TWI806870B - 抗pd-1抗體及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供抗PD-1抗體或其片段。在各種實例中，所述抗體或其片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3選自下列所組成之群：(a) HCDR1: GFTFSSYT (SEQ ID NO: 1)、HCDR2: ISHGGGDT (SEQ ID NO: 2)、HCDR3: ARHSGYERGYYYVMDY (SEQ ID NO: 3)、LCDR1: ESVDYYGFSF (SEQ ID NO: 4)、LCDR2: AAS (SEQ ID NO: 5)、LCDR3: QQSKEVPW (SEQ ID NO: 6)；(b) HCDR1: GYTFTSYT (SEQ ID NO: 7)、HCDR2: INPTTGYT (SEQ ID NO: 8)、HCDR3: ARDDAYYSGY (SEQ ID NO: 9)、LCDR1: ENIYSNL (SEQ ID NO: 10)、LCDR2: AAK (SEQ ID NO: 11)、LCDR3: QHFWGTPWT (SEQ ID NO: 12)；和(c) HCDR1: GFAFSSYD (SEQ ID NO: 13)、HCDR2: ITIGGGTT (SEQ ID NO: 14)、HCDR3: ARHRYDYFAMDN (SEQ ID NO: 15)、LCDR1: ENVDNYGINF (SEQ ID NO: 16)、LCDR2: VSS (SEQ ID NO: 17)、LCDR3: QQSKDVPW (SEQ ID NO: 18)。本發明還提供了使用所述抗體或其片段來治療和診斷諸如癌症、感染或免疫疾病等疾病的方法。

Description

抗PD-1抗體及其用途

本發明係關於對人程式性細胞死亡蛋白1(PD-L1)具有特異性的經分離抗體或其片段及其用途。

程式性細胞死亡1(PD-1)的cDNA於1992年從經歷細胞凋亡的小鼠T細胞融合瘤及造血先驅細胞株中分離出。基因切除(genetic ablation)研究顯示，PD-1的缺陷在多種小鼠品系中導致不同的自體免疫表型。具有轉基因T細胞受體(TCRs)的PD-1缺陷的同種異體T細胞對同種抗原(alloantigen)表現出增強的反應，表明T細胞上的PD-1對抗原之反應起負調節作用。

幾項研究對發現與PD-1相互作用的分子有所貢獻。在1999年，B7同源物1(B7 H1，也稱為程式性死亡配體1[PD-L1])，基於其與B7家族分子的同源性，利用分子選殖和人類表現序列標籤資料庫檢索，從PD-1獨立地被鑒定出來，並顯示B7 H1作為在活體外作用為T細胞反應的抑制劑。一年後，這兩個獨立的研究線相互印證，當時Freeman、Wood和Honjo的實驗室表明，B7 H1(以下稱為PD-L1)是PD-1的結合和功能性配偶體(partner)。接下來，確定PD-L1缺陷小鼠(PD-L1-KO小鼠)易於被誘導自身免疫性疾病，儘管這一小鼠品系沒有自發地發展出這樣的疾病。之後，闡明了PD-L1/PD-1相互作用在活體內抑制T細胞反應中 起著主導作用，特別是在腫瘤微環境中。

初步研究顯示，腫瘤相關的PD-L1促進了活化的T細胞的凋亡(Dong H.等，Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis：a potential mechanism of immune evasion.Nature medicine.2002；8(8)：793-800)，並且還刺激人周邊血T細胞中的IL-10產生(Dong H等，B7-H1,a third member of the B7 family,co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.Nature medicine.1999；5(12)：1365-9)以介導免疫抑制。目前已知PD-L1對免疫抑制的作用要複雜得多。除了T細胞凋亡和IL-10誘導外，PD-L1還可以藉由多種機制誘導T細胞功能障礙。在活體外和活體內，PD途徑也顯示出促進T細胞無能(anergy)。

最近，FDA批准了兩種PD-1 mAb來治療人類癌症，其中一種來自施貴寶(OpDivo，nivolumab,MDx1106，BMS-936558，ONO-45 38)，另一種來自默克(Keytruda,pembrolizumab,lambrolizumab，MK-3475)。此外，多個PD-1或PD-L1的mAb正在數以百計的牽涉數以千計的患者的臨床試驗中積極開發。迄今為止，抗PD治療藉由誘導晚期和轉移性腫瘤的消退(regression)和提高生存率而產生顯著的臨床益處。更重要的是，抗PD治療可以具有持久的效果，可耐受的毒性，並顯示適用於廣譜的癌症類型，特別是實體腫瘤。這些臨床發現進一步證實了PD通路阻斷的原理，並將抗PD治療置於與個人化或腫瘤類型特異性治療不同的獨特類別中。由於其獨特的和與其他癌症治療非重疊的機制，人們正將抗PD治療的方式與幾乎所有的癌症治療方法相結合，以試圖進一步擴大治療效力。除了與多種癌症免疫治療方法(如癌症疫苗、共刺激和共抑制抗體和過繼性細胞治療)相結合外還起始了各種臨床 試驗以將抗PD治療與化療、放療和靶向治療相結合。

抗PD治療在人類癌症特別是實體腫瘤的免疫治療中處於中心地位。這種療法不同於以前的免疫治療劑──其主要目的是增強全身免疫反應或產生對癌症的新免疫力；相反，抗PD治療調節腫瘤部位的免疫反應，靶向治療腫瘤誘導的免疫缺陷，並修復正在進行的免疫反應。雖然抗PD治療在治療多種人類癌症方面的臨床成功已經證實了這種方法，但我們仍在研究這一途徑和相關的免疫反應，這將有助於發現和設計新的臨床可應用的癌症免疫治療方法。

本發明提供了抗PD-1抗體，其對PD-1蛋白呈現良好的結合和抑制活性。其中的一個經測試甚至比兩個經監管批准的抗PD-1抗體產物顯示更強的結合活性。

因此，根據本發明的一個具體實施例，提供了一種對人類程式性細胞死亡蛋白1(PD-L1)具有特異性的經分離抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3選自下列所組成之群：(a)HCDR1：GFTFSSYT(SEQ ID NO：1)，HCDR2：ISHGGGDT(SEQ ID NO：2)，HCDR3：ARHSGYERGYYYVMDY(SEQ ID NO：3)，LCDR1：ESVDYYGFSF(SEQ ID NO：4)，LCDR2：AAS(SEQ ID NO：5)，LCDR3：QQSKEVPW(SEQ ID NO：6)；(b)HCDR1：GYTFTSYT(SEQ ID NO：7)，HCDR2：INPTTGYT(SEQ ID NO：8)，HCDR3： ARDDAYYSGY(SEQ ID NO：9)，LCDR1：ENIYSNL(SEQ ID NO：10)，LCDR2：AAK(SEQ ID NO：11)，LCDR3：QHFWGTPWT(SEQ ID NO：12)；and(c)HCDR1：GFAFSSYD(SEQ ID NO：13)，HCDR2：ITIGGGTT(SEQ ID NO：14)，HCDR3：ARHRYDYFAMDN(SEQ ID NO：15)，LCDR1：ENVDNYGINF(SEQ ID NO：16)，LCDR2：VSS(SEQ ID NO：17)，LCDR3：QQSKDVPW(SEQ ID NO：18)。

在一些具體實施例中，本發明的抗體或片段還包括重鏈恒定區、輕鏈恒定區、Fc區或其組合。在一些具體實施例中，輕鏈恒定區是κ鏈或λ鏈恒定區。

在一些具體實施例中，所述抗體或其片段可以是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的同種型(isotype)。在一些具體實施例中，所述同種型為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些具體實施例中，所述抗體或其片段是嵌合抗體、人源化抗體或全人源抗體(fully human antibody)。

在一些具體實施例中，所述抗體或其片段包含重鏈可變區，所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：39具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。在一些具體實施例中，所述抗體或其片段包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：45具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。

在另一個具體實施例中，本發明提供一種對人類程式性細 胞死亡蛋白1(PD-L1)具有特異性的經分離抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3選自下列所組成之群：(a)HCDR1：GFTFSSYT(SEQ ID NO：1)，HCDR2：ISHGGGDT(SEQ ID NO：2)，HCDR3：ARHSGYERGYYYVMDY(SEQ ID NO：3)，LCDR1：ESVDYYGFSF(SEQ ID NO：4)，LCDR2：AAS(SEQ ID NO：5)，LCDR3：QQSKEVPW(SEQ ID NO：6)；(b)HCDR1：GYTFTSYT(SEQ ID NO：7)，HCDR2：INPTTGYT(SEQ ID NO：8)，HCDR3：ARDDAYYSGY(SEQ ID NO：9)，LCDR1：ENIYSNL(SEQ ID NO：10)，LCDR2：AAK(SEQ ID NO：11)，LCDR3：QHFWGTPWT(SEQ ID NO：12)；(c)HCDR1：GFAFSSYD(SEQ ID NO：13)，HCDR2：ITIGGGTT(SEQ ID NO：14)，HCDR3：ARHRYDYFAMDN(SEQ ID NO：15)，LCDR1：ENVDNYGINF(SEQ ID NO：16)，LCDR2：VSS(SEQ ID NO：17)，LCDR3：QQSKDVPW(SEQ ID NO：18)；和(d)如(a)-(c)所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，但至少其中一個包含一個、兩個或三個胺基酸添加、缺失、保守胺基酸取代或其組合。

在一些具體實施例中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)中的任一項所示，但其中之一包括保守胺基酸取代。在一些具體實施例中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)中的任一項所示，但 其中兩個每個均包含保守胺基酸取代。在一些具體實施例中，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3如(a)-(c)中的任一項所示，但其中三個每個均包含保守胺基酸取代。

在一個具體實施例中還提供了包含本發明的抗體或其片段和藥學上可接受的載體的組合物。在一個具體實施例中，還提供了一種經分離細胞，其包含編碼所述抗體或其片段的一個或多個多核苷酸。

本發明還提供了用途和方法。在一個具體實施例中，提供了本發明的抗體或其片段在製備用於治療癌症的藥物中的用途。所述癌症可選自下列所組成之群：膀胱癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、頭頸部癌、胃腸道癌(gastrointestinal cancer)、胃癌、食道癌、卵巢癌、腎癌、黑色素瘤、前列腺癌和甲狀腺癌。還提供了治療有需要的患者的癌症的方法，包括向所述患者施用本發明的抗體或其片段。

在另一個具體實施例中，本發明提供了治療有需要的患者的癌症或感染的方法，包括(a)以本發明的抗體或其片段在活體外處理細胞；和(b)將處理過的細胞施用於患者。在一些具體實施例中，所述細胞是T細胞。

在另一個具體實施例中，提供了本發明的任何一種抗體或其片段在製備用於治療感染的藥物中的用途。在一些具體實施例中，所述感染是病毒感染、細菌感染、真菌感染或寄生蟲感染。

在另一個具體實施例中，提供了本發明的抗體或其片段在製備用於治療免疫病症的藥物中的用途。在一些具體實施例中，所述免疫病症選自感染、與感染相關的內毒素休克、關節炎、類風濕性關節炎、哮 喘、COPD、盆腔炎性疾病、阿爾茨海默(Alzheimer's)病、炎性腸病、克羅恩(Crohn's)病、潰瘍性結腸炎、佩羅尼氏(Peyronie's病、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛病(Pilonidal disease)、腹膜炎、牛皮癬、血管炎、手術粘連、中風、I型糖尿病、萊姆病、關節炎、腦膜腦炎、自體免疫性葡萄膜炎、免疫介導的中樞和周邊神經系統炎性疾病、多發性硬化、狼瘡和格林-巴利(Guillain Barr)綜合症、異位性皮膚炎、自體免疫性肝炎、纖維性肺泡炎、葛瑞夫茲氏(Grave's)病、IgA腎病、特發性血小板減少性紫癜、梅尼爾氏(Meniere's)病、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、結節病、硬皮病、韋格納肉芽腫、胰腺炎、創傷、移植物抗宿主病、移植排斥反應、缺血性疾病、心肌梗死、動脈粥樣硬化、血管內凝血、骨吸收、骨質疏鬆、骨關節炎、牙周炎、胃酸過少和與母胎(fetal-maternal)免疫耐受缺失有關的不孕。

圖1顯示所有五個hPD-1 mAb同種型均可與hPD-1以高特異性結合。

圖2顯示抗hPD-1不與hB7-1、hPD-L1、hB7-H3、hB7-H4和hCD137結合。

圖3顯示hPD-1 mAb可與人和食蟹猴細胞PD-1蛋白二者結合，而不顯示與mPD-1的交叉結合。

圖4顯示hPD-1 mAb對hPD-1與hPD-L1的結合具有劑量依賴的阻斷作用。

圖5顯示在競爭性結合環境中觀察時，hPD-1 mAb的消除(abrogating)和阻斷作用。

圖6顯示凝膠電泳分析確認RACE產物的的結果。

圖7顯示(A)重組DNA抗體結合PD-1的能力，以及(B)它們對PD-1與PD-L1結合能力的阻斷作用。

圖8顯示九種人源化抗體呈現了與PD-1的各種結合親和力，包括高於和低於親本抗體的親和力。

圖9顯示人源化抗體可對PD-1與PD-L1的結合能力具有阻斷作用。

圖10顯示人源化抗體可對PD-1與PD-L2的結合能力具有阻斷作用。

圖11顯示人源化mAb增強同種異體CD8+CTL細胞對癌細胞的活體外細胞毒性。

圖12顯示MLR對抗hPD-1抗體的增殖反應。

圖13顯示MLR培養上清液中的IL-2和IFNγ表現。

圖14顯示PD-1 mAb抑制淋巴細胞中PD-L1的表現。

圖15顯示了人源化PD-1抗體的活體內抗腫瘤活性。

圖16示出了抗體結合親和力和動力學的比較。

圖17顯示PD-1抗體在PD-1/PD-L1阻斷中的比較。

圖18顯示mAb在增強同種異體CD8+CTL細胞對癌細胞的活體外細胞毒性中的比較。

圖19顯示測試製品與hPD-1或mPD-1的結合(ELISA測定)。

圖20使用流式細胞術顯示測試製品針對表現hPD-1-或cPD-1的CHOK1細胞的結合。

圖21顯示測試製品對hPD-L1(左)和hPD-L2(右)結合表現hPD-1的CHOK1細胞的阻斷活性。

圖22在人MLR測定中顯示人的IL-2(左)和IFN-γ(右)濃度。

圖23顯示在工程化腫瘤和T細胞共培養測定中的IFN-γ濃度。

圖24顯示根據ELISA的抗原決定基結合結果(上圖)和不同測試製品的抗原決定基重疊概略圖(下圖)。

圖25(a)至25(d)顯示納武(Nivolumab)((a)與(b))或TY101-04-T3-05((c)與(d))抗體在低固定濃度(60RU，(a)與(c))和高固定濃度(960RU，(b)與(d))下與重組hPD-1的結合。

定義

要注意的是，術語“一”或“一個(種)”實體指的是一個(種)或多個(種)該實體；例如，“一個(種)抗體”被理解為代表一個(種)或多個(種)抗體。因此，術語“一”(或“一個(種)”)、“一個(種)或多個(種)”和“至少一個(種)”可以在本文中互換使用。

如本文所使用的，術語“多肽”意在包括單數的“多肽”和複數的“多肽”，並指由醯胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(胺基酸)構成的分子。術語“多肽”指的是兩個或多個胺基酸的任何一個或多個鏈，而不涉及該產物的特定長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質”、“胺基酸鏈”或用於指兩個或更多胺基酸的一個或多個鏈的任何其他術語都包括在“多肽”的定義中，而術語“多肽”可以代替這些術語中的任何一個或 與其互換使用。術語“多肽”還意指多肽的後表現修飾的產物，包括但不限於糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、已知保護/阻斷基團的衍生化、蛋白水解裂解或由非天然存在的胺基酸的修飾。多肽可來源於天然生物來源或由重組技術產生，但不一定必須從指定的核酸序列轉譯。它可以以任何方式產生，包括藉由化學合成。

本文所用的術語“經分離(isolated)”對於細胞、核酸(如DNA或RNA)而言，是指與存在於所述大分子的天然來源中的其他相應的DNA或RNA分開的分子。本文所用的“經分離”一詞也指下述核酸或肽：當其藉由重組DNA技術產生時，基本上不含細胞材料、病毒材料或培養基，或當其藉由化學合成產生時，基本上不含化學前體或其他化學物質。此外，“經分離核酸”意在包括不作為片段天然存在的和不會見於天然狀態的核酸片段。術語“經分離”也用於指從其他細胞蛋白質或組織中分離出來的細胞或多肽。經分離多肽意在涵蓋純化的和重組的多肽二者。

如本文所使用的，術語“重組的”當與多肽或多核苷酸有關時，意指不天然存在的多肽或多核苷酸的形式，它的非限制性實例可以藉由合併通常不一同存在的多核苷酸或多肽來構建。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指兩個肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。同源性可以藉由比較每個序列中的位置來確定，所述位置可經比對以便於比較。當比較序列中的位置被相同的鹼基或胺基酸佔據時，則這些分子在該位置上是同源的。序列之間的同源程度是所述序列所共用的匹配或同源位置的數目的函數。一個“不相關的”或“非同源的”序列與本發明的序列中的一個相比，具有小於40%的同一性，儘管較佳小於25%的同一性。

多核苷酸或多核苷酸區(或多肽或多肽區)與另一個序列具有“序列同一性”的特定百分比(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)意味著，當比對時，該百分比的鹼基(或氨基)在兩個序列的比較中是相同的。這種比對和同源性或序列同一性的百分比可以使用本領域已知的軟體程式來確定，例如在Ausubel等人編，(2007)Current Protocols in Molecular Biology中描述的那些。較佳地，比對使用預定參數。一個比對程式是BLAST，使用預設參數。特別地，程式是BLASTN和BLASTP，使用以下預定參數：Genetic code=standard；filter=none；strand=both；cutoff=60；expect=10；Matrix=BLOSUM62；Descriptions=50 sequences；sort by=HIGH SCORE；Databases=non-redundant,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。生物等效多核苷酸是具有上述指定百分比同源性並編碼具有相同或相似生物活性的多肽者。

“等效核酸或多核苷酸”是指具有與所述核酸或其互補物的核苷酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的核苷酸序列的核酸。雙鏈核酸的同源物旨在包括具有下述核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列與其或其互補物具有一定程度的同源性。在一個方面，核酸的同源物能夠與核酸或其互補物雜交。同樣，“等效多肽”是指與參考多肽的胺基酸序列具有一定程度的同源性或序列同一性的多肽。在一些方面，序列同一性至少為約70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。在一些方面，與參考多肽或多核苷酸相比，等效多肽或多核苷酸具有一個、兩個、三個、四個或五個添加、缺失、取代及其組合。在某些方面，等效序列保留 了參考序列的活性(例如抗原決定基結合)或結構(例如，鹽橋)。

雜交反應可在不同“嚴格”條件下進行。通常，在約40℃下在約10 x SSC，或等價離子強度/溫度的溶液中進行低嚴格雜交反應。中等嚴格雜交通常在約6 x SSC在約50℃進行，高嚴格雜交反應通常在約1 x SSC在約60℃進行。雜交反應也可以在“生理條件”下進行，這是本領域技術人員所熟知的。生理條件的一個非限制性的例子是通常見於細胞中的溫度、離子強度、pH和Mg²⁺的濃度。

多核苷酸由腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)(在多核苷酸為RNA時替換胸腺嘧啶)四種核苷酸鹼基的特定序列構成。因此，術語“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。該字母表示可以被輸入到具有中央處理單元的電腦中的資料庫中，並用於生物資訊學應用，如功能基因組學和同源性搜索。術語“多態性(polymorphism)”指的是基因或其一部分的一種以上形式的共存。有至少兩種不同形式，即兩種不同的核苷酸序列的基因的一部分，被稱為“基因的多態性區域”。多態性區域可以是單核苷酸，其身份在不同的等位基因上不同。

術語“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用，是指任何長度的核苷酸的聚合形式，其可為去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可以具有任何三維結構，並且可以執行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段(例如探針、引子、EST或SAGE標籤)、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重組多核苷酸、支化多核苷酸、質體、載體、任何序列的經分離DNA、任何序 列的經分離RNA、核酸探針和引子。多核苷酸可以包括修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，可以在組裝多核苷酸之前或之後賦予核苷酸結構的修飾。核苷酸序列可以被非核苷酸組分打斷。多核苷酸可以在聚合後進一步修飾，例如藉由與標記成分結合。該術語也指雙鏈和單鏈分子二者。除非另有規定或要求，本發明的任何一個多核苷酸的具體實施例，既包括雙鏈形式，也包括已知或預期形成雙鏈形式的兩種互補的單鏈形式中的任何一個。

“編碼”一詞應用於多核苷酸是指多核苷酸，如果在其原生狀態，或當以本領域技術人員熟知的方法操縱時，其可以被轉錄和/或轉譯以產生多肽和/或其片段的mRNA，則稱其為“編碼”多肽。反義鏈是這種核酸的互補物，編碼序列可以由此推斷。

如本文所用，“抗體”或“抗原結合多肽”是指特異識別和結合抗原的多肽或多肽複合物。抗體可以是完整的抗體及其任何抗原結合片段或單鏈。因此，“抗體”一詞包括任何含有蛋白質或肽的分子，該分子包含至少一部分具有與抗原結合的生物活性的免疫球蛋白分子。這樣的實例包括但不限於重鏈或輕鏈或其配體結合部分的互補決定區(CDR)、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恒定區、框架(FR)區或其任何部分，或結合蛋白的至少一部分。

本文所用的“抗體片段”或“抗原結合片段”是抗體的一部分，如F(ab')₂、F(ab)₂、Fab'、Fab、Fv、scFv等。不管結構如何，抗體片段與完整抗體所識別的相同抗原結合。術語“抗體片段”包括適體(aptamers)、spiegelmers、雙鏈抗體(diabodies)。術語“抗體片段”還包括藉由與特定抗原結合形成複合物來發揮抗體的作用的任何合成的或 基因工程化的蛋白。

“單鏈可變片段”或“scFv”是指免疫球蛋白重鏈(V_H)和輕鏈(V_L)可變區的融合蛋白。在一些方面，這些區域用十個至約25個胺基酸的短連接子肽連接。該連接子可以富含甘胺酸以助於柔性，以及絲胺酸或蘇胺酸以助於溶解度，並且可以將V_H的N端連接到V_L的C端，或者反之亦然。儘管除去恒定區和引入連接子，該蛋白仍保留原免疫球蛋白的特異性。scFv分子在本領域中是已知的，並描述於，例如美國專利第5892019號。

術語“抗體”包括各種廣泛類型的多肽，它們可以生物化學地區別開來。本領域的技術人員知道重鏈被歸類為γ、μ、α、δ或ε，其中有一些亞類(如γ1-γ4)。正是這種鏈的性質決定了抗體的“類別”分別為IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等已充分表徵，並且已知其賦予功能專一性。從本發明的角度來看，這些類別和同種型中的每一個的修飾型式很容易由本領域技術人員辨別，因此，它們也涵蓋在本發明的範圍內。所有的免疫球蛋白類型顯然都在本發明的範圍之內，下面的討論通常會指向免疫球蛋白分子的IgG類。關於IgG，標準的免疫球蛋白分子包括分子量約為23000道爾頓的兩個相同的輕鏈多肽，和分子量為53000~70000的兩個相同的重鏈多肽。這四個鏈通常由二硫鍵連接在一個“Y”構型中，其中輕鏈從“Y”口開始並繼續在整個可變區上包夾著重鏈。

本發明的抗體、抗原結合多肽、其變體或衍生物包括但不限於多株、單株、多特異性、人源、人源化、靈長類化或嵌合抗體、單鏈抗體、抗原決定基結合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')₂、Fd、Fv、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv(sdFv)、包含VK或VH結構域的片段、由Fab表現文庫產生的片段和抗獨特型(抗Id)抗體(包括針對本文中公開的LIGHT抗體的抗Id抗體)。本發明的免疫球蛋白或抗體分子可以是免疫球蛋白分子的任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。

輕鏈分為κ或λ。每個重鏈類別可以與κ或λ輕鏈結合。一般來說，輕鏈和重鏈是彼此共價鍵合的，且當免疫球蛋白由融合瘤、B細胞或基因工程化的宿主細胞產生時，兩個重鏈的“尾部”部分藉由共價二硫鍵或非共價鍵鍵合。在重鏈中，胺基酸序列從Y結構的叉端的N端直到每個鏈的底部的C端。

輕鏈和重鏈都分為結構和功能同源的區域。術語“恒定”和“可變”在功能上使用。在這方面，咸知輕(VK)和重(VH)鏈部分的可變結構域確定抗原識別和特異性。相反，輕鏈恒定結構域(CK)和重鏈恒定結構域(CH1，CH2或CH3)賦予了重要的生物學特性，如分泌、胎盤遷移率(transplacental mobility)、Fc受體結合、補體結合等。按照慣例，恒定區域的編號隨著其遠離抗原結合位點或抗體的胺基末端而增加。N端部分是可變區，而C端部分是恒定區；CH3和CK結構域實際上分別包含重鏈和輕鏈的羧基末端。

如上所述，可變區允許抗體選擇性地識別和特異性結合抗原上的抗原決定基。也就是說，抗體的VK結構域和VH結構域或互補決定區(CDR)的子集結合在一起形成定義三維抗原結合位點的可變區。該四級抗體結構形成在Y的每個臂的末端存在的抗原結合位點。更具體地，抗原結合位點由VH和VK鏈中的每個上的3個CDR(即CDR-H1、CDR- H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)定義。在一些情況下，例如來源於駝類物種的某些免疫球蛋白分子或基於駝類免疫球蛋白的工程化免疫球蛋白，完整的免疫球蛋白分子可以僅由重鏈組成，沒有輕鏈。參見，例如，Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-448(1993)。

在天然存在的抗體中，存在於每個抗原結合域的六個“互補決定區”或“CDR”是短的、非相連的胺基酸序列，當抗體在水性環境中形成其三維構型時，這些序列特異性地定位形成抗原結合域。抗原結合域中的其餘胺基酸稱為“框架”區，顯示較少的分子間變異性。框架區大部分形成一個β-層疊構象，而CDR形成環，所述環連接，並且在某些情況下形成β-層疊結構的一部分。因此，框架區域起到形成支架的作用，所述支架藉由鏈間、非共價相互作用提供CDR在正確方向上的定位。由定位的CDR形成的抗原結合域限定了與免疫反應性抗原上的抗原決定基互補的表面。該互補表面促進抗體與其識別的抗原決定基的非共價結合。分別構成CDR和框架區的胺基酸對於任何給定的重鏈或輕鏈可變區可以由本領域的通常技術人員容易地識別出，因為它們已被精確定義(參見“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”Kabat,E.等，U.S.Department of Health and Human Services,(1983)；和Chothia和Lesk,J.MoI.Biol.,196：901-917(1987)。

在存在本領域中使用和/或接受的術語的兩個或多個定義的情況下，本文中所使用的術語的定義意在包括所有這些含義，除非明確地指示相反的含義。一個具體的例子是使用“互補決定區”(“CDR”)來描述在重鏈和輕鏈多肽的可變區內發現的非相連抗原結合位點。Kabet等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983)和Chothia等人，J.MoI.Biol.196：901-917(1987)(其全文引用併入本文)描述了這個特定的區域。根據Kabat和Couthia的CDR定義包括將其相互比較時，胺基酸殘基的重疊或其子集。然而，應用任一定義來指抗體或其變體的CDR，其均旨在包含於本文定義和使用的術語的範圍內。涵蓋上述引用的每一個定義的CDR的適當胺基酸殘基在下表中列出作為比較。涵蓋特定CDR的確切殘基數會根據CDR的序列和大小而變化。根據抗體的可變區胺基酸序列，本領域技術人員可以常規地確定哪些殘基構成特定的CDR。

Kabet等人還定義了適用於任何抗體的可變域序列的編號系統。本領域的普通技術人員可以毫無疑義地將該“Kabat編號”系統分配給任何可變域序列，而不依賴於除序列本身之外的任何實驗資料。如本文所使用的，“Kabat編號”指的是Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的編號系統。

除上表外，Kabat編號系統描述CDR區域如下：CDR-H1起始於大約胺基酸31(即，在第一半胱胺酸殘基之後大約9個殘基)，包括大約5-7個胺基酸，並在下一個色胺酸殘基處結束。CDR-H2開始於 CDR-H1結束後的第十五個殘基，包括約16-19個胺基酸，並在下一個精胺酸或賴胺酸殘基處結束。CDR-H3開始於CDR-H2結束後的大約第三十三個胺基酸殘基；包含3-25個胺基酸；並且在W-G-X-G序列處結束，其中X是任何胺基酸。CDR-L1開始於大約殘基24(即，在半胱胺酸殘基之後)；包括大約10-17個殘基；並且在下一個色胺酸殘基處結束。CDR-L2大約在CDR-L1結束後的第十六個殘基開始，並且包含大約7個殘基。CDR-L3開始於CDR-L2(即半胱胺酸殘基)結束後的大約第三十三個殘基；包括大約7-11個殘基和在序列F或W-G-X-G結束，其中X是任何胺基酸。

本文公開的抗體可來自任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物。較佳地，抗體是人、鼠、驢、兔、山羊、豚鼠、駱駝、羊駝、馬或雞抗體。在另一個具體實施例中，可變區域可以是來源於軟骨魚類(例如，來自鯊魚)。

如本文所使用的，術語“重鏈恒定區”包括源自免疫球蛋白重鏈的胺基酸序列。含有重鏈恒定區的多肽包含CH1結構域、鉸鏈(例如，上、中、和/或下鉸鏈區)域、CH2結構域、CH3結構域或其變體或片段中的至少一個。例如，供在本發明中使用的抗原結合多肽可以包括包含CH1結構域的多肽鏈；包含CH1結構域、至少一部分鉸鏈結構域和CH2結構域的多肽鏈；包含CH1結構域和CH3結構域的多肽鏈；包含CH1結構域、至少一部分鉸鏈結構域和CH3結構域的多肽鏈，或包含CH1結構域、至少一部分鉸鏈結構域、CH2結構域和CH3結構域的多肽鏈。在另一個具體實施例中，本發明的多肽包括包含CH3結構域的多肽鏈。此外，供本發明中使用的抗體可能缺乏CH2結構域的至少一部分(例如，CH2結構域的 全部或部分)。如上所述，本領域的通常技術人員會理解，重鏈恒定區可以被修改，使得它們在胺基酸序列方面與天然存在的免疫球蛋白分子不同。

本文所公開的抗體的重鏈恒定區可以源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重鏈恒定區可以包含源自IgG1分子的CH1結構域和源自IgG3分子的鉸鏈區。在另一個實例中，重鏈恒定區可以包含部分來自IgG1分子和部分來自IgG3分子的鉸鏈區。在另一個實例中，重鏈部分可以包括部分來自IgG1分子和部分來自IgG4分子的嵌合鉸鏈。

如本文所使用的，“輕鏈恒定區”一詞包括從抗體輕鏈衍生的胺基酸序列。較佳地，輕鏈恒定區域包括恒定κ域或恒定λ域中的至少一個。

“輕鏈重鏈對”是指輕鏈和重鏈的集合，其可藉由輕鏈的CL結構域和重鏈的CH1結構域之間的二硫鍵形成二聚體。

如前所述，各種免疫球蛋白類的恒定區的亞基結構和三維構型是眾所周知的。如本文所用，術語“VH結構域”包括免疫球蛋白重鏈的胺基末端可變結構域，術語“CH1結構域”包括免疫球蛋白重鏈的第一個(胺基最末端)恒定區結構域。CH1結構域與VH結構域相鄰，位於免疫球蛋白重鏈分子的鉸鏈區的胺基端。

本文所使用的術語“CH2結構域”包括使用傳統的編號方案大約從抗體的殘基244延伸到殘基360的重鏈分子的部分(殘基244至360，Kabat編號系統，和殘基231-340，EU編號系統；參見Kabet等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”(1983))。CH2結構域是獨特的，因為它並不緊 密地與另一個結構域配對。相反，兩個N-連接的支化糖鏈被插入在完整的天然IgG分子的兩個CH2結構域之間。據可靠記錄，CH3結構域從CH2結構域延伸到IgG分子的C端，並包含大約108個殘基。

如本文所使用的，術語“鉸鏈區”包括重鏈分子連接CH1結構域和CH2結構域的部分。該鉸鏈區包含大約25個殘基並且是柔性的，從而允許兩個N端抗原結合區獨立移動。鉸鏈區可以細分為三個不同的結構域：上、中、下鉸鏈域(Roux等人，J.Immunol 161：4043(1998))。

如本文所使用的術語“二硫鍵”包括兩個硫原子之間形成的共價鍵。胺基酸半胱胺酸包括硫醇基團，其可以與第二個硫醇基團形成二硫鍵或橋。在大多數天然存在的IgG分子中，CH1和CK區域由二硫鍵連接，並且兩個重鏈根據Kabat編號系統在239和242對應的位置(位置226或229，EU編號系統)上由兩個二硫鍵連接。

如本文所用，術語“嵌合抗體”會被認為意指任何抗體，其中免疫反應區或位點是從第一物種獲得或衍生的，而恒定區(根據本發明可以為完整的、部分的或修飾的)是從第二物種獲得。在某些具體實施例中，靶結合區或位點會來自非人類來源(例如小鼠或靈長類動物)，而恒定區域是人的。

如本文所使用的，“百分比人源化”是藉由確定人源化結構域和種系結構域之間的框架胺基酸差異的數目(即，非CDR差異)，從胺基酸總數中減去該數，然後將其除以胺基酸總量乘以100來計算。

“特異性結合”或“對......具有特異性”通常意味著抗體藉由其抗原結合域與抗原決定基結合，並且該結合需要(entail)在抗原結合域和抗原決定基之間一定的互補性。根據這個定義，抗體被稱為“特異性 結合”抗原決定基時，它藉由其抗原結合域比它結合到一個隨機的，無關的抗原決定基更容易結合到該抗原決定基。本文中使用術語“特異性”來定性某一抗體與某一抗原決定基結合的相對親和力。例如，抗體A可能被認為對給定抗原抗原決定基具有比抗體“B”更高的特異性，或者抗體“A”可以被稱為以比相關抗原決定基D更高的特異性結合抗原決定基“C”。

如本文所使用的，術語“治療”或“處理”指的是治療處理和預防或防止措施二者，其目的是預防或減緩(減少)不希望的生理變化或病症，如癌症的進展。有益或期望的臨床結果包括但不限於緩解症狀、減少疾病程度、穩定病情(即不惡化)、延緩或減緩疾病進展、改善或減輕疾病狀態、緩解(部分或全部)，無論是可檢測的還是不可檢測的。“治療”也意味著與未接受治療時的預期生存期相比延長生存期。需要治療的人包括那些已經患有病況或病症的患者，以及那些容易發生病況或病症的患者，或那些需要預防病況或病症的患者。

“受試者”或“個體”或“動物”或“病人”或“哺乳動物”指的是任何受試者，尤其是哺乳動物受試者，對其進行診斷、預後或治療是需要的。哺乳動物受試者包括人類、家畜、牲畜、動物園動物、運動用動物或寵物動物，如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、母牛等。

如本文所使用的，諸如“需要治療的病人”或“需要治療的受試者”這樣的短語包括受試者，如哺乳類受試者，其會受益於本發明的抗體或組合物的施用，例如用於檢測，用於診斷和/或用於治療。

抗PD-1抗體

本發明提供了對人類PD-1蛋白具有高親和力的抗PD-1抗體。所測試的抗體呈現強力的結合和抑制活性，並可用於治療和診斷用 途。此外，測試的人源化抗體之一(TY101)比兩個FDA批准的抗hPD-1抗體呈現顯著更高的結合親和力。

因此，本發明的一個具體實施例提供了抗PD-1抗體或其片段，所述抗體或其片段可以特異性結合人程式性死亡1(PD-1)蛋白。

根據本發明的一個具體實施例，提供了一種抗體，該抗體包含重鏈和輕鏈可變區，所述重鏈和輕鏈可變區具有如表1中的CDR群組之一的CDR區。

例如，在一個具體實施例中，提供了對人類程式性細胞死 亡蛋白1(PD-1)具有特異性的經分離抗體或片段，其中所述抗體或其片段包含重鏈可變區以及輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3為HCDR1：GFTFSSYT(SEQ ID NO：1)，HCDR2：ISHGGGDT(SEQ ID NO：2)，HCDR3：ARHSGYERGYYYVMDY(SEQ ID NO：3)，LCDR1：ESVDYYGFSF(SEQ ID NO：4)，LCDR2：AAS(SEQ ID NO：5)，LCDR3：QQSKEVPW(SEQ ID NO：6)。

例如，在一個具體實施例中，提供了對人類程式性細胞死亡蛋白1(PD-1)具有特異性的經分離抗體或片段，其中所述抗體或其片段包含重鏈可變區以及輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3為HCDR1：GYTFTSYT(SEQ ID NO：7),HCDR2：INPTTGYT(SEQ ID NO：8),HCDR3：ARDDAYYSGY(SEQ ID NO：9),LCDR1：ENIYSNL(SEQ ID NO：10),LCDR2：AAK(SEQ ID NO：11),LCDR3：QHFWGTPWT(SEQ ID NO：12)。

例如，在一個具體實施例中，提供了對人類程式性細胞死亡蛋白1(PD-1)具有特異性的經分離抗體或片段，其中所述抗體或其片段包含重鏈可變區以及輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述輕鏈可變區包含輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、 LCDR1、LCDR2和LCDR3為HCDR1：GFAFSSYD(SEQ ID NO：13),HCDR2：ITIGGGTT(SEQ ID NO：14),HCDR3：ARHRYDYFAMDN(SEQ ID NO：15),LCDR1：ENVDNYGINF(SEQ ID NO：16),LCDR2：VSS(SEQ ID NO：17),LCDR3：QQSKDVPW(SEQ ID NO：18)。

如實驗實施例所示，含有這些CDR區的抗體，無論是小鼠、人源化還是嵌合抗體，都具有強力的PD-1結合和抑制活性。進一步的電腦建模表明，CDR內的某些殘基可以被修飾以保留或改善抗體的性質。在一些具體實施例中，本發明的抗PD-1抗體包括表1中列出的VH和VL CDR，其具有一個、兩個或三個進一步的修飾。這種修飾可以是胺基酸的添加、缺失或取代。

在一些具體實施例中，修飾是在每個CDR不超過一個熱點位置的取代。在一些具體實施例中，修飾是在一個、兩個或三個這樣的熱點位置的取代。在一個具體實施例中，修飾是在熱點位置中的一個處的取代。在一些具體實施例中，這樣的取代是保守取代。

“保守胺基酸取代”是胺基酸殘基被替換為具有類似側鏈的胺基酸殘基的胺基酸取代。在本領域中已經定義了具有類似側鏈的胺基酸殘基的家族，包括鹼性側鏈(例如賴胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電的極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-支化側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)和芳香側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需胺基酸殘基較佳替換為來自相同側鏈家族的另一胺基酸殘基。在 另一個具體實施例中，可以將胺基酸串用結構相似的串替換，其側鏈家族成員的順序和/或組成方面有所不同。

保守胺基酸取代的非限制性實例在下表中提供，其中相似性得分為0或更高表示兩個胺基酸之間的保守取代。

胺基酸類似性矩陣

保守胺基酸取代

VH的非限制性實例在SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：39中提供。SEQ ID NO：27是鼠VH。SEQ ID NO：31是嵌合抗體的VH，而SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39是人源化的。

VL的非限制性實例在SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：45中提供。SEQ ID NO：29是鼠VL。SEQ ID NO：33是嵌合抗體的VL，而SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45是人源化的。

在一些具體實施例中，本發明的抗PD-1抗體包括SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，或SEQ ID NO：39中的VH，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，或SEQ ID NO：45的VL，或它們各自的生物等效物。VH或VL的生物等效物是包含指定胺基酸，同時總體具有80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的序列。例如，SEQ ID NO：27的生物等效物，可以是VH，其與SEQ ID NO：27總體具有80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性，但保留CDR。

本領域的通常技術人員也可以理解，本文所公開的抗體可以被修飾，使得它們在胺基酸序列方面與它們所衍生自的天然結合多肽不同。例如，源自指定蛋白質的多肽或胺基酸序列可以是相似的，例如，與起始序列具有一定百分比同一性，例如，它可以與起始序列60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%相同。

在某些具體實施例中，抗體包括不與抗體正常相關聯的一個或多個部分或胺基酸序列。下面將更詳細地描述示例性修飾。例如，本發明的抗體可以包含柔性連接序列，或者可以被修飾以添加功能部分(例如，PEG、藥物、毒素或標籤)。

本發明的抗體、其變體或衍生物包括被修飾的衍生物，即，藉由任何類型分子共價附接到抗體，使得上述共價附接不能阻止抗體與抗原決定基結合。例如，而非意在限制，抗體可以被修飾，例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、磷酸化、醯胺化、已知保護/封閉基團的衍生化、蛋白水解裂解、與細胞配體或其他蛋白質的連接等修飾。許多化學修飾均可以藉由已知的技術進行，包括但不限於特定的化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素的代謝合成等。此外，抗體可以含有一種或 多種非經典胺基酸。

在一些具體實施例中，抗體可以與治療劑、前藥、肽、蛋白質、酶、病毒、脂質、生物反應調節劑、藥物製劑或PEG結合。

抗體可與治療劑結合或融合，其可包括可檢測的標記物，如放射性標記物、免疫調節劑、激素、酶、寡核苷酸、光活性治療或診斷劑、細胞毒劑，其可能是藥物或毒素，超音波增強劑、非放射性標記物、其組合和本領域已知的其他此類試劑。

抗體可藉由將其偶聯到化學發光化合物而被可檢測地標記。然後藉由檢測在化學反應過程中出現的發光的存在來確定化學發光標記抗原結合多肽的存在。特別有用的化學發光標記化合物的實例是發光胺(luminol)、異發光胺(isoluminol)、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯。

抗體也可利用螢光發射金屬如¹⁵²Eu或其它鑭系元素可檢測地標記。這些金屬可以用金屬螯合基團如二亞乙基三氨基乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)附接到抗體上。用於將各種部分與抗體結合的技術是眾所周知的，參見，例如，Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人編，,pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.(1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery”,in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等人編，Marcel Dekker,Inc.,pp.623-53(1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”,in Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人編，pp.475-506 (1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人編，Academic Press pp.303-16(1985)，和Thorpe等人，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”,Immunol.Rev.(52：119-58(1982))。

雙功能性分子

PD-1是一種免疫檢查點分子，也是一種腫瘤抗原。作為腫瘤抗原靶向分子，對PD-1具特異性的抗體或抗原結合片段可與對免疫細胞具特異性的第二抗原結合片段結合以產生雙特異性抗體。

在某些具體實施例中，所述免疫細胞選自T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、吞噬細胞、自然殺傷細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞。可被靶向的免疫細胞上的分子包括，例如CD3、CD16、CD19、CD28和CD64。其他實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3(也稱為CD233)、CD28、CD122、4-1BB(也稱為CD137)、TIM3、OX-40或OX40L、CD40或CD40L、LIGHT、ICOS/ICOSL、GITR/GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM或BTLA(也稱為CD272)、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)和CD47。雙特異性的具體實例包括，但不限於，PD-L1/PD-1、PD-1/LAG3、PD-1/TIGIT和PD-1/CD47。

作為免疫檢查點抑制劑，對PD-1具特異性的抗體或抗原結合片段可與對腫瘤抗原具特異性的第二抗原結合片段結合，以產生雙特異性抗體。“腫瘤抗原”是一種在腫瘤細胞中產生的抗原物質，即其在宿主體 內觸發免疫反應。腫瘤抗原在鑒定腫瘤細胞中是有用的，並且是用於癌症治療的潛在候選物。體內的正常蛋白質不是抗原性的。然而，某些蛋白質在腫瘤發生過程中產生或過度表現，因此對身體顯得為“外來”。這可能包括與免疫系統隔離良好的正常蛋白質，通常以極少量產生的蛋白質，通常只在某些發育階段產生的蛋白質，或者由於突變而修飾結構的蛋白質。

本領域已知豐富的腫瘤抗原，藉由篩選可以容易地識別新的腫瘤抗原。腫瘤抗原的非限制性實例包括EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CD73、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、葉酸結合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整聯蛋白、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和肌糖蛋白(Tenascin)。

在某些方面，單體單元對於在腫瘤細胞上過度表現的蛋白質，相比於相應的非腫瘤細胞具有特異性。本文中所用的“相應的非腫瘤細胞”是指與腫瘤細胞起源為相同的細胞類型的非腫瘤細胞。值得注意的是，這種蛋白質不一定與腫瘤抗原不同。非限制性的例子包括癌胚抗原(CEA)，其在大多數結腸癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃腸道癌中過度表現；調節蛋白(heregulin)受體(HER-2、neu或c-erbB-2)，其在乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌和宮頸癌中常被過度表現。表皮生長因數受體(EGFR)，其在一系列實體腫瘤中高度表現，包括乳腺癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌和前列腺癌；唾液酸糖蛋白受體；轉鐵蛋白受體；絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)酶複合受體，其在肝細胞上表現。成纖維細胞生長因數受體(FGFR)，其在胰腺導管腺癌細 胞中高度表現；血管內皮生長因數受體(VEGFR)，用於抗血管生成基因治療；葉酸受體，其選擇性地在90%的非黏液性卵巢癌中過度表現；細胞表面糖萼(glycocalyx)；碳水化合物受體；和聚合免疫球蛋白受體，其可用於基因遞送到呼吸道上皮細胞，並為治療肺部疾病，如囊性纖維化的有吸引力手段。在這方面的雙特異性的非限制性實例包括PD-1/EGFR、PD-1/HER2、PD-1/CD33、PD-1/CD133、PD-1/CEA和PD-1/VEGF。

本發明還提供了雙特異性抗體的不同形式。在一些具體實施例中，每個抗PD-1片段和第二片段各自獨立地選自Fab片段、單鏈可變片段(scFv)或單結構域抗體。在一些具體實施例中，雙特異性抗體還包括Fc片段。

本發明還提供了不僅包括抗體或抗原結合片段的雙功能性分子。作為腫瘤抗原靶向分子，對PD-1具特異性的抗體或抗原結合片段(如本文中所描述的)可以與免疫細胞素或配體，視情況藉由肽連接物結合。連接的免疫細胞素或配體包括但不限於IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、GM-CSF、TNF-α、CD40L、OX40L、CD27 L、CD30L、4-1BBL、LIGHT和GITRL。這樣的雙功能性分子可以組合免疫檢查點阻斷效應與腫瘤部位的局部免疫調節。

編碼抗體的多核苷酸和製備抗體的方法

本發明還提供編碼本發明的抗體、其變體或衍生物的經分離多核苷酸或核酸分子(例如，SEQ ID NO：22、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44和46)。本發明的多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或不同的多核苷酸分子上編碼抗原結合多肽，其變體 或衍生物的整個重鏈和輕鏈可變區。另外，本發明的多核苷酸可以在相同的多核苷酸分子上或不同的多核苷酸分子上編碼抗原結合多肽，其變體或衍生物的重鏈和輕鏈可變區的一部分。

製備抗體的方法在本領域中是眾所周知的，並在本文中進行了描述。在某些具體實施例中，本發明的抗原結合多肽的可變區和恒定區都是完全人源的。完全人源抗體可以使用本領域所描述的技術和本文所述的技術來製備。例如，針對特定抗原的完全人源抗體可以藉由下述方法製備：將抗原給予轉基因動物，此轉基因動物已被修飾以產生此類回應抗原挑戰之抗體，但是其內源基因座已經被去能(disable)。可用於製備此類抗體的示例性技術在美國專利第6,150,584；6,458,592；6,420,140號中描述，其全文引用併入本文。

在某些具體實施例中，所製備的抗體不會在待治療的動物例如人中引發有害的免疫反應。在一個具體實施例中，本發明的抗原結合多肽、其變體或衍生物被修飾以使用本領域公認的技術來降低其免疫原性。例如，抗體可經人源化、靈長類化、去免疫(deimmunized)或可製備嵌合抗體。這些類型的抗體來源於非人源抗體，通常是鼠類或靈長類動物抗體，其保留或基本上保留親本抗體的抗原結合特性，但在人類中的免疫原性較低。這可以藉由各種方法來實現，包括(a)將整個非人可變域移植到人源恒定區以產生嵌合抗體；(b)將至少一個或多個非人源互補決定區(CDR)的一部分移植到人源框架和恒定區中，其中保留或不保留關鍵框架殘基；或(c)移植整個非人源的可變區域，但藉由表面殘基替換用人源樣區段使其“隱形”。這樣的方法公開於Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 57：6851-6855(1984)；Morrison等人，Adv. Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.25：489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.31：169-217(1994)，和美國專利第5,585,089, 5,693,761, 5,693,762和6,190,370號，其全文引用併入本文。

去免疫也可用於降低抗體的免疫原性。如本文所使用的，術語“去免疫”包括改變抗體以修飾T細胞抗原決定基(參見，例如，國際申請公開號：WO/9852976 A1和WO/0034317 A2)。例如，分析來自起始抗體的可變重鏈和可變輕鏈序列，並構建來自每個V區的人T細胞抗原決定基“圖”，其顯示抗原決定基相對於互補決定區(CDR)和序列內的其他關鍵殘基的位置。分析來自T細胞抗原決定基圖中的個別T細胞抗原決定基，以鑒定改變最終抗體活性的風險較低的其它胺基酸取代。設計一系列其它可變重和可變輕鏈序列，其包括胺基酸取代的組合，而這些序列隨後被併入一系列結合多肽中。通常，生成12至24個變異抗體，並測試其結合和/或功能。然後將包含修飾的可變區和人恒定區的完整的重鏈和輕鏈基因選殖到表現載體中，並將所得的質體引入細胞株中以產生完整的抗體。然後在適當的生化和生物測定中比較抗體，鑒定最佳變體。

本發明抗原結合多肽的結合特異性可藉由活體外試驗，如免疫沉澱法、放射免疫分析法(RIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)來確定。

或者，可採用描述用於生產單鏈單元的技術(美國專利第4694778號；Bird,Science 242：423-442(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 55：5879-5883(1988)；以及Ward等人，Nature 334：544-554(1989))來產生本發明的單鏈單元。單鏈單元藉由經由胺基酸橋連接 Fv區的重鏈和輕鏈片段形成，從而產生單鏈融合肽。還可以使用在大腸桿菌中組裝功能性Fv片段的技術(Skerra等人，Science 242：1038-1041(1988))。

可用於產生單鏈Fv(scFv)和抗體的技術的實例，包括在美國專利第4,946,778和5,258,498號，Huston等人，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等人，Proc.Natl.Sci.USA 90：1995-1999(1993)；和Skerra等人，Science 240：1038-1040(1988)中所描述的技術。對於一些用途，包括抗體在人體體內中的使用和活體外檢測試驗，較佳使用嵌合、人源化或人源抗體。嵌合抗體是一種分子，其中抗體的不同部分來源於不同的動物物種，例如具有源自小鼠單株抗體可變區的和人免疫球蛋白恒定區的抗體。產生嵌合抗體的方法在本領域中是已知的。參見，例如Morrison,Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美國專利第5,807,715號；4,816,567號和4,816,397號，其全文引用併入本文。

人源化抗體是從非人類物種抗體衍生的抗體分子，其與所需的抗原結合，具有來自非人類物種的一個或多個互補決定區(CDR)，和來自人免疫球蛋白分子的框架區。通常，人類框架區中的框架殘基會被來自CDR供體抗體的相應殘基取代，以改變，較佳地改善抗原結合。這些框架取代藉由本領域公知的方法來鑒定，例如，藉由對CDR和框架殘基的相互作用的建模來鑒定對抗原結合重要的框架殘基，和進行序列比較以鑒定特定位置上的不尋常的框架殘基。(參見例如，Queen等，美國專利第5,585,089號；Riechmann等，Nature 332：323(1988)，其全文引用併入本 文)。抗體可以使用本領域已知的多種技術進行人源化，包括例如CDR移植(EP 239400；PCT公開號WO 91/09967；美國專利第5225539；5530101；和5585089號)，貼面(veneering)或重新表面化(resurfacing)(EP 592106；EP 519596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等，Proc.Natl.Sci.USA 91：969-973(1994))和鏈改組(chain shuffling)(美國專利第5565332號，其全文引用併入本文)。

完全人源抗體對人類患者的治療處理是特別理想的。人源抗體可以藉由本領域已知的多種方法來製備，包括噬菌體展示方法，其使用源自人免疫球蛋白序列的抗體文庫。也參見，美國專利第4444887和4716111號；以及PCT公開號WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741；其每一個均全文引用併入本文。

人源抗體也可使用轉基因小鼠產生，這些轉基因小鼠不能表現功能性內源性免疫球蛋白，但能表現人免疫球蛋白基因。例如，人類重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因複合物可以隨機引入或藉由同源重組引入小鼠胚胎幹細胞。另外，除了人類重鏈和輕鏈基因外，人的可變區、恒定區和多樣性區可以被引入到小鼠胚胎幹細胞中。小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因可單獨或同時藉由同源重組引入人免疫球蛋白基因座而非功能化。特別地，JH區的純合子缺失阻止內源性抗體的產生。將修飾的胚胎幹細胞擴增並微注射到囊胚中以產生嵌合小鼠。然後將嵌合小鼠育種成產生表現人源抗體的純合後代。轉基因小鼠以選定的抗原，例如所需的目標多肽的全 部或一部分以正常方式免疫接種(immunize)。可以使用常規融合瘤技術從經免疫接種的轉基因小鼠獲得針對抗原的單株抗體。轉基因小鼠所攜帶的人免疫球蛋白轉基因在B細胞分化過程中重新排列，隨後進行類別轉換和體細胞突變。因此，使用這種技術，可以產生治療上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體。對於這種產生人源抗體的技術的概述，參見Lonberg和HuszarInt.Rev.Immunol.73：65-93(1995)。為了詳細討論這種用於產生人源抗體和人單株抗體的技術和產生這類抗體的規程，參見，例如PCT公開號WO 98/24893；WO 96/34096；WO 96/33735；美國專利第5413923；5625126；5633425；5569825；5661016；5545806；5814318；和5939598，其全文引用併入本文。此外，可聯絡諸如Abgenix,Inc.(Freemont，Calif.)和GenPharm(San Jose，Calif.)這樣的公司使用與上述相似的技術提供針對選定抗原的人源抗體。

還可使用被稱為“導向選擇(guided selection)”的技術產生識別所選擇抗原決定基的完全人源抗體。在該方法中，選定的非人單株抗體，例如小鼠抗體，用於指導識別相同抗原決定基的完全人源抗體的選擇。Jespers等，Bio/Technology 72：899-903(1988)。亦參見美國專利第5565332號，其全文引用併入本文。

在另一個具體實施例中，編碼所需單株抗體的DNA可以容易地使用常規步驟分離和測序(例如，藉由使用能夠特異性結合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。經分離和亞選殖的融合瘤細胞作為這種DNA的較佳來源。一旦分離，DNA可以被置入表現載體中，然後將其轉染到原核或真核宿主細胞中，例如大腸桿菌細胞、猿類COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或否則不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞。更 具體而言，經分離DNA(可以如本文所述合成的)可以用於選殖供製備抗體的恒定和可變區序列，如1995年1月25日申請的Newman等於美國專利第5658570號所描述者，其引用併入本文。基本上，這需要從所選擇的細胞中提取RNA，轉化為cDNA，並藉由使用Ig特異性引子的PCR擴增。用於此目的的合適的引子也在美國專利5658570號中描述。如下面將更詳細地討論的，表現所需抗體的轉化細胞可以以相對較大的數量生長，以提供免疫球蛋白的臨床和商業供應。

此外，使用常規重組DNA技術，本發明的抗原結合多肽的一個或多個CDR可以插入框架區內，例如，插入人類框架區以使非人源抗體人源化。框架區可以是天然存在的或共通的(consensus)框架區，較佳地是人類框架區(關於人類框架區的列表，參見，例如Chothia等，J.Mol.Biol.278：457-479(1998))。較佳地，由框架區和CDR的組合產生的多核苷酸編碼特異性結合到所需多肽(例如LIGHT)的至少一個抗原決定基的抗體。較佳地，可以在框架區內進行一個或多個胺基酸取代，並且較佳所述胺基酸取代提高抗體與其抗原的結合。另外，這些方法可用於使構成鏈內二硫鍵的一個或多個可變區半胱胺酸殘基的胺基酸取代或缺失，以產生缺乏一個或多個鏈內二硫鍵的抗體分子。本發明涵蓋多核苷酸的其他改變，其也屬於本領域的技術範圍內。

此外，可使用開發用於產生“嵌合抗體”的技術(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：851-855(1984)；Neuberger等，Nature 372：604-608(1984)；Takeda等，Nature 314：452-454(1985))，即從小鼠抗體分子中剪接具有適當的抗原特異性的基因，以及來自具有適當生物活性的人抗體分子的基因。如本文所使用的，嵌合抗體是其中不同部分源自 不同動物物種的分子，例如具有源自小鼠單株抗體的可變區和人免疫球蛋白恒定區的分子。

Newman,Biotechnology 10：1455-1460(1992)公開了另一種高效的供產生重組抗體的方法。具體而言，該技術導致產生包含猴可變域和人類恒定序列的靈長類化抗體。該文獻引用併入本文。此外，該技術也被描述在具有相同受讓方的美國專利第5658570,5693780和5756096號，其每一個均全文引用併入本文。

可選地，可以使用本領域技術人員熟知的技術選擇和培養抗體產生細胞株。這種技術描述於各種實驗室手冊和原始文獻。在這方面，如下文所述的適用於本發明的技術描述於Current Protocols in Immunology,Coligan等編，Green Publishing Associates and Wiley-Interscience,John Wiley and Sons,New York(1991)，其包括附文在內全文引用併入本文。

此外，可用於在編碼本發明抗體的核苷酸序列中引入突變的本領域技術人員已知的標準技術包括但不限於，導致胺基酸取代的定點誘變和PCR介導的誘變。較佳地，變體(包括衍生物)編碼相對於參照重鏈可變區，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、輕鏈可變區、CDR-L1、CDR-L2，或CDR-L3少於50個胺基酸取代，少於40個胺基酸取代，少於30個胺基酸取代，少於25個胺基酸取代，少於20個胺基酸取代，少於15個胺基酸取代，少於10個胺基酸取代，少於5個胺基酸取代，少於4個胺基酸取代，少於3個胺基酸取代，或少於2個胺基酸取代。或者，可以隨機地沿著編碼序列的全部或部分引入突變，例如藉由飽和誘變，並且可以對所產生的突變體就生物活性進行篩選，以鑒定保留活性的突變體。

癌症治療

如本文所述，本發明的抗體、變體或衍生物可用於某些治療和診斷方法。

本發明進一步涉及基於抗體的治療，其涉及將本發明的抗體給予諸如動物、哺乳動物和人的患者，用於治療本文中所述的一種或多種病症或病況。本發明的治療化合物包括但不限於本發明的抗體(包括本文中所述的其變體和衍生物)和編碼本發明的抗體的核酸或多核苷酸(包括本文中所述的其變體和衍生物)。

本發明的抗體也可用於治療或抑制癌症。PD-1可在腫瘤細胞中過度表現。腫瘤衍生的PD-1可與免疫細胞上的PD-L1結合，從而限制抗腫瘤T細胞免疫。用小分子抑制劑，或靶向PD-1的單株抗體在鼠類腫瘤模型中的結果表明靶向PD-1治療是有效控制腫瘤生長的重要方案和現實途徑。如實驗實施例所示，抗PD-1抗體啟動了適應性免疫反應機制，此可導致癌症患者的存活率提高。

因此，在一些具體實施例中，提供了用於治療有需要的患者的癌症的方法。在一個具體實施例中，該方法涉及向患者施用有效量的本發明的抗體。在一些具體實施例中，患者中的至少一種癌細胞(例如，基質細胞)表現、過度表現或受誘導表現PD-1。例如，PD-1表現的誘導可以藉由施用腫瘤疫苗或放射治療來完成。

表現PD-1蛋白的腫瘤包括膀胱癌、非小細胞肺癌、腎癌、乳腺癌、尿道癌、結直腸癌、頭頸部癌、鱗狀細胞癌、默克爾細胞癌、胃腸道癌、胃癌、食道癌等，卵巢癌、腎癌和小細胞肺癌。因此，本發明的抗體可用於治療任何一種或多種此類癌症。

本發明還提供了細胞療法，如嵌合抗原受體(CAR)T細胞療法。可以使用合適的細胞，將其與本發明的抗PD-1抗體接觸(或者其經工程改造表現本發明的抗PD-1抗體)。在這種接觸或工程改造後，細胞可以被引入需要治療的癌症患者。癌症患者可患有本文中公開的任何類型的癌症。例如，所述細胞(例如，T細胞)可以是腫瘤浸潤T淋巴細胞，CD4+T細胞，CD8+T細胞，或它們的組合，但不限於此。

在一些具體實施例中，細胞是從癌症患者自身中分離出來的。在一些具體實施例中，細胞由供體或細胞庫提供。當細胞是從癌症患者分離出來時，不欲的免疫反應可以被最小化。

可被本發明的抗體或其變體或衍生物治療、預防、診斷和/或預後的與細胞存活率增加有關的其它疾病或病況，包括但不限於惡性腫瘤的進展和/或轉移，和相關的病症如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴細胞白血病、急性骨髓細胞性白血病(包括骨髓母細胞、前骨髓細胞、骨髓單核細胞、單核細胞和紅白血病)和慢性白血病(例如慢性髓細胞(粒細胞)白血病)和慢性淋巴細胞白血病)、真性紅細胞增多症(polycythemia vera)、淋巴瘤(如霍奇金病和非霍奇金病)、多發性骨髓瘤、華氏(Waldenstrom's)巨球蛋白血症、重鏈病和實體瘤，包括但不限於肉瘤和癌，如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、伊文氏(Ewing's)瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞 癌(hepatoma)、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏(Wilm's)瘤、宮頸癌、睾丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤(hemangioblastoma)、聽神經瘤，少枝膠質細胞瘤(oligodendroglioma)、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤和視網膜母細胞瘤。

感染和免疫病症的治療

如實驗實施例所示，本發明的抗體可以啟動免疫反應，從而可以用於治療感染。

感染是病原體侵入生物體的身體組織，其增殖，和宿主組織對這些生物體和它們產生的毒素的反應過程。感染可由諸如病毒，類病毒，朊病毒，細菌，線蟲如寄生蛔蟲和蟯蟲，節肢動物如蜱、蟎、跳蚤和蝨子，真菌如癬，和其他大型寄生蟲如絛蟲和其他蠕蟲的傳染原(infectious agent)引起。在一個方面，傳染原是細菌，例如革蘭氏陰性細菌。在一個方面，傳染原是病毒，如DNA病毒、RNA病毒和逆轉錄病毒。病毒的非限制性實例包括腺病毒、柯薩奇病毒、Epstein-Barr病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒-1型、單純皰疹病毒-2型、巨細胞病毒、人類皰疹病毒-8型、HIV、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒，人乳頭狀瘤病毒、副流感病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、風疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒。

在某些具體實施例中，還提供了用於治療免疫病症的抗體或其片段的方法或用途。免疫病症的非限制性例子包括感染、感染相關的內毒素休克、關節炎、類風濕性關節炎、哮喘、COPD、盆腔炎性疾病、 阿爾茨海默病、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結腸炎、佩羅尼氏病、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛病(Pilonidal disease)、腹膜炎、牛皮癬、血管炎、手術粘連、中風、I型糖尿病、萊姆病、關節炎、腦膜腦炎、自體免疫性葡萄膜炎、中樞神經系統和周邊神經系統的免疫介導的炎性疾病、多發性硬化、狼瘡和格林-巴利綜合征、異位性皮膚炎、自體免疫性肝炎、纖維性肺泡炎、葛瑞夫茲氏病、IgA腎病、特發性血小板減少性紫癜、梅尼爾氏病、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、結節病、硬皮病、韋格納肉芽腫病、胰腺炎、創傷、移植物抗宿主病、移植排斥反應、缺血性疾病、心肌梗死、動脈粥樣硬化、血管內凝血、骨吸收、骨質疏鬆、骨關節炎、牙周炎、胃酸過少和與胎兒母體耐受性缺乏有關的不孕。

本發明的抗體還可用於藉由靶向微生物和免疫細胞以實現消除微生物來治療由微生物引起的傳染病，或殺死微生物。在一個方面，微生物是包括RNA和DNA病毒的病毒、革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、原生動物或真菌。

任何特定患者的特定劑量和治療方案會取決於多種因素，包括所使用的特定抗體、其變體或衍生物，患者的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食，以及給藥時間、排泄率、藥物組合，以及被治療的特定疾病的嚴重程度。醫療照護者對這些因素的判斷是本領域的一般技術。所述量也會取決於待治療的個體病人，給藥途徑，製劑的類型，所用的化合物的特性，疾病的嚴重程度，以及所需的效果。所使用的量可以藉由本領域公知的藥理學和藥代動力學原理來確定。

抗體、變體的給藥方法包括但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服途徑。抗原結合多肽或組合物可 以藉由任何方便的途徑施用，例如藉由輸注或灌注(bolus injection)，藉由上皮或粘膜皮膚襯裡(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，並可以與其他生物活性劑一起施用。因此，含有本發明抗原結合多肽的藥物組合物可以經口、經直腸、腸胃外、腦池內、陰道內、腹膜內、局部(如藉由粉末、軟膏、滴劑或透皮貼劑)、含服或口服或鼻腔噴霧施用。

本法所稱“腸胃外”是指包括靜脈內、肌肉內、腹膜內、胸骨內、皮下和關節內注射和輸注的施用方式。

施用可以是全身性的，也可以是局部的。此外，可能希望藉由任何合適的途徑將本發明的抗體引入中樞神經系統，包括腦室內和鞘內注射；腦室內注射可藉由腦室導管促進，例如，附接到儲庫(reservoir)，例如歐麥牙(Ommaya)儲庫。也可以使用肺給藥，例如，藉由使用吸入器或霧化器，以及用氣霧劑(aerosolizing agent)配製製劑。

可能需要局部地將抗體多肽或組合物施用到需要治療的區域；這可以藉由例如，在外科手術期間局部灌注，局部應用，例如，結合在手術後敷料，藉由注射，藉由導管，藉由栓劑，或藉由植入物(所述植入物是多孔的、無孔的或凝膠狀的材料，包括膜，例如矽橡膠(sialastic)膜或纖維)來實現，但不限於此。較佳地，當施用蛋白質(包括本發明的抗體)時，必須注意使用不吸收該蛋白質的材料。

在另一個具體實施例中，抗體或組合物可以在囊泡中遞送，特別是脂質體(見Langer,1990,Science 249：1527-1533；Treat等，in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler編，Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez- Berestein，同上，pp.317-327；一般資訊亦見上文。)

仍在另一個具體實施例中，抗原結合多肽或組合物可以在受控釋放系統中遞送。在一個具體實施例中，可以使用泵(見Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等，1980,Surgery 88：507；Saudek等，1989,N.Engl.J.Med.321：574)。在另一個具體實施例中，可以使用聚合物材料(參見Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise編，CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball編，Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,J.,1983,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；還參見Levy等，1985,Science 228：190；During等，1989,Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989,J.Neurosurg.71：105)。還在另一個具體實施例中，可將控釋系統置於治療目標(即腦)附近，因此僅需要全身劑量的一小部分(參見，例如，Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。其他控制釋放系統在Langer的綜述中(1990,Science 249：1527-1533)討論。

在本發明的組合物中包含核酸或編碼蛋白質的多核苷酸的具體實施例中，所述核酸可以在活體內施用以促進其編碼的蛋白的表現，即將其構建為適當的核酸表現載體的一部分，使其進入細胞內，例如，藉由使用逆轉錄病毒載體(見美國專利第4980286號)，或藉由直接注射，或藉由使用微粒轟擊(例如，基因槍；生物槍(Biolistic)，Dupont)，或用脂類或細胞表面受體或轉染劑包被，或藉由將其與已知進入細胞核的同源盒樣(homebox-like)肽連接(參見，例如Joliot等，1991,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)。或者，核酸可以引入細胞內，並藉由同源重組併入宿主細胞DNA中以供表現。

藉由標準的臨床技術可以確定會在治療、抑制和預防炎症、免疫或惡性疾病、病症或病況中有效的本發明的抗體的量。此外，可視情況使用活體外試驗幫助鑒定最佳劑量範圍。在製劑中待使用的精確劑量也會取決於給藥途徑，以及疾病、病症或病況的嚴重程度，並應根據執業醫師的判斷和和每個患者的情況決定。從活體外或動物模型試驗系統中得到的劑量-反應曲線可以外推出有效劑量。

作為一般性建議，施用給患者的本發明的抗原結合多肽的劑量通常是0.1毫克/千克至100毫克/千克患者體重，0.1毫克/千克至20毫克/千克患者體重，或1毫克/千克至10毫克/千克患者體重。通常，人源抗體在人體內的半衰期比來自其他物種的抗體更長，這是由於對外源多肽的免疫反應。因此，低劑量的人源抗體和較不頻繁的施用往往是可能的。此外，藉由例如脂質化等修飾來增強抗體的攝取和組織滲透(例如，進入大腦)，可以減少本發明的抗體的劑量和施用頻率。

治療感染或惡性疾病、病況或病症的方法，包括施用本發明的抗體、其變體或衍生物，在用於人之前，通常在活體外測試，然後在可接受的動物模型中活體內測試所需的治療或預防活性。合適的動物模型包括轉基因動物，是本領域一般技術人員所熟知的。例如，活體外試驗證明本文中所述的抗原結合多肽的治療效用包括抗原結合多肽對細胞株或患者組織樣本的作用。抗原結合多肽對細胞株和/或組織樣本的作用可以利用本領域技術人員已知的技術來確定，例如本文中其它部分所公開的試驗。根據本發明，可用於確定是否為施用特異性抗原結合多肽的適應症的 活體外試驗包括活體外培養細胞試驗，其中患者組織樣本在培養中生長，並暴露於或以其他方式施用化合物，並觀察此化合物對組織樣本的作用。

已知多種遞送系統，可用於施用本發明的抗體或編碼本發明抗體的多核苷酸，例如包埋於脂質體、微粒、微膠囊，能夠表現化合物的重組細胞、受體介導的胞吞作用(參見，例如Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262：4429-4432)，作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分的核酸的構建等。

診斷方法

在某些腫瘤樣品中觀察到PD-1的過表現，並且具有PD-1過表現細胞的患者可能對本發明的抗PD-1抗體的治療作出反應。因此，本發明的抗體也可用於診斷和預後目的。

可以從患者中獲得較佳包括細胞的樣本，該患者可以是癌症患者或期望診斷的患者。細胞是腫瘤組織或腫瘤塊、血液樣本、尿樣或來自患者的任何樣本的細胞。在對樣品進行視情況的預處理時，在允許抗體與可能存在於樣品中的PD-1蛋白相互作用的條件下，可以將樣品與本發明的抗體培育。可以利用如ELISA等方法，利用抗PD-1抗體檢測樣品中PD-1蛋白的存在。

樣品中PD-1蛋白的存在(視情況，其量或濃度)可用於癌症的診斷，作為該患者適合用抗體治療的指示，或指示患者對癌症治療有反應(或沒有)。對於預後方法，可以在癌症治療開始後，在某些階段，一次、兩次或更多次地進行檢測以指示治療的進展。

組合物

本發明亦提供藥物組合物。此等組合物包含有效量的抗體 和可接受的載體。在一些具體實施例中，組合物還包括第二抗癌劑(例如，免疫檢查點抑制劑)。

在具體實施例中，術語“藥學上可接受”是指由聯邦或州政府的管理機構批准或在美國藥典或其他公認藥典中列出的在動物中，尤其是在人類中使用的藥物。此外，“藥學上可接受的載體”通常會是無毒固體、半固體或液體填料、稀釋劑、包封材料或任何類型的製劑助劑。

術語“載體”是指與治療劑一同施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介。這種藥物載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當將藥物組合物靜脈內給藥時，水是較佳的載體。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液體載體，特別是用於可注射的溶液。適宜的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、幹脫脂奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，該組合物還可以含有少量潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽。還包括抗菌劑如苄基醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；以及張度調節劑如氯化鈉或葡萄糖的試劑。這些組合物可以採取溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋製劑等的形式。該組合物可以用傳統粘合劑和載體如甘油三酯配製成栓劑。口服製劑可包括標準載體，如藥物等級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。E.W.Martin在Remington's Pharmaceutical Sciences(其以引用併入本文)中描述了合適的藥用載體的實例。這樣的組合物會包含治療有效量的抗原結合多肽，較佳以純化形式，連同適當量的載體， 以提供適合施用於患者的形式。製劑應符合給藥方式。腸胃外製劑可以被封閉在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑膠製成的多劑量瓶中。

在一個具體實施例中，按照常規程式配製該組合物作為適於給人靜脈內給藥的藥物組合物。通常，用於靜脈內給藥的組合物是無菌等張水性緩衝液形式的溶液。必要時，組合物還可包括增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因，以減輕注射部位的疼痛。通常，成分單獨或混合在一起以單位劑量形式供應，例如作為在指示活性劑的數量的密封容器中，如安瓿或袋狀物中的幹式凍幹粉末或無水濃縮物。在該組合物藉由輸注進行施用時，可使用含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶配給。在該組合物藉由注射給藥時，可以提供滅菌注射用水或鹽水的安瓿，使得成分可以在施用前混合。

本發明的化合物可配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括那些用陰離子形成的鹽，例如來自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸和酒石酸等的陰離子，以及那些用陽離子形成的鹽，例如由鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺，2-乙基氨基乙醇、組胺酸、普魯卡因等衍生的陽離子。

實施例 實施例1：針對人PD-1的人單株抗體的生成 全長人PD-1 cDNA的選殖

用MACS珠子(MiltenyiBiotec)從人周邊血淋巴細胞(PBMC)中分離出人T淋巴細胞。用RNeasy Mini Kit(QiAGEN)從人T細胞中提取總RNA，並藉由逆轉錄PCR(SuperScript First-Strand Synthesis System,Invitrogen)獲得cDNA。利用有義引子(5’- CTGTCTAGAATGCAGATCCCACAGGCGCC，SEQ ID NO：47)和反義引子(5’ GGATCCTCAGAGGGGCCAAGAGCAGT，SEQ ID NO：48)從人T細胞mRNA藉由RT-PCR生成編碼hPD-1的全長cDNA。序列經DNA測序和與NCBI資料庫(NM-005018.2)進行比較來驗證。

建立hPD-1穩定表現細胞株：用Xbal和BamH I消化後，將hPD-1 PCR片段選殖到PCDA3.1(-)載體(Invitrogen)中。然後利用lipofectamine 2000(Invitrogen)將pcDNA-hPD-1全長質體轉染至中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。穩定表現hPD-1的細胞株(CHO/hPD-1)藉由G418選擇並藉由流式細胞術篩選。

人PD-1 Ig融合蛋白的產生：藉由特異性引子以PCR從全長pcDNA-hPD-1擴增包含hPD-1胞外域的hPD-1 mIg和hPD-1 hIg融合蛋白的cDNA。將用EcoR I和Bgl Ⅱ消化的PCR片段融合到表現質體pmIgG中的小鼠IgG2a重鏈的CH2-CH3結構域中或融合到表現質體phIgG的人IgG1重鏈中(H Dong等Nat Med.1999；5：1365-1369)。培養上清液中的蛋白質以蛋白A Sepharose凝膠管柱(HiTrap Protein A HP,GE healthcare)純化。純化後的蛋白經SDA-PAGE電泳證實。

單株抗體的生成：將8~10周齡的雌性Balb/c小鼠在多位點皮下(s.c.)免疫接種200μL的含100μg hPD-1mIg融合蛋白和完全弗氏佐劑(CFA)(Sigma Aldrich)的乳劑。3周後，用50-100μg蛋白與不完全弗氏佐劑(IFA)(Sigma Aldrich)皮下(s.c.)免疫接種小鼠，共三次。小鼠每次免疫接種2周後放血進行血清效價測定。當效價足夠時，藉由腹膜內(i.p.)注射60μg蛋白的PBS溶液對小鼠進行免疫增強(boost)。藉由將經免疫接種的小鼠的脾細胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞株(來自ATCC) 融合，以獲得融合瘤。用二氧化碳處死經免疫增強的小鼠，並在無菌下收穫脾臟。將整個脾解離成單細胞懸液，並用ACK緩衝液溶解紅細胞。在50毫升錐形離心管中以1：1的比例混合SP2/0-Ag14骨髓瘤和脾細胞。離心後，上清液被丟棄，並用50%聚乙二醇(Roche)進行細胞融合。在HAT選擇培養基中培養融合細胞8-10天，將融合瘤培養上清液以高通量轉染和篩選系統篩選對hPD-1表現細胞的結合(S Yao等.Immunity.2011；34(5)：729-40)，且陽性株經流式細胞分析來證實。使用限制稀釋技術對陽性融合瘤進行亞選殖至少5次，以實現純單株培養。

實施例2：PD-1單株抗體的表徵

mAb的同種型：使用Mouse Immunoglobutin Isotyping Kit(BD Biosciences)鑒定mAb的同種型。所有五種PD-1 mAb均為IgG1同種型和κ鏈型。

抗hPD-1的結合特異性：以流式細胞術，使用在表面上表現hPD-1的CHO細胞(CHO/hPD-1)，來確定PD-1 mAb的特異性。將CHO/hPD-1細胞在冰上與抗PD-1 mAb培育。培育後，將細胞洗滌並用抗mIgG-APC(eBiosciences)進一步培育。流式細胞分析使用FACSVerse(BD Biosciences)進行。資料顯示，所有五個hPD-1 mAb高特異性結合hPD-1(圖1)。為了排除hPD-1 mAb與其它蛋白結合的可能性，以流式細胞分析將轉染了hB7-1、hPD-L1、hB7-H3、hB7-H4、hCD137或其它蛋白分子的CHO細胞用抗hPD-1 mAb染色。這些細胞也分別用它們各自的陽性抗體染色作為陽性對照。資料顯示，抗PD-1 mAb不結合此等測試的蛋白質(圖2)。

物種交叉反應性：為了評價抗hPD-1 mAb的物種特異性， 用Ficoll(Sigma Aldrich)從周邊血分離出食蟹猴(來自Guangdong landau Biotechnology Company)的周邊血單個核細胞(PBMC)。將PBMC懸浮於含有10% FCS的RPMI 1640培養基中，並放入預塗1μg/ml的抗hCD3的24孔板中。細胞培養2天。細胞首先用抗hPD-1染色。洗滌後，細胞用抗mIgG-APC和CD3-FITC；CD8-PerCP染色以供流式細胞分析。此外，使用小鼠PD-1轉染的CHO細胞(CHO/mPD-1)以流式細胞術測定mAb與小鼠PD-1的交叉反應性。

資料顯示，抗hPD-1 mAb可與人和食蟹猴T細胞上的PD-1蛋白結合，對小鼠PD-1未發現交叉結合(圖3)。

配體阻斷：為了檢查配體結合的阻斷，將100ng的hPD1hIg融合蛋白與指示劑量的mAb(400,300,200，100,50ng/10ul)或對照Ig在4℃下預培育30分鐘，然後用於染色CHO/hB7-H1細胞。洗滌細胞並用山羊抗hIgG-APC進一步染色。用流式細胞術檢測阻斷效果。

結果顯示，抗-hPD-1mAb 1和2(Ab1和Ab2)對配體阻斷無影響。Ab3、Ab4和Ab5可以以劑量依賴的方式阻斷hPD-1融合蛋白與hPD-L1的結合(圖4)。

競爭性結合分析：進行競爭性結合試驗研究這些mAb是否識別與hPD-1蛋白的相同或不同的結合位點。於4℃下，分別用五個過量的PD-1 mAb(10μg)預培育CHO/hPD-1細胞30分鐘。洗滌後，在4℃下用50ng不同生物素標記的mAb培育細胞20分鐘。使用流式細胞分析測量mAb的結合作用。

流式細胞分析顯示，Ab4和Ab5完全消除了彼此對hPD-1 蛋白的結合，飽和劑量的Ab3對Ab4和Ab5的結合有部分阻斷作用，而Ab1和Ab2對Ab4和Ab5與hPD-1的結合無阻斷作用(圖5)。因此，Ab4和Ab5在PD-1上的結合位點可能重疊。Ab1或Ab2和Ab4或Ab5藉由不同的介面與PD-1結合，這也被配體阻斷試驗所證實。

實施例3：產生抗PD-1抗體的融合瘤的測序及抗體人源化

產生抗PD-1 mAb的融合瘤的測序：將1×10⁷個融合瘤細胞收穫並用PBS洗滌。信使RNA使用RAeasy Mini Kit(Qiagen)從融合瘤中提取。利用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)合成了RACE-Ready第一鏈cDNA。在逆轉錄後，用準備好的cDNA為範本，由試劑盒提供的5’通用引子(UPM)，和根據小鼠IgG1重鏈可變區和κ輕鏈基因序列設計的3'基因特異性引子(GSP1)進行了5’ RACE PCR反應。藉由凝膠電泳分析確定RACE產物(圖6)。PCR產物用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen)選殖到T載體中。轉化後，質體以測序分析驗證。使用VBASE2(http：//www.vBas2.org)對抗體基因片段進行分析。序列在(表2)中公開。

重組抗體的蛋白表現和功能確定：為了確保重組抗體序列的正確性，將重組抗體重鏈和輕鏈的全長序列分別選殖到pcDNA3.1載體中，並暫時性轉染HEK 293T細胞。用蛋白G sepharose管柱(GE healthcare)純化來自細胞培養上清液的蛋白進行功能評價。

流式細胞分析資料表明，重組抗體可結合hPD-1蛋白，並能阻斷hPD-1融合蛋白與PD-L1蛋白的結合(圖7，小圖A、B)

抗人PD-1抗體的人源化：基於抗hPD-1融合瘤的可變重鏈 (VH)和可變輕鏈(VL)序列進行人源化。簡言之，首先構建了包含小鼠親本VH和VL序列以及人IgG4-S228P恒定區和人κ鏈的小鼠-人嵌合mAb。在鑒定嵌合抗體的特徵後，設計了三個VL和三個VL人源化序列，並用於製備九個人源化抗體。序列列表於(表3A和3B)。

實施例4：人源化抗體的特徵及功能

人源化抗體的結合力：將CHO/hPD-1細胞與系列稀釋的mAb培育。用流式細胞分析評估九種人源化抗體對PD-1蛋白的結合作用，並與嵌合親本抗體進行比較。

流式細胞分析結果顯示，一些突變體組合的結合活性高於親本抗體，一些與親本抗體相同或略低於親本抗體(圖8)。突變體組合列在下面的表4中。

人源化抗體的阻斷能力：測量人源化抗體阻斷hPD-1與hPD-L1結合的能力。在4℃下，用在10μL PBS中不同劑量的人源化抗體預培育100ng的hPD1mIg 30分鐘，然後將其用於對CHO/hB7-H1細胞進 行染色。將細胞洗滌並用山羊抗mIgG-APC進一步染色。用流式細胞術評價阻斷效果。使用類似的方法，測量人源化抗體阻斷hPD-1與hPD-L2結合的能力。

結果顯示，所有人源化抗體均以劑量依賴的方式抑制hPD-1mIgG與CHO/hPD-L1細胞的結合。一些突變體組合比嵌合親本抗體具有更高的阻斷能力(圖9)。結果還顯示，hPD-1mIgG與CHO/hPD-L2細胞的結合也被阻斷(圖10)。

人源化抗體的結合親和性和動力學測定：用Biacore T100(GE Healthcare Life Sciences)評估人源化PD-1 mAb與hPD-1蛋白相互作用的結合親和力和動力學。hPD-1mIg蛋白藉由胺偶聯固定在感測器晶片CM5上。濾過的人源化抗體用HBS-EP緩衝液pH7.4(GE Healthcare Life Sciences)稀釋，隨後注射在hPD-1mIg固定的表面上。對每個樣品測試九種不同濃度。詳細的結合動力學參數(締合速率，Ka，解離速率，Kd，以及親和常數，KD)可以藉由全動力學分析來確定。

分析資料顯示，突變體組合與嵌合親本抗體的締合速率(Ka)無顯著差異。在解離速率(Kd)上，三個突變體組合(3,6,9)接近嵌合親本抗體。所有的人源化抗體均有很強的親和力，其KD值在低奈米莫耳範圍(10^-10M)。兩個突變體組合(3,6)KD值接近嵌合親本抗體(9.89×10^-11M)(表4)。

抗PD-1對同種異體CD8+ CTL活體外殺傷PD-L1陽性腫瘤細胞的增強作用：基於抗PD-1抗體的抗腫瘤機制，本實施例設計了活體外模型以確定抗PD-1抗體對人同種異體CD8+細胞毒淋巴細胞(同種異體CD8⁺ CTL)殺傷腫瘤細胞的增強作用。首先，從人PMBC中分離出CD8+淋巴細胞，並與經輻射照射、轉染hB7-1的人黑色素瘤細胞(624Mel/B7-1)培養，產生同種異體CD8⁺cyto CTL。然後在人源化抗體或對照Ig的存在下，將同種異體CD8⁺ CTL在96孔板上與過夜培養的624 Mel/hPD-L1腫瘤細胞共培養5天。將平板孔中的細胞用0.5%結晶紫染色，並將平板用ELISA讀數器(ELISA reader)在540nm讀取。基於腫瘤細胞的存活率計算殺傷活性。

%細胞毒性=(100%活細胞對照孔的吸光度-測試孔的吸光度)/100%生活細胞對照孔的吸光度x 100

結果顯示，某些突變體組合可增強同種異體CTL細胞活體外殺傷腫瘤細胞的能力(圖11)。

選擇最佳組的突變體組合(變體3)，將蛋白編碼序列選殖到合適的表現載體中，並轉移到CHO細胞中，以產生抗hPD-1抗體，其也稱為TY101。

實施例5：TY101在癌症免疫治療中的特徵

PBMC中細胞素增強混合淋巴細胞反應(MRL)。使用Ficoll-Hypaque以密度梯度離心法分離來自健康個體的人周邊血單個核細胞(PBMC)。來自健康供體1的PBMC用40Gy劑量的X射線輻照作為刺激細胞。用人Pan T cell Isolation Kit(MiltenylBiotec)從健康供體2分離出T淋巴細胞作為反應細胞。將反應細胞和刺激細胞在含有10%FCS的完全RPMI培養基中重懸，並在系列稀釋的TY101或hIgG對照存在下，將每孔2.5×10⁵個反應細胞和1.25×10⁵個刺激細胞(R/S=2)接種到96孔板中。將細胞在37℃下在含5% CO₂的加濕培養箱中培養5天。在第5天藉由Cell Counting Kit-8(Dojindo Molecular Technologies,Inc)評估T細胞的增殖活性。為了檢測細胞素，在第3天和第5天收集培養上清液。使用Human Th1/Th2/Th17 Cytometric Bead Array kit(CBA；BD Biosciences)進行細胞素分析。

結果顯示，T細胞對TY101的增殖反應與對hIgG相似(圖12)。有趣的是，與施用hIgG相比，在施用了TY101的MLR的培養上清液中細胞素IL-2和IFNγ的產生顯著增加(圖13)。

阻斷PD-1在T淋巴細胞上的表現。PD-L1在腫瘤細胞中的表現可誘導腫瘤微環境中的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)上的PD-1表現，並觸發PD-1依賴性免疫抑制。本實施例設計了一個活體外模型，以確定TY101是否能在與hPD-L1轉染的腫瘤細胞培養時抑制人淋巴細胞上的 hPD-1表現。將從人PBMC分離的人T淋巴細胞與轉染hPD-L1的人黑色素瘤(624/hPD-L1)細胞在10μg/ml的TY101或對照IgG的存在下培養4天。以流式細胞術檢測hPD-1在淋巴細胞上的表現。

結果顯示，與只有培養基和hIgG對照相比，添加TY101完全抑制了淋巴細胞上的PD-1表現(圖14)。

人源化PD-1抗體的活體內抗腫瘤活性：研究TY101活體內抗腫瘤作用。將8周齡雌性人PD-1敲入(knock-in)小鼠(購自Shanghai Model Organisms Center,Inc.)，在第0天用hPD-L1轉染的MC38腫瘤細胞(MC38/hPD-L1)在右體側(right flank)皮下(s.c)移植(1×10⁶/小鼠)。在第6天、第9天和第13天，以腹膜內(i.p.)注射施用TY101或對照Ig(10mg/kg)。監測腫瘤大小和生存情況。

所有動物最初都有可檢測的腫瘤(在第6天為4-5毫米)。然而，在用TY101治療具有MC38/hPD-L1腫瘤的小鼠後，在100%的小鼠中發生了完全反應。用TY101處理的所有五隻小鼠中的腫瘤在第25天完全消退。與之相對，五隻接受對照IgG的小鼠中的兩隻發展出持續生長的腫瘤。在另三隻用對照IgG治療的小鼠中，儘管腫瘤在第32天也消退，但在兩隻小鼠中腫瘤很快復發(圖15)。結果顯示，TY101可增強活體內抗腫瘤效力。

實施例6：TY101與市售的PD-1抗體功能的比較

本實施例選擇了兩種目前已被批准用於癌症患者的臨床治療的抗hPD-1抗體，以與TY101比較：Merck的吉舒達(Keytruda)(帕博利珠單抗(pembrolizumab))和Bristol-Myers Squibb的保疾伏(Opdivo)(納武單抗(nivolumab))。

抗體結合親和力和動力學：用Biacore T200儀器(GE Healthcare Life Sciences)分析TY101的親和力和動力學，並與兩種市售抗體進行比較。在感測器晶片CM5上以低濃度(33RU)固定hPD-1mIg蛋白，將抗體作為分析物(流動相)來檢測相互作用。資料顯示，三種抗體的締合速率Ka差異不顯著。TY101略低於市售抗體。TY101的解離速率Kd比兩個市售抗體慢至十分之一，且TY101的親和力KD比市售抗體強至4-7倍。結果表明，TY101顯示出更強的結合(圖16)。

PD-1抗體在PD-1/PD-L1阻斷方面的比較：用PD-1/PD-L1Blockade Bioassays Kit(Promega)進行PD-1/PD-L1阻斷生物測定。將1×10⁵個細胞/孔的Jurkat-PD1細胞以過夜培養的CHO-PD-L1細胞(培養開始於5x10⁴個細胞/孔)在不透明的96孔TC板中，在TY101、帕博利珠單抗、納武單抗或陰性對照hIgG4的系列稀釋(0~30μg/ml)的存在下刺激5h。在培育5h後，在SpectraMAX L光度計上，用ONE-Glo受質(Promega)以相對光單位(RLU)測量螢光素酶活性，來檢測Jurkat-PD-1細胞活化。

分析資料顯示TY101和兩種市售抗體可以阻斷PD-1/PD-L1途徑。TY101的阻斷效應與帕博利珠單抗相似，而優於納武單抗(圖17)。

活體外腫瘤細胞生長抑制作用的比較：如前所述，在不同的mAb和對照IgG的存在下，將同種異體CD8⁺ CTL細胞在96孔板上與過夜培養的624 Mel/PD-L1腫瘤細胞共培養5天。將細胞用0.5%結晶紫染色，並將平板用ELISA讀數器在540nm讀取。基於腫瘤細胞的存活率計算殺傷活性。

結果顯示，所有三種抗PD-1MAb均能增強同種異體CD8⁺CTL的腫瘤殺傷活性。TY101的增強作用高於兩種市售抗體(圖18)。

實施例7：開發TY101選殖株及其活性

將TY101序列選殖到專有(proprietary)表現載體中，並轉染CHO細胞。採用ClonePix和/或限制稀釋法建立單株細胞株。建立了多個選殖株，並對3個此等選殖株(TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1)產生的抗體進行表徵。

測試抗體與hPD-1或mPD-1蛋白結合(ELISA)

以ELISA法檢測抗體對hPD-1的結合及對mPD-1蛋白的交叉反應性。在用1μg/ml hPD-1或mPD-1預塗的ELISA平板上加入系列稀釋的測試抗體。然後加入HRP結合的山羊抗人IgG或山羊抗小鼠IgG抗體，隨後加入受質四甲基聯苯胺(TMB)，並在450nm波長下用SpectraMax Plus 384 Microplate Reader(Molecular Device,LLC.,Sunnyvale,CA)定量。測試的TY101選殖株TY101-01-09，TY101-04-T3-05和TY101-4G1顯示與hPD-1蛋白具有良好的結合，EC50在0.01~0.15nm範圍。抗體沒有呈現出與mPD-1蛋白的結合(圖19)。

測試抗體與表現hPD-1和cPD-1的CHOK1細胞的結合(流式細胞術)

使用表現hPD-1或食蟹猴PD-1(cPD-1)的CHOK1的細胞，以流式細胞術測試抗體對hPD-1的結合以及對cPD-1的交叉反應性。將CHOK1-hPD-1、CHOK1-cPD-1和CHOK1空白細胞(blank)與系列稀釋的試驗製品培育，隨後用Alexa Fluor® 488結合的山羊抗人IgG(H+L)抗體培育，並使用FACSCanto II(BD Biosciences,San Jose, CA)進行分析。測試的TY101選殖株TY101-01-09，TY101-04-T3-05和TY101-4G1顯示與CHOK1-hPD-1具有亞奈米莫耳級的EC50以及與CHOK1-cPD-1細胞具有個位數奈米莫耳EC50的良好結合(圖20)。

測試抗體對hPD-1/hPD-L1或hPD-1/hPD-L2結合的阻斷活性(流式細胞術)

進一步測試這些抗體阻斷hPD-1/hPD-L1以及hPD-1/hPD-L2結合的活性，這會是癌症患者治療潛在有效性的關鍵。將CHOK1-hPD-1細胞同與生物素-hPD-L1或生物素-hPD-L2混合的系列稀釋的試驗製品培育。然後用Alexa 488標記的鏈黴親和素培育細胞，並使用FACSCanto II進行分析。抗hPD-1抗體TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1阻斷hPD-L1與表現hPD-1的CHOK1細胞的結合，IC50在1.15~1.47nm。其亦阻斷hPD-L2與表現hPD-1的CHOK1細胞的結合，IC50s在1.2-2.33nm(圖21)。

用人混合白細胞反應(MLR)試驗測試抗體對T細胞的作用

以分離自2個供體的T細胞於人MLR試驗中測試此等抗體對T細胞功能的影響。粘附的PBMC(主要是單核細胞，從供體1分離並在細胞培養皿中鋪板以允許粘附)在100ng/ml重組人(rh)GM-CSF和50ng/ml rhIL-4的存在下培養5天，在3天後更換一半體積的培養基，在第6天添加1μg/ml LPS。在第7天，收穫所得的細胞(主要是成熟的DC)且以絲裂黴素C處理。CD3+T細胞以EasySep^TM Human T Cell Isolation Kit(陰性選擇，STEMCELL Technologies)從供體2和3分離。將DC和T細胞在3種濃度(5、0.5、0.05μg/ml)的測試抗體的存在下共培養5天。3天後收穫上清液，測定IL-2濃度，並5天後(100μL)測定IFN-γ濃度。抗 hPD-1抗體TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1，與同種型對照hIgG4相比，以劑量依賴性方式促進來自兩個供體的細胞的IL-2和IFN-γ分泌(圖22)。

工程化腫瘤細胞-人T細胞共培養法測試抗體對T細胞的作用

利用從4個不同供體分離的T細胞，在工程化腫瘤細胞人-T細胞共培養試驗中測試此等抗體對T細胞功能的影響。以EasySep^TM Human T Cell Isolation Kit從4個供體的PBMC中分離出CD3⁺T細胞。工程化腫瘤細胞Hep3B-OSC-hPDL1，其係經工程化穩定表現OS8(抗CD3單鏈可變片段(scFv))以及hPD-L1的Hep3B細胞(KCLB，目錄號：88064)，以絲裂黴素C處理，並在3個濃度(5，0.5，0.05μg/ml)的測試抗體存在下與CD3⁺T細胞共培養3天，收穫培養上清液以測定IFN-γ濃度。當與同種型對照hIgG4相比時，抗hPD-1抗體TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1以劑量依賴性方式促進來自所有4個供體的細胞分泌IFN-γ(圖23)。

實施例8：與FDA批准的抗hPD-1抗體相比，TY101選殖株顯示出更好的結合親和力 用競爭性ELISA測試抗體抗原決定基重疊

在競爭性ELISA測定中測試此等抗體是否與FDA批准的抗hPD-1抗體納武單抗或帕博利珠單抗結合到相同的抗原決定基。將競爭性抗體和生物素-hPD-1的系列稀釋加入到預塗有1μg/ml測試抗體的ELISA平板中。然後加入HRP結合的鏈黴親和素，隨後加入受質TMB，並在450nm波長下用SpectraMax Plus 384 Microplate Reader定量。抗-hPD-1抗體TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1幾乎完全阻斷了彼此 與hPD-1的結合，提示其具有相似的抗原決定基。這3種抗體也幾乎完全阻斷了納武單抗和帕博利珠單抗對hPD-1的結合(93%至94%)，而納武單抗和帕博利珠單抗僅部分阻斷了這些抗體與hPD-1的結合(對納武單抗為77%-78%，對帕博利珠單抗為46%-49%)。這些資料表明，TY101-01-09，TY101-04-T3-05和TY101-4G1抗體結合不同於納武單抗B和帕博利珠單抗的抗原決定基，且其對hPD-1的親和力可能高於納武單抗B和帕博利珠單抗(圖24)。

藉由SPR測定測試抗體與hPD-1的結合親和力

為了獲得對hPD-1的結合親和力的準確測量，以SPR分析抗體TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1以及納武單抗和帕博利珠單抗。將人PD-1 ECD蛋白固定在CM5感測器晶片上不同的時間長度，以在流動池(flow cell)3中達到低的固定化水平(在60RU)及在流動池4中的高固定化水平(960RU)。將系列稀釋(0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25和50nM)抗體注射到流動池中。締合時間為180s，解離時間為600s(對於納武單抗和帕博利珠單抗)或1500s(對於TY101-01-09，TY101-04-T3-05和TY101-4G1)。在參考(流動池1)和零濃度的信號從樣品中減去之後，使用BiaCore T200評價軟體版本1.0和1：1結合模型計算結合動力學以進行曲線擬合(curve fitting)。對照人IgG4與hPD-1無結合。基於低固定化水平的hPD-1(~60RU；表3；圖23)的數據，抗hPD-1抗體TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1對人PD-1的締合速率略低於納武單抗和帕博利珠單抗(2到4分之一)。這3種抗體的人PD-1的解離速率比納武單抗和帕博利珠單抗慢至12~30分之一，導致它們的親和力比納武單抗和帕博利珠單抗高至4-8倍 (較低的K_D對應於更好的親和性，反之亦然；表3)。抗hPD-1抗體TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1與hPD-1的結合親和力也在高固定化水平hPD-1上進行測試。抗體TY101-01-09，TY101-04-T3-05和TY101-4G1顯示非常緩慢的解離速率，甚至在1500秒的解離時間後也幾乎無解離(圖23)。資料顯示，TY101-01-09、TY101-04-T3-05和TY101-4G1的結合親和力優於納武單抗和帕博利珠單抗，主要是由於緩慢的解離速率(圖25)。

本發明的範圍不受所描述的具體具體實施例的限制，所述具體實施例旨在作為本發明的各個方面的單一說明，並且任何功能等同的組合物或方法都在本發明的範圍內。對於本領域技術人員來說，顯然在不脫離本發明的精神或範圍的情況下，可以在本發明的方法和組合物中進行各種修改和變化。因此，本案旨在涵蓋了本發明的修改和變化，前提是其在所附申請專利範圍及其等同的範圍內。

本說明書中提及的所有出版物和專利申請案均以引用併入本文，如同各個單獨的出版物或專利申請案被具體地和個別地標示引用併入本文。

<110> 中國大陸商大有華夏生物醫藥集團有限公司(TAYU HUAXIA BIOTECH MEDICAL GROUP CO.,LTD.)

<120> 抗PD-1抗體及其用途

<140> TW 107117605

<141> 2018-05-23

<160> 48

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> 其他特徵

<222> (4)..(4)

<223> Xaa為空間填充物，無需胺基酸

<400> 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 6

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 7

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 8

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 9

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> 其他特徵

<222> (4)..(4)

<223> Xaa為空間填充物，無需胺基酸

<400> 11

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 12

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 16

<210> 17

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> 其他特徵

<222> (4)..(4)

<223> Xaa為空間填充物，無需胺基酸

<400> 17

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 18

<210> 19

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 19

<210> 20

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 20

<210> 21

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 21

<210> 22

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 22

<210> 23

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 23

<210> 24

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 24

<210> 25

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 25

<210> 26

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 26

<210> 27

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 27

<210> 28

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 28

<210> 29

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 29

<210> 30

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 30

<210> 31

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 31

<210> 32

<211> 1357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 32

<210> 33

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 33

<210> 34

<211> 661

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 34

<210> 35

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 35

<210> 36

<211> 373

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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<210> 37

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 37

<210> 38

<211> 373

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 38

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 39

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 40

<210> 41

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 41

<210> 42

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 43

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成

<400> 44

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成

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<223> 合成

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<223> 合成

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<223> 合成

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Claims (16)

1. 一種對人程式性細胞死亡蛋白1(PD-L1)具有特異性的經分離抗體或其片段，其中該抗體或其片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列。
2. 如請求項1之抗體或其片段，進一步包括重鏈恆定區、輕鏈恆定區、Fc區或其組合。
3. 如請求項2之抗體或其片段，其中該輕鏈恆定區是κ鏈或λ鏈恆定區。
4. 如請求項1之抗體或其片段，其中該抗體或其片段是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD的同種型(isotype)。
5. 如請求項4之抗體或其片段，其中該同種型為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
6. 如請求項1之抗體或其片段，其中該抗體或其片段是人源化抗體。
7. 一種組合物，其包含如請求項1-6中任一項之抗體或其片段及藥學上可接受的載體。
8. 一種經分離細胞，其包含一個或多個編碼如請求項1-6中任一項之抗體或其片段的多核苷酸。
9. 一種如請求項1-6中任一項之抗體或其片段之用途，其係用於製備治療癌症的藥物。
10. 如請求項9之用途，其中該癌症選自由以下組成之群：膀胱癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、頭頸部癌、胃腸道癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、腎癌、黑色素瘤、前列腺癌及甲狀腺癌。
11. 如請求項9之用途，其中該治療癌症包括：(a)用如請求項1-6中任一項之抗體或其片段在活體外處理細胞；(b)將經處理的細胞施用於患者。
12. 如請求項11的用途，其中該細胞是T細胞。
13. 一種如請求項1-6中任一項之抗體或其片段之用途，其係用於製備治療感染的藥物。
14. 如請求項13之用途，其中該感染是病毒感染、細菌感染、真菌感染或寄生蟲感染。
15. 一種如請求項1-6中任一項之抗體或其片段之用途，其係用於製備治療免疫病症的藥物。
16. 如請求項15之用途，其中該免疫病症選自由以下組成之群：感染、與感染相關的內毒素休克、關節炎、類風濕性關節炎、哮喘、COPD、盆腔炎性疾病、阿爾茨海默(Alzheimer's)病、炎性腸病、克羅恩(Crohn's)病、潰瘍性結腸炎、佩羅尼氏(Peyronie's)病、乳糜瀉、膽囊疾病、藏毛病(Pilonidal disease)、腹膜炎、牛皮癬、血管炎、手術粘連、中風、I型糖尿病、萊姆病、關節炎、腦膜腦炎、自體免疫性葡萄膜炎、免疫介導的中樞和周邊神經系統炎性疾病、多發性硬化、狼瘡和格林-巴利(Guillain Barr)綜合症、異位性皮膚炎、自體免疫性肝炎、纖維性肺泡炎、葛瑞夫茲氏(Grave's)病、IgA腎病、特發性血小板減少性紫癜、梅尼爾氏(Meniere's)病、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬化、結節病、硬皮病、韋格納肉芽腫、胰腺炎、創傷、移植物抗宿主病、移植排斥反應、缺血性疾病、心肌梗死、動脈粥樣硬化、血管內凝血、骨吸收、骨質疏鬆、骨關節炎、牙周炎、胃酸過少及與母胎(fetal-maternal)免疫耐受缺失有關的不孕。