關之抗原在腫瘤細胞上過表現，或者由於與非腫瘤組織相比，腫瘤組織結構之緻密性較低，與腫瘤相關之抗原在腫瘤細胞中易於與抗體結合。在一些實施形態中，與腫瘤相關之抗原位於腫瘤之脈管系統上。

與腫瘤相關之抗原之示例性之實例為CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD133、Fms樣酪胺酸激酶3(FLT-3，CD135)、硫酸軟骨素蛋白聚糖4(CSPG4，與黑色素瘤相關之硫酸軟骨素蛋白聚糖)、表皮生長因子受體(EGFR)、Her2、Her3、IGFR、IL3R、成纖維細胞活化蛋白(FAP)、CDCP1、Derlin1、肌腱蛋白、frizzled 1-10、血管抗原VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4、CD309)、PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)、內皮糖蛋白、CLEC14、Tem1-8，以及Tie2。進一步之實例可包括A33、CAMPATH-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、羧化酶IX(MN/CA IX)、de2-7、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、Ep-CAM、葉酸結合蛋白、G250、Fms樣酪胺酸激酶3(FLT-3，CD135)、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、HLA-DR、IGFR、IL-2受體、IL3R、MCSP(與黑色素瘤相關之細胞表面硫酸軟骨素蛋白聚糖)、Muc-1、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性抗原(PSA)及TAG-72。

本申請所述之雙特異性抗體與抗原結合片段可用本領域公知之任意合適之方法製備。在傳統方法中，可在宿主細胞中共表現兩個具有不同抗原特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，以用重組方式產生雙特異性抗體(參見例如Milstein與Cuello，Nature，305：537(1983))，隨後藉由親和層析純化。

亦可使用重組方法，其中編碼兩個特異性之抗體重鏈可變域之序列分別與免疫球蛋白恆定域序列融合，隨後插入表現載體，其與輕鏈序列之表現載體共轉染至合適之宿主細胞，以重組表現上述雙特異性抗體(參見例如WO 94/04690；Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986))。相似地，scFv二聚體亦可重組構建，並且自宿主細胞表現(參見例如Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994))。

在另一種方法中，來自Fos與Jun蛋白之亮胺酸拉鏈肽可藉由基因融合連接至兩個不同抗體之Fab'部分。連接之抗體在鉸鏈區被還原成四個半抗體(即單體)，並隨後再氧化以形成異二聚體(Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))。

上述兩個抗原結合域亦可被共軛或交聯以形成雙特異性抗體或抗原結合片段。例如，一個抗體可與生物素耦合而另一個抗體與親和素耦合，並且生物素與親和素之間之強連接會使上述兩個抗體錯合在一起，以形成雙特異性之抗體(參見例如美國專利號4,676,980；WO 91/00360、WO 92/00373及EP 03089)。又例如，上述兩個抗體或抗原結合片段可藉由本領域公知之傳統方法交聯，例如，如美國專利號4,676,980所述。

雙特異性之抗原結合片段可生成自雙特異性抗體，例如藉由蛋白水解裂解或藉由化學連接。例如，可製備抗體之抗原結合片段(例如Fab')，並轉變為Fab'-巰基衍生物並隨後與具有不同之抗原特異性之另一轉變之Fab'衍生物混合並發生反應，以形成雙特異性之抗原結合片段(參見例如Brennan等，Science，229：81(1985))。

在某些實施形態中，上述雙特異性抗體或抗原結合片段可在界面處改造，使得可形成knob-into-hole連接，以促進兩個不同之抗原結合位點之異二聚體化。用於本申請之「knob-into-hole」係指兩個多肽(如CH3結構域)之間之相互作用，其中一個多肽由於存在具有龐大側鏈之胺基酸殘基(例如酪胺酸或色胺酸)而具有突起(即「knob」)，而另一個多肽具有有小側鏈胺基酸殘基(例如丙胺酸或蘇胺酸)位於其中之空腔(即「hole」)，並且上述突起可置於上述空腔內以促進上述兩個多肽之相互作用，以形成異二聚體或複合體。用knobs-into-holes生成多肽之方法為本領域公知，例如，如美國專利號5,731,168所述。

結合物

在一些實施形態中，上述抗CD3ε抗體及其抗原結合片段進而包含結合物。結合物可與抗體及其抗原結合片段連接。結合物係可附接至上述抗體或其抗原結合片段之非蛋白質部分。可設想，本申請所述之抗體或抗原結合片段可與多種結合物連接(參見例如「Conjugate Vaccines」，Contributions to Microbiology and Immunology，J.M.Cruse與R.E.Lewis,Jr.(編)，Carger Press，紐約(1989))。該等結合物可藉由共價結合、親和結合、嵌入、協同結合(coordinate binding)、錯合、結合、混合或加入等其他方式與上述抗體或抗原結合片段連接。

在某些實施形態中，本申請中公開之抗體與抗原結合片段可工程化以在表位結合部分之外含有特定位點，上述特定位點可用於與一個或多個結合物結合。例如，該位點可包括一個或多個反應性之胺基酸殘基(例如半胱胺酸或組胺酸殘基)，以便於與結合物之共價連接。

在某些實施形態中，上述抗體可與結合物間接連接，或者藉由另一個結合物連接。例如，上述抗體或抗原結合片段可與生物素共軛，隨後與第二結合物間接共軛，上述第二經合物與抗生物素蛋白共軛。上述結合物可為毒素(例如化療劑)、可檢測之標記(例如放射性同位素、鑭系元素、發光標記、螢光標記或酶-受質標記)。

「毒素」可為對細胞有害之或可能損壞或殺死細胞之任何試劑。毒素之實例包括但不限於紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊甙、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、阿黴素、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素及其類似物、抗代謝物(例如甲胺蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達卡巴

)、烷化劑(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法侖、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴素C及二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環類抗生素(例如柔紅黴素(以前之道諾黴素)及阿黴素)、抗生素(例如更生黴素(以前稱為放線菌素)、博來黴素、光神黴素及胺茴黴素(AMC))以及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。

可檢測之標記之例可包括螢光標記(例如螢光素、羅丹明、丹磺醯、藻紅蛋白或德克薩斯紅)、酶-受質標記物(例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、³H、¹¹¹In、¹¹²In、¹⁴C、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、²¹¹At、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi及³²P、其他鑭系元素、發光標記)、發色團部分、地高辛、生物素/親和素、DNA分子或金以進行檢測。

在某些實施形態中，上述結合物可為藥代動力學修飾部分，其幫助延長抗體之半衰期。示例性之實例包括水溶性聚合物，例如 PEG、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、乙二醇/丙二醇共聚物等。上述聚合物可具有任何分子質量，並且可分支或不分支。與抗體結合之聚合物之數量可變，並且當多於一個聚合物與抗體結合，其可為相同或不同之分子。

在某些實施形態中，上述結合物可為純化部分例如磁珠。

在某些實施形態中，本發明所述之抗體及其抗原結合片段用於作為結合物之基底。

多核苷酸及重組方法

本發明提供一種編碼上述抗CD3ε抗體及其抗原結合片段之分離之多核苷酸。在某些實施形態中，上述分離之多核苷酸包含一個或多個如下所示之編碼本申請提供之示例性之抗體之可變區之核苷酸序列：SEQ ID NO：82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118及/或120。使用傳統之步驟，可容易地對編碼上述單株抗體之DNA進行分離及定序(例如藉由使用能夠與編碼上述抗體之重及輕鏈之基因特異性結合之寡核苷酸探針)。編碼之DNA亦可藉由合成方法獲得。

使用本領域公知之重組技術，可將編碼上述抗CD3ε抗體及其抗原結合片段之分離之多核苷酸(例如包括如下所示之序列：SEQ ID NO：82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118及/或120)插入載體，用於進一步之選殖(DNA之擴增)或用於表現。多種載體可供選擇。載體組分通常包括但不限於下列之一種或多種：信號序列、複製起始點、一種或多種標記基因、增強子元件、啟動子(例如SV40、CMV、EF-1α)及轉錄終止序列。

在一些實施形態中，載體體系包括哺乳動物、細菌、酵母體系等，並且包含質粒，例如但不限於pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMD18-T、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2.2等、以及其他可從實驗室獲得或市售之載體。適宜之載體可包括質粒或病毒載體(例如複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。

可將包含編碼上述抗體或抗原結合片段之多核苷酸序列之載體引入宿主細胞，用於選殖或基因表現。本申請中適用於選殖或表現上述之載體中之DNA之宿主細胞為上述之原核、酵母或高等真核細胞。適用於本申請用途之原核細胞包括真細菌，如革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌，例如，腸桿菌科，如大腸桿菌、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷白氏桿菌屬、變形桿菌屬、沙門氏菌屬如鼠傷寒沙門(氏)桿菌、沙雷氏菌屬如黏質沙雷氏菌、以及志賀氏菌屬、及桿菌屬如枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌、假單胞菌如綠膿桿菌及鏈黴菌。

除了原核細胞以外，真核微生物如絲狀真菌或酵母亦可作為宿主細胞選殖或表現編碼抗CD3ε抗體之載體。釀酒酵母、或麵包酵母係最常用之低等真核宿主微生物。但是，許多其他屬、種及株均較常用且在本發明中適用，如粟酒裂殖酵母；克魯維酵母屬宿主如乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(ATCC 16,045)、魏氏克魯維酵母(ATCC 24,178)、克魯雄酵母(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母及馬克斯克魯維酵母；解脂耶氏酵母(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(EP 183,070)；假絲酵母；里氏木黴(EP 244,234)；鏈孢黴；西方許旺酵母，如：西方許旺酵母；及絲狀真菌，如：脈孢菌、青黴菌、彎頸黴及曲黴菌，如：鉤巢麯黴及黑麯黴。

本發明中提供之適用於表現糖基化抗體或其抗原結合片段之宿主細胞由多細胞生物衍生得到。無脊椎細胞之實例包括植物與昆蟲細胞。已發現多種桿狀病毒株(baculoviral strains)及其變體以及對應之許可性昆蟲宿主細胞(permissive insect host cells)，來自於諸如以下之宿主：草地夜蛾(毛蟲)、埃及斑蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黑腹果蠅(果蠅)及家蠶。多種用於轉染之病毒株為公眾可得，例如苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒與家蠶核型多角體病毒之Bm-5變種，該等病毒均可在本發明中使用，特別是用於轉染草地夜蛾細胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛花、西紅柿及煙草之植物細胞培養亦可用作宿主。

但是，最感興趣者為脊椎細胞，且脊椎細胞之培養(組織培養)已經成為常規操作。可用之哺乳動物宿主細胞實例有：SV40轉化之猴腎細胞CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎細胞系(293或懸浮培養之293細胞亞純系，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼地鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠睾丸支持細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人肝癌細胞系(Hep G2)。在某些較佳之實施形態中，上述宿主細胞為293F細胞。

用上述之可產生抗CD3ε抗體之表現或選殖載體轉化宿主細胞，並將其在常規之營養培養基中培養，上述營養培養基經修飾後適宜於誘導啟動子、選擇轉化細胞或擴增編碼目的序列之基因。在另一實施形態中，上述抗體可藉由本領域公知之同源重組之方法製得。

本發明中用於產生上述抗體或其抗原結合片段之宿主細胞可在多種培養基中培養。市售之培養基如Ham's F10(Sigma)、最低基本培液(MEM，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)，Sigma)可用於培養上述宿主細胞。又，任何在Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等Anal.Biochem.102：255(1980)，美國專利號4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利申請Re.30,985中說明之培養基均可用作上述宿主細胞之培養基。該等培養基均可添加必要之激素及/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類(如氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂及磷酸鹽)、緩衝液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸及胸腺嘧啶)、抗生素(如慶大黴素)、微量元素(定義為終濃度通常在微莫耳範圍無機化合物)、及葡萄糖或與之等同之能量源。上述培養基亦可含有本領域公知之適當濃度之任何其他必要之添加劑。上述培養基之條件，如溫度、pH值等類似條件係選擇用於表現之宿主細胞此前所使用之條件，為普通技術人員所熟知。

使用重組技術時，可在壁膜間隙細胞內產生抗體，或者直接分泌進入基質。若在細胞內產生抗體，則第一步係移除顆粒碎片(宿主細胞或裂解之片段)，例如藉由離心或超濾。Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)記述了將分泌至大腸桿菌之壁膜間隙之抗體分離之方法。簡要而言，在乙酸鈉(pH值3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)之存在下將細胞漿解凍30分鐘以上。可藉由離心移除細胞碎片。抗體分泌進入基質時，通常首先使用市售之蛋白濃縮過濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置，將來自該表現系統之上清液濃縮。任何前述步驟可包括蛋白酶抑制劑，如PMSF，以抑制蛋白水解，並且可包括抗生素，以防止偶然污染物之生長。

從上述細胞中製得之抗CD3ε抗體及其抗原結合片段可採用純化方法進行純化，例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、DEAE-纖維素離子交換層析柱、硫酸銨沈澱、鹽析以及親和層析，其中親合層析為較佳之純化技術。

在某些實施形態中，固定於固相之蛋白A用於上述抗體及其抗原結合片段之免疫親和純化。上述抗體之種類以及上述抗體中存在任何免疫球蛋白之Fc結構域決定了蛋白A作為親和配體是否適合。蛋白A可用於純化基於人γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G適用於所有鼠源異構體及人γ3(Guss等，EMBO J.5：1567 1575(1986))。瓊脂糖係最常用之親和配體附著基質，但亦可選用其他基質。機械力穩定之基質如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯與用瓊脂糖相比可實現更快之流速及更短之處理時間。如該抗體含有CH3結構域，則可用Bakerbond ABX.TM樹脂進行純化(J.T.Baker，新澤西菲利普斯堡)。亦可根據需要獲得之抗體確定其他蛋白純化之技術，如離子交換柱中之分餾、乙醇沈澱、反相HPLC、矽膠層析、基於陰離子或陽離子交換樹脂之肝素瓊脂糖凝膠層析(如聚天冬胺酸柱)、層析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸銨沈澱。

在任意初步純化步驟之後，可用低pH值疏水相互作用層析之方法處理含有感興趣之抗體與雜質之混合物，用pH值約2.5~4.5之洗滌緩衝液，較佳為於低鹽濃度下進行(例如，從約0至0.25M鹽濃度)。

藥物組合物

本申請進而提供一種包含抗CD3ε抗體或其抗原結合片段之藥物組合物、及一個或多個藥學上容許之載劑。

用本申請中公開之藥物組合物中之藥學上容許之載劑可包括：例如，藥用容許之液體、凝膠或固體載劑、水相溶劑、非水相溶劑、抗微生物物質、等滲物質、緩衝液、抗氧化劑、麻醉劑、懸浮劑/分散劑、螯合劑、稀釋劑、助劑、輔料或無毒輔助物質、其他本領域公知之組分或以上之多種組合。

適用之組分可包括：例如，抗氧劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝液、防腐劑、潤滑劑、攪味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑例如糖及環糊精。適用之抗氧劑可包括：例如，甲硫胺酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱胺酸、巰基甘油、巰基乙酸、巰基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羥基甲苯及/或沒食子酸丙酯。如本發明所公開，在一種含有本發明公開之抗體或其抗原結合片段之組合物中包括一種或多種抗氧劑如甲硫胺酸，可降低上述抗體或其抗原結合片段之氧化。對氧化作用之減少可防止或減少結合親和力之降低，從而提高抗體穩定性並延長保質期。因此，在某些實施形態中，本發明提供之組合物中含有一種或多種上述之抗體或其抗原結合片段以及一種或多種抗氧化劑例如甲硫胺酸。本發明進而提供一種多種方法，藉由將本發明中提供之抗體或其抗原結合片段與一種或多種抗氧劑混合，例如甲硫胺酸，可防止上述抗體或其抗原結合片段氧化、延長其保質期及/或提高其活性。

進一步而言，藥用容許之載劑可包括：例如，水相介質如氯化鈉注射液、林格氏液注射液、等滲葡萄糖注射液、無菌水注射液、或葡萄糖及乳酸林格注射液、非水介質例如：植物來源之不揮發性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、細菌抑制或真菌抑制濃度下之抗菌物質、等滲劑如：氯化鈉或葡萄糖、緩衝液如：磷酸鹽或枸櫞酸酸鹽緩衝液、抗氧化劑如：硫酸氫鈉、局部麻醉劑如：鹽酸普魯卡因、助懸劑及分散劑如：羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯啶酮、乳化劑如：聚山梨醇酯80(吐溫-80)、螯合試劑如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇雙(2-胺基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。作為載劑之抗菌劑可加入多次劑量容器中之藥物組合物中，其包括酚類或甲酚、汞製劑、苯甲醇、氯代丁醇、甲基及丙基對羥基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷銨及氯苯乙銨。適用之輔料可包括：例如，水、鹽、葡萄糖、甘油或乙醇。適用之無毒輔助物質可包括：例如，乳化劑、pH值緩衝劑、穩定劑、增溶劑、或者乙酸鈉、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者環糊精之類之物質。

上述藥物組合物可為液體溶液、懸浮液、乳劑、丸劑、膠囊、錠劑、持續釋放製劑或粉末。口服製劑可包括標準載體如藥物級之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。

在某些實施形態中，上述藥物組合物被製劑成可注射之組合物。可注射之藥物組合物可以任何常規之形式製備，例如，液體溶劑、懸浮劑、乳化劑或適用於產生液體溶劑、懸浮劑或乳化劑之固體形式。注射製劑可包括現用之無菌及/或無熱原溶液、使用前現與溶劑結合之無菌乾燥之可溶物，如凍乾粉，包括皮下片、注射即用之無菌懸浮劑、使用前現與介質結合之無菌乾燥不溶產品、及無菌及/或無熱原之乳劑。溶劑可為水相或非水相。

在某些實施形態中，單位劑量之注射製劑包裝在一個安瓿、一支管或一支帶有針之針筒中。本領域習知，所有注射投予之製劑應為無菌無熱原。

在某些實施形態中，藉由將本申請中公開之抗體或其抗原結合片段溶解於某適當之溶劑中可製備無菌凍乾之粉末。上述溶劑可含有一種可提高粉或由粉末製得之重組溶液之穩定性、或改善粉末或重組溶液之其他藥理組分。適用之輔料包括但不限於水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他適用之物質。溶劑可含有緩衝液，如枸櫞酸緩衝液、磷酸鈉或磷酸鉀緩衝液或其他本技術熟練人員公知之緩衝液，在一種實施形態中，緩衝液之pH值為中性。在本領域公知之標準條件下進行對上述溶解進行隨後之過濾除菌，然後凍乾製得理想之製劑。在一種實施形態中，將所得之溶劑分裝至小管中凍乾。每支小管可容納單次劑量或多次劑量之上述抗CD3ε抗體或其抗原結合片段或其組合物。每支小管中之裝入量可略微高於每次劑量所需或多次劑量所需(例如10%過量)，從而保證取樣精確及投予精確。凍乾粉可在適當之條件下儲存，如在約4℃至室溫範圍。

用注射用水將凍乾粉重溶得到用於注射投予之製劑。在一種實施形態中，可將凍乾粉加至無菌無熱原水或其他適用之液體載劑中重溶。精確之量由選擇之療法決定，可根據經驗值決定。

使用方法

本發明亦提供一種治療方法，上述治療方法包含：向需要其之個體施用治療有效量之如本申請所述之抗體或其抗原結合片段，從而治療或預防與CD3ε相關之病症或狀況。在一些實施形態中，上述與CD3ε相關之病症或狀況為癌症、自體免疫疾病、炎性疾病或感染性疾病。

癌症之實例包括但不限於非小細胞肺癌(鱗狀/非鱗狀)、小細胞肺癌、腎細胞癌、結直腸癌、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌(包括基底乳腺癌、乳腺導管內癌及乳腺小葉癌)、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、間皮瘤、黑色素瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、肉瘤、前列腺癌、膠質母細胞瘤、宮頸癌、胸腺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、蕈狀肉芽腫、梅克爾細胞癌、肝細胞癌(HCC)、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤以及其他肉瘤、滑膜肉瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、淋巴惡性腫瘤、基底細胞癌、腺癌、肝腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、維爾姆斯腫瘤、宮頸癌、睾丸癌、精原細胞瘤、經典型霍奇金淋巴瘤(CHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、富於T細胞/組織細胞之B細胞淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、急性粒細胞性白血病、慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病、慢性粒細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、真性紅細胞增多症、肥大細胞源性腫瘤、EBV陽性及陰性PTLD及瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、漿母細胞淋巴瘤、淋巴結外NK/T細胞淋巴瘤、鼻咽癌、與HHV8相關之原發性滲出性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、華氏巨球蛋白血症、重鏈疾病、骨髓增生異常綜合症、毛細胞白血病及骨髓增生異常、原發性CNS淋巴瘤、脊髓軸腫瘤、腦幹膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。

自體免疫疾病包含但不限於獲得性免疫缺陷綜合症(AIDS，其為具有自體免疫成分之病毒疾病)、斑禿、強直性脊柱炎、抗磷脂綜合症、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內耳病(AIED)、自身免疫性淋巴細胞增生綜合症(ALPS)、自身免疫性血小板減少性紫癜(ATP)、貝切特氏病、心肌病、乳糜瀉乳糜性皮炎、慢性疲勞免疫功能障礙綜合症(CFIDS)、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、冷凝集素病、CREST綜合症、克羅恩氏病、德哥斯病、幼年皮肌炎、盤狀狼瘡、原發性混合冷球蛋白血症、纖維肌痛性纖維肌炎、Graves病、吉蘭-巴雷綜合症、橋本氏甲狀腺炎、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病、胰島素依賴型糖尿病、幼年型慢性關節炎(斯蒂爾病)、幼年類風濕性關節炎、梅尼埃氏病、混合結締組織病、多發性硬化、重症肌無力、頑固性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺體綜合症、風濕性多肌痛、多發性肌炎及皮肌炎、原發性無丙種球蛋白血症、原發性膽汁性肝硬化、牛皮癬、牛皮癬關節炎、雷諾現象、萊特爾氏綜合症、風濕熱、類風濕性關節炎、結節病、硬皮病(進行性系統性硬化症(PSS)，又稱系統性硬化症(SS))、乾燥綜合症、全身肌強直綜合症、系統性紅斑狼瘡、高安動脈炎、顳動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、白癜風及韋格納肉芽腫病。炎性疾病包含例如慢性及急性炎性疾病。炎性疾病之示例包含阿爾茨海默病、哮喘、特應性變態反應、過敏、動脈粥樣硬化、支氣管哮喘、濕疹、腎小球腎炎、移植物抗宿主病、溶血性貧血、骨關節炎、膿毒病、中風、組織及器官移植、血管炎、糖尿病性視網膜病變及呼吸機所致肺損傷。在一些實施形態中，與CD3相關之狀況為炎性疾病，如系統性紅斑狼瘡(SLE)、腸黏膜炎、與結腸炎相關之消耗性疾病、多發性硬化、病毒感染、類風濕性關節炎、骨關節炎、克羅恩病，以及炎性腸病、牛皮癬、系統性硬皮病、自體免疫性糖尿病等等。

感染性疾病包含但不限於真菌感染、寄生蟲/原生動物感染或慢性病毒感染，例如瘧疾、球孢子菌病、組織胞漿菌病、甲真菌病、麯黴病、芽生菌病、白色念珠菌病、副球孢子菌病、微孢子蟲病、棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔蟲病、巴貝斯蟲病、小袋蟲病、貝利斯蟲病、美洲錐蟲病、華支睾吸蟲病、錐蠅病、隱孢子蟲病、裂頭絛蟲病、龍線蟲病、棘球蚴病、象皮腫、蟯蟲病、片形吸蟲病、薑片吸蟲病、絲蟲病、賈第蟲病、頜口線蟲病、膜殼絛蟲病、等孢子球蟲病、釘螺熱、利什曼病、萊姆病、後殖吸蟲病、蠅蛆病、盤尾絲蟲病、虱病、疥瘡、血吸蟲病、昏睡病、圓線蟲病、絛蟲病、弓蛔蟲病、弓形蟲病、旋毛蟲病、鞭蟲病、錐蟲病、蠕蟲感染、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、疱疹病毒、EB病毒、HIV、巨細胞病毒、單純疱疹病毒I型、單純疱疹病毒II型、人乳頭瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺陷病毒I、人類免疫缺陷病毒II、卡波西西肉瘤相關疱疹病毒流行病、薄環病毒(指環病毒)、人T淋巴營養性病毒I型人T淋巴營養性病毒II型、水痘帶狀疱疹、JC病毒或BK病毒之感染。

在另一個方面，提供一種在會從免疫應答之上調中受益之個體中治療狀況之方法，上述方法包含向需要其之個體施用如本申請所述之治療有效量之抗體或抗原結合片段。

本申請所述之抗體或其抗原結合片段之治療有效劑量依賴於本領域公知之多種因素，例如體重、年齡、過往病史、現用治療、對象之健康狀況及交叉感染之潛力、過敏、超敏及副作用、以及投予途徑與腫瘤發展之程度。本領域熟練人員(例如醫生或獸醫)可根據該等或其他條件或要求按比例降低或升高劑量。

在某些實施形態中，如本申請所述之抗體或抗原結合片段可在治療有效劑量約0.01mg/kg至約100mg/kg之間投予(例如約0.01mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、約80mg/kg、約85mg/kg、約90mg/kg、約95mg/kg或約100mg/kg)。在某些實施形態中，上述抗體或抗原結合片段以約50mg/kg或更少之劑量施用，並且在某些此種實施形態中，上述劑量為10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、3mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少或0.1mg/kg或更少。在某些實施形態中，投予劑量可隨治療進程變化。例如，在某些實施形態中，初始投予劑量可比後續投予劑量高。在某些實施形態中，投予劑量在治療進程中根據投予對象之反應進行調整。

投予方案可藉由調整達到最優反應(如治療反應)。例如，可進行單劑量投予或在一段時間分多個分隔之劑量投予。

本申請中公開之抗體與抗原結合片段可藉由本領域公知之投予方式投予，例如腸胃外投予(如皮下注射、腹腔注射、靜脈注射，包括靜脈滴注、肌肉注射或皮內注射)或非腸胃外投予途徑(如口服投予、鼻腔投予、舌下投予、直腸投予或外用投予)。

在一些實施形態中，本申請中公開之抗體或抗原結合片段可單獨投予或與一種或多種其他治療手段或物質聯合投予。例如，本發明公開之抗體與抗原結合片段可與另一種治療劑，例如化療劑或抗癌藥聯合投予。

在某些此種實施形態中，本申請中公開之抗體或抗原結合片段與一種或多種另外之治療物質聯用時，可與上述之一種或多種另外之治療物質同時投予，在某些此種實施形態中，上述之抗體與抗原結合片段可作為同一個藥物組合物之一部分同時投予。但是，與其他治療物質「聯用」之抗體或抗原結合片段無需同時投予或與該治療物質在同一組合物中投予。本申請中「聯用」之含義亦包括，在另一個治療物質之前或之後投予之抗體或抗原結合片段亦被認為係與該治療物質「聯用」，即便上述抗體或其抗原結合片段與第二種物質藉由不同投予方式投予。在可能之情況下，與本申請中公開之抗體或其抗原結合片段聯用之其他治療物質可參照該其他治療物質之產品說明書之方法用藥、或參照外科醫生之案頭參考書 2003(Physicians' Desk Reference，第57版；Medical Economics Company；ISBN：1563634457；第57版(2002年11月))、或參照其他本領域公知之方法。

本發明進而提供一種使用上述抗CD3ε抗體或其抗原結合片段之方法。在一些實施形態中，本發明提供一種在體內或在體外活化表現CD3ε之T細胞之方法，包含：將上述表現CD3ε之T細胞與本申請所述之抗體或其抗原結合片段接觸。在一些實施形態中，本發明提供一種在表現CD3ε之細胞中調節CD3活性之方法，包含將上述表現CD3ε之細胞暴露於本申請所述之抗體或其抗原結合片段。

在一些實施形態中，本發明提供一種藉由表現CD3ε之T細胞來促進第二抗原之體內或體外加工之方法，上述方法包括將上述表現CD3ε之T細胞與本申請所述之雙特異性抗體或其抗原結合片段接觸，其中上述雙特異性抗體或抗原結合片段能夠與上述表現CD3ε之T細胞及第二抗原特異性地結合，從而使兩者接近。

在一些實施形態中，本發明提供一種檢測樣品中CD3ε之存在或含量之方法，其包括將上述樣品與上述抗體或其抗原結合片段接觸，以及確定樣品中CD3ε之存在或含量。

在一些實施形態中，本發明提供一種診斷在個體中與CD3相關之疾病或狀況之方法，其包括：a)獲取來自上述個體之樣品；b)將上述獲取自上述個體之樣品與本申請所述之抗體或其抗原結合片段接觸；c)確定在上述樣品中CD3ε之存在或含量；以及d)將上述CD3ε之存在情況與個體中之與CD3相關之疾病或狀況相關聯。

在一些實施形態中，本發明亦提供一種本申請所述之抗體或其抗原結合片段在製備用於在個體中治療與CD3相關疾病或狀況之藥物中之用途、在製備用於診斷與CD3相關之疾病或狀況之診斷試劑中之用途。

以下實施例旨在更良好地說明本發明，且不應理解為限制本發明之範圍。所有下述之特定組合物、材料及方法，其整體或部分均在本發明之範圍內。該等特定之組合物、材料及方法並非為了限制本發明，而僅係為了說明特定之實施形態在本發明之範圍內。本領域熟練技術人員可不添加創造性及不偏離本發明範圍而開發出等同之組合物、材料及方法。應理解，對本發明之方法作出之多種改動可仍然包括在本發明範圍內。發明人意在將此種變動包括在本發明之範圍內。

實施例1：雜交瘤抗體之產生 1.1 動物免疫

重組人CD3胞外域(ECD)蛋白、組胺酸標記之人CD3ε(目錄號：10977-H08H；中國北京Sino Biological Inc.)、人CD3γ(目錄號：ab140563；中國上海Abcam)及人CD3δ(目錄號：10977-H08H；中國北京Sino Biological Inc.)作為動物免疫之免疫原。Balb/c小鼠購自上海SLAC實驗動物有限公司，籠養在IACUC批准之動物設施中。每兩週藉由皮下及足墊注射途徑，用CD3ε、CD3γ及CD3δ之ECD蛋白或每隻小鼠用7×10⁶個新鮮分離之人T細胞與Titermax助劑之混合物免疫小鼠。

在免疫前及免疫後採集小鼠血液，藉由ELISA監測對目標免疫蛋白之血清滴度。

1.2 雜交瘤之產生

選擇血清滴度最高之小鼠用於細胞融合。根據電融合之一般步驟，採用小鼠脾及淋巴結之B細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合。細胞融合後，將細胞鋪板於含有補充了20% FBS及1% HAT選擇性試劑之DMEM培養基之96孔板中。

存在於雜交瘤培養基上清液中之抗體藉由流式細胞術(FACS)，使用表現CD3之Jurkat細胞進行篩選，並且藉由FACS使用CD3陰性之MOLT-4 T細胞進行反向篩選。收集具有與Jurkat細胞之結合活性，但不與MOLT-4細胞交叉結合之雜交瘤細胞作為陽性雜交瘤細胞系，並隨後採用半固體培養基之方法進行亞純系階段。

將單一細胞群落挑入含有補充了10% FBS之DMEM培養基之96孔板中2~3日，藉由流式細胞術(FACS)，使用表現CD3之Jurkat細胞針對CD3之靶標進行複篩，並且藉由FACS測定，使用CD3陰性之MOLT-4 T細胞進行反向篩選。

1.3 雜交瘤定序

從雜交瘤細胞中提取出RNA，並藉由使用5'-RACE套組，隨後藉由使用3'簡並引子PCR擴增cDNA。隨後將PCR產物選殖至pMD18-T載體，進行轉化、擴增及定序。

產生了八個小鼠單株抗體，其CDR序列示於上文之表1中。

實施例2：人源化抗體之產生 2.1 IgG轉換及人源化

鼠源單抗產生嵌合抗體：WBP3311_2.166.48、WBP3311_2.306.4及WBP3312_3.179.16之VH與VL基因用含有適當之限制性位點之選殖引子進行再擴增，並且選殖至WuXi Biologics專有之表現載體中，以產生具有人IgG1之恆定區之嵌合抗體之對應純系。

人源化及人源化V基因之合成：使用最佳擬合法對WBP3311_2.166.48與WBP3311_2.306.4之輕鏈及重鏈進行人源化。對於輕鏈，將對應之V基因之胺基酸序列與公司內部之人種系V基因資料庫進行BLAST比對。人源化VL基因之序列源自使用Kabat CDR定義，將相似度最高之人CDR序列替換為小鼠CDR序列。使用擴展之CDR定義框架，其中Kabat CDR1在N末端延長5個胺基酸。藉由將小鼠框架與人種系免疫球蛋白資料庫進行BLAST比對，每條重鏈及輕鏈均產生了多個人源化序列。產生了不同之FR組合，並分析其結合活性，使用相似度最高之三個序列得到人源化之VH基因。對人源化之基因進行回譯、密碼子優化用於哺乳動物表現，以及藉由GeneArt Costum Gene Synthesis(Life Technologies)合成。將合成之基因重新選殖至IgG表現載體內，表現並純化。兩個人源化抗體及其親本小鼠抗體之FR示於上文之表2中。

嵌合抗體與人源化抗體之瞬時表現及純化：將如上文所述之嵌合抗體與人源化抗體構建至WuXi Biologics專有之表現載體中，並由293F細胞表現。使用Protein A層析柱收集含有對應抗體之培養上清液並進一步純化。

實施例3：體外表徵 3.1 ELISA與FACS測得之抗體結合

下述用於ELISA與FACS之抗原、抗體及細胞列於表3中。

ELISA與EC ₅₀ 檢測抗體與蛋白之結合力：在96孔板中分別預被覆人CD3ε、CD3δ及CD3γ蛋白。藉由對應之HRP標記之二抗測定八個單抗在不同濃度與該三種不同之CD3蛋白胞外域結合之活性。藉由使用GraphPad Prism軟體公式：非線性回歸(曲線擬合)-對數(激動劑)vs.應答-可變斜率，來分析結合EC₅₀(待測抗體在達到最大結合之一半時之濃度)。

ELISA檢測抗體與人CD3ε蛋白之特異性結合：八個小鼠單抗表現出與人CD3ε高度特異性結合之活性，而不與CD3γ及CD3δ結合，資料如表5所示。

FACS與EC ₅₀ 檢測抗體之細胞結合力：將不同濃度之待測單抗加至Jurkat細胞，隨後藉由二抗-FITC檢測單抗結合至細胞表面上之活性。使用OKT3作為陽性對照。藉由使用BD Biosciences FACSCanto II工具及Flow Jo Version軟體來分析染色之細胞。藉由使用GraphPad Prism軟體公式：非線性回歸(曲線擬合)-對數(激動劑)vs.應答-可變斜率，來計算結合EC₅₀。

與T細胞表面上之人CD3受體之特異性結合：在表6中，八個單抗表現出與表現人CD3之細胞(Jurkat細胞)高度特異性之結合活性，而不結合CD3陰性之細胞(MOTL-4細胞與293F細胞)。

3.2 ELISA與FACS檢測抗體跨種屬靶蛋白之結合力

對待測抗體與來自不同種屬之CD3進行結合活性之分析。人、猴、大鼠及小鼠CD3之參照序列之同源性如下所示。

ELISA檢測抗體與食蟹猴CD3ε及小鼠CD3ε之交叉結合：將不同濃度之待測抗體、陽性對照及陰性對照加入預被覆有食蟹猴CD3ε蛋白及小鼠CD3ε之96孔板中。抗體與食蟹猴CD3ε蛋白及小鼠CD3ε蛋白之結合力藉由對應之HRP標記之二抗(BETHYL,A90-231P)進行檢測。使用GraphPad Prism軟體計算EC₅₀。

資料顯示八個單抗均與食蟹猴CD3ε有較強交叉結合活性，但不結合小鼠CD3ε。陽性對照OKT3與食蟹猴CD3ε及小鼠CD3ε均無交叉結合之活性(表7)。

FACS檢測抗體與食蟹猴CD3ε交叉結合力：藉由使用Ficoll-Paque PLUS梯度離心、及100g離心步驟去除血小板，從健康食蟹猴之全血中分離出食蟹猴PBMC。在完全RPMI-1640培養基中培養PBMC待用。將不同濃度之待測抗體加至食蟹猴PBMC，隨後藉由二抗-FITC(Jackson,115-095-008)檢測抗體與細胞表面之結合活性。藉由使用BD Biosciences FACSCanto II及FlowJo Version軟體分析染色之細胞。藉由使用GraphPad Prism軟體公式：非線性回歸(曲線擬合)計算結合力之EC₅₀。

FACS檢測抗體表位分組(Epitope binning)：將不同濃度之待測抗體分別與一定量W3311-2.383.47之生物素化之抗體混合。混合物隨後加至96孔板中之表現CD3之細胞，4℃孵育1小時。使用PE共軛之抗生物素抗體檢測目標抗體與表現CD3之細胞之結合。藉由流式細胞術測試樣品，並且藉由FlowJo分析資料。

ELISA方法檢測針對人CD3ε與食蟹猴CD3ε蛋白之結合力以及計算EC ₅₀：在表8中，八個單抗表現出與人CD3ε較強之結合活性以及與食蟹猴CD3ε蛋白之交叉結合，並且表現出人CD3ε與食蟹猴CD3ε之間相似之較低nM範圍之EC₅₀。

4.3 人源化抗體之跨種屬結合檢測

兩個人源化單抗與食蟹猴CD3ε蛋白之結合力及EC ₅₀ 值：在表9中，所有資料表明兩個人源化單抗均保持了其與食蟹猴CD3ε蛋白之高度結合活性(見圖1)，兩個人源化抗體之EC₅₀值均為0.043nM。

FACS檢測抗體親和力：Jurkat細胞以5×10⁴個/孔接種至96孔板中，隨後將不同濃度之純化之待測候選抗體作為一抗加入，4℃培養1小時。加入山羊抗小鼠二抗IgG Fc-FITC，4℃孵育30分鐘，隨後藉由FACS檢測經FITC染色之細胞。根據上述方法計算K_D值。

兩個人源化單抗與人CD4 T細胞之結合活性檢測：在表10中，資料表明兩個人源化抗體均保持與CD4 T細胞之高度結合活性(參見圖2)，WBP3311-2.166.48-z1-uIgG1k與WBP3311-2.306.4-z1-uIgG1k之EC₅₀值分別低至1.01及0.46nM，比其各自之親本抗體低0.5~1倍。

4.5 FACS檢測抗體親和力及EC₅₀

藉由FACS檢測了8個單抗之EC₅₀，並且檢測了其與表現人CD3之細胞(Jurkat細胞)之親和力。該8個單抗之EC₅₀之範圍為0.57nM至6.91nM(參見表11)，並且在表12中，其親和力範圍為1.3×10^-9至9.3×10^-10M。

4.6 FACS檢測兩個人源化單抗親和力與動力學K_D值

藉由FACS檢測了兩個人源化單抗與Jurkat細胞之親和力。在圖4及表13中，資料表明兩個人源化抗體均保持其與Jurkat細胞之高度親和活性，其K_D值與其各自之親本單抗相似。

3.3 基於細胞之功能性測定

藉由FACS檢測抗體之細胞內化：Jurkat細胞1×10⁵個細胞/孔接種在96孔板中。將待測抗體(1μg/mL)加至細胞，4℃孵育1小時。孵育後，洗去未結合之抗體，隨後將細胞在4℃或37℃、5% CO₂下孵育3小時。孵育後，藉由二抗(Abcam，ab98742)檢測抗體在細胞表面之留存量。藉由使用BD Biosciences FACSCanto II及FlowJo Version軟體分析染色之細胞。內化率計算如下：[(MFI_0小時-MFI_3小時)/MFI_0小時]*100%.

4.7 細胞內化率測定

藉由FACS使用Jurkat細胞檢測內化率。在圖5中，資料表明在3小時之研究期之後，8個單抗全部表現出範圍在86~94%之抗體內化之高內化率，而OKT3表現出約72%之內化率。

細胞內細胞因子染色法檢測抗體之T細胞活化：細胞內細胞因子染色法係一種基於流式細胞術之測定，其可藉由免疫細胞結合細胞表面標記物檢測細胞因子之產生。從健康供體中分離出人PBMC。簡要而言，使用Ficoll-Paque PLUS梯度離心，隨後進行100g離心之步驟來去除血小板。在完全RPMI-1640培養基中培養PBMC。在補充了Golgi Stop之細胞培養基中重懸PBMC，並且以2×10⁵個/孔加入至96孔板中。加入不同濃度之待測抗體、陽性對照及陰性對照，隨後在37℃下與細胞一起孵育4.5個小時。孵育後，用1% BSA將細胞洗滌兩次，並且隨後藉由使用抗人CD4-FITC抗體(BD，550628)及抗人CD8-PE抗體(BD，560959)對其表面標記物染色，然後使用人調節性T細胞染色套組(eBioscience，88-8999)固化並透化。在固化/透化之後，藉由使用抗人TNF-APC抗體(BD，554514)及抗人IFN-PerCP-Cy5.5抗體(eBioscience，45-7319-42)檢測細胞之細胞因子產生。藉由使用BD Biosciences FACSCanto II及FlowJo Version軟體分析染色之細胞。

T細胞活化：藉由細胞內細胞因子染色方法，使用人PBMC評價T細胞活化，並且監測TNFα及INFγ細胞因子。資料表明在8個待測單株抗體中，2.306.4與2.844.8未顯示出顯著之T細胞活化現象，同時亦未監測到顯著之TNFα及INFγ細胞因子釋放，而其他6個待測單抗全部顯示出與OKT3相似之T細胞活化程度，除了純系2.383.47，其顯示出弱於OKT3之T細胞活化，資料示於圖6中。

兩個人源化單抗之人T細胞活化：藉由細胞內細胞因子染色方法檢測兩個人源化單抗對人PBMC之T細胞活化之活性，並且監測TNFα及INFγ細胞因子。資料表明兩個人源化抗體均顯示出與OKT3陽性對照相似之對CD8+ T細胞之T細胞活化程度，而兩個人源化單抗對CD4+ T細胞均顯示出低於OKT3之活化程度。亦注意到，親本小鼠抗體純系2.306.4重複性地顯示無T細胞活化。資料示於圖7中。

3.4 FACS檢查抗體表位分組

表位分組：針對純系2.383.47對8個單抗中之7個進行表位分組，結果顯示8個單抗全部具有相同之表位分組(圖8)。

Claims

一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其包括重鏈CDR序列，其包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：5；以及κ輕鏈CDR序列，其包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：6。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其包括a)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：81；以及κ輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：83；或b)重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：113；以及κ輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO：115。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其進而包括一個或多個胺基酸殘基置換，但仍然保持與CD3ε之特異性結合親和力，其中該置換係在一個或多個FR序列中。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其進一步包括免疫球蛋白恆定區。
如請求項4之抗體或其抗原結合片段，其中該免疫球蛋白恆定區為IgG之恆定區。
如請求項5之抗體或其抗原結合片段，其中該IgG之恆定區為人IgG1之恆定區。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其為人源化抗體。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其為雙功能抗體(diabody)、scFv、scFv二聚體、BsFv、dsFv、(dsFv)₂、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')₂、雙特異性抗體或ds雙功能抗體(ds diabody)。
如請求項8之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為雙特異性且具有針對CD3ε之第一特異性以及第二特異性。
如請求項9之抗體或其抗原結合片段，其中該第二特異性係針對不同於CD3ε之第二抗原，其中該第二抗原存在於表現CD3ε之T細胞附近，此對於該第二抗原被免疫系統識別為所欲的。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其與一種或多種結合物連接，其中該結合物包括化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素、發光標記、螢光標記或酶受質標記。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其能夠特異性地與CD3ε結合。
如請求項12之抗體或其抗原結合片段，其中該CD3ε源自小鼠、大鼠、猴或人。
如請求項12之抗體或其抗原結合片段，其中該CD3ε係重組CD3ε或表現在細胞表面上之CD3ε。
一種醫藥組合物，其包括如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段以及醫藥上可接受之載劑。
一種經分離之多核苷酸序列，其編碼如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段。
一種載體，其包括如請求項16之經分離之多核苷酸。
一種宿主細胞，其包括如請求項17之載體。
一種表現如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段之方法，其包括在表現如請求項18之宿主細胞所包括之載體之條件下培養該宿主細胞。
一種如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項15之醫藥組合物之用途，其係用於製備治療CD3相關之疾病或病況之醫藥品。
如請求項20之用途，其中該抗體或其抗原結合片段為雙特異性，並且該疾病或病況為癌症。
一種如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製備活化表現CD3ε之T細胞之醫藥品。
一種在體外活化表現CD3ε之T細胞之方法，其包括將表現CD3ε之T細胞與如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸。
一種如請求項9或10之抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製備藉由表現CD3ε之T細胞來促進第二抗原之加工之醫藥品，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段能夠與該表現CD3ε之T細胞及第二抗原兩者特異性地結合，從而使兩者接近。
一種藉由表現CD3ε之T細胞來促進第二抗原之體外加工之方法，其包括將該表現CD3ε之T細胞與如請求項9或10之抗體或其抗原結合片段接觸，其中該雙特異性抗體或其抗原結合片段能夠與該表現CD3ε之T細胞及第二抗原兩者特異性地結合，從而使兩者接近。
一種套組，其包含如請求項1至14中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於檢測CD3ε或用於診斷與CD3相關之疾病或病況。
如請求項26一種套組，其中該CD3ε係檢測重組CD3ε、表現在細胞表面上之CD3ε或表現CD3ε之細胞。