TWI819268B - 藉由基因轉導改變眼睛顏色 - Google Patents

Abstract

本發明係關於人的虹膜顏色可藉由引入黑色素細胞殺死劑(melanocyte-killing agent)穿過人的眼睛角膜並使虹膜之前表面與該藥劑足以殺死虹膜基質中之黑色素細胞之劑量接觸而變淺，諸如自棕色變為淺棕色、綠色、淡褐色(hazel)或藍色。

Description

藉由基因轉導改變眼睛顏色

本技術大體上係關於眼科學。

有些人想要改變其眼睛顏色。為此目的，已使用諸如經著色隱形眼鏡及植入於虹膜上之經著色盤之技術。

例如，根據以下描述的各個態樣說明本技術。為方便起見，將本技術之態樣之各種實例描述作編號條款(1、2、3等)。此等係作為實例提供且不限制本技術。應注意，任何附屬條款可以任何組合方式組合且置於各自的獨立條款中或置於其他獨立條款中。其他條款可以類似方式提出。 1.1    一種用於改變個體的虹膜顏色之方法，該方法包括： 將黑色素細胞殺死劑引入個體眼睛之前房； 由此導致黑色素細胞死亡且改變虹膜之顏色。 1. 一種用於改變個體的虹膜顏色之方法，該方法包括： 將基因載體引入個體眼睛之前房； 其中該基因載體能夠誘導眼睛虹膜基質中之黑色素細胞死亡，由此改變虹膜之顏色。 2. 如條款1之方法，其中該引入係自前房外部穿過眼睛角膜中之開口進入至前房中來進行。 3. 如條款1之方法，其進一步包括允許前房中之基因載體接觸虹膜一段足夠的時間以導致基質中之黑色素細胞死亡；及 經過足夠的時間後，自前房取出過量之基因載體。 4. 如條款1之方法，其中該基因載體包含自殺基因。 5. 如條款4之方法，其中該自殺基因為胸苷激酶(tk)基因。 6. 如條款4之方法，其中該自殺基因為單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因。 7. 如條款4至6中任一項之方法，其中該基因載體進一步包含調節自殺基因之表現之啟動子。 8. 如條款7之方法，其中該啟動子為黑色素細胞特異性基因啟動子，視需要，其中該黑色素細胞特異性基因啟動子為酪胺酸酶(Tyr)啟動子。 9. 如條款4之方法，其中該基因載體包含單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因及酪胺酸酶(Tyr)啟動子。 10.    如條款7至9中任一項之方法，其中該自殺基因及該黑色素細胞特異性基因啟動子係攜載於質體上。 11.    如條款7至9中任一項之方法，其中該自殺基因及該黑色素細胞特異性基因啟動子係藉由病毒載體攜載，其中該病毒載體係選自由腺病毒、腺相關病毒及慢病毒組成之群。 12.    如條款7至9中任一項之方法，其中該自殺基因及該黑色素細胞特異性基因啟動子係藉由腺相關病毒載體攜載。 13.    如條款12之方法，其中該腺相關病毒載體包含rAAV1衣殼或rAAV6衣殼。 14.    如條款4之方法，其進一步包括對個體投與核苷類似物。 15.    如條款14之方法，其中該核苷類似物係選自由更昔洛韋(ganciclovir)、阿昔洛韋(acyclovir)及纈更昔洛韋(valganciclovir)所組成之群。 16.    一種用於改變個體的虹膜顏色之方法，該方法包括使虹膜之前表面與殺死黑色素細胞之物質接觸，由此改變虹膜之顏色。 17.    如條款16之方法，其中該物質包含在酪胺酸酶(Tyr)啟動子之控制下攜載單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因之腺相關病毒(AAV)。 18.    一種用於改變個體的虹膜顏色之組合物，其包含： 無菌眼科製劑，其包括含有自殺基因之遺傳載體，該自殺基因處於誘導黑色素細胞中自殺基因之表現之黑色素細胞特異性基因啟動子之控制下。 19.    如條款18之組合物，其中該遺傳載體包含腺相關病毒。 20.    如條款18或19之組合物，其中該製劑係呈粉末形式，且可用液體復原以形成無菌眼科溶液或懸浮液。 21.    一種用於傳遞生物藥劑之裝置，其包括(i)經構型以與人的虹膜接觸之生物相容性物件，及(ii)如條款18至20中任一項之組合物。 22.    如條款21之裝置，其中該生物相容性物件包括盤、條帶或小壓布(pledget)。 23.    如條款18至20中任一項之組合物，其中該自殺基因為處於酪胺酸酶(Tyr)啟動子之控制下之單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因。 24.    一種用於將生物藥劑傳遞至虹膜之前表面之裝置，其包括： 撓性盤，其可穿過個體眼睛角膜中之切口插入且可定位在眼睛虹膜之前表面處； 其中該盤具有穿過其中的瞳孔開口，該開口在該盤定位在虹膜之前表面處時可定位在眼睛之瞳孔處，由此允許水樣液自眼睛之瞳孔流動穿過瞳孔開口； 位於盤之後側處之傳遞材料，該材料經構型以接觸虹膜之前表面且將遺傳載體釋放於虹膜之基質中；及 遺傳載體。 25.    如條款24之裝置，其中該傳遞材料包括水凝膠。 26.    如條款24或25之裝置，其中該遺傳載體包含腺相關病毒(AAV)。 27.    如條款24至26中任一項之裝置，其中該遺傳載體包含(a)自殺基因及(b)調節該自殺基因之表現之黑色素細胞特異性基因啟動子。 28.    如條款27之裝置，其中該自殺基因為單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因及該黑色素細胞特異性基因啟動子為酪胺酸酶(Tyr)啟動子。 29.    如條款24至28中任一項之裝置，其進一步包括： 中央突出，其自盤之後側以向後方向延伸且與瞳孔開口相鄰地配置； 其中，該中央突出係經構型以當盤位於虹膜之前表面處時且在個體的水樣液從眼睛之瞳孔流動穿過瞳孔開口時，接觸虹膜之瞳孔周區域。 30.    如條款29之裝置，其中該中央突出圍繞瞳孔開口周向延伸。 31.    如條款24至28中任一項之裝置，其進一步包括： 周邊突出，其自盤之後側以向後方向延伸且與盤之周邊相鄰地配置； 其中，該周邊突出係經構型以當盤位於虹膜之前表面處時且在個體的水樣液從眼睛之瞳孔流動穿過瞳孔開口時，接觸虹膜之周邊。 32.    如條款31之裝置，其中該周邊突出圍繞盤之周邊周向延伸。 33.    如條款29之裝置，其進一步包括： 周邊突出，其自盤之後側以向後方向延伸且與盤之周邊相鄰地配置； 其中，該周邊突出係經構型以當盤位於虹膜之前表面處時且在個體的水樣液從眼睛之瞳孔流動穿過瞳孔開口時，接觸虹膜之周邊。 34.    如條款31之裝置，其中該周邊突出圍繞盤之周邊周向延伸。 35.    如條款24至34中任一項之裝置，其中該盤係可折疊，從而允許穿過寬度較盤之最大直徑小之角膜切口插入個體眼睛之前房。 36.    如條款24至35中任一項之裝置，其進一步包括工具，該工具經構型以在外科醫生穿過角膜切口插入盤時將盤攜載至個體眼睛之前房中。 37.    一種腺相關病毒(AAV)，其具有AAV1或AAV6衣殼及包含處於誘導黑色素細胞中自殺基因之表現之啟動子控制下之自殺基因之構築體。 38.    如條款37之AAV，其中該自殺基因為胸苷激酶(tk)基因。 39.    如條款37之AAV，其中該自殺基因為單純疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)自殺基因。 40.    如條款37至39中任一項之AAV，其中該啟動子為酪胺酸酶(Tyr)啟動子。 41.    一種醫藥組合物，其包含存於賦形劑中之如條款37至40中任一項之AAV。 42.    一種用於改變眼睛顏色之套組，其包含如條款37至40中任一項之AAV或如條款41之醫藥組合物及核苷類似物。 43.    如條款42之套組，其中該核苷類似物係選自由更昔洛韋、阿昔洛韋及纈更昔洛韋組成之群。 44.    如條款41至43中任一項之套組，其進一步包括用於將AAV或醫藥組合物傳遞至人類個體之黑色素細胞中之裝置。

在一個態樣中，本發明提供一種用於改變個體虹膜顏色之組合物，其包含：包含遺傳載體之無菌眼科製劑，該遺傳載體攜載(a)自殺基因；及(b)可操作地連接至自殺基因之黑色素細胞特異性基因啟動子。

在一些實施例中，遺傳載體係選自由質體、腺病毒、腺相關病毒及慢病毒組成之群。在一些實施例中，遺傳載體包含重組腺相關病毒。

在一些實施例中，製劑係呈粉末形式，且可用液體復原以形成無菌眼科溶液或懸浮液。在一些實施例中，該組合物進一步包含生物相容性物件，該生物相容性物件經構型以接觸製劑且經定尺寸以與人的虹膜接觸放置。在一些實施例中，生物相容性物件包括盤、條帶或小壓布。

在一些實施例中，自殺基因係選自由以下組成之群：(i)單純皰疹病毒胸苷激酶基因；(ii)胞嘧啶脫胺酶基因；(iii)硝基還原酶基因；及(iv)羧肽酶G2基因。在一些實施例中，黑色素細胞特異性基因啟動子包含酪胺酸酶(Tyr)啟動子。在一些實施例中，自殺基因包括單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因，及黑色素細胞特異性基因啟動子包括酪胺酸酶(Tyr)啟動子。

在另一個態樣中，本發明提供一種用於改變個體虹膜顏色之方法，該方法包括：將黑色素細胞殺死劑引入至個體眼睛之前房中；其中該藥劑導致眼睛虹膜基質中之黑色素細胞凋亡性死亡，由此改變虹膜之顏色。

在又另一個態樣中，本發明提供一種用於改變個體虹膜顏色之方法，該方法包括：將基因載體引入至個體眼睛之前房中；其中該基因載體之引入導致眼睛虹膜基質中之黑色素細胞死亡，由此改變虹膜之顏色。

在一些實施例中，該引入步驟係自前房外部穿過眼睛角膜中之開口進入至前房中來進行。

在一些實施例中，基因載體包含自殺基因。在一些實施例中，自殺基因係選自由以下組成之群：(i)單純皰疹病毒胸苷激酶基因；(ii)胞嘧啶脫胺酶基因；(iii)硝基還原酶基因；及(iv)羧肽酶G2基因。在一些實施例中，基因載體包含病毒胸苷激酶(tk)自殺基因。在一些實施例中，基因載體包含單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因。在一些實施例中，自殺基因係可操作地連接至黑色素細胞特異性基因啟動子。在一些實施例中，自殺基因係可操作地連接至酪胺酸酶(Tyr)之黑色素細胞特異性基因啟動子。在一些實施例中，自殺基因包含可操作地連接至酪胺酸酶(Tyr)之黑色素細胞特異性基因啟動子之單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因。

在一些實施例中，基因載體係選自由質體、腺病毒、腺相關病毒及慢病毒組成之群。在一些實施例中，基因載體包含重組腺相關病毒。在一些實施例中，重組腺相關病毒包含AAV1或AAV6衣殼蛋白。

在一些實施例中，該方法進一步包括對個體投與核苷類似物。在一些實施例中，該方法進一步包括在引入期間維持個體眼睛之瞳孔縮瞳。在一些實施例中，核苷類似物為更昔洛韋、阿昔洛韋或纈更昔洛韋。

在一個態樣中，本發明提供一種用於改變個體虹膜顏色之方法，該方法包括使虹膜之前表面與殺死黑色素細胞之物質接觸，由此改變虹膜之顏色。在一些實施例中，該物質包含重組腺相關病毒(rAAV)，其包含可操作地連接至酪胺酸酶(Tyr)之基因啟動子之單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因。

在一個態樣中，本發明提供一種基因載體於改變個體虹膜顏色之用途，其中該基因載體包含(a)自殺基因；及(b)可操作地連接至自殺基因之黑色素細胞特異性基因啟動子。

在另一個態樣中，本發明提供一種用於改變個體虹膜顏色之基因載體，其中該基因載體包含(a)自殺基因；及(b)可操作地連接至自殺基因之黑色素細胞特異性基因啟動子。

在又另一個態樣中，本發明提供一種用於改變個體虹膜顏色之組合物，其包含無菌眼科製劑，該無菌眼科製劑包含攜載核酸之遺傳載體，該核酸在投與眼睛中時能夠誘導虹膜中之黑色素細胞死亡。

本技術之另外特徵及優點將在以下描述中闡述，且部分地自描述中將明白，或可藉由本技術之實踐而獲知。藉由在書面描述及其申請專利範圍以及附圖中特別指出的結構，將實現及達成本技術之優點。

應明瞭，前述一般描述及隨後詳細描述均係示例性及說明性且意欲提供對所主張的本技術之進一步解釋。

相關申請案之交叉參考

本申請案主張2020年1月16日申請之美國臨時專利申請案第62/962,063號及2020年5月18日申請之美國臨時專利申請案第63/026,554號之權益，該等申請案之全文係以引用之方式併入本文中。

在以下詳細描述中，闡述許多特定細節以全面理解本技術。然而，熟習此項技術者當明瞭，可在沒有一些此等特定細節下實踐本技術。在其他情況下，未詳細顯示熟知的結構及技術以免使本技術模糊。

片語諸如「一個態樣」並不意指此態樣係本技術必不可少的或此態樣適用於本技術之所有構型。關於一個態樣之揭示內容可應用於所有構型或一或多個構型。一個態樣可提供本發明之一或多個實例。片語諸如「一個態樣」可指一或多個態樣及反之亦然。片語諸如「一個實施例」並不意指此實施例係本技術必不可少的或此實施例適用於本技術之所有構型。關於一個實施例之揭示內容可應用於所有實施例或一或多個實施例。一個實施例可提供本發明之一或多個實例。片語諸如「一個實施例」可指一或多個實施例及反之亦然。片語諸如「一個構型」並不意指此構型係本技術必不可少的或此構型適用於本技術之所有構型。關於一個構型之揭示內容可應用於所有構型或一或多個構型。一個構型可提供本發明之一或多個實例。片語諸如「一個構型」可指一或多個構型及反之亦然。在法律允許的範圍內，本發明之內容(包括任何圖式及文字)受美國版權法(版權2019)的保護。

改變眼睛顏色

虹膜顏色作為美麗之屬性起著顯著社交功能。使用經著色隱形眼鏡可改變某些類型之虹膜顏色。此等眼鏡可具有處方屈光力(optical power)或僅可起到美容功能。

將經著色隱形眼鏡用於美容目的有幾個缺點。該等眼鏡具有與具處方屈光力之隱形眼鏡相同之潛在使用併發症，包括對鏡片材料之過敏反應及來自不當處理之感染。此外，由於不適，一些潛在使用者不能耐受隱形眼鏡。另外，經著色隱形眼鏡需要一定程度之靈巧性來插入及移除，其並非所有潛在使用者皆擁有的。此外，透過使用經著色隱形眼鏡不能達成虹膜顏色之永久改變。此外，經著色隱形眼鏡通常不能提供看起來自然、在美容上可接受之效果。雖然天然棕色虹膜係不透明的，而天然藍色、灰色、紫色及綠色虹膜則不是。然而，當將藍色或綠色隱形眼鏡放在棕色虹膜上時，會呈現不透明藍色或(及)綠色虹膜。由於自然界中不存在此種情況，因此虹膜看起來虛假且在美容上不具吸引力。

用於改變虹膜顏色之其他方法涉及使用植入至虹膜前方之經著色盤或注射於虹膜中之色素。由於此等侵入性眼手術之潛在併發症及在眼睛內留下異物，及由於此等干預後虹膜之不自然的不透明外觀，因此尚未廣泛採用植入經著色虹膜植入物及將色素插入虹膜中。

改變虹膜顏色之又另一種方法係對眼睛施加雷射能量，此自虹膜之前部移除一些有色素的組織。關於此方法之潛在問題包括由於過度熱轉移而使虹膜疤痕化，促進眼睛顏色之虹膜蛋白及虹膜之細微結構(例如基質隱窩及犁溝)之破壞，及因脫落的虹膜碎片阻塞負責自前房排出水樣液以維持正常眼內壓之眼睛小梁網之術後青光眼。此外，由於將雷射能量傳輸至眼睛後部且損傷視網膜或視神經之風險，可能難以在瞳孔附近安全地投與雷射光。

因此，仍需要一種安全且永久地改變人類虹膜顏色之方法，該方法不需要經著色隱形眼鏡、經植入眼鏡、虹膜中之色素沉積或虹膜之雷射。

虹膜及顏色

虹膜由五個細胞層，即前緣層、基質、括約肌及開大肌纖維、及後色素上皮組成，其中對於眼睛顏色之外觀最重要的是前層及其下層基質。眼睛形成之胚胎學研究證實，虹膜之兩個有色素層係來自不同來源。後層稱為虹膜色素上皮(IPE)且由雙層緊密融合之立方形色素細胞組成。此等為神經外胚層起源，來自視杯之前端(anterior extremity)。與IPE相反，在神經脊中，基質黑色素細胞與真皮黑色素細胞具有相同的胚胎學起源，且在發育期間遷移穿過葡萄膜(uveal tract)。除患有白化病的人外，IPE在所有眼睛顏色之虹膜檢查中始終有色素，且對眼睛顏色之印象幾乎沒有貢獻。位於上方之基質很薄，此層可對於圖案化具有一些影響。例如，IPE之深著色可吸收具有極薄基質之眼睛中之穿透光，此將給予基質之較深細胞層中之白色膠原蛋白纖維灰色調。

IPE可藉由吸收僅可穿過瞳孔進入且無法反射回去之過量光而對視網膜起到保護作用。基質-IPE接面處的無色素平滑肌分化組織用作虹膜開大肌。虹膜中之兩個頂細胞層係為虹膜之主要組分。外部前緣層極薄，尤其在其沒有色素且係由經修飾之基質細胞(亦即纖維母細胞、黑色素細胞及呈放射狀地排列膠原蛋白纖維之緻密集合)組成時。

下層基質由疏鬆結締組織組成，該結締組織係由纖維母細胞、黑色素細胞、膠原蛋白原纖維蛋白(I型、III型、VI型及XVIII型)、葡糖胺聚醣及免疫細胞(諸如巨噬細胞及肥大細胞)組成。基質黑色素細胞之樹突一般平行於虹膜表面定向，傾向於叢集在前緣層中，且已顯示代表約66%之虹膜基質細胞，與眼睛顏色無關。

常見出現較淺的虹膜顏色幾乎僅在歐洲人及歐洲混種個體中發現，儘管在其他群體中偶有報導。黑色素細胞之數量在不同眼睛顏色之間沒有顯示差異，然而據報導，由於虹膜面積較小或黑色素細胞密度稍低，亞洲人虹膜中黑色素細胞總數與非洲人或歐洲人血統相比可能較少。虹膜基質黑色素細胞之超微結構研究顯示，感知的眼睛顏色之差異係包裹於此等細胞中黑色素之黑素體顆粒之量及品質變化之結果。

有兩種類型之黑色素造成眼睛顏色：真黑色素(其具有黑褐色)及類黑色素(pheomelanin)/脂色素(lipochrome) (其具有紅黃色)。除患有白化病者(其在其皮膚或眼睛中幾乎沒有或沒有色素)外，其他人在其虹膜之後部均具有真黑色素。藉由反射各種顏色之光，虹膜之前部中黑色素之類型及量對眼睛顏色具有重要作用。

與皮膚及毛髮(其中不斷產生及分泌黑色素)不同，在虹膜中，黑素體經保留且充滿虹膜基質中之黑色素細胞之細胞質。亦已以化學方式研究眼睛顏色之間的黑色素品質，據報告藍色虹膜具有最小色素含量，而在其他眼睛顏色中已檢測到真黑色素及類黑色素形式。值得注意的是，黑色素之量及類型亦與虹膜顏色相關，其中深色眼睛之真黑色素:類黑色素比更大，而淺色眼睛展示稍微更大量的類黑色素。因此，黑色素量、包裝及品質均有所不同，從而得出一系列眼色調。

研究顯示，黑色素細胞之數量、虹膜基質中黑色素細胞佔所有細胞(包括纖維母細胞)之比例及虹膜基質細胞性並不是虹膜顏色之主要影響因素。

反而，虹膜顏色之差異至少部分可歸因於淺層虹膜黑色素細胞內每個核周細胞質區域的可變平均黑素體面積(AMAC)及每個核周區域的平均黑素體數目(AMNC)。此結果反映均勻藍色眼睛與所有其他顏色群組之間的巨大差異。具體而言，在被歸類為均勻藍色、均勻淡褐色、均勻棕色之剖檢眼睛或顯示深色瞳孔周環之任何眼睛當中，電子顯微鏡影像及電腦化影像分析測定僅核周細胞質區域內或經組合之淺層基質黑色素細胞之核周及周邊細胞質區域內之成熟黑素體之面積、數量及尺寸，從而得出以上引述的發現。

眼睛顏色遺傳學

虹膜中黑色素之存在負責人類眼睛著色且在此組織中亦呈現複雜模式，包括福克斯隱窩(Fuchs’ crypts)、痣、沃爾夫林結節(Wolfflin nodules)及收縮犁溝(contraction furrows)。儘管已使用簡單孟德爾(Mendelian)顯性-隱性基因模型描述藍褐色眼睛顏色之分離，但現代分子遺傳學觀點將此過程之生物複雜性視為多基因性表徵。據認為人類眼睛顏色中約74%的變異是由包含OCA2基因之15號染色體上的一個間隔所解釋。此區域之精細定位(fine mapping)已識別上游HERC2基因座之內含子86內的單個鹼基變化rs12913832 T⁄C，此解釋幾乎所有的此種與藍褐色眼睛顏色之相關性。充當SWI⁄SNF家族成員HLTF之靶位點之此SNP用作OCA2基因透過染色質重塑活化所需的高度演化保守調節元件之一部分。可能影響虹膜模式之主要候選基因亦包括MITF及PAX6。

用來殺死黑色素細胞的自殺基因轉導

如本文所用，「自殺基因」為編碼蛋白質之多核苷酸，該蛋白質通常通過凋亡(亦即計畫性細胞死亡)或藉由任何其他細胞毒性機制導致細胞自殺。此等基因之活化可由於許多過程引起，但誘導凋亡之主要細胞「開關」為p53蛋白。自殺基因亦稱為前藥轉化基因，因為其編碼可將非毒性前藥受質轉化為毒性藥物之酵素。例如，非毒性5F-胞嘧啶(5Fc)可藉由來自大腸桿菌(Escherichia coli )之胞嘧啶脫胺酶(CD)轉化為癌症毒性5F-尿嘧啶(5Fu)。

使用減活化之藥物殺死細胞之自殺基因療法稱為基因導向酵素前藥療法(gene-directed enzyme prodrug therapy；GDEPT)或基因前藥活化療法(gene-prodrug activation therapy；GPAT)。

GDEPT係利用編碼傳遞至腫瘤之外源酵素之基因，此後投與前藥及活化已在腫瘤中表現之細胞毒性藥物。三種最有前景的自殺基因/前藥(例如核苷類似物)組合為(1)單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase；HSV1-TK)與更昔洛韋(ganciclovir；GCV)，(2)胞嘧啶脫胺酶(cytosine deaminase；CD)與5-氟胞嘧啶(5-fluorocytodine；5-FC)，及(3)細菌硝基還原酶(nitroreductase；NTR)與5-(氮丙啶(azaridin)-1-基)-2,4-二硝基苯甲醯胺(CB1954)。

GDEPT之另一個實例為CPG2–CMDA系統(一種基於細菌酵素羧肽酶G2 (carboxypeptidase G2；CPG2)之自殺基因療法)。CPG2優於經廣泛研究之自殺基因HSV-TK及CD之優點在於其活化能夠殺死靜止期細胞以及增殖細胞之前藥。CPG2會裂解前藥CMDA，使得直接釋放其細胞毒性藥物且具有不需要進一步酶催化處理即可進行藥物活化之優點。

皮內注射其中HSV胸苷激酶(HSVtk)自殺基因透過酪胺酸酶啟動子(Tyr-HSVtk)轉錄靶向黑色素細胞之質體會導致在投與核苷類似物前藥更昔洛韋(GCV)後組織可特異性殺死黑色素細胞，且具有最小化的發炎。Tyr-HSVtk質體與表現鼠類熱休克蛋白70 (hsp70)基因(CMV-hsp70)之質體之多次皮膚注射之組合會產生高度發炎環境中正常黑色素細胞之局部化殺死。幸運的是，簡單殺死黑色素細胞在活體內產生抗黑色素細胞/黑色素瘤T細胞反應上之效率很差，從而降低自體免疫反應(諸如白斑症)之風險。

DNA注射會促進毛囊之球狀基質(bulb matrix)內產生色素之黑色素細胞之靶向表現。酪胺酸酶基因之轉錄作用係特定地發生在毛髮週期之生長期階段中於毛球中之黑色素生成(melanogenic)細胞中，此時細胞增殖且發生毛髮纖維之產生。酪胺酸酶基因之啟動子可引導治療性轉基因之黑色素細胞-及黑色素瘤特異性基因表現，例如用於治療黑色素瘤。毛囊構成免疫特權(亦即免疫反應被限制或阻止)之區域。此種免疫特權之喪失可能與病理相關，諸如斑禿，其特徵係斑片狀脫髮(patchy hair loss)且被認為是由毛髮生長期中對毛囊之自體免疫反應引起。

腫瘤細胞之免疫原性殺死與hsp之誘導相關，hsp可充當藉由樹突細胞(DC)之自身抗原之耐受原性呈現轉化為足以破壞免疫耐受性之高度免疫刺激性呈現之有效開關。傳遞轉錄靶向細胞毒性基因之皮內質體DNA注射液以及熱休克蛋白(hsp)可於小鼠中用來誘導直接活體內發炎性殺死正常黑色素細胞。當與經由質體之hsp投與組合時，高度特異性殺死正常細胞可用於破壞對自身抗原之免疫耐受性及導致排斥已建立的全身分佈性腫瘤。然而，抗自身T細胞反應在活體內亦被快速抑制，據推測是一種在其中發生正常細胞之病理性殺死之情況下針對於自體免疫疾病發展之保護措施。

Tyr-HSVtk DNA之皮內注射靶向黑色素細胞。為將細胞毒性基因表現靶向黑色素細胞，可建構攜載藉由酪胺酸酶啟動子(Tyr-HSVtk)轉錄控制之單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因之質體或其他載體。注射酪胺酸酶啟動子–lacZ質體導致特定地在黑色素細胞所在的毛幹之基部處之表現。酪胺酸酶之表現對黑色素細胞具有特異性，及其表現之喪失可用作黑色素細胞破壞之替代標誌。於提供前藥更昔洛韋(GCV) (或其他適宜核苷類似物)後，表現HSVtk之細胞將GCV轉化為其毒性三磷酸鹽形式，其在合成期間被併入DNA中時導致細胞死亡。與經磷酸鹽緩衝溶液(PBS)處理之動物相比，在經GCV處理之動物中於注射位點處酪胺酸酶mRNA量及酶催化二羥基苯基丙胺酸(L-DOPA)氧化酶活性持續降低(p ＜ 0.01)，指示局部注射位點處黑色素細胞之破壞。

核苷類似物

可根據本技術用於投與之核苷類似物包括下列：

脫氧腺苷類似物：地達諾新(didanosine) (ddI)、阿糖腺苷(vidarabine)

腺苷類似物：BCX4430

去氧胞苷類似物：阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、恩曲他濱(emtricitabine)、拉米夫定(lamivudine)、紮西他賓(zalcitabine)

鳥苷及去氧鳥苷類似物：阿巴卡韋(abacavir)、阿昔洛韋、恩替卡韋(entecavir)、更昔洛韋、纈更昔洛韋(前藥鳥苷類似物)

胸苷及去氧胸苷類似物：司他夫定(stavudine) (d4T)、替比夫定(telbivudine)、齊多夫定(zidovudine) (疊氮胸苷(azidothymidine)或AZT)

去氧尿苷類似物：碘去氧尿苷(idoxuridine)、曲氟尿苷(trifluridine)。

更昔洛韋

更昔洛韋(9- [(1,3,-二羥基-2-丙氧基)甲基]鳥嘌呤，或DHPG)為核苷鳥苷之合成、非環狀嘌呤類似物。其在結構上及藥理學上均類似阿昔洛韋且對皰疹病毒具有活性。該藥物為前藥，其藉由病毒激酶，例如感染期間藉由巨細胞病毒(CMV)基因UL97編碼之病毒激酶細胞內轉化為更昔洛韋5'-單磷酸酯。隨後，細胞激酶催化二磷酸更昔洛韋及三磷酸更昔洛韋之形成，其係以與未感染細胞相比大10倍的濃度存在於CMV或單純皰疹病毒(HSV)感染之細胞中。與阿昔洛韋相比，更昔洛韋在結構上有所不同，使得其對巨細胞病毒(CMV)具有實質上增加之抗病毒活性及對病毒DNA之選擇性較低。

三磷酸更昔洛韋為三磷酸去氧鳥苷併入至DNA中之競爭性抑制劑且與細胞DNA聚合酶相比更優先地抑制病毒DNA聚合酶。另外，三磷酸更昔洛韋充當鏈延長之不良受質，由此藉由第二途徑破壞病毒DNA合成。

更昔洛韋之活性磷酸化形式藉由透過與去氧鳥苷競爭併入病毒DNA中來干擾DNA合成及藉由在併入點終止DNA合成來抑制CMV及其他人類皰疹病毒之複製。更昔洛韋相比於其對細胞聚合酶更有效地抑制病毒DNA聚合酶。當移除更昔洛韋時，鏈延長恢復。在經CMV感染之細胞中，據認為更昔洛韋之磷酸化比在未感染細胞中要快速得多；然而，未感染細胞亦可產生低濃度之三磷酸更昔洛韋。在經CMV感染之細胞中，經CMV感染之細胞中三磷酸更昔洛韋之濃度可為未感染細胞中的100倍高，且可持續數天。

纈更昔洛韋係迅速地轉化為更昔洛韋之口服前藥且在治療及預防免疫受損宿主之CMV感染中發揮主要作用。

基因療法載體

病毒載體

已發現諸如腺病毒(AV)、腺相關病毒(AAV)、逆轉錄病毒及慢病毒之病毒將基因有效地輸送至角膜中。腺病毒及逆轉錄病毒可在例如短時期內成功地將基因傳遞至角膜中，且具有輕度至重度發炎反應。然而，此兩種載體用於基因療法之用途有限，此乃因其不能轉導低/非分裂細胞諸如角膜內皮及角膜細胞，及誘導免疫反應。AAV及失能的慢病毒載體為將基因傳遞至眼睛組織中提供更佳替代，此乃因其能夠轉導慢/非分裂細胞及能夠提供長期轉基因表現。慢病毒載體之來源(馬類傳染性貧血病毒及HIV)令人擔憂且明顯地削弱其在人類患者中使用之熱情。在病毒載體中，AAV因其效力及安全性而成為基因療法之良好選擇。重組AAV載體針對於眼基因療法及恢復患者視力而無重大副作用顯示很大前景性。

腺相關病毒

迄今為止，在110種經識別的AAV血清型當中，已使用血清型1至10來進行基因療法。AAV載體已在視網膜、角膜及許多活體內非眼組織中展示高轉導效率及長期轉基因表現。與用於基因療法之其他AAV血清型相比，AAV2已更深入地經測試，儘管各血清型已針對各種細胞/組織顯示獨特轉導模式。AAV6、-8及-9尤其具有有效地介導全身基因轉移之能力。藉由不同AAV血清型之基因轉移變異可能係歸因於宿主細胞受體與病毒衣殼之間的相互作用。不同AAV血清型之衣殼區域中之結構變化使得各血清型能夠結合不同細胞表面受體。例如，AAV血清型4、5及6使用唾液酸，而AAV 8及9使用層黏連蛋白受體以進入細胞。此導致雜交AAV載體之發展，因為使用AAV2基因組之轉衣殼化(transencapsidation)產生多種假包裝載體於AAV1–9之衣殼中。在各種動物模型之眼組織中，此等下一代雜交載體AAV2/1–9與AAV2/2相比展現更高轉導效率。

經由玻璃體內及視網膜下注射將載體引入至眼睛中後，AAV2/7及2/8在視網膜及前房組織(包括虹膜、小梁網及角膜)中均展示優異長期轉導能力(長達6個月)。關於AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8及AAV2/9載體之隨後研究進一步強化視網膜組織之此等發現。AAV2/8及2/9以類似方式在非眼組織(諸如心臟、腦、骨骼肌、肺及肝臟)中展示5至100倍的優異轉導效率。

編碼鹼性磷酸酶(AP)之AAV2/6、AAV2/8及AAV2/9載體可有效地轉導人類角膜纖維母細胞，但在轉導效率方面不同。與AAV2/8或AAV2/9相比，AAV2/6展現高30至50倍的轉導效率。所測試的AAV血清型均未引起明顯細胞死亡或細胞活力喪失，再確認得出AAV載體對於角膜是安全的。與體外研究相比，使用活體內小鼠角膜及體外人類角膜針對此等載體之研究顯示極其不同的轉導概況。與體外發現相反，發現三種經測試載體之轉導效率之順序為AAV2/9 ≥ AAV2/8 ＞ AAV2/6。此等發現並不是意外的，因為文獻報告指出體外基因傳遞可能不同於活體內轉導。三種經測試血清型均未引起任何顯著副作用，諸如細胞死亡、細胞活力喪失、發炎及/或角膜中之明顯免疫反應(如利用TUNEL及CD11b或F4/80免疫染色測定)。在小鼠眼睛中使用AAV2可檢測到角膜上皮中轉基因表現長達8個月，表明rAAV傳遞之轉基因可在活體內持續數月且可能數年。

AAV-DJ (2型/8型/9型嵌合體)係藉由改組八種不同野生型未處理(native)病毒而設計的，由於可將基因高度有效地轉移至寬廣範圍之細胞類型中而被用於基因轉導。例如，AAV-DJ載體已被用於敲除豬纖維母細胞中之基因，其靶向頻率高於其他天然存在之血清型。在人類角質細胞中，AAV-DJ在轉導效率上優於所有其他血清型。

可根據本發明之原理使用任何前述或其他適宜AAV載體，端視諸如劑量及暴露於組織之持續時間的因素而定。

非病毒載體

在不使用病毒下將表現治療性基因之質體DNA引入至靶細胞中係落在非病毒基因轉移方法之寬泛類別範圍內。非病毒基因療法由於低毒性、免疫原性及致病性而被認為比病毒基因療法更安全。另外，質體載體之生產係直接且具有成本效益。然而，低轉染效率係主要問題。此等技術之簡要描述如下。

微注射

以角膜為例，經由微注射之質體已成功地導致將基因(包括GFP、介白素(IL)18、Flt23k、內皮抑素、MMP14及血管抑素(vasohibin))傳遞至角膜之各種細胞中。已在各種解剖位置進行針對角膜之不同層之微注射且包括基質內、結膜下及直接注射至前房中。顯微外科技術亦提供探索角膜病症中之基因功能之可行方法。使用由SAINT-18及編碼報導或FGF2基因之質體載體組成之經部分乾燥之p-bFGF–SAINT-18複合物之基質內層狀植入來進行活體內角膜之成功轉基因傳遞。此種角膜基因轉移方法允許在角膜中之局部化轉基因傳遞。

根據本技術之原理，可透過微注射或其他方式將用於質體或裸DNA插入之此等相同技術應用於虹膜。

電穿孔

電穿孔(亦稱為電基因療法(electrogenetherapy)或電通透(electropermeabilization))利用高強度電脈衝以在細胞膜中形成瞬時孔且可用於基因遞送於經培養之眼睛細胞及活體內眼表面組織兩者中。一個優點係大型DNA構築體可轉運至細胞中，儘管需要專門設備。再以角膜為例，電穿孔具有將外源基因傳遞至角膜上皮以及角質細胞中之能力。200 V/cm之電流不會引起創傷、角膜水腫或發炎，但引入的轉基因低量。較高電流導致增強之基因轉移，但亦導致相當大的角膜損傷。電流可引起不可逆組織損傷，由於加熱或由於細胞膜破裂而引起Ca2+流入所致。已描述用電輔助將基因傳遞至離體之人類角膜之內皮中。使用定製設計的電極，使用125 mA方波電流(square current)之八次1-Hz 100-ms脈衝成功地將兩個報導基因EGFP及β-半乳糖苷酶(βgal)轉運至器官培養中之人類角膜中。儘管效率遠低於病毒載體，但低細胞死亡及內皮細胞緊密接合完整性無明顯變化顯示其潛在臨床應用。已報導使用離子電滲法(iontophoresis)及電穿孔個別及組合將甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)小干擾RNA (siRNA)及葡聚糖大分子活體內電轉移至小鼠角膜上皮中。儘管離子電滲法及電穿孔均獨立地將大分子傳遞至角膜中，但發現離子電滲法更有效且於離子電滲法接著電穿孔之組合比兩種方法單獨更有效。

聲穿孔 (Sonoporation)

聲穿孔利用超音波以在質膜中形成孔隙以便將DNA傳遞至細胞核。超音波對於體外及體內細胞轉染有效。除了使用造影劑(諸如微泡)之外，此種方法之轉染效率取決於轉換器頻率、聲壓、輸出強度及超音波處理之脈衝持續時間。產生微泡作為造影劑以不僅增強成像而且經由增強細胞通透性來提高基因傳遞效率。超音波靶向之微泡破壞作為一種位點特異性基因轉移方法可具有巨大潛力且已成功用於體外人類RPE細胞及體內大鼠視網膜之AAV介導之基因轉染。

基因槍

基因槍係一種彈道(亦稱為生物彈道)基因轉移方法。其利用微米大小的生物惰性重金屬(金、銀或鎢)顆粒及機械或大彈(macroprojectile) (向心、磁或靜電)力。DNA包覆顆粒以高速度轟擊細胞/組織導致基因轉移。利用基因槍之基因傳遞取決於許多因素，諸如顆粒上包覆的DNA之量、溫度、細胞數量、力大小、DNA包覆顆粒數量等。顆粒之淺穿透、大量細胞損傷、不受控制之基因轉移、高成本、接近內臟器官等為此方法之一些局限性。

根據本技術之原理且如熟習此項技術者將理解及針對於情況定製，可將微注射、電穿孔、離子電滲法、聲穿孔及用於質體或裸DNA插入之基因槍技術應用於虹膜。

用於黑色素細胞之 AAV 載體

腺相關病毒(AAV)為與任何已知病理均不相關之輔助依賴型小病毒。重組AAV (rAAV)不表現病毒蛋白，能夠轉導分裂及非分裂細胞，且與持久轉基因表現相關。其已作為基因療法載體進行廣泛評估，其中數百名患者已在臨床試驗中接受rAAV而無任何顯著載體相關併發症。不同於γ-逆轉錄病毒及慢病毒載體，rAAV之整合並不常見，其中載體基因組仍處於游離狀態(episomal state)。rAAV有至少十二種血清型及許多衣殼變體，且不同受體及共受體用法導致用於不同細胞類型之不同向性。

儘管已成功地使用AAV2/2、2/1及2/4以還原主要影響視網膜色素上皮之不同視網膜疾病模型之表型，但在一項研究中血清型2 rAAV載體(rAAV2)未見原代人類黑色素細胞之轉導。已報導眼內注射後藉由rAAV血清型1轉導鼠類脈絡膜及虹膜黑色素細胞，表明至少一些rAAV血清型可能能夠轉導人類黑色素細胞。

針對於轉導原代人類黑色素細胞之能力來篩選rAAV之變體，識別出rAAV6為最佳血清型，其轉導7至78%之細胞。rAAV6酪胺酸衣殼突變體之轉導未見增加。表現轉基因之細胞數量在感染後6至12天達到峰值，且在第28天仍可檢測到經轉導之細胞。因此，rAAV6可被認為是用於轉導原代人類黑色素細胞之非整合載體。

除rAAV1及rAAV6外，可根據本技術之原理使用任何適宜腺相關病毒載體。

基因載體載體 (Vector Carrier)

如本文所用，「基因載體」或「遺傳載體」可指一或多個多核苷酸或該一或多個多核苷酸之載體，諸如攜載所關注的核酸序列(例如DNA及/或RNA、基因、啟動子及增強子)之病毒(例如腺相關病毒之衣殼)，或指該包含多核苷酸且亦攜載任何其他蛋白質或其他分子之載體之整體組合。

如本文所用，「基因」具有標準定義且亦可指包含具有足以編碼特定蛋白質之資訊之序列之多核苷酸(例如DNA或RNA)。

如本文所用，術語「胸苷激酶基因」係指生物體中包含編碼胸苷激酶之已知標準DNA序列或其修飾之多核苷酸。編碼胸苷激酶之已知標準DNA序列之修飾包括(1)編碼胸苷激酶之已知DNA編碼序列(例如密碼子最佳化序列)之變體或片段；或(2)標準DNA編碼序列之互補DNA或RNA序列(包括信使RNA，或mRNA)，其包含足以導致胸苷激酶或具有與胸苷激酶相同功能之蛋白質之轉錄及/或轉譯之資訊。

如本文所用，「可操作地連接」意指用於表現之元件相對於編碼序列以指導或調節編碼序列表現之方式定位在載體中。

根據本技術之基因載體(例如DNA序列、質體或病毒載體(諸如AAV))可由外科醫生藉由任何多種載體(「基因載體載體」) (包括液體溶液或懸浮液、血漿、凝膠或糊劑(例如，用刮刀、小壓布或其他施覆器施覆至虹膜表面)、或生物相容性材料之加藥盤、條帶或小壓布，例如於其上將基因載體施覆至一側，如加藥繃帶)攜帶至虹膜表面。例如，外科醫生可在一段時間(例如1、3、5、10、12或15分鐘或更長時間)內將此種材料之一或多個盤、條帶或小壓布施覆至虹膜表面，其中接觸虹膜之材料側包含例如藉由毛細管力或藉由可生物降解黏著劑(諸如纖維蛋白或白蛋白糊劑或膠水或快速溶解的其他適宜材料)黏著至其之載體顆粒。

水凝膠及傳遞基因載體之其他材料

水凝膠為具有在水或水性溶劑系統中溶脹且保持溶劑(所欲藥物)在溶脹交聯凝膠相中以進行傳遞之能力之聚合物。透過控制滲透及擴散特性，其能夠保留疏水及親水藥劑、小分子及大分子。取決於特定結構，其在應用中可係不可降解或可降解。水凝膠具有保留疏水、親水、小分子及大分子之能力。其可經設計為溫度及pH敏感。

水凝膠係由親水性聚合物之交聯或自組裝形成，該親水性聚合物可由天然存在之材料(例如纖維蛋白、甲殼素及透明質酸)或合成材料(例如聚乙二醇(PEG)及聚乙烯醇)形成。此外，水凝膠可針對許多應用進行客製化。例如，其可經設計成可注射或具有環境響應性(environmentally responsive)，以鼓勵特定細胞類型之浸潤且獲得各種幾何形狀。藉由改變水凝膠載體之物理性質，諸如孔徑及降解動力學，可達成對遺傳載體傳遞之控制。重要的是，轉基因表現可經設計成增強支架之固有生物活性或與支架之固有生物活性協同且由此建立促進再生藥物之組織形成之環境。

水凝膠為用於遺傳貨物之臨床應用之一種特別吸引人之傳遞材料，因為其可利用微創程序引入體內。已顯示纖維蛋白PEG及自組裝肽水凝膠可成功地包封及釋放AAV及LV二者。藻酸鹽(一種帶負電荷之生物材料)為吸引人且通用之媒劑，其因其低免疫原性、可調諧之生物降解性及溫和的膠凝化程序而亦已進行針對於病毒載體傳遞之測試。與用於病毒傳遞之其他水凝膠相反，藻酸鹽特別適用於其中意欲在聚合物網路外部直接在組織標靶之細胞微環境內原位達成轉導而無組織相互作用之應用。熟知藻酸鹽水凝膠不進行化學修飾就不支持細胞浸潤及黏著。

通常，可藉由控制藻酸鹽水凝膠系統之三個關鍵態樣來調整藻酸鹽水凝膠中有效負載(payload)之釋放：水凝膠中有效負載之擴散性；水凝膠之可降解性；及藻酸鹽與有效負載間之親和力。以上三個態樣已用於控制小分子、蛋白質及最近之較大顆粒(諸如病毒載體)之釋放。AAV及LV展現獨特固有物理特性，包括不同尺寸及表面特徵。考慮到此等差異，預期自藻酸鹽水凝膠載體釋放之機制在兩種載體之間將不同。例如，篩孔尺寸係藻酸鹽水凝膠影響擴散性之關鍵特性。實際上，所報告的藻酸鹽水凝膠孔徑在∼5至170 nm之範圍內且因此對於展現相似尺寸之貨物，必需破壞現有的聚合物網路(亦即降解)以調節貨物釋放。藉由改變藻酸鹽分子量組成、交聯接面之尺寸不匹配及聚合物鏈氧化之程度，可將藻酸鹽水凝膠工程化成在數天至數月之範圍內之規模上降解。因此，可降解之藻酸鹽水凝膠為理想的傳遞材料，其可經定製以滿足病毒載體(諸如LV及AAV)之所需釋放速率。

對於高度水溶性有效負載，自親水性聚合物基質溶解主要係藉由載體擴散穿過水凝膠層來控制；凝膠層內的高載體濃度梯度有助於載體傳遞。然而，對於具有較低水性溶解度之候選藥物，載體釋放速率主要取決於聚合物基質之侵蝕。結果，親水性聚合物之溶脹特性可顯著影響載體釋放概況。另外，聚合物基質之水合及侵蝕導致進一步水吸收及滲透；此將於隨後影響載體擴散。

裝載有水凝膠及載體顆粒之虹膜傳遞盤

根據本技術之用於攜載基因載體(例如AAV或慢病毒顆粒)之一種類型之載體載體裝置為攜載水凝膠或另一傳遞材料[2] (例如纖維蛋白或白蛋白基質或「膠水」)之撓性條帶或「盤」 [1] (圖1A至1D)，其中該等載體顆粒經包埋、包封或以其他方式包含在孔、腔室、袋、管柱或類似功能化結構中。用於釋放顆粒之介質或基質可由多種材料及其組合組成。以下論述將以舉例方式聚焦於水凝膠，而不限制根據本技術之原理可用於相同載體釋放目的之材料。

用於傳遞遺傳載體之水凝膠較佳位於盤[1] 之後側，當盤[1] 在程序期間定位時，面對且接觸虹膜[7b] 之前表面(圖1D)。盤上水凝膠(例如傳遞材料)之隱窩[6] 顯示於圖1D中。水凝膠在與水(例如患者前房中之水樣液)接觸後或在達到體溫(37℃)或pH (7.4)後開始溶解。在自0秒至2分鐘或更長時間之初始期之後，水凝膠開始釋放載體顆粒。可基於水凝膠組分及其濃度及化學之選擇來工程化顆粒之溶解及釋放速率。

在一些實施例中，水凝膠將在與患者眼睛中之水樣液接觸後及在初始期(例如30、45、60、75或90秒或更長時間)之後開始溶解或降解，以給與外科醫生時間來將盤放置於患者的虹膜上(例如藉由展開盤且將其定位)，水凝膠將開始自該水凝膠釋放基因載體。水凝膠在一些實施例中將較佳在初始期過去後的例如1至3分鐘或更少時間內快速釋放載體。此允許載體儘快且以高濃度或滴度接觸虹膜，以幫助確保快速成功地轉導虹膜基質黑色素細胞，從而使程序持續時間相對較短。

在一些實施例中，盤係圓形，經定尺寸及成型以配合患者的虹膜。亦可使用替代形狀，諸如多邊形條帶。盤可具有各種尺寸以配合各種虹膜尺寸，或可例如基於虹膜尺寸之統計平均值標準化為一種或幾種尺寸。盤中之中央、瞳孔開口允許水樣液在盤安置於虹膜上且在手術期間釋放載體的同時通過其流動。

本文所述的盤之非限制性實例顯示於圖1A至1D中。在一些實施例中，盤[1] 具有「瞳孔防護」[4] ，其為圍繞盤[1] 之瞳孔開口[3] 周向配置之中央、圓柱形隆凸(圖1B至1D)。圖1D顯示配合於患者眼睛之虹膜[7a 至 7b] 之盤之示意圖。盤[1] 中之中央、瞳孔開口[3] 允許水樣液在盤[1] 安置於虹膜[7a] 上且在手術期間釋放載體的同時通過其流動。瞳孔防護[4] 較佳自盤[1] 朝著虹膜表面[7b] 延伸且在水凝膠與瞳孔開口[3] 之間建立障壁。在手術期間，瞳孔防護[4] 可降低載體顆粒自前房[8] 穿過瞳孔[9] 逆行行進(相對於水樣液流動)至後房之風險。

在一些實施例中，盤[1] 具有「邊緣防護」[5] ，其為圍繞盤[1] 之周邊周向配置之中央、圓柱形隆凸(圖1B及1D)。邊緣防護[5] 較佳自盤[1] 朝著虹膜表面[7b] 延伸且以角膜[10] 之虹膜角膜角在眼邊緣附近在水凝膠與小梁網之間建立障壁。瞳孔防護[4] 可降低手術期間載體顆粒自前房順行行進(相對於水樣液流動)至小梁網中之風險。

在一些實施例中，盤既沒有瞳孔防護也沒有邊緣防護(圖1A)。在其他實施例中，盤同時具有瞳孔防護[4] 及邊緣防護[5] (圖1B及1D)。在一些實施例中，盤具有瞳孔防護[4] 而無邊緣防護(圖1C)。且在一些實施例中，盤具有邊緣防護[5] 而無瞳孔防護(未顯示)。

手術

以下手術描述僅係例示性，而並不意指限制本技術。根據眼科醫生的技術、經驗及偏好，可採行用於根據本技術投與基因療法之任何適宜程序。

可在患者中使用手術前縮瞳藥(諸如毛果芸香鹼及/或前房內縮瞳藥)以將該程序期間與基因載體接觸之可用前表面積最大化。此外，縮瞳可有益於打開小梁網，由此增加水樣液流出速率，且透過較小瞳孔相對較大瞳孔增加水流進入前房之速度。此種較高流動速度及水樣液之增加流出可降低IPE暴露於游離載體顆粒之風險，否則該等游離載體顆粒可在該程序期間及之後自前房穿過瞳孔流動且流至虹膜之後表面。

在達成患者之適宜局部或全身麻醉後，可建立角膜穿刺，且利用黏彈性或氣泡加深前房及前角。替代地，可藉由使用直接插入未事先穿刺的前房中之針自注射器注射載體顆粒來進行該程序。利多卡因(Lidocaine)或其他局部麻醉劑可經前房內徐徐滴入以進行進一步麻醉。

外科醫生將遺傳載體載體引入前房中，引入整個前房內或後部，達成一定體積之黏彈性物或氣泡。投與液體於氣泡後方，例如，可減少產生臨床結果所需的注射遺傳載體載體之量，增加DNA載體顆粒與前虹膜間接觸之可能性，及減少進入角膜內皮或角膜基質中之顆粒之損失，其中該攜載酪胺酸酶啟動子之載體將係無功能。

在將載體顆粒之遺傳載體載體(例如溶液、懸浮液或加藥條帶或盤)注射至前房中後，外科醫生可等待一段適宜時間段過去以確保顆粒與前虹膜間之充分表面相互作用。此時間可根據，例如，所投與液體中顆粒之滴度(濃度)、所注射液體之體積、及其中已放置所投與液體之前房內(例如整個前房(在成人中平均體積為約170 µL)內)或黏彈性物或氣泡後側之空間之體積而改變。

在等待一段適宜長度的時間以確保載體顆粒與前虹膜間足夠的表面相互作用後，外科醫生可藉由任何適宜方式(例如抽吸)自前房取出任何過剩量或剩餘之所投與的遺傳載體載體，用適宜液體(諸如平衡鹽溶液(BSS))沖洗，及/或漂洗等。此在一段適宜暴露時間後移除遺傳載體載體可被認為是該過程之「淬滅」，以限制或防止遠端黑色素細胞(諸如在IPE、脈絡膜及RPE中)暴露於遺傳載體。

在其中經由針將適宜劑量之載體(例如5至50 uL之1E10至1E13 vg/ml AAV顆粒溶液)注射至前房中使得不需要於隨後自前房移除載體之情況下，尚未被吸收於虹膜黑色素細胞或其他細胞中之任何載體將藉由以每分鐘約1%正常排出水樣液穿過小梁網及葡萄膜鞏膜流出系統離開前房且進入全身循環中。

可自前房移除或灌洗(irrigated)黏彈性物或氣泡(若適用)，且可經前房內注射卡巴可(Carbachol)眼內溶液(或其他縮瞳劑)以產生瞳孔縮瞳。將所有傷口水合且檢查以確保水密閉合及若需要則將10-0尼龍縫線例如放置於主傷口中。或者，角膜傷口可自行密封。

手術後，應投與核苷類似物諸如更昔洛韋或阿昔洛韋(或基於所使用的自殺基因構築體選擇之其他適宜前藥，諸如彼等以上列出者)一段適宜持續時間，例如幾天至幾週。若醫生選擇，則可由患者手術前開始此種藥物。投與持續時間可基於患者反應，例如隨著時間推移其眼睛逐漸變淺，或基於固定協定，例如1至7天或1至4週之任何時間而改變。在一些實施例中，在手術後至少一週、兩週、三週、四週或五週開始投與核苷類似物。在一些實施例中，投與核苷類似物三天、四天、五天、六天、七天、八天或九天。在一些實施例中，在手術後的第5天至第10天、第10天至第15天、第15天至第20天、第20天至第25天、第25天至第30天、第30天至第35天、第35天至第40天或第40天至第45天投與核苷類似物。在一些實施例中，在手術後的第13天至第17天、第18天至第22天、第23天至第27天、第28天至第32天、第33天至第37天、第38天至第42天、第43天至第47天或第48天至第52天投與核苷類似物。

應手術後監測患者之虹膜炎之症狀及徵兆，此可在黑色素細胞死亡或其他眼發炎時發生。預期此種發炎係輕度及暫時性的且可用睫狀肌麻痺劑(cycloplegics) (例如環戊酸酯(cyclopentolate))及局部或全身性皮質類固醇(例如培尼皮質醇滴眼液(prednisolone eyedrops)或口服普賴松(oral prednisone)或甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)劑量包)進行管理。可用乙醯胺酚、非類固醇抗發炎NSAID藥物(如布洛芬(ibuprofen))或在罕見情況下類鴉片(諸如羥考酮(oxycodone))來管理疼痛。

實驗實例

實例 1 ：活體內研究 - 選擇性移除兔前虹膜基質黑色素細胞

使一隻荷蘭黑帶(Dutch Belted) (DB)兔適應且隔離14天，然後在用氯胺酮(35 mg/kg)及甲苯噻嗪(xylazine)(5 mg/kg)之混合物進行全身麻醉後，使用具有30G針之500 µL胰島素注射器，以2E+13 vg/ml之滴度單側OD (右眼)接受AAV6在磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中之50 µL注射液於前房中。手術期間瞳孔利用2%毛果芸香鹼局部滴眼液保持縮瞳且手術後高達QID維持一天。在第38天至第42天，兔經腹膜內接受50mg/kg更昔洛韋注射液。在第1天、第3天、第5天、第7天、第14天、第21天、第28天、第38天、第45天、第52天、第59天、第66天及第83天用裂隙燈檢查眼睛。在基線下進行快速視網膜電位圖譜(Flash electroretinography)且係正常的。

在此種情況下，AAV6載體攜載編碼單純皰疹病毒1型(HSV)胸苷激酶之自互補(雙股) DNA盒(pAL120-TK質體序列，由Maria Castro博士提供：揭示於King等人，J Virol. 2008年5月 82(9):4680-4；Addgene，Watertown，MA)，其藉由小鼠酪胺酸酶啟動子序列(pDRIVE5Lucia-mTyr，InvivoGen，San Diego，CA)驅動。如本文所論述，能夠藉由凋亡誘導細胞死亡之任何其他黑色素細胞特異性基因構築體及/或根據本技術之原理傳遞之任何其他載體(諸如不同AAV血清型)將係適宜的。

在整個83天的研究中在眼科檢查期間沒有發現變化，且在研究期間受試兔子之體重穩定。角膜及虹膜看起來健康。在前房中未觀測到發炎細胞或發紅(flare)。水晶體係透明的。在整個持續時間中，結膜、鞏膜及後段檢查保持正常，具有正常外觀的玻璃體、視網膜、脈絡膜及視神經。吾人準備在前房發炎之第一徵兆時用局部0.1%地塞米松(dexamethasone) (地塞米松，WZF POLFA SA，Poland)治療經注射之眼睛，但此從未發生。

在冷凍包埋之前，用1xTBS洗滌虹膜及視網膜，且置於在1xPBS中製備的10%、20%及30%梯度蔗糖溶液。之後，組織藉由將其包埋於O.C.T.(低溫包埋溶液)中來冷凍，在液氮中冷凍且保持在-20℃直至進一步處理。使用Leica冷凍切片機CM1860切割10 µm厚度之切片。

用蘇木精(Hematoxylin)及曙紅(Eosin)、Fontana Masson染色套組及抗CD68抗體染色虹膜及視網膜之切片以識別巨噬細胞。

結果

毛皮 ：研究期間兔的黑色皮毛沒有脫色之徵兆，指示毛囊中之黑色素細胞沒有顯著損失。

裂隙燈檢查 ：在第45天(第38天的更昔洛韋注射一週後)，觀測到呈均勻分佈之虹膜之整個表面上前虹膜色素沉著損失(整體且以點狀方式)。此種色素沉著損失在第2週(第52天)及第3週(第59天)增加，然後穩定。在第59天至第83天之間，藉由裂隙燈檢查在25x放大倍率下未觀測到進一步脫色。參見圖 2 。

組織學 ：Fontana-Masson染色顯示，相對於對照眼(OS)，在治療眼(OD)中，前虹膜基質黑色素細胞損失，特別是在虹膜之前表面上。參見圖 3 。虹膜色素上皮(在虹膜之後側)沒有變化，在此區域中未觀測到黑色素細胞之損失。視網膜及脈絡膜亦未顯示黑色素細胞之損失。

實例 2 ：活體內研究 – 兔的眼睛顏色變化

使一隻荷蘭黑帶(DB)兔適應且隔離14天，然後在用氯胺酮(35 mg/kg)及甲苯噻嗪(5 mg/kg)之混合物進行全身麻醉後，使用具有30G針之500 µL胰島素注射器，以2E+13 vg/ml之滴度單側OD (右眼)接受AAV6在磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中之50 µL注射液於前房中。使用如以上在實例1中描述之包含單純皰疹病毒1型(HSV)胸苷激酶之編碼序列之AAV6載體。

手術期間瞳孔利用2%毛果芸香鹼局部滴眼液保持縮瞳且手術後高達QID維持一天。一隻兔在第7天至第11天經腹膜內接受50 mg/kg更昔洛韋注射液，及另一隻兔在第14天至第18天經腹膜內接受50 mg/kg更昔洛韋注射液。

在第0天、第1天、第3天、第7天、第14天、第21天、第28天及第35天用裂隙燈檢查眼睛，且每天拍攝OD (注射眼)及OS (未注射AAV6之對照眼)之照片。第0天及第35天之影像提供於圖4A (第0天)及4B (第35天)中。圖4B清楚地顯示病毒注射後35天，OD (注射眼)中眼睛顏色改變而OS (對照眼)中則沒有改變。

提供前述描述以使熟習此項技術者能夠實踐本文所述的各種構型。儘管已參考各種圖式及構型特定描述本技術，但應明瞭，此等僅係出於說明目的而不應被視為限制本技術之範疇。

可有許多其他方式來實施本技術。可在不脫離本技術之範疇下將本文所述的各種功能及元件與彼等所示者不同地劃分。熟習此項技術者將輕易地明白此等構型之各種修改，且可將本文所定義的一般原理應用於其他構型。因此，可由一般技術者在不脫離本技術之範疇下對本技術做出許多改變及修改。

如本文所用，「至少一段特定時間之時期」(例如「至少一天之時期」)係指具有至少與該時間一樣長之持續時間之時期(例如持續一天或更長持續時間之時期)。

如熟習此項技術者將明白，如本文所述的投與具有自殺基因及黑色素細胞特異性基因啟動子之遺傳載體載體之任何方法或系統可用於本技術之此描述中所列出的任何狀況。可根據患者反應改變或滴定暴露於遺傳載體載體及藥物投與之量及時序。

應明瞭，所揭示過程中步驟之特定順序或層次係示例性方法之說明。基於設計偏好，應明瞭，可重新安排過程中步驟之特定順序或層次。一些該等步驟可同時進行。隨附方法主張以樣本順序呈現各個步驟之要素而非意欲受限於所呈現的特定順序或層次。

如本文所用，片語在一系列項目之後的「...中之至少一者」 (以術語「及」或「或」分隔任何項目)係修飾整個清單，而不是清單之各成員(亦即各項目)。片語「...中之至少一者」可包括但不要求選擇系列中各項目中之至少一者。而是，該片語允許意指其包括任何一個該等項目中之至少一者、及/或該等項目之任何組合中之至少一者、及/或各個該等項目中之至少一者。舉例而言，片語「A、B及C中之至少一者」包括單獨A、單獨B、單獨C、A、B及C之任何組合；及/或A、B及C中之各者中之至少一者。

如本發明中所使用的術語諸如「頂部」、「底部」、「前部」、「後部」及類似者應理解為係指任意參考框架，而不是指尋常重力參考框架。因此，頂表面、底表面、前表面及後表面可在重力參考框架中向上、向下、對角或水平地延伸。

此外，在本描述或申請專利範圍中使用術語「包括(include)」、「具有(have)」或類似者之程度上，該術語意欲以類似於術語「包含(comprise)」之方式呈包括性，當在申請專利範圍中使用作為過渡詞時解釋為「包含(comprise)」。

詞語「示例性」在本文中用於意指「充當一個實例(example)、實例(instance)或說明」。本文中描述為「示例性」之任何實施例不一定被解釋為較佳或優於其他實施例。

除非具體陳述，否則以單數形式提及一要素並不意欲意指「一個及僅一個」，而是「一或多個」。男性代名詞(例如他的)包括女性及中性性別(例如她的及它的)及反之亦然。術語「一些」係指一或多個。僅出於方便而使用加底線、粗體及/或斜體標題及次標題，其並不限制本技術，且並非結合本技術之描述之解讀而被提及。熟習此項技術者已知或稍後知曉的描述於本發明全文中之各種構型之要素之所有結構及功能等效物均以引用之方式明確地併入本文中且意欲為本技術所涵蓋。此外，無論以上描述中是否明確敘述此揭示內容，本文所揭示的任何內容均不意欲獻給公眾。

儘管已描述本發明之某些態樣及實施例，但此等態樣及實施例僅舉例呈現，而不意欲限制本發明之範疇。實際上，在不脫離本發明之精神下，本文所述的新穎方法及系統可以各種其他形式來體現。隨附申請專利範圍及其等效物意欲涵蓋將落入本發明之範疇及精神內之此種形式或修改。

[1]:盤 [2]:傳遞材料 [3]:瞳孔開口 [4]:瞳孔防護 [5]:邊緣防護 [6]:傳遞材料隱窩 [7a]:虹膜(橫截面) [7b]:虹膜表面(前) [8]:前房 [9]:瞳孔 [10]:角膜 [11]:鞏膜

圖1A至1D顯示基因載體傳遞盤之各種實施例。

圖1A為基因載體傳遞盤之側透視圖。

圖1B為具有瞳孔及邊緣防護之基因載體傳遞盤之剖面圖。

圖1C為具有瞳孔防護之基因載體傳遞盤之剖面圖。

圖1D為經定位成與眼睛虹膜接觸之基因載體傳遞盤之剖面圖。

圖2為兔兩隻眼睛之虹膜之放大裂隙燈(slit lamp)視圖。

圖3顯示使用Fontana-Masson染色之兩個虹膜之組織學冷凍切片。

圖4A為在注射當天(第0天)經如實例2中所述處理之兔之OD (經注射之眼睛)及OS (不注射AAV6之對照眼睛)之圖像。

圖4B為在注射35天後(第35天)經如實例2中所述處理之兔之OD (經注射之眼睛)及OS (不注射AAV6之對照眼睛)之圖像。

Claims (10)

1. 一種基因載體用於製備改變個體虹膜顏色之組合物之用途，其中該組合物係用於引入至個體眼睛之前房中；其中該基因載體包含重組腺相關病毒，該重組腺相關病毒包含可操作地連接至黑色素細胞特異性基因啟動子之自殺基因，其中該個體之虹膜為健康的，以及其中該組合物之引入導致該眼睛之健康虹膜基質中黑色素細胞死亡，且於該前房中不引起發炎徵兆，由此改變虹膜之顏色。
2. 如請求項1之用途，其中該組合物係用於自前房外部引入穿過眼睛角膜中之開口進入至前房中。
3. 如請求項1之用途，其中該自殺基因係選自由以下組成之群：(i)單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)；(ii)胞嘧啶脫胺酶基因；(iii)硝基還原酶基因；及(iv)羧肽酶G2基因。
4. 如請求項1之用途，其中該自殺基因包含單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因。
5. 如請求項4之用途，其中該組合物係用於與核苷類似物之投與併用引入個體眼睛之前房中，其中該核苷類似物係選自下列組成之群：更昔洛韋(ganciclovir)、阿昔洛韋(acyclovir)及纈更昔洛韋(valganciclovir)。
6. 如請求項1之用途，其中該黑色素細胞特異性基因啟動子係酪胺酸酶(TYR)之啟動子。
7. 如請求項6之用途，其中該自殺基因包含可操作地連接至酪胺酸酶(TYR)之該黑色素細胞特異性基因啟動子的HSVtk基因。
8. 如請求項1之用途，其中該重組腺相關病毒包含AAV1或AAV6衣殼蛋白。
9. 如請求項1之用途，其中該組合物係用於在維持個體眼睛瞳孔之縮瞳時引入眼睛之前房中。
10. 如請求項1之用途，其中該組合物係用於以5至50μL之1E10至1E13載體基因組(vg)/mL之劑量引入眼睛之前房中。