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TWI896841B - 過敏原固定化擔體及過敏原特異性抗體的檢測方法 - Google Patents

過敏原固定化擔體及過敏原特異性抗體的檢測方法

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TWI896841B
TWI896841B TW111102147A TW111102147A TWI896841B TW I896841 B TWI896841 B TW I896841B TW 111102147 A TW111102147 A TW 111102147A TW 111102147 A TW111102147 A TW 111102147A TW I896841 B TWI896841 B TW I896841B
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allergen
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carrier
allergens
antibodies
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山下和美
伊藤正照
古志洋一郎
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日商東麗股份有限公司
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Abstract

本發明提供一種過敏檢查用之過敏原固定化擔體，其縱使用比先前少量之檢體，仍對過敏原特異性IgE抗體能以高靈敏度進行多項目同時測定，並且能與「Immunocap」之測定值相關性高地測定；該過敏檢查用之過敏原固定化擔體的特徵在於過敏原以密度120～500ng/cm 2被固定化於擔體。

Description

過敏原固定化擔體及過敏原特異性抗體的檢測方法
本發明係有關用於檢測過敏原特異性抗體之固定化有過敏原的擔體，及使用該擔體的過敏原特異性抗體之檢測方法。
過敏檢查通常是藉著測定存在於受檢者之血液中或淚液中的過敏原特異性IgE抗體之量而進行。由於對某種特定過敏原之過敏反應越強的受檢者，針對該過敏原之特異性IgE抗體越大量存在於血液中或淚液中，所以其測定值成為高值。
特異性IgE抗體之檢測，係藉由下述進行：準備將過敏原固定化於擔體之過敏原固定化擔體，使檢體與其接觸反應，捕捉與過敏原結合的檢體中之特異性IgE抗體，使用使用酵素或螢光標識之抗IgE抗體檢測所形成的過敏原與特異性抗體之複合體。
就使用將過敏原等蛋白質進行固定化的擔體來測定受驗物質之方法而言，以ELISA(酵素連結免疫吸附檢定(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay))為代表，將蛋白質固定於聚苯乙烯擔體者被廣泛使用。例如，在專利文獻1中，記載藉由ELISA之牛乳過敏患者中之牛乳特異性IgE抗體的測定。在專利文獻2中，記載將過敏原固定於聚苯乙烯擔體。
又，在非專利文獻1中，記載使用將蛋白質固定於玻璃擔體之微陣列的檢測。此外，在非專利文獻2中，記載將過敏原固定於多孔質的纖維素泡綿之擔體，在專利文獻3中，記載將過敏原固定於DLC(類金剛石碳(Diamond-like Carbon))之擔體，在專利文獻4中，記載分別使用將過敏原固定於光反應性樹脂之擔體的檢測。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2000-266746號公報 [專利文獻2]日本專利第4829460號公報 [專利文獻3]日本專利第5322242號公報 [專利文獻4]日本特開2020-132803號公報 [非專利文獻]
[非專利文獻1] Nava Levit-Binnun et al., Anal Chem., 75(6): 1436-41(2003) [非專利文獻2] Jean Bousquet et al., J. Allergy Clin. Immunol., 85(6): 1039-1043(1990)
[發明欲解決之課題]
在過敏檢查之臨床現場，特異性IgE抗體之測定中，標準上所用者為非專利文獻2記載之將過敏原固定於多孔質的纖維素泡綿之Thermo Fisher Scientifics股份有限公司之「Immunocap」(註冊商標)。在參考使用該「Immunocap」之測定值(以下，亦稱為「Immunocap值」)及概率曲線(表示「Immunocap值」與過敏症狀誘發可能性之關係的曲線)下，進行過敏之治療方針或食物負荷試驗的實施、過敏耐性獲得的判斷。由於「Immunocap」被標準地使用於過敏檢查診斷，因此在開發測定特異性IgE抗體之新檢查藥上，必須與「Immunocap值」相關性良好。
另一方面，「Immunocap」為在1次的檢查只能測定1項過敏原之過敏原特異性IgE抗體的製品。由於在1次的測定需要40微升之血清，若進行複數個項目之過敏原特異性IgE抗體的測定，則需要數毫升之採血。成為受檢者之過敏患者多為小孩，從非常小之兒童進行數毫升的採血，或以針穿刺兒童之極細血管，均為身體的極大負擔，使用「Immunocap」之多項目過敏原特異性IgE抗體的同時檢查在實施上有困難。
從以上之現況，乃期望開發一種過敏原固定擔體，其可從少量血液(相當於血液1滴的100μL以下之程度)以高靈敏度且與Immunocap測定值相關性良好地測定多項目的過敏原特異性IgE抗體。 [用以解決課題之手段]
為克服上述課題，本發明人等重複專心研討之結果，發現藉由使用以密度120～500ng/cm 2固定化有過敏原的擔體，能以高靈敏度進行多項目之過敏原的同時測定且可與「Immunocap」相關性高地測定。
亦即，本發明係以下列(1)～(15)之態樣構成。 (1)一種用於檢測過敏原特異性抗體之過敏原固定化擔體，其係過敏原被固定化於過敏原固定化區域的擔體，其中過敏原係以密度120ng/cm 2以上500ng/cm 2以下被固定。 (2)如(1)記載之過敏原固定化擔體，其中前述過敏原係以密度180ng/cm 2以上300ng/cm 2以下被固定。 (3)如(1)或(2)記載之過敏原固定化擔體，其中於前述擔體中設置凸部，該凸部為前述過敏原固定化區域。 (4)如(1)～(3)中任一項記載之過敏原固定化擔體，其中2種以上100種以下之過敏原被固定化於過敏原固定化區域。 (5)如(1)～(4)中任一項記載之過敏原固定化擔體，其中前述過敏原經由包含式(Ia)或(Ib)所示之單元的聚合物而被固定化；
(式(Ia)及式(Ib)中，R 1表示碳數1～4之伸烷基，R 2表示R 3、OR 4或NHR 5，R 3及R 5各自獨立地表示氫原子或碳數1～4之烷基，R 4表示碳數1～4之烷基，R 6表示碳數1～2之伸烷基，R 7及R 8各自獨立地表示氫原子或碳數1～4之烷基。) (6)如(3)記載之過敏原固定化擔體，其中設置包含前述凸部的反應槽。 (7)如(1)～(6)中任一項記載之過敏原固定化擔體，其中前述過敏原之中至少1種為蛋白、牛乳、落花生或蟎中任一者。 (8)如(1)～(7)中任一項記載之過敏原固定化擔體，其中前述擔體為包含脂肪族結構之樹脂製。 (9)如(1)～(8)中任一項記載之過敏原固定化擔體，其中前述擔體為包含酯之樹脂製。 (10)如(1)～(9)中任一項記載之過敏原固定化擔體，其中前述擔體為丙烯酸系樹脂製。 (11)如(1)～(10)中任一項記載之過敏原固定化擔體，其中前述擔體為聚丙烯酸酯製或聚甲基丙烯酸酯製。 (12)一種過敏原特異性抗體之檢測方法，其包含：使檢體接觸於如(1)～(11)中任一項記載之過敏原固定化擔體，形成該過敏原與在檢體中所含的該過敏原特異性IgE抗體之複合體的步驟；以及檢測該所形成之過敏原與過敏原特異性IgE抗體之複合體的步驟。 (13)如(12)記載之過敏原特異性抗體之檢測方法，其中前述檢體為選自包含IgG抗體、IgM抗體、IgA抗體及IgD抗體之群組中之至少1種抗體被除去的檢體。 (14)一種方法，其係在擔體設置凸部，且1種以上100種以下之過敏原以密度120ng/cm 2以上500ng/cm 2以下被固定於前述凸部之擔體的製造方法，其包含將過敏原固定化於擔體之凸部的步驟、以及將該被固定化之過敏原定量而測定固定化密度的步驟。 (15)如(14)記載之方法，其中前述過敏原係以密度180ng/cm 2以上300ng/cm 2以下被固定化於前述過敏原固定化區域。 [發明之效果]
藉由使用本發明之擔體，變得能以比先前少量之檢體，同時以高靈敏度且與「Immunocap」之相關性高地測定多項目之過敏原特異性IgE抗體。
[用以實施發明的形態]
本發明之過敏原固定化擔體，其特徵為過敏原以密度120ng/cm 2以上500ng/cm 2以下被固定在擔體之過敏原固定化區域。
本發明中所用之過敏原，為將過敏原材料所含之蛋白質萃取者。過敏原可為萃取之粗蛋白質，亦可為進一步分離精製者，或經單離之單一蛋白質。
過敏原材料為包含引起過敏之過敏原之材料的總稱。具體而言，可列舉微生物、植物、動物、昆蟲及蟎、屋塵(house dust)、以及包含此等之食品等。是否引起過敏，係依存於體質。
就包含過敏原的微生物之例而言，可列舉鏈隔孢菌(Alternaria)、麴菌、念珠菌、馬拉色菌(Malassezia)等。就包含過敏原的植物之例而言，可列舉杉樹、柏樹、赤楊、樺樹、鴨茅、豚草、艾蒿及貓尾草、以及此等之花粉等。就包含過敏原的動物之例而言，可列舉貓、狗、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、長尾小鸚鵡、鴨子等。就包含過敏原的昆蟲之例而言，可列舉飛蛾、蟑螂、蜜蜂等。就包含過敏原的食品之例而言，可列舉蛋、牛乳、小麥、落花生、大豆、蕎麥、芝麻、米、蝦、蟹、魷魚、章魚、奇異果、香蕉、蘋果、桃子、番茄、大蒜、鮪魚、鮭魚、鯖魚、牛肉、豬肉、雞肉等。此外，就包含屋內之過敏原因的過敏原之例而言，可列舉蟎或屋塵。又，就包含職業性過敏原因的過敏原之例而言，可列舉乳膠等。
過敏原可使用市售者，亦可使用自行從過敏原材料萃取者。從過敏原材料萃取過敏原的方法無特別限定，可依照周知之方法萃取。市售之過敏原可從Stallergenes Greer公司(GREER公司)、鳥居藥品股份有限公司、ITEA股份有限公司、Cosmo Bio股份有限公司、Biostir股份有限公司(Biostir公司)等購入。
就本發明之過敏原固定化擔體的原料而言，例如可列舉樹脂、玻璃、金屬、矽晶片、陶瓷、纖維素、硝基纖維素等，而以廉價且成形性優良的樹脂為較佳。樹脂之中，包含脂肪族結構之樹脂，由於與具有芳香族結構之樹脂比較時，本身螢光低，使用於螢光檢測分析用擔體時可減低干擾(noise)，故為較佳。又，包含酯鍵結之樹脂，由於可藉由水解處理生成的羧基，與過敏原蛋白質所含的胺基形成共價鍵而固定化，故為較佳。尤其丙烯酸系樹脂之加工性優良，可適應射出成形、押出成形、壓縮成形等各種成形法，亦適於切削加工、裁切、接著、彎曲加工等，故為更佳。就丙烯酸系樹脂而言，可列舉聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯及彼等之修飾物等，然而以聚甲基丙烯酸酯為較佳。就聚甲基丙烯酸酯而言，例如，可列舉聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)或聚甲基丙烯酸丙酯等聚甲基丙烯酸烷酯(PAMA)，較佳為易藉由射出成形或熱凸印(hot embossing)法而微細加工的PMMA。
就丙烯酸系樹脂而言，亦可使用與丙烯酸系樹脂之共聚物。例如，就包含聚甲基丙烯酸酯之共聚物而言，可列舉甲基丙烯酸甲酯・丙烯腈・丁二烯・苯乙烯共聚物(MABS樹脂)、甲基丙烯酸甲酯・丁二烯・苯乙烯共聚物(MBS樹脂)、甲基丙烯酸甲酯・苯乙烯共聚物(MS樹脂)等。
又，亦可在丙烯酸系樹脂中含有黑色物質。若列舉黑色物質之較佳者，可使用碳黑、石墨、鈦黑、苯胺黑、Ru、Mn、Ni、Cr、Fe、Co及Cu之氧化物、Si、Ti、Ta、Zr及Cr之碳化物等。
擔體之形狀可從板狀、薄膜、粒子狀、多孔質狀等適宜選擇，然而較佳為板狀。
擔體，就固定化有過敏原的固定化區域而言，以具有凸部為較佳。在使用板狀之擔體的情況，作為過敏原固定化區域之凸部，將擔體水平放置時，存在於上面為較佳。若在此面，可將為固定化區域之多數個凸部設於一片擔體上。
如後述，本發明之過敏原固定化擔體可使用於過敏原特異性IgE抗體的檢測。在將與本發明之擔體結合之過敏原特異性IgE抗體，以螢光標識二次抗體檢測的情況，可採取使用掃描器等掃描擔體的手法。此時，使用在擔體之凸部上面固定化了過敏原之擔體的情況，發揮所謂不易檢測到非特異性地吸附在凸部以外之表面的螢光標識二次抗體之螢光(干擾)的效果。其理由係由於照射光的焦點會聚在凸部上面，因此在凸部上面以外，照射光散焦(defocus)。
凸部以上面平坦為較佳。若凸部之上面平坦，則在1個凸部上面內檢測到之螢光的強度不會發生誤差，而可得到良好信號(螢光)。
在複數個凸部設置於相同擔體之情況，以凸部上面的面積約略相同為較佳。藉由此種作法，在將過敏原固定化於各個凸部之全面的情況，可使各個凸部上的固定量一致。其中，凸部之上部面積約略相同，意指凸部之中最大的上面面積除以最小的上面面積的值為1.2以下。
凸部上面之面積，無特別限定，然而從能減少過敏原之量的觀點及操作之容易度的觀點而言，以4mm 2以下、10μm 2以上為較佳。就凸部之高度而言，以0.01mm以上、1mm以下為較佳。
在板狀之擔體中，較佳具有將過敏原固定化之固定化區域以及反應槽，該反應槽為能保持體液等檢體而使其與過敏原反應的槽。例如，就反應槽而言，可例示設置於擔體的凹部形狀的槽，或在擔體上以凸狀隔牆圍繞而成的槽等型態。
將具有反應槽的擔體之例子示於圖1。擔體1具有使檢體反應用之反應槽2，可在反應槽2內與檢體反應。反應槽之外側由於未與檢體接觸，可防止檢體向反應槽外的污染。反應槽如圖1之A所例示，可單一存在於1個擔體中，亦可如圖1之B所示，在1個擔體中可具有複數個反應槽2。在具有複數個反應槽之情況，由於可在相同擔體之各反應槽使複數個檢體個別地反應，可防止檢體彼此之污染，同時對於複數個檢體，可在相同擔體上同時進行正確的測定。
在反應槽內，存在固定化有過敏原的過敏原固定化區域，使於反應槽內被固定化之過敏原與檢體接觸，進行反應。在過敏原固定化區域中，被固定之過敏原可為1種，亦可為2種以上。 在反應槽中，可具有單一之過敏原固定化區域，亦可具有複數個過敏原固定化區域。在具有複數個過敏原固定化區域的情況，可在全部過敏原固定化區域固定化有相同的過敏原，亦可將2種以上之過敏原各自固定於個別之過敏原固定化區域。與在1個反應槽能檢測1種過敏原特異性抗體之擔體相較，後者的情況，由於可在1個反應槽進行複數個過敏原特異性抗體之檢測，故具有可減少每一項目過敏原之特異性抗體檢查所需之檢體量的優點。
將反應槽內設置複數個凸部，並將過敏原固定於凸部上面之一例示於圖2。在擔體1之反應槽2中設置複數個凸部3，形成於凸部上面固定有過敏原之區域4。被固定之過敏原可為1種，亦可為2種以上。如圖2之具有複雜結構的樹脂製擔體，可藉由射出成型製造。
就將過敏原固定於擔體之方法而言，可為藉由物理吸附進行固定化的方法，亦可為藉由化學鍵結以化學方式進行固定化的方法，不過由於以化學方式進行固定化之方法強固，故為較佳。就藉由物理吸附的固定化而言，可列舉利用凡德瓦爾力、氫鍵的方法。具體而言，例如，在擔體上將過敏原溶液滴入，原樣靜置至水分蒸發，藉此可使過敏原物理性吸附於擔體上。又，就化學性固定化而言，可列舉利用共價鍵、離子鍵、配位鍵之方法等，此等之中，以藉由共價鍵結合的方法為較佳。
過敏原藉由共價鍵於丙烯酸系樹脂等含酯之樹脂擔體的固定化，可藉由在擔體表面生成可與過敏原鍵結之官能基而進行。例如，可在擔體上依照周知之方法生成羧基，藉由與過敏原蛋白質所含的胺基共價鍵結而進行固定化。具體而言，將PMMA等丙烯酸系樹脂擔體的表面藉由苛性鈉等鹼性水溶液進行水解處理，使羧基生成於樹脂表面後，藉由使該羧基與過敏原萃取物之加熱處理物所含之胺基直接共價鍵結(醯胺鍵)而進行固定化。又，亦可對於在擔體上生成之羧基，以酯鍵導入馬來醯亞胺基，並使該馬來醯亞胺基、與過敏原所含之源自半胱胺酸殘基的硫醇基共價鍵結，藉此固定化。又，除DSG(戊二酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl glutarate))、DSS(辛二酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl suberate))、DSP(二硫代雙(琥珀醯亞胺丙酸酯)(dithiobis(succinimidyl propionate)))及此等之水溶性類似物等之交聯劑或PEG(聚乙二醇)連接劑之外，亦可透過以下所示之聚合物等固定化於丙烯酸系樹脂等擔體。
就可使用於過敏原之固定化的具體聚合物而言，可列舉包含式(Ia)或式(Ib)所示之單元的聚合物。
式(Ia)及式(Ib)中之R 1表示碳數1～4之伸烷基。R 1以亞甲基及伸乙基為較佳，以亞甲基為更佳。式(Ia)中之R 2表示R 3、OR 4或NHR 5。R 3及R 5各自獨立，表示氫原子或碳數1～4之烷基，R 4表示碳數1～4之烷基。R 3以甲基及乙基為較佳，以甲基為更佳。R 4以甲基及乙基為較佳，以甲基為更佳。R 5以氫原子為較佳。式(Ib)中之R 6表示碳數1～2之伸烷基。R 6以伸乙基為較佳。式(Ib)中之R 7及R 8各自獨立地表示氫原子或碳數1～4之烷基。R 7及R 8以氫原子及甲基為較佳，以氫原子為更佳。
又，亦可為包含式(Ia)或(Ib)所示之單元、及式(Ia)或(Ib)所示之單元以外之單元的雜聚合物。在為雜聚合物之情況，將該聚合物藉由共價鍵固定化於基板表面的情況，式(Ia)或(Ib)所示之單元以外的單元，以具有反應性官能基為較佳。就反應性官能基而言，可列舉胺基、羧基、羥基、鹵素基、甲苯磺醯基、環氧基、醯基、疊氮基，然而以胺基為較佳。
在雜聚合物之情況，以式(Ia)或(Ib)(以下，為了方便，將此等總稱為式(I))表示的單元對全部單元之比率，較佳為5莫耳%以上95莫耳%以下，更佳為10莫耳%以上90莫耳%以下，進一步更佳為30莫耳%以上70莫耳%以下。
包含式(Ia)或(Ib)所示之單元的聚合物，在為雜聚合物之情況中，以式(II)所示之單元之雜聚合物為較佳。式(II)中之R 1，與式(Ia)或(Ib)中之R 1同樣地，表示碳數1～4之伸烷基。
又，該雜聚合物中，相對於式(I)所示之單元及式(II)所示之單元的合計，式(I)所示之單元的比率，較佳為5莫耳%以上95莫耳%以下，更佳為10莫耳%以上90莫耳%以下，進一步更佳為30莫耳%以上70莫耳%以下。
過敏原溶液於擔體之過敏原固定化區域的塗布(點樣)，可使用周知之點塗(spotting)裝置、分配器(dispenser)、印刷機等進行。在將複數種過敏原固定化於接近之固定化區域的情況，為避免異種過敏原混入鄰接之過敏原固定化區域，若使用於反應槽設置複數個獨立之凸部的擔體，並以該凸部之上面作為過敏原固定化區域，塗布過敏原溶液，由於可藉由表面張力，將過敏原溶液留在凸部上面，故為較佳。此情況之複數個凸部之高度以約略相同為較佳。其中，高度約略相同，意指在同量之受檢物質結合於複數個高度略微相異之凸部上之面的狀態中，用掃描器等藉由螢光等測定其量時，其螢光強度等之測定值之差異不會成為問題的高度。具體而言，高度約略相同，意指高度之差小於100μm。
本發明之過敏原固定化擔體，係將過敏原以密度120ng/cm 2以上500ng/cm 2以下固定於過敏原固定化區域。過敏原之固定化密度，較佳為180ng/cm 2以上300ng/cm 2以下。更佳為190ng/cm 2以上280ng/cm 2以下，進一步更佳為195ng/cm 2以上270ng/cm 2以下。
就將過敏原以規定之固定化密度進行固定化的方法而言，可列舉算出對固定化區域之表面積所必要的過敏原量，將濃度已知之過敏原溶液的必要量，塗布於全部該固定化區域之方法。其中，可在考慮到經由蛋白質之胺基的過敏原固定化之反應效率下，適宜選擇過敏原蛋白質濃度、反應溫度、反應時間而實施。
例如，以上述之在擔體上滴入過敏原溶液，將其以原樣靜置至水分蒸發為止，藉此使過敏原物理吸附於擔體上之方法進行固定化的情況，固定化效率被認為約略100%。因此，例如，在使用設置反應槽及於其內部設置凸部，並將凸部上面作為固定化區域之擔體的情況，若針對該凸部上面之面積，算出成為期望之固定化密度的過敏原量，塗布包含該必要量之過敏原溶液後，靜置一晚，使水分乾燥，可製成以所期望之過敏原固定化密度固定的擔體。
在藉由共價鍵，利用過敏原蛋白質之胺基(N末端之胺基、離胺酸側鏈之胺基)固定化於擔體的情況，由於固定化反應之效率，隨著各過敏原所含之蛋白質具有之離胺酸的含有率或蛋白質之立體結構等而變動，所以選擇適宜的過敏原濃度、反應溫度、或反應時間而製作。例如，在使用設置反應槽及於其內部設置凸部，並將凸部上面作為固定化區域的丙烯酸系樹脂製擔體，並使該擔體之表面生成羧基，共價鍵結過敏原而進行固定化的情況，可依照以下之方法製作。首先，準備包含丙烯酸系樹脂等含酯的樹脂擔體，於10N氫氧化鈉水溶液中，70℃下浸漬14～48小時，生成羧基。將該羧基以使N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)與1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)反應等周知之方法進行NHS酯化，滴入過敏原溶液，藉此使其與過敏原蛋白質之胺基進行縮合反應。NHS酯，由於在與蛋白質之胺基之縮合反應之同時進行利用水解之不活化，通常使用大幅過剩量，具體而言100倍當量以上之過敏原蛋白質，於室溫反應大約一晩。然後，藉由將未結合之過敏原蛋白質用生理食鹽水等洗淨，可製作過敏原以密度120ng/cm 2以上500ng/cm 2以下被固定的擔體。過敏原蛋白質之量係準備0.01～50mg/mL之範圍的複數種過敏原溶液，並進行以1～37℃之條件培育1～48小時的研討，一邊估計反應效率，一邊製作即可。
擔體上固定之過敏原的定量，可藉由將擔體上固定之過敏原從擔體脫離，回收至液中等進行測定的間接方法，或將維持在擔體上固定化之狀態下的過敏原進行直接定量的方法而實施。
就間接地定量之方法而言，例如，可列舉將擔體上固定之過敏原從擔體脫離，回收至液中，將該液中之過敏原濃度藉由紫外吸光光度法、BCA法、布拉福(Bradford)法、洛瑞(Lowry)法等已知之蛋白質定量方法測定的方法。然而，由於使特別如共價鍵般，被強固地固定化在擔體上之過敏原完全脫離為困難，故在此情況，以將擔體上之過敏原進行直接定量的下列方法為較佳。
就將被固定在擔體上之過敏原進行直接定量的方法而言，可列舉：將擔體上之過敏原蛋白質藉由螢光物質或放射性同位素等進行標識，測定其強度的方法，然而，標識效率因蛋白質而異，有不易正確算出標識效率的情形。在此種情況，以採取利用飛行時間型2次離子質量分析法(TOF-SIMS)，從所得到的質量光譜中之源自過敏原蛋白質之峰及源自擔體之樹脂之峰的強度比算出固定化量之方法為較佳。
本發明之過敏原特異性抗體的檢測方法，包含：使檢體接觸於上述之過敏原固定化擔體，形成該過敏原與在檢體中所含之該過敏原特異性IgE抗體之複合體的步驟，及檢測該形成之過敏原與過敏原特異性IgE抗體之複合體的步驟。形成過敏原與過敏原特異性IgE抗體之複合體之步驟後，亦可進行將擔體洗淨，除去多餘之檢體成分的步驟。
檢測形成之複合體的步驟，可藉由反應與過敏原特異性IgE抗體結合的螢光標識二次抗體並測定螢光強度而進行。就二次抗體之標識體而言，除螢光物質(螢光色素)之外，亦可使用生成顯色・發光物質的酵素、放射性同位素元素等，然而此等之中，較佳為使用能安全且簡便地操作的以螢光物質修飾之二次抗體的方法。
本發明中所用之檢體，以源自體液者為較佳。就體液而言，可列舉血液、汗、尿、淚液、唾液、咳痰・呼吸道分泌液、母乳、羊水、腦脊髓液、腹水、胸水、關節液、精液、陰道分泌物等，然而以過敏原特異性IgE抗體等特異性抗體所含之量多的血液或淚液為較佳。在血液之情況，還可較佳使用血清或血漿。又，檢體可視需要進行前處理。
就前處理而言，可列舉檢體之稀釋或檢體中所含之成分的除去。若一邊使用稀釋之檢體，一邊使用將檢體中之為受驗物質的過敏原特異性IgE抗體以外之蛋白質或脂質除去的檢體，變得可抑制非特異性吸附反應，可使為受驗物質之過敏原特異性IgE抗體的檢測感度提高。又，由於體液檢體中之IgG抗體、IgM抗體、IgA抗體、IgD抗體與過敏原特異地結合，在檢測過敏原特異性IgE抗體時引起競爭性抑制(competitive inhibition)，導致過敏原特異性IgE抗體之檢測感度降低，故較佳為使用將選自包含IgG抗體、IgM抗體、IgA抗體及IgD抗體之群組中的至少1種抗體(以下，簡便地稱為「非IgE抗體」)除去的檢體。
尤其，由於IgG抗體為體液檢體中含量最多之抗體，在消解與過敏原特異性IgE抗體之競爭上，以除去IgG抗體的前處理為較佳。檢體之前處理，可列舉使用膜之過濾、親和性層析、離子交換層析等層析。具體而言，除抗IgG抗體、抗IgM抗體、抗IgA抗體、抗IgD抗體之抗體外，使用源自金黃色葡萄球菌之蛋白質A、源自G群溶血性鏈球菌之蛋白質G、源自革蘭氏陽性嫌氣性球菌之蛋白質L、源自菠蘿蜜之木菠蘿素(jacalin)等周知配體固定於擔體的親和性層析，可將檢體中之非IgE抗體吸附除去。
本發明之過敏原固定化擔體，可藉由包含：將過敏原固定化於擔體之凸部的步驟及將該被固定之過敏原定量，測定固定化密度之步驟的方法而製造。
將過敏原固定化於擔體之凸部的步驟，可依照前述方法進行。亦即，可為藉由物理吸附而進行固定化的方法，亦可為藉由化學鍵結以化學方式進行固定化的方法，然而由於以化學方式進行固定化的方法強固，為較佳。就化學性固定化而言，可列舉利用共價鍵、離子鍵、配位鍵之方法等，此等之中，以藉由共價鍵結合的方法為較佳。
將過敏原固定化於擔體之凸部的步驟，可藉由將過敏原溶液塗布(點樣)於擔體之過敏原固定化區域而進行。過敏原溶液之塗布，可使用周知之點塗裝置、分配器、印刷機等而進行。
將被固定之過敏原定量，測定固定化密度的步驟，可依照前述之方法進行。亦即，可藉由將固定在擔體上之過敏原從擔體脫離，回收至液中等進行測定的間接方法，或將維持在擔體上固定化之狀態下的過敏原進行直接定量的方法而實施。就直接定量之方法而言，除將擔體上之過敏原蛋白質藉由螢光物質或放射性同位素等進行標識並測定其強度的方法之外，亦可使用TOF-SIMS法，而以TOF-SIMS法為較佳。
若依照本發明之製造方法，可判斷過敏原是否以規定之固定化密度被固定化，而進行過敏原固定化擔體之製造步驟中的品質管理。 [實施例]
藉由下列之實施例具體地說明本發明。
[實施例1～6] (1)過敏原固定化擔體(擔體A)之製作 (1)-1 NHS酯化PMMA製擔體之製作 將如圖2示意性地所示之設有1個上部表面具有256個(16×16，間距560μm)直徑150μm之圓錐台狀凸部之反應槽(12.5mm×10mm×深度0.15mm)的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)製基板(75mm×25mm×1.0mm)，於70℃浸漬在10N氫氧化鈉水溶液中14小時。繼而，依序用純水、0.1N HCl水溶液、純水洗淨。如此作法，可將基板表面之PMMA的側鏈水解，生成羧基。
繼而，使100mg之N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、350mg之1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)溶解於400mL之2-啉基乙磺酸一水合物(MES)緩衝液(以0.1N氫氧化鈉調至pH5.0)中。將上述水解後的PMMA製基板浸漬在此等之混合溶液中，用微攪拌器攪拌1小時，得到NHS酯化之PMMA製基板。
(1)-2過敏原溶液之調製 實施例1及2中所使用之蛋白過敏原、實施例4及5中所使用之牛乳過敏原，任一者皆作為過敏原抓痕萃取物(allergen scratch extract)而由鳥居藥品購入。過敏原抓痕萃取物中由於包含50%之濃甘油，實施透析(透析膜：Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO，透析液：磷酸緩衝生理食鹽水)除去甘油後，以磷酸緩衝生理食鹽水調至表1所示之濃度使用。
實施例3及6中所使用之過敏原製造者GREER公司之蛋白過敏原、牛乳過敏原，由於任一者皆為凍結乾燥粉末，故以磷酸緩衝生理食鹽水溶解，調至1.0mg/mL使用。
(1)-3過敏原之固定 將於(1)-2調製之各過敏原溶液，使用定位用機器人(Robot of spotting)(日本雷射電子(股)，GTMASStamp-2)，點塗在(1)-1所製作的NHS酯化PMMA樹脂基板之各個不同的凸部上面。繼而，將該基板放入密閉之塑膠容器，於37℃，濕度100%之條件下培育24小時，進行固定化。培育後，以包含0.05%Tween20之磷酸緩衝生理食鹽水洗淨，除去未固定之過敏原。如以上之作法，得到蛋白及牛乳之各過敏原分別被固定於設置在1個反應槽中之不同凸部上面之「擔體A」。
(2)過敏原固定化密度之測定 將蛋白過敏原溶液用水・甲醯胺混合溶劑進行階段稀釋，調製標準液，使用非接觸噴射分配器(jet dispenser)Cyber jet2(武藏工程公司製)，將液滴吐出至與(1)-1中所使用相同PMMA製基板上，在室溫使其自然乾燥至溶劑蒸發為止。從吐出液量及吐出液之附著面積，求出過敏原固定化密度，製成密度在0～400ng/cm 2之範圍內之21水準之標準基板。對於標準基板之過敏原固定化區域實施TOF-SIMS測定，取得正2次離子質量光譜(裝置：TOF．SIMS5(ION-TOF公司製)，1次離子種類：Bi 3 ＋＋，1次離子加速電壓：25kV，脈衝幅度：11.7ns，聚束：有，測定真空度：＜4×10 -7Pa，帶電中和：有，後段加速：10kV)，在取得之光譜中，從C 4H 8N ＋及C 4H 5O ＋之峰強度比，製成可算出蛋白過敏原之固定化密度的檢量線。
將(1)中所製作的擔體A之過敏原固定化區域以相同條件進行TOF-SIMS測定，從所得到之C 4H 8N ＋及C 4H 5O ＋之峰強度比，使用檢量線，算出被固定化在擔體A之各凸部上面的蛋白過敏原之固定化密度(實施例1～3)。
以同樣作法，製成可算出牛乳過敏原之固定化密度的檢量線，使用其算出被固定化在擔體A之各凸部上面的牛乳過敏原之固定化密度(實施例4～6)。
將結果示於表1。
(3)與「Immunocap」之相關性評價 使用於(1)中製作之擔體A，依照下列之方法，測定過敏陽性檢體及過敏陰性檢體的螢光強度，測定各檢體中之過敏原特異性抗體。檢體係使用共計7檢體(血漿)之從PlasmaLab公司購入的Immunocap值為已知之蛋白、牛乳、落花生、蟎過敏陰性檢體及陽性檢體。
以相同檢體之Immunocap值作為X軸，以測定之螢光強度作為Y軸，算出兩值間之相關係數R。
將結果示於表1。
其中，上述過敏原特異性抗體(螢光強度)之測定係以如下列之方法進行。
將於(1)中製作之擔體A於4℃浸漬在ELISA用阻斷試劑(Blocking Reagent For ELISA)(Sigma-Aldrich公司)中一晚，阻斷處理後，用PBST洗淨3次。將50μL之將檢體以磷酸緩衝生理食鹽水稀釋至3倍的溶液，滴入上述處理後之擔體之固定有過敏原的部分，蓋上間隙蓋玻片(gap cover glass)(松波硝子工業股份有限公司製：24mm×25mm，間隙大小20μm)進行密封。於37℃反應2小時後，移開間隙蓋玻片，用PBST洗淨3次。繼而，將50μL之經包含1重量%BSA之PBST稀釋1000倍的Dylight-650色素標識抗人類IgE山羊多株抗體(Novus biologicals製)添加於基板，蓋上間隙蓋玻片，於室溫反應1小時。然後，移開間隙蓋玻片，用PBST洗淨3次後乾燥，藉由掃描器裝置(東麗股份有限公司製，3D-GeneScanner3000)以下列條件測定螢光強度。
(螢光強度測定條件)
裝置：3D-GeneScanner3000(東麗製)
激發光波長：635nm 檢測波長：670nm PMT：30 (4)陰性檢體、陽性檢體中之過敏原特異性IgE的測定 使用(1)中製作之擔體A，依照與上述(3)同樣之方法，測定下列之陰性檢體A及陽性檢體B的螢光強度，檢測出蛋白過敏原特異性抗體(實施例1～3)、牛乳過敏原特異性抗體(實施例4～6)。
檢體中任一者，皆使用從PlasmaLab公司購入之血漿檢體。使用蛋白、牛乳、落花生、蟎之過敏中任一者皆為陰性的檢體，亦即蛋白過敏等級、牛乳過敏等級、落花生過敏等級、蟎過敏等級中任一者皆為等級0之陰性檢體A(蛋白特異性IgE濃度：小於0.1 IU/mL，牛乳特異性IgE濃度：小於0.1 IU/mL，落花生特異性IgE濃度：小於0.1 IU/mL，蟎特異性IgE濃度：小於0.1 IU/mL)，及蛋白過敏等級1且牛乳過敏等級1之陽性檢體B(蛋白特異性IgE濃度：0.38IU/mL，牛乳特異性IgE濃度：0.62IU/mL)。再者，將過敏等級區分成為陰性之等級0及為陽性之等級1～6的7階段，特異性IgE濃度越高則過敏等級越高。特異性IgE抗體濃度小於0.35，為陰性，等級0。特異性IgE抗體濃度為0.35以上，為陽性，等級1為0.35以上小於0.70，特異性IgE抗體濃度越高，則等級變得越大。
測定陰性檢體A及陽性檢體B之螢光強度，算出陽性檢體B之螢光強度對陰性檢體A之螢光強度的比(陽性檢體/陰性檢體)，將結果示於表1。
[實施例7～11] 將過敏原之項目、過敏原之製造者、過敏原之濃度、培育時間如表1所示設定，依照與實施例1～6同樣的方法，製作蛋白及牛乳之各過敏原分別被固定於設置在1個反應槽中之不同凸部上面的「擔體B」，實施過敏原固定化密度之測定、與「Immunocap」之相關性的評價、過敏原特異性IgE之測定。
將結果示於表1。
[實施例12、比較例1] 將過敏原之項目、過敏原之製造者、過敏原之濃度、培育時間如表1所示設定，依照與實施例1～6同樣的方法，製作蛋白及牛乳之各過敏原分別被固定於設置在1個反應槽中之不同凸部上面的「擔體C」，實施過敏原固定化密度之測定、與「Immunocap」之相關性的評價、過敏原特異性IgE之測定。
將結果示於表1。
[表1]
  過敏原固定化條件 擔體 過敏原 固定化密度 ng/cm 2 相關係數 R 螢光強度比 等級1陽性檢體B / 等級0陰性檢體 A
項目 製造者 濃度 mg/mL 培育時間 h
實施例1 蛋白 鳥居藥品 0.5 24 擔體A 196 0.90 2.5
實施例2 蛋白 鳥居藥品 1.0 24 219 0.96 2.9
實施例3 蛋白 GREER公司 1.0 24 220 0.91 4.4
實施例4 牛乳 鳥居藥品 0.2 24 192 0.96 3.8
實施例5 牛乳 鳥居藥品 0.5 24 225 0.95 3.7
實施例6 牛乳 GREER公司 1.0 24 230 0.99 3.8
實施例7 蛋白 鳥居藥品 2.0 16 擔體B 241 0.93 3.6
實施例8 牛乳 鳥居藥品 1.0 16 266 0.96 4.5
實施例9 蛋白 鳥居藥品 0.2 16 170 0.71 2.1
實施例10 蛋白 鳥居藥品 4.0 16 317 0.96 1.6
實施例11 牛乳 鳥居藥品 0.2 16 163 0.95 1.7
比較例1 蛋白 鳥居藥品 1.0 4 擔體C 113 0.54 0.9
實施例12 牛乳 鳥居藥品 3.0 4 327 0.96 1.7
[實施例13～15、比較例2～4] 將過敏原之項目、過敏原之製造者、過敏原之濃度、培育時間如表2所示設定，依照與實施例1～6同樣的方法，製作蛋白、牛乳、落花生、蟎之各過敏原分別被固定於設置在1個反應槽中之不同凸部上面的「擔體D」，實施過敏原固定化密度之測定、與「Immunocap」之相關性的評價、過敏原特異性IgE之測定。
實施例13中所使用之落花生過敏原係作為過敏原抓痕萃取物而由鳥居藥品購入。過敏原抓痕萃取物中由於包含50%濃甘油，實施透析(透析膜：Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO，透析液：磷酸緩衝生理食鹽水)除去甘油後，以磷酸緩衝生理食鹽水調至表2所示之濃度而使用。
實施例14及15中所使用的過敏原製造者GREER公司之蟎過敏原，及比較例4中所使用的Biostir公司之蟎過敏原，由於任一者皆為凍結乾燥粉末，故以磷酸緩衝生理食鹽水溶解，調至表2所示的濃度而使用。
過敏原特異性IgE之測定中，使用陰性檢體A及陽性檢體C，測定陰性檢體A及陽性檢體C之螢光強度，算出陽性檢體C之螢光強度對陰性檢體A之螢光強度的比(陽性檢體/陰性檢體)，將結果示於表2。陽性檢體C為從PlasmaLab公司購入之血漿檢體，其為蛋白過敏等級、牛乳過敏等級、落花生過敏等級、蟎過敏等級中任一者皆為等級1(蛋白特異性IgE濃度：0.39IU/mL，牛乳特異性IgE濃度：0.50IU/mL，落花生特異性IgE濃度：0.39IU/mL，蟎特異性IgE濃度：0.38IU/mL)的檢體。
將結果示於表2。 [實施例16～20、比較例5、6] 將過敏原之項目、過敏原之製造者、過敏原之濃度、培育時間如表2所示設定，依照與實施例13～15、比較例2～4同樣的方法，製作蛋白、牛乳、落花生、蟎之各過敏原分別被固定於設置在1個反應槽中之不同凸部上面的「擔體E」，實施過敏原固定化密度之測定、與「Immunocap」之相關性的評價、過敏原特異性IgE之測定。
由於實施例17中所使用的過敏原製造者GREER公司之落花生過敏原為凍結乾燥粉末，故以磷酸緩衝生理食鹽水溶解，調至表2所示的濃度而使用。
將結果示於表2。 [實施例21～24、比較例7～9] 將過敏原之項目、過敏原之製造者、過敏原之濃度、培育時間如表2所示設定，依照與實施例13～15、比較例2～4同樣的方法，製作蛋白、牛乳、落花生、蟎之各過敏原分別被固定於設置在1個反應槽中之不同凸部上面的「擔體F」，實施過敏原固定化密度之測定、與「Immunocap」之相關性的評價、過敏原特異性IgE之測定。
將結果示於表2。
[表2]
  過敏原固定化條件 擔體 過敏原 固定化密度 ng/cm 2 相關係數 R 螢光強度比 等級1陽性檢體C / 等級0陰性檢體 A
項目 製造者 濃度 mg/mL 培育時間 h
比較例2 蛋白 鳥居藥品 8.0 24 擔體D 700 0.75 1.2
比較例3 牛乳 鳥居藥品 10.0 24 515 0.97 1.4
實施例13 落花生 鳥居藥品 0.25 24 150 0.98 1.6
實施例14 蟎 GREER公司 0.1 24 184 0.99 2.5
實施例15 蟎 GREER公司 0.7 24 336 0.78 2.6
比較例4 蟎 Biostir公司 4.0 24 562 0.77 1.1
比較例5 蛋白 鳥居藥品 0.1 16 擔體E 110 0.64 1.0
比較例6 蛋白 鳥居藥品 10.0 16 527 0.75 0.4
實施例16 牛乳 鳥居藥品 0.1 16 135 0.89 3.2
實施例17 落花生 GREER公司 3.0 16 207 0.99 2.3
實施例18 落花生 鳥居藥品 4.0 16 291 0.99 2.1
實施例19 落花生 鳥居藥品 8.0 16 388 0.86 2.3
實施例20 蟎 GREER公司 0.2 16 152 0.75 2.6
實施例21 蛋白 GREER公司 8.0 4 擔體F 315 0.96 1.8
實施例22 蛋白 鳥居藥品 10.0 4 327 0.96 1.6
實施例23 牛乳 鳥居藥品 8.0 4 343 0.96 1.8
比較例7 牛乳 鳥居藥品 0.1 4 16 0.64 1.0
比較例8 落花生 鳥居藥品 0.25 4 64 0.45 1.5
實施例24 蟎 Biostir公司 4.0 4 204 0.98 2.4
比較例9 蟎 GREER公司 0.7 4 92 0.65 1.5
如實施例1～24所示，顯示本發明之過敏原固定化擔體，在任一個過敏原中，相關係數R亦皆為0.7以上，具有與「Immunocap」的高相關性。
實施例1～8、10～14、17、18、21～24中，在任一種過敏原中，相關係數R亦皆為0.9以上，顯示具有與「Immunocap」的更高相關性。
以過敏檢查藥承載於過敏原固定化擔體之過敏原，雖為萃取過敏原材料所含之蛋白質者，然而過敏原材料多為從自然界得到的情況。因此，由於過敏原原材料之個體不同、採取方法不同，再者萃取時條件不同等原因，實現與「Immunocap」之相關性高的檢查有困難。若根據本發明之過敏原固定化擔體，即使如鳥居藥品、GREER公司、Biostir公司般，過敏原製造者不同，過敏原材料之個體或萃取條件不同，亦顯示具有與「Immunocap」的高相關性。
又，在實施例1～24中，對於任一項目之過敏原，關於陰性與陽性之分界的等級0及等級1之檢體，螢光強度比皆為1.5倍以上，顯示若根據本發明之過敏原固定化擔體，可實施高靈敏度、正確的過敏檢查。
在實施例1～9、14～20、24中，對於任一項目之過敏原，關於陰性與陽性之分界的等級0及等級1之檢體，螢光強度比皆為2倍以上，進一步顯示可實施高靈敏度、正確的過敏檢查。
如實施例1～24所示，若根據使用本發明之擔體，相關係數R為0.7以上，與「Immunocap」相關性高，並且等級0及等級1之檢體，螢光強度比為1.5倍以上，可進行高靈敏度、正確的測定。再者，如實施例1～8、14、17、18、24所示，若使用以密度180ng/cm 2以上300ng/cm 2以下固定有過敏原之擔體，相關係數R成為0.9以上，與「Immunocap」之相關性更高，並且等級0及等級1之檢體，螢光強度比為2倍以上，可進行更高靈敏度、正確的測定。
另一方面，如比較例1～9所示，在過敏原固定化密度低於120ng/cm 2之擔體、或過敏原固定化密度高於500ng/cm 2之擔體，顯示無法兼具可在相關係數為0.7以上、及等級0檢體與等級1檢體之螢光強度比為1.5倍以上測定。
又，在實施例1～11、13～24中所用之擔體A、B、D、E、F，任一個皆為將複數種過敏原(蛋白過敏原、牛乳過敏原、落花生過敏原、蟎過敏原之中2種以上)固定化於設置在1個反應槽內之複數個凸部上面，且為使用該擔體且同時實施複數種過敏原特異性IgE的測定者。若使用本發明之擔體，對於多項目之過敏原，顯示可同時實施與「Immunocap」之相關性高，且高靈敏度、正確的測定。
1:擔體 2:反應槽 3:凸部 4:過敏原固定化區域
圖1為呈示本發明之設有反應槽的擔體之例的圖。 圖2為呈示本發明之設有反應槽的擔體之例的圖，其中該反應槽於上面具有複數個固定有過敏原的凸部。
1:擔體 2:反應槽 3:凸部 4:過敏原固定化區域

Claims (12)

  1. 一種用於檢測過敏原特異性抗體之過敏原固定化擔體，其係過敏原被固定化於過敏原固定化區域之擔體，其中過敏原係以密度180ng/cm2以上300ng/cm2以下被固定，前述過敏原之中至少1種為蛋白、牛乳、落花生或蟎中任一者。
  2. 如請求項1之過敏原固定化擔體，其中在前述擔體中設置凸部，該凸部為前述過敏原固定化區域。
  3. 如請求項1或2之過敏原固定化擔體，其中2種以上100種以下之過敏原被固定化於過敏原固定化區域。
  4. 如請求項1或2之過敏原固定化擔體，其中前述過敏原經由包含式(Ia)或(Ib)所示之單元的聚合物而被固定化；式(Ia)及式(Ib)中，R1表示碳數1～4之伸烷基，R2表示R3、OR4或NHR5，R3及R5各自獨立地表示氫原子或碳數1～4之烷基，R4表示碳數1～4之烷基，R6表示碳數1～2之伸烷基，R7及R8各自獨立地表示氫原子或碳數1～4之烷基。
  5. 如請求項2之過敏原固定化擔體，其中設置包含前述凸部的反應槽。
  6. 如請求項1或2之過敏原固定化擔體，其中前述擔體為包含脂肪族結構之樹脂製。
  7. 如請求項1或2之過敏原固定化擔體，其中前述擔體為包含酯之樹脂製。
  8. 如請求項1或2之過敏原固定化擔體，其中前述擔體為丙烯酸系樹脂製。
  9. 如請求項1或2之過敏原固定化擔體，其中前述擔體為聚丙烯酸酯製或聚甲基丙烯酸酯製。
  10. 一種過敏原特異性抗體之檢測方法，其包含：使檢體接觸於如請求項1至9中任一項之過敏原固定化擔體，形成該過敏原與在檢體中所含的該過敏原特異性IgE抗體之複合體的步驟；及檢測該形成之過敏原與過敏原特異性IgE抗體之複合體的步驟。
  11. 如請求項10之過敏原特異性抗體之檢測方法，其中前述檢體為選自由IgG抗體、IgM抗體、IgA抗體及IgD抗體所組成之群組中的至少1種抗體被除去之檢體。
  12. 一種擔體之製造方法，其係在擔體設置凸部，且1種以上100種以下之過敏原以密度180ng/cm2以上300ng/cm2以下被固定於前述凸部之方法，其包含將過敏原固定化於擔體之凸部的步驟、及將該被固定化之過敏原定量而測定固定化密度的步驟，前述過敏原之中至少1種為蛋白、牛乳、落花生或蟎中任一者。
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