TWI802111B - 細胞活化反應器及細胞活化方法 - Google Patents

Abstract

本揭露提供一種細胞活化反應器及細胞活化方法。所述細胞活化反應器包括本體、旋轉件、上蓋、微孔洞薄膜以及多個檔板。本體具有容置空間，適於容置多個細胞與多個磁珠。旋轉件設置於容置空間中，其包括多個葉輪。微孔洞薄膜設置於容置空間，並覆蓋容置空間的多個通透孔。多個檔板設置於本體，當旋轉件被驅動旋轉時，多個檔板與多個葉輪的交互作用使細胞與磁珠分離。

Description

細胞活化反應器及細胞活化方法

本揭露是有關於一種細胞活化反應器及細胞活化方法，且特別是有關於一種增進細胞增殖的細胞活化反應器及細胞活化方法。

細胞培養為生醫科技領域的重要技術之一，在近年內熱切研究及優化的免疫治療技術中，可透過由患者的生物檢體分離出T細胞，再將T細胞進行培養擴增，使T細胞的濃度足夠，進而實施免疫治療方法，可針對特定癌細胞進行專一性攻擊，且副作用低。

在細胞培養過程中（尤其是T細胞），除了一般常規條件（例如：置於穩定的細胞培養箱、添加營養液）之外，也可藉由多突狀磁珠增加更多與細胞接觸的表面積，以刺激細胞活化，進而達到更好品質與數量的擴增效果。在此技術過程中，須將緊貼於磁珠的細胞彼此分離，分離後可純化出細胞，以進行下一階段的擴增培養週期。在既有技術中，一般是透過人工操作進行細胞分離，操作人員需要使用微量吸管與塑膠容器移轉這些液體於各個機台之間。然而，人工操作方式很有可能導致細胞交叉汙染、生物廢棄物感染疑慮、較冗長的操作時間以及較高的人力成本等問題，進而限制細胞培養的研究場所僅能於實驗室模式。當應用於免疫療法時，因價格高昂，所以並不普及於目前的癌症治療方法中。

基於上述，如何改善人工分離細胞的實驗手法，並優化細胞培養製程，縮短培養細胞時間且提升細胞培養品質，進而降低成本，顯得日趨重要。

本揭露提供一種細胞活化反應器及細胞活化方法，適於改善人工分離細胞的實驗手法，可優化細胞培養製程，減少人工操作誤差，提升實驗再現性。

本揭露的細胞活化反應器包括本體、旋轉件、上蓋、微孔洞薄膜以及多個檔板。本體具有由封閉端、側部與開放端形成的容置空間，適於容置含有多個細胞與多個磁珠的細胞培養液。旋轉件設置於容置空間中，包括軸心以及多個葉輪，旋轉件適於與驅動器連接而被驅動旋轉。上蓋可拆卸地設置於本體上方，以覆蓋容置空間的開放端，上蓋具有開孔，開孔對應於旋轉件的位置設置，使旋轉件的軸心穿設於開孔內，並露出旋轉件的軸心之端部，驅動器透過端部與旋轉件連接。微孔洞薄膜設置於容置空間的封閉端，封閉端具有貫通的多個通透孔，微孔洞薄膜覆蓋多個通透孔。多個檔板設置於容置空間的側部上，當旋轉件被驅動旋轉時，多個檔板與旋轉件的多個葉輪的交互作用使細胞與磁珠分離。

本揭露的細胞活化方法使用上述細胞活化反應器進行細胞活化，其步驟包含：可程控的啟動驅動器，間歇式的使旋轉件被驅動而旋轉，以分散多個細胞與多個磁珠；以及靜置活化後，移除並收集多個細胞。

基於上述，本揭露的細胞活化反應器包括本體、旋轉件、上蓋、微孔洞薄膜以及多個檔板。透過多個檔板與旋轉件的交互作用，可自動化地使細胞與磁珠分離。此外，位於本體容置空間封閉端的微孔洞薄膜具有多個通透孔，氣體藉由通透孔在容置空間內外進行自主性交換，因此，可使本體容置空間處於富氧環境。如此一來，可進行靜態細胞培養，改善人工分離細胞的實驗手法，同時優化細胞培養製程，減少人工操作誤差，並提升實驗再現性。除此之外，更可提升可自動化的可能性，量化製程加速細胞生產系統開發，進而縮短培養細胞時間且提升細胞培養品質，並降低習知技術中較高的人力成本。

下文列舉實施例並配合附圖來進行詳細地說明，但所提供的實施例並非用以限制本揭露所涵蓋的範圍。此外，附圖僅以說明為目的，並未依照原尺寸作圖。為了方便理解，在下述說明中相同的元件將以相同的符號標示來說明。另外，關於文中所使用「包含」、「包括」、「具有」等等用語，均為開放性的用語，也就是指「包含但不限於」。再者，文中所提到的方向性用語，例如「上」、「下」等，僅是用以參考附圖的方向，並非用來限制本揭露。此外，在說明書中所提及的數量與形狀僅用以具體地說明本揭露以便於了解其內容，而非用以限定本揭露。

在本文中，由「一數值至另一數值」表示的範圍，是一種避免在說明書中一一列舉該範圍中的所有數值的概要性表示方式。因此，某一特定數值範圍的記載，涵蓋該數值範圍內的任意數值以及由該數值範圍內的任意數值界定出的較小數值範圍，如同在說明書中說明文寫出該任意數值和該較小數值範圍一樣。

圖1為依照本揭露的一實施例的細胞活化反應器的局部結構示意圖。圖2為依照本揭露的一實施例的細胞活化反應器的結構示意圖。圖3為依照本揭露的一實施例的細胞活化反應器的本體與上蓋接面的剖面示意圖。圖4為沿圖3中切線L-L’的剖面示意圖。圖5為依照本揭露的一實施例的細胞活化反應器的本體與下蓋接面的剖面示意圖。

請先參照圖1，細胞活化反應器的主要組成包括本體10、上蓋20以及下蓋30，上蓋20可拆卸地設置於本體10上方，下蓋30設置於本體10下方。本體10、上蓋20以及下蓋30的材料可包括聚碳酸脂（PC）。請同時參照圖1及圖2，除了圖1中所繪示的主要組成，細胞活化反應器可更包括驅動器40、支架42以及座體50。座體50設置於本體10下方，下蓋30可崁入於座體50的凹槽中。驅動器40設置於上蓋20上方，支架42連接驅動器40與座體50，以支持驅動器40維持於上蓋20上方的位置。驅動器40可包括馬達，但本揭露並不以此為限。

請同時參照圖1、圖2及圖3，本體10具有容置空間12，本體10的容置空間12係由封閉端12A、側部12B與開放端12C所形成，容置空間12適於容置含有多個細胞與多個磁珠的細胞培養液。在一實施例中，容置空間12的腔體體積例如是20 mL。在其他實施例中，容置空間12的腔體體積可為10-1000mL。旋轉件70設置於容置空間12中，其包括軸心A以及多個葉輪72，旋轉件70適於與驅動器40連接而被驅動旋轉。在本實施例中，上蓋20覆蓋容置空間12的開放端12C，上蓋20可透過開孔22而限定旋轉件70的位置，且在旋轉件70被驅動而轉動時能夠防止細胞培養液漏出。詳細來說，上蓋20具有開孔22，開孔22對應於旋轉件70的位置設置，使旋轉件70的軸心A可凸出於本體10外而穿設於開孔22內，並露出旋轉件70的軸心A之端部M，藉此，驅動器40透過端部M與旋轉件70連接，使旋轉件70可被驅動器40驅動而旋轉，旋轉件70的轉速例如是0至100 rpm，且可進行可程控旋轉。多個檔板60設置於容置空間12的側部12B上，多個葉輪72的數量可對應於多個檔板60的數量，但並不以此為限。當旋轉件70被驅動旋轉時，由於多個檔板60與旋轉件70的多個葉輪72之間具有較為狹窄之縫隙，藉由多個檔板60與旋轉件70的多個葉輪72交互作用，可以使細胞與磁珠分離，且檔板60與葉輪72可增加流體剪力。關於細胞與磁珠分離的詳細操作流程，將會於下文中詳細說明。

請同時參照圖1、圖2及圖3，葉輪72與檔板60之間的最小距離d例如是1 mm。在其他實施例中，葉輪72與檔板60之間的最小距離d可為1-8mm。在本實施例中，本體10例如是圓柱狀，本體10的軸心與旋轉件70的軸心A可重合，各葉輪72以旋轉件70的軸心A向容置空間12的側部12B延伸而厚度漸縮，各檔板60以容置空間12的側部12B向旋轉件70的軸心A延伸而厚度漸縮，以減少細胞破裂。多個檔板60的數量例如是4個以上，多個葉輪72的數量例如是4個以上。雖然圖3中繪示的檔板60及葉輪72的數量分別為各6個，但本揭露並不以此為限，且檔板60及葉輪72的數量可以是奇數或偶數。

請同時參照圖1、圖2、圖3及圖4，旋轉件70與容置空間12的封閉端12A之間的距離h例如是0.05 mm至1 mm，可強化層流，使流體（即細胞培養液）平均受力。在本實施例中，葉輪72的剖面形狀例如是長方形。

請同時參照圖1、圖2、圖3、圖4及圖5。要注意的是，在圖4中因應解說之需要而僅繪示出部分元件，且各元件僅作為示意，主要呈現各元件之間的配置關係，但並非代表實際元件大小的比例關係。在本實施例中，微孔洞薄膜80設置於容置空間12的封閉端12A，係使用透氣不透水的薄膜材料製成，例如是包括聚四氟乙烯（Polytetrafluoroethylene， PTFE）的材料。詳細來說，容置空間12的封閉端12A具有上下貫通的多個通透孔14，微孔洞薄膜80設置於容置空間12的封閉端12A，並覆蓋這些通透孔14。由於微孔洞薄膜80的厚度非常的薄，容置空間12的封閉端12A可使用具有支撐性的材料製成，例如是包括PC或尼龍(Nylon)，以避免微孔洞薄膜80因為容置空間12容置細胞培養液而造成塌陷。藉由微孔洞薄膜80與這些通透孔14的設置，氣體可在容置空間12內外進行自主性交換，使細胞培養液能維持在富氧的環境中。在一實施例中，多個通透孔14的孔徑例如是1.2 mm，微孔洞薄膜80的面積例如是490.87mm ²。在其他實施例中，通透孔14的孔徑可為0.6 ~ 1.5 mm，微孔洞薄膜80的面積可為324 ~ 14400 mm ²。

在一實施例中，下蓋30具有多個腳架32，可架高本體10，以露出這些通透孔14，使細胞活化反應器在靜置時，保留足夠的空間讓氣體透過通透孔14在容置空間12進出，以提供容置空間12具備自主性的富氧環境，可以活化細胞。在另一實施例中，細胞活化反應器更可包含座體50，設置於本體10下方，下蓋30可崁入於座體50的凹槽中，以使細胞活化反應器在靜置時更為穩固，並同時提供足夠的空間讓氣體進出。

圖6A至圖6C是依照本揭露的一實施例的細胞活化反應器的操作剖面示意圖。

本揭露也提供一種細胞活化方法，使用上述細胞活化反應器進行細胞活化，詳細的操作流程如圖6A至圖6C所示。請參照圖6A，細胞培養液100中含有多個細胞102與多個磁珠104，此時細胞102與磁珠104緊密地結合在一起，細胞培養液100中細胞102的初始量例如是5×10 ⁵至10×10 ⁵。請參照圖6B，當旋轉件70與驅動器40連接而被驅動旋轉時，多個旋轉件70的多個葉輪72交互作用，以使細胞102與磁珠104分離，旋轉件70被驅動器40驅動旋轉，檔板60與葉輪72可提供剪切力以分離細胞102與磁珠104，取代習知技術中透過人工操作移液器來回吸吐進行細胞分離的流程。在一實施例中，驅動器40可進行可程控啟動，如間歇式的使旋轉件70被驅動而旋轉，以進行磁珠與細胞的分散。

如此一來，請參照圖6C，細胞102即可與磁珠104分離。請參照圖6A至圖6C，各葉輪72與各檔板60的剖面形狀例如是長方形，且各葉輪72與各檔板60的高度相同，細胞培養液100的液面高度例如是高於各葉輪72的高度。

以下，藉由實驗例來詳細說明上述本揭露所提出的細胞活化反應器以及細胞活化方法。然而，下述實驗例並非用以限制本揭露。 實驗例

為了證明本揭露的細胞活化反應器以及細胞活化方法可有效地使細胞與磁珠分離，以下特別作此實驗例。 實驗例 1 ：不同數目檔板與葉輪的磁珠細胞分散測試

圖7是使用本揭露的一實施例的細胞活化反應器進行磁珠細胞分散測試的顯微鏡圖。分別使用具有不同數目檔板與葉輪的細胞活化反應器進行磁珠細胞分散測試，在細胞初始量為5×10 ⁵的情形下，以旋轉件之轉速在100 rpm、轉30秒、停30秒交錯的條件下進行5次。之後，使用顯微鏡取部分視野進行拍攝。請參照圖7，可得知在檔板數量為4個以上且葉輪數量為4個以上時，皆具有良好的磁珠細胞分散效果，可充分地打散磁珠與細胞，在本實施例中，使用6個檔板及6個葉輪時，效果良好。 實驗例 2 ：磁珠細胞分散測試比較

圖8是使用本揭露的一實施例的細胞活化反應器進行磁珠細胞分散測試的細胞活性與數量量測圖。在本實驗例中，以數量5×10 ⁵的T細胞與iKNOBEAD磁珠，在T細胞與磁珠為緊密結合的狀況下，分別使用人工操作移液器（pipet）以及本揭露的細胞活化反應器進行T細胞與磁珠的分離打散。在靜置活化三天後，移除磁珠並收集T細胞。之後，實驗組中所收集的T細胞自細胞活化反應器中移除，與對照組的T細胞分別於細胞培養裝置中靜置培養四天後，量測細胞活性與數量。請參照圖8，可得知相較於人工操作移液器（對應圖8中的pipet），本揭露的細胞活化反應器可使T細胞與磁珠具有良好分散性，可縮小人工誤差，再現性高。

綜上所述，本揭露的細胞活化反應器包括本體、旋轉件、上蓋、微孔洞薄膜以及多個檔板。透過多個檔板與旋轉件的交互作用，可自動化地使細胞與磁珠分離，更可強化流體剪力並切斷黏滯力，檔板更可加速液體對流。此外，位於本體容置空間封閉端的微孔洞薄膜具有多個通透孔，氣體藉由通透孔在容置空間內外進行自主性交換，因此，可使本體容置空間富氧，以活化細胞。如此一來，可進行靜態細胞培養，改善人工分離細胞的實驗手法，同時優化細胞培養製程，減少人工操作誤差，並提升實驗再現性。除此之外，更可提升可自動化的可能性，量化製程加速細胞生產系統開發，進而縮短培養細胞時間且提升細胞培養品質，並降低習知技術中較高的人力成本。

10:本體 100:細胞培養液 102:細胞 104:磁珠 12:容置空間 12A:封閉端 12B:側部 12C:開放端 14:通透孔 20:上蓋 22:開孔 30:下蓋 32:腳架 40:驅動器 42:支架 50:座體 60:檔板 70:旋轉件 72:葉輪 80:微孔洞薄膜 A:軸心 d、h:距離 M:端部

圖1為依照本揭露的一實施例的細胞活化反應器的局部結構示意圖。 圖2為依照本揭露的一實施例的細胞活化反應器的結構示意圖。 圖3為依照本揭露的一實施例的細胞活化反應器的本體與上蓋接面的剖面示意圖。 圖4為沿圖3中切線L-L’的剖面示意圖。 圖5為依照本揭露的一實施例的細胞活化反應器的本體與下蓋接面的剖面示意圖。 圖6A至圖6C是依照本揭露的一實施例的細胞活化反應器的操作剖面示意圖。 圖7是使用本揭露的一實施例的細胞活化反應器進行磁珠細胞分散測試的顯微鏡圖。 圖8是使用本揭露的一實施例的細胞活化反應器進行磁珠細胞分散測試的細胞活性與數量量測圖。

10:本體

20:上蓋

22:開孔

30:下蓋

32:腳架

M:端部

Claims (13)

1. 一種細胞活化反應器，包括：本體，具有由封閉端、側部與開放端形成的容置空間，適於容置含有多個細胞與多個磁珠的細胞培養液；旋轉件，設置於所述容置空間中，所述旋轉件包括軸心以及多個葉輪，所述旋轉件適於與驅動器連接而被驅動旋轉；上蓋，可拆卸地設置於所述本體上方，以覆蓋所述容置空間的所述開放端，所述上蓋具有開孔，所述開孔對應於所述旋轉件的位置設置，使所述旋轉件的軸心穿設於所述開孔內，並露出所述旋轉件的軸心之端部，所述驅動器透過所述端部與所述旋轉件連接；微孔洞薄膜，設置於所述容置空間的所述封閉端，所述封閉端具有貫通的多個通透孔，所述微孔洞薄膜覆蓋多個所述通透孔；多個檔板，設置於所述容置空間的所述側部上，當所述旋轉件被驅動旋轉時，多個所述檔板與多個所述葉輪的交互作用使所述細胞與所述磁珠分離；以及下蓋，設置於所述本體下方，所述本體透過所述微孔洞薄膜與所述下蓋連通，所述下蓋架高所述本體，以露出所述通透孔，使所述細胞活化反應器在靜置時，保留足夠的空間讓氣體透過所述通透孔在所述容置空間進出，提供所述容置空間具備自主性的富氧環境以活化細胞。
2. 如請求項1所述的細胞活化反應器，其中所述葉輪與所述檔板之間的最小距離為1-8mm。
3. 如請求項1所述的細胞活化反應器，其中所述本體為圓柱狀，所述本體的軸心與所述旋轉件的軸心重合，各所述葉輪以所述旋轉件的軸心向所述容置空間的所述側部延伸而厚度漸縮。
4. 如請求項1所述的細胞活化反應器，其中各所述檔板以所述容置空間的所述側部向所述旋轉件的軸心延伸而厚度漸縮。
5. 如請求項1所述的細胞活化反應器，其中多個所述檔板的數量為4個以上，多個所述葉輪的數量為4個以上。
6. 如請求項1所述的細胞活化反應器，其中各所述葉輪與各所述檔板的剖面形狀為長方形。
7. 如請求項1所述的細胞活化反應器，其中所述旋轉件與所述容置空間的所述封閉端之間的距離為0.05mm至1mm。
8. 如請求項1所述的細胞活化反應器，其中多個所述通透孔的孔徑為0.6-1.5mm。
9. 如請求項1所述的細胞活化反應器，其中所述微孔洞薄膜的面積為324-14400mm²。
10. 如請求項1所述的細胞活化反應器，更包括座體，設置於所述本體下方，所述下蓋崁入於所述座體的凹槽中。
11. 如請求項1所述的細胞活化反應器，其中各所述葉輪與各所述檔板的高度相同。
12. 如請求項1所述的細胞活化反應器，其中所述細胞培養液的液面高度高於各所述葉輪的高度。
13. 一種細胞活化方法，使用請求項1至請求項12中任一項所述的細胞活化反應器進行細胞活化，其步驟包含：可程控的啟動驅動器，間歇式的使旋轉件被驅動而旋轉，以分散多個細胞與多個磁珠；以及靜置活化後，移除並收集多個所述細胞。

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