TWI894965B - 使用影像毛細管等電聚焦以分析樣品基質中蛋白質變異體之方法 - Google Patents

Abstract

本發明揭露的實施態樣係用於分析諸如血管內皮生長因子VEGF捕獲劑(Trap)之蛋白質的電荷變異體之方法、對應該方法的系統、裝置及試劑盒。

Description

使用影像毛細管等電聚焦以分析樣品基質中蛋白質變異體之方法

本揭露之領域為用於分析在樣品基質中諸如血管內皮生長因子VEGF捕獲劑(Trap)之蛋白質的電荷變異體之方法及系統。 相關申請案之交叉參照

本申請案請求於2017年8月18日提出申請之美國專利臨時申請案號62/547,602的優先權，其之整體內容藉由引用而併入本文。 序列表

本申請案包含序列表，其已經通過EFS-Web以ASCII格式提交，並且其全部內容藉由引用而併入本文。在2018年8月15日創建的所述ASCII拷貝命名為REGE-005_001WO_ST25.txt，大小為4,214 bytes。

對於用作生物藥物的各種蛋白質，通常需要對電荷變異體進行分析，因為這種改變會影響藥物活性、穩定性，並且在某些情況下會影響患者的安全性。在產業中進行用於鑑定及特徵化電荷變異體包括離子交換色譜、等電聚焦凝膠電泳和毛細管等電聚焦的例行性方法。由於毛細管等電聚焦的高解析度、減少的樣品體積和快速的處理時間，已發現該方法是可使用的。因此，使用影像毛細管等電聚焦來確定諸如VEGF捕獲劑(Trap)的蛋白質的電荷變異體的方法和系統將是有利的。

本發明所描述用於各種蛋白質的電荷變異體分析的方法及系統。例如，使用該方法及系統分析VEGF捕獲劑的電荷變異體。取代目前已批准的用於分析VEGF捕獲劑的等電聚焦凝膠電泳之方法，其係經由膠行(bands)3-9分組來報告電荷變異體之分佈，本文所描述的方法及系統通常使用影像毛細管等聚焦以電荷變異體同功型的百分比來報告電荷異質性(heterogeneity)，以及將他們分組成三個不同的電泳圖(electropherogram)區。該報告方法可以更靈敏於發生在VEGF捕獲劑樣品的同功型之改變。

承如上述，本說明書的實施例係為用於確認蛋白質電荷變異體之方法、系統及裝置，以及特別是，例如是影像毛細管等聚焦(iCIEF)分析以評估例如是血管內皮生長因子(VEGF)阻斷劑(blocker)之蛋白質的電荷變動，本文之後係指「VEGF捕獲劑」。iCIEF係一種替代目前已批准的用於VEGF捕獲劑電荷變異體分析之等電聚焦(IEF)方法。

iCIEF的實施例對應於基於蛋白質電荷變異體的等電點(pI)來分離該蛋白質電荷變異體之技術。例如，在一些實施例中，蛋白質樣品係加載至包含載體兩性電解質(ampholyte)(例如Pharmalyte ^TM)、甲基纖維素以及穩定添加劑(例如尿素)之混合物的分離的毛細管。在預定時間段內施加電壓會導致在該毛細管內的載體兩性電解質形成pH梯度。在一些實施例中，施加第二電壓，對應於「聚焦」時間的較長時間段。這導致蛋白質電荷變異體在毛細管內遷移，直到達到變異體的總電荷為中性的點(即其pI)。

在一些實施例中，毛細管微管(其具有氟碳(FC)塗層)係與數位(例如CCD)相機相連，該相機能夠直接檢測及量化該蛋白質的電荷變異體。尤其是，在聚焦時間之後，該CCD相機被配製以成像毛細管微管(較佳為即時(real time))而檢測在毛細管內的蛋白質。在一些實施例中，發生在約280 nm波長下。該技術的參數包含： -　兩性電解質品牌及濃度， -　使用的添加劑的類型及濃度，以及 -　聚焦時間及樣品濃度。

在毛細管內蛋白質的聚集及沉澱對電泳圖的再現性是有害的。因此，可用使用添加劑(例如是尿素)以助於在聚焦時該蛋白質的穩定及溶解。

因此，在一些實施例中，提供一種用於分析血管內皮生長因子VEGF捕獲劑(Trap)的電荷變異體之方法且將蛋白質樣品加載至具有至少載體兩性電解質、甲基纖維素以及穩定添加劑的混合物的分離之毛細管，在第一預定時間段內施加第一電壓以使在該毛細管內的載體兩性電解質形成pH梯度，在第二預定時間段內施加第二電壓以聚焦在該毛細管內的蛋白質之電荷變異體的遷移至其等電點，以及檢測及量化該蛋白質之電荷變異體。

在一些實施例中，檢測及量化電荷變異體包含測量複數個電荷變異體同功型的吸光值、將複數個電荷變異體同功型分離成包含至少第一酸/酸性區域(R1)、第二中性區域(R2)、以及第三鹼性/鹼性區域(R3)的分離區域；以及確定落入R1、R2以及R3區域的每個區域內的該電荷變異體同功型的百分比。

對於該些實施例，用於檢測及量化的影像分析可依據例行性的方法及系統(例如是影像分析軟體)。

在以上概述的實施例中，可以包括以下其它的特徵/功能的一個及/或另一個(在更進一步的發明實施例中得到)，然而，應該指出在這些特徵中的任何一個或多個各可以是不同的但仍在本發明的範圍內-以下提供的列表僅為一個實施例： -　進行電荷變異體的檢測及量化； -　該電荷變異體的檢測發生在約280 nm的波長下； -　加載至該毛細管微管的蛋白質濃度為約2.0 mg/ml； -　該穩定添加劑包含尿素； -　該混合物中尿素的量包含約2 M； -　該混合物包含0.35%甲基纖維素； -　該第一電壓包含1500 V； -　該第一預定時間段為約1分鐘； -　該第二電壓包含3000 V； -　該第二預定時間段為約7分鐘； -　加載至該毛細管微管的蛋白質濃度係在約1.0以及8.0 mg/ml之間； -　在該混合物中尿素的量係大於0M且小於約8M； -　該混合物包含在約0.01%以及約0.35%之間的甲基纖維素； -　該第一電壓係在約1 V以及約3000 V之間、或任何其中的範圍； -　該第一預定時間段係在約1秒以及約5分鐘之間、或任何其中的範圍； -　該第二電壓係在約1 V以及約3000 V之間、或任何其中的範圍；以及/或 -　該第二預定時間段係在約1分鐘以及約14分鐘之間、或任何其中的範圍。

在一些實施例中，提供一種配置用於VEGF捕獲劑的電荷變異體分析的iCIEF毛細管微管，且包含配置毛細管微管以接受蛋白質，其並配置有載體兩性電解質、甲基纖維素以及穩定添加劑的混合物。該毛細管微管包含氟碳塗料。

在一些實施例中，提供一種配置用於VEGF捕獲劑的電荷變異體分析的iCIEF試劑盒且包含配置一個或多個毛細管微管以接受蛋白質，其並配置有載體兩性電解質、甲基纖維素以及穩定添加劑的混合物，其中該毛細管微管包含氟碳塗料。

本發明所描述用於例如是VEGF捕獲劑的各種蛋白質的電荷變異體分析的方法及系統。VEGF捕獲劑為包含顯示於表1之序列的融合蛋白。取代目前已批准的用於分析VEGF捕獲劑的等電聚焦凝膠電泳之方法，其係經由膠行(bands)3-9分組來報告電荷變異體之分佈，本文所描述的方法及系統通常使用影像毛細管等聚焦以電荷變異體同功型的百分比來報告電荷異質性，以及將他們分組成三個不同的電泳圖(electropherogram)區。如先前所述，該報告方法可以更靈敏於發生在VEGF捕獲劑樣品的同功型之改變。

在整個本文中使用以下縮寫： -　iCIEF-影像毛細管等聚焦 -　IEF-等聚焦 -　pI-等電點 -　RS-參考標準品 -　DS-藥物原料 -　DSI-藥物原料中間物 -　FDS-經調配的藥物原料

該用於分析VEGF捕獲劑的電荷變異體通常包含加載蛋白質樣品至具有至少載體兩性電解質、甲基纖維素以及穩定添加劑的混合物的分離之毛細管，在第一預定時間段內施加第一電壓以使在該毛細管內的載體兩性電解質形成pH梯度，在第二預定時間段內施加第二電壓以聚焦在該毛細管內的蛋白質之電荷變異體的遷移，使得該變異體的總電荷是中性的，以及檢測及量化該蛋白質之電荷變異體。

該分離的毛細管可加載約0.5 mg/mL至約2 mg/mL濃度範圍的VEGF捕獲劑。例如，該分離的毛細管可加載約0.5 mg/mL、約1.0 mg/mL、約1.5 mg/mL、或約2 mg/mL濃度的VEGF捕獲劑。在一些實施例中，該分離的毛細管可加載約1.0 mg/mL濃度的VEGF捕獲劑。

在混合物中甲基纖維素的量可在約0.01%至約0.35%的範圍內。例如，在混合物中甲基纖維素的量可為約0.01%、約0.05%、約0.10%、約0.15%、約0.20%、約0.25%、約0.30%或約0.35%。在一些實施例中，在混合物中甲基纖維素的量可為約0.35%。

關於第一電壓，其可在約1 V至約3000 V的範圍內。例如，該第一電壓可為約1 V、約100 V、約500 V、約1000 V、約1500 V、約2000 V、約2500 V、或約3000 V。在一些實施例中，該第一電壓為約1500 V。

關於第二電壓，其可在約1 V至約3000 V的範圍內。例如，該第二電壓可為約1 V、約100 V、約500 V、約1000 V、約1500 V、約2000 V、約2500 V、或約3000 V。在一些實施例中，該第二電壓為約3000 V。

該第一預定時間段可在約1秒至約5分鐘之範圍內。例如，該第一預定時間段可為約1秒、約10秒、約20秒、約30秒、約40秒、約50秒、約1分鐘(60秒)、約1.5分鐘(90秒)、約2分鐘(120秒)、約2.5分鐘(150秒)、約3分鐘(180秒)、約3.5分鐘(210秒)、約4分鐘(240秒)、約4.5分鐘(270秒)、或約5分鐘(300秒)。在一些實施例中，該第一預定時間段為約1分鐘(60秒)。

該第二預定時間段可在約1分鐘至約14分鐘之範圍內。例如，該第二預定時間可為約1分鐘、約2分鐘、約3分鐘、約4分鐘、約5分鐘、約6分鐘、約7分鐘、約8分鐘、約9分鐘、約10分鐘、約11分鐘、約12分鐘、約13分鐘、或約14分鐘。在一些實施例中，該第二預定時間為約7分鐘。

可在該混合物中使用任何合適的添加劑。在一些實施例中，使用尿素作為添加劑為有益的。例如，2M尿素可能有利於包含在該混合物中。各種試劑(兩性電解質)亦可包含在該混合物中，如以下進一步描述。在一實施例中，加載1.0 mg/mL濃度的VEGF捕獲劑至毛細管，以及使用影像毛細管等聚焦方法分析，該方法使用0.35%甲基纖維素、2M尿素、以及具有3-10 pI 3%兩性電解質的混合物。

試劑及設備。以下表2所列為依據本文之一些實施例的試劑(兩性電解質)及設備。範例以iCE3 (ProteinSimple®)電荷變異體分析儀進行。除非另有說明，在方法開發及表徵期間使用VEGF捕獲劑參考標準品(RSVITV-5)作為測試物。 至少一些實施例的範例：

最初基於pI範圍及兩性電解質的來源進行兩性電解質的篩選。從三個不同來源獲得的四個兩性電解質，每個都包含特定的pI範圍。該兩性電解質係使用以下起點分析： -　2.0 mg/mL蛋白質濃度， -　2 M尿素， -　0.35%甲基纖維素， -　在1500 V下預聚焦1分鐘，以及 -　在3000 V下聚焦7分鐘。

圖1A-F說明使用iCE3電荷分析儀以六個範圍的兩性電解質獲得的電泳圖。以下使用兩性電解質範圍： 圖A-3-10 Pharmalyte         圖B-5-8/8-10.5 combo Pharmalyte 圖C-2-9 Servalyt              圖D-4-9 Servalyt 圖E-Bio-Lyte 3-10, 40%     圖F-3-3-10的Blend以及6.7-7.7 Pharmalyte

選用蛋白質。選用pI 3-10範圍的兩性電解質作為iCIEF電泳圖的整體表現(profile)，因為其與目前已批准的用於VEGF捕獲劑的電荷變異體分析程序的電泳圖最接近(參閱，如：圖3中所示IEF影像)。

最優化的尿素。最優化的方法，依據一些實施例，亦包含改變尿素濃度(從尿素不存在到高達8M)。圖2A-2E說明該尿素濃度的改變對VEGF捕獲劑RSVITV-5樣品電泳圖的影響。雖然尿素濃度的降低通常會改善解析度，發現增加的尿素(8M)會導致解析度減少。然而，VEGF捕獲劑在天然條件下(不含尿素)具有減少的解析度及缺乏再現性。因此，當分別使用1-3M尿素濃度時，VEGF捕獲劑的所有波形及解析度彼此是可比較的。

使用2 M尿素進行進一步實驗以優化該兩性電解質3-10濃度及蛋白質濃度。圖3說明在1.0 mg/mL蛋白質濃度下使用2M尿素、0.35%甲基纖維素以及3% 3-10兩性電解質獲得的電泳圖。iCIEF電泳圖與另一個電泳圖進行比較，並做成暫時的波峰分配圖(圖3)。

方法特徵。使用iCIEF獲得的整體電荷表現及波形圖，分析方法與IEF膠行表現比\較(如圖2A-2E)。然而，為進一步了解及將IEF分析方法的膠行表現與使用iCIEF分析獲得的波形連結，進行VEGF捕獲劑樣品的OFFGEL分離作用(fractionation)。從OFFGEL電泳獲得的個別電荷變異體分液(fraction)以IEF以及iCIEF分析方法進行分析。使用Agilent 3100 OFFGEL分離儀依等電點分離 VEGF捕獲劑參考標準品，且使用IEF以及iCIEF兩種方法分析依液體分液回收的分離的同功型。使用涵蓋對於VEGF捕獲劑發現的電荷變異體之pI範圍以pH 6-9使用固定pH梯度膠片(IPG strips)進行VEGF捕獲劑RS分離。實驗及分離的詳細設置如下：

1)經由2.3 mL 50%甘油、230.4 µl of IPG緩衝液(pH 6-11)、以及16.64 ml水之組合產生的19.2 ml總體積製備儲存溶液。

2)經由加入73 µg VEGF(4.2 mg)至12 mL儲存溶劑及3 mL水製備VEGF捕獲劑溶液。

3)經由1.15 mL水與4.6 mL儲存溶液(stock solution)之組合過量製備IPG膠片再水合溶液。

4)IPG 凝膠膠片、pH範圍為6-9(24 cm)排列在兩個儀器托盤的每一其他條列中，並將24個孔框架在其上咬合就位。標準的OFFGEL試劑盒步驟(參閱OFFGEL使用手冊：Agilent 3100 OFF GEL分離儀試劑盒快速入門指南，2010年9月第5版)用於膠片再水合、抗體加載、和將托盤裝載到儀器上。

5)使用20℃的平台溫度。用於24孔設置的標準儀器蛋白質聚焦方法使用50 μA的恆定電流進行，最大電壓設置為8000 V以及最大功率設置為200 mW。

6)分離作用34 h之後，該分析停止並且將來自3至12孔的每個條列的孔數合併，然後交換成水，並在分析前濃縮約5倍。

7)經由在Nanodrop超微量分光光度計上利用1.15吸光係數以280 nm吸光值測量來確認每個分液中的抗體量。一種用以測量分液的濃度之儀器，然後將分液的體積乘以濃度。

簡而言之，4.2 mg VEGF捕獲劑RS使用12 IPG膠片進行分離32小時；在透析之後，將來自對應於相同pI範圍之每一膠片的每個分液合併及量化。從分離中作用中，使用IEF及iCIEF分析具有足夠回收率的總共七個分液(分液4-10)。分析該分液的兩個方式：使用IEF及iCIEF分析方法的OFFGEL分液(4-10)的個別分析(參閱圖4)且將OFFGEL分液(5-10)摻入(spiked)至VEGF捕獲劑RS，接著使用IEF及iCIEF分析經摻入之樣品(圖5)。表3列出從OFFGEL分離作用研究所列的分液及回收的對應量。

除了使用IEF和iCIEF單獨分析OFFGEL分液之外，以1：0.1(VEGF捕獲劑RS：分液)的比例摻入(spiked)產生更高回收率的分液(5-10)並經由兩個電荷變異體分析方法分析。圖5顯示使用iCIEF(上圖)和IEF(下圖)分析方法分析的VEGF捕獲劑RS摻入VEGF捕獲劑OFFGEL分液(5-10)的一組電泳圖。對於每個摻入RS的OFFGEL分液，於IEF和iCIEF分析方法中相對應的控制組RS(未摻入)是重疊的。摻入與未摻入(RS+OFFGEL與RS)樣品的重疊有助於可視化及了解IEF和iCIEF測定方法之波峰的圖形的相關性。在每組圖中，對應摻入分液的電荷種類的增強使用從酸性分液(圖5A)開始到鹼性分液(圖5F)的箭頭標示出。

基於IEF膠行圖形的凝膠與基於iCIEF波形的毛細管之間的相關性從OFFGEL分液的分析中是明顯的。從圖4和圖5(每個分液分析與經摻入的分液一起)可以推知經由目前批准的IEF凝膠方法實現的電荷同功型分離與使用基於iCIEF的毛細管方法獲得的VEGF捕獲劑的波形是相當且類似的。

使用iCIEF方法報告電荷變異體分佈。目前批准用於VEGF捕獲劑電荷變異體分佈的IEF方法經由在IEF凝膠中膠行3-9之分組報告電荷變異的百分比。使用例如肌紅蛋白(獨立蛋白質標記物)作為指引以鑑定出基於肌紅蛋白的pI膠行數而總和及報導出膠行3-9的面積百分比。目前說明書IEF方法的目前規範驗收標準(SPEC)為 82%(膠行3-9)。

新的iCIEF分析方法採用類似的方法，其中來自ProteinSimple，pI 7.05標記物Cat＃102226的獨立標記物摻入(spiked)iCIEF混合液(master mix)中(2M尿素、0.35%甲基纖維素、3%3-10兩性電解質)。摻入混合物中的標記物7.05的iCIEF電泳圖顯示在圖6(上圖)，混合物中pI 5.12和pI 9.50範圍的標記物是用於校正之目的。圖5的下圖顯示出VEGF捕獲劑RS的iCIEF電泳圖，其與含有摻入7.05標記物的空白對照組重疊，該標記物將用於鑑定在VEGF捕獲劑iCIEF樣品中的波峰5。標記物波峰7.05在第4波峰和第5波峰之間的pI處遷移，這將用於鑑定VEGF捕獲劑的主要同功型族群中的主要波峰6(波峰5、6以及7)。

不是像IEF方法那樣報告波峰3-9，iCIEF方法(根據一些實施例)報告按照區域1(酸性)、區域2(中性)和區域3(鹼性)分組的電荷變異體同功型的百分比表示的VEGF捕獲劑樣品的電荷異質性。VEGF捕獲劑iCIEF電泳圖中圍繞中性pI範圍遷移並且是最突出的同功型的三個主要波峰(波峰值5,6和7)的群組將被分組為區域2(中性)。如圖7所示，在三個波峰的群組中，使用在空白注射中摻入的獨立的pI 7.05標記物而鑑定出對應於遷移至特定pI的主波峰5的不同同功型。在VEGF捕獲劑iCIEF樣品的區域1(酸性)與VEGF捕獲劑電泳圖中的三個主要波峰(波峰5、6以及7)的群組相比報告為較酸性的波峰組。VEGF捕獲劑iCIEF樣品中的區域3(鹼性)報告為與VEGF捕獲劑電泳圖譜中的三個主要波峰(波峰5、6以及7)的群組相比為較鹼性的波峰組。

使用區域1、2和3的報告方法經由監測三個區域(區域1、2和3)而不是傳統的基於膠行3-9分組的IEF凝膠方法提供更嚴格控制電荷變異體同功型的優點。圖7B說明根據本揭露的iCIEF方法的實施例的報告與IEF報告之間的差異。此外，關於區域1、2以及3之報告提供iCIEF分析方法，其對電荷變異體同功型改變的靈敏度比傳統方法更早得多。這使得iCIEF分析比先前的IEF分析步驟在其解讀上更加靈敏，並且為更具穩定性的代表分析。相反於傳統IEF分析的3-9報告，以下表4提供iCIEF分析方法採用的新分組方法的穩定性代表能力的實施例。經由兩種報告方式(區域分組和與類似的波峰3-9的IEF分析方法)使用新的iCIEF分析能分析加速的(accelerated)VEGF捕獲劑穩定性樣品，並與IEF分析方法的過去的結果進行比較。

在表4(以下)中，可以看出區域1、2以及3分組方式更加靈敏且代表VEGF捕獲劑樣品的電荷變異體分佈的改變。IEF方法顯示關於3-9膠行整體電荷分佈的改變減少2%且該改變是但該改變與當使用3-9波峰方法分組時的iCIEF分析的結果相當。然而，從表4明顯看出在25℃下VEGF捕獲劑的強降解樣品(accelerated stressed sample)，使用iCIEF分析觀察在區域1中(或酸性變異體)增加5%以及區域3(鹼型變異體)同時減少約5%。在iCIEF分析中VEGF捕獲劑電荷分佈係為取決於不同程度的唾液酸化(sialylation)的電荷模式的結構及複雜性，準確反映出VEGF捕獲劑樣品中發生改變的性質。在加速熱應力下使用iCIEF分析方法VEGF捕獲劑樣品的酸性變異體(區域1-高度唾液酸化物質)的增加反映可能的脫醯胺作用與聚集相結合。另一方面，經由IEF方法使用傳統的3-9膠行進行分組會掩蓋VEGF捕獲劑電荷同功型中發生的細微改變，並且幾乎沒有空間來控制不同的電荷種類，使其不像檢測VEGF捕獲劑樣品的電荷異質性的細微改變之方法那樣靈敏。

VEGF捕獲劑具有十個糖基化位點。與這些位點連接的聚醣鏈是支鏈的，並且每個支鏈可以或可以不以負電荷糖單體唾液酸作為末端。在聚醣鏈末端存在唾液酸基團的天然改變導致具有淨電荷範圍的VEGF捕獲劑電荷變異體的整體。這些膠行的比例取決於存在的電荷種類的豐度。因此，基於區域1(重度唾液酸化)、2(中度唾液酸化)、以及3(最少唾液酸化)的各種電荷種類分組的新報告方法使得iCIEF分析對在VEGF捕獲劑樣品的唾液酸形成中發生的改變更具響應性。

穩定性表示iCIEF分析方法的能力。使用跨越24個月的時間段的7個獨立時間點分析VEGF捕獲劑DP樣品的即時穩定性樣品(保持在2-8℃)；表5(下面)顯示對應於該研究的數據。提供這些VEGF捕獲劑獲得樣品的過去的IEF數據作為參考，並與來自區域分組以及3-9波峰報告的VEGF捕獲劑獲得的iCIEF數據進行比較。在2-8℃的即時儲存條件下，基於過去的IEF數據觀察到VEGF捕獲劑樣品幾乎沒有顯著改變，當使用iCIEF 3-9波峰方法報導時觀察到類似的趨勢。

圖8顯示使用iCIEF經過24個月的時間段VEGF捕獲劑的區域%1、2以及3的線性迴歸(linear fit)。從圖中可以看出，隨區域3減少，區域1的小幅度但穩定的增加。

使用新的iCIEF分析方法進行使用強制降解的VEGF捕獲劑DS樣品的額外分析。對於該研究，使用iCIEF方法(區域以及3-9)在0、3、9以及15天時間點分析在45℃下稀釋及應力15天的熱降解的VEGF DS樣品。從表6(下面)可以明顯看出，當使用區域方法分組時，對於強制降解的VEGF捕獲劑樣品，iCIEF分析方法比3-9波峰值報告在更早的時間點觀察到酸性電荷變異體(區域1)的細微增加。雖然%3-9報告顯示3-9個峰的總電荷分佈有2%的改變，但在相同條件下的區域1顯示出7%的增加，而區域3隨著時間的推移伴隨著8%的減少。圖9顯示使用iCIEF分析方法強制降解的VEGF捕獲劑樣品的電泳圖；從表現中可以看出酸性物種的增加。

經由與VEGF非經應力樣品的個別波峰百分比相比，進行VEGF捕獲劑應力樣品的三個區域的%分布的統計分析。圖10A-10C表示關於熱應力VEGF捕獲劑樣品的iCIEF數據之統計分析。分別由區域1及3觀察到統計上的顯著改變。

基於iCIEF分析方法的特性及最優化的數據，分析參數衍生且並列於表7(以下)。該方法條件係關於線性、準確度(accuracy)、精確度(precision)以及中間精度。

iCIEF 分析方法鑑定。iCIEF分析方法的線性。方法線性由單一分析人員評估。使用VEGF捕獲劑參考標準品以0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL以及2.0 mg/mL的不同蛋白質濃度製備樣品溶液。在實驗中，樣品基質中的蛋白質濃度在0.5至2 mg/mL之間改變，同時保持其他基質組分恆定在3%兩性電解質3-10以及0.35%甲基纖維素。聚焦時間也保持恆定在1+7分鐘。表8概述在VEGF捕獲劑樣品的區域1,2和3的百分比分佈，線性範圍為0.5-2.0 mg/mL。圖11中提供作為VEGF捕獲劑樣品的面積計算函數的濃度的線性圖。

基於回歸分析，該分析證明以R2＞0.99在0.5 mg/mL至2.0 mg/mL的蛋白質濃度範圍內可接受的線性關係。此外，同功型分佈在相同的濃度範圍內保持一致。這表示該測定能夠在0.5至2.0 mg/mL的蛋白質濃度範圍內提供波形面積和同功型分佈一致結果。

iCIEF分析方法的精確度。經由與1.0 mg/mL的正常濃度比較，使用線性數據基於稀釋比例評估方法準確度。基於線性數據的稀釋回收率顯示在下表9中。計算回收率百分比使用=(測量面積百分比/正常面積百分比)×100%。

關於VEGF捕獲劑樣品基於在0.5 至 2.0 mg/mL蛋白質濃度的稀釋比例的回收率是在三個區域的98%至101%之內。

iCIEF方法的中間精度分析。中間精密度由兩個獨立的分析人員(A、B)使用他們各自的試劑製劑和使用兩個iCE3電荷變異體分析儀器在4天內對VEGF捕獲劑RS樣品進行評估。分析結果列於下表10中。

當由不同分析人員使用不同的試劑製劑執行時，所提出的VEGF捕獲劑iCIEF分析方法證明可接受的精確度。計算整體%RSD，並且所有三個區域的RSD均在2%之內。

iCIEF分析方法的穩健性。經過各種實驗評估分析方法穩健性的幾個要素。這些實驗列於表11中。

製備的溶液在機器中的穩定性。通過製備樣品基質中的參考標準樣品並使用iCIEF分析樣品來評估溶液穩定性。在10℃下在含有3%兩性電解質3-10、0.35%甲基纖維素以及2M尿素組成的基質中分析後，將樣品儲存在iCE3儀器中。約24小時後再次分析樣品。每種分析的同功型分佈如下表12所示。

在基於在每個時間點觀察到的範圍(最大值和最小值)計算在T=0和在T=24小時分析的樣品之間的絕對差異。三個區域的絕對差值等於或小於0.5%。這表示樣品在10℃下儲存在iCE3電荷變異體分析儀中時，樣品在基質中穩定性長達24小時。

兩性電解質(3-10)樣品的評價。分析來自一個來源的3-10兩性電解質的幾個樣品。可比較使用不同樣品分析的VEGF捕獲劑樣品的總電荷變異體的表現。對於一些兩性電解質樣品，在區域1中觀察到波峰圖形的電泳圖圖形的微小差異，然而，百分比分佈是相似的並且在分析變異性內。來自三個兩性電解質樣品的代表性電泳圖顯示在圖12中。

範例-使用新的iCIEF分析技術過去的VEGF捕獲劑釋放樣品(DS、FDS以及DSI)分析方法

為了進一步建立iCIEF分析方法的穩健性，使用兩個兩性電解質的樣品以iCIEF分析總共37個獨立的過去的VEGF捕獲劑樣品，這些樣品在其譜系(genealogy)中不相關。該分析包括15 VEGF捕獲劑DSI(藥物原料中間體、含有5 mM磷酸鈉、5 mM檸檬酸鈉以及100 mM氯化鈉的水溶液緩衝溶液，pH 6.2)、10 VEGF捕獲劑DS樣品(藥物原料SPEC C701、含有10 mM磷酸鈉的水性緩衝溶液，pH 6.2)以及12 VEGF捕獲劑FDS樣品(經調配的原始原料、含有10 mM磷酸鈉、40 mM氯化鈉，0.03 %(w/v)聚山梨醇酯20和5%(w/v)蔗糖的SPEC C713水溶液緩衝溶液，pH 6.2)。使用iCIEF分析方法分析這些VEGF捕獲劑樣品。

兩性電解質是不同類型的兩性化合物的混合物，其等電點光譜在3和10之間，有助於在電場的影響下建立pH梯度。在iCIEF測定方法中使用的兩性電解質3-10購自通常分批生產的同一來源。根據供應商的建議以及我們對其他蛋白質的iCIEF分析的使用知識，已經觀察到不同樣品之間的輕微改變且是無法避免的。因此，為了在不同的兩性電解質樣品上建立新的iCIEF分析的穩定性，分析兩性電解質的兩個樣品。使用所提出的區域分組方法(R1、R2和R3)並且還基於類似於IEF分析方法的3-9波峰分組來分析來自DS、DSI和FDS產品階段的VEGF樣品。圖13A-13C顯示對於VEGF捕獲劑DS、DSI和FDS樣品的兩性電解質樣品的統計分析作為區域%1、2和3以及波峰3-9的函數。對於兩性電解質樣品之一，對應於37種VEGF捕獲劑樣品的數據提供在表13中。表14-16提供37個樣本的完整數據組。

基於針對區域1、2和3以及3-9分組方法的收集兩性電解質樣品的數據來進行配對分析(圖13D)。來自匹配對分析的數據用於比較兩個兩性電解質之間的平均值，並評估由於兩性電解質樣品的固有差異而可能觀察到的分析報告的任何差異。基於該數據，可以推斷，當區域報告時，三個區域R1、R2以及R3的樣品之間的最大觀察到的平均差異小於0.1%。此外，基於p值可以得出結論，使用區域方法兩個兩性電解質樣品之間跨越區域1、2和3的%分佈沒有統計學意義。

然而，當使用類似於IEF分析方法的3-9波峰分組方法分析DS、DSI和FDS樣品的VEGF捕獲劑數據組時，在一些兩性電解質樣品之間注意到統計學顯著性差異。例如，在一些樣品之間，當以iCIEF分析方法的波峰3-9報告時，平均差異高達4.8%。圖13A-13D顯示了使用不同的兩性電解質樣品獲得的iCIEF表現，並且從圖像中可以明顯看出，兩種電解質樣品之間觀察到的變異性局限於酸性區域，並且經由區域1、2和3分組，可變性會被掩蓋。這使得iCIEF分析報告的區域方法成為一種強大且可重複的方法。

基於區域%1、2及3分組使用兩性電解質樣品從DSI、DS以及FDS樣品分析獲得的數據使iCIEF分析為更強大的分析方法。

因此，在iCIEF系統中，在本文提供的方法及裝置定量VEGF捕獲劑藥物原料、藥物原料中間物、經調配的藥物原料以及藥物產品的電荷變異體表現。該實施例可取代目前核准的用於VEGF捕獲劑電荷異質性分析之基於IEF的凝膠方法。

使用OFFGEL 3100分離儀分離的VEGF捕獲劑電荷變異體能夠證明在基於iCIEF的毛細管分析方法中獲得的波峰與基於IEF的凝膠分析步驟中分辨的膠行之間的相關性。經由分別分析OFFEGEL電泳的VEGF捕獲劑分液並經由研究中的峰值，實現單個iCIEF波峰與VEGF捕獲劑電荷變異體的IEF膠行的直接比較。研究證實，新的iCIEF分析步驟能夠解析出先前使用基於IEF的凝膠方法以相同且更精確的方式解析的所有電荷變異體同功型。

因此，基於本文揭露的區域1、2及3的百分比分佈的報告方法之一些實施例可允許用於控制所有VEGF捕獲劑同功型，且使該分析代表穩定性代表分析。

本文還描述與iCEF方法一起使用的毛細管微管。通常，配置iCIEF毛細管微管以用於VEGF捕獲劑的電荷變異體分析，並且包括配置成接收蛋白質的毛細管，並配置有載體兩性電解質、甲基纖維素以及穩定添加劑的混合物。毛細管微管亦包括氟碳塗料。

在一些實施例中，提供配置用於VEGF捕獲劑的電荷變異體分析的iCIEF試劑盒，以及包含一或多個配置以接受蛋白質的毛細管微管、且配置具有載體兩性電解質、甲基纖維素以及穩定添加劑的混合物，其中該毛細管微管包括氟碳塗料。

雖然本文已經描述和說明各種發明實施例，但是本發明技術領域中具有通常知識者將容易想到用於執行功能及/或獲得結果的各種其他裝置及/或結構及/或一個或多個本文描述的優點以及這些改變和/或修飾中的每一個被認為是在本文描述的發明實施例的範圍內。更一般地，本發明技術領域中具有通常知識者將容易理解本文所述的所有參數、數量、百分比、濃度、尺寸、材料及組態是一個範例，並且實際參數、數量、百分比、濃度、尺寸、材料及/或組態將取決於使用本發明教示的特定應用或應用。本發明技術領域中具有通常知識者將認識到或者能夠使用不超過常規的實驗確定本文所述的具體發明實施方案的許多等同物。因此，應該理解，前述實施例僅作為示例呈現。本文公開的發明實施例可以不同於具體描述和請求的方式實施。本公開的發明實施例還包括本文描述的各個特徵、系統、物品、材料、試劑盒和方法。此外，兩個或更多個這樣的特徵、系統、物品、材料、試劑盒和方法的任何組合也是創造性的(如果這些不相互矛盾)。一些實施例可以與現有技術區別開來，以明確地缺少一個或多個特徵/元件/功能(即，針對該些實施例的請求項可能包括否定限制)。

各種發明構思可以一種或多種方法實施。執行為方法之部分之動作可以任何適合方式排序。因此，可構造其中以不同於所圖解說明之一次序執行動作之實施例，其可包含同時執行某些動作(即使在說明性實施例中展示為順序動作)。

對本申請案中任何地方呈現的公開文獻或其他文獻的任何及所有參考文獻，其之整體內容藉由引用而併入至本文中。此外，如本文中定義和使用的所有定義應理解為控制以超過字典定義，藉由引用併入的文獻中的定義，及/或定義的術語的普通含義。

[圖1A至1F]使用不同兩性電解質產生之VEGF捕獲劑電泳圖。在圖1A，該兩性電解質為具有3-10 pI範圍的Pharmalyte™；在圖1B，該兩性電解質為具有5-8 pI範圍的Pharmalyte™與具有8-10.5 pI範圍的Pharmalyte™之組合；在圖1C，該兩性電解質為具有2-9 pI範圍的Servalyt™；在圖1D，該兩性電解質為具有4-9 pI範圍的Servalyt™；在圖1E，該兩性電解質為具有3-10 pI範圍的Biolyte™；以及圖1F，該兩性電解質為具有3-10 pI範圍的Pharmalyte™以及具有6.7-7 pI範圍的Pharmalyte™之組合。

[圖2A至2E]比較在改變尿素濃度下VEGF捕獲劑的電泳圖。

[圖3]比較使用等聚焦及影像毛細管等聚焦方法所獲得的VEGF捕獲劑的電泳圖。

[圖4A至4G]說明使用等聚焦及影像毛細管等聚焦方法的VEGF捕獲劑OFFGEL分液分析(分液#5至#10)。

[圖5A至5F]說明分析將VEGF捕獲劑RS摻入在圖4A至4G中VEGF捕獲劑OFFGEL分液(分液#5至#10)的電泳圖。

[圖6]比較空白組與摻入獨立標記物的獨立標記物及VEGF捕獲劑的電泳圖。

[圖7A]表示具有指定區域1、2及3的VEGF捕獲劑RS樣品的影像毛細管等聚焦電泳圖。

[圖7B]說明等聚焦方法及影像毛細管等聚焦方法之間的電泳圖報告之差異。

[圖8]提供使用關於VEGF捕獲劑穩定性的影像毛細管等聚焦所獲得的數據。

[圖9]提供在強制降解VEGF捕獲劑樣品上進行使用影像毛細管等聚焦的穩定性數據。

[圖10A至10C]顯示在圖9提供的影像毛細管等聚焦數據的統計分析。

[圖11]提供關於影像毛細管等聚焦方法的線性數據。

[圖12]比較兩性電解質的三個樣品關於影像毛細管等聚焦之電泳圖。

[圖13A至13D]顯示過去的VEGF捕獲劑樣品獲得的影像毛細管等聚焦數據的統計分析。

Claims (10)

1. 一種用於分析血管內皮生長因子VEGF捕獲劑(Trap)蛋白質的電荷變異體改變之方法，該方法包含： 將包含該VEGF捕獲劑蛋白質之蛋白質樣品加載至毛細管上，該毛細管包含2 M尿素、0.35%甲基纖維素及3%具有pI為3至10之兩性電解質； 施加1500 V之第一電壓達1分鐘以使在該毛細管內的該兩性電解質形成pH梯度； 施加3000 V之第二電壓達7分鐘以聚焦在該毛細管內的該VEGF捕獲劑蛋白質之電荷變異體的遷移，使得該變異體的總電荷是中性的； 產生包含對應電荷變異體同功型的複數個波峰之電泳圖，該複數個波峰包含9個波峰，該9個波峰包括3個主要波峰；及 檢測及量化該VEGF捕獲劑蛋白質之電荷變異體，該檢測及量化包含： (i) 測量複數個電荷變異體同功型的吸光值； (ii) 將該複數個電荷變異體同功型分離成分離區域，該分離區域包含至少第一酸/酸性區域(R1)、包含該3個主要波峰之第二中性區域(R2)及第三鹼/鹼性區域(R3)；及 (iii) 測定落入R1、R2及R3區域的每個區域內之電荷變異體同功型的百分比。
2. 如請求項1之方法，其中該VEGF捕獲劑蛋白質包含SEQ ID NO：1之序列。
3. 如請求項1之方法，其中該電荷變異體的檢測發生在280 nm的波長下。
4. 如請求項1之方法，其中加載至該毛細管的VEGF捕獲劑蛋白質濃度係介於1.0至8.0 mg/ml之間或其中任何範圍。
5. 如請求項4之方法，其中加載至該毛細管的VEGF捕獲劑蛋白質濃度係1.0 mg/ml。
6. 如請求項4之方法，其中加載至該毛細管的VEGF捕獲劑蛋白質濃度係2.0 mg/ml。
7. 如請求項1之方法，其中該毛細管包括氟碳塗料。
8. 如請求項1之方法，其中該第二中性區域(R2)之該3個主要波峰係與獨立標記物波峰相比經鑑定。
9. 如請求項1之方法，其中該電荷變異體改變包含該VEGF捕獲劑蛋白質之唾液酸化的改變。
10. 如請求項1之方法，其進一步包含： (i) 於最初時間點測定落入R1、R2及R3區域的每個區域內之電荷變異體同功型的百分比； (ii) 保持該蛋白質樣品於2-8℃下達至24個月；及 (iii) 於第二時間點測定落入R1、R2及R3區域的每個區域內之電荷變異體同功型的百分比。