TWI898456B

TWI898456B - 從l-高絲胺酸直接製備l-草銨膦的方法

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Publication number: TWI898456B
Application number: TW113107303A
Authority: TW
Inventors: 賴煩; 任杰; 楊苹苹; 范謙
Original assignee: 大陸商湖南利爾生物科技有限公司
Priority date: 2023-03-01
Filing date: 2024-02-29
Publication date: 2025-09-21
Also published as: CN120826474A; TW202500755A; AU2024229805A1; CN118581169A; AR132025A1; EP4647500A9; EP4647500A1; WO2024179537A1

Abstract

本發明提供一種通過酶催化高絲胺酸和甲基次膦酸反應製備L-草銨膦的方法。本發明的方法不包括產生O-醯基-L-高絲胺酸的步驟，且所述方法不使用O-醯基-L-高絲胺酸。

Description

從L-高絲胺酸直接製備L-草銨膦的方法

本發明屬於生物化工領域。具體而言，本發明涉及一種以L-高絲胺酸為底物直接酶促製備L-草銨膦的方法。

草銨膦(glufosinate，也稱為4-[羥基(甲基)膦醯基]-D,L-高丙胺酸)是世界銷量第二的轉基因作物耐受的除草劑。草銨膦是一種廣譜觸殺型除草劑，通過抑制植物體內的L-麩醯胺酸合成酶的活性，導致植物體內氮代謝紊亂，最終殺死植物。與草甘膦相比，草銨膦具有顯著優勢，如應用範圍廣、見效快、持效期長、更低毒、安全等。因此，草銨膦的銷量增長迅速，在未來一段時間內市場需求巨大，前景非常廣闊。

但是，草銨膦的工藝路線複雜，導致產品生產技術難度高。高昂的價格阻礙其迅速取代草甘膦。此外，化學合成的草銨膦是包含等量的兩種光學異構體的外消旋混合物(D,L-草銨膦)，但其中只有L-構型具有生理活性。

近年來報道從D,L-草銨膦製備L-草銨膦的方法眾多。例如，將D-草銨膦氧化成2-羰基-4-(羥基甲基膦醯基)丁酸(PPO)，再對PPO進行還原或轉氨生成L-草銨膦。然而，先化學合成D/L草銨膦，再通過酶法將其中的D-草銨膦轉化為L-草銨膦的工藝複雜，生產成本高。因此，仍然需要更高效的合成L-草銨膦的方法。

WO 2022/207543 A1報道了一種以經活化的高絲胺酸(O-乙醯基高絲胺酸或O-琥珀醯基高絲胺酸)和甲基次膦酸或其酯為底物，在酶(硫化氫解酶或胱硫醚γ合酶)的催化下合成L-草銨膦或其膦酸酯。

然而，此方法需要先生產(例如通過發酵)O-醯基高絲胺酸，從而受限於i)O-醯基高絲胺酸的積累量；ii)O-醯基高絲胺酸(對酸、鹼和加熱)的不穩定性；iii)副產物有機酸對酶活性的抑制；和iv)如果在反應過程中調節pH，增加生產成本、工藝複雜性和產物分離難度。

因此，需要開發新的製備L-草銨膦的方法，使用容易獲得的穩定的底物，降低產物對反應的抑制，簡化工藝(包括生產和分離)並降低成本。

出人意料地，發明人發現，L-高絲胺酸可以在酶的催化下與甲基次膦酸或其酯反應，生成L-草銨膦或其膦酸酯和水(如式I所示)。

L-高絲胺酸是比O-醯基高絲胺酸更易獲得的且更穩定的化合物，並且本發明的反應不產生抑制酶活性的有機酸副產物。

因此，本發明提供一種製備L-草銨膦的方法，包括以下步驟：a)提供反應介質，其包含L-高絲胺酸或其鹽、酯、醯胺或酸酐，甲基次膦酸或其酯和酶，所述酶選自轉移除甲基外的烷基或芳香基的轉移酶、氨裂解酶和催化碳-硫鍵斷裂的裂解酶；b)溫育所述反應介質以產生包含L-草銨膦或其膦酸酯的反應產物；和任選存在的c)從所述反應產物回收L-草銨膦或其膦酸酯。

在一些實施方案中，所述酶選自EC編號為EC 2.5.1.-、EC 4.3.1.-和EC 4.4.1.-的酶。

在一些實施方案中，所述反應介質還包含磷酸吡哆醛或其鹽。

在一些實施方案中，所述酶選自EC編號為EC 2.5.1.47、EC 2.5.1.48、EC 2.5.1.49、EC 2.5.1.51、EC 2.5.1.52、EC 2.5.1.65、EC 2.5.1.76、EC 2.5.1.113、EC 2.5.1.134、EC 2.5.1.140、EC 2.5.1.144、EC 4.3.1.15、EC 4.3.1.17、EC 4.3.1.18、EC 4.3.1.19、EC 4.4.1.1、EC 4.4.1.2、EC 4.4.1.9、EC 4.4.1.10、EC 4.4.1.11、EC 4.4.1.13、EC 4.4.1.15、EC 4.4.1.16、EC 4.4.1.25、EC 4.4.1.28和EC 4.4.1.35的酶。

在一些實施方案中，所述酶來源於選自Thermus thermophiles、球形賴胺酸芽孢桿菌(Lysihibacillus sphaericus)、艱難梭菌(Clostridioides difficile)、諾氏梭菌(Clostridium novyi)、嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)、海棲熱胞菌(Thermotoga maritima)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、獨島不動滑菌(Nonlabens dokdonensis)、銀合歡(Leucaena leucocephala)、Aeropyrum pernix、Methanosarcina acetivorans、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、大腸桿菌(Escherichia coli)、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)、暗產色鏈黴菌(Streptomyces phaeochromogenes)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、菠菜(Spinacia oleracea)、Cyanobacteria bacterium、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、Ruegeria pomeroyi、Methanococcus maripaludis和亞麻薺(Camelina sativa)的生物體。

在一些實施方案中，所述酶選自來源於Thermus thermophiles的半胱胺酸合酶(EC 2.5.1.47-cysteine synthase)、來源於球形賴胺酸芽孢桿菌的胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48-cystathionine gamma-synthase)、來源於艱難梭菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶(EC 2.5.1.49-O-acetylhomoserine aminocarboxypropyltransferase)、來源於諾氏梭菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於嗜熱脂肪地芽孢桿菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於海棲熱胞菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於綠膿假單胞菌O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於獨島不動滑菌的β吡唑醯丙胺酸合酶(EC 2.5.1.51-beta-pyrazolylalanine synthase)、來源於銀合歡的L-含羞草素合酶(EC 2.5.1.52-L-mimosine synthase)、來源於Aeropyrum pernix的O-磷酸絲胺酸硫化氫解酶(EC 2.5.1.65-O-phosphoserine sulthydrylase)、來源於Methanosarcina acetivorans的半胱胺酸合酶(EC 2.5.1.76-cysteate synthase)、來源於結核分支桿菌的[CysO硫載體蛋白]-硫酯依賴性半胱胺酸合酶(EC 2.5.1.113-[CysO sulfur-carrier protein]-thiocarboxylate-dependent cysteine synthase)、來源於枯草芽孢桿菌的胱硫醚β合酶(EC 2.5.1.134-cystathionine beta-synthase)、來源於金黃色葡萄球菌的N-(2-胺基-2-羧基乙基)-L-麩胺酸合酶(EC 2.5.1.140-N-(2-amino-2-carboxyethyl)-L-glutamate synthase)、來源於螢光假單胞菌的S-硫-L-半胱胺酸合酶(EC 2.5.1.144-S-sulfo-L-cysteine synthase)、來源於大腸桿菌的二胺基丙酸氨裂解酶(EC 4.3.1.15-Diaminopropionate ammonia-lyase)、來源於大腸桿菌的L-絲胺酸氨裂解酶(EC 4.3.1.17-L-serine ammonia-lyase)、來源於大腸桿菌的D-絲胺酸氨裂解酶(EC 4.3.1.18-D-serine ammonia-lyase)、來源於麥芽糖假絲酵母的蘇胺酸氨裂解酶(EC 4.3.1.19-threonine ammonia-lyase)、來源於暗產色鏈黴菌的胱硫醚γ裂解酶(EC 4.4.1.1-cystathionine gamma-lyase)、來源於粗糙脈孢菌的胱硫醚γ裂解酶(EC 4.4.1.1-cystathionine gamma-lyase)、來源於枯草芽孢桿菌的高半胱胺酸脫巰基酶(EC 4.4.1.2-homocysteine desulfhydrase)、來源於菠菜的L-3-氰基丙胺酸合酶(EC 4.4.1.9-L-3-cyanoalanine synthase)、來源於Cyanobacteria bacterium的半胱胺酸裂解酶(EC 4.4.1.10-cysteine lyase)、來源於惡臭假單胞菌的甲硫胺酸γ裂解酶(EC 4.4.1.11-methionine gamma-lyase)、來源於乳酸乳球菌的半胱胺酸S綴合物β裂解酶(EC 4.4.1.13-cysteine-S-conjugate beta-lyase)、來源於大腸桿菌的D-半胱胺酸脫巰基酶(EC 4.4.1.15-D-cysteine desulfhydrase)、來源於大腸桿菌的硒代半胱胺酸裂解酶(EC 4.4.1.16-selenocysteine lyase)、來源於Ruegeria pomeroyi的L-半胱胺酸硫裂解酶(EC 4.4.1.25-L-cysteate sulfo-lyase)、來源於Methanococcus maripaludis的L-半胱胺酸脫硫化物酶(EC 4.4.1.28-L-cysteine desulfidase)和來源於亞麻薺的L-胱胺酸β裂解酶(EC 4.4.1.35-L-cystine beta-lyase)。

在一些實施方案中，所述酶包含選自SEQ ID NO：1-31的胺基酸序列。

在一些實施方案中，所述方法是無細胞方法。

在一些實施方案中，步驟a)中的所述反應介質包含表達所述酶的宿主細胞。在一些實施方案中，本發明的方法還包括培養所述宿主細胞的步驟。

在一些實施方案中，在步驟b)中，在30-40℃、32-39℃、34-38℃、36-38℃或37℃溫育所述反應介質。

圖1顯示經純化的GsMetY催化的反應產物的LC-MS結果。A：反應產物樣品檢測結果，B：加入內標後的檢測結果。

圖2顯示表達GsMetY的大腸桿菌催化的反應產物的LC-MS結果。A：樣品檢測結果，B：加入內標後的檢測結果。

圖3顯示表達SpCGL的大腸桿菌催化的反應產物的LC-MS結果。A：樣品檢測結果，B：加入內標後的檢測結果。

本發明提供一種製備L-草銨膦的新方法。除非另有說明，本文中使用的術語具有本發明所屬領域中具通常知識者一般理解的含義。

現有技術報道，4-羥基活化的L-高絲胺酸(如O-醯基高絲胺酸)可以在酶的催化下與甲基次膦酸或其酯反應，產生L-草銨膦或其膦酸酯。

L-高絲胺酸是比O-醯基高絲胺酸更易獲得的且更穩定的化合物，並且式I的反應不產生抑制酶活性的有機酸副產物。

因此，本發明提供一種製備L-草銨膦的方法，包括以下步驟：a)提供反應介質，其包含L-高絲胺酸供體，甲基次膦酸或其酯和酶，所述酶選自轉移除甲基外的烷基或芳香基的轉移酶、氨裂解酶和催化碳-硫鍵斷裂的裂解酶；b)溫育所述反應介質以產生包含L-草銨膦或其膦酸酯的反應產物；和任選存在的c)從所述反應產物回收L-草銨膦或其膦酸酯。

一、底物

如本文所用，「L-高絲胺酸」是指L-2-胺基-4-羥基-1-酸，分子式為C₄H₉NO₃。在本文中，L-高絲胺酸供體包括但不限於L-高絲胺酸或其鹽、酯或醯胺，以及L-高絲胺酸與L-高絲胺酸或其他酸形成的酸酐。L-高絲胺酸供體也包括其胺基上的一或兩個氫被取代的衍生物。L-高絲胺酸的酯是指L-高絲胺酸的羧基與醇或酚反應產生的化合物。L-高絲胺酸醯胺是指L-高絲胺酸的羧基與胺類化合物反應產生的化合物。

在本文中，L-高絲胺酸供體不包括4-羥基的氫原子被醯基取代的衍生物，即O-醯基高絲胺酸。

在步驟b)中，L-高絲胺酸是酶的直接底物。本發明的方法不包括產生O-醯基-L-高絲胺酸的步驟，且所述方法不使用O-醯基-L-高絲胺酸。

甲基次膦酸或其酯如式II所示。

其中，R選自氫、烷基、烯基、炔基、羥烷基和芳基。

在一些實施方案中，所述反應介質包含甲基次膦酸酯。在一些實施方案中，所述方法還包括水解L-草銨膦膦酸酯的步驟。

二、酶

如上所述，本發明的反應在酶的催化下進行，即酶促反應。

如本文所用，術語「酶」是指能夠特異性催化或促進化學或生物化學反應的蛋白質或多肽。本發明的酶可以是完整的天然蛋白質或多肽或其具有催化活性的部分。本發明的酶也可以是天然蛋白質或多肽的經修飾的變體。本發明的酶可以分離自生物體、重組產生或合成產生。本發明所屬領域中具通常知識者能夠通過常規方法獲得酶。

如本文所用，術語「肽」表示通過肽鍵連接的至少兩個胺基酸的鏈。術語「多肽」在本文中可以與術語「蛋白質」互換使用，是指含有十個或更多個胺基酸殘基的鏈。本文中的所有肽和多肽化學式或序列均是從左至右書寫的，表示從胺基末端至羧基末端的方向。

術語「胺基酸」包括蛋白質中天然存在的胺基酸和非天然胺基酸。蛋白質中天然存在的胺基酸的單字母和三字母命名採用本領域慣用名，可見於Sambrook,et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd,ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。

如本文所用，術語「修飾」是指對由本發明的多肽或其同源序列組成的多肽的任何修飾，包括但不限於，取代、刪除、插入和/或添加一或多個胺基酸。

一些酶的催化作用需要輔酶參與。術語「輔酶」是一大類有機輔助因子的總稱，是酶催化氧化還原反應、基團轉移和異構反應的必須因子。它們在酶催化反應中承擔傳遞電子、原子或基團的功能。

發明人發現，用於本發明的酶僅以磷酸吡哆醛作為輔酶。因此，在一些實施方案中，所述反應介質還包含磷酸吡哆醛或其鹽。

在一些實施方案中，所述酶選自半胱胺酸合酶(EC 2.5.1.47-cysteine synthase)、胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48-cystathionine gamma-synthase)、O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶(EC 2.5.1.49-O-acetylhomoserine aminocarboxypropyltransferase)、β吡唑醯丙胺酸合酶(EC 2.5.1.51-beta- pyrazolylalanine synthase)、L-含羞草素合酶(EC 2.5.1.52-L-mimosine synthase)、O-磷酸絲胺酸硫化氫解酶(EC 2.5.1.65-O-phosphoserine sulfhydrylase)、半胱胺酸合酶(EC 2.5.1.76-cysteate synthase)、[CysO硫載體蛋白]-硫酯依賴性半胱胺酸合酶(EC 2.5.1.113-[CysO sulfur-carrierprotein]-thiocarboxylate-dependentcysteine synthase)、胱硫醚β合酶(EC 2.5.1.134-cystathionine beta-synthase)、N-(2-胺基-2-羧基乙基)-L-麩胺酸合酶(EC 2.5.1.140-N-(2-amino-2-carboxyethyl)-L-glutamate synthase)、S-硫-L-半胱胺酸合酶(EC 2.5.1.144-S-sulfo-L-cysteine synthase)、二胺基丙酸氨裂解酶(EC 4.3.1.15-Diaminopropionate ammonia-lyase)、L-絲胺酸氨裂解酶(EC 4.3.1.17-L-serine ammonia-lyase)、D-絲胺酸氨裂解酶(EC 4.3.1.18-D-serine ammonia-lyase)、蘇胺酸氨裂解酶(EC 4.3.1.19-threonine ammonia-lyase)、胱硫醚γ裂解酶(EC 4.4.1.1-cystathionine gamma-lyase)、高半胱胺酸脫巰基酶(EC 4.4.1.2-homocysteine desulfhydrase)、L-3-氰基丙胺酸合酶(EC 4.4.1.9-L-3-cyanoalanine synthase)、半胱胺酸裂解酶(EC 4.4.1.10-cysteine lyase)、甲硫胺酸γ裂解酶(EC 4.4.1.11-methionine gamma-lyase)、半胱胺酸S綴合物β裂解酶(EC 4.4.1.13-cysteine-S-conjugate beta-lyase)、D-半胱胺酸脫巰基酶(EC 4.4.1.15-D-cysteine desulfhydrase)、硒代半胱胺酸裂解酶(EC 4.4.1.16-selenocysteine lyase)、L-半胱胺酸硫裂解酶(EC 4.4.1.25-L-cysteate sulfo-lyase)、L-半胱胺酸脫硫化物酶(EC 4.4.1.28-L-cysteine desulfidase)和L-胱胺酸β裂解酶(EC 4.4.1.35-L-cystine beta-lyase)。

本發明的酶可以來源於任何合適的生物體，包括原核生物和真核生物，例如但不限於古細菌、放線菌、細菌、真菌、動物、植物、藻類和酵母。在一些實施方案中，所述酶來源於選自Thermus thermophiles、球形賴胺酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sphaericus)、艱難梭菌(Clostridioides difficile)、諾氏梭菌(Clostridium novyi)、嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)、海棲熱胞菌(Thermotoga maritima)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、獨島不動滑菌(Nonlabens dokdonensis)、銀合歡(Leucaena leucocephala)、Aeropyrum pernix、Methanosarcina acetivorans、結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、大腸桿菌(Escherichia coli)、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)、暗產色鏈黴菌(Streptomyces phaeochromogenes)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、菠菜(Spinacia oleracea)、Cyanobacteria bacterium、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、Ruegeria pomeroyi、Methanococcus maripaludis和亞麻薺(Camelina sativa)的生物體。

在一些實施方案中，所述酶選自來源於Thermus thermophiles的半胱胺酸合酶(EC 2.5.1.47-cysteine synthase)、來源於球形賴胺酸芽孢桿菌的胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48-cystathionine gamma-synthase)、來源於艱難梭菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶(EC 2.5.1.49-O-acetylhomoserine aminoearboxypropyltransferase)、來源於諾氏梭菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於嗜熱脂肪地芽孢桿菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於海棲熱胞菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於綠膿假單胞菌O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於獨島不動滑菌的β吡唑醯丙胺酸合酶(EC 2.5.1.51-beta-pyrazolylalanine synthase)、來源於銀合歡的L-含羞草素合酶(EC 2.5.1.52-L-mimosine synthase)、來源於Aeropyrum pernix的O-磷酸絲胺酸硫化氫解酶(EC 2.5.1.65-O-phosphoserine sulfhydrylase)、來源於Methanosarcina acetivorans的半胱胺酸合酶(EC 2.5.1.76-cysteate synthase)、來源於結核分支桿菌的[CysO硫載體蛋白]-硫酯依賴性半胱胺酸合酶(EC 2.5.1.113-[CysO sulfur-carrier protein]-thiocarboxylate-dependent cysteine synthase)、來源於枯草芽孢桿菌的胱硫醚β合酶(EC 2.5.1.134-cystathionine beta-synthase)、來源於金黃色葡萄球菌的N-(2-胺基-2-羧基乙基)-L-麩胺酸合酶(EC 2.5.1.140-N-(2-amino-2-carboxyethyl)-L-glutamate synthase)、來源於螢光假單胞菌的S-硫-L-半胱胺酸合酶(EC 2.5.1.144-S-sulfo-L-cysteine synthase)、來源於大腸桿菌的二胺基丙酸氨裂解酶(EC 4.3.1.15-Diaminopropionate ammonia-lyase)、來源於大腸桿菌的L-絲胺酸氨裂解酶(EC 4.3.1.17-L-serine ammonia-lyase)、來源於大腸桿菌的D-絲胺酸氨裂解酶(EC 4.3.1.18-D-serine ammonia-lyase)、來源於麥芽糖假絲酵母的蘇胺酸氨裂解酶(EC 4.3.1.19-threonine ammonia-lyase)、來源於暗產色鏈黴菌的胱硫醚γ裂解酶(EC 4.4.1.1-cystathionine gamma-lyase)、來源於粗糙脈孢菌的胱硫醚γ裂解酶(EC 4.4.1.1-cystathionine gamma-lyase)、來源於枯草芽孢桿菌的高半胱胺酸脫巰基酶(EC 4.4.1.2-homocysteine desulfhydrase)、來源於菠菜的L-3-氰基丙胺酸合酶(EC 4.4.1.9-L-3-cyanoalanine synthase)、來源於Cyanobacteria bacterium的半胱胺酸裂解酶(EC 4.4.1.10-cysteine lyase)、來源於惡臭假單胞菌的甲硫胺酸γ裂解酶(EC 4.4.1.11-methionine gamma-lyase)、來源於乳酸乳球菌的半胱胺酸S綴合物β裂解酶(EC 4.4.1.13-cysteine-S-conjugate beta-lyase)、來源於大腸桿菌的D-半胱胺酸脫巰基酶(EC 4.4.1.15-D-cysteine desulfhydrase)、來源於大腸桿菌的硒代半胱胺酸裂解酶(EC 4.4.1.16-selenocysteine lyase)、來源於Ruegeria pomeroyi的L-半胱胺酸硫裂解酶(EC 4.4.1.25-L-cysteate sulfo-lyase)、來源於Methanococcus maripaludis的L-半胱胺酸脫硫化物酶(EC 4.4.1.28-L-cysteine desulfidase)和來源於亞麻薺的L-胱胺酸β裂解酶(EC 4.4.1.35-L-cystine beta-lyase)。在一些實施方案中，所述酶是來自諾氏梭菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶。

在一些實施方案中，所述酶包含選自SEQ ID NO：1-31的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述酶是經修飾的變體。

如本文所用，術語「變體」是指與給定多肽或核酸的胺基酸或核苷酸序列相比具有一定序列相同性的多肽或核酸。

對於本發明，為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的相同性百分比，以最佳比較為目的比對序列(例如在第一個胺基酸或核酸序列中可導入缺口，以與第二個胺基酸或核酸序列進行最佳比對)。然後比較在相應胺基酸位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸。當第一個序列中的位置在第二個序列中相應位置由相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則這些分子在這個位置是相同的。兩個序列之間的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的數量的函數(即相同性百分比=相同位置的數量/位置(即重疊位置)的總數量×100)。優選地，這兩個序列是相同長度的。

本發明所屬領域中具通常知識者知曉，可以使用不同的計算機程序確定兩個序列之間的相同性。

「胺基酸相同性百分比」或者「胺基酸序列相同性百分比」是指比較兩個多肽的胺基酸，當最佳比對時，所述兩個多肽具有大約指定的相同胺基酸百分比。例如，「95%的胺基酸相同性」是指比較兩個多肽的胺基酸，當最佳比對時，所述兩個多肽有95%的胺基酸相同。

在一些實施方案中，所述酶包含與選自SEQ ID NO：1-31的胺基酸序列具有至少65%或70%，優選至少75%或80%，更優選至少85%或90%，特別優選至少94%、95%、96%、97%、98%或99%，最優選至少99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%的序列相同性的胺基酸序列，所述酶具有催化式I的反應的活性。

在一些實施方案，所述酶的胺基酸序列與選自SEQ ID NO：1-31的胺基酸序列的區別在於，具有一或多個胺基酸的取代、刪除、插入和/或添加，所述酶具有催化式I的反應的活性。在一些實施方案中，所述酶的胺基酸序列與選自SEQ ID NO：1-31的胺基酸序列相比，具有一或多個胺基酸的保守取代，所述酶具有催化式I的反應的活性。在一些實施方案中，所述酶的胺基酸序列與選自SEQ ID NO：1-31的胺基酸序列相比，具有一或多個胺基酸的插入或刪除，所述酶具有催化式I的反應的活性。

術語「保守取代」也稱為由「同源」胺基酸殘基取代，是指其中胺基酸殘基由具有相似側鏈的胺基酸殘基置換的取代，例如，鹼性側鏈的胺基酸(例如賴胺酸、精胺酸和組胺酸)、酸性側鏈的胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、非荷電極性側鏈胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支的側鏈胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香側鏈胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。

保守胺基酸取代通常對所得蛋白質的活性的影響最小。這種取代在下文描述。保守取代是用大小、疏水性、電荷、極性、空間特徵、芳香性等相似的胺基酸置換一個胺基酸。當希望精細調節蛋白質的特性時，這種取代通常是保守的。

如本文所用，「同源」胺基酸殘基是指具有相似化學性質的胺基酸殘基，所述化學性質涉及疏水性、電荷、極性、空間特徵、芳香性特徵等。彼此同源的胺基酸的例子包括正電荷的賴胺酸、精胺酸、組胺酸，負電荷的麩胺酸、天冬胺酸，疏水性的甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸，極性的絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸，芳香性的苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸，化學相似側鏈基團的絲胺酸與蘇胺酸，或者麩醯胺酸和天冬醯胺酸，或者白胺酸和異白胺酸。

蛋白質中胺基酸保守取代的例子包括：Ser取代Ala，Lys取代Arg，Gln或His取代Asn，Glu取代Asp，Ser取代Cys，Asn取代Gln，Asp取代Glu，Pro取代Gly，Asn或Gln取代His，Leu或Val取代Ile，Ile或Val取代Leu，Arg或Gln取代Lys，Leu或Ile取代Met，Met、Leu或Tyr取代Phe，Thr取代Ser，Ser取代Thr，Tyr取代Trp，Trp或Phe取代Tyr，及Ile或Leu取代Val。

三、製備條件

本發明的酶可以以分離的多肽的形式提供。

在一些實施方案中，所述方法是無細胞方法，即步驟a)中的反應介質包含分離的酶。所述酶可以是重組產生的或合成的。在一些實施方案中，所述反應介質是水性介質，優選水性緩衝液，例如磷酸鹽緩衝液，如PBS。

在一些實施方案中，步驟a)中的所述反應介質包含表達所述酶的宿主細胞。在一些實施方案中，本發明的方法還包括培養所述宿主細胞的步驟。在一些實施方案中，所述反應介質包含培養所述宿主細胞的培養基。在一些實施方案中，所述反應介質是水性介質，優選水性緩衝液，例如磷酸鹽緩衝液，如PBS。

在一些實施方案中，所述宿主細胞包含編碼所述酶的表達載體。在一些實施方案中，所述宿主細胞是大腸桿菌，例如，大腸桿菌BL21(DE3)。在一些實施方案中，所述載體是原核表達載體，如pET-29b(+)。

在一些實施方案中，所述反應介質的pH為約5-約8，優選約6-約7.8，例如7.5。

實施例

通過以下實施例，本發明所屬領域中具通常知識者會更清楚地理解本發明。應理解，實施例只是用於說明，而非限制本發明的範圍。

實施例1、材料和方法

如無特別說明，本發明中使用的實驗方法均為常規方法，基因選殖操作具體可參見前述Sambrook et al.,1989。

i)試劑：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自碧雲天生物技術有限公司，L-高絲胺酸購自江蘇艾康生物醫藥研發有限公司，甲基次膦酸丁酯為根據專利CN106674275B報道的方法公司內部合成，L-草銨膦、磷酸吡哆醛(PLP)、乙腈購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，曲拉通-X100購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

ii)載體和菌株：- 實施例中所使用的表達載體為pET-29b(+)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；- 實施例中所使用的宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)，購自天根生化科技(北京)有限公司。

iii)基因選殖：將編碼表1中各酶的核酸序列提交至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，獲得含有編碼各酶的核酸序列的pET29b(+)表達載體。

iv)重組宿主細胞製備將各表達載體分別轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，塗布於LB瓊脂培養基(含有50mg/L的卡那黴素)，37℃溫育過夜，然後挑取單菌落至LB液體培養基(含有50mg/L的卡那黴素)中培養，測序驗證合成序列的正確性。經驗證的選殖於-80℃保藏用於後續實驗。

v)蛋白質表達及全細胞催化劑的製備：在LB瓊脂培養基上將保藏的選殖活化。然後，將單菌落接種至LB液體培養基(含有50mg/L的卡那黴素)中，37℃震盪溫育12h。將400μL培養物轉接至20mL新鮮的LB液體培養基(含有50mg/L的卡那黴素)中，37℃震盪溫育至OD600達到約0.6，加入IPTG(終濃度為0.4mM)在25℃溫育16h以誘導蛋白質表達。溫育後，將培養物以4,000g在4℃離心10min，棄上清，收集大腸桿菌細胞。將收集的大腸桿菌細胞重懸於預冷的15mL pH 7.0的50mM PBS中，得到含有重組酶的大腸桿菌懸浮液，作為全細胞催化劑。

vi)酶的製備取v)製備的7.5mL的大腸桿菌懸浮液，在4℃超聲破碎大腸桿菌細胞。細胞破碎液以6,000g在4℃離心15min去除沉澱，得到的上清為含重組酶的粗酶液，將粗酶液用AKTA蛋白純化系統進行純化，獲得經純化的酶。

vii)經純化的酶催化反應向L-高絲胺酸的Tris(20mM)溶液中加入甲基次膦酸丁酯、PLP，並用鹽酸調節溶液pH值至7.4，溶液中L-高絲胺酸的終濃度為84mM，甲基次膦酸丁酯的終濃度為168mM，而PLP的終濃度為0.3mM。向上述溶液加入如vi)中是製備的經純化的酶，終濃度為0.5mg/mL。在37℃，於振盪器上持續震盪(220rpm)12小時，取樣並用6N HCl於100℃金屬浴加熱水解2小時，水解後調節pH值至7.0，用LC-MS檢測水解後的樣品和加入1mM的L-草銨膦作為內標的樣品，在正模式下提取分子量為182的峰，以此判斷L-草銨膦的生成情況。

viii)全細胞催化反應向L-高絲胺酸的Tris(20mM)溶液，中加入甲基次膦酸丁酯、PLP、曲拉通X-100，並用鹽酸調節溶液pH值至7.4，溶液中L-高絲胺酸的終濃度為84mM，甲基次膦酸丁酯的終濃度為168mM，PLP的終濃度為0.3mM，而曲拉通X-100的終濃度為0.2%。向上述溶液分別加入如v)中描述的方法製備的全細胞，全細胞的終濃度為30 OD₆₀₀。在37℃，於振盪器上持續震盪(220rpm)12小時，取樣並用6N HCl於100℃金屬浴加熱水解2小時，水解後調節pH值至7.0，用LC-MS檢測水解後的樣品和加入1mM的L-草銨膦作為內標的樣品，在正模式下提取分子量為182的峰，以此判斷L-草銨膦的生成情況。

實施例2、製備和檢測來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的MetY(GsMetY)

活化表達GsMetY(SEQ ID NO：5)的選殖，根據實施例1的方法製備經純化的酶，並檢測經純化的酶催化產生的L-草銨膦。經LC-MS檢測，GsMetY催化的反應產物樣品中提取到了分子量為182的峰(參見圖1A)；加入1mM L-草銨膦內標的樣品中也僅提取到一個分子量為182的峰並且該峰的峰高增大了(參見圖1B)，說明反應產物樣品中包含L-草銨膦，即GsMetY純酶催化產生了L-草銨膦。

實施例3、製備和檢測表達GsMetY的全細胞

活化表達GsMetY(SEQ ID NO：5)的選殖，根據實施例1的方法製備全細胞，並檢測全細胞催化產生的L-草銨膦。經LC-MS檢測，表達GsMetY的全細胞催化的反應產物樣品中提取到了分子量為182的峰(參見圖2A)，加入1mM L-草銨膦內標的樣品中沒有檢測到新的峰，並且保留時間為1.8min附近的峰的峰高和面積增大了(參見圖2B)，說明反應產物樣品中包含L-草銨膦，即表達GsMetY的全細胞催化產生了L-草銨膦。

實施例4、製備和檢測表達來自暗產色鏈黴菌的CGL(SpCGL)的全細胞

活化表達SpCGL(SEQ ID NO：20)的選殖，根據實施例1的方法製備全細胞，並檢測全細胞催化產生的L-草銨膦。經LC-MS檢測，表達SpCGL的全細胞催化的反應產物樣品中提取到了分子量為182的峰(參見圖3A)，加入1mM L-草銨膦內標的樣品中沒有檢測到新的峰，並且保留時間為1.8min附近的峰的峰高和面積增大了(參見圖3B)，說明反應產物樣品中包含L-草銨膦，即表達SpCGL的全細胞催化產生了L-草銨膦。

實施例5、用表達外源酶的大腸桿菌細胞生產L-草銨膦

本實施例的目的在於確定表達外源酶的大腸桿菌細胞是否能夠催化L-高絲胺酸轉化為L-草銨膦。

如實施例1所述，製備表達表1中各酶的重組大腸桿菌細胞，並檢測全細胞催化產生的L-草銨膦。

如表2所示，表達SEQ ID NO：1-31的酶中的任一種的重組大腸桿菌細胞能夠催化L-高絲胺酸轉化為L-草銨膦，其中酶催化能力以★表示，★越多，表示催化能力越強。

[序列表]

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2

SEQ ID NO：3

SEQ ID NO：4

SEQ ID NO：5

SEQ ID NO：6

SEQ ID NO：7

SEQ ID NO：8

SEQ ID NO：9

SEQ ID NO：10

SEQ ID NO：11

SEQ ID NO：12

SEQ ID NO：13

SEQ ID NO：14

SEQ ID NO：15

SEQ ID NO：16

SEQ ID NO：17

SEQ ID NO：18

SEQ ID NO：19

SEQ ID NO：20

SEQ ID NO：21

SEQ ID NO：22

SEQ ID NO：23

SEQ ID NO：24

SEQ ID NO：25

SEQ ID NO：26

SEQ ID NO：27

SEQ ID NO：28

SEQ ID NO：29

SEQ ID NO：30

SEQ ID NO：31

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Claims

一種製備L-草銨膦的方法，包括以下步驟： a) 提供反應介質，其包含L-高絲胺酸或其鹽、酯或醯胺，甲基次膦酸或其鹽或酯和酶，所述酶選自半胱胺酸合酶（EC 2.5.1.47）、胱硫醚γ合酶（EC 2.5.1.48）、O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶（EC 2.5.1.49）、β吡唑醯丙胺酸合酶（EC 2.5.1.51）、L-含羞草素合酶（EC 2.5.1.52）、O-磷酸絲胺酸硫化氫解酶（EC 2.5.1.65）、半胱胺酸合酶（EC 2.5.1.76）、[CysO硫載體蛋白]-硫酯依賴性半胱胺酸合酶（EC 2.5.1.113）、胱硫醚β合酶（EC 2.5.1.134）、N-(2-胺基-2-羧基乙基)-L-麩胺酸合酶（EC 2.5.1.140）、S-硫-L-半胱胺酸合酶（EC 2.5.1.144）、二胺基丙酸氨裂解酶（EC 4.3.1.15）、L-絲胺酸氨裂解酶（EC 4.3.1.17）、D-絲胺酸氨裂解酶（EC 4.3.1.18）、蘇胺酸氨裂解酶（EC 4.3.1.19）、胱硫醚γ裂解酶（EC 4.4.1.1）、高半胱胺酸脫巰基酶（EC 4.4.1.2）、L-3-氰基丙胺酸合酶（EC 4.4.1.9）、半胱胺酸裂解酶（EC 4.4.1.10）、甲硫胺酸γ裂解酶（EC 4.4.1.11）、半胱胺酸S綴合物β裂解酶（EC 4.4.1.13）、D-半胱胺酸脫巰基酶（EC 4.4.1.15）、硒代半胱胺酸裂解酶（EC 4.4.1.16）、L-半胱胺酸硫裂解酶（EC 4.4.1.25）、L-半胱胺酸脫硫化物酶（EC 4.4.1.28）和L-胱胺酸β裂解酶（EC 4.4.1.35）中的一種；和 b) 溫育所述反應介質以產生包含L-草銨膦或其膦酸酯的反應產物其中所述方法不包括產生O-醯基-L-高絲胺酸的步驟，且所述方法不使用O-醯基-L-高絲胺酸。
如請求項1的方法，還包括c)從所述反應產物回收L-草銨膦或其膦酸酯。
如請求項1或2的方法，其中所述反應介質還包含磷酸吡哆醛或其鹽。
如請求項1或2的方法，其中所述酶來源於選自 Thermus thermophiles、球形賴胺酸芽孢桿菌( Lysinibacillus sphaericus)、艱難梭菌( Clostridioides difficile)、諾氏梭菌( Clostridium novyi)、嗜熱脂肪地芽孢桿菌( Geobacillus stearothermophilus)、海棲熱胞菌( Thermotoga maritima)、綠膿假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa)、獨島不動滑菌( Nonlabens dokdonensis)、銀合歡( Leucaena leucocephala)、 Aeropyrum pernix、 Methanosarcina acetivorans、結核分支桿菌( Mycobacterium tuberculosis)、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、螢光假單胞菌( Pseudomonas fluorescens)、大腸桿菌( Escherichia coli)、麥芽糖假絲酵母( Candida maltosa)、暗產色鏈黴菌( Streptomyces phaeochromogenes)、粗糙脈孢菌( Neurospora crassa)、菠菜( Spinacia oleracea)、 Cyanobacteria bacterium、惡臭假單胞菌( Pseudomonas putida)、乳酸乳球菌( Lactococcus lactis)、 Ruegeria pomeroyi、 Methanococcus maripaludis和亞麻薺( Camelina sativa)的生物體。
如請求項1或2的方法，其中所述酶選自來源於 Thermus thermophiles的半胱胺酸合酶、來源於球形賴胺酸芽孢桿菌的胱硫醚γ合酶、來源於艱難梭菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於諾氏梭菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於嗜熱脂肪地芽孢桿菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於海棲熱胞菌的O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於綠膿假單胞菌O-乙醯高絲胺酸胺基羧基丙基轉移酶、來源於獨島不動滑菌的β吡唑醯丙胺酸合酶、來源於銀合歡的L-含羞草素合酶、來源於 Aeropyrum pernix的O-磷酸絲胺酸硫化氫解酶、來源於 Methanosarcina acetivorans的半胱胺酸合酶、來源於結核分支桿菌的[CysO硫載體蛋白]-硫酯依賴性半胱胺酸合酶、來源於枯草芽孢桿菌的胱硫醚β合酶、來源於金黃色葡萄球菌的N-(2-胺基-2-羧基乙基)-L-麩胺酸合酶、來源於螢光假單胞菌的S-硫-L-半胱胺酸合酶、來源於大腸桿菌的二胺基丙酸氨裂解酶、來源於大腸桿菌的L-絲胺酸氨裂解酶、來源於大腸桿菌的D-絲胺酸氨裂解酶、來源於麥芽糖假絲酵母的蘇胺酸氨裂解酶、來源於暗產色鏈黴菌的胱硫醚γ裂解酶、來源於粗糙脈孢菌的胱硫醚γ裂解酶、來源於枯草芽孢桿菌的高半胱胺酸脫巰基酶、來源於菠菜的L-3-氰基丙胺酸合酶、來源於 Cyanobacteria bacterium的半胱胺酸裂解酶、來源於惡臭假單胞菌的甲硫胺酸γ裂解酶、來源於乳酸乳球菌的半胱胺酸S綴合物β裂解酶、來源於大腸桿菌的D-半胱胺酸脫巰基酶、來源於大腸桿菌的硒代半胱胺酸裂解酶、來源於 Ruegeria pomeroyi的L-半胱胺酸硫裂解酶、來源於 Methanococcus maripaludis的L-半胱胺酸脫硫化物酶和來源於亞麻薺的L-胱胺酸β裂解酶。
如請求項1或2的方法，其中所述酶包含選自SEQ ID NO: 1-31的胺基酸序列。
如請求項1或2的方法，其中所述方法是無細胞方法。
如請求項1或2的方法，其中步驟a)中的所述反應介質包含表達所述酶的宿主細胞。
如請求項8的方法，其還包括培養所述宿主細胞的步驟。
如請求項1或2的方法，其中在步驟b)中，在30-40°C溫育所述反應介質。
如請求項1或2的方法，其中在步驟b)中，在32-39°C溫育所述反應介質。
如請求項1或2的方法，其中在步驟b)中，在34-38°C溫育所述反應介質。
如請求項1或2的方法，其中在步驟b)中，在36-38°C溫育所述反應介質。
如請求項1或2的方法，其中在步驟b)中，在37°C溫育所述反應介質。