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TWI897189B - 具有經改變重鏈基因座之嵌合基因轉殖免疫球蛋白小鼠及其製造及使用方法 - Google Patents

具有經改變重鏈基因座之嵌合基因轉殖免疫球蛋白小鼠及其製造及使用方法

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TWI897189B
TWI897189B TW113101004A TW113101004A TWI897189B TW I897189 B TWI897189 B TW I897189B TW 113101004 A TW113101004 A TW 113101004A TW 113101004 A TW113101004 A TW 113101004A TW I897189 B TWI897189 B TW I897189B
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TW
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human
heavy chain
chimeric
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TW113101004A
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TW202430028A (zh
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丹尼爾 羅爾
彼德 布萊姆斯
Original Assignee
美商基利科學股份有限公司
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Publication date
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Abstract

提供嵌合基因轉殖免疫球蛋白(Ig)小鼠，其包含經改變重鏈基因座，其中內源性小鼠D及J區段已經刪除，且在該位置插入人類重鏈Ig轉殖基因，使得基因轉殖Ig小鼠表現在重鏈中利用人類VH及小鼠VH之抗體組庫，各VH係連接至人類DH及JH區段，導致多樣性增強。亦提供製備及使用基因轉殖動物（例如，以產生抗體）之方法。

Description

具有經改變重鏈基因座之嵌合基因轉殖免疫球蛋白小鼠及其製造及使用方法
免疫療法已革新各式各樣的疾病之治療，包括癌症及自體免疫疾病。免疫療法之關鍵組分係針對所關注抗原產生具有所欲結合特徵之治療性抗體的能力。所屬技術領域已建立各式各樣的方法用於產生此類抗體，該等方法係在發現用於製造單株抗體(mAb)之原始B細胞融合瘤技術後開發的(關於綜述，參見例如Lu et al.(2018)J.Biomed.Sci.27：1)。最初，藉由將人類恆定區重組換為小鼠恆定區，使小鼠mAb變得更像人類(human-like)，藉以產生嵌合抗體。替代地，將小鼠(或其他非人類)mAb衍生之CDR序列移植至人類抗體構架中，藉以產生較嵌合抗體具有更多人類衍生序列之人源化抗體。隨後，能夠使用所屬技術領域中現已建立的兩種不同一般方法中之任一者產生完全人類治療性抗體：在體外篩選多樣的人類抗體庫，例如在諸如噬菌體之展示包裝上表現之庫；及在攜帶基因轉殖Ig序列(例如人類Ig序列)之動物中產生抗體。
所屬技術領域中產生之初始人類抗體基因轉殖小鼠將完全人類轉殖基因(人類可變區及恆定區)整合至小鼠基因體中，同時使內源性小鼠Ig基因座失效，使得在動物體內不產生小鼠抗體(參見例如美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；及第5,770,429號；皆屬於Lonberg及Kay；及美國專利第5,939,598號；第6,075,181號；第6,114,598號；第6,150,584號及第6,162,963號，皆屬於Kucherlapati等人)。
亦已描述基因轉殖小鼠，其僅攜帶與內源性小鼠恆定區可操作地連接之人類可變區轉殖基因序列，因而在動物體內產生嵌合抗體(參見例如美國專利第6,596,541號；美國專利第10,584,364號；及美國專利公開案第2016/0316731號)。使用相較於完全人類轉殖基因時保留較多天然內源性Ig基因座架構及信號傳導功能的小鼠恆定區，可能產生使用人類恆定區無法形成之抗體，藉以提供不同的抗體組庫(repertoire)以用於測試對所關注抗原之反應性。接著，可將在小鼠體內產生之嵌合抗體逆向工程改造為完全人類的。
所屬技術領域中已描述用於在Ig基因轉殖小鼠中達到不同抗體組庫多樣性之額外方法。例如，一種方法涉及在重鏈轉殖基因中使用長重鏈CDR3序列，其可產生額外的HCDR3多樣性(參見例如美國專利第10,640,574號；美國專利第10,562,980號；美國專利第10,259,863號；美國專利第10,259,863號；美國專利第9,504,236號；及美國專利公開案第2020/0181241號)。另一種方法涉及使用固定輕鏈轉殖基因序列，其可允許識別與使用輕鏈之完整組庫所獲得者不同的重鏈配對(參見例如美國專利第10,412,940號；及美國專利公開案第2020/0024368號)。
雖然已取得一些進展，但仍需要額外方法及組成物用於製備表現基因轉殖Ig序列之動物，以產生治療性抗體，特別是產生抗體組庫多樣性增加之宿主者。
本揭露係關於具有嵌合免疫球蛋白(Ig)重鏈基因座之基因轉殖小鼠及其製造方法。本揭露提供在小鼠細胞中製備嵌合Ig重鏈基因座之方法、以及藉由該方法產生之基因轉殖小鼠，其中內源性小鼠重鏈基因座之Adam6b基因下游及IgM區段上游之D及J區段經刪除，且在該位置插入包含複數個人類V、D、及J區段之人類重鏈可變區轉殖基因。在一些實施例中，所揭示之方法透過在經改變重鏈基因座之hVH-D-J重組或mVH-D-J重組，產生表現抗體組庫之基因轉殖小鼠，該抗體組庫在所得重鏈中利用人類VH區段及小鼠VH區段。因此，在一些實施例中，相較於藉由未經改變之內源性小鼠HC基因座或單獨的人源化VDJ基因座(亦即具有活性人類VH區段及去活化小鼠VH區段之基因座)所產生者，本揭露之基因轉殖小鼠(在本文中稱為攜帶Supra等位基因之Supra-多樣性小鼠)提供用於產生較大多樣性的VH序列之工具。
因此，在一個態樣中，本揭露係關於一種在小鼠細胞中製備嵌合免疫球蛋白重鏈基因座之方法，該方法包含：(a)刪除內源性小鼠免疫球蛋白(Ig)重鏈基因座中Adam6b下游及IgM上游之小鼠D區段及J區段；及(b)將人類重鏈可變區轉殖基因引入Adam6b下游及IgM上游之該內源性小鼠Ig重鏈基因座中，其中該轉殖基因包含複數個未經重排人類可變區段 (VH)、複數個人類D區段(DH)、及複數個人類J區段(JH)，藉以在該小鼠細胞中製備嵌合Ig重鏈基因座，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含小鼠VH區段及人類VH區段之抗體組庫(repertoire)，各VH區段係連接至人類DH及JH區段。
在一實施例中，使用CRISPR-Cas9介導之剔除/敲入技術同時進行步驟(a)及(b)。在另一實施例中，藉由CRISPR-Cas9介導之基因編輯刪除小鼠D區段及小鼠J區段(亦即該方法之步驟(a))，且藉由Cre-Lox介導之重組將人類重鏈可變區轉殖基因引入小鼠Ig重鏈基因座中(亦即該方法之步驟(b))。
在一實施例中，細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC)上攜帶人類重鏈可變區轉殖基因。
在實施例中，包含嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含至少二十、至少三十、或至少四十個不同人類VH區段之抗體組庫。在一實施例中，包含嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含人類VH區段3-74、3-73、3-72、2-70、1-69、3-66、3-64、4-61、4-59、1-58、3-53、5-51、3-49、3-48、1-46、1-45、3-43、4-39、4-34、3-33、4-31、3-30、4-28、2-26、1-24、3-23、3-21、3-20、1-18、3-15、3-13、3-11、3-9、1-8、3-7、2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、及6-1之抗體組庫。
在一實施例中，包含嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含至少100個不同小鼠VH區段之抗體組庫。
在一實施例中，包含嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含至少十五個不同人類DH區段之抗體組庫。在一實施例中，包含嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含至少二十六個不同人類DH區段之抗體組庫。
在一實施例中，包含嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含六個不同人類JH區段之抗體組庫。
在另一態樣中，本揭露係關於一種基因轉殖小鼠細胞，例如根據本揭露之方法製備之基因轉殖小鼠細胞。在一個實施例中，本揭露提供一種基因轉殖小鼠細胞，其包含嵌合免疫球蛋白(Ig)重鏈基因座，其中該嵌合Ig重鏈基因座：(a)缺乏內源性Adam6b序列下游及內源性IgM恆定序列上游之小鼠D區段及J區段；及(b)在內源性Adam6b序列下游及內源性IgM序列上游包含人類重鏈可變區轉殖基因，其中該轉殖基因包含複數個未經重排人類可變區段(VH)、複數個人類D區段(DH)、及複數個人類J區段(JH)，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之該基因轉殖小鼠細胞表現包含小鼠VH區段及人類VH區段之抗體組庫，各VH區段係連接至人類DH及JH區段。
在另一態樣中，本揭露係關於一種基因轉殖小鼠，例如由本揭露之基因轉殖小鼠細胞製備之基因轉殖小鼠。在一個實施例中，本揭露提供一種基因轉殖小鼠，其包含嵌合免疫球蛋白(Ig)重鏈基因座，其中該嵌合Ig重鏈基因座：(a)缺乏內源性Adam6b序列下游及內源性IgM恆定序列上游之小鼠D區段及J區段；及(b)在內源性Adam6b序列下游及內源性IgM序列上游包含人類重鏈可變區轉殖基因，其中該轉殖基因包含複數個未經重排人類可變區段(VH)、複數個人類D區段(DH)、及複數個人類J區段(JH)， 其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之該基因轉殖小鼠表現包含小鼠VH區段及人類VH區段之抗體組庫，各VH區段係連接至人類DH及JH區段。
在一實施例中，基因轉殖小鼠進一步包含編碼人類免疫球蛋白輕鏈之轉殖基因構築體，使得小鼠表現包含與小鼠或人類C-κ恆定區可操作地連接之人類免疫球蛋白輕鏈可變域的抗體。
在又另一實施例中，如本文所述，本揭露之嵌合免疫球蛋白重鏈基因座可作為透過刪除內源性小鼠VH區段建立全多樣性人類VH區段基因座的起始點。
在另一態樣中，本揭露係關於一種產生針對所關注抗原之抗體的方法，該方法包含向本揭露之基因轉殖小鼠投予該所關注抗原，從而產生與該所關注抗原結合之抗體。在一實施例中，該方法進一步包含自小鼠單離出所關注抗體。在一實施例中，該方法進一步包含自小鼠單離出編碼所關注抗體之核酸、及用人類恆定區序列置換核酸內之小鼠恆定區序列。
〔圖1〕係用於將人類重鏈轉殖基因構築體插入內源性小鼠Ig基因座中之一步驟程序的示意圖。
〔圖2A〕至〔圖2D〕顯示繪示Supra等位基因如何支持完全人類VDJ及嵌合VDJ重組兩者之示意圖(圖2A)、及顯示攜帶Supra等位基因之基因轉殖小鼠在初始(naïve)脾臟細胞(圖2B)、經Covid棘蛋白免疫之脾臟細 胞(圖2C)、及來自經目標X免疫之淋巴結之單一B細胞(圖2D)中小鼠VH相對於人類VH之使用的圖，如藉由次世代定序(NGS)所判定。
〔圖3〕係彙總Supra等位基因基因轉殖小鼠中之hVH、D、及J區段使用的示意圖。
〔圖4〕係彙總Supra等位基因基因轉殖小鼠中之mVH、hVH、D、及J區段使用的示意圖。
〔圖5〕係本揭露之人類Ig重鏈轉殖基因之代表性載體構築體的示意圖。
〔圖6〕係用於將Supra等位基因轉換成全多樣性人類VH區段轉殖基因之代表性方法的示意圖。
相關申請案之交互參照
本申請案依據35 U.S.C.§ 119(e)主張2023年1月18日申請之美國臨時專利申請案第63/439,801號之權益，其全文出於所有目的特此以引用方式併入本文中。
序列表
本申請案含有以.XML檔案格式電子提交之序列表，且其全文特此以引用方式併入本文中。該.XML副本(建立於2023年12月19日)係命名為ZL8018-WO-PCT_SL.xml，且檔案大小為153,150位元組。
本文所述之嵌合Ig重鏈基因座允許透過在經改變重鏈基因座之hVH-D-J重組或mVH-D-J重組來表現抗體組庫，該抗體組庫在所得重鏈中利用 人類VH區段及小鼠VH區段，如圖2A中所示意性地繪示。所得嵌合抗體以其嵌合形式可能非常適用於試劑及/或診斷用途。此外，可使用如本文所述之標準方法將嵌合抗體轉換成完全人類抗體，使其具有用於療法之潛在用途。再者，在另一實施例中，嵌合Ig重鏈基因座可作為透過切除內源性小鼠VH區段建立僅包含人類VH、DH、及JH可變區段之Ig重鏈基因座的起始點。
以下進一步詳細描述本揭露之各種態樣。除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術用語、符號、及其他科學用語意欲具有本揭露所屬技術領域中具有通常知識者普遍理解的含義。在一些情況下，為了清楚起見及/或便於參考，本文中定義具有普遍理解的含義之用語，且本文中包括此類定義不一定應被解讀為代表與所屬技術領域所通常理解者的差異。本文所描述或引用之技術及程序通常係所屬技術領域中具有通常知識者充分理解的且常使用習知方法採用，諸如例如下列中所述之廣泛使用的分子選殖方法：Sambrook el al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual 4th ed.(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY。若適當，除非另有說明，否則涉及使用市售套組及試劑之程序通常係根據製造商定義之規程及/或參數進行。
I. Supra-多樣性方法
圖1中示意性地繪示用於產生經修飾內源性Ig基因座之方法之一實施例，其使用人類或小鼠V區段產生重鏈。該方法涉及在內源性重鏈基因座之同時雙重修飾：(i)移除(刪除、切除、剔除)Adam6b基因下游及小鼠IgM恆定區區段上游之內源性小鼠D及J區段(在本文中亦稱為mDH及mJH)的修飾；及(ii)在刪除mDH及mJH之位點插入(敲入、換入(swap in))包含人類V、D、 及J區段(在本文中亦稱為hVH、hDH、及hJH)之人類Ig重鏈可變區轉殖基因的修飾。替代地，兩種修飾可如本文所述在兩個單獨的步驟中執行。如圖2A中所繪示，所得嵌合重鏈基因座能夠進行mVH-hDH-hJH及hVH-hDH-hJH重組兩者，藉以產生併入小鼠VH區段或人類VH區段之重鏈。
因此，在一個態樣中，本揭露係關於一種在小鼠細胞中製備嵌合免疫球蛋白重鏈基因座之方法，該方法包含：(a)刪除內源性小鼠免疫球蛋白(Ig)重鏈基因座中Adam6b下游(亦即3’)及IgM上游(亦即5’)之小鼠D區段及J區段；及(b)將人類重鏈可變區轉殖基因引入Adam6b下游(亦即3’)及IgM上游(亦即5’)之內源性小鼠Ig重鏈基因座中，其中轉殖基因包含複數個未經重排人類可變區段(VH)、複數個人類D區段(DH)、及複數個人類J區段(JH)，藉以在小鼠細胞中製備嵌合Ig重鏈基因座，其中包含嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含小鼠VH區段之抗體組庫及包含人類VH區段之抗體，各VH區段係連接至人類DH及JH區段。
在一個實施例中，例如使用CRISPR-Cas9介導之剔除/敲入技術同時進行步驟(a)及(b)。在另一實施例中，藉由CRISPR-Cas9介導之基因編輯刪除小鼠D區段及小鼠J區段(亦即步驟(a))，且藉由Cre-Lox介導之重組將人類重鏈可變區轉殖基因引入小鼠Ig重鏈基因座中(亦即步驟(b))。此等重組技術在所屬技術領域中已充分建立，且可使用標準方法應用於Ig基因座。在以下第III節及實例1中進一步詳細描述使用重組方法產生本揭露之Supra等位基因。
本揭露之Supra-多樣性小鼠產生抗體組庫，該抗體組庫包含使用小鼠VH或人類VH之重鏈，如圖4中所示意性地繪示並在實例2中詳細描述。 對小鼠中表現之抗體mRNA之分析顯示，包括在轉殖基因中之基本上所有人類VH、DH、及JH區段皆用於抗體組庫中。在以下第II節中進一步詳細描述人類Ig重鏈可變區轉殖基因之結構及構築。此外，mRNA分析顯示超過100個內源性小鼠VH區段係用於抗體組庫中。因此，在一實施例中，本揭露之基因轉殖小鼠包含嵌合Ig重鏈基因座，其表現包含至少100個不同小鼠VH區段之抗體組庫。
經修飾內源性重鏈基因座保留ADAM6基因複合物(包括Adam6a及Adam6b)之生殖系(germline)位置、構形、及序列。已證實此等基因係小鼠雄性生育力所需的，因此相較於所屬技術領域已知的自Ig基因座刪除ADAM6基因、接著將其重新插入小鼠基因體別處之基因轉殖方法(例如，如PCT公開案WO 2013/079953中所述)，在Ig基因座內保留ADAM6基因之初始結構係Supra等位基因的有益特徵，其可提供較佳的生育力。
ADAM6基因複合物包括嵌入其中的兩個小鼠DH區段1-3及3-1(如圖1中所繪示)，與經刪除之內源性小鼠DH區段的其餘部分分開。此等1-3及3-1 mDH區段保持具有功能及活性。因此，Supra等位基因亦能夠產生包含mVH-mDH-hJH之嵌合重鏈，作為產生多樣性的進一步手段。然而，應注意的是，由於mDH區段之長度短，且其等與Supra等位基因中存在的人類DH同源物之高度同源性，因此確實地確定ADAM6複合物內mDH區段之使用可能具有挑戰性。
在另一實施例中，Supra等位基因作為透過切除(刪除、剔除)內源性小鼠VH區段建立僅利用人類VH、DH、及JH可變區段之Ig重鏈基因座的起始點，同時仍保留ADAM6基因複合物(包括Adam6a及Adam6b)之生殖系 位置、構形、及序列。如圖6中所示意性地繪示，可藉由標準重組(例如，使用CRISPR/Cas9介導之重組或所屬技術領域中可用的其他合適的重組技術)刪除Supra等位基因之內源性小鼠VH區段，藉以產生含有人類VH區段之全多樣性、但缺乏內源性小鼠VH區段的Ig重鏈基因座，使得攜帶該Ig重鏈基因座之基因轉殖小鼠表現包含人類VH區段之全多樣性、且缺乏小鼠VH區段的抗體組庫。因此，在一實施例中，小鼠VH區段係藉由標準重組方法自本揭露之Supra等位基因刪除，以建立僅含有人類VH區段之Ig重鏈基因座。
在另一態樣中，本揭露提供一種在小鼠細胞中製備免疫球蛋白(Ig)重鏈基因座之方法，其中Supra等位基因係中間物，該方法包含：(a)刪除內源性小鼠免疫球蛋白(Ig)重鏈基因座中Adam6b下游(亦即3’)及IgM上游(亦即5’)之小鼠D區段及J區段；(b)將人類重鏈可變區轉殖基因引入Adam6b下游(亦即3’)及IgM上游(亦即5’)之內源性小鼠Ig重鏈基因座中，其中轉殖基因包含複數個未經重排人類可變區段(VH)、複數個人類D區段(DH)、及複數個人類J區段(JH)，藉以製備嵌合Ig重鏈基因座；及(c)刪除小鼠細胞中Adam6a上游(亦即5’)之小鼠V區段，其中包含該Ig重鏈基因座之小鼠表現包含人類VH區段(各連接至人類DH及JH區段)、且缺乏小鼠VH區段之抗體組庫。如圖6中所繪示，該方法允許引入人類VH區段之全多樣性，同時仍保留ADAM6基因複合物(包括Adam6a及Adam6b)之生殖系位置、構形、及序列。
II.重鏈轉殖基因構築體製備
本揭露之轉殖基因構築體可使用標準重組DNA技術製備。含有多連接子之選殖載體可用作用於插入所關注DNA片段之起始載體。合適的選殖載體在所屬技術領域中已充分建立。此外，所屬技術領域中已描述攜帶人類未經重排重鏈免疫球蛋白序列之質體或其他載體(例如YAC及BAC)(參見例如美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；及第5,770,429號；皆屬於Lonberg及Kay；及美國專利第5,939,598號；第6,075,181號；第6,114,598號；第6,150,584號及第6,162,963號，皆屬於Kucherlapati等人)，且可用作重鏈V、D、及J區序列之來源。此外，所屬技術領域中建立之資料庫揭示人類重鏈V、D、及J序列。在一實施例中，所欲序列可藉由標準方法合成或藉由標準重組DNA方法獲得。接著，透過連接將適當的DNA片段可操作地連接至選殖載體中，接著表徵載體(例如，藉由限制性片段分析或定序或類似者)以確保片段之正確排列。
在一實施例中，本揭露之嵌合Ig重鏈基因座包含超過二十個不同人類VH區段(例如，攜帶嵌合Ig基因座之基因轉殖小鼠表現包含至少二十個不同人類VH區段之抗體組庫)。在另一實施例中，本揭露之嵌合Ig重鏈基因座包含超過三十個不同人類VH區段(例如，攜帶嵌合Ig基因座之基因轉殖小鼠表現包含至少三十個不同人類VH區段之抗體組庫)。在另一實施例中，本揭露之嵌合Ig重鏈基因座包含超過四十個不同人類VH區段(例如，攜帶嵌合Ig基因座之基因轉殖小鼠表現包含至少四十個不同人類VH區段之抗體組庫)。
在一實施例中，本揭露之嵌合Ig重鏈基因座包含人類VH區段3-74、3-73、3-72、2-70、1-69、3-66、3-64、4-61、4-59、1-58、3-53、5-51、3- 49、3-48、1-46、1-45、3-43、4-39、4-34、3-33、4-31、3-30、4-28、2-26、1-24、3-23、3-21、3-20、1-18、3-15、3-13、3-11、3-9、1-8、3-7、2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、及6-1。例如，轉殖基因可包含人類VH區段3-74*01、3-73*01、3-72*01、2-70*03、1-69*01、3-66*01、3-64*01、4-61*01、4-59*01、1-58*01、3-53*01、5-51*01、3-49*01、3-48*01、1-46*01、1-45*01、3-43*01、4-39*01、4-34*01、3-33*01、4-31*02、3-30*01、4-28*01、2-26*01、1-24*01、3-23*01、3-21*01、3-20*01、1-18*01、3-15*01、3-13*04、3-11*01、3-9*02、1-8*01、3-7*02、2-5*02、7-4-1*02、4-4*05、1-3*02、1-2*01、及6-1*01。
在一實施例中，包含嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含人類VH區段3-74、3-73、3-72、2-70、1-69、3-66、3-64、4-61、4-59、1-58、3-53、5-51、3-49、3-48、1-46、1-45、3-43、4-39、4-34、3-33、4-31、3-30、4-28、2-26、1-24、3-23、3-21、3-20、1-18、3-15、3-13、3-11、3-9、1-8、3-7、2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、及6-1之抗體組庫。例如，本揭露之小鼠可表現包含人類VH區段3-74*01、3-73*01、3-72*01、2-70*03、1-69*01、3-66*01、3-64*01、4-61*01、4-59*01、1-58*01、3-53*01、5-51*01、3-49*01、3-48*01、1-46*01、1-45*01、3-43*01、4-39*01、4-34*01、3-33*01、4-31*02、3-30*01、4-28*01、2-26*01、1-24*01、3-23*01、3-21*01、3-20*01、1-18*01、3-15*01、3-13*04、3-11*01、3-9*02、1-8*01、3-7*02、2-5*02、7-4-1*02、4-4*05、1-3*02、1-2*01、及6-1*01之抗體組庫。
在一實施例中，人類Ig重鏈轉殖基因包含至少十五個不同人類D區段、更佳地至少26個不同人類D區段或迄今已識別之所有27個人類D區段。 在一實施例中，包含嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含至少15個、且更佳地至少26個不同人類D區段之抗體組庫。
在一實施例中，人類Ig重鏈轉殖基因包含六個不同人類J區段，亦即人類J1-J6區段。在一實施例中，包含嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含六個不同JH區段(亦即人類J1-J6)之抗體組庫。
在一實施例中，細菌人工染色體(BAC)上攜帶轉殖基因構築體。用於攜帶Ig轉殖基因之BAC技術在所屬技術領域中已充分建立。
圖5中示意性地繪示本揭露之人類Ig重鏈可變區轉殖基因載體之一非限制性實例。在一實施例中，人類Ig重鏈可變區轉殖基因構築體包含SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列。
轉殖基因構築體之核苷酸序列可針對預期目的進一步最佳化。例如，可改變構築體以進行密碼子最佳化(例如，以增加編碼區之表現)。
轉殖基因構築體可進一步包含允許將轉殖基因靶向插入特定基因座(例如內源性小鼠重鏈基因座)之序列。用經靶向轉殖基因置換內源性基因座之敲入技術在所屬技術領域中已充分建立，且係在以下第III節中進一步描述。在一較佳實施例中，轉殖基因構築體包含重組序列(引導重組序列(Guide Recombination Sequence)或GRS)，使轉殖基因能夠被敲入內源性小鼠重鏈基因座。
為了製備用於轉染、顯微注射、或其他基因轉殖技術之轉殖基因構築體，可藉由用適當的限制酶切割以釋放轉殖基因構築體片段，將轉殖基因構築體自攜帶其的載體中單離出來。片段可使用標準技術單離，諸如藉由在瓊脂糖凝膠上進行脈衝場凝膠電泳，接著諸如藉由β-瓊脂酶消化或藉由電洗 脫(electroelution)自瓊脂糖凝膠中單離出片段。例如，可使用標準方法自凝膠中切下含有轉殖基因構築體片段之瓊脂糖凝膠切片，且可將瓊脂糖用β-瓊脂酶(例如，來自Takara)消化。替代地，用於敲入目的之轉殖基因之製備可藉由標準BAC或質體純化技術進行，單離出閉合環狀形式以用於直接轉染或引入受體小鼠細胞或胚胎中。
III.基因轉殖小鼠之製備
本揭露之另一態樣係關於一種基因轉殖小鼠，其包含根據本揭露之方法製備之嵌合內源性免疫球蛋白重鏈基因座，使得動物表現包含利用人類VH區段之抗體(例如hVH-hDH-hJH-mC抗體)以及使用小鼠VH區段之抗體(例如mVH-hDH-hJH-mC抗體)的免疫組庫。本揭露之基因轉殖小鼠係使用所屬技術領域已知的標準方法製備，以刪除外源性基因體序列且將外源性核酸引入小鼠細胞之基因體中，接著自基因轉殖小鼠細胞製備基因轉殖小鼠。
因此，在一個態樣中，本揭露提供一種基因轉殖小鼠細胞，其包含嵌合免疫球蛋白(Ig)重鏈基因座，其中該嵌合Ig重鏈基因座：(a)缺乏內源性Adam6b序列下游及內源性IgM恆定序列上游之小鼠D區段及J區段；及(b)在內源性Adam6b序列下游及內源性IgM序列上游包含人類重鏈可變區轉殖基因，其中該轉殖基因包含複數個未經重排人類可變區段(VH)、複數個人類D區段(DH)、及複數個人類J區段(JH)，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之該基因轉殖小鼠細胞表現包含小鼠VH區段及人類VH區段之抗體組庫，各VH區段係連接至人類DH及JH區段。
在另一態樣中，本揭露提供一種基因轉殖小鼠，其包含嵌合免疫球蛋白(Ig)重鏈基因座，其中該嵌合Ig重鏈基因座：(a)缺乏內源性Adam6b序列下游及內源性IgM恆定序列上游之小鼠D區段及J區段；及(b)在內源性Adam6b序列下游及內源性IgM序列上游包含人類重鏈可變區轉殖基因，其中該轉殖基因包含複數個未經重排人類可變區段(VH)、複數個人類D區段(DH)、及複數個人類J區段(JH)，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之該基因轉殖小鼠表現包含小鼠VH區段及人類VH區段之抗體組庫，各VH區段係連接至人類DH及JH區段。
在一較佳方法中，本揭露之方法之步驟(a)及(b)係同時進行，以移除內源性小鼠DH及DJ區段並換入人類Ig重鏈轉殖基因，較佳地使用CRISPR/Cas9介導之重組以進行組合的剔除/敲入方法。例如，轉殖基因構築體可包括側翼(flanking)引導重組序列(GRS)，以促進CRISPR/Cas9介導之重組。此等係側接轉殖基因插入物之500至1500bp序列，且與小鼠基因體中鄰接特定CRISPR/Cas9切割位點之內源性小鼠序列具有特定同源性。將相同的CRISPR/CAS切割位點附加至GRS側翼序列之末端允許CRISPR/CAS介導之消化，以同時切割內源性小鼠基因體以及轉殖基因供體(例如環狀BAC載體)。以此方式，小鼠CRISPR/CAS位點之切割末端經由類似地切割及線性化轉殖基因供體插入片段而獲得同源重組介導之修復，產生位點特異性敲入。
替代地，兩種修飾可作為兩個單獨的步驟執行，亦即剔除步驟及敲入步驟。例如，可藉由標準剔除技術，較佳地使用CRISPR-Cas9介導之重組，自內源性小鼠Ig基因座中移除內源性小鼠重鏈D及J區段。接著，可藉由標 準敲入技術，將人類Ig重鏈可變區轉殖基因插入內源性小鼠Ig重鏈基因座中。例如，在一個敲入方法中，loxP側翼位點一般係包括在構築體中，使得此等位點在表現Cre重組酶後促進宿主loxP側翼位點與轉殖基因供體中之loxP側翼位點之間的重組。在小鼠胚胎幹細胞中執行重組，接著將所關注之經修飾胚胎幹細胞植入存活的胚胞中，胚胞接著生長成成熟的嵌合小鼠，其中一些細胞具有原始胚胞細胞遺傳資訊，而其他細胞具有引入胚胎幹細胞之修飾。接著，對嵌合小鼠之後續後代進行基因敲入。敲入技術係彙總於例如Manis(2007)New Engl.J.Med.357：2426-2429中。
使用南方墨點分析、PCR、或其他用於分析基因體DNA之此類技術，以偵測不存在於非基因轉殖動物中、但存在於基因轉殖動物中的獨特核酸片段之存在。基因轉殖後代之選擇性育種允許達成轉殖基因之同型接合性(homozygosity)。
攜帶嵌合Ig重鏈基因座之本揭露之基因轉殖小鼠可與攜帶免疫球蛋白輕鏈轉殖基因(例如人類Ig輕鏈轉殖基因)之小鼠雜交，藉以產生表現抗體之小鼠，該抗體包含與衍生自嵌合重鏈基因座之重鏈配對的轉殖基因衍生之輕鏈(例如人類輕鏈)。免疫球蛋白輕鏈基因轉殖小鼠在所屬技術領域中已充分建立。
IV.基因轉殖小鼠之用途
本揭露之基因轉殖小鼠可用於產生針對各式各樣的所關注抗原之抗體。針對僅攜帶嵌合Ig重鏈基因座及內源性小鼠輕鏈基因座之小鼠，小鼠將產生嵌合重鏈/小鼠輕鏈抗體，若為所欲，可將該抗體逆向工程改造，以將嵌 合重鏈與另一物種之輕鏈配對及/或用(多個)人類恆定區置換(多個)小鼠恆定區。替代地，針對攜帶嵌合Ig重鏈基因座及人類輕鏈Ig轉殖基因兩者之小鼠，可在宿主小鼠中製備嵌合重鏈/人類輕鏈抗體。未進一步人源化之嵌合抗體或完全人類嵌合抗體仍可用作體外試劑且用於診斷檢定中。意欲用於人類治療用途之抗體一般經逆向工程改造為完全人類的。
可對自具有嵌合Ig重鏈基因座之本揭露之基因轉殖小鼠單離的所關注抗體進行額外或替代重組工程改造。例如，針對利用mVH-hDH-hJH可變區或mVH-mDH-hJH可變區之抗體，可根據所屬技術領域中已充分建立的方法將由重組事件產生之獨特CDR3單離並移植至另一抗體骨架中。
因此，在另一態樣中，本揭露係關於一種產生針對所關注抗原之抗體的方法，該方法包含向本揭露之基因轉殖小鼠投予該所關注抗原。在一實施例中，向小鼠投予抗原，使得在小鼠中產生結合至所關注抗原之抗體。在一實施例中，基因轉殖小鼠包含如本文所述之嵌合Ig重鏈基因座及人類Ig輕鏈轉殖基因兩者，且向小鼠投予抗原，使得在小鼠中產生含hVH及含mVH之嵌合抗體。在一實施例中，該方法可進一步包含自宿主小鼠單離出所關注抗體。在一實施例中，該方法可進一步包含自小鼠單離出編碼所關注抗體之核酸、及用人類恆定區序列置換核酸內之小鼠恆定區序列。設想所得抗體之額外或替代重組工程改造(例如，將小鼠序列逆向工程改造為人類序列)。
基因轉殖動物可藉由所屬技術領域中已知的標準方法用(多種)所關注抗原免疫，且亦可藉由已建立的標準方法將動物中產生之抗體單離及表徵。多株抗體可直接自宿主動物中單離出來，且單株抗體可藉由諸如融合瘤技術之標準方法製備。使用融合瘤製造單株抗體之程序在所屬技術領域中已 充分建立(參見例如美國專利第4,977,081號、PCT公開案WO 97/16537、及歐洲專利第491057B1號，其等之揭露以引用方式併入本文中)。替代地，自經選殖cDNA分子在體外產生單株抗體亦係所屬技術領域中已建立的(參見例如Andris-Widhopf et al.(2000)J.Immunol.Methods 242：159；及Burton(1995)Immunotechnology 1：87，其揭露係以引用之方式併入本文中)。可自經免疫基因轉殖小鼠中單離出B細胞殖株，且編碼抗體之cDNA可藉由標準分子生物學技術單離並選殖至表現載體中。經選殖Ig cDNA之進一步重組工程改造亦係可能的，且在所屬技術領域中已充分建立。
V.定義
如本文中所使用，用語「嵌合(chimeric)」(如「嵌合Ig基因座」)意欲指衍生自兩種不同物種(諸如人類及小鼠)之核酸序列。因此，當內源性小鼠Ig基因座包括來自另一物種(諸如人類)之核酸序列時，其係嵌合的。
如本文中所使用，用語「可操作地連接(operationally linked)」意欲描述與另一核酸序列建立功能關係之核酸序列的構形。例如，若啟動子或增強子影響序列之轉錄，則該啟動子或增強子係可操作地連接至編碼序列。關於兩個蛋白質編碼區之接合，可操作地連接意指所連接之核酸序列係連續的且在閱讀框內。針對剪接供體/接受者及RSS序列，可操作地連接意指序列能夠實現其功能目的。
如本文中所使用，用語「Supra-多樣性小鼠(Supra-diversity mouse)」意欲指藉由插入人類Ig重鏈轉殖基因改變其內源性重鏈基因座的本揭 露之嵌合小鼠，使得相較於具有未經改變之內源性小鼠HC基因座之小鼠及具有人源化VDJ基因座之小鼠(其中小鼠V區段已去活化)，本揭露之嵌合小鼠表現具有較大V區多樣性(例如VH使用之多樣性)之抗體組庫。根據本揭露之方法製備之經改變Ig重鏈等位基因在本文中亦稱為「Supra等位基因(Supra allele)」，導致產生Supra-多樣性小鼠。
如本文中所使用，用語「轉殖基因(transgene)」係指作為外源性來源引入宿主基因體內之位點(例如小鼠重鏈Ig基因座)的基因。
如本文中所使用，用語「轉殖基因構築體(transgene construct)」係指適用於引入宿主動物基因體中之核酸製劑。
如本文中所使用，用語「基因轉殖小鼠(transgenic mouse)」係指包含具有如本文所定義之轉殖基因之細胞的小鼠。轉殖基因可存在於小鼠的全部或一些細胞中。
如本文中所使用，關於免疫球蛋白V區段之用語「未經重排(unrearranged)」係指呈其生殖系構形之免疫球蛋白V區段，其中V區段未經重組以緊鄰D或J區段。
本發明係藉由下列實例進一步說明，該等實例不應被解讀為造成進一步限制。圖式及本申請案通篇引用之所有參考文獻、專利、及公開之專利申請案之內容以引用方式明確併入本文中。
實例
實例1：Supra-多樣性基因轉殖小鼠之製備
在此實例中，描述具有嵌合內源性重鏈Ig基因座之Supra-多樣性基因轉殖小鼠之製備，其中自內源性基因座中刪除小鼠D及J區段，且在該位點引入人類V、D、及J區段，同時維持小鼠V區段之存在及功能，使得hVH-D-J及mVH-D-J重組兩者皆可發生。鑑於在形成Supra-多樣性小鼠之抗體組庫中使用mVH及hVH兩者，其代表一種用於產生較單獨具有完整內源性小鼠重鏈基因座之小鼠或僅具有已經完全人源化之重鏈基因座之小鼠(例如插入人類序列及包括mVH之小鼠序列去活化)更大多樣性的VH序列之工具。
內源性小鼠D及J區段之刪除
如圖1中所示意性地繪示，使用涉及自小鼠12號染色體上的內源性小鼠Ig重鏈基因座中刪除內源性小鼠D及J區段之程序來製備Supra-多樣性小鼠。刪除Adam6b基因下游及小鼠IgM區上游之小鼠D及J區段，其保留小鼠生育力所需之ADAM6基因區(包括Adam6a及Adam6b)。此策略維持嵌入ADAM6基因區內之小鼠1-3及3-1 D區段，同時刪除ADAM6基因區下游之所有小鼠D區段。由此程序產生之12號染色體上的小鼠IGH基因座之刪除區間對應於鹼基對113,391,744-113,446,387(根據NCBI參考序列：NC_000078.7；GRCm39；參見https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/NC_000078.7)。
使用標準CRISPR-Cas9介導之重組(包括嚮導RNA(gRNA))，在小鼠胚胎幹(ES)細胞中達成圖1所指示之區內內源性小鼠重鏈基因座之部分刪除，其係所屬技術領域中已充分建立的用於刪除基因體序列之方法。藉由標準方法識別在重鏈基因座具有適當重組之ES細胞。重組細胞包含嘌 呤黴素抗性基因，允許嘌呤黴素選擇。基因體DNA分析亦可用於確認適當重組。
人類Ig重鏈可變區轉殖基因之引入
亦如圖1中所示意性地繪示，用於製備Supra-多樣性小鼠之程序涉及將人類Ig重鏈可變區轉殖基因引入內源性小鼠Ig重鏈基因座中小鼠D及J區段被刪除的位點處。使用細菌人工染色體(BAC)作為載體，且包括複數個人類重鏈V、D、及J區段來設計人類Ig重鏈轉殖基因。以下四十一個人類VH區段係以其未經重排生殖系構形包括在轉殖基因中：3-74、3-73、3-72、2-70、1-69、3-66、3-64、4-61、4-59、1-58、3-53、5-51、3-49、3-48、1-46、1-45、3-43、4-39、4-34、3-33、4-31、3-30、4-28、2-26、1-24、3-23、3-21、3-20、1-18、3-15、3-13、3-11、3-9、1-8、3-7、2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、及6-1。轉殖基因亦包括呈其生殖系構形之27個人類DH區段及呈其生殖系構形之所有六個人類JH區段。所使用之27個DH區段代表存在於來自人類14號染色體之重鏈基因座中的整個人類DH組庫，其包括最遠端的DH區段。
BAC載體轉殖基因構築體係示意性地繪示於圖5中。人類Ig重鏈BAC係藉由基因合成及重組工程之組合產生。41個區段之人類VH陣列係插入BAC載體骨架中之完全合成構築體。接著，將此VH供體用於重組工程方案中，使用人類BAC殖株CTD-2572O2作為受質，將VH陣列與D及J元件之人類生殖系序列重組。將小鼠特異性GRS同源域附接至重組BAC之兩端、連同小鼠特異性CRISPR-Cas9引導識別位點，以促進GRS重組方法。所使用且併入BAC構 築體中以用於GRS重組方法之具體引導如下(括號內為原間隔子相鄰基序(protospacer adjacent motif,PAM))：
moIgH JEmu-1：TTATACAGTATCCGATGCAT(AGG)(SEQ ID NO：2)
*moIgH D1-1：ATCATGATATCCCACAAGTA(TGG)(SEQ ID NO：3)
將人類Ig重鏈可變區轉殖基因構築體引入ES細胞之內源性小鼠Ig重鏈基因座中，ES細胞已經歷內源性D及J區段之刪除，如圖1中所示意性地繪示。使用CRISPR-Cas9介導之重組的GRS方法，使用標準敲入技術將轉殖基因引入內源性小鼠重鏈基因座內之適當位點中。藉由標準方法識別在重鏈基因座具有適當重組之ES細胞。人類Ig轉殖基因之引入允許嘌呤黴素選擇。在選擇後，可例如藉由Flp重組或所屬技術領域中已建立的其他手段移除puro盒，以不干擾供體DNA基因表現。基因體DNA分析亦可用於確認轉殖基因之適當敲入。
在如上所述之小鼠ES細胞內的內源性小鼠Ig重鏈基因座產生Supra等位基因後，藉由所屬技術領域中已充分建立的標準方法自ES細胞產生基因轉殖Supra-多樣性小鼠。
實例2：Supra-多樣性基因轉殖小鼠之表徵
在此實例中，對如實例1中所述製備之Supra-多樣性小鼠的VH區段使用在初始動物及經免疫動物兩者中進行表徵。圖2A之示意圖繪示Supra等位基因如何產生衍生自敲入結構之不同部分的重組V-D-J單元。此係基於Ig 基因座之固有性質，以在B細胞發育期間在不同的VH、DH、及JH編碼序列之間經歷隨機(stochastic)重組，形成用以編碼Ig重鏈之可變部分的功能性V-D-J產物。
在第一組實驗中，使用在對Supra小鼠之RNA進行RT-PCR後的序列分析，以指定完全人類VDJ重組產物對mVH/hDH/hJH產物之比例，其使用Enpicom IGX平台進行Ig序列分析。檢查初始、未經免疫小鼠以及用不同免疫原免疫之小鼠。結果顯示，在初始、未經免疫小鼠中，人類VH使用率係45%，而小鼠VH使用率係55%(圖2B)。針對用COVID-19棘蛋白免疫之小鼠，人類VH使用率係44%，而小鼠VH使用率係56%(圖2C)。針對用未揭示免疫原(「目標X」)免疫之小鼠，人類VH使用率係63%，而小鼠VH使用率係37%(圖2D)。數據展現出兩種類型的重組產物皆容易回收，儘管比例隨RT-PCR+定序所使用之RNA來源而變化。自經免疫淋巴結中單離之單一B細胞(「目標X」實驗)似乎具有較批量處理的整個脾臟中所見者更大比例的完全人類重組產物。
使用IGX生物資訊學分析進一步表徵Supra-多樣性小鼠中所使用之特定V區。不同人類V、D、及J區段使用之相對頻率係繪示於圖3中，其顯示初始、未經免疫小鼠及用COVID-19棘蛋白或目標X免疫原免疫之小鼠的結果。結果展現出在所有三組小鼠之集合數據之間，所有輸入人類VH區段皆在一定程度上得到利用，大部分所有的人類D區段及所有J區段亦是如此，確認人類供體轉殖基因之功能性。
由IGX平台判定之人類VH、D、及J使用的更定量彙總係分別顯示於下表1至表3中。計數對應於NGS序列運行內經個別識別之VH、DH、或JH 區段之數目。初始樣本及經棘蛋白免疫樣本係自整個脾臟RNA運行的批量NGS。經目標X免疫樣本係使用10X方法在單一細胞模式下運行(https://www.10xgenomics.com/)。
經由NCBI「Ig BLAST」程式對初始、未經免疫脾臟樣本中經識別之前20個殖株型之胺基酸及核苷酸序列進行進一步分析。人類轉錄本佔總 數之59.7%，而小鼠轉錄本佔40.3%。此確認IGX程式可識別完全人類(hVH/hDH/hJH)轉錄本及小鼠-人類雜交(mVH/hDH/hJH)轉錄本兩者。
為了評估小鼠VH區段在Supra-多樣性小鼠中之使用是否反映「正常」小鼠之使用，對最常見的VH區段在下列之間進行比較：(i)Supra-多樣性小鼠；(ii)內部定序之野生型C57/Bl6小鼠脾臟RNA；及(iii)來自C57Bl/6野生型脾臟之正常小鼠Ig組庫的已發表參考文獻(Rettig et al.(2018)PLoS One 13(1)：e0190982)。三組中最常使用到最不常用的14個VH區段之等級順序係顯示於下表4中：
已發表之初始小鼠組庫(“PLoS”)中有數個最高「命中(hit)」(6/14)，亦可見於Supra-多樣性小鼠中(VH區段1-80、1-53、1-55、1-18、9-3、及1-64)。此外，Supra-多樣性小鼠及內部定序之C57 WT樣本「WT Zai初始moVH」中亦有共同的VH(VH區段1-61、1-74、及1-64)。在已發表之組庫(“PLoS”)與內部定序之樣本(“WT”)之間亦有共同的命中(VH區段1-26、1-9、1-50、1-78、及1-64)。總體而言，結果呈現出大致上一致的使用概況，但具有正常變化，其在分析初始組庫中係典型的。
亦透過NGS及生物資訊學分析檢查在Supra-多樣性小鼠中小鼠VH使用程度。使用IGX MiXCR應用程式在MiSeq平台上進行NGS定序得到的小鼠VH使用之彙總係顯示於下表5中：
結果顯示，Supra-多樣性小鼠中所表現之小鼠VH區段之數目係大約115個。自內部C57Bl/6野生型初始脾臟定序中識別出的所表現之小鼠VH區段之數目係114個。此外，已公開之組庫報告大約132個小鼠VH區段(Rettig et al.(2018)PLoS One 13(1)：e0190982)。基於此，Supra-多樣性小鼠中之VH使用頻率似乎正常。
Supra-多樣性小鼠中之VH使用係示意性地彙總於圖4中，其說明115個小鼠VH區段與26個人類VD區段及6個人類VJ區段之組合、以及41個人類VH區段與26個人類VD區段及6個人類VJ區段之組合的使用。此等結果證實，無論初始VH域衍生自人類或小鼠，所有可用的VH、DH、及JH區段在Supra-多樣性小鼠中皆被廣泛使用。
為了檢查Supra-多樣性小鼠中之CDR3多樣性，在Supra-多樣性小鼠與WT-C57Bl/6小鼠之間使用小鼠VH 1-64對前48個殖株型進行比較。當比較CDR3域時，Supra小鼠與WT小鼠之CDR3域之間顯然有一些共同的序列模體，但亦清楚的是，在該兩種品系中之CDR3之間同時有顯著的多樣性或分岐。此等結果證明，Supra-多樣性小鼠產生獨特的VH及CDR3之組合，該等組合在人類或野生型小鼠來源中並不典型或未被發現。
總而言之，Supra-多樣性小鼠之可變區使用分析證實，來自人類或小鼠之可變區序列被有效地使用及重組以形成功能性V-D-J域，其中幾乎所有可用的組分VH、DH、及JH區段皆被用於功能性重排中。此外，人類供體BAC轉殖基因之敲入仍允許回復在野生型小鼠中發現之相同的小鼠VH區段。序列分析指示，發現嵌合mVH/hDH/hJH及完全人類hVH/hDH/hJH重排兩者，其中hVH與mVH使用頻率在某些情況下幾乎相等，且在其他情況下顯示對完全人類重排之偏好。總體而言，結果支持使用Supra-多樣性小鼠作為新穎的抗體來源，其具有正常野生型小鼠或正常人類樣本中不存在的獨特組庫。
序列表之彙總
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Claims (15)

  1. 一種在小鼠細胞中製備嵌合免疫球蛋白重鏈基因座之方法，該方法包含：(a)將小鼠免疫球蛋白(Ig)重鏈基因座中內源性小鼠可變區段(VH)及內源性Adam6b下游以及內源性IgM上游之內源性小鼠D區段及J區段刪除；及(b)將人類重鏈可變區轉殖基因引入該小鼠Ig重鏈基因座中該內源性小鼠可變區段(VH)及內源性Adam6b下游以及內源性IgM上游，其中該轉殖基因包含複數個未經重排人類可變區段(VH)、複數個人類D區段(DH)、及複數個人類J區段(JH)，藉以在該小鼠細胞中製備嵌合Ig重鏈基因座，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含內源性小鼠VH區段及人類VH區段之抗體組庫(repertoire)，各VH區段係連接至人類DH及JH區段。
  2. 如請求項1之方法，其中使用CRISPR-Cas9介導之剔除/敲入技術同時進行步驟(a)及(b)。
  3. 如請求項1之方法，其中藉由CRISPR-Cas9介導之基因編輯刪除該等小鼠D區段及小鼠J區段，且藉由Cre-Lox介導之重組將該人類重鏈可變區轉殖基因引入該小鼠Ig重鏈基因座中。
  4. 如請求項1之方法，其中該人類重鏈可變區轉殖基因係攜帶於細菌人工染色體(BAC)上。
  5. 如請求項1之方法，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含至少二十個不同人類VH區段之抗體組庫。
  6. 如請求項1之方法，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含至少三十個不同人類VH區段之抗體組庫。
  7. 如請求項1之方法，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含至少四十個不同人類VH區段之抗體組庫。
  8. 如請求項1之方法，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含人類VH區段3-74、3-73、3-72、2-70、1-69、3-66、3-64、4-61、4-59、1-58、3-53、5-51、3-49、3-48、1-46、1-45、3-43、4-39、4-34、3-33、4-31、3-30、4-28、2-26、1-24、3-23、3-21、3-20、1-18、3-15、3-13、3-11、3-9、1-8、3-7、2-5、7-4-1、4-4、1-3、1-2、及6-1之抗體組庫。
  9. 如請求項1之方法，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含至少100個不同內源性小鼠VH區段之抗體組庫。
  10. 如請求項1之方法，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含至少十五個不同人類DH區段之抗體組庫。
  11. 如請求項1之方法，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含至少二十六個不同人類DH區段之抗體組庫。
  12. 如請求項1之方法，其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之小鼠表現包含六個不同人類JH區段之抗體組庫。
  13. 一種基因轉殖小鼠細胞，其包含嵌合免疫球蛋白(Ig)重鏈基因座，其中該嵌合Ig重鏈基因座：(a)缺乏內源性小鼠可變區段(VH)及Adam6b序列下游以及內源性IgM恆定序列上游之內源性小鼠D區段及J區段；及(b)在該內源性小鼠可變區段(VH)及Adam6b序列下游以及內源性IgM序列上游包含人類重鏈可變區轉殖基因，其中該轉殖基因包含複數個未經重排人類可變區段(VH)、複數個人類D區段(DH)、及複數個人類J區段(JH)， 其中包含該嵌合Ig重鏈基因座之該基因轉殖小鼠細胞表現包含內源性小鼠VH區段及人類VH區段之抗體組庫，各VH區段係連接至人類DH及JH區段。
  14. 如請求項13之細胞，其中該細胞為胚胎幹細胞。
  15. 如請求項13之細胞，其中該細胞為B細胞。
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