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TWI808169B - 基因治療構築體及使用方法 - Google Patents

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TWI808169B
TWI808169B TW108115137A TW108115137A TWI808169B TW I808169 B TWI808169 B TW I808169B TW 108115137 A TW108115137 A TW 108115137A TW 108115137 A TW108115137 A TW 108115137A TW I808169 B TWI808169 B TW I808169B
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黃 杜
史蒂芬 塔斯克
羅素 卡斯和
冊方 劉
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美商阿米庫斯醫療股份有限公司
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Abstract

本發明提供經改良之基因治療載體及使用方法，在一些實施例中，其包含用於改良治療蛋白之表現及細胞靶向的序列。

Description

基因治療構築體及使用方法
遺傳病症係因發生於基因組之基因編碼區中之可遺傳或新生突變所產生。在一些情況下，此類遺傳病症可藉由向患有遺傳病症之個體投與由經突變基因編碼之蛋白質來治療。然而，此類治療具有挑戰性，此係因為投與該蛋白質不會一直使蛋白質到達需要其的器官、細胞或細胞器。此外，此治療亦通常需要兩週一次輸注，該等輸注不需要與基因治療一起，其中單一治療可提供持續釋放。因此，基因治療具有提供優於目前遺傳病症之可用治療的改良結果的潛能。
本文提供用於使用基因治療治療遺傳病症之組合物及方法。本文亦提供用於基因治療之基因治療載體組分及方法，該基因治療用於改良蛋白質表現及增加細胞吸收或遞送及胞內或亞細胞靶向由基因治療載體提供之治療蛋白。
在某些態樣中，提供基因治療載體，例如包含核酸構築體之基因治療載體，該核酸構築體以5'至3'順序包含：(a)轉譯起始序列，及(b)編碼治療蛋白之核酸序列。在一些實施例中，轉譯起始序列包含Kozak序列。在一些實施例中，Kozak序列包含序列AX1 X2 ATGA (SEQ ID NO: 28)，其中X1 及X2 中之每一者為任何核苷酸。在一些實施例中，X1 包含A。在一些實施例中，X2 包含G。在一些實施例中，Kozak序列包含與AAGATGA (SEQ ID NO: 29)至少85%一致之核酸序列。在一些實施例中，Kozak序列與AAGATGA (SEQ ID NO: 29)之序列相差一個或兩個核苷酸。在一些實施例中，Kozak序列包含AAGATGA (SEQ ID NO: 29)。在一些實施例中，Kozak序列包含與GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)至少85%一致之核酸序列。在一些實施例中，Kozak序列與GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)之序列相差一個或兩個核苷酸。在一些實施例中，Kozak序列包含GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含編碼信號肽之核酸序列，該信號肽能夠相較於無信號肽之治療蛋白增加治療蛋白之分泌。在一些實施例中，信號肽係選自結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽及Gaussia信號肽。在一些實施例中，BiP信號肽包含與選自由SEQ ID NO: 13-17組成之群之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽與選自由SEQ ID No: 13-17組成之群之序列相差5個或更少、4個或更少、3個或更少、2個或更少或1個胺基酸。在一些實施例中，BiP信號肽包含選自由SEQ ID NO: 13-17組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，Gaussia信號肽包含與SEQ ID NO: 32至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽與SEQ ID NO: 32之序列相差5個或更少、4個或更少、3個或更少、2個或更少或1個胺基酸。在一些實施例中，Gaussia信號肽包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含內部核糖體進入序列(IRES)。在一些實施例中，IRES為蟋蟀麻痹病毒(CrPV) IRES。在一些實施例中，IRES包含與SEQ ID NO: 12至少90%一致之核酸序列。在一些實施例中，IRES包含SEQ ID NO: 12。
在額外態樣中，提供基因治療載體，其包含核酸構築體，該核酸構築體以5'至3'順序包含：(a)編碼信號肽之核酸序列，及(b)編碼治療蛋白之核酸序列，其中信號肽能夠相較於無信號肽之治療蛋白增加治療蛋白的分泌。在一些實施例中，信號肽係選自結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽及Gaussia信號肽。在一些實施例中，BiP信號肽包含與選自由SEQ ID NO: 13-17組成之群之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽與選自由SEQ ID No: 13-17組成之群之序列相差5個或更少、4個或更少、3個或更少、2個或更少或1個胺基酸。在一些實施例中，BiP信號肽包含選自由SEQ ID NO: 13-17組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽包含Gaussia信號肽。在一些實施例中，Gaussia信號肽包含與SEQ ID NO: 32至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽與SEQ ID NO: 32之序列相差5個或更少、4個或更少、3個或更少、2個或更少或1個胺基酸。在一些實施例中，Gaussia信號肽包含SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含轉譯起始序列。在一些實施例中，轉譯起始序列包含Kozak序列，該Kozak序列包含序列AX1 X2 ATGA (SEQ ID NO: 28)，其中X1 及X2 中之每一者為任何核苷酸。在一些實施例中，X1 包含A。在一些實施例中，X2 包含G。在一些實施例中，Kozak序列包含與AAGATGA (SEQ ID NO: 29)至少85%一致之核酸序列。在一些實施例中，Kozak序列與AAGATGA (SEQ ID NO: 29)之序列相差一個或兩個核苷酸。在一些實施例中，Kozak序列包含AAGATGA (SEQ ID NO: 29)。在一些實施例中，Kozak序列包含與GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)至少85%一致之核酸序列。在一些實施例中，Kozak序列與GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)之序列相差一個或兩個核苷酸。在一些實施例中，Kozak序列包含GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含內部核糖體進入序列(IRES)。在一些實施例中，IRES包含選自由以下組成之群之IRES：蟋蟀麻痹病毒(cricket paralysis virus；CrPV) IRES、小核糖核酸病毒IRES、口蹄疫病毒IRES、卡堡氏(Kaposi's)肉瘤相關疱疹病毒IRES、A型肝炎IRES、C型肝炎IRES、瘟病毒IRES、蟋蟀麻痹病毒(Cripavirus) IRES、禾谷縊管蚜病毒IRES及梅雷克氏(Merek's)病病毒IRES。在一些實施例中，IRES包含與SEQ ID NO: 12至少90%一致之核酸序列。在一些實施例中，IRES包含SEQ ID NO: 12。
在其他態樣中，提供基因治療載體，其包含核酸構築體，該核酸構築體以5'至3'順序包含：(a)內部核糖體進入序列(IRES)，及(b)編碼治療蛋白之核酸序列。在一些實施例中，IRES包含選自由以下組成之群之IRES：蟋蟀麻痹病毒(cricket paralysis virus；CrPV) IRES、小核糖核酸病毒IRES、口蹄疫病毒IRES、卡堡氏肉瘤相關疱疹病毒IRES、A型肝炎IRES、C型肝炎IRES、瘟病毒IRES、蟋蟀麻痹病毒(Cripavirus) IRES、禾谷縊管蚜病毒IRES及梅雷克氏病病毒IRES。在一些實施例中，IRES為蟋蟀麻痹病毒(CrPV) IRES。在一些實施例中，IRES包含與SEQ ID NO: 12至少90%一致之核酸序列。在一些實施例中，IRES包含SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含轉譯起始序列。在一些實施例中，轉譯起始序列包含Kozak序列，該Kozak序列包含序列AX1 X2 ATGA (SEQ ID NO: 28)，其中X1 及X2 中之每一者為任何核苷酸。在一些實施例中，X1 包含A。在一些實施例中，X2 包含G。在一些實施例中，Kozak序列包含與AAGATGA (SEQ ID NO: 29)至少90%一致之核酸序列。在一些實施例中，Kozak序列包含AAGATGA (SEQ ID NO: 29)。在一些實施例中，Kozak序列包含與GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)至少85%一致之核酸序列。在一些實施例中，Kozak序列與GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)之序列相差一個或兩個核苷酸。在一些實施例中，Kozak序列包含GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含編碼信號肽之信號核酸序列，該信號肽能夠相較於無信號肽之治療蛋白增加治療蛋白之分泌。在一些實施例中，信號肽係選自結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽及Gaussia信號肽。在一些實施例中，BiP信號肽包含與選自由SEQ ID NO: 13-17組成之群之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，BiP信號肽包含選自由SEQ ID NO: 13-17組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，Gaussia信號肽包含與SEQ ID NO: 32至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，Gaussia信號肽包含SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含編碼以高親和力與CI-MPR結合之肽的核酸序列。在一些實施例中，以高親和力與CI-MPR結合之肽為IGF2肽。在一些實施例中，IGF2肽為包含與選自由SEQ ID NO: 1-11組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列的vIGF2肽。在一些實施例中，IGF2肽為包含選自由SEQ ID NO: 1-11組成之群之胺基酸序列的vIGF2肽。在一些實施例中，vIGF2核苷酸序列在編碼治療蛋白之核酸序列的5'。在一些實施例中，vIGF2核苷酸序列在編碼治療蛋白之核酸序列的3'。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含在該vIGF2核苷酸序列與編碼治療蛋白之該核酸序列之間的編碼連接肽的連接子序列。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接肽包含與SEQ ID NO: 18-21或SEQ ID NO: 33至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，連接肽包含SEQ ID NO: 18-21或SEQ ID NO: 33。在一些實施例中，治療蛋白與溶酶體貯積病相關聯。在一些實施例中，治療蛋白係選自由以下組成之群：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白為α-半乳糖苷酶。在一些實施例中，酶為軟脂醯基蛋白質硫酯酶(PPT)，包括軟脂醯基蛋白質硫酯酶1及2 (分別地，PPT1及PPT2)。在一些實施例中，酶為軟脂醯基蛋白質硫酯酶1。在一些實施例中，治療蛋白與選自由以下組成之群之遺傳病症相關聯：CDKL5缺乏症、囊腫性纖維化、α-地中海型貧血及β-地中海型貧血、鐮狀細胞貧血、馬凡氏症候群(Marfan syndrome)、X脆折症候群、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、血色沉著病、先天性耳聾(非綜合型)、塔伊-薩克斯病(Tay-Sachs)、家族性高膽固醇血症、杜興氏肌肉失養症(Duchenne muscular dystrophy)、斯特格氏病(Stargardt disease)、尤塞氏症候群(Usher syndrome)、無脈絡膜症、色盲、X性聯視網膜劈裂症、血友病、韋-奧氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、X性聯慢性肉芽腫病、芳族L-胺基酸去羧酶缺乏症、隱性營養不良大皰性表皮鬆懈、α1抗胰蛋白酶缺乏症、哈-吉氏早老症症候群(Hutchinson-Gilford progeria syndrome；HGPS)、努南氏症候群(Noonan syndrome)、X性聯嚴重合併性免疫缺失(X-SCID)。在一些實施例中，治療蛋白係選自由以下組成之群：CDKL5、連接蛋白26、己糖苷酶A、LDL受體、肌縮蛋白、CFTR、β-球蛋白、HFE、亨廷頓氏、ABCA4、肌凝蛋白VIIA (MYO7A)、Rab護航蛋白-1 (REP1)、環狀核苷酸閘控通道β3 (CNGB3)、視網膜劈裂素1 (RS1)、血紅素次單元β (HBB)、因子IX、WAS、細胞色素B-245 β鏈、多巴去羧酶(DDC)、VII型膠原蛋白α1鏈(COL7A1)、絲胺酸蛋白酶抑因子家族A成員1 (SERPINA1)、LMNA、PTPN11、SOS1、RAF1、KRAS及IL2受體γ基因。在一些實施例中，治療蛋白能夠置換患有遺傳病症中之個體中與該遺傳病症相關之缺陷或缺乏蛋白質。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病胱胺酸症、法布立病(Fabry disease)、I型戈謝病(Gaucher disease type I)、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病(Pompe disease)、泰-薩克斯病(Tay Sachs disease)、桑多霍夫病(Sandhoff disease)、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病(Hurler disease)、亨特病(Hunter disease)、A型聖菲利波病(Sanfilippo disease type A)、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病(Morquio disease type A)、B型莫奎病、馬羅托-拉米病(Maroteau-Lamy disease)、斯利病(Sly disease)、A型尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease type A)、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病(Schindler disease type I)及II型辛德勒病。在一些實施例中，溶酶體貯積病係選自由以下組成之群：活化因子缺乏症、GM2-神經節苷脂貯積病；GM2-神經節苷脂貯積病、AB變型；α-甘露糖苷貯積病(2型，中度形式；3型，新生兒，重度)；β-甘露糖苷貯積病；溶酶體酸性脂肪酶缺乏症；胱胺酸症(晚發作幼年型或青年腎病類型；幼稚型腎病)；錢林-朵爾夫曼症候群；伴隨肌病之中性脂貯積病；NLSDM；達農病(Danon disease)；法布立病；晚期發作II型法布立病；法伯病(Farber disease)；法伯脂肪肉芽腫病；岩藻糖苷貯積症；半乳糖唾液酸貯積症(合併神經胺糖酸苷酶及β-半乳糖苷酶缺乏症)；戈謝病；II型戈謝病；III型戈謝病；IIIC型戈謝病；因鞘脂激活蛋白C缺乏所致之非典型戈謝病；GM1-神經節苷脂貯積病(晚幼稚型/幼年型GM1-神經節苷脂貯積病；成人/慢性GM1-神經節苷脂貯積病)；球狀細胞腦白質營養不良、克拉培病(Krabbe disease) (晚幼稚型發作；幼年型發作；成年發作型)；因鞘脂激活蛋白A缺乏所致之非典型克拉培病；異染性腦白質營養不良(幼年型；成人)；部分硫酸腦甘脂缺乏症；假芳基硫酸酯酶A缺乏症；因鞘脂激活蛋白B缺乏所致之異染性腦白質營養不良；黏多醣貯積症：MPS I、賀勒侯症群；MPS I、賀勒-沙伊侯症群；MPS I、沙伊侯症群；MPS II、亨特症候群；MPS II、亨特症候群；A型聖菲利波症候群/MPS IIIA；B型聖菲利波症候群/MPS IIIB；C型聖菲利波症候群/MPS IIIC；D型聖菲利波症候群/MPS IIID；莫奎症候群、A型/MPS IVA；莫奎症候群、B型/MPS IVB；MPS IX玻尿酸酶缺乏症；MPS VI馬洛特-拉米症候群；MPS VII斯利症候群；黏脂貯積症I、II型唾液腺病；I-細胞病、勒羅伊病、黏脂貯積症II；假賀勒多營養不良/III型黏脂貯積症；黏脂貯積症IIIC/ML III GAMMA；IV型黏脂貯積症；多硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克病(B型；C1型/慢性神經疾病形式；C2型；D型/諾瓦司考田)；神經元蠟樣質褐質病：CLN6病，非典型晚期幼稚型、晚發作變型、早幼年型；貝敦氏-家族黑蒙性白癡(Spielmeyer-Vogt)/幼年型NCL/CLN3病；芬蘭變型晚幼稚型CLN5；詹斯基-比爾朔夫斯基病(Jansky-Bielschowsky disease)/晚幼稚型CLN2/TPP1病；Kufs/成年發作型NCL/CLN4病(B型)；北方癲癇症/變型晚幼稚型CLN8；桑塔沃里-哈爾蒂亞(Santavuori-Haltia)/幼稚型CLN1/PPT病；龐培氏病(II型肝糖貯積病)；晚發作型龐培氏病；密骨發育障礙；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；辛德勒病(III型/中度，可變)；神琦病(Kanzaki disease)；薩拉病(Salla disease)；幼稚型無唾液酸貯積病(ISSD)；伴隨進展性肌痙攣癲癇症之脊髓性肌萎縮(SMAPME)；泰-薩克斯病/GM2神經節苷脂貯積病；幼發型泰-薩克斯病；晚發作型泰-薩克斯病；克里斯蒂安症候群(Christianson syndrome)；洛氏眼-腦-腎症候群；4J型恰克-馬利-杜斯病(Charcot-Marie-Tooth) CMT4J；尤里斯-凡倫症候群(Yunis-Varon syndrome)；雙側顳枕多小腦回(bilateral temporooccipital polymicrogyria；BTOP)；X性聯高鈣性腎石病，登特-1；及登特病2、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)及神經元蠟樣質脂褐質沈積症。在一些實施例中，遺傳病症為龐培氏病。在一些實施例中，遺傳病症為神經元蠟樣質脂褐質沈積症。在一些實施例中，神經元蠟樣質脂褐質沈積症係選自由以下組成之群：幼稚型NCL (桑塔沃里-哈爾蒂亞病)、晚幼稚型NCL (詹斯基-比爾朔夫斯基病)、貝敦氏病、成人NCL (庫夫斯病(Kufs disease))、芬蘭晚幼稚型NCL、變型晚幼稚型NCL、CLN7、CLN8、土耳其晚幼稚型NCL、9型NCL及CLN10。在一些實施例中，基因治療載體為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、痘病毒載體、牛痘病毒載體、腺病毒載體或疱疹病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為AAV載體。在一些實施例中，AAV載體包含反向末端重複序列(ITR)。在一些實施例中，AAV載體係選自由以下組成之群：AAV1載體、AAV2載體、AAV3載體、AAV4載體、AAV5載體、AAV6載體、AAV7載體、AAV8載體、AAV9載體、AAVrhS載體、AAVrh10載體、AAVrh33載體、AAVrh34載體、AAVrh74載體、AAV Anc80載體、AAVPHP.B載體、AAVhu68載體及AAV-DJ載體。
在某些態樣中，提供基因治療載體，諸如包含以下之基因治療載體：(a)編碼治療蛋白之核酸序列，及(b)編碼以高親和力與CI-MPR結合之肽的核酸序列。在一些實施例中，肽為變體IGF2 (vIGF2)肽。在一些實施例中，vIGF2肽包含與SEQ ID NO: 1至少90%一致且在選自由以下組成之群之一或多個位置處具有至少一個取代的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1之位置6、26、27、43、48、49、50、54、55及65。在一些實施例中，該至少一個取代係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1之E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R及K65R。在一些實施例中，該vIGF2肽包含在選自由以下組成之群之兩個或更多個位置處之至少兩個取代：SEQ ID NO: 1之位置6、26、27、43、48、49、50、54及55。在一些實施例中，該至少兩個取代係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1之E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R及L55R。在一些實施例中，該vIGF2肽包含N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含在SEQ ID NO: 1之位置1處之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-2之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-3之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-4之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-4之N端缺失及E6R、Y27L及K65R之取代。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-4之N端缺失及E6R及Y27L之取代。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-5之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含在SEQ ID NO: 1之位置1-6處之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含在SEQ ID NO: 1之位置1-7處之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽相較於原生IGF2肽針對胰島素受體及IGF1R具有降低的親和力或無親和力。在一些實施例中，vIGF2肽能夠促進將治療蛋白吸收至細胞中之溶酶體中。在一些實施例中，治療蛋白能夠置換患有遺傳病症中之個體中與該遺傳病症相關之缺陷或缺乏蛋白質。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病及II型辛德勒病。在一些實施例中，溶酶體貯積病係選自由以下組成之群：活化因子缺乏症、GM2-神經節苷脂貯積病；GM2-神經節苷脂貯積病、AB變型；α-甘露糖苷貯積病(2型，中度形式；3型，新生兒，重度)；β-甘露糖苷貯積病；溶酶體酸性脂肪酶缺乏症；胱胺酸症(晚發作幼年型或青年腎病類型；幼稚型腎病)；錢林-朵爾夫曼症候群；伴隨肌病之中性脂貯積病；NLSDM；達農病；法布立病；晚發作型II型法布立病；法伯病；法伯脂肪肉芽腫病；岩藻糖苷貯積症；半乳糖唾液酸貯積症(合併神經胺糖酸苷酶及β-半乳糖苷酶缺乏症)；戈謝病；II型戈謝病；III型戈謝病；IIIC型戈謝病；因鞘脂激活蛋白C缺乏所致之非典型戈謝病；GM1-神經節苷脂貯積病(晚幼稚型/幼年型GM1-神經節苷脂貯積病；成人/慢性GM1-神經節苷脂貯積病)；球狀細胞腦白質營養不良、克拉培病(晚幼稚型發作；幼年型發作；成年發作型)；因鞘脂激活蛋白A缺乏所致之非典型克拉培病；異染性腦白質營養不良(幼年型；成人)；部分硫酸腦甘脂缺乏症；假芳基硫酸酯酶A缺乏症；因鞘脂激活蛋白B缺乏所致之異染性腦白質營養不良；黏多醣貯積症：MPS I、賀勒侯症群；MPS I、賀勒-沙伊侯症群；MPS I、沙伊侯症群；MPS II、亨特症候群；MPS II、亨特症候群；A型聖菲利波症候群/MPS IIIA；B型聖菲利波症候群/MPS IIIB；C型聖菲利波症候群/MPS IIIC；D型聖菲利波症候群/MPS IIID；莫奎症候群、A型/MPS IVA；莫奎症候群、B型/MPS IVB；MPS IX玻尿酸酶缺乏症；MPS VI馬洛特-拉米症候群；MPS VII斯利症候群；黏脂貯積症I、II型唾液腺病；I-細胞病、勒羅伊病、黏脂貯積症II；假賀勒多營養不良/III型黏脂貯積症；黏脂貯積症IIIC/ML III GAMMA；IV型黏脂貯積症；多硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克病(B型；C1型/慢性神經疾病形式；C2型；D型/諾瓦司考田)；神經元蠟樣質褐質病：CLN6病，非典型晚期幼稚型、晚發作變型、早幼年型；貝敦氏-家族黑蒙性白癡/幼年型NCL/CLN3病；芬蘭變型晚幼稚型CLN5；詹斯基-比爾朔夫斯基病/晚幼稚型CLN2/TPP1病；Kufs/成年發作型NCL/CLN4病(B型)；北方癲癇症/變型晚幼稚型CLN8；桑塔沃里-哈爾蒂亞/幼稚型CLN1/PPT病；龐培氏病(II型肝糖貯積病)；晚發作型龐培氏病；密骨發育障礙；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；辛德勒病(III型/中度，可變)；神琦病；薩拉病；幼稚型無唾液酸貯積病(ISSD)；伴隨進展性肌痙攣癲癇症之脊髓性肌萎縮(SMAPME)；泰-薩克斯病/GM2神經節苷脂貯積病；幼發型泰-薩克斯病；晚發作型泰-薩克斯病；克里斯蒂安症候群；洛氏眼-腦-腎症候群；4J型恰克-馬利-杜斯病CMT4J；尤里斯-凡倫症候群；雙側顳枕多小腦回(BTOP)；X性聯高鈣性腎石病，登特-1；及登特病2、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)、慢性肉芽腫病(CGD)及神經元蠟樣質脂褐質沈積症。在一些實施例中，遺傳病症為龐培氏病。在一些實施例中，遺傳病症為神經元蠟樣質脂褐質沈積症。在一些實施例中，神經元蠟樣質脂褐質沈積症係選自由以下組成之群：幼稚型NCL (桑塔沃里-哈爾蒂亞病)、晚幼稚型NCL (詹斯基-比爾朔夫斯基病)、貝敦氏病、成人NCL (庫夫斯病)、芬蘭晚幼稚型NCL、變型晚幼稚型NCL、CLN7、CLN8、土耳其晚幼稚型NCL、9型NCL及CLN10。在一些實施例中，治療蛋白為可溶性溶酶體酶。在一些實施例中，治療蛋白包含選自由以下組成之群的酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，軟脂醯基蛋白質硫酯酶為軟脂醯基蛋白質硫酯酶1 (PPT1)或2 (PPT2)。在一些實施例中，軟脂醯基蛋白質硫酯酶為軟脂醯基蛋白質硫酯酶1。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含轉譯起始序列。在一些實施例中，轉譯起始序列包含Kozak序列。在一些實施例中，Kozak序列包含序列AX1 X2 ATGA (SEQ ID NO: 28)，其中X1 及X2 中之每一者為任何核苷酸。在一些實施例中，X1 包含A。在一些實施例中，X2 包含G。在一些實施例中，Kozak序列包含與AAGATGA (SEQ ID NO: 29)至少90%一致之核酸序列。在一些實施例中，Kozak序列包含AAGATGA (SEQ ID NO: 29)。在一些實施例中，Kozak序列包含與GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)至少85%一致之核酸序列。在一些實施例中，Kozak序列與GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)之序列相差一個或兩個核苷酸。在一些實施例中，Kozak序列包含GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含編碼信號肽之核酸序列，其中信號肽能夠相較於無信號肽之治療蛋白增加治療蛋白的分泌。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含編碼信號肽之核酸序列，其中該信號肽能夠相較於具有天然信號肽之治療蛋白增加治療蛋白之分泌。在一些實施例中，核酸構築體包含編碼非天然信號肽之核酸序列，其中該非天然信號肽能夠相較於治療蛋白之原生信號肽增加治療蛋白之分泌。在一些實施例中，信號肽係選自結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽及Gaussia信號肽。在一些實施例中，BiP信號肽包含與選自由SEQ ID NO: 13-17組成之群之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，BiP信號肽包含選自由SEQ ID NO: 13-17組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽包含Gaussia信號肽。在一些實施例中，Gaussia信號肽包含與SEQ ID NO: 32至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，Gaussia信號肽包含SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，vIGF2核酸序列在編碼治療蛋白之核酸序列的5'。在一些實施例中，vIGF2核酸序列在編碼治療蛋白之核酸序列的3'。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含在該vIGF2核苷酸序列與編碼治療蛋白之該核酸序列之間的編碼連接肽的連接子序列。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接肽包含SEQ ID NO: 18-21或SEQ ID NO: 33。在一些實施例中，基因治療載體為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體或疱疹病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為AAV載體。在一些實施例中，AAV載體包含反向末端重複序列(ITR)。在一些實施例中，AAV載體係選自由以下組成之群：AAV1載體、AAV2載體、AAV3載體、AAV4載體、AAV5載體、AAV6載體、AAV7載體、AAV8載體、AAV9載體、AAVrhS載體、AAVrh10載體、AAVrh33載體、AAVrh34載體、AAVrh74載體、AAV Anc80載體、AAVPHP.B載體、AAVhu68載體及AAV-DJ載體。
一種基因治療載體，其包含核酸構築體，該核酸構築體包含：(a)編碼治療蛋白之核酸序列，及(b)編碼增加治療蛋白之內吞作用之肽的核酸序列。在一些實施例中，增加該治療蛋白之內吞作用之該肽為與CI-MPR結合的肽。在一些實施例中，肽為變體IGF2 (vIGF2)肽、HIRMab或TfRMab或其他細胞靶向肽或蛋白質。在一些實施例中，肽為vIGF2。在一些實施例中，vIGF2肽包含與SEQ ID NO: 1至少90%一致且在選自由以下組成之群之一或多個位置處具有至少一個取代的胺基酸序列：SEQ ID NO: 1之位置6、26、27、43、48、49、50、54、55及65。在一些實施例中，該至少一個取代係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1之E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R及K65R。在一些實施例中，該至少一個取代係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1之E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R及L55R。在一些實施例中，該vIGF2肽包含在選自由以下組成之群之兩個或更多個位置處之至少兩個取代：SEQ ID NO: 1之位置6、26、27、43、48、49、50、54及55。在一些實施例中，該至少兩個取代係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1之E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R及L55R。在一些實施例中，該vIGF2肽包含N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含在SEQ ID NO: 1之位置1處之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含在SEQ ID NO: 1之位置1-6處之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-2之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-3之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-4之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-4之N端缺失及E6R、Y27L及K65R之取代。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-4之N端缺失及E6R及Y27L之取代。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-5之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含SEQ ID NO: 1之位置1-6之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽包含在SEQ ID NO: 1之位置1-7處之N端缺失。在一些實施例中，該vIGF2肽相較於原生IGF2肽針對陽離子非依賴性M6P受體(CI-MPR)具有增加的特異性。在一些實施例中，vIGF2肽能夠促進將治療蛋白吸收至細胞中之溶酶體中。在一些實施例中，治療蛋白能夠置換患有遺傳病症中之個體中與該遺傳病症相關之缺陷或缺乏蛋白質。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病及II型辛德勒病。在一些實施例中，溶酶體貯積病係選自由以下組成之群：活化因子缺乏症、GM2-神經節苷脂貯積病；GM2-神經節苷脂貯積病、AB變型；α-甘露糖苷貯積病(2型，中度形式；3型，新生兒，重度)；β-甘露糖苷貯積病；溶酶體酸性脂肪酶缺乏症；胱胺酸症(晚發作幼年型或青年腎病類型；幼稚型腎病)；錢林-朵爾夫曼症候群；伴隨肌病之中性脂貯積病；NLSDM；達農病；法布立病；晚發作型II型法布立病；法伯病；法伯脂肪肉芽腫病；岩藻糖苷貯積症；半乳糖唾液酸貯積症(合併神經胺糖酸苷酶及β-半乳糖苷酶缺乏症)；戈謝病；II型戈謝病；III型戈謝病；IIIC型戈謝病；因鞘脂激活蛋白C缺乏所致之非典型戈謝病；GM1-神經節苷脂貯積病(晚幼稚型/幼年型GM1-神經節苷脂貯積病；成人/慢性GM1-神經節苷脂貯積病)；球狀細胞腦白質營養不良、克拉培病(晚幼稚型發作；幼年型發作；成年發作型)；因鞘脂激活蛋白A缺乏所致之非典型克拉培病；異染性腦白質營養不良(幼年型；成人)；部分硫酸腦甘脂缺乏症；假芳基硫酸酯酶A缺乏症；因鞘脂激活蛋白B缺乏所致之異染性腦白質營養不良；黏多醣貯積症：MPS I、賀勒侯症群；MPS I、賀勒-沙伊侯症群；MPS I、沙伊侯症群；MPS II、亨特症候群；MPS II、亨特症候群；A型聖菲利波症候群/MPS IIIA；B型聖菲利波症候群/MPS IIIB；C型聖菲利波症候群/MPS IIIC；D型聖菲利波症候群/MPS IIID；莫奎症候群、A型/MPS IVA；莫奎症候群、B型/MPS IVB；MPS IX玻尿酸酶缺乏症；MPS VI馬洛特-拉米症候群；MPS VII斯利症候群；黏脂貯積症I、II型唾液腺病；I-細胞病、勒羅伊病、黏脂貯積症II；假賀勒多營養不良/III型黏脂貯積症；黏脂貯積症IIIC/ML III GAMMA；IV型黏脂貯積症；多硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克病(B型；C1型/慢性神經疾病形式；C2型；D型/諾瓦司考田)；神經元蠟樣質褐質病：CLN6病，非典型晚期幼稚型、晚發作變型、早幼年型；貝敦氏-家族黑蒙性白癡/幼年型NCL/CLN3病；芬蘭變型晚幼稚型CLN5；詹斯基-比爾朔夫斯基病/晚幼稚型CLN2/TPP1病；Kufs/成年發作型NCL/CLN4病(B型)；北方癲癇症/變型晚幼稚型CLN8；桑塔沃里-哈爾蒂亞/幼稚型CLN1/PPT病；龐培氏病(II型肝糖貯積病)；晚發作型龐培氏病；密骨發育障礙；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；辛德勒病(III型/中度，可變)；神琦病；薩拉病；幼稚型無唾液酸貯積病(ISSD)；伴隨進展性肌痙攣癲癇症之脊髓性肌萎縮(SMAPME)；泰-薩克斯病/GM2神經節苷脂貯積病；幼發型泰-薩克斯病；晚發作型泰-薩克斯病；克里斯蒂安症候群；洛氏眼-腦-腎症候群；4J型恰克-馬利-杜斯病CMT4J；尤里斯-凡倫症候群；雙側顳枕多小腦回(BTOP)；X性聯高鈣性腎石病，登特-1；及登特病2、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)、慢性肉芽腫病(CGD)及神經元蠟樣質脂褐質沈積症。在一些實施例中，遺傳病症為龐培氏病。在一些實施例中，遺傳病症為神經元蠟樣質脂褐質沈積症。在一些實施例中，神經元蠟樣質脂褐質沈積症係選自由以下組成之群：幼稚型NCL (桑塔沃里-哈爾蒂亞病)、晚幼稚型NCL (詹斯基-比爾朔夫斯基病)、貝敦氏病、成人NCL (庫夫斯病)、芬蘭晚幼稚型NCL、變型晚幼稚型NCL、CLN7、CLN8、土耳其晚幼稚型NCL、9型NCL及CLN10。在一些實施例中，治療蛋白為可溶性溶酶體酶。在一些實施例中，治療蛋白包含選自由以下組成之群的酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，軟脂醯基蛋白質硫酯酶為軟脂醯基蛋白質硫酯酶1 (PPT1)或2 (PPT2)。在一些實施例中，軟脂醯基蛋白質硫酯酶為軟脂醯基蛋白質硫酯酶1。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含轉譯起始序列。在一些實施例中，轉譯起始序列包含Kozak序列。在一些實施例中，Kozak序列包含序列AX1 X2 ATGA (SEQ ID NO: 28)，其中X1 及X2 中之每一者為任何核苷酸。在一些實施例中，X1 包含A。在一些實施例中，X2 包含G。在一些實施例中，Kozak序列包含與AAGATGA (SEQ ID NO: 29)至少90%一致之核酸序列。在一些實施例中，Kozak序列包含AAGATGA (SEQ ID NO: 29)。在一些實施例中，Kozak序列包含與GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)至少85%一致之核酸序列。在一些實施例中，Kozak序列與GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)之序列相差一個或兩個核苷酸。在一些實施例中，Kozak序列包含GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含編碼信號肽之信號核酸序列，其中信號肽能夠相較於無信號肽之治療蛋白增加治療蛋白的分泌。在一些實施例中，信號肽係選自結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽及Gaussia信號肽。在一些實施例中，BiP信號肽包含與選自由SEQ ID NO: 13-17組成之群之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，BiP信號肽包含選自由SEQ ID NO: 13-17組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽包含Gaussia信號肽。在一些實施例中，Gaussia信號肽包含與SEQ ID NO: 32至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，Gaussia信號肽包含SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，vIGF2核酸序列在編碼治療蛋白之核酸序列的5'。在一些實施例中，vIGF2核酸序列在編碼治療蛋白之核酸序列的3'。在一些實施例中，核酸構築體進一步包含在該vIGF2核苷酸序列與編碼治療蛋白之該核酸序列之間的編碼連接肽的連接子序列。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接肽包含SEQ ID NO: 18-21或SEQ ID NO: 33。在一些實施例中，基因治療載體為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體或疱疹病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為AAV載體。在一些實施例中，AAV載體包含反向末端重複序列(ITR)。在一些實施例中，AAV載體係選自由以下組成之群：AAV1載體、AAV2載體、AAV3載體、AAV4載體、AAV5載體、AAV6載體、AAV7載體、AAV8載體、AAV9載體、AAVrhS載體、AAVrh10載體、AAVrh33載體、AAVrh34載體、AAVrh74載體、AAV Anc80載體、AAVPHP.B載體、AAVhu68載體及AAV-DJ載體。
在額外態樣中，提供一種醫藥組合物，其包含(i)治療有效量之本文中之任一基因治療載體，及(ii)醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，載劑或賦形劑包含非離子性低滲透化合物、緩衝劑、聚合物、鹽或其組合。
在其他態樣中，提供用於治療遺傳病症之方法，其包含向有需要之個體投與本文提供之任一基因治療載體或本文提供之任一醫藥組合物。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病及II型辛德勒病。在一些實施例中，溶酶體貯積病係選自由以下組成之群：活化因子缺乏症、GM2-神經節苷脂貯積病；GM2-神經節苷脂貯積病、AB變型；α-甘露糖苷貯積病(2型，中度形式；3型，新生兒，重度)；β-甘露糖苷貯積病；溶酶體酸性脂肪酶缺乏症；胱胺酸症(晚發作幼年型或青年腎病類型；幼稚型腎病)；錢林-朵爾夫曼症候群；伴隨肌病之中性脂貯積病；NLSDM；達農病；法布立病；晚發作型II型法布立病；法伯病；法伯脂肪肉芽腫病；岩藻糖苷貯積症；半乳糖唾液酸貯積症(合併神經胺糖酸苷酶及β-半乳糖苷酶缺乏症)；戈謝病；II型戈謝病；III型戈謝病；IIIC型戈謝病；因鞘脂激活蛋白C缺乏所致之非典型戈謝病；GM1-神經節苷脂貯積病(晚幼稚型/幼年型GM1-神經節苷脂貯積病；成人/慢性GM1-神經節苷脂貯積病)；球狀細胞腦白質營養不良、克拉培病(晚幼稚型發作；幼年型發作；成年發作型)；因鞘脂激活蛋白A缺乏所致之非典型克拉培病；異染性腦白質營養不良(幼年型；成人)；部分硫酸腦甘脂缺乏症；假芳基硫酸酯酶A缺乏症；因鞘脂激活蛋白B缺乏所致之異染性腦白質營養不良；黏多醣貯積症：MPS I、賀勒侯症群；MPS I、賀勒-沙伊侯症群；MPS I、沙伊侯症群；MPS II、亨特症候群；MPS II、亨特症候群；A型聖菲利波症候群/MPS IIIA；B型聖菲利波症候群/MPS IIIB；C型聖菲利波症候群/MPS IIIC；D型聖菲利波症候群/MPS IIID；莫奎症候群、A型/MPS IVA；莫奎症候群、B型/MPS IVB；MPS IX玻尿酸酶缺乏症；MPS VI馬洛特-拉米症候群；MPS VII斯利症候群；黏脂貯積症I、II型唾液腺病；I-細胞病、勒羅伊病、黏脂貯積症II；假賀勒多營養不良/III型黏脂貯積症；黏脂貯積症IIIC/ML III GAMMA；IV型黏脂貯積症；多硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克病(B型；C1型/慢性神經疾病形式；C2型；D型/諾瓦司考田)；神經元蠟樣質褐質病：CLN6病，非典型晚期幼稚型、晚發作變型、早幼年型；貝敦氏-家族黑蒙性白癡/幼年型NCL/CLN3病；芬蘭變型晚幼稚型CLN5；詹斯基-比爾朔夫斯基病/晚幼稚型CLN2/TPP1病；Kufs/成年發作型NCL/CLN4病(B型)；北方癲癇症/變型晚幼稚型CLN8；桑塔沃里-哈爾蒂亞/幼稚型CLN1/PPT病；龐培氏病(II型肝糖貯積病)；晚發作型龐培氏病；密骨發育障礙；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；辛德勒病(III型/中度，可變)；神琦病；薩拉病；幼稚型無唾液酸貯積病(ISSD)；伴隨進展性肌痙攣癲癇症之脊髓性肌萎縮(SMAPME)；泰-薩克斯病/GM2神經節苷脂貯積病；幼發型泰-薩克斯病；晚發作型泰-薩克斯病；克里斯蒂安症候群；洛氏眼-腦-腎症候群；4J型恰克-馬利-杜斯病CMT4J；尤里斯-凡倫症候群；雙側顳枕多小腦回(BTOP)；X性聯高鈣性腎石病、登特-1；及登特病2、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)、慢性肉芽腫病(CGD)、CDKL5缺乏症及神經元蠟樣質脂褐質沈積症。在一些實施例中，遺傳病症為龐培氏病。在一些實施例中，遺傳病症為神經元蠟樣質脂褐質沈積症。在一些實施例中，神經元蠟樣質脂褐質沈積症係選自由以下組成之群：幼稚型NCL (桑塔沃里-哈爾蒂亞病)、晚幼稚型NCL (詹斯基-比爾朔夫斯基病)、貝敦氏病、成人NCL (庫夫斯病)、芬蘭晚幼稚型NCL、變型晚幼稚型NCL、CLN7、CLN8、土耳其晚幼稚型NCL、9型NCL及CLN10。在一些實施例中，投與係以鞘內、眼內、玻璃體內、視網膜內、靜脈內、肌肉內、心室內、顱內、小腦內、腦室內、腦實質內、經眼、皮下或其組合方式進行。在一些實施例中，投與係以鞘內方式進行。在一些實施例中，投與係以眼內、玻璃體內或視網膜內方式進行。
在額外態樣中，提供醫藥組合物，其包含本文中之基因治療載體及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑以用於治療遺傳病症。在其他態樣中，提供醫藥組合物，其包含本文中之任一基因治療載體及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑以用於製備用於治療遺傳病症的藥物。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病及II型辛德勒病。在一些實施例中，溶酶體貯積病係選自由以下組成之群：活化因子缺乏症、GM2-神經節苷脂貯積病；GM2-神經節苷脂貯積病、AB變型；α-甘露糖苷貯積病(2型，中度形式；3型，新生兒，重度)；β-甘露糖苷貯積病；溶酶體酸性脂肪酶缺乏症；胱胺酸症(晚發作幼年型或青年腎病類型；幼稚型腎病)；錢林-朵爾夫曼症候群；伴隨肌病之中性脂貯積病；NLSDM；達農病；法布立病；晚發作型II型法布立病；法伯病；法伯脂肪肉芽腫病；岩藻糖苷貯積症；半乳糖唾液酸貯積症(合併神經胺糖酸苷酶及β-半乳糖苷酶缺乏症)；戈謝病；II型戈謝病；III型戈謝病；IIIC型戈謝病；因鞘脂激活蛋白C缺乏所致之非典型戈謝病；GM1-神經節苷脂貯積病(晚幼稚型/幼年型GM1-神經節苷脂貯積病；成人/慢性GM1-神經節苷脂貯積病)；球狀細胞腦白質營養不良、克拉培病(晚幼稚型發作；幼年型發作；成年發作型)；因鞘脂激活蛋白A缺乏所致之非典型克拉培病；異染性腦白質營養不良(幼年型；成人)；部分硫酸腦甘脂缺乏症；假芳基硫酸酯酶A缺乏症；因鞘脂激活蛋白B缺乏所致之異染性腦白質營養不良；黏多醣貯積症：MPS I、賀勒侯症群；MPS I、賀勒-沙伊侯症群；MPS I、沙伊侯症群；MPS II、亨特症候群；MPS II、亨特症候群；A型聖菲利波症候群/MPS IIIA；B型聖菲利波症候群/MPS IIIB；C型聖菲利波症候群/MPS IIIC；D型聖菲利波症候群/MPS IIID；莫奎症候群、A型/MPS IVA；莫奎症候群、B型/MPS IVB；MPS IX玻尿酸酶缺乏症；MPS VI馬洛特-拉米症候群；MPS VII斯利症候群；黏脂貯積症I、II型唾液腺病；I-細胞病、勒羅伊病、黏脂貯積症II；假賀勒多營養不良/III型黏脂貯積症；黏脂貯積症IIIC/ML III GAMMA；IV型黏脂貯積症；多硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克病(B型；C1型/慢性神經疾病形式；C2型；D型/諾瓦司考田)；神經元蠟樣質褐質病：CLN6病，非典型晚期幼稚型、晚發作變型、早幼年型；貝敦氏-家族黑蒙性白癡/幼年型NCL/CLN3病；芬蘭變型晚幼稚型CLN5；詹斯基-比爾朔夫斯基病/晚幼稚型CLN2/TPP1病；Kufs/成年發作型NCL/CLN4病(B型)；北方癲癇症/變型晚幼稚型CLN8；桑塔沃里-哈爾蒂亞/幼稚型CLN1/PPT病；龐培氏病(II型肝糖貯積病)；晚發作型龐培氏病；密骨發育障礙；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；辛德勒病(III型/中度，可變)；神琦病；薩拉病；幼稚型無唾液酸貯積病(ISSD)；伴隨進展性肌痙攣癲癇症之脊髓性肌萎縮(SMAPME)；泰-薩克斯病/GM2神經節苷脂貯積病；幼發型泰-薩克斯病；晚發作型泰-薩克斯病；克里斯蒂安症候群；洛氏眼-腦-腎症候群；4J型恰克-馬利-杜斯病(CMT4J；尤里斯-凡倫症候群；雙側顳枕多小腦回(BTOP)；X性聯高鈣性腎石病、登特-1；及登特病2、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)、慢性肉芽腫病(CGD)、CDKL5缺乏症及神經元蠟樣質脂褐質沈積症。在一些實施例中，遺傳病症為龐培氏病。在一些實施例中，遺傳病症為神經元蠟樣質脂褐質沈積症。在一些實施例中，神經元蠟樣質脂褐質沈積症係選自由以下組成之群：幼稚型NCL (桑塔沃里-哈爾蒂亞病)、晚幼稚型NCL (詹斯基-比爾朔夫斯基病)、貝敦氏病、成人NCL (庫夫斯病)、芬蘭晚幼稚型NCL、變型晚幼稚型NCL、CLN7、CLN8、土耳其晚幼稚型NCL、9型NCL及CLN10。在一些實施例中，組合物經調配用於鞘內、眼內、玻璃體內、視網膜內、靜脈內、肌肉內、心室內、顱內、小腦內、經眼或皮下投與。在一些實施例中，組合物經調配用於鞘內投與。在一些實施例中，組合物經調配用於鞘內投與以用於治療神經退化性病症。在一些實施例中，組合物經調配用於經眼、玻璃體內或視網膜內投與。
在某些態樣中，提供融合蛋白，諸如包含變體IGF2肽及治療蛋白之融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白由包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)之核酸編碼。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，融合蛋白由包含Kozak序列之核酸編碼。
在額外態樣中，提供融合蛋白，其包含信號肽及治療蛋白，其中該信號肽在轉譯之後在自細胞分泌時移除。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，融合蛋白由包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)之核酸編碼。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，融合蛋白由包含Kozak序列之核酸編碼。
在其他態樣中，提供編碼融合蛋白之核酸序列，該融合蛋白包含治療蛋白，其中融合蛋白由包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)之核酸編碼。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，融合蛋白由包含Kozak序列之核酸編碼。
在額外態樣中，提供包含治療蛋白之融合蛋白，其中該融合蛋白由包含Kozak序列之核酸編碼。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，融合蛋白由包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)之核酸編碼。
在額外態樣中，提供編碼融合蛋白之核酸，諸如編碼包含變體IGF2肽及治療蛋白之融合蛋白的核酸。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸包含於病毒載體內。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。
在其他態樣中，提供編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含信號肽及治療蛋白。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。
在額外態樣中，提供編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含治療蛋白，其中該核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。
在其他態樣中，提供編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含治療蛋白，其中該核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。
在額外態樣中，提供組合物，其包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含變體IGF2肽及治療蛋白；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸包含於病毒載體內。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含脂質體、奈米粒子或細胞穿透肽。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含病毒外殼蛋白。在一些實施例中，病毒外殼蛋白係選自由以下組成之群：水泡性口炎病毒外殼蛋白、腺病毒外殼蛋白、腺相關病毒外殼蛋白、鼠類白血病病毒外殼蛋白、HIV外殼蛋白及流感病毒外殼蛋白。
在額外態樣中，提供組合物，其包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含信號肽及治療蛋白；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含脂質體、奈米粒子或細胞穿透肽。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含病毒外殼蛋白。在一些實施例中，病毒外殼蛋白係選自由以下組成之群：水泡性口炎病毒外殼蛋白、腺病毒外殼蛋白、腺相關病毒外殼蛋白、鼠類白血病病毒外殼蛋白、HIV外殼蛋白及流感病毒外殼蛋白。
在其他態樣中，提供組合物，其包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該包含治療蛋白；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑，其中該核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含脂質體、奈米粒子或細胞穿透肽。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含病毒外殼蛋白。在一些實施例中，病毒外殼蛋白係選自由以下組成之群：水泡性口炎病毒外殼蛋白、腺病毒外殼蛋白、腺相關病毒外殼蛋白、鼠類白血病病毒外殼蛋白、HIV外殼蛋白及流感病毒外殼蛋白。
在其他態樣中，提供組合物，其包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含治療蛋白；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑，其中該核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含脂質體、奈米粒子或細胞穿透肽。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含病毒外殼蛋白。在一些實施例中，病毒外殼蛋白係選自由以下組成之群：水泡性口炎病毒外殼蛋白、腺病毒外殼蛋白、腺相關病毒外殼蛋白、鼠類白血病病毒外殼蛋白、HIV外殼蛋白及流感病毒外殼蛋白。
在額外態樣中，提供治療個體之遺傳病症之方法，其包含投與組合物，該組合物包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含變體IGF2肽及治療蛋白；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含脂質體、奈米粒子或細胞穿透肽。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含病毒外殼蛋白。在一些實施例中，病毒外殼蛋白係選自由以下組成之群：水泡性口炎病毒外殼蛋白、腺病毒外殼蛋白、腺相關病毒外殼蛋白、鼠類白血病病毒外殼蛋白、HIV外殼蛋白及流感病毒外殼蛋白。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病、胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)及慢性肉芽腫病(CGD)。在一些實施例中，以離體方式處理來自個體之細胞，且在離體處理之後向該個體投與該等細胞。
在額外態樣中，提供治療個體之遺傳病症之方法，其包含投與組合物，該組合物包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含信號肽及治療蛋白；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含脂質體、奈米粒子或細胞穿透肽。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含病毒外殼蛋白。在一些實施例中，病毒外殼蛋白係選自由以下組成之群：水泡性口炎病毒外殼蛋白、腺病毒外殼蛋白、腺相關病毒外殼蛋白、鼠類白血病病毒外殼蛋白、HIV外殼蛋白及流感病毒外殼蛋白。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病、胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)及慢性肉芽腫病(CGD)。在一些實施例中，離體處理來自個體之細胞，且在離體處理之後向該個體投與該等細胞。
在其他態樣中，提供治療個體之遺傳病症之方法，其包含投與組合物，該組合物包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含治療蛋白；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑，其中該核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含脂質體、奈米粒子或細胞穿透肽。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含病毒外殼蛋白。在一些實施例中，病毒外殼蛋白係選自由以下組成之群：水泡性口炎病毒外殼蛋白、腺病毒外殼蛋白、腺相關病毒外殼蛋白、鼠類白血病病毒外殼蛋白、HIV外殼蛋白及流感病毒外殼蛋白。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病、胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)及慢性肉芽腫病(CGD)。在一些實施例中，離體處理來自個體之細胞，且在離體處理之後向該個體投與該等細胞。
在額外態樣中，提供治療個體之遺傳病症之方法，其包含投與組合物，該組合物包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含治療蛋白；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑，其中該核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含脂質體、奈米粒子或細胞穿透肽。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含病毒外殼蛋白。在一些實施例中，病毒外殼蛋白係選自由以下組成之群：水泡性口炎病毒外殼蛋白、腺病毒外殼蛋白、腺相關病毒外殼蛋白、鼠類白血病病毒外殼蛋白、HIV外殼蛋白及流感病毒外殼蛋白。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病、胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)及慢性肉芽腫病(CGD)。在一些實施例中，離體處理來自個體之細胞，且在離體處理之後向該個體投與該等細胞。
在其他態樣中，提供治療個體之遺傳病症之方法，其包含投與表現編碼融合蛋白之核酸之細胞，該融合蛋白包含變體IGF2肽及治療蛋白。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含脂質體、奈米粒子或細胞穿透肽。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含病毒外殼蛋白。在一些實施例中，病毒外殼蛋白係選自由以下組成之群：水泡性口炎病毒外殼蛋白、腺病毒外殼蛋白、腺相關病毒外殼蛋白、鼠類白血病病毒外殼蛋白、HIV外殼蛋白及流感病毒外殼蛋白。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病、胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)及慢性肉芽腫病(CGD)。在一些實施例中，細胞來源於個體。
在額外態樣中提供治療個體之遺傳病症之方法，其包含投與表現編碼融合蛋白之核酸之細胞，該融合蛋白包含信號肽及治療蛋白。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含脂質體、奈米粒子或細胞穿透肽。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含病毒外殼蛋白。在一些實施例中，病毒外殼蛋白係選自由以下組成之群：水泡性口炎病毒外殼蛋白、腺病毒外殼蛋白、腺相關病毒外殼蛋白、鼠類白血病病毒外殼蛋白、HIV外殼蛋白及流感病毒外殼蛋白。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病、胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)及慢性肉芽腫病(CGD)。在一些實施例中，細胞來源於個體。
在額外態樣中，提供治療個體之遺傳病症之方法，其包含投與表現編碼融合蛋白之核酸之細胞，該融合蛋白包含治療蛋白，其中該核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含脂質體、奈米粒子或細胞穿透肽。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含病毒外殼蛋白。在一些實施例中，病毒外殼蛋白係選自由以下組成之群：水泡性口炎病毒外殼蛋白、腺病毒外殼蛋白、腺相關病毒外殼蛋白、鼠類白血病病毒外殼蛋白、HIV外殼蛋白及流感病毒外殼蛋白。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病、胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)及慢性肉芽腫病(CGD)。在一些實施例中，細胞來源於個體。
在其他態樣中，提供治療個體之遺傳病症之方法，其包含投與表現編碼融合蛋白之核酸之細胞，該融合蛋白包含治療蛋白，其中該核酸進一步包含Kozak序列。在一些實施例中，核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含連接子。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。在一些實施例中，連接子包含GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)、GGGGS (SEQ ID NO: 19)、GGGSGGGGS (SEQ ID NO: 20)、GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 21)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 37，在本文中亦被稱作「2GS」)或GGSGSGSTS (SEQ ID NO: 33)之胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含信號肽。在一些實施例中，信號肽包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含變體IGF2肽。在一些實施例中，治療蛋白包含由以下組成之群的至少一種酶：α-半乳糖苷酶(A或B)、β-半乳糖苷酶、β-己糖苷酶(A或B)、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶(A或B)、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、溶酶體酶酸性神經磷脂酶、甲醯基甘胺酸生成酶、艾杜糖醛酸酶(例如，α-L)、乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷N-乙醯基轉移酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶、玻尿酸酶、α-N-乙醯基神經胺糖酸苷酶(唾液酸酶)、神經節苷脂唾液酸酶、磷酸轉移酶、α-葡糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-L-海藻糖苷酶、battenin、軟脂醯基蛋白質硫酯酶及其他貝敦氏相關蛋白(例如，蠟樣質-脂褐質沈積症神經元蛋白6)。在一些實施例中，治療蛋白包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，核酸進一步包含啟動子。在一些實施例中，核酸進一步包含病毒載體。在一些實施例中，病毒載體包含反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些實施例中，適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑包含病毒外殼蛋白。在一些實施例中，病毒外殼蛋白係選自由以下組成之群：水泡性口炎病毒外殼蛋白、腺病毒外殼蛋白、腺相關病毒外殼蛋白、鼠類白血病病毒外殼蛋白、HIV外殼蛋白及流感病毒外殼蛋白。在一些實施例中，遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病、胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病、II型辛德勒病、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)及慢性肉芽腫病(CGD)。在一些實施例中，細胞來源於個體。
本文進一步提供一種融合蛋白，其包含原生信號肽、ER蛋白質裂解域、變體IGF2肽及α-葡糖苷酶，其中該融合蛋白由包含Kozak序列之核酸編碼。
本文另外提供一種融合蛋白，其包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽、變體IGF2肽及α-葡糖苷酶，其中該融合蛋白由包含Kozak序列之核酸編碼。
本文另外提供一種融合蛋白，其包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽、變體IGF2肽及α-葡糖苷酶，其中該融合蛋白由包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)之核酸編碼。
本文另外提供一種編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含原生信號肽、ER蛋白質裂解域、變體IGF2肽及α-葡糖苷酶。
本文另外提供一種編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽、變體IGF2肽及α-葡糖苷酶，其中該核酸進一步包含Kozak序列。
本文另外提供一種編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含變體IGF2肽及α-葡糖苷酶，其中該核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。
本文另外提供一種組合物，其包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含原生信號肽、ER蛋白質裂解域、變體IGF2肽及α-葡糖苷酶；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑。
本文另外提供一種組合物，其包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽、變體IGF2肽及α-葡糖苷酶，其中該核酸進一步包含Kozak序列；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑。
本文另外提供一種組合物，其包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含變體IGF2肽及α-葡糖苷酶，其中該核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑。
本文另外提供一種治療個體之龐培氏病之方法，其包含投與組合物，該組合物包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含原生信號肽、ER蛋白質裂解域、變體IGF2肽及α-葡糖苷酶；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑。
本文另外提供一種治療個體之龐培氏病之方法，其包含投與組合物，該組合物包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽、變體IGF2肽及α-葡糖苷酶，其中該核酸進一步包含Kozak序列；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑。
本文另外提供一種治療個體之龐培氏病之方法，其包含投與組合物，該組合物包含：(a)編碼融合蛋白之核酸，該融合蛋白包含變體IGF2肽及α-葡糖苷酶，其中該核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)；及(b)適合於基因治療之緩衝劑或賦形劑。
本文另外提供一種治療個體之龐培氏病之方法，其包含投與表現編碼融合蛋白之核酸的細胞，該融合蛋白包含原生信號肽、ER蛋白質裂解域、變體IGF2肽及α-葡糖苷酶。
本文另外提供一種治療個體之龐培氏病之方法，其包含投與表現編碼融合蛋白之核酸的細胞，該融合蛋白包含結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽、變體IGF2肽及α-葡糖苷酶，其中該核酸進一步包含Kozak序列。
本文另外提供一種治療個體之龐培氏病之方法，其包含投與表現編碼融合蛋白之核酸的細胞，該融合蛋白包含變體IGF2肽及α-葡糖苷酶，其中該核酸進一步包含蟋蟀麻痹病毒內部核糖體進入序列(CrPV IRES)。 以引用之方式併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其引用的程度如同各單獨的公開案、專利或專利申請案經特定及單獨地表明以引用之方式併入一般。
交叉參考
本申請案主張2018年4月30日提交之美國臨時申請案第62/664,741號、2018年6月22日提交之美國臨時申請案第62/688,640號及2018年10月10日提交之美國臨時申請案第62/744,068號之權益，該等申請案之每一者以全文引用之方式併入本文中。
單一基因遺傳病症之基因治療呈現對於疾病及病症的可能單次治療，該等疾病及病症中之一些具有可能在生命早期出現且有時引起長期能力喪失的破壞性症狀。神經遺傳病症，諸如溶酶體貯積病，通常用酶置換治療治療，其向患者投與在疾病或病症狀態中缺陷或缺乏之活性蛋白質形式的治療蛋白。然而，目前療法存在難題，包括頻繁治療、發展對於治療蛋白之免疫反應及難以將治療蛋白靶向感染組織、細胞或亞細胞區室。基因治療提供包括降低治療次數及持久功效的優點。
本文提供用於基因治療載體之組分，該等基因治療載體為基因治療提供改良，諸如在需要之地方提供更多治療蛋白，因此改良治療功效。藉由改良治療蛋白之表現及細胞吸收或遞送及胞內或亞細胞靶向，本文解決此類難題。本文提供之特定工具或組分包括(但不限於)：用於增加分泌之信號肽(例如，結合免疫球蛋白蛋白(BiP)及Gaussia信號肽)；及增加治療蛋白之內吞作用之肽(例如，以高親和力與CI-MPR結合之肽，以增加細胞吸收及溶酶體遞送)。此類肽與由基因治療載體編碼之治療蛋白融合。在一些實施例中，肽為IGF2 (胰島素樣生長因子2)肽或其變體。在一些實施例中，預期本文提供之基因治療載體包含編碼治療蛋白之核酸，該治療蛋白與以高親和力同CI-MPR結合之肽融合以最佳化基因治療的功效。
設計用於酶置換治療之基因治療構築體。轉譯起始序列包括(但不限於)位於構築體之5'端處之Kozak序列或IRES序列，諸如CrPV IRES；隨後編碼GAA信號肽中之一或多者之信號肽的核酸；編碼抗胰蛋白酶抑制劑的核酸；及編碼BiP序列的核酸。在此等之後為編碼細胞靶向域之核酸，該細胞靶向域可為vIGF-2、HIRMab或TfRMab或其他細胞靶向肽或蛋白質。編碼將細胞靶向域與校正性酶連接之連接子之核酸。適合的校正性酶包括(但不限於)α-葡糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、艾杜糖醛酸酶(IDUA)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、PPT1及發現在個體中缺乏之其他酶。治療蛋白之胞內靶向
大多數溶酶體蛋白質之N-連接碳水化合物經修飾以含有稱為甘露糖6-磷酸(M6P)之特定碳水化合物結構。M6P為使得能夠經由膜結合M6P受體將溶酶體蛋白轉運至溶酶體之生物學信號。溶酶體貯積病之酶置換治療使用M6P受體以用於將治療蛋白吸收及遞送至溶酶體。某些療法並不使用M6P受體，包括Cerezyme®及其他重組人類GCase形式，使用能夠結合蛋白質聚糖上之末端甘露糖且遞送至溶酶體之甘露糖受體。某些酶置換治療面臨之問題為：少量的M6P存在於酶治療劑上，而其需要較高劑量來達到治療功效。此引起實質上較長的輸注時間、較高之發展對於治療劑之免疫反應的機率及較高的藥物需求，從而需要增加的蛋白質製造，導致成本增加。
CI-MPR自循環捕獲含M6P之溶酶體酶。受體具有針對M6P及胰島素樣生長因子之不同的結合域(域1-3及7-9，參見圖2)，且因此亦稱為IGF2/甘露糖-6-磷酸受體或IGF2/CI-MPR。可使用此受體來靶向含M6P或IGF2或IGF2變體之酶置換治療。此受體針對此等配體(包括胰島素樣生長因子)之結合親和力提供於表1中。值得注意的是，IGF2肽針對CI-MPR比單磷酸化或雙磷酸化寡醣具有更高結合親和力。 用於基因治療之治療性融合蛋白
本文提供由基因治療載體產生之治療性融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白由用編碼融合蛋白之基因治療載體轉導的細胞分泌。在一些實施例中，經轉導的細胞係在組織或器官(例如，肝)內。一旦自細胞分泌，融合蛋白經由患者之血管系統轉運且到達相關組織。在一些實施例中，治療性融合蛋白經工程改造以具有改良的分泌。在一些實施例中，融合蛋白包含用於相較於對應治療蛋白或包含治療蛋白但缺乏信號肽之融合蛋白改良分泌水準的信號肽。舉例而言，PPT1之融合蛋白(「PPT1-2」)為PPT1與不具有信號序列(BiP)之變體IGF2的融合蛋白，且當相較於另一融合蛋白(「PPT1-30」) (一種PPT1與具有BiP信號序列之變體IGF2的融合蛋白)時，具有低許多的分泌水準。在此實例中，PPT1-2及PPT1-30為各自包含不同變體IGF2肽之融合蛋白。因此，使用本文提供之信號序列之優點在於其可補償工程改造治療蛋白或融合蛋白之減弱的分泌水準。
如本文所用，「分泌」係指自細胞將蛋白質釋放至例如待運載至相關組織或治療蛋白作用部位之血流中。當基因治療產物分泌於器官之間隙空間中時，分泌可允許鄰近細胞之交叉校正。
如本文所用，「遞送」意謂藥物遞送。在一些實施例中，遞送過程意謂自細胞外部(例如，血液、組織或間隙空間)將藥物物質(例如，由基因治療載體產生之治療蛋白或融合蛋白)轉運至藥物物質之治療活性的靶細胞中。
如本文所用，「工程改造」或「蛋白質工程改造」係指藉由提供編碼蛋白質之適當核酸序列操縱蛋白質的結構以便產生所需特性或具有特定結構之蛋白質的合成。
在一些實施例中，所提供基因治療載體經工程改造以解決伴隨基因治療關於遞送治療蛋白之問題。舉例而言，在一些情況下，藉由僅僅在患者體內產生足夠量之治療蛋白，若歸因於例如妨礙配送治療蛋白至有需要之位點之物理及/或生物學障壁，不充分量的治療蛋白遞送至需要治療蛋白的細胞中，則基因治療可能不會達成預期治療。因此，即使基因治療能夠用高濃度之治療蛋白浸沒血液或組織至飽和點，但基因治療可能不為充分治療性的。另外，非產生性清除路徑可移除絕大部分的治療蛋白。即使在血管外將治療蛋白轉運至組織(例如，肌纖維)內之間隙空間，但不能保證充足的治療效果(參見圖 36 )。為了有效治療溶酶體貯積病，治療有效量之治療蛋白必須經歷細胞內吞作用及溶酶體遞送以產生有意義的功效。本發明藉由提供編碼融合蛋白之基因治療載體解決此等問題，該等融合蛋白包含使得能夠將治療蛋白內吞至治療靶細胞中，從而產生有效治療的肽。在一些實施例中，使得能夠進行內吞作用之肽為結合CI-MPR之肽。在一些實施例中，結合CI-MPR之肽為IGF2肽或其變體。
本文提供編碼融合蛋白之基因治療載體，該等融合蛋白包含使得能夠將治療蛋白內吞至治療靶細胞中之肽。在一些實施例中，基因治療載體編碼包含治療蛋白及結合CI-MPR之肽之融合蛋白。此類融合蛋白當由基因治療載體表現時，將治療蛋白(諸如酶置換治療)靶向至需要其之細胞，增加至此類細胞中之遞送或由此類細胞之細胞吸收，且將治療蛋白靶向至亞細胞位置(例如，溶酶體)。在一些實施例中，肽為IGF2肽或其變體，其可將治療蛋白靶向至溶酶體。此外，在一些實施例中，本文中之融合蛋白進一步包含增加分泌之信號肽，諸如BiP信號肽或Gaussia信號肽。在一些實施例中，融合蛋白包含連接子序列。在一些實施例中，編碼本文中之融合蛋白之核酸包含內部核糖體進入序列。
本文提供基因之治療蛋白，其包含vIGF2肽。例示性融合蛋白提供於下表2中。
本文提供之融合蛋白之組分在下文進一步描述。結合 CI-MPR 之 肽 ( 例如， vIGF2 肽 )
本文提供結合CI-MPR之肽。包含此類肽及治療蛋白之融合蛋白當由基因治療載體表現時，將治療蛋白靶向至需要其之細胞，增加由此類細胞之細胞吸收，且將治療蛋白靶向至亞細胞位置(例如，溶酶體)。在一些實施例中，肽與治療性肽之N端融合。在一些實施例中，肽與治療蛋白之C端融合。在一些實施例中，肽為IGF2肽或其變體。本文中之IGF2肽具有圖 3 中例示之結構。一些vIGF2肽維持與CI-MPR之高親和力結合，而其針對IGF1受體、胰島素受體及IGF結合蛋白(IGFBP)之親和力降低或消除。因此，相較於wt IGF2，一些變體IGF2肽實質上更具選擇性且具有降低的安全性風險。本文中之vIGF2肽包括具有SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之彼等肽。變體IGF2肽進一步包括在位置6、26、27、43、48、49、50、54、55或65處相較於wt IGF2 (SEQ ID NO: 1)具有變體胺基酸的彼等肽。在一些實施例中，vIGF2肽具有帶有來自由以下組成之群之一或多個取代的序列：E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R及K65R。在一些實施例中，vIGF2肽具有帶有E6R取代之序列。在一些實施例中，vIGF2肽具有帶有F26S取代之序列。在一些實施例中，vIGF2肽具有帶有Y27L取代之序列。在一些實施例中，vIGF2肽具有帶有V43L取代之序列。在一些實施例中，vIGF2肽具有帶有F48T取代之序列。在一些實施例中，vIGF2肽具有帶有R49S取代之序列。在一些實施例中，vIGF2肽具有帶有S50I取代之序列。在一些實施例中，vIGF2肽具有帶有A54R取代之序列。在一些實施例中，vIGF2肽具有帶有L55R取代之序列。在一些實施例中，vIGF2肽具有帶有K65R取代之序列。在一些實施例中，vIGF2肽具有帶有E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R及L55R取代之序列。在一些實施例中，vIGF2肽具有N端缺失。在一些實施例中，vIGF2肽具有一個胺基酸之N端缺失。在一些實施例中，vIGF2肽具有兩個胺基酸之N端缺失。在一些實施例中，vIGF2肽具有三個胺基酸之N端缺失。在一些實施例中，vIGF2肽具有四個胺基酸之N端缺失。在一些實施例中，vIGF2肽具有四個胺基酸之N端缺失及E6R、Y27L與K65R取代。在一些實施例中，vIGF2肽具有四個胺基酸之N端缺失及E6R與Y27L取代。在一些實施例中，vIGF2肽具有五個胺基酸之N端缺失。在一些實施例中，vIGF2肽具有六個胺基酸之N端缺失。在一些實施例中，vIGF2肽具有七個胺基酸之N端缺失。在一些實施例中，vIGF2肽具有七個胺基酸之N端缺失及Y27L與K65R取代。 內部核糖體進入序列
本文提供適用於治療病症之基因治療構築體，其進一步包含用於藉由繞過轉譯起始之瓶頸而增加基因表現之內部核糖體進入序列(IRES)。基因治療之用於最佳化表現之適合的內部核糖體進入序列包括(但不限於)蟋蟀麻痹病毒(cricket paralysis virus；CrPV) IRES、小核糖核酸病毒IRES、口蹄疫病毒IRES、卡堡氏肉瘤相關疱疹病毒IRES、A型肝炎IRES、C型肝炎IRES、瘟病毒IRES、蟋蟀麻痹病毒(Cripavirus) IRES、禾谷縊管蚜病毒IRES、梅雷克氏病病毒IRES及其他適合的IRES序列。在一些實施例中，基因治療構築體包含CrPV IRES。在一些實施例中，CrPV IRES具有AAAAATGTGATCTTGCTTGTAAATACAATTTTGAGAGGTTAATAAATTACAAGTAGTGCTATTTTTGTATTTAGGTTAGCTATTTAGCTTTACGTTCCAGGATGCCTAGTGGCAGCCCCACAATATCCAGGAAGCCCTCTCTGCGGTTTTTCAGATTAGGTAGTCGAAAAACCTAAGAAATTTACCTGCT (SEQ ID NO: 12)之核酸序列。在一些實施例中，CrPV IRES序列與SEQ ID NO: 12至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致。
蟋蟀麻痹病毒(CrPV) IRES有助於蛋白質合成。信號肽
在一些實施例中，本文提供之基因治療構築體進一步包含信號肽，該信號肽改良自用基因治療構築體轉導之細胞分泌治療蛋白。在一些實施例中，信號肽改良治療蛋白之蛋白質加工，且有助於初生多肽-核糖體複合物易位至ER，且確保恰當共轉譯及轉譯後修飾。在一些實施例中，信號肽位於(i)信號轉譯起始序列之上游位置，(ii)轉譯起始序列與治療蛋白之間，或(iii)治療蛋白之下游位置。適用於基因治療構築體之信號肽包括(但不限於)來自HSP70蛋白家族(例如，HSPA5，熱休克蛋白家族A成員5)之結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽及Gaussia信號肽，以及其變體。此等信號肽對於信號識別粒子具有超高親和力。BiP及Gaussia胺基酸序列之實例提供於中於下表5。在一些實施例中，信號肽具有與選自由SEQ ID No: 13-17組成之群之序列至少90%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽與選自由SEQ ID No: 13-17組成之群之序列相差5個或更少、4個或更少、3個或更少、2個或更少或1個胺基酸。
BiP信號肽-信號識別粒子(SRP)相互作用有助於易位至ER。此相互作用在圖 20 中說明。
Gaussia信號肽來源於Gaussia princeps 螢光素酶，且引導與此信號肽融合之治療蛋白之蛋白質合成及分泌增加。在一些實施例中，Gaussia信號肽具有與SEQ ID NO: 32至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽與SEQ ID NO: 32相差5個或更少、4個或更少、3個或更少、2個或更少或1個胺基酸。連接子
在一些實施例中，本文提供之基因治療構築體包含在(i) vIGF2肽與治療蛋白之間的連接子。在一些實施例中，此類連接子維持恰當間距，且減少vIGF2肽與治療蛋白之間的空間對撞。在一些實施例中，連接子包含重複甘胺酸殘基、重複甘胺酸-絲胺酸殘基，及其組合。在一些實施例中，連接子由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約5、6、7、8、9、10、11、12或13個胺基酸組成。本文中之基因治療構築體之適合的連接子包括(但不限於)下表6中提供的彼等。 轉譯起始序列
本文提供之基因治療構築體包含具有轉譯起始序列(諸如Kozak序列，其有助於起始mRNA之轉譯)之核酸。本文中涵蓋之Kozak序列具有gccRccAUGG (SEQ ID NO: 27)之共同序列，其中小寫字母表示在該位置處之最常見鹼基且鹼基變化，大寫字母指示僅極少變化的高度保守鹼基。R指示在彼位置處始終觀測到之嘌呤((腺嘌呤或鳥嘌呤)。圓括號中之序列(gcc)具有不明意義。在一些實施例中，Kozak序列包含序列AX1 X2 ATGA (SEQ ID NO: 28)，其中X1 及X2 中之每一者為任何核苷酸。在一些實施例中，X1 包含A。在一些實施例中，X2 包含G。在一些實施例中，Kozak序列包含與AAGATGA (SEQ ID NO: 29)至少85%一致之核酸序列。在一些實施例中，Kozak序列與AAGATGA (SEQ ID NO: 29)之序列相差一個或兩個核苷酸。在一些實施例中，本文提供之Kozak序列具有AAGATGA (SEQ ID NO: 29)之序列。在一些實施例中，Kozak序列包含與GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)至少85%一致之核酸序列。在一些實施例中，Kozak序列與GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)之序列相差一個或兩個核苷酸。在一些實施例中，Kozak序列包含GCAAGATG (SEQ ID NO: 44)。治療蛋白
本文提供之基因治療構築體包含編碼治療蛋白之核酸，該治療蛋白係用於治療因個體中之遺傳缺陷造成不存在或缺陷蛋白質所致的遺傳病症。從基因治療構築體所表現之治療蛋白來置換不存在或缺陷蛋白質。因此，基於個體中需要治療之遺傳缺陷，選擇治療蛋白。在一些實施例中，治療蛋白為結構蛋白。在一些實施例中，治療蛋白為酶。在一些實施例中，治療蛋白為調節蛋白。在一些實施例中，治療蛋白為受體。在一些實施例中，治療蛋白為肽激素。在一些實施例中，治療蛋白為細胞介素或趨化細胞素。
在一些實施例中，本文中之基因治療構築體可編碼酶，諸如在患有溶酶體貯積病之個體中具有遺傳缺陷之酶。在一些實施例中，基因治療構築體編碼溶酶體酶，諸如糖苷酶、蛋白酶或硫酸酯酶。在一些實施例中，由本文提供之基因治療構築體編碼之酶包括(但不限於)：α-D-甘露糖苷酶；N-天冬胺醯基-β-胺基葡糖苷酶；β-半乳糖苷酶；神經醯胺酶；岩藻糖苷酶；半乳糖腦苷脂酶；芳基硫酸酯酶A；N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶；艾杜糖醛酸硫酸酯酶；N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶；乙醯基-CoA:α-胺基葡糖苷乙醯基轉移酶；N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶；β-葡糖醛酸酶；玻尿酸酶；唾液酸酶；硫酸酯酶；神經磷脂酶；酸性β-甘露糖苷酶；組織蛋白酶K；3-己糖苷酶A；β-己糖苷酶B；α-N-乙醯基半乳糖胺酶；sialin；己糖苷酶A；β-葡糖苷酶；α-艾杜糖醛酸酶；α-半乳糖苷酶A；β-葡糖腦苷脂酶；溶酶體酸性脂肪酶；葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶；艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶；葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶；α-葡糖苷酶；乙醯肝素硫酸醯胺酶；NADPH氧化酶之gp-91次單元；腺苷脫胺酶；細胞週期素依賴性激酶樣5；及軟脂醯基蛋白質硫酯酶1。在一些實施例中，由本文提供之基因治療構築體編碼之酶包含α-葡糖苷酶。在一些實施例中，治療蛋白與選自由以下組成之群之遺傳病症相關聯：CDKL5缺乏症、囊腫性纖維化、α-地中海型貧血及β-地中海型貧血、鐮狀細胞貧血、馬凡氏症候群、X脆折症候群、亨廷頓氏病、血色沉著病、先天性耳聾(非綜合型)、塔伊-薩克斯病、家族性高膽固醇血症、杜興氏肌肉失養症、斯特格氏病、尤塞氏症候群、無脈絡膜症、色盲、X性聯視網膜劈裂症、血友病、韋-奧氏症候群、X性聯慢性肉芽腫病、芳族L-胺基酸去羧酶缺乏症、隱性營養不良大皰性表皮鬆懈、α1抗胰蛋白酶缺乏症、哈-吉氏早老症症候群(HGPS)、努南氏症候群、X性聯嚴重合併性免疫缺失(X-SCID)。在一些實施例中，治療蛋白係選自由以下組成之群：CDKL5、連接蛋白26、己糖苷酶A、LDL受體、肌縮蛋白、CFTR、β-球蛋白、HFE、亨廷頓氏、ABCA4、肌凝蛋白VIIA (MYO7A)、Rab護航蛋白-1 (REP1)、環狀核苷酸閘控通道β3 (CNGB3)、視網膜劈裂素1 (RS1)、血紅素次單元β (HBB)、因子IX、WAS、細胞色素B-245 β鏈、多巴去羧酶(DDC)、VII型膠原蛋白α1鏈(COL7A1)、絲胺酸蛋白酶抑因子家族A成員1 (SERPINA1)、LMNA、PTPN11、SOS1、RAF1、KRAS及IL2受體γ基因。
基因治療載體實例 基因治療載體及組合物
本文提供基因治療載體，其中插入編碼治療性融合蛋白，諸如vIGF2融合體或信號肽融合體，視情況具有內部核糖體進入序列的核酸，諸如DNA。來源於反轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體為達成長期基因轉移之適合工具，此係因為其允許長期穩定整合轉殖基因及其在子細胞中之傳播。慢病毒及腺相關病毒載體具有優於衍生於致癌反轉錄病毒之載體的額外優點，該等致癌反轉錄病毒諸如鼠類白血病病毒，其中其能夠轉導非增生細胞，諸如肝細胞及神經元。其亦具有低免疫原性之額外優點。
本文中之例示性基因治療載體編碼治療蛋白及包含vIGF2肽之治療性融合蛋白。編碼例示性融合蛋白胺基酸序列之核酸提供於下表7中。
在一些實施例中，本文提供之包含編碼所需治療性融合蛋白(諸如vIGF2融合體或信號肽融合體)，視情況具有內部核糖體進入序列之核酸的載體，為腺相關病毒載體(A5/35)。在一些實施例中，使用轉座子，諸如睡美人(sleeping beauty)、crisper、CAS9及鋅指核酸酶，來實現編碼vIGF2-治療性融合蛋白之核酸之表現(參見June等人2009 Nature Reviews Immunol. 9.10: 704-716，以引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，將編碼治療性融合蛋白(諸如vIGF2融合體或信號肽融合體)，視情況具有內部核糖體進入序列之核酸，選殖至多種類型之載體中。舉例而言，在一些實施例中，將核酸選殖至載體中，該載體包括(但不限於)質體、噬菌質體、噬菌體衍生物、動物病毒及黏質體。尤其受關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及定序載體。
此外，在一些實施例中，將編碼所需治療性融合蛋白(諸如vIGF2融合體或信號肽融合體)，視情況具有內部核糖體進入序列之核酸，以病毒載體形式提供至細胞。病毒載體技術描述於例如Sambrook等人, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Press, NY)及其他病毒學與分子生物學手冊中。適用作載體之病毒包括(但不限於)反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言，適合載體含有在至少一種生物體中起作用的複製起點、啟動子序列、適宜的限制性核酸內切酶位點，及一或多種可選標記物(例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
本文亦提供用於基因轉移之組合物及系統。已針對基因轉移至哺乳動物細胞中開發出多個基於病毒之系統。舉例而言，反轉錄病毒提供基因傳遞系統之適宜平台。在一些實施例中，使用適合技術，將所選擇基因插入至載體中且封裝在反轉錄病毒顆粒中。隨後，分離重組病毒且活體內或離體遞送至個體之細胞中。多種反轉錄病毒系統適合於基因治療。在一些實施例中，使用腺病毒載體。多種腺病毒載體適合於基因治療。在一些實施例中，使用腺相關病毒載體。多種腺相關病毒適合於基因治療。在一個實施例中，使用慢病毒載體。
本文提供之基因治療構築體包含載體(或基因治療表現載體)，其中將所關注之基因選殖至該載體中，或者該載體以使得載體之核苷酸序列允許表現(組成性表現或者以某種方式調節)所關注之基因的方式包括所關注之基因。本文提供之載體構築體包括能夠遞送至相關組織且將在所選擇相關組織中提供表現所關注之基因之任何適合的基因表現載體。
在一些實施例中，載體為腺相關病毒(AAV)載體，此係因為AAV載體跨越血腦障壁及轉導神經元組織之能力。在本文提供之方法中，考慮使用任何血清型之AAV。在某些實施例中，所使用之血清型之病毒載體係選自由以下組成之群：AAV1載體、AAV2載體、AAV3載體、AAV4載體、AAV5載體、AAV6載體、AAV7載體、AAV8載體、AAV9載體、AAVrhS載體、AAVrh10載體、AAVrh33載體、AAVrh34載體、AAVrh74載體、AAV Anc80載體、AAVPHP.B載體、AAVhu68載體、AAV-DJ載體及適合於基因治療之其他載體。
AAV載體係衍生自對於哺乳動物為非病原性的單股DNA細小病毒。簡言之，基於AAV之載體具有rep及cap病毒基因，考慮移除病毒基因組之96%，留下用於起始病毒DNA複製、封裝及整合之兩個側接145鹼基對反向末端重複序列(ITR)。在不存在輔助病毒下，野生型AAV以較佳位點特異性在染色體19q 13.3處整合至人類宿主細胞基因組中，或其可保持游離地表現。單一AAV顆粒能夠容納至多5 kb ssDNA。
在一說明性實施例中，使用血清型2衣殼，將包含在兩個AAV ITR之間的序列的AAV主鏈假型化，產生AAV2載體。在其他實施例中，使用血清型9衣殼，將包含在兩個AAV ITR之間的序列的AAV主鏈假型化，產生AAV9載體。其他實施例包括使用其他血清型衣殼以產生：AAV1載體、AAV2載體、AAV3載體、AAV4載體、AAV5載體、AAV6載體、AAV7載體、AAV8載體、AAV9載體、AAVrhS載體、AAVrh10載體、AAVrh33載體、AAVrh34載體、AAVrh74載體、AAV Anc80載體、AAVPHP.B載體、AAV-DJ載體及適合於基因治療之其他載體。視情況，AAV病毒衣殼為AAV2/9、AAV9、AAVrhS、AAVrh10、AAVAnc80或AAV PHP.B。
額外啟動子元件(例如，強化子)調節轉錄起始頻率。通常，此等位於起始位點上游30-110 bp區中，儘管已顯示許多啟動子亦在起始位點下游含有功能元件。啟動子元件之間的間距通常為可撓性的，使得當元件倒置或相對於彼此移動時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間距在活性開始下降之前通常增加至相隔50 bp。視啟動子而定，個別元件看起來合作地或獨立地起活化轉錄功能。
能夠表現治療性融合蛋白(諸如vIGF2融合體或信號肽融合體)，視情況具有內部核糖體進入序列、哺乳動物T細胞中之轉殖基因之啟動子的實例為EF1a啟動子。原生EF1a啟動子驅動延長因子-1複合物之α次單元的表現，該複合物負責將胺基醯基tRNA酶促傳遞至核糖體。EF1a啟動子已在哺乳動物表現中廣泛使用，且已顯示在驅動自選殖至慢病毒載體中之轉基因表現中有效(參見例如Milone等人, Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009))。啟動子之另一實例為即刻早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列為強組成型啟動子序列，其能夠驅動與其可操作地連接之任何聚核苷酸序列之高水準表現。然而，有時亦可使用其他組成型啟動子序列，包括(但不限於)雞β肌動蛋白啟動子、P546啟動子、猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)，以及人類基因啟動子，諸如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、延長因子-1a啟動子、血紅素啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，預期基因治療載體不限於使用組成型啟動子。此處亦涵蓋誘導性啟動子。誘導性啟動子之使用提供分子開關，該分子開關能夠在需要此類表現時打開其可操作地連接之聚核苷酸序列之表現或在不需要表現時關閉表現。誘導性啟動子之實例包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素調節啟動子。
為了評定視情況具有內部核糖體進入序列或其部分之治療性融合蛋白(諸如vIGF融合體或信號肽融合體)之表現，待引入至細胞中之表現載體通常含有可選標記基因或報導基因或兩者，以便於自設法經由病毒載體轉染或感染之細胞群體鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中，可選標記物通常攜載於獨立DNA段上且用於共轉染程序。可選標記物與報導基因有時側接適當的調節序列以實現在宿主細胞中的表現。適用可選標記物包括例如耐抗生素基因，諸如neo及其類似物。
用於引入至細胞中及表現基因之方法及組合物適合於本文中之方法。在表現載體之情形下，載體藉由此項技術中之任何方法容易地引入至宿主細胞(例如哺乳動物、細菌、酵母菌或昆蟲細胞)中。舉例而言，藉由物理、化學或生物方式，將表現載體轉移至宿主細胞中。
用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之物理方法及組合物包括磷酸鈣沈澱、脂質體轉染、粒子轟擊、顯微注射、基因槍、電穿孔及類似方法。用於製造包含載體及/或外源性核酸之細胞之方法適合於本文中之方法(參見例如Sambrook等人, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Press, NY)。將聚核苷酸引入宿主細胞中之一種方法為磷酸鈣轉染。
用於將相關聚核苷酸引入宿主細胞中之生物學方法及組合物包括使用DNA及RNA載體。病毒載體及尤其反轉錄病毒載體已成為最廣泛用於將基因插入至哺乳動物(例如人類)細胞中之方法。在一些實施例中，其他病毒載體來源於慢病毒、痘病毒、I型單純疱疹病毒、腺病毒及腺相關聯病毒及其類似病毒。
將聚核苷酸引入宿主細胞中之化學方式及組合物包括膠態分散系統，諸如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。用作活體外及活體內遞送媒劑之例示性膠態系統為脂質體(例如人工膜泡)。可獲得目前先進技術中靶向遞送核酸之其他方法，諸如用靶向奈米粒子或其他適合之亞微米大小的遞送系統遞送聚核苷酸。
在利用非病毒遞送系統之情況下，例示性遞送媒劑為脂質體。涵蓋脂質調配物之使用，以用於將核酸引入至宿主細胞(活體外、離體或活體內)中。在另一態樣中，核酸與脂質締合。在一些實施例中，與脂質締合之核酸囊封於脂質體之水性內部中，穿插於脂質體之脂質雙層內，經由與脂質體及寡核苷酸締合之連接分子與脂質體連接、包覆於脂質體中，與脂質體複合，分散於含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質合併，以懸浮液形式含於脂質中，含有微胞或與微胞複合，或以其他方式與脂質締合。與脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體締合的組合物不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言，在一些實施例中，其存在於雙層結構中，以微胞形式存在或具有「塌陷」結構。替代地，其可簡單地穿插於溶液中，可能形成大小或形狀上不均勻的聚集物。脂質為脂肪物質，其在一些實施例中為天然存在或合成脂質。舉例而言，脂質包括細胞質中天然存在之脂肪滴以及含有長鏈脂族烴及其衍生物之化合物類別(諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛)。
適用之脂質係獲自商業來源。舉例而言，在一些實施例中，二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)係獲自Sigma, St. Louis, Mo.；在一些實施例中，磷酸三十二烷基酯(「DCP」)係獲自K & K Laboratories (Plainview, N.Y.)；在一些實施例中，膽固醇(「Choi」)係獲自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質通常係獲自Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.)。脂質於氯仿或氯仿/甲醇中之儲備溶液通常儲存在約-20℃下。氯仿用作唯一溶劑，因為其比甲醇更容易蒸發。「脂質體」為通用術語，其涵蓋藉由產生經圍封之脂質雙層或聚集物而形成的多種單層及多層脂質媒劑。脂質體之特徵通常為具有囊泡結構，其具有磷脂雙層膜及內部水性介質。多層脂質體具有藉由水性介質分隔開之多個脂質層。其在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發地形成。脂質組分在形成封閉結構之前進行自身重排，且在脂質雙層之間捕獲水及溶解之溶解物(Ghosh等人, 1991 Glycobiology 5: 505-10)。然而，亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡結構不同之結構的組合物。舉例而言，在一些實施例中，脂質呈現微胞結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦涵蓋脂染胺-核酸複合物。
不管用於將外源性核酸引入宿主細胞中或者將細胞暴露於本文提供之視情況具有內部核糖體進入序列之治療性融合蛋白(諸如vIGF2融合體或信號肽融合體)的方法如何，為了確認宿主細胞中重組DNA序列的存在，考慮進行各種分析。此類分析包括例如適合於本文中之方法之「分子生物學」分析，諸如南方及北方墨點法、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，諸如偵測特定肽之存在或不存在，例如藉由免疫學方式(ELISA及西方墨點法)或藉由本文所描述之分析來鑑別在本文之範疇內的試劑。
本發明進一步提供一種載體，其包含治療性融合蛋白(諸如vIGF2融合體或信號肽融合體)，視情況具有內部核糖體進入序列、編碼核酸分子。在一個態樣中，治療性融合蛋白載體能夠直接轉導至細胞中。在一個態樣中，載體為選殖或表現載體，例如包括(但不限於)以下之載體：一或多種質體(例如，表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、反轉錄病毒及慢病毒載體構築體。在一個態樣中，載體能夠在哺乳動物細胞中表現vIGF2-治療性融合蛋白構築體。在一個態樣中，哺乳動物細胞為人類細胞。用途及治療方法
本文亦提供使用基因治療來治療遺傳病症之方法，其包含向個體投與本文所揭示之編碼治療性融合蛋白(諸如vIGF2融合體或信號肽融合體或信號肽-vIGF2融合體)，視情況具有內部核糖體進入序列的核酸。適合於使用本文方法進行治療之遺傳病症包含個體中由基因組中之一或多個突變引起的病症，該一或多個突變引起缺乏表現蛋白質或由突變型基因表現功能異常蛋白質。
本文進一步提供醫藥組合物，其包含基因治療載體，諸如基因治療載體，該基因治療載體包含本文所揭示之編碼治療性融合蛋白(諸如vIGF2融合體或信號肽融合體或信號肽-vIGF2融合體)，視情況具有內部核糖體進入序列之核酸，及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，以用於製備用於治療遺傳病症的藥物。
適合於藉由本文中之方法治療之遺傳病症包括(但不限於)：軟骨發育不全、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、抗磷脂症候群、常染色體顯性多囊性腎病、恰克-馬利-杜斯病(Charcot-Marie-Tooth)、結腸癌、貓叫症候群(Cri du chat)、克羅恩氏病(Crohn's Disease)、囊腫性纖維化、德爾肯病(Dercum Disease)、杜恩氏症候群(Duane Syndrome)、杜興氏肌肉失養症、因子V萊頓易栓病(Factor V Leiden Thrombophilia)、家族性高膽固醇血症、家族性地中海熱、X脆折症候群、戈謝病、血色沉著病、血友病、前腦無裂畸形、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、克氏症候群(Klinefelter syndrome)、馬凡氏症候群、肌緊張性營養障礙、神經纖維瘤、努南症候群、成骨不全、帕金森氏病(Parkinson's disease)、苯酮尿症、波蘭異常、卟啉症、早老症、色素性視網膜炎、嚴重合併性免疫缺失(SCID)、鐮狀細胞疾病、脊髓性肌萎縮、泰-薩克斯病、地中海貧血、三甲基胺尿症、特納症候群(Turner Syndrome)、顎心臉症候群、WAGR症候群或威爾遜病(Wilson Disease)。在一些實施例中，遺傳病症係選自由以下組成之群：CDKL5缺乏症、囊腫性纖維化、α-地中海型貧血及β-地中海型貧血、鐮狀細胞貧血、馬凡氏症候群、X脆折症候群、亨廷頓氏病、血色沉著病、先天性耳聾(非綜合型)、塔伊-薩克斯病、家族性高膽固醇血症、杜興氏肌肉失養症、斯特格氏病、尤塞氏症候群、無脈絡膜症、色盲、X性聯視網膜劈裂症、血友病、韋-奧氏症候群、X性聯慢性肉芽腫病、芳族L-胺基酸去羧酶缺乏症、隱性營養不良大皰性表皮鬆懈、α1抗胰蛋白酶缺乏症、哈-吉氏早老症症候群(HGPS)、努南氏症候群、X性聯嚴重合併性免疫缺失(X-SCID)。
在一些實施例中，適合於使用本文提供之方法治療之遺傳病症為溶酶體貯積病。在一些實施例中，本文中溶酶體貯積病使用基因治療遞送缺失或缺陷酶至患者來治療。在一些實施例中，本文中之方法將與vIGF2融合或與信號肽融合之酶遞送至患者，以便將酶遞送至需要其之細胞中。在一些實施例中，溶酶體貯積病係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、貝敦氏病胱胺酸症、法布立病、I型戈謝病、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病、泰-薩克斯病、桑多霍夫病、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積症、IV型黏脂貯積症、賀勒病、亨特病、A型聖菲利波病、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病、B型莫奎病、馬羅托-拉米病、斯利病、A型尼曼-匹克病、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病及II型辛德勒病。在一些實施例中，溶酶體貯積病係選自由以下組成之群：活化因子缺乏症、GM2-神經節苷脂貯積病；GM2-神經節苷脂貯積病、AB變型；α-甘露糖苷貯積病(2型，中度形式；3型，新生兒，重度)；β-甘露糖苷貯積病；天冬胺醯葡萄糖胺尿症；溶酶體酸性脂肪酶缺乏症；胱胺酸症(晚發作幼年型或青年腎病類型；幼稚型腎病)；錢林-朵爾夫曼症候群；伴隨肌病之中性脂貯積病；NLSDM；達農病(Danon disease)；法布立病；晚期發作II型法布立病；法伯病；法伯脂肪肉芽腫病；岩藻糖苷貯積症；半乳糖唾液酸貯積症(合併神經胺糖酸苷酶及β-半乳糖苷酶缺乏症)；戈謝病；II型戈謝病；III型戈謝病；IIIC型戈謝病；因鞘脂激活蛋白C缺乏所致之非典型戈謝病；GM1-神經節苷脂貯積病(晚幼稚型/幼年型GM1-神經節苷脂貯積病；成人/慢性GM1-神經節苷脂貯積病)；球狀細胞腦白質營養不良、克拉培病(晚幼稚型發作；幼年型發作；成年發作型)；因鞘脂激活蛋白A缺乏所致之非典型克拉培病；異染性腦白質營養不良(幼年型；成人)；部分硫酸腦甘脂缺乏症；假芳基硫酸酯酶A缺乏症；因鞘脂激活蛋白B缺乏所致之異染性腦白質營養不良；黏多醣貯積症：MPS I、賀勒侯症群；MPS I、賀勒-沙伊侯症群；MPS I、沙伊侯症群；MPS II、亨特症候群；MPS II、亨特症候群；A型聖菲利波症候群/MPS IIIA；B型聖菲利波症候群/MPS IIIB；C型聖菲利波症候群/MPS IIIC；D型聖菲利波症候群/MPS IIID；莫奎症候群、A型/MPS IVA；莫奎症候群、B型/MPS IVB；MPS IX玻尿酸酶缺乏症；MPS VI馬洛特-拉米症候群；MPS VII斯利症候群；黏脂貯積症I、II型唾液腺病；I-細胞病、勒羅伊病、黏脂貯積症II；假賀勒多營養不良/III型黏脂貯積症；黏脂貯積症IIIC/ML III GAMMA；IV型黏脂貯積症；多硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克病(B型；C1型/慢性神經疾病形式；C2型；D型/諾瓦司考田)；神經元蠟樣質褐質病：CLN6病，非典型晚期幼稚型、晚發作變型、早幼年型；貝敦氏-家族黑蒙性白癡/幼年型NCL/CLN3病；芬蘭變型晚幼稚型CLN5；詹斯基-比爾朔夫斯基病/晚幼稚型CLN2/TPP1病；Kufs/成年發作型NCL/CLN4病(B型)；北方癲癇症/變型晚幼稚型CLN8；桑塔沃里-哈爾蒂亞/幼稚型CLN1/PPT病；龐培氏病(II型肝糖貯積病)；晚發作型龐培氏病；密骨發育障礙；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；桑多霍夫病/GM2神經節苷脂貯積病；辛德勒病(III型/中度，可變)；神琦病；薩拉病；幼稚型無唾液酸貯積病(ISSD)；伴隨進展性肌痙攣癲癇症之脊髓性肌萎縮(SMAPME)；泰-薩克斯病/GM2神經節苷脂貯積病；幼發型泰-薩克斯病；晚發作型泰-薩克斯病；克里斯蒂安症候群；洛氏眼-腦-腎症候群；4J型恰克-馬利-杜斯病CMT4J；尤里斯-凡倫症候群；雙側顳枕多小腦回(BTOP)；X性聯高鈣性腎石病、登特-1；及登特病2。在一些實施例中，治療蛋白與溶酶體貯積病相關聯，且治療蛋白係選自由以下組成之群：GM2-活化因子蛋白質；α-甘露糖苷酶；MAN2B1；溶酶體ß-甘露糖苷酶；糖基天冬醯胺酶；溶酶體酸性脂肪酶；cystinosin；CTNS；PNPLA2；溶酶體相關膜蛋白-2；α-半乳糖苷酶A；GLA；酸性神經醯胺酶；α-L-岩藻糖苷酶；保護性蛋白質/組織蛋白酶A；酸性ß-葡糖苷酶；GBA；PSAP；ß-半乳糖苷酶-1；GLB1；半乳糖苷基神經醯胺ß-半乳糖苷酶；GALC；PSAP；芳基硫酸酯酶A；ARSA；α-L-艾杜糖醛酸酶；艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶；乙醯肝素N-硫酸酯酶；N-α-乙醯基胺基葡萄糖苷酶；乙醯肝素乙醯CoA:α-胺基葡糖苷乙醯基轉移酶；N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶；半乳胺糖-6-硫酸硫酸酯酶；ß-半乳糖苷酶；玻尿酸酶；芳基硫酸酯酶B；ß-葡糖醛酸酶；神經胺糖酸苷酶；NEU1；N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶之γ次單元；mucolipin-1；硫酸酯酶修飾因子-1；酸性神經磷脂酶；SMPD1；NPC1；及NPC2。
在一些實施例中，經由本文中之方法之治療將編碼治療蛋白之基因遞送至需要治療蛋白的細胞中。在一些實施例中，治療將基因遞送至個體中之所有體細胞中。在一些實施例中，治療置換靶向細胞中之缺陷基因。在一些實施例中，將離體治療以表現治療蛋白之細胞遞送至個體。
用於本文所揭示之病症之基因治療提供優於習知治療，包括酶置換治療之治療結果，此係因為其不需要長期輸注治療。此外，其具有個體發展對於治療蛋白之免疫反應之降低的風險，該免疫反應通常在接受酶置換治療之個體中經歷。定義
如本文所用，「離體基因治療」係指其中患者細胞在個體外部經基因修飾以例如表現治療性基因的方法。隨後，具有新遺傳資訊之細胞返回至其來源的個體。
如本文所用，「活體內基因治療」係指其中直接向個體投與攜帶治療性基因之載體的方法。
如本文所用，「融合蛋白」及「治療性融合蛋白」在本文中可互換使用，且係指具有與其連接之至少一個額外蛋白質、肽或多肽的治療蛋白。在一些情況下，融合蛋白為含有兩個或更多個蛋白質或其片段之單一蛋白質分子，該兩個或更多個蛋白質或其片段經由其各別肽鏈內之肽鍵而無化學連接子共價連接。在一些實施例中，融合蛋白包含治療蛋白及信號肽(一種增加融合蛋白之內吞作用之肽)或兩者。在一些實施例中，增加內吞作用之肽為結合CI-MPR之肽。
如本文所用，在本文中可互換使用之「載體」或「基因治療載體」，係指將治療性基因遞送至細胞之基因治療遞送媒劑或載劑。基因治療載體為適用於基因治療之任何載體，例如適合於將核酸聚合物(編碼多肽或其變體)治療性遞送至患者之靶細胞(例如，感覺神經元)中之任何載體。在一些實施例中，基因治療載體將編碼治療蛋白或治療性融合蛋白之核酸遞送至表現治療蛋白或融合體且自細胞分泌之細胞。載體可具有任何類型，例如其可為質體載體或小環DNA。通常，載體為病毒載體。此等包括基因失能病毒(諸如腺病毒)載體及非病毒載體(諸如脂質體)兩者。病毒載體可例如衍生自腺相關病毒(AAV)、反轉錄病毒、慢病毒、單純疱疹病毒或腺病毒。AAV源性載體。載體可包含AAV基因組或其衍生物。
如本文所用，「構築體」係指編碼治療蛋白或融合蛋白且視情況包含額外序列(諸如轉譯起始序列或IRES序列)之核酸分子或序列。
如本文所用，「AAV」係指野生型AAV病毒或病毒顆粒。AAV (細小病毒家族成員)為小的非包膜二十面體病毒，其具有4.7千鹼基(kb)至6 kb之單股線性DNA基因組。AAV歸為依賴病毒屬，因為該病毒發現為經純化腺病毒儲備液中之雜質。AAV之生命週期包括：潛伏期，此時AAV基因組在感染之後整合於宿主基因組中；及感染期，其中在腺病毒或單純疱疹病毒感染後，整合的AAV基因組隨後修復、複製及封裝成感染性病毒。非病原性、寬廣的感染宿主範圍(包括非分裂細胞)及整合之特性使得AAV為誘人的遞送媒劑。術語「AAV」、「AAV病毒」及「AAV病毒顆粒」在本文中可互換使用。術語「rAAV」係指重組AAV病毒或重組感染性囊封病毒顆粒。已描述用於自組織分離其之各種不同AAV序列及方法。在其他AAV序列之中，已描述自猴或人類組織來源獲得之AAV1-6、AAV7、AAV9及AAV9。參見例如國際專利公開案第WO 02/33269號、第WO 02/386122 (AAV8)號及國際專利公開案第WO 2005/033321號。藉由此，不再嚴格藉由血清交叉反應(血清型)來定義AAV。近期文獻定義此等AAV之間關於相關性的關係，將多組稱為「分枝系」。參見例如Gao等人, J Virol, 78(12):6381-6388 (2004年6月)；國際專利公開案第WO 2005/033321號。
術語「rAAV基因組」係指衍生自原生AAV基因組，已經修飾的聚核苷酸序列。在一些實施例中，rAAV基因組已經修飾以移除原生cap及rep基因。在一些實施例中，rAAV基因組包含內源性5'及3'反向末端重複序列(ITR)。在一些實施例中，rAAV基因組包含來自AAV血清型(不同於AAV基因組所來源之AAV血清型)之ITR。在一些實施例中，rAAV基因組包含編碼治療蛋白之核酸，其在5'及3'端上側接反向末端重複(ITR)。rAAV基因組可為自身互補(sc)基因組，其在本文中稱為「scAAV基因組」。或者，rAAV基因組可為單股(ss)基因組，其在本文中稱為「ssAAV基因組」。
術語「scAAV」係指包含自身互補基因組之rAAV病毒或rAAV病毒顆粒。術語「ssAAV」係指包含單股基因組之rAAV病毒或rAAV病毒顆粒。
「封裝」係指引起AAV顆粒之組裝及衣殼化之一系列胞內事件。術語「製造」係指藉由封裝細胞製造rAAV (感染性囊封rAAV顆粒)之過程。
AAV「rep」及「cap」基因係指分別編碼腺相關病毒之複製及衣殼化蛋白質的聚核苷酸序列。AAV rep及cap在本文中被稱作AAV「封裝基因」。
AAV之「輔助病毒」係指允許AAV (例如，野生型AAV)複製且藉由哺乳動物細胞封裝之病毒。AAV之各種此類輔助為此項技術中已知的，包括腺病毒、疱疹病毒及痘病毒(諸如牛痘)。腺病毒可涵蓋多個不同子組，但子組C之5型腺病毒最常用。已知人類、非人類哺乳動物及禽類來源之多種腺病毒且獲自貯藏所(諸如ATCC)。疱疹家族之病毒包括例如單純疱疹病毒(HSV)及埃-巴二氏病毒(EBV)以及巨細胞病毒(CMV)及假性狂犬病病毒(PRV)；其亦獲自諸如ATCC之貯藏所。
「輔助病毒功能」係指編碼在允許AAV複製及封裝(結合本文所描述之複製及封裝之其他需求)之輔助病毒基因組中的功能。如本文所描述，「輔助病毒功能」可以多種方式提供，包括藉由以反式向生產細胞提供輔助病毒或提供例如編碼必需功能之聚核苷酸序列。
如本文所用，「質體」係指在細胞內獨立於染色體DNA進行複製之環狀雙股DNA單元。
如本文所用，「啟動子」係指DNA上與酶RNA聚合酶結合且起始DNA轉錄為RNA之位點。
如本文所用，「體細胞療法」係指其中操縱將對於患者為校正性而非遺傳至下一代之細胞中之基因表現的方法。體細胞包括人體中之所有非生殖細胞。
如本文所用，「體細胞」係指除生殖細胞外之所有身體細胞。
如本文所用，「趨向性」係指載體(諸如病毒)對於某一細胞或組織類型之偏好。各種因素決定載體感染特定細胞之能力。病毒例如必須與特定細胞表面受體結合以進入細胞。若細胞不表現必需受體，則病毒通常不能感染細胞。
術語「轉導」用於指，經由本發明之複製缺陷型rAAV，向靶細胞活體內或活體外投與/遞送編碼治療蛋白之核酸，引起接受者細胞表現功能性多肽。用本發明之基因治療載體(諸如rAAV)轉導細胞，引起持久表現由rAAV編碼之多肽或RNA。因此，本發明提供藉由鞘內、視網膜內、眼內、玻璃體內、腦室內、腦實質內或靜脈內途徑或其任何組合，向個體投與/遞送編碼治療蛋白之基因治療載體(諸如rAAV)的方法。「鞘內」遞送係指遞送至大腦或脊髓之蜘蛛膜下之空間中。在一些實施例中，鞘內投與係經由腦池內投與。
術語「接受者」、「個體(individual/subject)」、「宿主」及「患者」在本文中可互換使用，且在一些情況下，係指需要診斷、治療或療法之任何哺乳動物個體，特定言之人類。出於治療之目的之「哺乳動物」係指歸類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家養動物及農畜、及實驗室、動物園、體育或寵物動物，諸如狗、馬、貓、牛、綿羊、山羊、豬、小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、猴等。在一些實施例中，哺乳動物為人類。
如本文所用，在一些情況下，術語「治療(treatment/treating)」、「改善症狀」及其類似者，係指出於以統計學上顯著方式或以臨床上顯著方式獲得治療效果(包括抑制、緩解、降低、預防或改變病症之至少一個態樣或標記)之目的，投與藥劑或進行程序。術語「改善」或「治療」不表明或暗示治癒潛在病狀。如本文所用，「治療」或「改善」(及類似者)可包括治療哺乳動物，特定言之人類，且包括：(a)預防病症或病症之症狀在可能易患該病症但尚未診斷患病(例如，包括可能與原發性病症相關聯或由其引起之病症)之個體中發生；(b)抑制病症，亦即遏制其發展；(c)減輕病症，亦即引起病症消退；及(d)改良病症之至少一個症狀。治療可指代在治療或改善或預防病症中之任何成功標誌，包括任何客觀或主觀參數，諸如消除；緩解；減弱症狀或使病症病狀對於患者為更可容忍的；減緩變性或衰退之速率；或使變性之最終點較低衰弱。治療或改善症狀係基於一或多個客觀或主觀參數；包括藉由醫師檢查之結果。因此，術語「治療」包括投與本發明之化合物或藥劑以預防與病症相關之症狀或病狀，或延遲、減輕或遏制或抑制與病症相關之症狀或病狀之發展。術語「治療效果」係指減少、消除或預防個體之病症、病症之症狀或病症之副作用。
術語「親和力」係指分子與其結合搭配物或受體之間的結合強度。舉例而言，親和力係指肽(或含有此種肽之治療性融合體)與CI-MPR結合以便使肽及CI-MPR之平衡朝向藉由其結合形成之複合物之存在偏移的程度。
如本文所用，片語「高親和力」係指例如含有結合CI-MPR之此種肽之治療性融合體，該治療性融合體與CI-MPR具有高於無該肽之治療蛋白約100至1,000倍或500至1,000倍的親和力。在一些實施例中，親和力高於無該肽之至少100、至少500或至少1000倍。舉例而言，當將治療蛋白及CI-MPR以相對相等濃度併入時，具有高親和力之肽將與可獲得的CI-MPR結合以便使平衡朝向高濃度之所得複合物偏移。
在一些情況下，「治療有效量」意謂當向個體投與以用於治療病症時，足以實現對彼病症之治療的量。
如本文所用，術語「約」某數目係指跨越小於該數目之10%至大於該數目之10%，且包括範圍內之值(諸如數目本身)的範圍。
如本文所用，術語「包含」技術方案之一或多個要素係指彼等要素但不排除包括額外一或多個要素。實例
以下實例出於說明本發明之各種實施例之目的給出且不意欲以任何方式限制本發明。該等實例連同本文中所描述之方法當前為較佳實施例之代表，為例示性的且不意欲作為對本發明範疇之限制。熟習此項技術者將想到涵蓋在本發明之精神範圍內、如由申請專利範圍之範疇所限定的其中之變化及其他用途。實例 1 ：變體 IGF2 肽與 CI-MPR 受體 之結合
使用Biacore進行表面電漿子共振(SPR)實驗以量測野生型及變體IGF2 (vIGF2)與CI-MPR受體之結合。野生型人類成熟IGF2肽(wt IGF2)具有SEQ ID NO: 1中闡述之序列。vIGF2序列與wt IGF2之不同之處在於其缺乏殘基1-4且含有以下突變：E6R、Y27L及K65R。其具有胺基序列SRTLCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPARSE (SEQ ID NO: 31)。vIGF2亦具有N端連接子，該N端連接子具有序列GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)。組合序列為GGGGSGGGGSRTLCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPARSE (SEQ ID NO: 43)。圖 4 顯示，如所預期，野生型IGF2肽以高親和力(0.2 nM)與CI-MPR受體結合。圖 5 顯示，變體IGF2肽(vIGF2)亦以高親和力(0.5 nM)與CI-MPR受體結合。此等資料指示，vIGF2肽針對預期CI-MPR受體具有高親和力以用於將療法靶向溶酶體。
使用SPR以量測與胰島素受體結合之肽，以評定潛在副作用。胰島素以高親和力(~8 nM；資料未顯示)結合胰島素受體。測試野生型IGF2及vIGF2，其中vIGF2具有帶有N端連接子之序列SRTLCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPARSE (SEQ ID NO: 31)，該N端連接子具有序列GGGGSGGGG (SEQ ID NO: 18)。圖 8 顯示，野生型IGF2亦以相對較高親和力(~100 nM)結合胰島素受體。來自Biomarin/Zystor IGF2-GAA融合蛋白(BMN-701)之IGF2肽亦以高親和力結合胰島素受體，且顯示在臨床試驗中引起低血糖症。圖 9 顯示vIGF2肽與胰島素受體之可量測結合。此等資料表明，vIGF2肽相較於wt IGF2肽融合體賦予優良安全概況。
使用相同SPR結合分析以表徵vIGF2肽與IGF1受體之相互作用。圖 10 顯示，野生型IGF2以相對較高親和力(~100 nM)結合IGF1受體。圖 11 顯示vIGF2肽與IGF1受體無可量測結合，表明相較於wt IGF2之經改良的安全概況。 實例 2 ： vIGF2 將 CI-MPR 之 低親和力配體轉化為高親和力 ERT
將具有N端連接子(SEQ ID NO: 18)之vIGF2肽(SEQ ID NO: 31)與阿糖苷酶-α化學偶合，在本文中成為vIGF2-阿糖苷酶-α，以測定vIGF2肽是否可改良針對CI-MPR之親和力。如圖 6 中所示，在塗覆有CI-MPR之96孔ELISA盤中使用CI-MPR盤結合分析，直接比較阿糖苷酶-α及vIGF2-阿糖苷酶-α之結合親和力。在量測結合酶活性之前，洗滌掉未結合酶。將變化濃度之兩種酶製劑與或不與游離WT IGF2肽一起使用。vIGF2實質上改良針對CI-MPR之親和力。此外，vIGF2-阿糖苷酶-α之結合由游離WT IGF2阻斷，指示結合為IGF2依賴性的。(資料未顯示。) vIGF2肽之偶合不損害GAA酶活性。
將vIGF2與重組人類N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶(rhNAGLU)偶合。測定肽是否可將非配體轉化為CI-MPR之高親和力配體的RrhNAGLU (缺乏M6P之溶酶體酶)。在此實驗中，使用CI-MPR盤結合分析，使用塗覆CI-MPR之培養盤，直接比較rhNAGLU及vIGF2-rhNAGLU。在量測結合酶活性之前，洗滌掉未結合酶。將變化濃度之兩種酶製劑與或不與游離vIGF2肽一起使用。如圖 7 中所示，vIGF2-rhNAGLU比缺乏vIGF2之rhNAGLU針對CI-MPR具有顯著較高的親和力。此外，vIGF2-rhNAGLU結合由游離vIGF2肽阻斷，指示受體結合對IGF2肽具有特異性。此等結果表明，可使用vIGF2肽來改良至溶酶體之藥物靶向。實例 3 ： vIGF2-GAA 融合蛋白之肌母細胞吸收
投與vIGF2-GAA融合蛋白(與實例1-2中相同之順序)，且量測酶之L6肌母細胞吸收。圖 6 顯示相較於rhGAA及M6P-GAA，vIGF2-rhGAA之優良吸收。因此，vIGF2在將GAA靶向細胞上有效。實例 4 ：藉由基因治療遞送之 ERT 之 構築體
在圖 12 中說明兩種不同構築體。上圖為編碼「天然hGAA」(SEQ ID NO: 45)之構築體，該構築體含有Kozak序列及編碼帶有原生信號肽之重組人類GAA之核酸(SEQ ID NO: 45)。中間圖為編碼「工程改造hGAA」(SEQ ID NO: 23)之構築體Kozak-BiP-vIGF2-2GS-GAA。此構築體之特徵在於Kozak序列、編碼BiP信號肽之核酸、編碼vIGF2肽(其具有SEQ ID NO: 31中闡述之序列)之核酸及編碼2GS連接子(SEQ ID NO: 18)之核酸，隨後編碼重組人類GAA (其中移除N端60個胺基酸以預防過早加工及移除vIGF2)之核酸。實例 5 ：基因治療構築體之增強分泌
工程改造 hGAA 具有較高分泌，且能夠與適合於細胞吸收及溶酶體靶向之細胞表面受體相互作用 培養表現工程改造hGAA(下文更詳細地描述)或天然hGAA之CHO，且收集條件培養基以用於量測GAA活性。圖15顯示工程改造及天然hGAA之相對活性，顯示工程改造hGAA相較於天然hGAA具有增加的活性。實例 6 ：條件培養基中之 PPT1 之分析
PPT1 構築體之選殖 將所有PPT1構築體選殖至含有CMV啟動子之pcDNA3.1表現載體(ThermoFisher，目錄號V79020)中。所測試構築體包括PPT1-1 (WT-PPT1) (SEQ ID NO: 24)、PPT1-2 (WT-vIGF2-PPT1) (SEQ ID NO: 25)、PPT1-29 (BiP2aa-vIGF2-PPT1) (SEQ ID NO: 26)。PPT1 分泌及結合
在HEK293T細胞中暫時表現PPT1構築體3天，且PPT1分泌於培養基中。藉由西方墨點法量化所分泌之PPT1，且使用所建立方法分析CI-MPR結合。
所分泌之PPT1顯示於圖13中。CI-MPR結合顯示於圖14中。
實例 7 ：動物研究方案 GAA 活性
將血漿與5.6 mM 4-MU-α-葡萄哌喃糖苷pH 4.0混合，且在37℃下培育三小時。用0.4 M碳酸鈉pH 11.5終止反應。使用Victor3螢光計，ex 355 nm及在460 nm下發射來量測相對螢光單位RFU。藉由內插法根據4-MU之標準曲線，計算以nmol/mL/hr為單位之活性。基於勻漿中之總蛋白含量，進一步標準化個體組織樣本中之活性。藉由 LC/MS 之 GAA 標誌肽
在100%甲醇中沈澱血漿，且離心。丟棄上清液。對集結粒(pellet)外加對於hGAA獨特之穩定同位素標記之肽作為內標，且將其與胰蛋白酶一起再懸浮，且在37℃下培育一小時。用10%甲酸終止消化。藉由C-18逆相層析分離胰蛋白酶肽，且藉由ESI-質譜分析鑑別及量化。根據標誌肽濃度計算血漿中之總GAA濃度。細胞表面受體結合分析
用受體塗覆96孔培養盤，洗滌且用BSA阻斷。將來自AAV處理小鼠之28天血漿連續稀釋，得到一系列降低濃度，且與偶合受體一起培育。在培育之後，洗滌培養盤，以移除任何未結合hGAA，且在37℃下添加4-MU-α-葡萄哌喃糖苷持續一小時。用1.0 M甘胺酸pH 10.5終止反應，且藉由Spectramax螢光計；ex 370、發射460讀取RFU。藉由內插法，根據4-MU之標準曲線，將每一樣本之RFU'轉化為活性(nmol/mL/hr)。使用GraphPad Prism進行非線性回歸。組織學
對組織進行福馬林固定且石蠟包埋。肌肉切片用PAS染色；CNS切片用luxol快藍/過碘酸-Schiff (PAS)染色。經委員會認證之獸醫學病理學家(JH)盲目地審查組織學切片。在掃描切片上進行具有肝醣儲存及細胞質空泡化之細胞之總百分比的半定量評估。產生0至4之得分，如下表中所描述。 免疫 - 組織化學 (IHC) 吾人根據使用抗-人類GAA抗體(Sigma HPA029126)免疫染色之切片研究轉殖基因表現及細胞定位。
實例 7.1 ：組織學 - 組織加工方案及龐培氏病動物模型中之結果
如上文實例4所描述，製備用於人類重組GAA之轉殖基因表現之構築體。根據研究方案，將所有組織固定於10% NBF (中性緩衝之福馬林)中。常規地使用本領域中之分析(PAS及IHC)。
四頭肌及三頭肌之 PAS 染色 ( 圖 31 及圖 34) ，將組織固定於10% NBF中，且包埋於石蠟中。將切片後固定於1%過碘酸中，且用Schiff試劑染色。隨後，切片用蘇木精複染。肝醣呈現為洋紅色聚集物(結合溶酶體)或擴散性粉紅色(胞質)；核為藍色。基於影像且假設各自表示一組，關於肝醣清除之排名順序為：工程改造hGAA＞天然hGAA。在整個圖像中，工程改造hGAA構築體相較於其餘的產生更多染色，表明經由vIGF2與CI-MPR之結合所介導之GAA蛋白質的內吞作用改良。
脊髓 ( 圖 28) 之 PAS 染色 ，將組織固定於10% NBF中。1%過碘酸中之後固定可在石蠟包埋之前或之後進行。切片用Schiff試劑染色，且可能用亞甲基藍複染。肝醣呈現為洋紅色聚集物(結合溶酶體)；神經纖維呈現藍色。影像聚焦於脊髓之下角及運動神經元中之肝醣積聚。在構築體中，工程改造hGAA在肝醣降低中看起來最有效。
GAA IHC ( 圖 23 、圖 26 、圖 29 、圖 32 及圖 35) ，將組織固定於10% NBF中且包埋於石蠟中。將切片與抗GAA一級抗體一起培育，隨後與識別一級抗體且攜帶酶標記HRP之二級抗體一起培育。隨後，進行酶反應，且形成棕色沈澱產物。隨後，切片用蘇木精複染。構築體顯示GAA吸收至肌纖維中(圖33)。工程改造hGAA＞天然hGAA。在整個圖像中，BiP-vIGF2構築體相較於其餘的具有更多的擴散染色。
相較於其他載體，工程改造hGAA產生更多GAA IHC信號，在肌纖維內部具有斑點樣外觀，表明多許多的有效溶酶體靶向(圖23)。
總之，在構築體中，工程改造hGAA始終表明在各種組織中之組織吸收、溶酶體靶向及肝醣降低中的優越性。
實例 8 ：在龐培氏病動物模型中測試基因治療載體
人類GAA轉殖基因經工程改造以用更高效序列置換原生信號序列，以實現較高蛋白質表現及hGAA之分泌(高於原生信號序列5至10倍)。此外，工程改造轉殖基因經設計以產生含有使得能夠與細胞表面受體高親和力結合以用於有效吸收及遞送至溶酶體之靶向基元的hGAA。一旦在細胞中，藉由西方墨點法，hGAA產物不可與野生型GAA區分，指示恰當地移除靶向基元且酶在溶酶體中正常處理。(資料未顯示。) 此等資料指示，hGAA之較高表現及分泌與有效肌肉靶向之組合可最終轉變為對於龐培氏病之更有效基因治療。
龐培氏基因治療：臨床前概念驗證研究設計
在GAA基因剔除(GAA KO)小鼠中，使用高劑量，進行臨床前研究，以用於構築體之初始比較。構築體顯示於圖16中。小鼠用媒劑或兩個構築體(天然hGAA或工程改造hGAA)中之一者處理。向小鼠投與5e11 gc/小鼠(大致2.5e13 gc/kg)。使用2月齡之GAA基因剔除小鼠。正常(野生型)小鼠用作對照。研究設計概述於圖17中。
龐培氏基因治療：血漿
如所指示自野生型(正常)小鼠或用媒劑或基因治療載體處理之GAA KO小鼠收集血漿，且量測GAA活性及細胞表面結合。資料概述於圖18、圖29及圖20中。在用基因治療載體處理之小鼠看見類似高GAA水準(圖18、圖19)。然而，工程改造構築體觀測到較高細胞靶向受體結合(圖20)。
龐培氏基因治療：四頭肌
在正常(野生型)小鼠及經處理GAA KO小鼠中評定GAA活性及肝醣儲存/細胞質空泡化(圖30)。四頭肌中之GAA活性約高於野生型的20倍。亦評定肝醣PAS (圖31)及免疫組織化學(圖32)。免疫組織化學顯示相較於野生型，工程改造hGAA具有更高溶酶體靶向。藉由PAS染色，工程改造hGAA之肝醣降低更恆定。
龐培氏基因治療：三頭肌
在正常(野生型)小鼠及經處理GAA KO小鼠中評定GAA活性及肝醣儲存/細胞質空泡化(圖33)。GAA活性約高於野生型的10-15倍。亦評定免疫組織化學及肝醣PAS(圖34及圖35)。免疫組織化學說明相較於野生型GAA，工程改造hGAA具有更高溶酶體靶向。如藉由PAS染色所量測，工程改造hGAA之肝醣降低更恆定。
龐培氏基因治療：脛前 (TA)
在正常(野生型)小鼠及經處理GAA KO小鼠中評定GAA活性及肝醣儲存/細胞質空泡化(圖21)。TA中之GAA活性約高於野生型的15-20倍。亦評定免疫組織化學及肝醣PAS(圖22及圖23)。免疫組織化學說明相較於野生型GAA，工程改造hGAA具有更高溶酶體靶向。肝醣水準接近於野生型水準。藉由PAS染色，工程改造hGAA之肝醣降低更恆定。
龐培氏基因治療：大腦及脊髓
在正常(野生型)小鼠及經處理GAA KO小鼠中評定GAA活性、肝醣含量及肝醣儲存/細胞質空泡化(圖24及圖27)。大腦中之GAA活性約低於野生型的5倍。亦評定免疫組織化學及肝醣PAS(圖25、圖26、圖28、圖29)。免疫組織化學指示，可存在直接轉導一些細胞。然而，天然構築體獲得極少至無肝醣清除。工程改造構築體之肝醣水準接近於野生型水準，即使活性僅為野生型之20%。脊髓中之PAS染色顯示天然構築體極少至無肝醣清除。在包括運動神經元之下角中，觀測到工程改造構築體接近於野生型之肝醣水準。免疫組織化學表明脊髓神經元中之直接轉導。由脈絡叢及神經元細胞產生之工程改造hGAA能夠藉由脊髓中之交叉校正而降低肝醣，而對於天然hGAA觀測到極少肝醣降低。
結論
總而言之，此實例中中之資料表明，工程改造基因治療構築體比習知治療中使用之野生型GAA具有大大更佳的吸收至組織中的吸收及肝醣降低，包括大腦及脊髓中之效果。
雖然本文已顯示及描述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將明白，此等實施例僅藉助於實例提供。在不脫離本發明之情況下，熟習此項技術者現將想到諸多變化、變更及取代。應理解，可採用本文所描述之實施例的各種替代方案。預期以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且由此覆蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內之方法及結構。
該專利申請檔案含有至少一個彩製圖。在申請且支付必要費用後，專利局將提供具有彩色圖式之本專利申請案之複本。將參考闡述利用本發明原理之說明性實施例及其附圖的以下詳細描述來獲得對本發明之特徵及優點的理解：圖 1 顯示具有或不具有M6P之阿糖苷酶-α rhGAA之GAA活性。不具有M6P之rhGAA不能靶向溶酶體。然而，具有M6P之rhGAA靶向溶酶體。圖1顯示能夠與CI-MPR結合之市售ERT之比例。第一峰為缺乏任何含有M6P之聚糖且因此不能加以吸收且遞送至溶酶體的rhGAA。第二峰為含有至少一個磷酸化聚糖且具有由細胞吸收且遞送至溶酶體以進行肝醣水解潛能的部分。圖 2 顯示包括IGF2之不同結合域及單磷酸化或雙磷酸化寡醣之CI-MPR的結構。圖 3 顯示IGF2肽(SEQ ID NO: 1) (組A)之序列及結構。提出影響其他受體之結合的位點特異性胺基酸取代(SEQ ID NO: 2-9) (組B)。圖 4 顯示野生型IGF2 (wtIGF2)肽對於CI-MPR之結合動力學，如藉由表面電漿子共振所量測。圖 5 顯示與CI-MPR結合之變體IGF2 (vIGF2)肽的結合，如藉由表面電漿子共振所量測。圖 6 顯示將vIGF2結合基元添加至阿糖苷酶α增加與IGF2/M6P受體結合的益處。圖 7 顯示添加vIGF2/CI-MPR結合基元對於vIGF2-ERT-C融合蛋白之結合及酶活性的益處。圖 8 顯示野生型IGF2與胰島素受體之結合。圖 9 顯示vIGF2肽與胰島素受體之缺乏/降低的結合。圖 10 顯示野生型IGF2與胰島素樣生長因子1受體之結合。圖 11 顯示vIGF2肽與胰島素樣生長因子1受體之缺乏/降低的結合。圖 12 顯示編碼用於基因治療之天然hGAA或vIGF2-GAA (「工程改造hGAA」)融合蛋白之哺乳動物表現盒的兩個實例。天然hGAA具有不佳磷酸化，導致不佳CIMPR結合及細胞吸收。工程改造hGAA具有添加用於改良的CIMPR結合的元件(vIGF2)、降低vIGF2-GAA蛋白與CIMPR之空間位阻的2GS連接子及用於改良分泌的BiP。圖 13 顯示來自表現PPT1及PPT1融合蛋白之細胞之PPT1的西方墨點。圖 14 顯示PPT1構築體與CI-MPR之結合。圖 15 顯示在表現工程改造或天然hGAA之CHO細胞之條件培養基中的GAA活性。圖 16 顯示用於小鼠研究中之包括工程改造或天然hGAA的基因治療構築體。圖 17 顯示在GAA基因剔除小鼠中之4週基因治療小鼠研究的研究設計。圖 18 顯示如所指示未處理野生型(「正常」)小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠中之GAA血漿活性。圖 19 顯示如所指示未處理野生型(「正常」)小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠中量測之GAA水準。圖 20 顯示如所指示來自獲自經處理小鼠之血漿樣本之rhGAA的細胞表面受體結合。圖 21 顯示如所指示未處理野生型(「正常」)小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之脛前的GAA活性及肝醣病理組織學得分。圖 22 顯示如所指示來自未處理野生型小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之脛前的肝醣PAS。圖 23 顯示如所指示來自未處理野生型小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之脛前的hGAA免疫組織化學。圖 24 顯示如所指示來自未處理野生型(「正常」)小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之大腦的GAA活性。圖 25 顯示如所指示來自未處理野生型小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之大腦的肝醣PAS。圖 26 顯示如所指示來自未處理野生型(「正常」)小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之腦幹及脈絡叢的hGAA免疫組織化學。圖 27 顯示如所指示來自未處理野生型(「正常」)小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之脊髓肝醣病理組織學計分。圖 28 顯示如所指示來自未處理野生型小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之脊髓的肝醣PAS。圖 29 顯示如所指示來自未處理野生型小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之脊髓的hGAA免疫組織化學。圖 30 顯示如所指示來自未處理野生型(「正常」)小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之四頭肌GAA活性及肝醣病理組織學計分。圖 31 顯示如所指示來自未處理野生型小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之四頭肌的肝醣luxol/PAS。圖 32 顯示如所指示來自未處理野生型小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之四頭肌的hGAA免疫組織化學。圖 33 顯示如所指示來自未處理野生型(「正常」)小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之三頭肌GAA活性及病理組織學計分。圖 34 顯示如所指示來自未處理野生型小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之三頭肌的肝醣luxol/PAS。圖 35 顯示如所指示來自未處理野生型小鼠或用基因治療載體或媒劑處理之GAA基因剔除小鼠之三頭肌的hGAA免疫組織化學。圖 36 顯示配送治療蛋白之物理及生物學障壁之說明。
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<211> 67
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Figure 108115137-A0305-02-0110-1
<210> 2
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列：合成多肽之描述
<400> 2
Figure 108115137-A0305-02-0110-2
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
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Figure 12_A0101_SEQ_0031

Claims (19)

  1. 一種基因治療載體，其包含一核酸構築體，該核酸構築體編碼一多肽，該多肽包含：(a)一治療蛋白，(b)一肽，該肽結合至陽離子非依賴性甘露糖6-磷酸(M6P)受體(CI-MPR)，其中該肽為一包括SEQ ID NO：31的序列的變體IGF2(vIGF2)肽；(c)一連接子，在該治療蛋白與結合CI-MPR的該肽之間；及(d)一信號肽，該信號肽選自一結合免疫球蛋白蛋白(BiP)信號肽及一Gaussia信號肽。
  2. 如請求項1之基因治療載體，其中該治療蛋白能夠置換一患有一遺傳病症個體中與該遺傳病症相關之一缺陷或缺乏蛋白。
  3. 如請求項2之基因治療載體，其中該遺傳病症為一溶酶體貯積病。
  4. 如請求項2之基因治療載體，其中該遺傳病症係選自由以下組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症(aspartylglucosaminuria)、貝敦氏病(Batten disease)、胱胺酸症、法布立病(Fabry disease)、I型戈謝病(Gaucher disease type I)、II型戈謝病、III型戈謝病、龐培氏病(Pompe disease)、泰-薩克斯病(Tay Sachs disease)、桑多霍夫病(Sandhoff disease)、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、II型黏脂貯積症、III型黏脂貯積 症、IV型黏脂貯積症、賀勒病(Hurler disease)、亨特病(Hunter disease)、A型聖菲利波病(Sanfilippo disease type A)、B型聖菲利波病、C型聖菲利波病、D型聖菲利波病、A型莫奎病(Morquio disease type A)、B型莫奎病、馬羅托-拉米病(Maroteau-Lamy disease)、斯利病(Sly disease)、A型尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease type A)、B型尼曼-匹克病、C1型尼曼-匹克病、C2型尼曼-匹克病、I型辛德勒病(Schindler disease type I)、II型辛德勒病、腺苷脫胺酶嚴重合併性免疫缺失(ADA-SCID)、慢性肉芽腫病(CGD)及神經元蠟樣質脂褐質沈積症。
  5. 如請求項2之基因治療載體，其中該遺傳病症為龐培氏病。
  6. 如請求項2之基因治療載體，其中該遺傳病症為CLN1病。
  7. 如請求項1之基因治療載體，其中該治療蛋白包括一可溶性溶酶體酶。
  8. 如請求項1之基因治療載體，其中該治療蛋白包含一溶酶體酶，其中該溶酶體酶選自由以下組成之群：α-半乳糖苷酶A、β-葡糖腦苷脂酶、葡糖腦苷脂酶、溶酶體酸性脂肪酶、葡糖胺聚糖α-L-艾杜糖醛水解酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙醯基半乳胺糖-6-硫酸酯酶、葡糖胺聚糖N-乙醯基半乳胺糖4-硫酸酯酶、軟脂醯基蛋白質硫酯酶、細胞週期素依賴性激酶樣5及α-葡糖苷酶。
  9. 如請求項8之基因治療載體，其中該治療蛋白為α-葡糖苷酶。
  10. 如請求項8之基因治療載體，其中該治療蛋白為軟脂醯基蛋白質硫酯酶。
  11. 如請求項1之基因治療載體，其中該核酸構築體進一步包含一轉譯起始序列。
  12. 如請求項1之基因治療載體，其中該構築體包含SEQ ID NO：36。
  13. 如請求項1之基因治療載體，其中該多肽包含SEQ ID NO：23。
  14. 如請求項1之基因治療載體，其中該構築體包含SEQ ID NO：38。
  15. 如請求項1之基因治療載體，其中該vIGF2肽在該多肽的N端。
  16. 如請求項1之基因治療載體，其中該vIGF2肽在該多肽的C端。
  17. 如請求項1之基因治療載體，其中該連接肽包含SEQ ID NO：18至21或SEQ ID NO：33。
  18. 如請求項1之基因治療載體，其中該基因治療載體為一選自由以下組成之群的病毒載體：腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、反轉錄病毒載 體、慢病毒載體、痘病毒載體、牛痘病毒載體(vaccinia virus vector)、腺病毒載體與疱疹病毒載體。
  19. 如請求項1之基因治療載體，其中該治療蛋白選自由以下組成之群：N-乙醯基-α-D-胺基葡糖苷酶、α-葡糖苷酶與軟脂醯基蛋白質硫酯酶。
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