TWI805777B - 預測前列腺癌惡化之生物標記 - Google Patents

Abstract

本發明係有關預測前列腺癌預後及/或監控前列腺癌惡化之生物標記、方法、及試驗套組。生物標記包括醣基轉移酶[核心1 β-3-半乳糖基轉移酶(C1GALT1)及/或ST3 β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶1 (ST3GAL1)]基因產物、其醣受質/產物、及/或半乳糖凝集素-4基因產物。

Description

預測前列腺癌惡化之生物標記

相關申請案。本申請案係依據35 U.S.C. §119，主張於2018年6月8日申請之美國暫時專利申請號62/682,410的權益，其揭示之全部內容在此併入本案以作為參考資料。

本發明係有關一種預測前列腺癌預後及/或監控前列腺癌惡化之生物標記、方法、及試驗套組。

雄性激素剝奪療法(ADT)代表先進的前列腺癌(PCa)治療骨幹，係因雄性激素受體(AR)傳訊在PCa發病機制中的關鍵角色。然而，在大多數病患中，利用ADT的治療，如第一線的亮丙瑞林(leuprolide)、戈舍瑞林(goserelin)、或比卡魯胺(bicalutamide)，以及第二線的阿比特龍(abiraterone)或安可坦(enzalutamide)，最終導致去勢抗性PCa (CRPC)且進一步發展成致命的轉移性疾病mCRPC (1)。在疾病惡化成CRPC的過程中，發現到HER2表現上調；以及藉由使細胞株與異種移植模型強制表現HER2的異常HER2傳訊活性，導致CRPC的腫瘤生長，其中HER2/HER3發現能促進AR蛋白穩定性與轉錄活性(2-4)。在阿比特龍抗性PCa病患族群中，發現HER2活化增加，可能係因雄性激素傳訊喪失的補償作用(5)。然而，HER2標靶治療的臨床試驗在CRPC病患中尚未發揮作用(6-8)。

累積證據顯示，醣化作用改變，同時獲得腫瘤惡化所需之細胞特徵，代表腫瘤相關聯之聚醣在診斷或治療標靶時具有潛在價值(9)。醣化作用具有顯著動態性，且通常在癌症中發生改變，導致癌症相關聯抗原的表現，有時稱作癌胚抗原(oncofetal antigen)，其概括正常情況下侷限在胚胎組織的表現。腫瘤表面上的數個聚醣，如Tn、唾液酸基-Tn、及T抗原，經確定在腫瘤惡化，如細胞週期失調、細胞黏附、侵襲活性、及血管生成(angiogenesis)，的各步驟過程中介導關鍵病理生理事件(9, 10)。舉例而言，在黑色素瘤中利用FUT8上調岩藻糖化作用(fucosylation)能驅動入侵與轉移(11)。腫瘤相關聯之碳水化合物與多重體外模型之抗藥性有關(12)，且亦可作為預測以含蒽環(anthracycline)輔助性化療之乳癌病患療效的預後標記(13)。在癌胚聚醣抗原之中，Galβ1-3GalNAcα雙醣(T抗原或CD176)高度表現在約60-90%的前列腺癌、乳癌、結腸癌、及胃癌中(14)。利用C1GALT1，將源自UDP-Gal之半乳糖(Gal)殘基轉移至N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc) 共軛連接之蛋白，以合成黏蛋白型核心1O -聚醣之T抗原，其正確折疊與定位取決於C1GALT1C1的伴護蛋白(COSMC)活性。表現在轉移性肺癌細胞表面上的T抗原在轉移性微環境（niche）中通過與半乳糖凝集素-3-攜帶型骨髓細胞交互作用而促進轉移(15)。值得注意的是，在肺癌、乳癌、及肝癌中，鑑定出T抗原與CD44或CD133 (癌症幹細胞之標記)的共同表現(16)。儘管有相當多的證據顯示，在多個癌症類型中，癌胚聚醣的發生與腫瘤惡化之間存在正相關，但在PCa中醣化作用改變之角色尚未被充分研究。

本發明首次證實，特定之醣基轉移酶[核心1 β-3-半乳糖基轉移酶(C1GALT1)與ST3 β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶1 (ST3GAL1)]基因產物及半乳糖凝集素-4基因產物係與前列腺癌惡化高度相關聯，因此醣基轉移酶基因產物與半乳糖凝集素-4基因產物，還有醣基轉移酶(例如，UDP-GalNAc、UDP-Gal、CMP-唾液酸)所使用的醣受質及由醣基轉移酶形成之醣產物(亦即，唾液酸基-T-抗原)可用作預測前列腺癌預後及/或監控前列腺癌惡化特異性分子標記。

因此，在一方面，本發明提供一種預測前列腺癌預後之方法，其包含： (i)                提供罹患前列腺癌之個體生物樣本；以及 (ii)             檢測樣本中第一標記與第二標記，其中第一標記為醣基轉移酶基因產物及/或其醣受質/產物，其係選自於由核心1 β-3-半乳糖基轉移酶(C1GALT1)、ST3 β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶1 (ST3GAL1)、UDP-GalNAc、UDP-Gal、CMP-唾液酸、唾液酸基-T-抗原、及其任何結合物組成之群組，且第二標記為半乳糖凝集素-4基因產物。

在一些具體實施例中，基因產物可為蛋白質或RNA轉錄本。

在一些具體實施例中，第一標記係以第一試劑檢測，其特異地結合至醣基轉移酶或其醣受質或產物。

在一些具體實施例中，第二標記係以第二試劑檢測，其特異地結合至半乳糖凝集素-4基因產物。

在一些具體實施例中，第一試劑為抗體及/或第二試劑為抗體。

具體而言，檢測係利用質譜試驗或免疫試驗進行。

在本文所述之方法中，欲檢測之生物樣本可為體液樣本或組織樣本。體液樣本之實例包括但不侷限於，精液、血液、及尿液。

在一些具體實施例中，本文所述之方法可進一步包含比較檢測結果與參考量，並依據比較的結果預測個體之預後。在一些實例中，相較於對照組樣本中不存在標記(例如，參考值為0)，樣本中存在標記表示前列腺癌預後不良。在其他實例中，標記量增加表示預後不良。

在一些具體實施例中，預後不良係選自於由存活率降低、腫瘤大小或數量增加、轉移風險增加、抗雄性激素剝奪療法(ADT)的風險增加、復發風險增加、及其任何結合物組成之群組。

在另一方面，本發明提供一種監控罹患前列腺癌病患之前列腺癌惡化的方法，其包含： (a)         在第一時間點提供病患之第一生物樣本； (b)        在第二時間點提供病患之第二生物樣本，第二時間點比第一時間點晚； (c)         檢測第一與第二生物樣本中第一標記與第二標記之量，其中第一標記為醣基轉移酶基因產物及/或其醣受質/產物，其係選自於由核心1 β-3-半乳糖基轉移酶(C1GALT1)、ST3 β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶1 (ST3GAL1)、UDP-GalNAc、UDP-Gal、CMP-唾液酸、唾液酸基-T-抗原、及其任何結合物組成之群組，且第二標記為半乳糖凝集素-4基因產物；以及 (d)        依據第一與第二生物樣本中第一標記與第二標記之量，決定病患之前列腺癌惡化情形，其中相較於第一生物樣本，第二生物樣本中第一標記及/或第二標記之量增加，表示前列腺癌惡化。

亦提供一種進行本文所述方法之套組，其包含第一試劑，其特異地辨識第一標記，及第二試劑，其特異地辨識第二標記，以及以套組檢測第一生物標記及/或第二生物標記之存在或數量的說明書。

進一步提供試劑之用途，其特異地辨識本文所述之生物標記，用於預測前列腺癌預後或監控前列腺癌惡化之方法，或製造進行預測前列腺癌預後之方法或監控前列腺癌惡化之方法的套組或組成物。

在一些具體實施例中，試劑係選自於由(i)特異地辨識C1GALT1之分子，(ii)特異地辨識ST3GAL1之分子，(iii)特異地辨識UDP-GalNAc之分子，(iv)特異地辨識UDP-Gal之分子，(v)特異地辨識CMP-唾液酸之分子，(vi)特異地辨識唾液酸基-T-抗原之分子，(vii)特異地辨識半乳糖凝集素-4基因產物之分子，以及(viii)(i)至(vii)之任何結合物組成之群組。

下列描述闡述本發明之一或多個具體實施例之細節。從以下數個具體實施例之詳細描述及從所附申請專利範圍，本發明之其他特徵或優勢將顯而易見。

散播性去勢抗性前列腺癌(disseminated CRPC)為男性常見疾病，其特徵在於侷限之存活率及具有雄性激素剝奪療法(ADT)抗性。在CRPC病患亞組中，HER2傳訊增加有助於雄性激素受體(AR)活性；然而，令人費解的是，CRPC病患的HER2標靶治療顯示缺乏療效。異常的醣化作用為癌症標誌，且涉及支持癌症惡化的關鍵過程。在本研究中，利用PCa數據集的轉錄組分析、臨床標本的組織病理學檢查、及異種移植模型的體內實驗，發明人顯示，聚醣結合蛋白半乳糖凝集素-4、特異性醣基轉移酶(C1GALT1與ST3GAL1)、及CRPC惡化過程中產生的黏蛋白型O -聚醣可協調增長。此外， 半乳糖凝集素-4連同C1GALT1依賴性O -聚醣以促進去勢抗性與轉移，其係藉由活化RTK傳訊與SOX9介導之癌細胞幹性性質。此半乳糖凝集素-聚醣交互作用上調MYC依賴性C1GALT1與ST3GAL1表現，其改變細胞黏蛋白型O -醣化作用，以容許半乳糖凝集素-4結合。在臨床PCa中，相較於低量表現的C1GALT1與半乳糖凝集素-4，高量表現的C1GALT1與半乳糖凝集素-4可共同預測出較差的總體存活率。結論為，MYC調節異常的O -醣化作用，因此引發細胞結合半乳糖凝集素-4與下游傳訊，其促進去勢抗性與轉移。

本發明揭示了特定之醣基轉移酶[核心1 β-3-半乳糖基轉移酶(C1GALT1)與ST3 β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶1 (ST3GAL1)]基因產物及/或醣基轉移酶使用之醣受質(包括UDP-GalNAc、UDP-Gal、CMP-唾液酸)與醣基轉移酶形成之醣產物(亦即，唾液酸基-T-抗原)可作為預測前列腺癌預後及/或監控前列腺癌惡化之特異性分子標記。

以下描述僅旨在說明本發明之多個具體實施例。因此，於此討論的特殊具體實施例或修正不應理解為侷限本發明之範疇。本領域技術人員顯而易見的是，在不悖離本發明範疇的情況下，可進行各種改變或等同物。

除非上下文中另有明確說明，本文中使用的單數形式「一」、「一者」、及「該」包括複數參考體。因此，舉例而言，「一組分」之引用可包括複數個此類組分及本領域技術人員習知之其等同物。

「包含」或「含有」等詞一般而言用於包括/包括了的意義，其意指允許存在一或多個特徵、成分、或組分。「包含」或「含有」等詞涵蓋「包括」或「由~組成」等詞。

本文中使用的「約」或「大約」等詞意指一程度之可接受偏差，其為本領域普通技術人員可理解的，其可在一定程度上變化，取決於使用其之上下文。一般而言，「約」或「大約」可指引用值附近具有±10%範圍的數值。

本文中使用的「核酸片段」、「核酸」、及「多核苷酸」等詞於此可互換使用，意指一由核苷酸單元組成的聚合物，包括天然存在的核酸，如去氧核糖核酸(「DNA」)與核糖核酸(「RNA」)，以及核酸類似物，包括彼等具有非天然存在之核苷酸者。因此，彼等術語包括但不侷限於，單股、雙股、或多股DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、mRNA、DNA-RNA雜交體、或聚合物，該聚合物包含嘌呤與嘧啶鹼基或其他天然、以化學或生物化學方式改良、非天然、或衍生之核苷酸鹼基。應理解的是，當一核酸片段以DNA序列(亦即，A、T、G、C)表示時，其亦包括RNA序列(亦即，A、U、G、C)，其中「U」取代「T」。

本文中使用的「引子」乙詞意指一特異性寡核苷酸序列，其與一標靶核苷酸序列互補，且用以雜交標靶核苷酸序列。引子可作為核苷酸聚合作用的起始點，其係由DNA聚合酶、RNA聚合酶、或反轉錄酶進行催化反應。舉例而言，CIGALTs與半乳糖凝集素-4之引子，如本文中個別使用的，為彼等能雜交個別標靶基因之核苷酸序列者，以啟動核苷酸聚合反應，並依據設計之引子序列如預期產生核苷酸產物。

本文中使用的「探針」乙詞意指一定義之核酸片段(或核苷酸類似物片段，例如，如本文定義之多核苷酸)，其可用於鑑定雜交過程中存在於樣本中的特異性多核苷酸序列，該核酸片段包含與欲鑑定之特異性多核苷酸序列互補的核苷酸序列。典型上，探針可產生一可檢測信號，係因其以特定方式標記，舉例而言，藉由併入一報導子分子，如螢光團或放射性核種或酵素。舉例而言，CIGALTs與半乳糖凝集素-4之探針，如本文中個別使用的，為彼等能與個別標靶基因之相應核苷酸序列特異性雜交並產生由此雜交作用產生的可檢測信號者。

本文中使用的「雜交作用」乙詞應包括一核酸鏈經由鹼基配對與互補鏈連接的任何過程。相關技術係本領域中習知，且描述於，舉例而言，Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)，以及Frederick M.A. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (2001)。典型而言，在規定的離子強度與pH下，所選擇的嚴格條件比指定序列之熱熔點(T_m )低約5至30°C。更典型而言，在規定的離子強度與pH下，所選擇的嚴格條件比指定序列之T_m 低約5至15°C。舉例而言，嚴格雜交作用條件為彼等鹽濃度小於約1.0 M的鈉(或其他鹽類)離子者，典型上為在約pH 7.0至約pH 8.3下約0.01至約1 M的鈉離子濃度，其中短探針(例如，10至50個核苷酸)的溫度至少約25°C，且長探針(例如，大於50個核苷酸)的溫度至少約55°C。一長探針(例如，大於50個核苷酸)之示例性非嚴格或低嚴格條件包含一緩衝液(20 mM Tris，pH 8.5，50 mM KCl，及2 mM MgCl₂ )，以及一反應溫度25°C。

本文中使用的「編碼」乙詞意指多核苷酸(例如，基因、cDNA、或mRNA)中特殊序列核苷酸之固有性質，以作為一模板，用於合成具有一定義之核苷酸序列(亦即，rRNA、tRNA、及mRNA)或一定義之胺基酸序列的基因產物，並從其產生生物性質。

本文中使用的「表現」乙詞意指實現編碼在基因中的基因訊息以產生基因產物，如未剪接之RNA、mRNA、mRNA剪接變體、多胜肽、或蛋白質、轉譯後修飾之多胜肽、多胜肽剪接變體等等。

本文中使用的「表現量」乙詞意指由細胞中特定基因表現之基因產物的量，其可由本領域習知之任何適用方法確定。

在本文中，「多胜肽」與「蛋白質」等詞可互換使用，意指任何長度之胺基酸聚合形式，其可包括編碼與非編碼之胺基酸、以化學或生物化學方式修飾或衍生之胺基酸、及具有修飾之胜肽骨架的多胜肽。

本文中使用的「抗體」乙詞意指免疫球蛋白，其能結合抗原。本文中使用的抗體意指包括完整抗體，以及能結合感興趣之表位、抗原、或抗原片段的任何抗體片段(例如，F(ab').sub.2、Fab'、Fab、Fv)。本發明之抗體具有免疫反應性或免疫特異性，因此能特異地與選擇性地結合感興趣之蛋白質，例如，C1GALTs與半乳糖凝集素-4。用於感興趣之蛋白質的抗體較佳地具有免疫特異性，亦即，實質上不與相關材料交叉反應，儘管其可辨識出其跨物種的同源物。「抗體」乙詞涵蓋所有類型的抗體(例如，單株與多株)。

本文中使用的生物學標記(或稱作生物標記或標記)為以客觀方式測量與評估之特徵，作為正常或異常生物過程/狀況、疾病、致病過程、或對處理或治療干預之反應的指標。標記可包括存在或不存在特徵或樣貌或特徵之集合，其為特定生物過程/條件的指標。標記通常用於診斷與預後目的。然而，其可用於治療、監控、藥物篩選、及其他本文所述之目的，包括評估癌症治療之效用。

使用於此，欲以本文所述方法之任一者分析的生物樣本可為取自欲檢測個體之任何類型樣本。在一些具體實施例中，生物樣本可為體液樣本，如血液樣本、尿液樣本、腹水樣本、或精液樣本。典型上，生物樣本為尿液樣本。在其他具體實施例中，血液樣本可為全血或其分液，例如，血清或血漿，經肝素化或EDTA處理，以避免血液凝固。或者，生物樣本可為組織樣本或腫瘤之生檢樣本。

本文中使用的「受試者」、「個體」、及「病患」等詞在此可互換使用，意指需要診斷、預後、處理、或治療的哺乳類動物個體，特別是人類。其他個體可包括牛、犬、貓、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、馬等等。

本文中使用的「診斷」乙詞一般而言包括確定個體是否受到指定之疾病、病症、或功能障礙的影響。技術人員通常基於一或多個診斷指標(亦即，一標記)進行診斷，其存在、不存在、或量為疾病、病症、或功能障礙存在或不存在之指標。本領域將理解的是，診斷並不意指以100%準確度確定特定疾病之存在或不存在，而是個體存在特定疾病之可能性增加。

本文中使用的「預後」乙詞一般而言意指預測臨床病症或疾病之可能病程與結果。病患之預後通常藉由評估疾病之因子或症狀，彼等為疾病之有利或不利過程或結果的指標。應理解的是，「預後」乙詞不一定意指能100%準確預測病況的過程或結果。相反地，技術人員將理解的是，「預後」乙詞意指特定病程或結果發生的可能性增加；也就是說，當相較於沒有表現病況之個體時，一給定病況之病患更可能發生過程或結果。可以理解的是，積極的預後典型上意指有益的臨床結果或前景，如長期存活且個體之癌症狀況沒有復發，而預後不良典型上意指負面的臨床結果或前景，如癌症復發或惡化。在特定具體實施例中，預後不良係選自於由存活率降低、腫瘤大小或數量增加、轉移風險增加、抗雄性激素剝奪療法(ADT)的風險增加、復發風險增加、及其任何結合物組成之群組。

本文中使用的「治療」乙詞意指將一或多個活性劑施加或投予個體，該個體患有病症、病症之症狀或病況、或病症惡化，其中目的為治癒、拯救、緩解、紓緩、改變、補救、改善、改進、或影響疾病、疾病之症狀或病況、由疾病引起的殘疾、或疾病之惡化或易感受性。

本文中使用的「正常個體」乙詞可互換使用，意指個體健康且不患有疾病(例如，前列腺癌)，且可指單一正常個體或一群正常個體。

本文中使用的「異常量」可指一量相較於參考量係增加。舉例而言，一異常量可高過參考量10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%。在一些具體實施例中，以待測個體之本文所述生物標記表現量與基於歷史數值之標準量進行比較。舉例而言，標準量之設定，可依據個體之世代研究獲得的相應生物樣本中此生物標記之平均或中位數表現量。舉例而言，個體之同期群（cohort）可為一組參與臨床試驗的前列腺癌病患。在特定具體實施例中，個體之同期群可為一組在疾病初級/早期階段而無惡化(例如，轉移或具有雄性激素剝奪療法(ADT)抗性)的前列腺癌病患。在一些具體實施例中，參考量可指在正常個體或樣本(例如，組織或細胞)中測得之未患病處(鄰近之非癌症/正常組織)量。

本文中使用的生物標記「低度表現」或「高度表現」為相對的術語，意指樣本中發現的生物標記量。在一些具體實施例中，基於樣本中此生物標記之表現是否高於(高度)或低於(低度)平均值或中位數表現量，可隨即將各樣本分派為低度與高度表現。在一些具體實施例中，低度與高度表現可藉由比較生物標記在非癌症樣本中的表現量而定，其中低度表現可指表現量比在非癌症樣本中的表現量更低或可比較，且高度表現可指表現量比在非癌症樣本中的表現量更高。

本文中使用的半乳糖凝集素-4為蛋白質，其在人類中由LGALS4 基因所編碼。核心1 β-3-半乳糖基轉移酶(C1GALT1)為酵素，其在人類中由C1GALT1 基因所編碼。ST3 β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸基轉移酶1 (ST3GAL1)為酵素，其在人類中由ST3GAL1 基因所編碼。上述生物標記基因之核苷酸序列及其基因產物之相應胺基酸序列為本領域中習知。半乳糖凝集素-4或LGALS4 NCBI基因ID：3960。其外部連結ID：HGNC：6565。Entrez基因：3960。Ensembl：ENSG00000171747。OMIM：602518。UniProtKB：P56470。C1GALT1 ID：HGNC: 24337。Entrez基因：56913。Ensembl：ENSG00000106392。OMIM：610555。UniProtKB：Q9NS00。ST3GAL1 ID：HGNC: 10862。Entrez.基因：6482。Ensembl：ENSG00000008513。OMIM：607187。UniProtKB：Q11201。

欲進行本文所述之方法，生物樣本可取自有需求之個體，且生物樣本中的第一標記及/或第二標記可經由本領域習知之任何方法(如質譜法與免疫試驗)檢測或測定。生物樣本可為生物流體樣本，如精液、血液、及尿液。標記之檢測可為定量或定性。在一具體實施例中，分析取自有需求之個體的樣本存在或不存在標記。若取自有需求之個體的樣本檢測到標記，則個體鑑定為前列腺癌預後不良。在一些具體實施例中，可將取自候選個體樣本之標記量與參考量進行比較，以確定是否候選個體具有前列腺癌預後不良。在源自候選個體生物樣本中檢測到的更高量標記，表示候選個體具有前列腺癌預後不良。在一些實例中，利用常規試驗(例如，質譜與免疫試驗)，在對照組樣本中未檢測出標記的量(亦即，參考值為0)，而利用相同試驗，在個體的生物樣本中檢測出標記的存在，表示個體具有前列腺癌預後不良。在一些實例中，可在不同時間點測定標記的量，以監控前列腺癌的惡化程度。舉例而言，在二個不同時間點從候選個體取得二個生物樣本。若隨時間推移觀察到標記的量有增加趨勢，舉例而言，在後來獲得的樣本中標記的量高於先前獲得的樣本，則個體視為具有前列腺癌預後不良。

利用常規技術，可確定生物樣本中本文所述生物標記之存在與數量。在一些具體實施例中，可利用質譜確定本文所述生物標記之存在及/或數量，其容許以高靈敏度與可重複性直接測定分析物。有許多質譜方法可供選擇。質譜之實例包括但不侷限於，液相層析質譜(LC-MS)、液相層析串聯質譜(LC-MS-MS)、電噴灑離子化質譜(ESI-MS)、基質輔助雷射脫附游離/飛時測距(MALDI-TOF)、及表面增強雷射脫附游離/飛時測距(SELDI-TOF)。此方法之一特定實例為串聯質譜(MS/MS)，其涉及多步驟的質量選擇或分析，通常將某種碎片形式分開。

在其他具體實施例中，可利用免疫試驗確定生物標記之存在及/或數量。免疫試驗之實例包括但不侷限於，西方墨點法、酵素結合免疫吸附試驗(ELISA)、放射線免疫試驗(RIA)、放射線免疫沉澱試驗(RIPA)、免疫螢光試驗(IFA)、ELFA (酵素結合螢光免疫試驗)、電化學發光(ECL)、及毛細管凝膠電泳(CGE)。在一些實例中，可利用一特異地辨識該生物標記之試劑(例如，特異地結合至生物標記的抗體)確定生物標記之存在及/或量。

在其他具體實施例中，可利用測定一或多個基因的mRNA量確定生物標記之存在及/或數量。試驗基於使用引子或探針，其特異地辨識所述之基因核苷酸序列，可用於測定，其包括但不侷限於，反轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)與原位雜交作用(ISH)，其程序為本領域中習知。本領域之技術人員可基於感興趣之核酸區域易於設計與合成引子或探針。應理解的是，鑑於本領域揭示之感興趣基因的核苷酸序列，可以任何適用之方法設計用於本發明之適用引子或探針。

本文中使用的抗體可為多株或單株。針對特定蛋白質之多株抗體的製備，係以一有效量之胜肽或抗原組分注射一適用之實驗動物、從動物收集血清、及利用任何習知之免疫吸附技術分離異特性血清。可容易地用於產生本發明中使用之多株抗體的動物包括雞、小鼠、兔、大鼠、山羊、馬、及其類似物。

在一些具體實施例中，源自候選個體樣本中之生物標記數量可與標準值相比較，以確定是否候選個體具有前列腺癌預後不良。標準值可代表在前列腺癌病患群體中本文所述生物標記之平均值或中位數數量。典型上，此類前列腺癌病患群體的挑選在諸如年齡及/或種族背景上須符合候選個體。較佳地，此類前列腺癌病患群體與候選個體屬於相同種族。

當個體，如人類病患，經診斷為具有預後不良時，該個體可能會接受進一步測試(例如，常規物理測試，包括手術生檢或成像方法，如X光射線成像、磁共振成像(MRI)、或超音波)，以確認疾病的發生及/或確定癌症之階段與惡化 。

在一些具體實施例中，本文所述之方法可進一步包含治療前列腺癌病患到至少緩解與疾病相關聯的症狀。治療方法可為任何常規之抗前列腺癌療法，包括放射線療法、化療、及手術。

亦提供一進行本發明方法之套組。特別的是，套組包含試劑(例如，抗體、引子、探針、或標記試劑)，其可特異地檢測本文所述之標記。套組可進一步說明使用該套組檢測生物樣本中標記之存在或數量，以預測前列腺癌預後及/或監控前列腺癌惡化。組分(包括本文所述之檢測試劑)可以套組形式包裝在一起。舉例而言，檢測試劑可包裝在不同的容器中，例如，用於進行試驗的核酸(引子或探針)或抗體(結合固體基質或與試劑分開包裝，使其結合至基質)、對照組試劑(陽性及/或陰性)、及/或可檢測之標籤，以及說明書(例如，書面、磁帶、VCR、CD-ROM等)亦可包括在套組之中。套組之試驗形式可為諸如北方雜交作用、晶片、或ELISA。進一步提供以此試劑進行方法，用於預測前列腺癌預後及/或監控前列腺癌惡化。此試劑包括第一試劑，其特異地辨識第生物標記，及/或第二試劑，其特異地辨識第二生物標記。在一些具體實施例中，此試劑包括第一試劑，其係選自於由(i)特異地辨識C1GALT1之分子，(ii)特異地辨識ST3GAL1之分子，(iii)特異地辨識UDP-GalNAc之分子，(iv)特異地辨識UDP-Gal之分子，(v)特異地辨識CMP-唾液酸之分子，(vi)特異地辨識唾液酸基-T-抗原之分子，(vii)特異地辨識半乳糖凝集素-4基因產物之分子，以及(viii)(i)至(vii)之任何結合物組成之群組。在一些具體實施例中，此試劑包括第二試劑，其特異地辨識半乳糖凝集素-4。試劑之實例可為抗體、引子、探針、或含有可檢測標記(例如，螢光標記)之標記試劑，其特異地辨識生物標記。試劑可與載體(例如，醫藥上可接受之載體)混合，以形成用於檢測或診斷目的之組成物。此載體之實例包括可注射鹽液、可注射蒸餾水、可注射緩衝溶液、及其類似物。

本發明係利用以下實施例進一步說明，其提供之目的在於證實而非侷限。依據本揭示之內容，本領域之技術人員應理解的是，在不悖離本發明之精神與範疇的情況下，可在所揭示之特定具體實施例中進行許多改變，且仍獲得相同或相似的結果。

實施例

發明人研究腫瘤相關聯之醣化作用基因的調節作用，以確定適合CRPC之特異性子族群的潛在治療方法。在本研究中，轉錄組數據集與病理學檢查顯示，在與mCRPC相關聯之醣化作用基因中，C1GALT1與ST3GAL1之表現高於原發性PCa。一致的是，源自LNCaP與22Rv1細胞之原位異種移植的體內腫瘤惡化顯示特異性黏蛋白型O -醣基轉移酶的附隨性增加，其合成核心1O -聚醣，包括C1GALT1與ST3GAL1。重要的是，發明人進一步發現，C1GALT1介導O -醣化作用，其編碼半乳糖凝集素-4結合作用與傳訊，以促進去勢抗性、癌細胞幹性性質、及轉移。此外，C1GALT1與半乳糖凝集素-4在臨床標本中之共同表現呈現協同作用，其與總體存活率差相關。

縮寫：

ADT，雄性激素剝奪療法；AR，雄性激素受體；BLI，生物發光造影；ChIP，染色質免疫沉澱；cl. PARP，斷裂型聚(ADP-核糖)聚合酶；CSCs，癌症幹細胞；CRPC，去勢抗性前列腺癌；DHT，二氫睪固酮；GSEA，基因組富集化分析；IHC，免疫組織化學；PCa，前列腺癌；MSigDB，分子印記資料庫；PNA，花生凝集素；PHA-L，菜豆(Phaseolus Vulgaris Leucoagglutinin)；qPCR，定量PCR。

1. 材料與方法

1.1 化學試劑與抗體

使用對抗半乳糖凝集素-4 (GeneTex，Hsinchu City，Taiwan)、pHER2 (EMD Millipore，Billerica，MA)、C1GALT1用於 IHC (Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)、ERK、C1GALT1、雄性激素受體(Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX)、pIGF1R、pHER3、及GAPDH (Abcam，San Francisco，CA)之商用抗體。其他抗體購自Cell Signaling Technology，Danvers，MA。生物素化凝集素係購自Vector Labs (Burlingame，CA)。抑制劑、拉帕替尼(lapatinib)、利斯替尼(linsitinib)、BEZ235、及PD0325901係購自AdooQ BioScience (Irvine，CA)。苦馬豆素與芐基-α-GalNAc係購自EMD Millipore。

1.2 細胞株

22Rv1、LNCaP、及PC-3細胞株係取自American Type Culture Collection (ATCC，Manassas，VA)。細胞株及其衍生物之鑑定係利用分析STR樣貌進行，並與六個月內的ATCC資料庫比較。所有細胞株皆常規培養於RPMI-1640，其中補充2 mM麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉、及10%胎牛血清。

1.3 定量 RT-PCR

針對半乳糖凝集素-4之誘導，細胞以去氧羥四環素(DOX，1 μg/mL)處理4天。利用TRIzol試劑(Invitrogen)分離總RNA，並利用PrimeScript RT試劑套組(TaKaRa)，由相當濃度之總RNA合成互補DNA，其係依據製造商之說明進行。感興趣基因之編碼序列及填入之對照組(GAPDH)係以Bio-rad SYBR Green Supermix放大，並以Bio-rad CFX即時PCR系統進行分析。針對各實驗，確定循環閾值數值，並以填入對照組進行標準化，且數值以相對於個別對照組(2^-ΔΔCt )之倍數變化表示。利用各基因之特異性引子進行PCR放大，如下：C1GALT1之正向引子5′-TCCCTTTGTGCCAGAACACC (SEQ ID NO: 1)，反向引子5′-AGCAACCAGGACCCTCTACA (SEQ ID NO: 2)；AR之正向引子5′-CGTTCTTCAAGCCCAAGTGC (SEQ ID NO: 3)，反向引子5′-ATGGGCAGCTTGATGACTGG (SEQ ID NO: 4)；PSA之正向引子5′-GTATCACGTCATGGGGCAGT (SEQ ID NO: 5)，反向引子5′-GGTTGATAGGGGTGCTCAGG (SEQ ID NO: 6)；半乳糖凝集素-4之正向引子5′-GATGCCACCTTACCCTGGTC (SEQ ID NO: 7)，反向引子5′-CCTTGCAGCCTCCCGAAATA (SEQ ID NO: 8)；SOX9之正向引子5′-TCTGAACGAGAGCGAGAAGC (SEQ ID NO: 9)，反向引子5′-CCGTTCTTCACCGACTTCCT (SEQ ID NO: 10)；ST3GAL1之正向引子5′-GGCAACCTGAGGGAGTCTTC (SEQ ID NO: 11)，反向引子5′-GTACACCAGATGGTGGGTGG (SEQ ID NO: 12)。

1.4 染色質免疫沉澱

發明人使用基於網路之軟體PhysBinder (17)與ChIP富集化分析資料庫(18)，以預測MYC在標靶基因的結合作用元件。22Rv1-M4細胞以多聚甲醛交聯，且核萃取物以超音波處理，以剪切DNA。依據製造商之步驟，利用ChIP套組進行ChIP試驗(Zymo Research，Irvine，CA)。下列ChIP等級抗體係用於ChIP：MYC (Cat# 13987，RRID：AB_2631168，Cell Signaling)與對照組IgG (Cat# ab172730，Abcam)。接著，溶液在溶析之前以低鹽、高鹽、即LiCl緩衝液連續清洗。在RNase與蛋白酶K消化及DNA萃取之後，利用qPCR分析免疫沉澱與對照組(投入)的DNA；陰性對照組引子係針對轉錄因子結合位點上游約2000 bp之區域設計。ChIP qPCR引子：MYC結合位點之正向引子5′- AGCAGGATCAGAAATGCGGA (SEQ ID NO: 13)，反向引子；5′- CCCTAATGCGAAGGGGTCTG (SEQ ID NO: 14)；陰性對照組正向引子5′- TGGCCAGCCATGACTTATGA (SEQ ID NO: 15)，反向引子5′- AAACTCGTTGGAGTAGGTCGG (SEQ ID NO: 16)。

1.5 CRPC 模型之體內發育

雄性BALB/c裸鼠與NOD-SCID小鼠(6-8週大)係取自National Laboratory Animal Center (Taiwan)，且所有動物作業皆依據中央研究院動物照護與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，Academia Sinica)核可之方案進行。針對所有的異種移植研究，在產生腫瘤之後，將小鼠隨機分派至各實驗組別。在去勢抗性細胞的發育方面，將溶於DPBS之螢光素酶基因標記之2×10⁵ 個LNCaP細胞(LNCaP-Luc2)懸浮液以原位方式注射至裸鼠前列腺前方。在發育4週後，以手術切除小鼠兩睾丸而去勢。將宿主小鼠屍體剖檢，並在去勢7週後，在層流下解剖原發性腫瘤。以無菌手術刀切碎腫瘤組織，且進一步以膠原酶D (Roche，Taipei，Taiwan)消化1小時。將此程序重複兩次、三次、或四次，以取得CRPC初代培養物，分別定義為LNCaP-CR2、-CR3、及-CR4。將LNCaP-tetO-Gal4細胞注射至裸鼠前列腺，並在4週後將小鼠去勢，以分析腫瘤生長時的雄性激素剝奪反應。針對體內生物發光造影(BLI)之測定，小鼠以腹腔注射方式接受150 mg/kg的D-螢光素，並以IVIS Lumina XRMS捕捉BLI影像，之後處理數據，並以製造商的Living Image軟體(PerkinElmer，Waltham，MA)進行定量分析。

1.6 細胞生長與集落形成之體外試驗

針對細胞生長試驗，將5000 LNCaP-tetO-Gal4細胞隔夜接種於96孔培養盤，並在有或無1 nM DHT之CD-FBS培養基中以去氧羥四環素處理6天，以誘導半乳糖凝集素-4表現。每隔2天更換新鮮培養基。利用CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay (Invitrogen)，在BioTek微盤讀儀上測定細胞數之讀值，其中激發與發射波長分別為510與535。將1×10³ 個LNCaP、LNCaP-CR4、或其衍生細胞分盤在6孔培養盤中，以進行處理後的集落形成試驗。在2天後，將細胞培養在有或無雄性激素之CD-FBS培養基或以藥物處理96小時。在10天後，細胞以溶於PBS之4%多聚甲醛固定，並以結晶紫溶液染色，且以FluorChem HD2系統(ProteinSample，San Jose，CA)定量>50個細胞之集落。

1.7 腫瘤球體試驗

針對腫瘤球體試驗，將細胞懸浮於DMEM/F12培養基 (Invitrogen)中，其中補充B27補充物(Invitrogen)與GlutaMAX (Invitrogen)。藉由加入0.5%甲基纖維素(R&D Systems)，將培養基製成半固體，以防止細胞聚集。細胞以每孔1,000個細胞之密度接種在超低附著性之6孔培養盤(Corning)中。在10天後，利用coulter計數儀(Beckman Coulter)定量粒徑≥ 60 μm之球體數量。

1.8 流式細胞術

欲分析細胞表面聚醣，細胞以Accutase (Innovative Cell Technologies，San Diego，CA)處理而剝奪、以PBS清洗三次、及懸浮在Carbo-Free Blocking Solution (VECTOR，Burlingame，CA)中。細胞以生物素共軛連接之凝集素、PHA-L (2 μg/mL)、PNA (10 μg/mL)、MALII (5 μg/mL)、木菠蘿凝集素(5 μg/mL，VECTOR)、及半乳糖凝集素-4 (5 μg/mL)培養，或以BSA作為對照組，接著以APC標記之鏈親和素培養。在冰上培養30分鐘後，細胞以Accuri C6流式細胞儀(BD Biosciences，Taiwan)分析。半乳糖凝集素-4 (R&D Systems，Minneapolis，MN)與BSA係以Lightning-Link Rapid Conjugation System (Innova Biosciences，Cambridge，UK)進行生物素化，並依據製造商之說明進行。

1.9 免疫化學染色

將腫瘤樣本固定在10%中性緩衝性福馬林中20小時且包埋在石蠟中。將腫瘤切片(4 μm)脫蠟，並在分級系列之乙醇中再水合。在取出抗原後，切片接著以特異性一次抗體，包括半乳糖凝集素-4 (Cat# GTX114527，GeneTex)與C1GALT1 (Cat# HPA011294，Sigma-Aldrich)，培養1小時。以微聚合物檢測系統(Biocare Medical)檢測一次抗體。由兩位病理學家檢查所有組織微陣列玻片及計分。以手動方式評估PCa組織陣列之免疫染色，且強度按以下等級計分：0：陰性，1：弱，2：中度，以及3：強。利用以下方式計分：經染色呈陽性之細胞分佈 × 染色強度。以計分120作為截止值，並以樣本計分高之目標表現(計分≧120)與所有其餘樣本進行比較。

1.10 統計分析與發表數據處理

統計分析係利用GraphPad Prism 7軟體進行。實驗數據以平均值 ± SEM或柱散點表示。P值小於0.05視為顯著，並採用Student’s t檢定(雙尾)。利用卡本-麥爾法進行存活分析，並以對數秩檢定進行顯著性、風險比率(HR)、及95% CI的比較。藉由運算皮爾森相關係數r與關聯性P值，確定組間相關性。本文之微陣列數據已提交至基因表現綜合(GEO)資料庫，其登錄號為GSE100301。多個先前報導的人類PC試樣世代研究GSE32269、GSE21032、GSE70770、及GSE35988的基因表現數據，皆從GEO下載。以GSEA軟體包(19)進行基因組富集化分析(GSEA)，並以無偏誤方式針對分子印記資料庫(MSigDB)評估富集化之印記，其中過濾標準為P值小於0.05與FDR q > 0.25。取觀察之基因Z計分平均值之間的差，除以z-差異分佈之SD值，計算出Z比率。通過對先前LNCaP細胞中ChIP-qPCR驗證之MYC標靶基因z-計分數值(20)求和，計算已發表數據中各PCa樣本之MYC活性計分。

2. 結果

2.1 醣基因 (glycogene) 表現之系統性分析顯示 C1GALT1 介導之 O - 聚醣和轉移與臨床 PCa 存活率差之間相關

欲探討PCa惡化之醣化作用改變，發明人研究病患之四個PCa轉錄組數據集的醣基轉移酶(醣基因)表現量，其係使用N -聚醣生合成、黏蛋白型O -聚醣生合成、O -甘露糖聚醣生合成、醣胺聚醣生合成、及醣神經鞘脂質生合成的KEGG途徑資料庫(21-23)。藉由計算KEGG之聚醣生合成基因集的每一個體基因Z計分總和，分析四個PCa世代研究(GSE21032、GSE35988、GSE70770、及GSE32269)的聚醣生合成印記。熱圖(heat map)呈現印記的差異表現(Z比率)，且原發性與轉移性(或mCRPC)腫瘤樣本的醣基因差異表現(Z比率)如熱圖所呈現(未顯示數據)。藉由計算每一基因集之基因Z計分總和，發明人發現，相較於原發性腫瘤，在轉移腫瘤或mCRPC中，黏蛋白型O -聚醣生合成途徑脫穎而出，其活性增加。該分析進一步顯示，在mCRPC中，核心1O -醣化作用之T抗原合成酶C1GALT1與加帽(capping)(唾液酸化作用)酵素ST3GAL1之表現比原發性PCa的更高，而核心2O -聚醣分支基因(GCNTs)呈現下調傾向，且N -醣化作用醣基因顯示無明顯變化(圖1A)。另一PCa組織微陣列之IHC分析進一步顯示，在70%的PCa腫瘤樣本中，C1GALT1以高量表現，並與進行性腫瘤階段相關(圖1B)。

2.2 在異種移植模型的 PCa 惡化過程中 C1GALT1 表現係上調並促進去勢抗性

由於C1GALT1表現與CRPC相關聯且為O -聚醣生合成所必需，故發明人檢查是否C1GALT1在CRPC惡化時扮演任何角色。首先，發明人重建CRPC之體內惡化，其係於裸鼠前列腺中生長去勢敏感性LNCaP異種移植物，並以去勢方式剝奪小鼠雄性激素(圖2A)。重複此過程三次，以取得一系列CRPC初代培養物，分別定義為LNCaP-CR2、-CR3、及-CR4。相較於親代LNCaP腫瘤，LNCaP-CR2與CR3腫瘤在去勢後繼續生長，如BLI (生物發光造影)曲線與終點腫瘤塊之結果，其代表去勢抗性表型(圖2A)。在成株生長過程中，LNCaP-CR4細胞對安可坦亦呈現抗性(圖2B)。重要的是，CRPC細胞株表現出增加的C1GALT1 mRNA與蛋白質量(圖2C、D)。此外，LNCaP衍生之CRPC細胞株展現出增加的T與唾液酸基-T抗原表現，如PNA與木菠蘿凝集素染色結果所示，但N -聚醣的量不變，如PHA-L染色結果所示(圖2E、F)。C1GALT1下調使得LNCaP-CR4細胞對ADT敏感，如所指，相較於生長在含有雄性激素(1 nM DHT)的培養基，生長在CD-FBS培養基的細胞凋亡(PARP斷裂)增加且LNCaP-CR4細胞生長下降(圖2G、H)。 此外，抑制C1GALT1亦降低AR與下游PSA的表現量(圖2I)。

2.3 半乳糖凝集素 -4 藉由活化 RTKs 與 C1GALT1 介導之聚醣結合而促進 AR 傳訊、去勢抗性、及集落生長

愈來愈多的證據顯示，異常的醣化作用，如癌細胞表面上的T與唾液酸基-T抗原，可能涉及藉由與半乳糖凝集素交互作用而促使癌症惡化，其本身常在腫瘤微環境中過度表現(15, 24, 25)。欲檢查半乳糖凝集素在PCa惡化中的潛在角色，發明人探討半乳糖凝集素在公開之轉錄組數據集中的表現量。數據集顯示，半乳糖凝集素-4在mCRPC病患中的表現始終高於原發性PCa (未顯示數據)。一致的是，相較於親代細胞，LNCaP-CR4細胞系列呈現逐漸增加的半乳糖凝集素-4表現(圖3A)。在生長試驗與細胞凋亡(PARP斷裂)過程中，以shRNA耗盡半乳糖凝集素-4，能使LNCaP-CR4細胞對ADT敏感，亦降低LNCaP-CR4細胞中PSA與AR的表現量(圖3B-D)。最近的數據顯示，半乳糖凝集素-4的表現係以聚醣依賴性方式活化EGFR、HER2、HER3、及IGF1R (26)。同時，HER2/3與IGF1R的活化作用與臨床CRPC相關聯，並報導了在異種移植模型中能支持CRPC (2, 27)。欲確定是否半乳糖凝集素/聚醣傳訊調節HER2/3磷酸化與AR傳訊，以芐基-α-GalNAc (一抑制O -醣化作用的偽受質)或苦馬豆素(一α-甘露糖苷酶II抑制劑，以停止N -醣化作用成熟)處理表現半乳糖凝集素-4之LNCaP與22Rv1 PCa細胞。儘管處理苦馬豆素確實減少N -聚醣的PHA-L染色，但其不影響HER2/3的磷酸化及AR與PSA蛋白質表現的誘導(圖3E與圖8A、8B)。另一方面，芐基-α-GalNAc阻斷半乳糖凝集素-4介導之HER2/3活化作用與AR傳訊。在PCa細胞中，藉由減少核心1O -聚醣之α2,3-唾液酸化作用，使芐基-α-GalNAc干擾黏蛋白型O -醣化作用，從而減少經處理之細胞結合至MALII並增加結合至PNA。彼等數據亦顯示，α2,3-唾液酸化之核心1O -聚醣基本上藉由半乳糖凝集素-4介導RTKs活化作用，因此造成CRPC惡化(圖3E與圖8A、8B)。與此發現相符的是，在CRPC細胞株22Rv1惡化成轉移性22Rv1-M4細胞的過程中，亦觀察到半乳糖凝集素-4與C1GALT1表現的上調，其源自體內淋巴結轉移並展現高量的轉移能力(26)。凝集素染色之流式細胞圖顯示PNA與木菠蘿凝集素曲線向右移動，顯示22Rv1-M4細胞與其親代細胞相較，細胞表面O -醣化作用具有差異，而以PHA-L凝集素染色的N -聚醣保持不變(圖3F與圖8C)。醣表型數據亦顯示，在表現高量C1GALT1的PCa細胞中，核心1O -聚醣的增加會伴隨半乳糖凝集素-4結合位點的增加(圖3F)。在22Rv1-M4細胞中，半乳糖凝集素-4或C1GALT1的下調明顯抑制集落形成能力(圖3G)。

2.4 半乳糖凝集素 -4/O - 聚醣傳訊不僅促進去勢抗性生長還有體內轉移

在體內條件下，相較於LNCaP-CR4對照組腫瘤，半乳糖凝集素-4的下調使得LNCaP-CR4腫瘤對去勢處理敏感，其係藉由抑制原發性腫瘤生長與淋巴結轉移，顯示LNCaP-CR4的去勢抗性生長具有半乳糖凝集素-4傳訊活性(圖4A-C)。欲確定是否外源性半乳糖凝集素-4表現可蓋括PCa之侵襲性表型，發明人以四環黴素誘導性系統在雄性激素依賴性LNCaP細胞中強制半乳糖凝集素-4過度表現。發明人發現，相較於對照組處理，半乳糖凝集素-4過度表現提升裸鼠LNCaP腫瘤生長，且完全消除去勢誘導之腫瘤消退(圖4D、E)。相較於持續表現半乳糖凝集素-4之腫瘤，藉由在建立的腫瘤中撤除去氧羥四環素而剝奪半乳糖凝集素-4，可延緩腫瘤生長(圖4D、E)。此外，半乳糖凝集素-4亦促使LNCaP原位腫瘤模型的淋巴結轉移，如離體BLI與IHC之分析結果(圖4F)。

2.5 半乳糖凝集素 -4/O - 聚醣傳訊促進 SOX9 表現、癌細胞幹性性質、及經由活化 RTKs 之轉移

欲了解半乳糖凝集素/聚醣傳訊之轉移機制，發明人以cDNA微陣列分析全基因體反應基因，其係藉由比較半乳糖凝集素-4與對照組載體在親代細胞、LNCaP與22Rv1細胞，或對照組與半乳糖凝集素-4減量條件在表現高量半乳糖凝集素-4之22Rv1-M4細胞中的異位表現。利用基因集富集化分析(GSEA)與分子印記資料庫(MSigDB)策劃基因集的半乳糖凝集素-4反應基因分析顯示，HER2傳訊、O -聚醣生合成、及癌症幹細胞印記於PCa細胞中富集化，其取決於半乳糖凝集素-4表現(圖5A)。鑒於PCa病患的半乳糖凝集素-4高度表現與轉移相關聯，接著，發明人探討半乳糖凝集素-4介導之傳訊在癌症幹細胞中的功能。全基因組分析顯示，半乳糖凝集素-4表現上調SOX9 (未顯示數據)，其為一涉及幹細胞調節的轉錄因子(28)。在體外條件下，22Rv1-M4細胞之半乳糖凝集素-4減量，明顯減少SOX9表現與球體形成幅度，其為一可信的CSC特徵(圖5B與圖9A)。一致的是，剝奪SOX9會減少22Rv1-M4與LNCaP-CR4細胞的腫瘤球體(圖5C與圖9B)。在轉移實驗中，SOX9的耗盡明顯抑制22Rv1-M4細胞的轉移性集落形成，表示半乳糖凝集素-4與SOX9在調節轉移性集落形成時的基本角色(圖5D)。證實了SOX9在調節轉移性集落形成的必要角色後，發明人進一步研究半乳糖凝集素-4調節SOX9表現的途徑。以O -醣化作用抑制劑處理22Rv1-M4細胞可明顯抑制SOX9表現，而N -醣化作用抑制劑則不影響SOX9表現(圖9C、9D)。同時，22Rv1-M4細胞之C1GALT1減量可抑制SOX9與ALDH1A1表現並減少腫瘤球體形成(圖5E、5F)。反之，半乳糖凝集素-4在LNCaP與PC-3 PCa細胞的異位表現增加了CSC標記、SOX9、及ALDH1A1的表現，並在一系列繁殖後促使其生長成腫瘤球體，顯示半乳糖凝集素-4驅動成株生長與細胞存活傳訊，不管生長因子缺乏(圖9E、9F)。總之，半乳糖凝集素-4與C1GALT1依賴性O -聚醣之交互作用可活化CSC性質之傳訊並促進體內轉移性集落形成。

2.6 半乳糖凝集素 -4 藉由改變特異性 O - 醣化作用途徑前饋（ feed-forward ）上調其結合位點與下游傳訊

由於半乳糖凝集素-4/SOX9傳訊取決於C1GALT1介導之O -醣化作用並伴隨過度表現與PCa惡化；發明人接著探討是否半乳糖凝集素-4、C1GALT1、及蛋白質O -醣化作用的表現可相互調節。半乳糖凝集素-4在22Rv1-M4細胞中的下調明顯減少C1GALT1與ST3GAL1在核心1O -醣化作用中的基因表現，而核心2分支酵素GCNT1則上調，顯示半乳糖凝集素-4表現可上調特異性O -醣化作用酵素的基因表現，以調控蛋白質O -醣化作用(圖6A)。欲確定改變蛋白質醣化作用之半乳糖凝集素-4下游調節劑，發明人進行半乳糖凝集素-4介導之差異基因的富集化分析，其係使用Enrichr演算法與ENCODE TF ChIP-seq資料庫(18)。在富集化之轉錄因子之中，發明人發現C1GALT1列於MYC標靶基因(圖6B)。MYC減量可減少C1GALT1與ST3GAL1的表現量，並增加GCNT1的表現量而不改變半乳糖凝集素-4表現(圖6C、D)。同時，在22Rv1-M4細胞中，MYC減量可減少唾液酸化之核心1O -聚醣(其以木菠蘿凝集素染色)，而非N -聚醣(其以PHA-L染色)，造成相較於對照組減量，喪失半乳糖凝集素-4結合位點、下游SOX9表現、及腫瘤球體形成活性(圖6D-F)。另一方面，在LNCaP細胞中，MYC過度表現上調C1GALT1與ST3GAL1表現，但不促進半乳糖凝集素-4與SOX9表現，顯示半乳糖凝集素-4與改變之O -聚醣的表現為調節CSCs性質所需(圖10A、10B)。的確，藉由在PCa細胞中過度表現而活化MYC，導致在細胞表面有更多外源性半乳糖凝集素-4的結合位點，從而在流式細胞術試驗中觀察到半乳糖凝集素-4染色曲線向右移動(圖6G)。此外，HER2免疫沉澱與隨後的凝集素墨染顯示，半乳糖凝集素-4與木菠蘿凝集素直接結合至HER2分子，其係因MYC的減量而消除(圖6H)。利用染色質免疫沉澱(ChIP-PCR)試驗分析MYC的C1GALT1基因調節作用。在22Rv1-M4細胞中，C1GALT1 啟動子之MYC抗體特異性富集化證實，MYC直接結合至C1GALT1啟動子序列(圖6I)。在RTK作用時，ERK磷酸化MYC的Ser62，因此穩定MYC蛋白及其轉錄活性(29)。免疫墨染結果顯示，相較於處理載體之22Rv1-M4細胞與表現半乳糖凝集素-4之22Rv1與LNCaP細胞，MEK1/2抑制劑阻斷MYC與C1GALT1的誘導(圖10C)。與上述數據一致的是，臨床PCa試樣的C1GALT1表現明顯與發表之PCa轉錄組數據集中MYC活性相關(圖6J)。總之，彼等數據顯示，MYC調節細胞表面RTKs之異常O -醣化作用，從而引發細胞結合半乳糖凝集素-4及下游傳訊途徑，使腫瘤再生與轉移。

2.7 C1GALT1 與半乳糖凝集素 -4 表現所呈現之協同作用造成總存活率變差

關於C1GALT1在CRPC惡化中介導半乳糖凝集素-4傳訊的關鍵角色，發明人接著檢查PCa試樣中C1GALT1與半乳糖凝集素-4之臨床相關性。半乳糖凝集素-4與C1GALT1之mRNA量在原發性PCa中比其配對之相鄰正常組織的更高，如qRT-PCR測定的結果(圖7A)。發明人發現，該世代研究中半乳糖凝集素-4與C1GALT1的腫瘤表現之間呈現正相關(圖7B)。此外，在另一PCa世代研究中，皮爾森相關性分析強調C1GALT1與半乳糖凝集素-4表現之間的強相關性，顯示其在大多數病患的PCa惡化過程中參與互聯的傳訊網絡及上調作用(圖7C)。欲進一步探討C1GALT1與半乳糖凝集素-4在PCa病患中的預後潛力，發明人利用Cox比例風險模型，依據在台北三軍總醫院治療的PCa病患(n = 231)中C1GALT1與半乳糖凝集素-4之腫瘤表現，分析總體存活的風險比率(HR)。表現高半乳糖凝集素-4之PCa病患具有比彼等低半乳糖凝集素-4病患更高的HR (2.975)(低半乳糖凝集素-4表現意指腫瘤中平均半乳糖凝集素-4 mRNA表現量未明顯高於同一PCa病患所配對之相鄰正常組織)(圖7D)。同時，具有高與低C1GALT1表現的PCa病患死亡率亦增加，HR = 2.28 (圖7D)(低C1GALT1表現意指腫瘤中平均C1GALT1 mRNA表現量未明顯高於同一PCa病患所配對之相鄰正常組織)。檢查PCa病患中半乳糖凝集素-4與C1GALT1之間的關係，結果顯示，病患腫瘤同時過度表現半乳糖凝集素-4與C1GALT1時，其在PCa病患中具有最高的HR 15.8與最差的總體存活率(圖7D-F)。此外，半乳糖凝集素-4之表現量亦明顯與C1GALT1表現相關(圖7G)。總之，彼等數據顯示，半乳糖凝集素-4與C1GALT1的共同表現在大多數mCRPC病例中增加，並強烈預測PCa病患的存活率較差。

3. 討論

O -醣化作用的上升涉及廣範圍的癌症。在癌細胞中發生的醣化作用典型特徵包括不完全的或短的O -聚醣，如T與唾液酸基-T抗原，不同於正常細胞，其表現核心3或核心4衍生之長鏈O -聚醣(30, 31)。異常聚醣之生合成為一複雜過程，需要多個醣基轉移酶的協同作用，以及獲得轉移酶的受質。在激素難治性PCa細胞及原發性前列腺腫瘤的進行階段中，由於高基氏基質蛋白巨蛋白(giantin)功能障礙，GCNT1錯誤定位在內質網，導致核心2相關聯之聚乳糖胺表現下降，同時T抗原增強，其容許細胞逃避半乳糖凝集素-1誘導的細胞凋亡(32)。醣基轉移酶的差異表現亦可影響醣表型；舉例而言，ST3GAL1末端修飾會與GCNT1競爭核心1受質，以防止核心2結構並促進唾液酸基-T抗原發展(33)。另一方面，結腸癌組織中UDP-Gal運輸蛋白的mRNA量增加，且轉染UDP-Gal運輸蛋白cDNA會導致T抗原表現(34)。臨床分析的收斂性與發明人的數據指出，PCa中升高的半乳糖凝集素-4與短鏈核心1O -聚醣的發展相關聯，其係藉由增加C1GALT1與ST3GAL1並降低GCNT1，導致表面O -醣化作用的變化，使更多的半乳糖凝集素-4結合。於此，MYC可作為分級控制系統的調節劑，其係通過直接的DNA結合而協調O -醣化酵素基因表現，以產生基本O -聚醣受質；半乳糖凝集素-4表現進一步增強MYC介導之O -醣化酵素轉錄作用，並改變表面O -醣化作用，使更多的半乳糖凝集素-4結合。與先前的研究相同，顯示ST3GAL1在結腸癌細胞中高度表現，且在轉錄上由MYC上調(35)。MYC原致癌基因(proto-oncogene)常在人類癌症(包括PCa)中活化。據此，臨床PCa組織之調查顯示，MYC的表現與CRPC密切相關(36)。利用螢光原位雜交分析，確定在高達72%的激素難治性PCa組織中檢測到MYC基因的擴增；在ADT之前有33%的臨床PCa檢測到MYC基因擴增，且在ADT之後明顯增加至57% (37, 38)。發明人的數據指出，MYC活化會上調PCa細胞中C1GALT1介導之O -醣化作用；此外，半乳糖凝集素-4之表現能協同MYC功能，以促進PCa惡化。

上調之C1GALT1與mCRPC之關聯性高於局部之腫瘤，顯示核心1O -醣化作用可介導癌細胞傳播與適應遠端組織。與此假設一致的是，乳腺上皮中C1galt1 之基因剔除阻礙MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤模型的致癌作用(39)。在結直腸腫瘤中，C1GALT1表現增加與存活率低相關聯，而C1GALT1過度表現修飾FGFR2上的O -聚醣並增強其磷酸化，其促進結腸癌細胞中的侵襲行為與類幹細胞性質(40)。同時，膠質母細胞瘤(glioblastoma)中ST3GAL1高度表現與存活率差相關聯，且ST3GAL1減量會抑制CSC特性並延長小鼠模型的存活率(41)。以芐基-α-GalNAc處理之PCa細胞明顯損害α2,3-唾液酸基-T抗原的生合成，並抑制半乳糖凝集素-4活性，顯示半乳糖凝集素-4對α2,3-唾液酸基-T抗原的選擇性結合優於T抗原。其亦顯示，芐基-α-GalNAc對Galβ1-3GalNAc-α-O-芐基的細胞代謝，可作為α2,3-唾液酸基轉移酶活性的有效抑制劑，從而耗盡唾液酸化作用並改變細胞表面蛋白的聚醣表型(42)。在本研究中，發明人證實，α2,3-唾液酸化之核心1O -醣化作用經由半乳糖凝集素-4與α2,3-唾液酸化之核心1衍生之O -聚醣交互作用介導CRPC之發展與轉移，從而RTK活化。利用LNCaP原位腫瘤模型進行去勢抗性惡化，發明人證實，半乳糖凝集素-4-聚醣的交互作用不僅促進PCa轉移，還驅動CRPC發展。HER2/3活化作用在接受ADT的PCa病患中上調，該發現使得在前臨床前研究中採用ADT與HER2/3抑制劑的組合策略，如阿比特龍加上拉帕替尼(5)。然而，半乳糖凝集素-4的參與可同時活化多個RTKs，其為惡化與對抗ADT與HER2/3標靶療法的關鍵。

發明人發表的臨床數據集電腦模擬分析與發明人的實驗結果顯示，CRPC的發展，至少在一PCa病患亞群中，與ADT之後半乳糖凝集素-4的反芻性升高有因果關係。與發明人之數據一致的是，最近的一項發現強調，CRPC之~30%離群族群異常表現胃腸道(GI)譜系轉錄組，包括LGALS4 (半乳糖凝集素-4)、HNF4G 、HNF1A 、及SPINK1 (43)。半乳糖凝集素-4誘導之侵襲行為進一步由SOX9表現的增加所支持。SOX9經確定為一在ALDH^hi 、CD44⁺ 、α2β1⁺ PCa表現的PCa幹細胞相關聯之分子，而下調SOX9可減少腫瘤球體形成及體內腫瘤形成(44)。

惡性轉形與表面蛋白之O -醣化作用改變有關，可能是藉由與凝集素交互作用，從而有助於癌細胞之轉移行為與去勢抗性，因此腫瘤相關聯之碳水化合物抗原可作為診斷與治療標靶。舉例而言，已經證實，CD176抗血清抑制CD176⁺ 白血病細胞在骨髓、脾臟、肝臟、及肺臟中的生長與擴散，從而延長白血病小鼠的存活時間(45)。同時，已經發現，T抗原可結合CSC標記，例如，結腸癌的CD44、乳癌的MUC1、或白血病的CD34，顯示T抗原本身亦可能是CSC的標記(46)。在本研究中，發明人的數據證實，半乳糖凝集素-4連同RTKs之C1GALT1依賴性聚醣修飾作用，導致其活化，增強AR途徑之活性，且驅動去勢抗性與轉移。因此，阻斷半乳糖凝集素-聚醣之交互作用可抑制轉移性CRPC惡化。參考資料 1.       Buttigliero, C., Tucci, M., Bertaglia, V., Vignani, F., Bironzo, P., Di Maio, M., and Scagliotti, G. V. (2015) Understanding and overcoming the mechanisms of primary and acquired resistance to abiraterone and enzalutamide in castration resistant prostate cancer.Cancer Treat Rev 41 , 884-892 2.       Mellinghoff, I. K., Vivanco, I., Kwon, A., Tran, C., Wongvipat, J., and Sawyers, C. L. (2004) HER2/neu kinase-dependent modulation of androgen receptor function through effects on DNA binding and stability.Cancer Cell 6 , 517-527 3.       Signoretti, S., Montironi, R., Manola, J., Altimari, A., Tam, C., Bubley, G., Balk, S., Thomas, G., Kaplan, I., Hlatky, L., Hahnfeldt, P., Kantoff, P., and Loda, M. (2000) Her-2-neu expression and progression toward androgen independence in human prostate cancer.J Natl Cancer Inst 92 , 1918-1925 4.       Craft, N., Shostak, Y., Carey, M., and Sawyers, C. L. (1999) A mechanism for hormone-independent prostate cancer through modulation of androgen receptor signaling by the HER-2/neu tyrosine kinase.Nat Med 5 , 280-285 5.       Gao, S., Ye, H., Gerrin, S., Wang, H., Sharma, A., Chen, S., Patnaik, A., Sowalsky, A. G., Voznesensky, O., Han, W., Yu, Z., Mostaghel, E. A., Nelson, P. S., Taplin, M. E., Balk, S. P., and Cai, C. (2016) ErbB2 Signaling Increases Androgen Receptor Expression in Abiraterone-Resistant Prostate Cancer.Clin Cancer Res 22 , 3672-3682 6.       Whang, Y. E., Armstrong, A. J., Rathmell, W. K., Godley, P. A., Kim, W. Y., Pruthi, R. S., Wallen, E. M., Crane, J. M., Moore, D. T., Grigson, G., Morris, K., Watkins, C. P., and George, D. J. (2013) A phase II study of lapatinib, a dual EGFR and HER-2 tyrosine kinase inhibitor, in patients with castration-resistant prostate cancer.Urol Oncol 31 , 82-86 7.       Ziada, A., Barqawi, A., Glode, L. M., Varella-Garcia, M., Crighton, F., Majeski, S., Rosenblum, M., Kane, M., Chen, L., and Crawford, E. D. (2004) The use of trastuzumab in the treatment of hormone refractory prostate cancer; phase II trial.The Prostate 60 , 332-337 8.       de Bono, J. S., Bellmunt, J., Attard, G., Droz, J. P., Miller, K., Flechon, A., Sternberg, C., Parker, C., Zugmaier, G., Hersberger-Gimenez, V., Cockey, L., Mason, M., and Graham, J. (2007) Open-label phase II study evaluating the efficacy and safety of two doses of pertuzumab in castrate chemotherapy-naive patients with hormone-refractory prostate cancer.J Clin Oncol 25 , 257-262 9.       Fuster, M. M., and Esko, J. D. (2005) The sweet and sour of cancer: glycans as novel therapeutic targets.Nat Rev Cancer 5 , 526-542 10.     Barrow, H., Guo, X., Wandall, H. H., Pedersen, J. W., Fu, B., Zhao, Q., Chen, C., Rhodes, J. M., and Yu, L. G. (2011) Serum galectin-2, -4, and -8 are greatly increased in colon and breast cancer patients and promote cancer cell adhesion to blood vascular endothelium.Clin Cancer Res 17 , 7035-7046 11.     Agrawal, P., Fontanals-Cirera, B., Sokolova, E., Jacob, S., Vaiana, C. A., Argibay, D., Davalos, V., McDermott, M., Nayak, S., Darvishian, F., Castillo, M., Ueberheide, B., Osman, I., Fenyo, D., Mahal, L. K., and Hernando, E. (2017) A Systems Biology Approach Identifies FUT8 as a Driver of Melanoma Metastasis.Cancer Cell 31 , 804-819 e807 12.     Very, N., Lefebvre, T., and El Yazidi-Belkoura, I. (2018) Drug resistance related to aberrant glycosylation in colorectal cancer.Oncotarget 9 , 1380-1402 13.     Kinney, A. Y., Sahin, A., Vernon, S. W., Frankowski, R. F., Annegers, J. F., Hortobagyi, G. N., Buzdar, A. U., Frye, D. K., and Dhingra, K. (1997) The prognostic significance of sialyl-Tn antigen in women treated with breast carcinoma treated with adjuvant chemotherapy.Cancer 80 , 2240-2249 14.     Zhang, S., Zhang, H. S., Cordon-Cardo, C., Reuter, V. E., Singhal, A. K., Lloyd, K. O., and Livingston, P. O. (1997) Selection of tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry: II. Blood group-related antigens.Int J Cancer 73 , 50-56 15.     Reticker-Flynn, N. E., and Bhatia, S. N. (2015) Aberrant glycosylation promotes lung cancer metastasis through adhesion to galectins in the metastatic niche.Cancer Discov 5 , 168-181 16.     Lin, W. M., Karsten, U., Goletz, S., Cheng, R. C., and Cao, Y. (2011) Expression of CD176 (Thomsen-Friedenreich antigen) on lung, breast and liver cancer-initiating cells.Int J Exp Pathol 92 , 97-105 17.     Broos, S., Soete, A., Hooghe, B., Moran, R., van Roy, F., and De Bleser, P. (2013) PhysBinder: Improving the prediction of transcription factor binding sites by flexible inclusion of biophysical properties.Nucleic Acids Res 41 , W531-534 18.     Chen, E. Y., Tan, C. M., Kou, Y., Duan, Q., Wang, Z., Meirelles, G. V., Clark, N. R., and Ma'ayan, A. (2013) Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool.BMC Bioinformatics 14 , 128 19.     Subramanian, A., Tamayo, P., Mootha, V. K., Mukherjee, S., Ebert, B. L., Gillette, M. A., Paulovich, A., Pomeroy, S. L., Golub, T. R., Lander, E. S., and Mesirov, J. P. (2005) Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.Proc Natl Acad Sci U S A 102 , 15545-15550 20.     Anderson, P. D., McKissic, S. A., Logan, M., Roh, M., Franco, O. E., Wang, J., Doubinskaia, I., van der Meer, R., Hayward, S. W., Eischen, C. M., Eltoum, I. E., and Abdulkadir, S. A. (2012) Nkx3.1 and Myc crossregulate shared target genes in mouse and human prostate tumorigenesis.J Clin Invest 122 , 1907-1919 21.     Cai, C., Wang, H., He, H. H., Chen, S., He, L., Ma, F., Mucci, L., Wang, Q., Fiore, C., Sowalsky, A. G., Loda, M., Liu, X. S., Brown, M., Balk, S. P., and Yuan, X. (2013) ERG induces androgen receptor-mediated regulation of SOX9 in prostate cancer.J Clin Invest 123 , 1109-1122 22.     Taylor, B. S., Schultz, N., Hieronymus, H., Gopalan, A., Xiao, Y., Carver, B. S., Arora, V. K., Kaushik, P., Cerami, E., Reva, B., Antipin, Y., Mitsiades, N., Landers, T., Dolgalev, I., Major, J. E., Wilson, M., Socci, N. D., Lash, A. E., Heguy, A., Eastham, J. A., Scher, H. I., Reuter, V. E., Scardino, P. T., Sander, C., Sawyers, C. L., and Gerald, W. L. (2010) Integrative genomic profiling of human prostate cancer.Cancer Cell 18 , 11-22 23.     Grasso, C. S., Wu, Y. M., Robinson, D. R., Cao, X., Dhanasekaran, S. M., Khan, A. P., Quist, M. J., Jing, X., Lonigro, R. J., Brenner, J. C., Asangani, I. A., Ateeq, B., Chun, S. Y., Siddiqui, J., Sam, L., Anstett, M., Mehra, R., Prensner, J. R., Palanisamy, N., Ryslik, G. A., Vandin, F., Raphael, B. J., Kunju, L. P., Rhodes, D. R., Pienta, K. J., Chinnaiyan, A. M., and Tomlins, S. A. (2012) The mutational landscape of lethal castration-resistant prostate cancer.Nature 487 , 239-243 24.     Glinsky, V. V., Glinsky, G. V., Glinskii, O. V., Huxley, V. H., Turk, J. R., Mossine, V. V., Deutscher, S. L., Pienta, K. J., and Quinn, T. P. (2003) Intravascular metastatic cancer cell homotypic aggregation at the sites of primary attachment to the endothelium.Cancer Res 63 , 3805-3811 25.     Yazawa, E. M., Geddes-Sweeney, J. E., Cedeno-Laurent, F., Walley, K. C., Barthel, S. R., Opperman, M. J., Liang, J., Lin, J. Y., Schatton, T., Laga, A. C., Mihm, M. C., Qureshi, A. A., Widlund, H. R., Murphy, G. F., and Dimitroff, C. J. (2015) Melanoma Cell Galectin-1 Ligands Functionally Correlate with Malignant Potential.J Invest Dermatol 135 , 1849-1862 26.     Tsai, C. H., Tzeng, S. F., Chao, T. K., Tsai, C. Y., Yang, Y. C., Lee, M. T., Hwang, J. J., Chou, Y. C., Tsai, M. H., Cha, T. L., and Hsiao, P. W. (2016) Metastatic Progression of Prostate Cancer Is Mediated by Autonomous Binding of Galectin-4-O-Glycan to Cancer Cells.Cancer Res 76 , 5756-5767 27.     Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Quinn, S. A., Rodriguez-Barrueco, R., Lujambio, A., Williams, E., Sun, X., de la Iglesia-Vicente, J., Lee, A., Readhead, B., Chen, X., Galsky, M., Esteve, B., Petrylak, D. P., Dudley, J. T., Rabadan, R., Silva, J. M., Hoshida, Y., Lowe, S. W., Cordon-Cardo, C., and Domingo-Domenech, J. (2015) A targetable GATA2-IGF2 axis confers aggressiveness in lethal prostate cancer.Cancer Cell 27 , 223-239 28.     Larsimont, J. C., Youssef, K. K., Sanchez-Danes, A., Sukumaran, V., Defrance, M., Delatte, B., Liagre, M., Baatsen, P., Marine, J. C., Lippens, S., Guerin, C., Del Marmol, V., Vanderwinden, J. M., Fuks, F., and Blanpain, C. (2015) Sox9 Controls Self-Renewal of Oncogene Targeted Cells and Links Tumor Initiation and Invasion.Cell Stem Cell 17 , 60-73 29.     Sears, R., Nuckolls, F., Haura, E., Taya, Y., Tamai, K., and Nevins, J. R. (2000) Multiple Ras-dependent phosphorylation pathways regulate Myc protein stability.Genes Dev 14 , 2501-2514 30.     Glinsky, V. V., Glinsky, G. V., Rittenhouse-Olson, K., Huflejt, M. E., Glinskii, O. V., Deutscher, S. L., and Quinn, T. P. (2001) The role of Thomsen-Friedenreich antigen in adhesion of human breast and prostate cancer cells to the endothelium.Cancer Res 61 , 4851-4857 31.     Storr, S. J., Royle, L., Chapman, C. J., Hamid, U. M., Robertson, J. F., Murray, A., Dwek, R. A., and Rudd, P. M. (2008) The O-linked glycosylation of secretory/shed MUC1 from an advanced breast cancer patient's serum.Glycobiology 18 , 456-462 32.     Petrosyan, A., Holzapfel, M. S., Muirhead, D. E., and Cheng, P. W. (2014) Restoration of compact Golgi morphology in advanced prostate cancer enhances susceptibility to galectin-1-induced apoptosis by modifying mucin O-glycan synthesis.Mol Cancer Res 12 , 1704-1716 33.     Dalziel, M., Whitehouse, C., McFarlane, I., Brockhausen, I., Gschmeissner, S., Schwientek, T., Clausen, H., Burchell, J. M., and Taylor-Papadimitriou, J. (2001) The relative activities of the C2GnT1 and ST3Gal-I glycosyltransferases determine O-glycan structure and expression of a tumor-associated epitope on MUC1.J Biol Chem 276 , 11007-11015 34.     Kumamoto, K., Goto, Y., Sekikawa, K., Takenoshita, S., Ishida, N., Kawakita, M., and Kannagi, R. (2001) Increased expression of UDP-galactose transporter messenger RNA in human colon cancer tissues and its implication in synthesis of Thomsen-Friedenreich antigen and sialyl Lewis A/X determinants.Cancer Res 61 , 4620-4627 35.     Sakuma, K., Aoki, M., and Kannagi, R. (2012) Transcription factors c-Myc and CDX2 mediate E-selectin ligand expression in colon cancer cells undergoing EGF/bFGF-induced epithelial-mesenchymal transition.Proc Natl Acad Sci U S A 109 , 7776-7781 36.     Hawksworth, D., Ravindranath, L., Chen, Y., Furusato, B., Sesterhenn, I. A., McLeod, D. G., Srivastava, S., and Petrovics, G. (2010) Overexpression of C-MYC oncogene in prostate cancer predicts biochemical recurrence.Prostate Cancer Prostatic Dis 13 , 311-315 37.     Nupponen, N. N., Kakkola, L., Koivisto, P., and Visakorpi, T. (1998) Genetic alterations in hormone-refractory recurrent prostate carcinomas.Am J Pathol 153 , 141-148 38.     Kaltz-Wittmer, C., Klenk, U., Glaessgen, A., Aust, D. E., Diebold, J., Lohrs, U., and Baretton, G. B. (2000) FISH analysis of gene aberrations (MYC, CCND1, ERBB2, RB, and AR) in advanced prostatic carcinomas before and after androgen deprivation therapy.Lab Invest 80 , 1455-1464 39.     Song, K., Herzog, B. H., Fu, J., Sheng, M., Bergstrom, K., McDaniel, J. M., Kondo, Y., McGee, S., Cai, X., Li, P., Chen, H., and Xia, L. (2015) Loss of Core 1-derived O-Glycans Decreases Breast Cancer Development in Mice.J Biol Chem 290 , 20159-20166 40.     Hung, J. S., Huang, J., Lin, Y. C., Huang, M. J., Lee, P. H., Lai, H. S., Liang, J. T., and Huang, M. C. (2014) C1GALT1 overexpression promotes the invasive behavior of colon cancer cells through modifying O-glycosylation of FGFR2.Oncotarget 5 , 2096-2106 41.     Chong, Y. K., Sandanaraj, E., Koh, L. W., Thangaveloo, M., Tan, M. S., Koh, G. R., Toh, T. B., Lim, G. G., Holbrook, J. D., Kon, O. L., Nadarajah, M., Ng, I., Ng, W. H., Tan, N. S., Lim, K. L., Tang, C., and Ang, B. T. (2016) ST3GAL1-Associated Transcriptomic Program in Glioblastoma Tumor Growth, Invasion, and Prognosis.J Natl Cancer Inst 108 42.     Ulloa, F., Franci, C., and Real, F. X. (2000) GalNAc-alpha -O-benzyl inhibits sialylation of de Novo synthesized apical but not basolateral sialoglycoproteins and blocks lysosomal enzyme processing in a post-trans-Golgi network compartment.J Biol Chem 275 , 18785-18793 43.     Shukla, S., Cyrta, J., Murphy, D. A., Walczak, E. G., Ran, L., Agrawal, P., Xie, Y., Chen, Y., Wang, S., Zhan, Y., Li, D., Wong, E. W. P., Sboner, A., Beltran, H., Mosquera, J. M., Sher, J., Cao, Z., Wongvipat, J., Koche, R. P., Gopalan, A., Zheng, D., Rubin, M. A., Scher, H. I., Chi, P., and Chen, Y. (2017) Aberrant Activation of a Gastrointestinal Transcriptional Circuit in Prostate Cancer Mediates Castration Resistance.Cancer Cell 32 , 792-806 e797 44.     Chen, X., Li, Q., Liu, X., Liu, C., Liu, R., Rycaj, K., Zhang, D., Liu, B., Jeter, C., Calhoun-Davis, T., Lin, K., Lu, Y., Chao, H. P., Shen, J., and Tang, D. G. (2016) Defining a Population of Stem-like Human Prostate Cancer Cells That Can Generate and Propagate Castration-Resistant Prostate Cancer.Clin Cancer Res 22 , 4505-4516 45.     Yi, B., Zhang, Z., Zhang, M., Schwartz-Albiez, R., and Cao, Y. (2013) CD176 antiserum treatment leads to a therapeutic response in a murine model of leukemia.Oncol Rep 30 , 1841-1847 46.     Karsten, U., and Goletz, S. (2013) What makes cancer stem cell markers different?Springerplus 2 , 301

無

當結合附圖閱讀時，將更好地理解前述之發明內容及本發明之下列詳細描述。欲說明本發明，在附圖中顯示目前較佳之具體實施例。然而，應理解的是，本發明不侷限於所示之精確佈置與作法。

在圖式中：

圖1A至圖1B顯示在mCRPC中的醣化作用基因表現。圖1A顯示，GSE32269 (左方)與GSE35988 (右方)公開之PCa世代研究中的C1GALT1表現量。***P > 0.001 (未配對t檢定，雙尾)。圖1B顯示，以IHC測定商用PCa組織陣列中C1GALT1之表現，並利用卡方檢定分析病理階段，P = 0.0027。右方為正常前列腺組織與PCa第IV階段的IHC影像。

圖2A至圖2I顯示，在CRPC惡化過程中及在LNCaP腫瘤模型中，C1GALT1為維持去勢抗性所需。圖2A顯示LNCaP細胞之體內CRPC發展流程圖。下方，定量分析LNCaP衍生之原位腫瘤的縱向BLI (生物發光造影)，以取得腫瘤生長曲線，且數值以平均值 ± SEM表示，n=5。圖2B顯示代表性之集落形成試驗，並在安可坦處理10天之下定量LNCaP與LNCaP-CR4細胞。圖2C顯示，在LNCaP細胞及其衍生物中的C1GALT1免疫墨染。圖2D顯示針對LNCaP與LNCaP衍生之CRPC細胞的C1GALT1定量RT-PCR。圖2E為N-聚醣與黏蛋白型O-聚醣之凝集素結合位點示意圖。圖2F顯示以PNA、木菠蘿凝集素(jacalin)、及PHA-L凝集素染色法分析LNCaP與LNCaP-CR4細胞的表面醣表型。下方，三重複之平均螢光強度(MFI)數值。圖2G顯示生長在有或無1 nmol/L DHT之CD-FBS培養基中4天，CR4-shCtrl與CR4-shC1GALT1細胞之C1GALT1、雄性激素受體(AR)、PSA、及斷裂型PARP (cl. PARP)的免疫墨染。圖2H顯示LNCaP-CR4細胞以對照組(CR-shCtrl)或C1GALT1 (CR4-shC1GALT1#1、#2) shRNAs減量後的細胞存活試驗。細胞生長在有或無補充DHT之CD-FBS培養基(ADT)中6天。將數據標準化為第0天時的數值。圖2I顯示在CR4-shCtrl與CR4-shC1GALT1中半乳糖凝集素-4、PSA、及AR之定量RT-PCR。數據以平均值± SEM表示。*P > 0.05，**P > 0.01，***P > 0.001 (未配對t檢定，雙尾)。

圖3A至圖3G顯示半乳糖凝集素-4/O-聚醣傳訊介導RTK活化與去勢抗性。圖3A顯示在LNCaP與LNCaP衍生之CRPC細胞中半乳糖凝集素-1、2、3、4、8、及9之定量RT-PCR。圖3B顯示穩定表現對照組(CR4-shCtrl)或半乳糖凝集素-4 (CR4-shGal4#1、#2) shRNAs之LNCaP-CR4細胞的細胞存活試驗。細胞生長在有或無補充DHT之CD-FBS培養基(ADT)中6天。將數據標準化為第0天時的數值。圖3C顯示生長在有或無1 nmol/L DHT之CD-FBS培養基中4天，CR4-shCtrl與CR4-shGal4細胞之半乳糖凝集素-4與斷裂型PARP (cl. PARP)的免疫墨染。圖3D顯示穩定表現對照組(CR-shCtrl)或半乳糖凝集素-4 (CR4-shGal4#1、#2) shRNAs之LNCaP-CR4細胞之半乳糖凝集素-4、雄性激素受體(AR)、及PSA的定量RT-PCR。圖3E顯示LNCaP-tetO-Gal4與22Rv1-tetO-Gal4細胞以3 μM苦馬豆素(Swainsonine)或4 mM芐基-α-GalNAc處理2天，且隨後以去氧羥四環素(doxycycline)介導之半乳糖凝集素-4誘導後，半乳糖凝集素-4、HER2/3磷酸化、AR、及PSA表現的免疫墨染。圖3F顯示利用木菠蘿凝集素與半乳糖凝集素-4染色，分析22Rv1與22Rv1-M4細胞之表面醣表型。下方，三重複之平均螢光強度(MFI)數值。圖3G顯示代表性集落形成試驗，即M4-shCtrl、M4-shGal4、及M4-shC1GALT1細胞於生長10天後之定量。數據以平均值± SEM表示。*P > 0.05，**P > 0.01，***P > 0.001 (未配對t檢定，雙尾)。

圖4A至圖4F顯示半乳糖凝集素-4表現在原位前列腺癌異種移植模型中促進去勢抗性與轉移。圖4A顯示CR4-shCtrl或CR4-shGal4腫瘤的縱向BLI，以確定腫瘤生長，如圖2A所示。將2× 10⁵ 個細胞植入有或無去勢之NOD-SCID小鼠前列腺中，n= 6。圖4B顯示在終點時圖4A的腫瘤重量，其表示為平均值± SEM (n=6)。右方，腫瘤的總體外觀。圖4C顯示在終點時所檢查之圖4A中淋巴結的BLI。右方，代表性BLI影像。圖4D顯示在裸鼠(n=6)中表現四環黴素誘導性半乳糖凝集素-4之LNCaP原位腫瘤的縱向BLI。將DOX加入飲用水(0.5 mg/mL)中，且每三天更新一次。圖4E顯示所指之不同組別中半乳糖凝集素-4的IHC染色。圖4F顯示在終點時，以柱散點表示淋巴結的BLI，n=6。右方，在轉移時之代表性BLI影像與抗CK18抗體染色。數據表示為 ± SEM。*P > 0.05，**P > 0.01，***P > 0.001 (未配對t檢定，雙尾)。

圖5A至圖5F顯示半乳糖凝集素-4介導之SOX9表現能促進類幹細胞表型與轉移性集落形成。圖5A顯示相較於M4-shGal4細胞，GSEA顯示在M4-shCtrl細胞中，半乳糖凝集素-4之轉錄組印記在HER2傳訊、癌症幹細胞、及O-聚醣生合成途徑之基因明顯豐富。利用全基因組微陣列鑑定差異表現之基因(P_adj > 0.05與FC ≥ 1.5)，並與shRNA介導之半乳糖凝集素-4減量之M4細胞或強制半乳糖凝集素-4表現之LNCaP與22Rv1細胞比較。圖5B顯示M4-shCtrl或M4-shGal4細胞之代表性腫瘤球體試驗與定量。圖5C顯示SOX9表現對腫瘤球體形成的作用。22Rv1-M4細胞以對照組或SOX9 shRNAs穩定轉染並誘導10天後的代表性腫瘤球體試驗與定量。圖5D顯示利用尾靜脈注射1 × 10⁶ 個M4-shCtrl或M4-shSOX9細胞至NOD-SCID小鼠(n=8)的轉移性集落形成試驗。下方，所指組別之代表性BLI影像。圖5E顯示M4-shC1GALT1與M4-shCtrl細胞中C1GALT1、半乳糖凝集素-4 (Gal4)、SOX9、及ALDH1A1的免疫墨染。圖5F顯示M4-shCtrl與M4-shC1GALT1細胞中代表性腫瘤球體試驗與定量。數據表示為平均值 ± SEM。*P > 0.05，**P > 0.01，***P > 0.001 (未配對t檢定，雙尾)。

圖6A至圖6J顯示半乳糖凝集素-4表現調節MYC介導之O-醣化作用生合成途徑。圖6A顯示表現對照組或半乳糖凝集素-4 shRNAs之22Rv1-M4細胞中半乳糖凝集素-4 (Gal4)、C1GALT1、GCNT1、及ST3GAL1的qRT-PCR。圖6B顯示利用ENCODE TF ChIP-seq資料庫，預測富含於LNCaP細胞之半乳糖凝集素-4介導之基因印記的轉錄因子。圖6C顯示表現對照組(M4-shCtrl)或MYC (M4-shMYC #1、#2) shRNAs之22Rv1-M4細胞中核心1 O-聚醣相關酵素與MYC的qRT-PCR。圖6D為表現對照組或MYC shRNAs之22Rv1-M4細胞中MYC、C1GALT1、SOX9、及半乳糖凝集素-4的表現量。圖6E顯示以木菠蘿凝集素、PHA-L、及半乳糖凝集素-4染色分析M4-shCtrl與M4-shMYC細胞的醣表型。下方，三重複之平均螢光強度(MFI)數值。圖6F顯示M4-shCtrl與M4-shMYC細胞之腫瘤球體試驗的代表性腫瘤球體影像與定量。圖6G顯示有或無DOX處理4天之22Rv1-tetO-MYC與LNCaP-tetO-MYC的半乳糖凝集素-4結合試驗。下方，三重複之平均螢光強度(MFI)數值。圖6H顯示LNCaP-CR4細胞中之HER2免疫沉澱，隨後進行木菠蘿凝集素與半乳糖凝集素-4凝集素墨染。圖6I顯示22Rv1-M4中MYC結合至C1GALT1啟動子區的ChIP-qPCR。Neg Ctrl，陰性對照組引子係針對C1GALT1啟動子之MYC結合位點上游約2000 bp之區域設計。圖6J顯示GSE21032之公開PCa世代研究中C1GALT1與MYC活性計分間之表現量皮爾森相關性分析(pearson correlation analysis)。除了6J以外，數據表示為平均值 ± SEM。*P > 0.05，**P > 0.01，***P > 0.001 (未配對t檢定，雙尾)。

圖7A至圖7G顯示C1GALT1上調與PCa中半乳糖凝集素-4之臨床階段和風險增加相關。圖7A顯示決定PCa與配對之相鄰正常組織(n=21)之半乳糖凝集素-4與C1GALT1的mRNA量。利用配對t檢定決定P值。圖7B顯示利用皮爾森相關係數分析圖7A中半乳糖凝集素-4與C1GALT1 mRNA量間之相關性。圖7C顯示GSE32269之公開PCa世代研究中C1GALT1與半乳糖凝集素-4間之表現量的皮爾森相關性分析。圖7D顯示臨床PCa (n=231)中半乳糖凝集素-4與C1GALT1過度表現之風險比率(HR)的森林圖(forest plot)比較。利用對數秩檢定(Log-rank test)確定HR與P值。圖7E顯示如圖7D所指子組別之卡本-麥爾存活分析(Kaplan-Meier survival analysis)。圖7F顯示圖7E之代表性IHC影像。圖7G顯示圖7E之半乳糖凝集素-4與C1GALT1間之染色計分的皮爾森相關性分析。

圖8A至圖8C顯示前列腺癌細胞醣表型之確認。圖8A與圖8B顯示LNCaP-tetO-Gal4 (A)與22Rv1-tetO-Gal4 (B)細胞以3 μM苦馬豆素或4 mM芐基-α-GalNAc處理2天，且隨後以去氧羥四環素誘導半乳糖凝集素-4後之凝集素結合試驗。圖8C顯示利用PNA與PHA-L凝集素染色分析22Rv1與22Rv1-M4細胞之表面醣表型。下方，三重複之平均螢光強度(MFI)數值。數據表示為平均值 ± SEM。*P> 0.05，**P> 0.01，***P> 0.001 (未配對t檢定，雙尾)。

圖9A至圖9F顯示PCa細胞中半乳糖凝集素-4之表現介導癌症幹細胞性質。圖9A顯示表現對照組(M4-shCtrl)或半乳糖凝集素-4 (M4-shGal4#1、#2) shRNAs之22Rv1-M4細胞中半乳糖凝集素-4與SOX9的qRT-PCR。圖9B顯示SOX9表現對腫瘤球體形成的作用。穩定轉染對照組(CR4-shCtrl)或SOX9(CR4-shSOX9#1、#2) shRNAs之LNCaP-CR4細胞的代表性腫瘤球體試驗與定量。圖9C顯示以3 μM苦馬豆素或4 mM芐基-α-GalNAc處理2天之22Rv1-M4細胞的凝集素結合試驗。圖9D顯示以3 μM苦馬豆素或4 mM芐基-α-GalNAc (Bn-α-GalNAc)處理2天後之22Rv1-M4細胞中半乳糖凝集素-4介導之RTK磷酸化與SOX9表現的免疫墨染。圖9E顯示於存在或不存在去氧羥四環素下以四環黴素誘導性半乳糖凝集素-4穩定轉染4天之LNCaP與PC-3細胞中半乳糖凝集素-4(Gal4)、SOX9、及ALDH1A1的免疫墨染。圖9F顯示LNCaP-tetO-Gal4與PC-3-tetO-Gal4細胞在有或無去氧羥四環素下進行3個系列之繼代培養後的代表性腫瘤球體試驗與定量。數據以平均值± SEM表示。***P> 0.001 (未配對t檢定，雙尾)。

圖10A至圖10C顯示MYC表現調節O-醣化作用的基因印記。圖10A顯示以有或無DOX處理4天之22Rv1-tetO-MYC (左方)與LNCaP-tetO-MYC (右方)細胞中MYC與核心1 O-聚醣相關之醣基轉移酶的qRT-PCR。圖10B顯示以有或無去氧羥四環素處理4天之22Rv1-tetO-MYC與LNCaP-tetO-MYC細胞中MYC、C1GALT1、半乳糖凝集素-4(Gal4)、及SOX9的免疫墨染。圖10C顯示22Rv1-M4細胞與半乳糖凝集素-4-表現之22Rv1與LNCaP細胞在所指處理24 h下之AKT與ERK磷酸化、MYC、及C1GALT1量的免疫墨染。數據以平均值 ± SEM表示。*P> 0.05，**P> 0.01，***P> 0.001 (未配對t檢定，雙尾)。

無

Claims (15)

1. 一種預測前列腺癌預後之方法，其包含：(i)提供罹患前列腺癌之個體的生物樣本；以及(ii)檢測樣本中第一標記與第二標記，其中該第一標記為核心1 β-3-半乳糖基轉移酶(core 1 beta-3-galactosyltransferase，C1GALT1)基因產物，以及該第二標記為半乳糖凝集素-4(galectin-4)基因產物；以及比較檢測結果與參考量，並依據比較的結果預測該個體之預後，其中該第一標記及該第二標記之量增加，表示預後不良。
2. 如請求項1之方法，其中該基因產物包括蛋白質或RNA轉錄本。
3. 如請求項1之方法，其中該第一標記係以第一試劑檢測，其特異地結合至該C1GALT1基因產物，及該第二標記係以第二試劑檢測，其特異地結合至該半乳糖凝集素-4基因產物。
4. 如請求項3之方法，其中該第一試劑為抗體及/或該第二試劑為抗體。
5. 如請求項1之方法，其中該檢測係利用質譜試驗或免疫試驗進行。
6. 如請求項1之方法，其中該生物樣本為體液樣本或組織樣本。
7. 如請求項6之方法，其中該體液樣本係選自於由精液、血液、及尿液組成之群組。
8. 如請求項1之方法，其中該預後不良係選自於由存活率降低、腫瘤大小或數量增加、轉移風險增加、抗雄性激素剝奪療法(ADT)的風險增加、復發風險增加、及其任何結合物組成之群組。
9. 一種監控罹患前列腺癌病患之前列腺癌惡化的方法，其包含：(a)在第一時間點提供該病患之第一生物樣本；(b)在第二時間點提供該病患之第二生物樣本，該第二時間點比第一時間點晚；(c)檢測該第一與第二生物樣本中第一標記與第二標記之量，其中該第一標記為核心1 β-3-半乳糖基轉移酶(core 1 beta-3-galactosyltransferase，C1GALT1)基因產物，以及該第二標記為半乳糖凝集素-4(galectin-4)基因產物；以及(d)依據該第一與第二生物樣本中該第一標記與該第二標記之量，決定病患之前列腺癌惡化情形，其中相較於該第一生物樣本，該第二生物樣本中該第一標記及該第二標記之量增加，表示前列腺癌惡化。
10. 如請求項9之方法，其中該基因產物包括蛋白質或RNA轉錄本。
11. 如請求項9之方法，其中該第一標記係以第一試劑檢測，其特異地結合至該C1GALT1基因產物，及/或該第二標記係以第二試劑檢測，其特異地結合至該半乳糖凝集素-4基因產物。
12. 如請求項11之方法，其中該第一試劑為抗體及/或該第二試劑為抗體。
13. 如請求項9之方法，其中該檢測係利用質譜試驗或免疫試驗進行。
14. 如請求項9之方法，其中該生物樣本為體液樣本或組織樣本。
15. 如請求項14之方法，其中該體液樣本係選自於由精液、血液、及尿液組成之群組。

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