TWI894742B

TWI894742B - 抗CD79b抗體及其用途

Info

Publication number: TWI894742B
Application number: TW112150202A
Authority: TW
Inventors: 建輝周; 金澤李; 勝振濤; 潔胡; 馬丁特里德; 黄甦; 維韋卡南達凱達奇
Original assignee: 美商Ｌｔｚ治療股份有限公司
Priority date: 2022-12-29
Filing date: 2023-12-22
Publication date: 2025-08-21
Also published as: CN118271439A; TW202542200A; CN118271439B; TW202432604A

Abstract

本發明內容涉及抗CD79b (分化簇79B) 抗體、其抗原結合片段、源自其的抗體-藥物綴合物(ADC)及其用途。

Description

抗CD79b抗體及其用途

本發明內容涉及抗CD79b(分化簇79B)抗體、其抗原結合片段、源自其的抗體-藥物綴合物(ADC)及其用途。

CD79是B細胞受體的信號傳導成分，作為包含CD79a和CD79b的共價異二聚體發揮作用。CD79b包含細胞外免疫球蛋白(Ig)結構域、跨膜結構域和細胞內信號傳導結構域、基於免疫受體酪胺酸的啟動基序(ITAM)結構域。幾乎所有非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴細胞白血病(ALL)和慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者的表面均檢測到CD79b表達。

由於多種原因，CD79b是B細胞惡性腫瘤的一個有吸引力的治療靶點。首先，CD79b不僅在B細胞惡性腫瘤中廣泛表達，而且CD19或CD20缺失後表達不變，使該受體成為除CD19或CD20靶向治療之外的有吸引力的靶向治療替代方案。其次，當B細胞受體交聯時，它會靶向主要組織相容性複合物II類隔室，即類似溶酶體的隔室，作為B細胞呈遞II類抗原的一部分。

鑒於CD79b在癌症中的重要作用，需要開發靶向CD79b的治療劑。

本發明涉及抗CD79b抗體、其抗原結合片段及其用途。

一方面，本發明內容涉及結合CD79b(分化簇79B)的抗體或其抗原結合片段，其包含：一個包含互補決定區(CDR)1、2和3的重鏈可變區(VH)，其中VH CDR1區包含與所選VH CDR1胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列，VH CDR2區包含與所選VH CDR2至少80%相同的胺基酸序列，並且VH CDR3區包含與所選VH CDR3至少80%相同的胺基酸序列；和一個包含CDR 1、2和3的輕鏈可變區(VL)，其中VL CDR1區包含與所選VL CDR1至少80%相同的胺基酸序列，VL CDR2區包含與所選VL CDR2至少80%相同的胺基酸序列，並且VL CDR3區包含與所選VL CDR3至少80%相同的胺基酸序列，其中所選VH CDR 1、2和3的胺基酸序列和所選VL CDR 1、2和3的胺基酸序列是以下之一：(1)所選VH CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：9、11、13，所選VL CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：14~16；(2)所選VH CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：19、21、23，所選VL CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：24~26；(3)選定的VH CDR 1、2、3胺基酸序列分別如SEQ ID NO：29、31、33所示，選定的VL CDR 1、2、3胺基酸序列分別如SEQ ID NO：24~26所示；(4)所選VH CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：39、41、43，所選VL CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：44~46；(5)所選VH CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：49、51、53，所選VL CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：54~56； (6)所選VH CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：59、61、63，所選VL CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：64~66；(7)所選VH CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：10、12、13，所選VL CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：14~16；(8)所選VH CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：20、22、23，所選VL CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：24~26；(9)所選VH CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：30、32、33，所選VL CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：34~36；(10)所選VH CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：40、42、43，所選VL CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：44~46；(11)所選VH CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：50、52、53，所選VL CDR 1、2、3胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：54~56；(12)所選VH CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：60、62、63，所選VL CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：64~66。

在一些實施例中，根據Kabat定義，VH包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：9、11、13，並且VL包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：14~16。

在一些實施例中，根據Kabat定義，VH包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：19、21、23，並且VL包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：24~26。

在一些實施例中，根據Kabat定義，VH包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：29、31、33，並且VL包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：34~36。

在一些實施例中，根據Kabat定義，VH包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：39、41、43，並且VL包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：44~46。

在一些實施例中，根據Kabat定義，VH包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：49、51、53，並且VL包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：54~56。

在一些實施例中，根據Kabat定義，VH包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：59、61、63，並且VL包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：64~66。

在一些實施例中，根據Chothia定義，VH包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：10、12、13，並且VL包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：14~16。

在一些實施例中，根據Chothia定義，VH包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：20、22、23，並且VL包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：24~26。

在一些實施例中，根據Chothia定義，VH包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：30、32、33，並且VL包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：34~36。

在一些實施例中，根據Chothia定義，VH包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：40、42、43，並且VL包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：44~46。

在一些實施例中，根據Chothia定義，VH包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：50、52、53，並且VL包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：54~56。

在一些實施例中，根據Chothia定義，VH包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：60、62、63，並且VL包含CDR 1、2、3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：64~66。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段特異性結合人類、小鼠、猴子或狗的CD79b。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段是人源化抗體或其抗原結合片段、單鏈可變片段(scFv)、單臂抗體和/或多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1恆定區、人類IgG2恆定區或人類IgG4恆定區。

一方面，本發明內容涉及包含編碼多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含：(1)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：9、11、13，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(2)免疫球蛋白輕鏈或其包含VL的片段，所述VL包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：14~16，且其中的VL在與包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的VH配對時結合CD79b； (3)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：19、21、23，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(4)免疫球蛋白輕鏈或其包含VL的片段，所述VL包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：24~26，且其中的VL在與包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列的VH配對時結合CD79b；(5)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：29、31、33，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(6)免疫球蛋白輕鏈或其包含VL的片段，所述VL包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：34~36，且其中的VL在與包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VH配對時結合CD79b；(7)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：39、41、43，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(8)免疫球蛋白輕鏈或其包含VL的片段，所述VL包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：44~46，且其中的VL在與包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列的VH配對時結合CD79b；(9)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：49、51、53，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(10)免疫球蛋白輕鏈或其包含VL的片段，所述VL包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：54~56，且其中的VL在與包含SEQ ID NO：47的胺基酸序列的VH配對時結合CD79b；(11)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：59、61、63，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(12)免疫球蛋白輕鏈或其包含VL的片段，所述VL包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：64~66，且其中的VL在與包含SEQ ID NO：57的胺基酸序列的VH配對時結合CD79b；(13)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：10、12、13，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(14)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：20、22、23，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(15)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：30、32、33，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b； (16)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：40、42、43，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(17)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：50、52、53，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：48的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(18)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：60、62、63，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：58的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(19)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：19、21、23，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：70的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(20)免疫球蛋白輕鏈或其包含VL的片段，所述VL包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：24~26，且其中的VL在與包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列的VH配對時結合CD79b；(21)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：20、22、23，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：70的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b； (22)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：39、41、43，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：72的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(23)免疫球蛋白輕鏈或其包含VL的片段，所述VL包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：44~46，且其中的VL在與包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列的VH配對時結合CD79b；(24)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：40、42、43，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：72的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(25)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：49、51、53，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：73的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(26)免疫球蛋白輕鏈或其包含VL的片段，所述VL包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：54~56，且其中的VL在與包含SEQ ID NO：74的胺基酸序列的VH配對時結合CD79b；(27)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：50、52、53，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：73的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(28)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：59、61、63，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：76的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b；(29)免疫球蛋白輕鏈或其包含VL的片段，所述VL包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：64~66，且其中的VL在與包含SEQ ID NO：75的胺基酸序列的VH配對時結合CD79b；(30)免疫球蛋白重鏈或其包含VH的片段，所述VH包含互補決定區(CDR)1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：60、62、63，且其中的VH在與包含SEQ ID NO：76的胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時結合CD79b。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白輕鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VL，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：14~16。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白輕鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VL，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：24~26。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白輕鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VL，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：34~36。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白輕鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VL，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：44~46。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白輕鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VL，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：54~56。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白輕鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VL，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：64~66。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白重鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VH，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：9、11、13。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白重鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VH，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：19、21、23。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白重鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VH，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：29、31、33。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白重鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VH，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：39、41、43。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白重鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VH，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：49、51、53。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白重鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VH，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：59、61、63。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白重鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VH，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：10、12、13。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白重鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VH，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：20、22、23。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白重鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VH，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：30、32、33。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白重鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VH，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：40、42、43。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白重鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VH，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：50、52、53。

在一些實施例中，所述核酸包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含免疫球蛋白重鏈的多肽或其片段，所述多肽包含CDR 1、2和3的VH，所述CDR 1、2和3的胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：60、62、63。

在一些實施例中，VH在與VL配對時特異性結合人類、小鼠、猴子或狗的CD79b，或者VL在與VH配對時特異性結合人類、小鼠、猴子或狗的CD79b。

在一些實施例中，免疫球蛋白重鏈或其片段包含人免疫球蛋白重鏈片段(例如，人IgGl重鏈CH1、CH2和/或CH3，人IgG2重鏈CH1、CH2和/或CH3，或人IgG4重鏈CH1、CH2和/或CH3)，並且免疫球蛋白輕鏈或其片段包含人免疫球蛋白輕鏈恆定區。

在一些實施例中，核酸編碼單鏈可變片段(scFv)、單臂抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)或嵌合抗原受體(CAR)。

在一些實施例中，核酸是cDNA。

一方面，本發明內容涉及包含本文所述的一種或多種核酸的載體。

一方面，本發明內容涉及包含兩種本文所述核酸的載體，其中所述載體編碼一起結合CD79b的VL區和VH區。

一方面，本發明內容涉及一對載體，其中每個載體包含本文所述核酸之一，其中該對載體共同編碼並結合到CD79b的VL區和VH區。

一方面，本發明內容涉及包含本文所述載體或本文所述載體對細胞。

在一些實施例中，細胞是CHO細胞。

一方面，本發明內容涉及包含本文所述的一種或多種核酸的細胞。

一方面，本發明內容涉及包含兩種本文所述核酸的細胞。

在一些實施例中，所述兩種核酸共同編碼並結合到CD79b的VL區和VH區。

一方面，本發明內容涉及產生抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括(a)在足以使細胞產生抗體或抗原結合片段的條件下培養本文所述的細胞；和(b)收集細胞產生的抗體或抗原結合片段。

一方面，本發明內容涉及結合CD79b的抗體或其抗原結合片段，其包括重鏈可變區(VH)包含與所選VH序列至少90%相同的胺基酸序列，和輕鏈可變區(VL)包含與所選VL序列至少90%相同的胺基酸序列，其中所選VH序列和所選VL序列為以下之一：(1)所選VH序列為SEQ ID NO：7，所選VL序列為SEQ ID NO：8；(2)所選VH序列為SEQ ID NO：17或69，所選VL序列為SEQ ID NO：18或70；(3)所選VH序列為SEQ ID NO：27，所選VL序列為SEQ ID NO：28；(4)所選VH序列為SEQ ID NO：37或71，所選VL序列為SEQ ID NO：38或72；(5)所選VH序列為SEQ ID NO：47或73，所選VL序列為SEQ ID NO：48或74；(6)所選VH序列為SEQ ID NO：57或75，所選VL序列為SEQ ID NO：58或76。

在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：7的序列並且VL包含SEQ ID NO：8的序列。

在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：17的序列並且VL包含SEQ ID NO：18的序列。

在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：27的序列並且VL包含SEQ ID NO：28的序列。

在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：37的序列並且VL包含SEQ ID NO：38的序列。

在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：47的序列並且VL包含SEQ ID NO：48的序列。

在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：57的序列並且VL包含SEQ ID NO：58的序列。

在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：69的序列並且VL包含SEQ ID NO：70的序列。

在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：71的序列並且VL包含SEQ ID NO：72的序列。

在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：73的序列並且VL包含SEQ ID NO：74的序列。

在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：75的序列並且VL包含SEQ ID NO：76的序列。

一方面，本發明內容涉及結合CD79b的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)，其包含與所選VH序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相同的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；且輕鏈可變區(VL)，其包含與所選VL序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相同的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所選VH序列和所選VL序列是以下之一：(1)所選VH序列為SEQ ID NO：7，所選VL序列為SEQ ID NO：8；(2)所選VH序列為SEQ ID NO：17或69，所選VL序列為SEQ ID NO：18或70；(3)所選VH序列為SEQ ID NO：27，所選VL序列為SEQ ID NO：28；(4)所選VH序列為SEQ ID NO：37或71，所選VL序列為SEQ ID NO：38或72；(5)所選VH序列為SEQ ID NO：47或73，所選VL序列為SEQ ID NO：48或74；和 (6)所選VH序列為SEQ ID NO：57或75，所選VL序列為SEQ ID NO：58或76。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段是人源化抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體、單鏈可變片段(scFv)、單臂抗體和/或多特異性抗體。抗體(例如，雙特異性抗體)。

在一些實施例中，抗體或抗原結合片段包含人IgG1 Fc、人IgG2 Fc或人IgG4 Fc。

一方面，本發明內容涉及與本文所述的抗體或其抗原結合片段交叉競爭的抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含可結晶區片段(Fc區)。

一方面，本發明內容涉及包含本文所述的抗體或其抗原結合片段的嵌合抗原受體(CAR)。

一方面，本發明內容涉及抗體-藥物綴合物，其包含與治療劑共價結合的本文所述的抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，治療劑是細胞毒性劑或細胞抑制劑。

一方面，本發明內容涉及治療患有癌症的受試者的方法，所述方法包括施用治療有效量的組合物，所述組合物包含本文所述的抗體或其抗原結合片段、本文所述的CAR或抗體藥物綴合物將本文所述的提供給受試者。

在一些實施例中，癌症是淋巴瘤、白血病、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌或尿路上皮癌。

在一些實施例中，癌症是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、B型急性淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、B細胞幼淋巴球白血病(PLL)、伴隨絨毛淋巴球的脾臟淋巴瘤(SLVL)、毛細胞白血病(HCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)或套細胞(MCL)淋巴瘤。

在一些實施例中，受試者進一步用有效量的抗4-1BB抗體、抗OX40抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA4抗體、抗CD40抗體、BTK抑制劑和BCL2抑制劑治療。

一方面，本發明內容涉及降低腫瘤生長速率的方法，所述方法包括使腫瘤細胞與有效量的組合物接觸，所述組合物包含本文所述的抗體或其抗原結合片段、本文所述的CAR或本文所述的抗體-藥物綴合物。

一方面，本發明內容涉及殺死腫瘤細胞的方法，所述方法包括使腫瘤細胞與有效量的組合物接觸，所述組合物包含本文所述的抗體或其抗原結合片段、本文所述的CAR或本文所述的抗體-藥物綴合物。

一方面，本發明內容涉及增加受試者免疫應答的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含本文所述的抗體或其抗原結合片段、本文所述的CAR或本文所述的抗體-藥物綴合物。

一方面，本發明內容涉及治療患有自體免疫疾病的受試者的方法，所述方法包括施用治療有效量的組合物，所述組合物包含本文所述的抗體或其抗原結合片段、本文所述的CAR或本文所述的抗體-藥物綴合物。

在一些實施例中，所述自體免疫疾病選自類風濕性關節炎、牛皮癬、乾癬、多發性硬化症、免疫性血小板減少性紫斑症、重症肌無力、視神經脊髓炎、IgG4相關疾病、狼瘡、系統性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、鉅細胞動脈炎、高安病、冷凝集素病、溫熱性自體免疫性溶血性貧血和抗中性粒細胞胞漿抗體 (ANCA)相關的血管炎、伴隨多血管炎的肉芽腫病(GPA)(韋格納肉芽腫)或顯微鏡下多血管炎(MPA)、發炎性腸道疾病(IBD)和自體反應性胰臟炎。

在一些實施方案中，自體免疫疾病是多發性硬化症、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、發炎性腸道疾病(IBD)或自體反應性胰臟炎。

一方面，本發明內容涉及包含本文所述的抗體或其抗原結合片段和藥學上可接受的載體的藥物組合物。

一方面，本發明內容涉及包含本文所述的抗體藥物綴合物和藥學上可接受的載體的藥物組合物。

根據本文所用，術語“癌症”是指具有自主生長能力的細胞。此類細胞的例子包括具有以快速增殖的細胞生長為特徵的異常狀態或狀況的細胞。所述術語旨在包括癌性生長，例如腫瘤；致癌過程、轉移組織和惡性轉化的細胞、組織或器官，與組織病理學類型或侵襲階段無關。所述術語還包括各種器官系統的惡性腫瘤，例如呼吸系統、心血管系統、腎臟系統、生殖系統、血液系統、神經系統、肝臟系統、胃腸道系統和內分泌系統；以及腺癌，包括惡性腫瘤，例如大多數結腸癌、腎細胞癌、前列腺癌和/或睾丸腫瘤、肺癌的非小細胞癌和小腸癌。“自然產生”的癌症包括任何不是通過將癌細胞植入受試者體內而在實驗上誘發的癌症，包括例如自發產生的癌症、由患者暴露於致癌物引起的癌症、由插入轉基因致癌基因或敲除抑癌基因引起的癌症、以及由感染引起的癌症，例如病毒感染。術語“癌”是本領域公認的並且是指上皮或內分泌組織的惡性腫瘤。所述術語還包括癌肉瘤，其包括由癌性和肉瘤性組織組成的惡性腫瘤。“腺癌”是指源自腺體組織或其中腫瘤細胞形成可識別的腺體結構的癌。術語“肉瘤”是本領域公認的並且是指間充質來源的惡性腫瘤。術語“造血系統腫瘤疾病”包括涉及造血來源的增生性/腫瘤細胞的疾病。造血系統腫瘤疾病可由髓系、淋巴系或紅系系或其前體細胞引起。

根據本文所用，術語“抗體”是指包含至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或六個)互補決定區(CDR)(例如，來自免疫球蛋白輕鏈的三個CDR中的任何一個或來自免疫球蛋白重鏈的三個CDR中的任何一個)並且能夠特異性結合表位的任何抗原結合分子。抗體的非限制性實例包括：單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、單鏈抗體、嵌合抗體、人抗體和人源化抗體。在一些實施例中，抗體可包含人抗體的Fc區。術語抗體還包括衍生物，例如雙特異性抗體、單鏈抗體和由抗體片段形成的多特異性抗體。

根據本文所用，術語“抗原結合片段”是指全長抗體的一部分，其中抗體的所述部分能夠特異性結合抗原。在一些實施例中，抗原結合片段包含至少一個可變結構域(例如，重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域)。抗體片段的非限制性實例包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。

根據本文所用，術語“嵌合抗體”是指包含存在至少兩種不同抗體中的序列的抗體(例如，來自兩種不同哺乳動物物種的抗體，例如人抗體和非人抗體)。嵌合抗體的非限制性實例是包含非人(例如，小鼠、兔)抗體的可變結構域序列(例如，全部或部分輕鏈和/或重鏈可變結構域序列)的抗體和人類抗體的恆定域。嵌合抗體的其他例子在本文中描述並且是本領域已知的。

根據本文所用，術語“人源化抗體”是指非人抗體，其包含源自非人(例如，小鼠、兔)免疫球蛋白的最少序列並包含源自人免疫球蛋白的序列。在非限制性實例中，人源化抗體是人抗體(受體抗體)，其中受體抗體的高變區(例如，CDR)殘基被來自非人抗體(例如，供體抗體)例如小鼠、大鼠或兔抗體的高變區(例如，CDR)殘基取代，具有所需的特異性、親和力和能力。在一些實施例中，人免疫球蛋白的Fv構架殘基被相應的非人(例如，小鼠、兔)免疫球蛋白殘基替代。在一些實施例中，人源化抗體可含有在受體抗體或供體抗體中未發現的殘基。這些修改可以進一步改進抗體性能。在一些實施例中，人源化抗體含有基本上所有的至少一個，通常是兩個可變域，其中所有或基本上所有的高變環(CDR)對應於非人(CDR)免疫球蛋白的高變環，並且所有或基本上所有的構架區是人免疫球蛋白的那些。人源化抗體還可以含有至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恆定區。可以使用本領域已知的分子生物學方法產生人源化抗體。本文描述了用於產生人源化抗體的方法的非限制性實例。

根據本文所用，術語“受試者”和“患者”在整個說明書中可互換使用並且描述動物、人類或非人類，向其提供根據本發明的方法的治療。本發明涵蓋獸醫和非獸醫應用。人類患者可以是成年人或未成年人(例如，18歲以下的人)。除人類外，患者還包括但不限於小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、雪貂、貓、狗和靈長類動物。患者還包括包括，例如，非人靈長類動物(例如猴子、黑猩猩、大猩猩等)、齧齒類動物(例如大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、雪貂、兔)、兔形動物、豬(例如豬、微型豬)、馬科動物、犬科動物、貓科動物、牛科動物和其他家養、農場和動物園動物。

根據本文所用，當提及抗體時，短語“特異性結合”是指抗體與其靶分子(例如，CD79b)優選地與其他分子相互作用，因為相互作用依賴於靶分子上的特定結構(即抗原決定簇或表位)；換句話說，所述試劑識別並結合包含特定結構的分子，而不是一般的所有分子。特異性結合靶分子的抗體可稱為靶特異性抗體。例如，特異性結合CD79b分子的抗體可稱為CD79b特異性抗體或抗CD79b抗體。

根據本文所用，術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”可互換使用，指至少兩個胺基酸的任何長度的胺基酸聚合物。

根據本文所用，術語“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”在本文中可互換使用，指至少兩個核苷酸的任何長度的核苷酸聚合物，包括但不限於DNA、RNA、DNA/RNA雜交體及其修飾。

除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同。本文描述了用於本發明的方法和材料；也可以使用本領域已知的其他合適的方法和材料。材料、方法和實施例僅是說明性的而不是限制性的。本文提及的所有出版物、專利申請、專利、序列、資料庫條目和其他參考文獻均通過引用整體併入。在衝突的情況下，以本說明書(包括定義)為准。

本發明的其他特徵和優點將從以下詳細描述和附圖以及申請專利範圍中顯而易見。

圖1顯示抗CD79b抗體對人CD79b重組蛋白的ELISA結合親和力。

圖2顯示抗CD79b抗體與食蟹猴CD79b重組蛋白的ELISA結合親和力。

圖3顯示抗CD79b抗體與人CD79b重組蛋白結合的BLI結合親和力。

圖4顯示來自Ramos細胞的細胞表面的抗CD79b抗體的相對內化。

圖5顯示了惡性B腫瘤細胞和正常B細胞表面上抗CD79b抗原密度的量化

圖6顯示抗CD79b抗體對BJAB細胞的結合親和力。

圖7顯示抗CD79b抗體對Ramos細胞的結合親和力。

圖8顯示抗CD79b抗體對Daudi細胞的結合親和力。

圖9顯示抗CD79b抗體對SU-DHL-4細胞的結合親和力。

圖10顯示抗CD79b抗體對Nalm-6細胞的結合親和力。

圖11顯示抗CD79b抗體對供體2890的結合親和力。

圖12顯示抗CD79b抗體對供體2235的結合親和力。

圖13顯示抗CD79b抗體對供體889的結合親和力。

圖14顯示抗CD79b抗體對供體356的結合親和力。

圖15顯示抗CD79b抗體對CLL供體5716的結合親和力。

圖16顯示抗CD79b抗體對CLL供體0255的結合親和力。

圖17A-17B顯示抗CD79b抗體與CD79b的長亞型和短亞型的結合。

圖18顯示人源化抗CD79b抗體與重組人CD79b ECD的ELISA結合。

圖19顯示人源化抗CD79b抗體與表達內源CD79b的細胞系的結合。

圖20列出了根據Kabat定義所定義的抗CD79b抗體的CDR序列。

圖21列出了根據Chothia定義所定義的抗CD79b抗體的CDR序列。

B淋巴細胞抗原受體是一種多聚體複合物，包括抗原特異性成分、表面免疫球蛋白(Ig)。表面免疫球蛋白與另外兩種蛋白質CD79a和CD79b非共價結合，這兩種蛋白質對於B細胞抗原受體的表達和功能是必需的。CD79是B細胞受體的信號傳導成分，作為包含CD79a(即Ig-α或MB1)和CD79b(即 Ig-β或B29)的共價異二聚體發揮作用。CD79b包含細胞外免疫球蛋白(Ig)結構域、跨膜結構域和細胞內信號傳導結構域、基於免疫受體酪胺酸的啟動基序(ITAM)結構域。幾乎所有非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴細胞白血病(ALL)和慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者的表面均檢測到CD79b表達。

本發明內容提供了結合CD79b的抗體及其抗原結合片段的實例。

CD79b

CD79由幾乎只在B細胞和B細胞腫瘤上表達的CD79a和CD79b成分組成。在B細胞個體發育過程中，CD79a和CD79b表達先於免疫球蛋白(Ig)重鏈基因重排和CD20表達，並且在B細胞分化的晚期(漿細胞)階段晚於CD20消失。因此，針對CD79a和CD79b的抗體可用於鑒別診斷B細胞腫瘤與T細胞腫瘤或骨髓腫瘤，或L和H淋巴細胞優勢型何杰金氏淋巴瘤與經典何杰金氏淋巴瘤。此外，抗CD79a和抗CD79b抗體是診斷前體B型急性淋巴細胞白血病(pre-B-ALL)的有用標誌物，因為其中許多腫瘤對其他B細胞標誌物(如CD20和CD45RA)呈陰性.

CD79被認為是抗體的一個有趣的治療靶點，因為它在成熟B細胞和絕大多數B細胞NHL中生理且特異表達，包括DLBCL(從90%到100%)，以及B型急性淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、B細胞幼淋巴球白血病(PLL)、伴隨絨毛淋巴球的脾臟淋巴瘤(SLVL)、毛細胞白血病(HCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)和套細胞淋巴瘤(MCL)淋巴瘤。

CD79與用於抗原識別的細胞表面免疫球蛋白(sIg)結合，構成B細胞抗原受體(BCR)複合物，在B細胞成熟和啟動中起關鍵作用。CD79由α(CD79a)和β(CD79b)異二聚體組成，其功能是BCR的信號轉導成分。CD79的兩個亞基都包含一個細胞外Ig結構域、一個跨膜結構域和一個細胞內信號結構域，它們在抗原結合後啟動BCR信號，最終導致B細胞活化、抗原呈遞、細胞因數產生以及細胞增殖和分化。

BCR的抗原結合誘導其內化和加工到主要組織相容性複合體II類(MHCII)隔室，即類似溶酶體的隔室，用於B細胞的II類抗原呈遞。這種細胞內運輸特別令人感興趣，因為藥物直接遞送到靶細胞進入溶酶體隔室，增強細胞毒活性，並且它允許使用在MHCII隔室中切割的更穩定的接頭。

CD79b及其功能的詳細評論可以在Chu,Peiguo G.,and Daniel A.Arber."CD79：a review." Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 9.2(2001)：97-106；Bourbon,Estelle,and Gilles Salles."Polatuzumab vedotin：an investigational anti-CD79b antibody drug conjugate for the treatment of diffuse large B-cell lymphoma." Expert Opinion on Investigational Drugs 29.10(2020)：1079-1088.中找到，其中每一篇文獻都通過引用整體併入本文。

本發明內容提供了幾種抗CD79b抗體、其抗原結合片段以及使用這些抗CD79b抗體和抗原結合片段來抑制腫瘤生長、治療癌症和治療自體免疫疾病的方法。

抗體和抗原結合片段

本發明內容提供了抗CD79b抗體及其抗原結合片段。通常，抗體(也稱為免疫球蛋白)由輕鏈和重鏈兩類多肽鏈組成。本發明內容的非限制性抗體可以是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的完整的四條免疫球蛋白鏈抗體。抗體的重鏈可以是任何同種型，包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD或同種亞型，包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等。輕鏈可以是κ輕鏈或λ輕鏈。一個抗體可包含兩個相同的輕鏈拷貝和兩個相同的重鏈拷貝。每條重鏈都包含一個可變結構域(或可變區，VH)和多個恆定結構域(或恆定區)，通過其恆定結構域內的二硫鍵相互結合，形成抗體的“主幹”。每條輕鏈均包含一個可變結構域(或可變區，VL)和一個恆定結構域(或恆定區)，每條輕鏈均通過二硫鍵結合至一條重鏈。每條輕鏈的可變區與其所結合的重鏈的可變區對齊。輕鏈和重鏈的可變區包含三個高變區，夾在更保守的框架區(FR)之間。

這些稱為互補決定區(CDR)的高變區形成環，構成抗體的主要抗原結合表面。四個框架區主要採用β折疊構象，CDR形成連接β折疊結構的環，且在某些情況下形成β折疊結構的一部分。每條鏈中的CDR與框架區緊密相鄰，並且與另一條鏈中的CDR一起促進抗原結合區的形成。

通過分析抗體的胺基酸序列來鑒定抗體的CDR區的方法是眾所周知的，並且通常使用CDR的多種定義。Kabat定義基於序列變異性，而Chothia定義基於結構環區域的位置。這些方法和定義在Martin,"Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering,Springer Berlin Heidelberg,2001.422-439；Abhinandan,et al."Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains," Molecular immunology 45.14(2008)：3832-3839；Wu,T.T.and Kabat,E.A.(1970)J.Exp.Med.132：211-250；Martin et al.,Methods Enzymol.203：121-53(1991)；Morea et al.,Biophys Chem.68(1-3)：9-16(Oct.1997)；Morea et al.,J Mol Biol.275(2)：269-94(Jan.1998)；Chothia et al.,Nature 342(6252)：877-83(Dec.1989)；Ponomarenko and Bourne,BMC Structural Biology 7：64(2007)中描述，其中每一篇文獻通過引用整體併入本文。

CDR對於識別抗原表位是重要的。根據本文所用，“表位”是能夠被抗體的抗原結合結構域特異性結合的靶分子的最小部分。表位的最小數量可以約三個、四個、五個、六個或七個胺基酸，但這些胺基酸不需要位於抗原一級結構的連續線性序列中，因為表位可能取決於抗原基於抗原二級和三級結構的三維空間構型。

在一些實施例中，抗體是完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亞類(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)高度保守，它們的恆定區不同，尤其是鉸鏈和上部CH2結構域。IgG亞類的序列和差異是本領域已知的，並且在Vidarsson,et al,IgG subclasses and allotypes：from structure to effector functions.Frontiers in immunology 5(2014)；Irani,et al.Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases.Molecular immunology 67.2(2015)：171-182；Shakib,Farouk,ed中描述。人類IgG亞類的分子特性及其對設計抗傳染病治療性單克隆抗體的意義。Molecular immunology 67.2(2015)：171-182；Shakib,Farouk,ed.The human IgG subclasses：molecular analysis of structure,function and regulation.Elsevier,2016；其中每一個都通過引用整體併入本文。

所述抗體也可以是來源於任何物種的免疫球蛋白分子(例如，人類、齧齒動物、小鼠、駱駝、兔子)。本文披露的抗體還包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體和嵌合抗體，其包括融合到另一多肽的免疫球蛋白結合域。術語“抗原結合結構域”或“抗原結合片段”是保留完整抗體特異性結合活性的抗體的一部分，即能夠與完整抗體靶分子上的表位特異性結合的抗體的任何部分。它包括，例如，Fab，Fab'，F(ab')2，以及這些片段的變體。因此，在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可以是，例如，單鏈抗體、Fv、Fd、雙特異性抗體、單鏈抗體分子、由抗體片段形成的多特異性抗體，以及包括與抗體結合結構域或與抗體結合結構域同源的結合結構域的任何多肽。抗原結合域的非限制性例子包括，例如，完整抗體的重鏈和/或輕鏈CDR，完整抗體的重鏈和/或輕鏈可變區，完整抗體的全長重鏈或輕鏈，或完整抗體的重鏈或輕鏈中的單個CDR。

在一些實施例中，抗原結合片段可形成嵌合抗原受體(CAR)的一部分。在一些實施例中，scFv具有一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域。在一些實施例中，scFv具有兩個重鏈可變域和兩個輕鏈可變域。

抗CD79b抗體和抗原結合片段

本發明內容提供特異性結合CD79b(例如，人CD79b)的抗體及其抗原結合片段。本文所述的抗體和抗原結合片段能夠結合CD79b。這些抗體可以是CD79b介導的BCR信號傳導的激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，抗體和抗原結合片段可以結合人CD79b的細胞外結構域。

本發明內容提供例如抗CD79b抗體22D10、23D8、29C3、44G2、48H10、57B9、其嵌合抗體及其人源化抗體。

根據Kabat定義，22D10和22D10衍生抗體(例如，人源化抗體)的CDR序列包括重鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：9、11、13，和輕鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：14~16，CDR也可以由Chothia來定義。根據Chothia定義，重鏈可變結構區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：10、12、13，和輕鏈可變結構區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：14~16。

類似地，根據Kabat定義，23D8和23D8衍生抗體的CDR序列包括重鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：19、21、23，和輕鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：24~26。根據Chothia定義，重鏈可變區的CDR 胺基酸序列列於SEQ ID NO：20、22、23，和輕鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：24~26。

根據Kabat定義，29C3和29C3衍生抗體的CDR序列包括重鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：29、31、33，和輕鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：34~36。根據Chothia定義，重鏈可變區的CDR序列胺基酸序列列於SEQ ID NO：30、32、33，和輕鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：34~36。

根據Kabat定義，44G2和44G2衍生抗體的CDR序列包括重鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：39、41、43，和輕鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：44~46。根據Chothia定義，重鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：40、42、43，和輕鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：44~46。

根據Kabat定義，48H10和48H10衍生抗體的CDR序列包括重鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：49、51、53，和輕鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：54~56。根據Chothia定義，重鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：50、52、53，和輕鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：54~56。

根據Kabat定義，57B9和57B9衍生抗體的CDR序列包括重鏈可變區的CDR胺基酸列於SEQ ID NO：59、61、63，和輕鏈可變區的CDR胺基酸列於SEQ ID NO：64~66。根據Chothia定義，重鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：60、62、63，和輕鏈可變區的CDR胺基酸序列列於SEQ ID NO：64~66。

22D10抗體的重鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：7。22D10抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：8。

23D8抗體的重鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：17。23D8抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：18。

29C3抗體的重鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：27。29C3抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：28。

44G2抗體的重鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：37。44G2抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：38。

48H10抗體的重鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：47。48H10抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：48。

57B9抗體的重鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：57。57B9抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：58。

在一些實施例中，抗CD79b抗體是人源化抗體。在一些實施例中，抗CD79b抗體是人源化23D8、44G2、48H10或57B9。

人源化23D8抗體的重鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：69。23D8抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：70。

人源化44G2抗體的重鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：71。44G2抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：72。

人源化48H10抗體的重鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：73。48H10抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：74。

人源化57B9抗體的重鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：75。57B9抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列列於SEQ ID NO：76。

還提供了修飾抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區與SEQ ID NO：7、17、27、37、47和57中的任一個具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在一些實施例中，輕鏈可變區與SEQ ID NO：8、18、28、38、48 和58中的任何一個具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。重鏈可變區序列可以與相應的輕鏈可變區序列配對並共同結合到CD79b。

人源化百分比是指重鏈或輕鏈可變區序列與國際免疫遺傳學資訊系統(IMGT)資料庫中的人抗體序列相比的同一性百分比。在一些實施例中，人源化百分比大於80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%。關於如何確定人源化百分比以及如何確定熱點命中的詳細描述在本領域是已知的，並且在Jones,et al.The INNs and outs of antibody nonproprietary names.MAbs.Vol.8.No.1.Taylor & Francis,2016中描述，其通過引用整體併入本文。高人源化百分比通常具有各種優勢，例如，對人類更安全和更有效，更可能被人類受試者耐受，和/或不太可能產生副作用。在一些實施例中，可變區是完全人源的，例如衍生自人重鏈免疫球蛋白基因座序列(例如，人IGHV、人IGHD和人IGHJ基因的重組)和/或人κ鏈免疫球蛋白基因座序列(例如，人IGKV和人IGKJ基因的重組)。

此外，在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段還可含有一個、兩個或三個選自SEQ ID NO：9、11、13；SEQ ID NO：19、21、23；SEQ ID NO：29、31、33；SEQ ID NO：39、41、43；SEQ ID NO：49、51、53；SEQ ID NO：59、61、63；SEQ ID NO：10、12、13；SEQ ID NO：20、22、23；SEQ ID NO：30、32、33；SEQ ID NO：40、42、43；SEQ ID NO：50、52、53；SEQ ID NO：60、62、63的重鏈可變區CDR，和/或選自SEQ ID NO：14~16、SEQ ID NO：24~26、SEQ ID NO：34~36、SEQs ID NO：44~46，SEQs ID NO：54~56和SEQ ID NO：64~66的一個、兩個或三個輕鏈可變區CDR。

在一些實施例中，抗體可具有重鏈可變區(VH)，其包含互補決定區(CDR)1、2、3，其中CDR1區包含與所選VH CDR1胺基酸序列至少80 %、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由其組成，CDR2區包含與所選VH CDR2胺基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由其組成，CDR3區包含與所選VH CDR3胺基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，抗體可具有輕鏈可變區(VL)，其包含互補決定區(CDR)1、2、3，其中CDR1區包含與所選VL CDR1胺基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由其組成，CDR2區包含與所選VL CDR2胺基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由其組成，CDR3區包含與所選VL CDR3胺基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由其組成。圖20(Kabat CDR)和圖21(Chathia CDR)顯示了所選VH CDR 1、2、3胺基酸序列和所選VL CDR，1、2、3胺基酸序列。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：9；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：11；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：13。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：19；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：21；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：23。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：29；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：31；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：33。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：39；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：41；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：43。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：49；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：51；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：53。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：59；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：61；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：63。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：10；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：12；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：13。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：20；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：22；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：23。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：30；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：32；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：33。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：40；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：42；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：43。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：50；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：52；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：53。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有重鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：60；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：62；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：63。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有輕鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：14；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：15；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：16。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有輕鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：24；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：25；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：26。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有輕鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：34；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：35；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：36。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有輕鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：44；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：45；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：46。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有輕鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：54；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：55；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：56。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以含有輕鏈可變區，所述可變區含有一個、兩個或三個CDR，具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：64；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：65；具有零、一或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO：66。

插入、缺失和取代可以在CDR序列內，或者在CDR序列的一個或兩個末端。在一些實施例中，CDR是基於Kabat定義來確定的。在一些實施例中，CDR基於Chothia定義來確定的。在一些實施例中，CDR基於Kabat定義和Chothia定義的組合來確定的。

本發明內容還提供了結合CD79b的抗體或其抗原結合片段。抗體或其抗原結合片段含有重鏈可變區(VH)，其包含與所選VH序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由其組成，輕鏈可變區(VL)包含或由與所選VL序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由其組成。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO：7，並且所選VL序列是SEQ ID NO：8。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO：17，並且所選VL序列是SEQ ID NO：18。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO：27，並且所選VL序列是SEQ ID NO：28。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO：37，並且所選VL序列是SEQ ID NO：38。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO：47，並且所選VL序列是SEQ ID NO：48。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO：57，並且所選VL序列是SEQ ID NO：58。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO：69，並且所選VL序列是SEQ ID NO：70。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO：71，並且所選VL序列是SEQ ID NO： 72。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO：73，並且所選VL序列是SEQ ID NO：74。在一些實施例中，所選VH序列是SEQ ID NO：75，並且所選VL序列是SEQ ID NO：76。

本發明內容還提供了可以與本文描述的抗體競爭的抗體或其抗原結合片段。在一些方面，抗體或抗原結合片段可以結合與本文所述的抗體相同的表位。

本發明還提供了與本文所述的任何抗體或抗原結合片段交叉競爭的抗體或其抗原結合片段。交叉競爭測定是本領域已知的，並在Moore et al.,"Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein." Journal of virology 70.3(1996)：1863-1872中描述，其通過引用整體併入本文作為參考。一方面，本發明內容還提供了與本文所述的任何抗體或抗原結合片段結合相同表位元或區域的抗體或其抗原結合片段。表位合併測定是本領域已知的，並在Estep et al."High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning." MAbs.Vol.5.No.2.Taylor & Francis,2013中描述，其通過引用整體併入本文作為參考。

為了確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的百分比同一性，將序列進行比對以達到最佳比較目的(例如，可以在第一個和第二個胺基酸或核酸序列中的一個或兩個中引入空位以用於達到比較目的，可以忽略最佳比對和非同源序列)。然後比較相應胺基酸位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸。當第一個序列中的一個位置被與第二個序列中相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在該位置是相同的。兩個序列之間的同一性百分比是序列共用的相同位置數量的函數，同時考慮到間隙的數量和每個間隙的長度，需要引入這些間隙以實現兩個序列的最佳比對。例如，序列的比較和兩個序列之間同一性百分比的確定可使用Blossum 62評分矩陣完成，空位為12，空位延伸為4，移碼空位為5。

本發明內容還提供了包含編碼多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈。免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈包含的CDR如圖20或21所示，或者如圖22所示的序列。當多肽與相應的多肽(例如，相應的重鏈可變區或相應的輕鏈可變區)配對時，配對的多肽結合CD79b(例如，人CD79b)。

抗CD79b抗體和抗原結合片段還可以是抗體或抗體片段的抗體變體(包括衍生物和綴合物)以及多特異性(例如，雙特異性)抗體或抗體片段。本文提供的其他抗體是多克隆、單克隆、多聚體、多特異性(例如，雙特異性)、人源化抗體、嵌合抗體(例如，人-小鼠嵌合體)、單鏈抗體、細胞內製造的抗體(即，胞內抗體)及其抗原結合片段。抗體或其抗原結合片段可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段是IgG抗體或其抗原結合片段。

抗體片段適用於所提供的方法，只要它們保留全長抗體所需的親和力和特異性即可。因此，結合CD79b的抗體片段將保留結合CD79b的能力。Fv片段是包含完整抗原識別和結合位點的抗體片段。所述區域由緊密結合的一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區的二聚體組成，其本質上可以是共價的，例如在scFv中。正是在這種構型中，每個可變區的三個CDR相互作用以定義VH-VL二聚體表面上的抗原結合位點。總的來說，六個CDR或其子集賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使是單個可變區(或僅包含三個對抗原特異的CDR的Fv的一半)也可以具有識別和結合抗原的能力，儘管親和力通常低於整個結合位點。

單鏈Fv或(scFv)抗體片段包含抗體的VH和VL結構域(或區域)，其中這些結構域存在於單個多肽鏈中。通常，scFv多肽還包含VH和VL結構域之間的多肽接頭，這使得scFv能夠形成抗原結合所需的結構。

Fab片段包含輕鏈的可變結構域和恆定結構域以及重鏈的可變結構域和第一恆定結構域(CH1)。F(ab')2抗體片段包含一對Fab片段，其通常通過它們之間的鉸鏈半胱胺酸在其羧基末端附近共價連接。抗體片段的其他化學偶聯也是本領域已知的。

本發明的抗體和抗體片段可以在Fc區進行修飾以提供所需的效應子功能或血清半衰期。在一些實施例中，Fc區可被修飾以沉默或降低補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。

在一些實施例中，多特異性抗體是雙特異性抗體。可以通過設計一對抗體分子之間的介面來製造雙特異性抗體，以最大限度地提高從重組細胞培養物中回收的異二聚體的百分比。例如，介面可以包含抗體恆定域的至少一部分CH3域。在這種方法中，來自第一抗體分子介面的一個或多個小胺基酸側鏈被較大的側鏈(例如，酪胺酸或色胺酸)取代。通過用較小的胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)替換大的胺基酸側鏈，在第二抗體分子的介面上創建與大側鏈大小相同或相似的補償“空腔”。這提供了一種機制，用於增加異二聚體的產量，而不是其他不需要的終產物，如同二聚體。這種方法在例如WO96/27011中有所描述，所述文獻通過引用整體併入本文。

本文所述的任何抗體或抗原結合片段可以偶聯穩定分子(例如，增加抗體或其抗原結合片段在受試者中或在溶液中的半衰期的分子)。穩定分子的非限制性實例包括：聚合物(例如聚乙二醇)或蛋白質(例如血清白蛋白，如人血清白蛋白)。穩定分子的偶聯可以使抗體或抗原結合片段在體外(例如，在組織培養中或當作為藥物組合物儲存時)或體內(例如，人)增加半衰期或延長生物活性

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段可以偶聯治療劑。包含抗體或其抗原結合片段的抗體-藥物綴合物可以共價或非共價結合治療劑。在一些實施例中，治療劑是細胞毒劑或細胞抑制劑(例如，細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米汀、絲裂黴素、依託泊苷、替諾泊苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、多柔比星、柔紅黴素、二羥基蒽酸、美登木素生物鹼，例如DM-1和DM-4、二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-脫氫睾酮、醣皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素、表柔比星和環磷醯胺及類似物)。

在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段識別內源性CD79b或重組CD79b。在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段識別人CD79b(例如，人CD79b的胞外區)。

抗體藥物偶聯(ADC)

本文所述的抗體、其抗原結合片段或抗原結合蛋白構建體(例如，雙特異性抗體)可以偶聯至治療劑(藥物)。治療劑可以共價或非共價結合至抗體或抗原結合片段或抗原結合蛋白構建體(例如，雙特異性抗體)。

在一些實施例中，治療劑是細胞毒性劑或細胞抑制劑(例如，單甲基奧裡斯他汀E、單甲基奧裡斯他汀F、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂黴素、依託泊苷、替諾泊苷、長春新鹼、長春花鹼、秋水仙素、阿黴素、柔紅黴素、二羥基蒽醌、美登木素生物鹼例如DM-1和DM-4、二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-脫氫睾酮、醣皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素、表柔比星和環磷醯胺和類似物)。有用的細胞毒性劑、細胞抑制劑或免疫調節劑包括例如抗微管蛋白劑、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑和烷化劑。

在一些實施例中，治療劑可以包括但不限於細胞毒性試劑，例如化療劑、免疫治療劑等、抗病毒劑或抗微生物劑。在一些實施例中，待偶聯的治療劑可以選自但不限於MMAE(單甲基奧裡斯他汀E)、MMAD(單甲基奧裡斯他汀D)或MMAF(單甲基奧裡斯他汀F)。

在一些實施例中，治療劑是auristatin，例如auristatin E(本領域也稱為朵拉司他汀-10的衍生物)或其衍生物。阿裡他汀可以是例如阿裡他汀E和酮酸之間形成的酯。例如，auristatin E可以與對乙醯基苯甲酸或苯甲醯戊酸反應分別產生AEB和AEVB。其他典型的阿裡他汀包括AFP、MMAF和MMAE。示例性阿裡他汀的合成和結構描述於美國專利申請公開號2003-0083263；國際專利公開號WO 04/010957、國際專利公開號WO 02/088172、以及美國專利號5,990,910。編號7,498,298、6,884,869、6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444；4,486,414和4,486,414，其每一篇均出於所有目的通過引用整體併入本文。

Auristatin已被證明可以干擾微管動力學以及細胞核和細胞分裂，並具有抗癌活性。Auristatin結合微管蛋白，可以對癌細胞產生細胞毒性或細胞抑制作用。存在本領域已知的多種不同測定法，其可用於確定阿裡他汀或所得抗體-藥物綴合物是否對所需細胞發揮細胞抑制或細胞毒性作用。

在一些實施例中，治療劑是化療劑。化療劑的實例包括烷化劑，例如塞替派和環磷醯胺(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸鹽，例如白消安、異丙消安和呱泊消安；氮丙啶類，例如苯多巴、卡波醌、美杜巴和烏多巴；乙烯亞胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亞乙基三聚氰胺、三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫代磷醯胺和三羥甲基三聚氰胺；氮芥類，例如苯丁酸氮芥、氯萘嗪、氯磷醯胺、雌莫司汀、異環磷醯胺、氮芥、鹽酸氮芥、美法侖、諾萬比欽、苯酯林、潑尼莫司汀、曲磷醯胺、尿嘧啶芥；亞硝脲類，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如阿克拉黴素、放線菌素、紅黴素、重氮絲胺酸、博萊黴素、放線菌素、加利車黴素、卡比星、洋紅黴素、親癌菌素、色黴素、放線菌素、柔紅黴素、地托黴素、6-重氮-5-氧代-L-正亮胺酸、阿黴素、表柔比星、依索比星、idarubicin、馬塞黴素、絲裂黴素、麥考酚酸、諾加黴素、橄欖黴素、培洛黴素、泊非黴素、嘌呤黴素、克拉黴素、羅多黴素、鏈黑素、鏈佐星、結核菌素、烏苯美克斯、齊諾他汀、佐柔比星；抗代謝藥，例如甲胺蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如去甲蝶呤、甲胺蝶呤、蝶蝶呤、曲美曲沙；嘌呤類似物，例如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫代米林、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱、阿紮胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿醣胞苷、雙去氧尿苷、多西氟尿苷、依西他濱、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡睾酮、丙酸屈他雄酮、表噻甾烷醇、美匹替坦、睾內酯；抗腎上腺藥，例如胺基魯米特、米托坦、曲洛斯坦；葉酸補充劑，例如葉酸；乙醯丙酮；醛磷醯胺醣苷；胺基乙醯丙酸；安吖啶；貝斯特拉布西爾；比生群；依達曲沙酯；去磷胺；德美考辛；二嗪醌；艾爾福尼胺酸；醋酸玫瑰樹酯；依託醣；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣；氯尼達明；米托瓜腙；米托蒽醌；莫匹達莫；硝基分泌；噴司他丁；菲納美特；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基醯肼；丙卡巴肼；PSK7；雷佐生；西佐菲蘭；螺鍺；烯草酸；三嗪酮；2’,2’,2’-三氯三乙胺；聚胺酯；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀；米托布羅醇；米托乳醇；吡波溴曼；加胞嘧啶；阿醣苷(“Ara-C”)；環磷醯胺；紫杉烷類，例如紫杉醇(TAXOL®， Bristol-MyersSquibbOncology，普林斯頓，新澤西州)和多西他賽(TAXOTERE®，Rhone-PoulencRorer，安東尼，法國)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；鉑類似物，例如順鉑和卡鉑；長春花鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；長春花；諾凡特龍；替尼泊苷；道諾黴素；胺基蝶呤；希羅達；伊班膦酸鈉；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯帕黴素；卡培他濱；以及任何上述物質的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。該定義還包括起到調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素劑，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、三奧昔芬、酮昔芬、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述物質的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。化療劑的詳細描述可以在例如US20180193477A1中找到，其通過引用整體併入本文。

在一些實施例中，抗原結合構建體通過可裂解接頭例如接頭與藥物偶聯。SPBD接頭或馬來醯亞胺己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄氧基羰基(VC)接頭。在一些實施例中，抗原結合構建體通過不可切割的接頭例如接頭與藥物偶聯。使用SMCC或磺基-SMCC形成的MCC接頭。具有本領域知識並考慮相關因素(例如與抗原結合構建體的連接位點、藥物的任何結構限制和疏水性)的技術人員可以容易地選擇用於給定ADC的適當接頭(例如參見Nolting,Chapter 5,Antibody-Drug Conjugates：Methods in Molecular Biology,2013,Ducry(Ed.),Springer)。在某些實施例中，已經描述了許多特定的接頭-毒素組合並且可以與本文描述的抗原結合構建體一起使用來製備ADC。實例包括但不限於具有auristatins例如MMAE和MMAF、喜樹鹼例如SN-38、duocarmycins和PBD二聚體的可裂解肽基接頭；具有auristatins MMAF和MMAE的不可切割的基於MC的接頭；具有加利刹黴素和阿黴素的酸不穩定腙基連接體；基於二硫鍵的美登木素生物鹼接頭，例如DM1和DM4，以及基於雙馬來醯亞胺三氧乙二醇(BMPEO)的美登木素生物鹼DM1連接體。一些治療劑和接頭描述在Peters & Brown,(2015)Biosci.Rep.e00225；Dosio et al.,(2014)Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery 9：35-65；美國專利公開號US2015/0374847和US20180193477A1；其全部內容通過引用整體併入本文。

根據所需的藥物和所選擇的接頭，本領域技術人員可以選擇合適的方法將它們偶聯在一起。例如，一些常規偶聯方法，如胺偶聯方法，可用於形成所需的藥物-接頭複合物，其仍含有通過共價連接與抗體偶聯的反應基團。在一些實施例中，藥物-馬來醯亞胺複合物(即，馬來醯亞胺連接藥物)可用於本發明內容中帶有反應基團的有效負載。在ADC製備中最常見的能夠與硫醇基團結合的反應基團是馬來醯亞胺。此外，有機溴化物、碘化物也經常使用。

ADC的製備可以通過本領域已知的幾種途徑之一，採用本領域技術人員已知的有機化學反應、條件和試劑來製備，詳見Bioconjugate Techniques(G.T.Hermanson,2013,Academic Press)。例如，可以通過以下方式實現偶聯：(1)抗體的親核基團或親電子基團與二價接頭試劑反應，通過共價鍵形成抗體-接頭中間體Ab-L，然後與活化的藥物部分D；或(2)藥物部分的親核基團或親電子基團與連接試劑反應，通過共價鍵形成藥物-連接基中間體D-L，然後與抗體的親核基團或親電子基團反應。偶聯方法(1)和(2)可與多種抗體、藥物部分和接頭一起使用來製備此處描述的ADC。各種製備的接頭、接頭組分和毒素是可商購的或者可以使用標準合成有機化學技術來製備。這些方法描述在March’s Advanced Organic Chemistry(Smith & March,2006,Sixth Ed.,Wiley)；Toki et al.,(2002)J.Org.Chem.67：1866-1872；Frisch et al.,(1997)Bioconj.Chem.7：180-186；Bioconjugate Techniques(G.T.Hermanson,2013,Academic Press)； US20210379193A1和US20180193477A1，其全部內容通過引用整體併入本文。此外，許多適合與所選抗原結合構建體反應的預形成的藥物接頭也可商業購買獲得，例如，包含DM1、DM4、MMAE、MMAF或Duocarmycin SA的接頭毒素可從Creative BioLabs(Shirley,N.Y.)獲得。

ADC製備方法的幾個具體實施例是本領域已知的並且描述於美國專利No.4,070,007中。美國專利號8,624,003(一鍋法)美國專利號8,163,888(一步法)和美國專利號8,163,888(一步法)美國專利號5,208,020(兩步法)和US20180193477A1，其全部內容通過引用整體併入本文。其他方法是本領域已知的並且包括抗體-藥物綴合物：Methods in Molecular Biology,2013,Ducry(Ed.),Springer。

載藥量由ADC分子中每個抗體的藥物部分數量表示。對於一些抗體-藥物綴合物，載藥量可能受到抗體上附著位點數量的限制。例如，當連接物是半胱胺酸硫醇時，根據本文所述的某些示例性實施例中，藥物負載的範圍可以是每個抗體0至8個藥物部分。在某些實施例中，更高的藥物負載，例如p5，可能導致某些抗體-藥物綴合物聚集、不溶、毒性或細胞通透性喪失。在某些實施例中，抗體-藥物綴合物的平均藥物負載範圍為1至約8；約2至約6；或約3至約5。事實上，已經表明對於某些抗體-藥物綴合物，每個抗體的藥物部分的最佳比例約為4。在一些實施例中，藥物與抗體之比(DAR)為約或至少1、2、3、4、5、6、7或8。在一些實施例中，組合物中的平均DAR為約1至約2、約2至約3、約3至約4、約3至約5、約4至約5、約5至約6、約6至約7，或者約7至約8。

抗體和ADC特性

根據本文所述的抗體或其抗原結合片段或由其衍生的ADC可以是激動劑或拮抗劑。在一些實施例中，通過結合CD79b，抗體可以抑制CD79b介導的BCR信號傳導。

在一些實施例中，抗體(或其抗原結合片段)或由其衍生的ADC以解離速率特異性結合CD79b(例如，人CD79b、猴CD79b(如，恆河猴、食蟹猴)、狗CD79b、小鼠CD79b)。解離速率(koff)小於0.1s-1、小於0.01s-1、小於0.001s-1、小於0.0001s-1、小於0.00001s-1、小於0.000001s-1或小於0.0000001s-1。在一些實施例中，解離速率(koff)大於0.01s-1、大於0.001s-1、大於0.0001s-1、大於0.00001s-1、大於0.000001s-1、大於0.0000001s-1或大於0.00000001s-1。

在一些實施例中，動力學結合率(kon)大於1×102/Ms、大於1×103/Ms、大於1×104/Ms、大於1×105/Ms或大於1×106/Ms。在一些實施例中，動力學結合速率(kon)小於1×105/Ms、小於1×106/Ms或小於1×107/Ms。在一些實施例中，KD小於50nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM。在一些實施例中，KD大於1×10-7M、大於1×10-8M、大於1×10-9M、大於1×10-10M、大於1×10-11M，大於1 x 10-12M，大於1 x 10-13M，大於1 x 10-14M。

用於測量抗體對抗原的親和力的一般技術包括例如BLI、ELISA、RIA、流式細胞術和表面等離子共振(SPR)。在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC結合人CD79b、猴CD79b、狗CD79b和/或小鼠CD79b。在一些實施例中，抗體不結合人CD79b、猴CD79b、狗CD79b和/或小鼠CD79b。

此外，已經描述了慢性淋巴細胞白血病中CD79b的選擇性剪接異構體。所述同工型(也稱為“短同工型”)編碼125個胺基酸(SEQ ID NO：67) 並且不同於野生型的229個胺基酸(也稱為“長同工型”)(SEQ ID NO：68)通過刪除基本上編碼大部分胞外結構域的外顯子3。在一些實施例中，本文所述的抗CD79b抗體可以結合CD79b的兩種同工型。在一些實施例中，抗CD79b抗體結合CD79b同種型(例如，SEQ ID NO：67)。在一些實施例中，抗CD79b抗體不結合CD79b同種型(例如，SEQ ID NO：67)。在一些實施例中，抗CD79b抗體結合野生型CD79b(例如，SEQ ID NO：68)。在一些實施例中，本文所述的抗體結合CD79b的胞外結構域。

在一些實施例中，抗CD79b抗體結合CD79b變體(如，SEQ ID NO：2)。在一些實施例中，抗CD79b抗體不結合CD79b變體(如，SEQ ID NO：2)。在一些實施例中，抗CD79b抗體結合位於CD79b的ECD的胺基酸1-13內的表位(如，SEQ ID NO：1)。

在一些實施例中，將本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC加至Ramos細胞以檢測內化速率。在一些實施例中，在不同時間點(例如，1小時、3小時或6小時)，本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC具有5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上或98%以上的內化率。在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段或由其衍生的ADC與polatuzumab相比具有較慢的內化速率。

在一些實施例中，測定熱穩定性。根據本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC可具有大於60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74的Tm、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95℃。在一些實施例中，Tm小於 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95℃。

由於IgG可以被描述為多結構域蛋白，因此熔解曲線有時會顯示兩個轉變，即第一變性溫度Tm1和第二變性溫度Tm2。這兩個峰的存在通常分別表明Fc結構域(Tm1)和Fab結構域(Tm2)的變性。因此，在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段具有大於60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95℃的Tm1。在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段具有大於60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95℃的Tm2。

在一些實施例中，Tm、Tm1、Tm2小於60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95℃。

在一些實施例中，通過ELISA檢測，本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC可以結合人或猴CD79b。在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段或源自其的ADC可以結合人或猴CD79b，其IC50小於200nM、小於100nM、小於50nM、小於10nM、小於5nM、小於1nM、小於0.75nM、小於0.5nM、或小於0.25nM。

在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC可以結合CD79b的相同表位。在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC可以結合CD79b的不同表位。

在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC通過流式細胞術測定可以結合具有高和低CD79b抗原密度的惡性B細胞系(如BJAB、Ramos、Daudi、SU-DHL-4和Nalm-6)。在一些實施例中，EC50小於200nM、小於100nM、小於50nM、小於10nM、小於5nM、小於1nM、小於0.75nM、小於0.5nM、或小於0.25nM。

在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC可以比Polatuzumab更高的細胞表面結合親和力結合人B細胞。在一些實施例中，EC50小於200nM、小於100nM、小於50nM、小於10nM、小於5nM、小於1nM、小於0.75nM、小於0.5nM、或小於0.25nM。

在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC可以結合慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者的B淋巴細胞上的細胞表面CD79b。在一些實施例中，所述結合比polatuzumab更有效。

在一些實施例中，本文所述的ADC具有通過HPLC測定的高於3、高於3.2、高於3.4、高於3.6、高於3.8、高於4、高於4.2、高於4.4或高於4.6的平均藥物與抗體比率(DAR)。在一些實施例中，本文所述的ADC具有通過HPLC測定的低於3、低於3.2、低於3.4、低於3.6、低於3.8、低於4、低於4.2、低於4.4或低於4.6的平均DAR。在一些實施例中，DAR為約4。

在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC具有大於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%的腫瘤生長抑制百分比(TGI%)。在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC具有小於60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%的腫瘤生長抑制百分比。TGI%可以在治療開始後3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天，或治療開始後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月進行測定。根據本文所用，腫瘤生長抑制百分比(TGI%)使用下式計算：TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100

Ti是治療組在第i天的平均腫瘤體積。T0是治療組在第0天的平均腫瘤體積。Vi是第i天對照組的平均腫瘤體積。V0是第0天對照組的平均腫瘤體積。

在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC可以結合表達CD79b的腫瘤細胞。在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段或源自其的ADC可以誘導補體依賴性細胞毒性(CDC)和/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，並殺死腫瘤細胞。

在一些實施例中，本文所述的抗體或其抗原結合片段或源自其的ADC具有功能性Fc區。在一些實施例中，功能性Fc區的效應子功能是抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。在一些實施例中，功能性Fc區的效應子功能是吞噬作用。在一些實施例中，功能性Fc區的效應子功能是ADCC和吞噬作用。

在一些實施例中，Fc區是人IgGl、人IgG2、人IgG3或人IgG4。在一些實施例中，抗體是人源化IgG1抗體，任選地具有SI突變、LALA突變、N297A突變、YTE突變和/或FLAA突變。在一些實施例中，抗體是人源化IgG4抗體，任選地具有SI突變、LALA突變、N297A突變、YTE突變和/或FLAA突變。

在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段或由其衍生的ADC不具有功能性Fc區。例如，抗體或抗原結合片段是Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。在一些實施例中，Fc區具有LALA突變(根據EU編號的L234A和L235A突變)或LALA-PG突變(根據EU編號的L234A、L235A、P329G突變)。在一些實施例中，Fc區具有FLAA突變(根據EU編號的F234A和L235A)。在一些實施例中，Fc具有SI突變(根據EU編號的S239D和I332E突變)。在一些實施例中，Fc具有根據EU編號的N297A突變。在一些實施例中，Fc具有YTE突變(根據EU編號的M252Y、S254T和T256E)。

製備抗CD79b抗體的方法

人CD79b的分離片段可用作免疫原，使用多克隆和單克隆抗體製備的標準技術產生抗體。可以通過多次注射(例如，皮下或腹膜內注射)抗原肽或蛋白質在動物體內產生多克隆抗體。在一些實施例中，抗原肽或蛋白質與至少一種佐劑一起注射。在一些實施例中，抗原肽或蛋白質可以與在待免疫的物種中具有免疫原性的試劑綴合。動物可以注射抗原肽或蛋白質超過一次(例如，兩次、三次或四次)。

可以使用全長多肽或蛋白質(或其胞外區)，或者，可以使用其抗原肽片段作為免疫原。蛋白質的抗原肽包含CD79b的胺基酸序列的至少8個(例如，至少10、15、20或30個)胺基酸殘基，並且包含蛋白質的表位，使得針對該肽形成的抗體與蛋白質的特異性免疫複合物。如上所述，人CD79b的全長序列是本領域已知的。在一些實施例中，Fc標籤或His標籤的人CD79b蛋白用作免疫原。在一些實施例中，人CD79b的細胞外結構域(ECD)用作免疫原。

免疫原通常用於通過免疫合適的受試者(例如，表達至少一個人免疫球蛋白基因座的人或轉基因動物)來製備抗體。合適的免疫原性製劑可以包含例如重組表達的或化學合成的多肽(例如人CD79b的片段)。所述製劑還可包括佐劑，例如弗氏完全或不完全佐劑，或類似的免疫刺激劑。

根據上述通過用CD79b多肽或其抗原肽(如CD79b的一部分)作為免疫原免疫合適的受試者來製備多克隆抗體。可以通過標準技術隨時間監測免疫受試者的抗體效價，例如使用固定化CD79b多肽或肽的酶聯免疫吸附測定(ELISA)。如果需要，可以從哺乳動物(如從血液)中分離抗體分子，並通過眾所周知的技術進一步純化，例如蛋白G層析的蛋白A，以獲得IgG級分。在免疫後的適當時間，例如，當特異性抗體滴度最高時，可從受試者獲得產生抗體的細胞並用於通過標準技術製備單克隆抗體，例如最初由Kohler等人描述的雜交瘤技術(Nature 256：495-497,1975)，人B細胞雜交瘤技術(Kozbor et al.,Immunol.Today 4：72,1983)，EBV雜交瘤技術(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96,1985)或trioma技術。產生雜交瘤的技術是眾所周知的(通常詳見Current Protocols in Immunology,1994,Coligan et al.(Eds.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY)。產生單克隆抗體的雜交瘤細胞通過篩選雜交瘤培養物上清液中結合感興趣的多肽或表位的抗體來檢測，例如，使用標準ELISA測定法。

本文所述的抗體或抗原結合片段的變體可通過將適當的核苷酸變化引入編碼本文所述的人、人源化或嵌合抗體或其抗原結合片段的DNA中，或通過肽合成來製備。此類變體包括例如構成抗體的抗原結合位元點或抗原結合結構域的胺基酸序列內的殘基的缺失、插入或取代。在此類變體群體中，一些抗體或抗原結合片段對靶蛋白(例如CD79b)的親和力會增加。可以進行缺失、插入和/或組合的任何組合以獲得對靶標具有增加的結合親和力的抗體或其抗原結合片段。引入抗體或抗原結合片段的胺基酸變化也可以改變或引入新的翻譯後修飾到抗體或抗原結合片段，例如改變(例如，增加或減少)醣基化位點的數量，改變醣基化位點的類型(例如，改變胺基酸序列，使細胞中存在的酶連接不同的醣)，或引入新的醣基化位點。

本文所述的抗體可源自任何動物物種，包括哺乳動物。天然抗體的非限制性實例包括源自人類、靈長類動物(如猴子和猿)、兔、牛、豬、馬、綿羊、駱駝科動物(如駱駝和美洲駝)、雞、山羊和齧齒動物(如大鼠、小鼠、倉鼠和兔子)，包括經過基因工程改造以產生人類抗體的轉基因動物。

人抗體和人源化抗體包括具有源自人種系免疫球蛋白序列(或具有與源自那些相同的胺基酸序列)的可變區和恆定區的抗體。人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如通過體外隨機或定點誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)，例如在CDR中。

人源化抗體通常具有嫁接有非人CDR的人框架(FR)。因此，人源化抗體具有從非人類來源引入其中的一個或多個胺基酸序列。這些非人類胺基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，通常取自“輸入”可變域。人源化基本上可以通過例如用齧齒動物CDR或CDR序列替換人抗體的相應序列來進行。這些方法描述於如Jones et al.,Nature,321：522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239：1534-1536(1988)；其中每一篇文獻均通過引用整體併入本文。因此，“人源化”抗體是嵌合抗體，其中基本上少於完整的人V結構域已被來自非人物種的相應序列取代。實際上，人源化抗體通常是非人抗體，其中一些CDR殘基和一些FR殘基被人抗體中類似位點的殘基取代。

用於製備人源化抗體的人VH和VL結構域的選擇對於降低免疫原性非常重要。根據所謂的“最佳匹配”方法，非人類抗體的V結構域序列針對已知人類結構域序列的整個文庫進行篩選。然後，最接近非人類動物序列的人類序列被接受為人源化抗體的人類FR(ims et al.,J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196：901(1987))。

更重要的是抗體被人源化，同時保留對抗原的高特異性和親和力以及其他有利的生物學特性。為實現這一目標，可以通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產品的過程來製備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是普遍可用的並且為本領域技術人員所熟悉。可以使用電腦程式來說明和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構。檢查這些展示可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。以這種方式，可以從受體和輸入序列中選擇和組合FR殘基，從而實現所需的抗體特徵，例如增加對靶抗原的親和力。

通常，人、人源化或嵌合抗CD79b抗體的胺基酸序列變體將包含與原始抗體的輕鏈或重鏈中存在的序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。

相對於原始序列的同一性或同源性通常是候選序列中存在的胺基酸殘基與人、人源化或嵌合抗CD79b抗體或片段中存在的序列相同的百分比，在比對序列並引入後間隙，如有必要，以獲得最大百分比序列同一性，並且不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分。

可以對抗CD79b抗體或抗原結合片段進行其他修飾。例如，可將半胱胺酸殘基引入Fc區，從而允許在該區域形成鏈間二硫鍵。由此產生的同源二聚體抗體可具有任何增加的體外和/或體內半衰期。還可以使用異雙功能交聯劑製備體外和/或體內半衰期延長的同源二聚體抗體，例如，Wolff等人所述。(Cancer Res.53：2560-2565,1993)。或者，可以設計具有雙Fc區的抗體(詳見如，Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design 3：219-230,1989)。

在一些實施例中，可以對抗-CD79b抗體或其抗原結合片段進行共價修飾。這些共價修飾可以通過化學或酶促合成，或通過酶促或化學裂解來進行。通過使抗體或片段的目標胺基酸殘基與能夠與選定的側鏈或N-或C-末端殘基反應的有機衍生化試劑反應，將抗體或抗體片段的其他類型的共價修飾引入分子中。

在一些實施例中，提供的抗體變體具有缺乏(直接或間接)連接至Fc區的岩藻醣的碳水化合物結構。例如，此類抗體中岩藻醣的量可以為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。通過計算Asn297醣鏈內岩藻醣的平均量來確定岩藻醣的量，相對於通過MALDI-TOF質譜法測量的連接到Asn 297的所有醣結構(例如複合、雜合和高甘露醣結構)的總和，如在WO 2008/077546中描述。Asn297指位於Fc區中約297位的天冬醯胺殘基(Fc區殘基的Eu編號；或Kabat編號中的314位)；然而，由於抗體中的微小序列變異，Asn297也可能位於297位上游或下游約±3個胺基酸，即294位和300位之間。這種岩藻醣基化變體可能具有改善的ADCC功能。在一些實施例中，為了減少聚醣異質性，可以進一步改造抗體的Fc區以用丙胺酸(N297A)取代297位處的天冬醯胺。

在一些實施例中，為了避免Fab臂交換來提高生產效率，抗體的Fc區被進一步改造以用脯胺酸(S228P)取代IgG4的228位(EU編號)處的絲胺酸。關於S228突變的詳細描述，例如在Silva et al."The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation." Journal of Biological Chemistry 290.9(2015)：5462-5469，其通過引用整體併入本文。

重組載體

本發明還提供了重組載體(例如，表達載體)，其包括本文公開的分離的多核苷酸(例如，編碼本文公開的多肽的多核苷酸)、重組載體被引入其中的宿主細胞(即，使得宿主細胞含有多核苷酸和/或包含多核苷酸的載體)，以及通過重組技術生產重組抗體多肽或其片段。

如本文所用，“載體”是當載體被引入宿主細胞時能夠將一種或多種目的多核苷酸遞送至宿主細胞的任何構建體。“表達載體”能夠在已引入表達載體的宿主細胞中遞送和表達一種或多種感興趣的多核苷酸作為編碼的多肽。因此，在表達載體中，目的多核苷酸通過與調控元件(例如啟動子、增強子和/或多聚腺苷酸尾)可操作地連接在載體內或基因組中而定位用於在載體中表達。在感興趣的多核苷酸的整合位點處或附近或側翼的宿主細胞，使得感興趣的多核苷酸將在引入表達載體的宿主細胞中翻譯。

根據本文所用，“載體”是當載體被引入宿主細胞時能夠將一種或多種目的多核苷酸遞送至宿主細胞的任何構建體。“表達載體”能夠在已引入表達載體的宿主細胞中遞送和表達一種或多種感興趣的多核苷酸作為編碼的多肽。因此，在表達載體中，目的多核苷酸通過與調控元件(例如啟動子、增強子和/或多聚腺苷酸尾)可操作地連接在載體內或基因組中而定位用於在載體中表達。在感興趣的多核苷酸的整合位點處或附近或側翼的宿主細胞，使得感興趣的多核苷酸將在引入表達載體的宿主細胞中翻譯。

可以通過本領域已知的方法將載體引入宿主細胞，例如電穿孔、化學轉染(如DEAE-葡聚醣)、轉化、轉染和感染和/或轉導(例如，用重組病毒)。因此，載體的非限制性實例包括病毒載體(可用於產生重組病毒)、裸DNA或RNA、質粒、粘粒、噬菌體載體和與陽離子縮合劑結合的DNA或RNA表達載體。

在一些實施例中，使用病毒表達系統(例如，牛痘病毒或其他痘病毒、逆轉錄病毒或腺病毒)引入本文所述的多核苷酸(例如，編碼本文所述的多肽的多核苷酸)，這可能涉及使用非-致病性(缺陷)、複製能力強的病毒，或可能使用複製缺陷型病毒。在後一種情況下，病毒繁殖通常只發生在互補的病毒包裝細胞中。合適的系統在Fisher-Hoch et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：317-321；Flexner et al.,1989,Ann.N.Y.Acad Sci.569：86-103；Flexner et al.,1990,Vaccine,8：17-21；U.S.Pat.NO.4,603,112,4,769,330,and 5,017,487；WO 89/01973；U.S.Pat.No.4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner-Biotechniques,6：616-627,1988；Rosenfeld et al.,1991,Science,252：431-434；Kolls et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91：215-219；Kass-Eisler et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：11498-11502；Guzman et al.,1993,Circulation,88：2838-2848；and Guzman et al.,1993,Cir.Res.,73：1202-1207中描述。將DNA摻入此類表達系統的技術為本領域普通技術人員所熟知。DNA也可以是“裸露的”，如Ulmer et al.,1993,Science,259：1745-1749,and Cohen,1993,Science,259：1691-1692中所述。通過將DNA包被到可有效轉運到細胞中的可生物降解的珠子上，可以增加裸DNA的攝取。

為了表達，包含本文所述的編碼抗體或編碼多肽的多核苷酸的DNA插入片段可以可操作地連接到合適的啟動子(如異源啟動子)，例如噬菌體λPL啟動子、大腸桿菌lac、trp和tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉錄病毒LTR的啟動子等等。其他合適的啟動子是本領域技術人員已知的。表達構建體可以進一步包含用於轉錄起始、終止的位點，以及在轉錄區域中用於翻譯的核糖體結合位點。由構建體表達的成熟轉錄物的編碼部分可包括起始於待翻譯多肽末端的翻譯起始和終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。

根據所指出的，表達載體可以包括至少一種選擇標記。此類標記包括用於真核細胞培養的二氫葉酸還原酶或新黴素抗性以及用於在大腸桿菌和其他細菌中培養的四環素或胺苄青黴素抗性基因。合適宿主的代表性例子包括但不限於細菌細胞，例如大腸桿菌、鏈黴菌和鼠傷寒沙門氏菌細胞；真菌細胞，例如酵母細胞；果蠅S2、貪夜蛾Sf9等昆蟲細胞；CHO、COS、Bowes黑色素瘤、HK293細胞等動物細胞；和植物細胞。適用於本文所述宿主細胞的培養基和條件是本領域已知的。

用於細菌的非限制性載體包括pQE70、pQE60和pQE-9，可從Qiagen獲得；pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，可從Stratagene獲得；和ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5，可從Pharmacia獲得。非限制性真核載體包括pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG，可從Stratagene獲得；pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL可從Pharmacia獲得。其他合適的載體對技術人員來說是顯而易見的。

適用的非限制性細菌啟動子包括大腸桿菌lacI和lacZ啟動子、T3和T7啟動子、gpt啟動子、λPR和PL啟動子以及trp啟動子。合適的真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、逆轉錄病毒LTR的啟動子，例如Rous肉瘤病毒(RSV)的啟動子，以及金屬硫蛋白啟動子，例如小鼠金屬硫蛋白-I啟動子。

在釀酒酵母中，可以使用許多含有組成型或誘導型啟動子的載體，例如α因數、醇氧化酶和PGH。相關描述詳見Ausubel et al.(1989)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y,and Grant et al.,Methods Enzymol.,153：516-544(1997).中。

可以通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚醣介導的轉染、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、感染或其他方法將構建體引入宿主細胞。此類方法在許多標準實驗室手冊中有所描述，例如在Davis et al.,Basic Methods In Molecular Biology(1986)，其通過引用整體併入本文作為參考。

可通過將增強子序列插入載體中來增加高等真核生物對編碼本發明內容的抗體的DNA的轉錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常長約10至 300bp，在給定宿主細胞類型中起到增加啟動子轉錄活性的作用。增強子的例子包括SV40增強子，它位於複製起點的100到270鹼基對的後期，巨細胞病毒早期啟動子增強子，複製起點後期的多瘤增強子和腺病毒增強子。

為了將翻譯的蛋白質分泌到內質網腔、周質空間或細胞外環境中，可以將適當的分泌信號摻入所表達的多肽中。信號可以是多肽的內源性信號或者它們可以是異源信號。

多肽(如抗體)可以以修飾的形式表達，例如融合蛋白(如GST-融合蛋白)或帶有組胺酸標籤，並且不僅可以包括分泌信號，還可以包括額外的異源功能區。例如，可以在多肽的N末端添加一個額外的胺基酸區域，特別是帶電荷的胺基酸，以在純化過程中或在隨後的處理和儲存過程中提高在宿主細胞中的穩定性和持久性。此外，可以將肽部分添加到多肽中以促進純化。可以在最終製備多肽之前去除這些區域。向多肽添加肽部分以引起分泌或排泄、提高穩定性和促進純化等是本領域熟悉和常規的技術。

治療方法

本發明內容的抗體或其抗原結合片段可用於各種治療目的。

一方面，本發明內容提供了治療受試者癌症的方法、降低受試者腫瘤體積隨時間增加的速率的方法、降低發生轉移的風險的方法，或減少轉移的方法。在受試者中發生額外轉移的風險。在一些實施例中，治療可以停止、減緩、延緩或抑制癌症的進展。在一些實施例中，治療可導致受試者中癌症的一種或多種症狀的數量、嚴重性和/或持續時間的減少。

一方面，本發明內容的特徵在於包括將治療有效量的本文公開的抗體或其抗原結合片段給予有需要的受試者(如患有癌症或鑒定或診斷患有癌症的受試者)的方法，例如，乳腺癌(如三陰性乳腺癌)、類癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、神經膠質瘤、頭頸癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、結腸直腸癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、尿道癌或血液系統惡性腫瘤。在一些實施例中，癌症是不可切除的黑色素瘤或轉移性黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、膀胱癌或轉移性激素難治性前列腺癌。在一些實施例中，癌症是NSCLC、卵巢癌、黑色素瘤、結腸直腸癌、乳腺癌、血液惡性腫瘤、頭頸癌、胃腸癌、膀胱癌或骨癌。在一些實施例中，受試者患有何杰金氏淋巴瘤。在一些實施例中，受試者患有三陰性乳腺癌(TNBC)、胃癌、尿路上皮癌、默克爾細胞癌或頭頸癌。在一些實施例中，癌症是黑色素瘤、胰腺癌、間皮瘤、血液惡性腫瘤，尤其是非何杰金氏淋巴瘤、淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病或晚期實體瘤。在一些實施例中，癌症是淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌或尿路上皮癌。

在一些實施例中，本文所述的組合物和方法可用於治療處於癌症風險中的患者。可以用本領域已知的各種方法鑒定患有癌症的患者。

一方面，本發明內容提供了用於治療、預防或降低發生與異常或不需要的免疫反應相關的病症例如自體免疫病症的風險的方法。這些自體免疫疾病包括但不限於斑禿、狼瘡、強直性脊柱炎、美尼爾氏病、抗磷脂綜合征、混合性結締組織病、自體免疫性艾迪生病、多發性硬化症、自體免疫性溶血性貧血、重症肌無力、自體免疫性肝炎、尋常型天皰瘡、白塞氏病、惡性貧血、大皰性類天皰瘡、結節性多發性關節炎、心肌病、多軟骨炎、腹腔口炎性口炎、多腺體綜合征、慢性疲勞綜合征(CFIDS)、風濕性多肌痛、慢性炎症性脫髓鞘、多發性肌炎和皮肌炎、慢性炎症性多發性神經病、原發性丙種球蛋白血症、Churg-Strauss綜合征、原發性膽汁性肝硬化、瘢痕性類天皰瘡、牛皮癬、CREST 綜合征、雷諾現象、冷凝集素病、Reiter綜合征、克羅恩病、風濕熱、盤狀狼瘡、類風濕性關節炎、冷球蛋白血症、肉瘤病、纖維肌痛、硬皮病、Grave病、Sjögren's綜合征、格林-巴厘綜合征、stiff-man綜合征、橋本氏甲狀腺炎、大動脈炎、特發性肺纖維化、顳動脈炎/鉅細胞動脈炎、特發性血小板減少性紫斑症(ITP)、潰瘍性結腸炎、IgA腎病、葡萄膜炎、糖尿病(如I型))、血管炎、扁平苔蘚和白癜風。還可以將抗CD79b抗體或其抗原結合片段施用於受試者以治療、預防或降低發生與細胞、組織或器官移植相關的異常或不需要的免疫反應相關的病症的風險，例如腎移植、肝臟和心臟移植，例如移植物抗宿主病(GVHD)，或防止同種異體移植排斥反應。在一些實施例中，受試者患有皮膚病、肝病(例如，肝硬化)、汗腺炎、實驗性自體免疫性腦脊髓炎。在一些實施例中，受試者患有腎病、狼瘡、乾燥綜合征、潰瘍性結腸炎、牛皮癬、化膿性汗腺炎、免疫性血小板減少症(ITP)或其他炎性關節炎。在一些實施例中，受試者患有多發性硬化症或重症肌無力。在一些實施例中，受試者患有克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎或1型糖尿病。在一些實施例中，受試者患有自體免疫性甲狀腺疾病、格雷夫氏病、多發性硬化症、牛皮癬、炎性腸病(例如，克羅恩氏病(CD)和潰瘍性結腸炎)、類風濕性關節炎、乾燥綜合征、自體免疫性腎炎或系統性紅斑狼瘡。在一些實施例中，所述方法涉及向受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含根據本文所述的抗體或其抗原結合片段。

根據本文所用，“有效量”是指足以實現有益或期望結果的量或劑量，包括停止、減緩、延緩或抑制疾病例如自體免疫疾病或癌症的進展。有效量將根據例如要施用抗體、抗原結合片段、抗體編碼多核苷酸、包含多核苷酸的載體和/或其組合物的受試者的年齡和體重、嚴重程度而變化症狀和給藥途徑，因此可以在個體基礎上確定給藥。

可以在一次或多次施用中施用有效量。例如，抗體或抗原結合片段的有效量是足以改善、停止、穩定、逆轉、抑制、減緩和/或延遲患者自體免疫疾病或癌症進展的量，或者是足以在體外改善、停止、穩定、逆轉、減緩和/或延遲細胞(例如活檢細胞、本文所述的任何癌細胞或細胞系(例如癌細胞系))增殖的量。如本領域所理解的，抗體或抗原結合片段的有效量可以變化，尤其取決於患者病史以及其他因素例如所用抗體的類型(和/或劑量)。

可以憑經驗確定用於施用本文所述的抗體、編碼抗體的多核苷酸和/或組合物的有效量和時間表，並且進行此類確定在本領域技術範圍內。本領域技術人員將理解，必須施用的劑量將根據例如將接受本文所述的抗體、編碼抗體的多核苷酸和/或組合物的哺乳動物、施用途徑、特定類型而變化本文所述的抗體、編碼抗體的多核苷酸、抗原結合片段和/或組合物的組合以及其他藥物被施用於哺乳動物。可以在關於抗體和抗原結合片段的治療用途的文獻中找到為抗體或抗原結合片段選擇適當劑量的指導，例如，Handbook of Monoclonal Antibodies,Ferrone et al.,eds.,Noges Publications,Park Ridge,N.J.,1985,ch.22 and pp.303-357；Smith et al.,Antibodies in Human DiagNOis and Therapy,Haber et al.,eds.,Raven Press,New York,1977,pp.365-389。

有效量抗體的典型日劑量為0.01mg/kg至100mg/kg。在一些實施例中，劑量可以小於100mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些實施例中，劑量可以大於10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.1mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg。在一些實施例中，劑量為約10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg或0.1mg/kg。

在本文所述的任何方法中，至少一種抗體、其抗原結合片段或藥物組合物(如本文所述的任何抗體、抗原結合片段或藥物組合物)和任選地至少一種額外的治療劑可以每週至少一次施用於受試者(如每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次、每天一次、每天兩次或每天三次)。在一些實施例中，至少兩種不同的抗體和/或抗原結合片段在同一組合物(如液體組合物)中施用。在一些實施例中，至少一種抗體或抗原結合片段和至少一種另外的治療劑在同一組合物(如液體組合物)中施用。在一些實施例中，至少一種抗體或抗原結合片段和至少一種另外的治療劑以兩種不同的組合物施用(如含有至少一種抗體或抗原結合片段的液體組合物和含有至少一種另外的治療劑的固體口服組合物)。在一些實施例中，至少一種另外的治療劑作為丸劑、片劑或膠囊給藥。在一些實施例中，至少一種另外的治療劑以緩釋口服製劑施用。

在一些實施例中，可以在施用至少一種抗體、抗原結合抗體片段或藥物組合物(例如任何抗體、抗原結合抗體)之前或之後向受試者施用一種或多種額外的治療劑本文所述的片段或藥物組合物)。在一些實施例中，將一種或多種另外的治療劑和至少一種抗體、抗原結合抗體片段或藥物組合物(例如，本文所述的任何抗體、抗原結合抗體片段或藥物組合物)施用至受試者中的一種或多種另外的治療劑和至少一種抗體或抗原結合片段(例如，本文所述的任何抗體或抗原結合片段)的生物活性期存在重疊。

在一些實施例中，可以在延長的時間段內(如在至少1周、2周、3周、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、1年、2年、3年、4年或5年的時間內)向受試者施用至少一種抗體、抗原結合抗體片段或藥物組合物(如本文描述的任何抗體、抗原結合抗體片段或藥物組合物)。熟練的醫療專業人員可以使用本文描述的任何方法來確定治療期的長度，以診斷或跟蹤治療的有效性(如觀察至少一種癌症症狀)。根據本文所述，熟練的醫學專業人員還可以改變給予受試者的抗體或抗原結合抗體片段(和/或一種或多種另外的治療劑)的識別和數量(如增加或減少)，並且還可以調整(如增加或減少)。基於治療有效性的評估(如增加或減少)向受試者施用至少一種抗體或抗原結合抗體片段(和/或一種或多種另外的治療劑)的劑量或頻率(如使用本文描述的和本領域已知的任何方法)。

在一些實施例中，可將一種或多種另外的治療劑施用於受試者。額外的治療劑可包含一種或多種選自下組的抑制劑：B-Raf抑制劑、EGFR抑制劑、MEK抑制劑、ERK抑制劑、K-Ras抑制劑、c-Ras抑制劑。Met，一種間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑，一種磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑，一種Akt抑制劑，一種mTOR抑制劑，一種雙重PI3K/mTOR抑制劑，一種布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑)，以及異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)和/或異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)的抑制劑。在一些實施例中，另外的治療劑是吲哚胺2,3-雙加氧酶-1)(IDO1)的抑制劑(如epacadostat)。

在一些實施例中，另外的治療劑可包含一種或多種選自下組的抑制劑：PD-1抑制劑、LSD1抑制劑、MDM2抑制劑、BCL2抑制劑、CHK1抑制劑、啟動刺蝟信號通路，以及選擇性降解雌激素受體的藥劑。

在一些實施例中，另外的治療劑可以包括一種或多種選自下組的治療劑：曲貝替定、白蛋白結合型紫杉醇、曲貝尼布、帕唑帕尼、西地尼布、帕博西尼、依維莫司、氟嘧啶、IFL、瑞戈非尼、Reolysin、Alimta、Zykadia、Sutent、temsirolimus、axitinib、everolimus、sorafenib、Votrient、Pazopanib、IMA-901、AGS-003、cabozantinib、Vinflunine、一種Hsp90抑制劑、Ad-GM-CSF、Temazolomide、IL-2、IFNa、vinblastine、Thalomid、dacarbazine、cyclophosphamide、來那度胺、氮雜胞苷、來那度胺、硼替佐米、氨柔比星、卡非佐米、普拉曲沙和恩紮妥林。

在一些實施例中，另外的治療劑可以包括一種或多種選自下組的治療劑：佐劑、TLR激動劑、腫瘤壞死因數(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗劑、IL-4拮抗劑、IL-13拮抗劑、IL-17拮抗劑、HVEM拮抗劑、ICOS激動劑、靶向CX3CL1的治療、靶向CXCL9的治療、靶向CXCL10的治療、靶向CCL5的治療、LFA-1激動劑、ICAM1激動劑和PD-1激動劑。

在一些實施例中，向受試者施用卡鉑、白蛋白結合型紫杉醇、紫杉醇、順鉑、培美曲塞、吉西他濱、FOLFOX或FOLFIRI。

在一些實施例中，另外的治療劑是抗OX40抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L2抗體、抗LAG-3抗體、抗TIGIT抗體、抗BTLA抗體、抗CTLA4抗體、抗ICOS抗體、抗CD27抗體、抗4-1BB抗體、抗CD40抗體、抗VEGFR2抗體、抗EGFR抗體、抗HER2抗體、TIM3抗體、CD103抗體、TGFBR2抗體和/或抗GITR抗體。

一方面，本發明內容提供了聯合療法。在一些實施例中，抗CD79b抗體或其抗原結合片段(如本文所述的任何抗體)可以與抗CTLA4抗體一起施用。

藥物組合物和給藥途徑

本文還提供藥物組合物，其包含至少一種(如一種、兩種、三種或四種)本文所述的抗體或抗原結合片段。兩種或更多種(如兩種、三種或四種)本文所述的任何抗體或抗原結合片段可以任何組合存在於藥物組合物中。藥物組合物可以本領域已知的任何方式配製。

配製藥物組合物以與其預期給藥途徑(如靜脈內、動脈內、肌內、皮內、皮下或腹膜內)相容。所述組合物可以包括無菌稀釋劑(如無菌水或鹽水)、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑、抗菌劑或抗真菌劑，例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸酸、硫柳汞等，抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉，螯合劑，例如乙二胺四乙酸，緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及等滲劑，例如醣類(如葡萄糖)，多元醇(如甘露醇或山梨醣醇)，或鹽(如氯化鈉)或其任何組合。脂質體懸浮液也可用作藥學上可接受的載體(詳見如美國專利號4,522,811)。可以配製組合物的製劑並將其封裝在安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。在需要時(如在可注射製劑中)，可以通過使用例如卵磷脂或表面活性劑等包衣來維持適當的流動性。抗體或其抗原結合片段的吸收可以通過包含延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鋁和明膠)來延長。或者，可通過植入物和微囊化遞送系統實現控釋，其中可包括可生物降解的生物相容性聚合物(如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸；AlzaCorporation和NovaPharmaceutical,Inc.)。

含有一種或多種本文所述的任何抗體或抗原結合片段的組合物可以配製成劑量單位形式(即物理上離散的單位，含有預定量的活性化合物，以便於給藥和劑量均勻)。

用於腸胃外給藥的藥物組合物優選是無菌的和基本上等滲的並且在良好生產規範(GMP)條件下製造。藥物組合物可以單位劑量形式提供(即單次給藥的劑量)。藥物組合物可以使用一種或多種生理上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑來配製。製劑取決於選擇的給藥途徑。對於注射，抗體可以在水溶液中配製，優選在生理相容的緩衝液中以減少注射部位的不適。該溶液可以含有配製劑，例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。或者，抗體可以是凍幹形式，以便在使用前用合適的載體(如無菌無熱原水)進行配製。

組合物的毒性和治療功效可以通過細胞培養物或實驗動物(例如，猴子)中的標準藥學程式來確定。例如，可以確定LD50(對50%的人群致死的劑量)和ED50(對50%的人群治療有效的劑量)：治療指數是LD50：ED50的比率。優選表現出高治療指數的藥劑。當藥物表現出不良副作用時，應注意儘量減少潛在損害(即減少不良副作用)。毒性和治療效果可以通過其他標準製藥程式來確定。

從細胞培養測定和動物研究中獲得的資料可用於配製任何給定藥劑的適當劑量以用於受試者(如人類)。一種或多種(如一種、兩種、三種或四種)抗體或其抗原結合片段(如本文所述的任何抗體或抗體片段)的治療有效量將是治療疾病的量受試者(如殺死癌細胞)在受試者(如被鑒定為患有癌症的人類受試者)中，或被鑒定為處於發展疾病風險中的受試者(如先前已經患上癌症但現在已經治癒)，降低受試者(如人類)的一種或多種疾病症狀的嚴重程度、頻率和/或持續時間。本文所述的任何抗體或抗原結合片段的有效性和劑量可由醫療保健專業人員或獸醫專業人員使用本領域已知的方法以及通過觀察受試者的一種或多種疾病症狀來確定(如人類)。某些因素可能會影響有效治療受試者所需的劑量和時間(如疾病或病症的嚴重程度、既往治療、受試者的一般健康狀況和/或年齡，以及其他疾病的存在)。

示例性劑量包括每公斤受試者體重的毫克或微克量的本文所述的任何抗體或抗原結合片段(如約1μg/kg至約500mg/kg；約100μg/kg至約500mg/kg；約100μg/kg至約50mg/kg；約10μg/kg至約5mg/kg；約10μg/kg至約0.5mg/kg；或約1μg/kg至約50μg/kg)。雖然這些劑量涵蓋了廣泛的範圍，但本領域的普通技術人員將理解，包括抗體及其抗原結合片段在內的治療劑的效力各不相同，並且有效量可以通過本領域已知的方法來確定。通常，首先給予相對較低的劑量，主治醫療保健專業人員或獸醫專業人員(在治療應用的情況下)或研究人員(當仍處於開發階段時)可以隨後逐漸增加劑量，直到出現適當的反應獲得。此外，可以理解，任何特定受試者的具體劑量水準將取決於多種因素，包括所用具體化合物的活性、受試者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食、時間給藥方式、給藥途徑、排泄速率和抗體或抗體片段在體內的半衰期。

藥物組合物可以與給藥說明一起包含在容器、包裝或分配器中。本發明內容還提供了製造用於本文所述的各種用途的抗體或其抗原結合片段的方法。

實施例

本發明內容在以下實施例中進一步描述，其不限制所描述的申請專利範圍中關於本發明內容的範圍。

實施例1. 抗CD79b抗體的產生

用CD79b抗原免疫兔

為了產生針對人CD79b的單克隆抗體，使用完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，用人類CD79b ECD抗原(SEQ ID NO：1，aa.29-159，帶his標籤，來自AcroBiosystems)對兩隻紐西蘭白兔進行免疫。第二次注射後通過ELISA監測血清效價。

篩選產生CD79b單克隆抗體的單個B細胞

在以200μg/兔/注射進行3-4次免疫後，滴度良好(>1：100,000)的兔接受最後一次加強注射，並在最後一次注射後7天收穫脾臟。

從兔中分離脾細胞

以下所有程式(離心除外)均在生物安全櫃中進行。在最後一次加強注射後7天收穫兔脾臟。在放置在100mm無菌培養皿底部的無菌細胞篩檢程式中製備脾細胞，其中含有20mL RPMI+1%的青黴素-鏈黴素(P/S)。使用無菌鑷子，將脾臟組織轉移到細胞篩檢程式中。具體地，在用鑷子夾住脾臟的同時，將脾臟切成小塊，然後將其壓過細胞濾網的網眼。用10mL RPMI+1% P/S清洗組織碎片。將脾細胞從培養皿轉移到新的50mL錐形管中。添加RPMI+1% P/S至最終體積為50ml。將細胞以400×g離心5分鐘，吸出上清液。添加13mL ACK緩衝液(Gibco目錄號A1049201)以重懸細胞。懸浮的細胞在室溫下孵育1分鐘。添加RPMI+1% P/S以達到50ml的最終體積。將細胞以400×g離心5分鐘，吸出上清液。將細胞沉澱重新懸浮在RPMI+10% FBS+1% P/S中。將細胞以400×g離心5分鐘，吸出上清液。將沉澱重新懸浮在15ml RPMI+10% FBS+1% P/S中。將細胞通過100μm細胞篩檢程式移入50mL錐形管中以去除細胞團塊。然後將脾細胞以所需的密度(例如，4E6個細胞/ml)用適當的培養基接種以進行分選。剩餘的脾細胞在90%血清+10% DMSO中以6×107個細胞/小瓶(~1.8ml)在-80℃下冷凍過夜。將冷凍細胞轉移至液氮罐中長期保存。

抗原特異性B細胞分選

對於B細胞分選，在B細胞培養基(RPMI-1640、15% FBS、1×HEPES、1×2-ME(2-巰基乙醇)、1%青黴素/鏈黴素)在分選前過夜。在分選前一天相應地製備96孔B細胞飼養板。在分選當天，通過用移液器輕輕吸取培養基對著燒瓶的培養表面收集懸浮和鬆散附著的脾細胞。然後將細胞轉移到錐形管中並以400×g離心3分鐘。用螢光啟動細胞分選(FACS)緩衝液(1×PBS+0.5% BSA)洗滌細胞沉澱兩次。以5μg/ml(終濃度)添加生物素化抗原。將混合物在室溫(RT)下孵育20分鐘。然後將染色混合物以400×g離心3分鐘，並將細胞重新懸浮在FACS緩衝液中。將細胞轉移到1.5ml琥珀色Eppendorf管中。然後將染色抗體混合物添加到細胞中。將染色混合物在4℃下孵育15-30分鐘，然後以400×g離心3分鐘。細胞沉澱用FACS緩衝液洗滌兩次。將洗滌後的細胞沉澱以約107個細胞/ml的濃度重懸於1×PBS+1% FBS中。使用螢光啟動細胞分選法，將抗原特異性單個B細胞分選到96孔板(每只兔子20個板)中。將分選B細胞的96孔B細胞培養板在37℃、5% CO2條件下培養12天。

單個B細胞培養物的篩選

在分選後第8天，從每個孔中收集15μL的B細胞培養上清液用於抗原特異性ELISA。簡而言之，將B細胞培養物上清液轉移至包被的CD79b胞外域(ECD)，然後封閉384孔板。細胞在室溫下孵育1小時，並用PBS加0.05% Tween-20洗滌3次。使用山羊抗兔IgG HRP+TMB底物檢測分泌的抗體。然後選擇符合OD450截止值(>0.5或3倍於免疫前血清)的B細胞上清液。使用FACS，將選定的細胞(1)反篩選具有N端缺失的CD79b變體(從N端刪除前13個胺基酸殘基，SEQ ID NO：2)；(2)針對獼猴CD79b(SEQ ID NO：3)進行跨物種結合篩選，和(3)針對細胞表面結合篩選Daudi細胞。

對來自40個板(96孔板)分選的B細胞的上清液進行初始ELISA篩選，以篩選CD79b特異性抗體。鑒定了大約230個CD79b抗原特異性陽性B細胞克隆。

在分選後第12天，將B細胞培養板以400×g離心3分鐘。收集來自陽性克隆的上清液(OD大於抗原特異性ELISA的選定截止值)，並將細胞沉澱保存在250μL PCR管中的100μL DNA/RNA shield(Zymo Cat# R1100-250)中。收集的上清液進行如下所述的額外測試。

篩選與細胞表面表達的CD79b結合的CD79b特異性抗體

CD79b是B細胞受體複合物的成員。預計由於表位可及性，並非所有在ELISA中結合CD79b的抗體克隆也會結合細胞表面表達的CD79b。通過FACS對通過ELISA鑒定的CD79b特異性B細胞克隆進行與Daudi細胞的細胞表面結合測定。簡而言之，將50μl B細胞上清液(在FACS緩衝液、1x PBS+0.5% BSA中按1：10稀釋)與50,000個Daudi細胞(接種在96孔板中)一起在冰上孵育1小時，然後用150微升冰冷的FACS緩衝液。加入100μl抗兔-PE二抗(Biolegend)，混合並在冰上孵育30分鐘。細胞用150μl FACS緩衝液洗滌3次，最後重懸於100μl FACS緩衝液中。來自每個染色的5,000個細胞被收集在流式細胞儀中用於分析。在大約230個ELISA陽性B細胞克隆中，有12個克隆顯示與細胞表面的CD79b結合。

從選定的抗CD79b克隆中獲得VH和VL基因序列

編碼來自B細胞克隆的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)的DNA片段顯示對CD79b具有高細胞表面結合親和力，通過5' RACE(cDNA末端快速擴增)、TOPO克隆和測序。

實施例2. 嵌合表達構建體的生成

為了表達兔/人嵌合IgG1抗體，人IgG1重鏈恆定區(CH1-CH3，SEQ ID NO：4)和人Kappa輕鏈恆定區(CL-kappa，SEQ ID NO：5)被分別合成並克隆到pcDNA3.4載體(Invitrogen)中。重鏈克隆載體pcDNA3.4-huIgG1-Hc用EcoRI/NheI消化用於VH片段的克隆。輕鏈克隆載體pcDNA3.4-huKappa-Lc用EcoRI/BsiWI消化用於VL片段的克隆。生了重組兔/人嵌合抗體構建體。具體而言，通過基因合成(整合DNA技術)獲得從兔抗CD79b抗體中選擇的VH和VL 序列，並與前導序列(SEQ ID NO：6)連接，以在兩個5'和3'端用於Gibson組裝(NEB NEBuilder® HiFi DNA組裝)以生成HC和LC表達質粒。組裝的質粒用於轉化感受態大腸桿菌(NEB® 5-alpha)。根據測序結果(Elim Biopharm)篩選出序列正確的克隆，再用含有羧苄青黴素(100ug/ml)的LB培養。純化質粒(QIAGEN Plasmid Plus Kits)，在無核酸酶H₂O(Sigma)中洗脫，並儲存在-80℃。

實施例3.嵌合抗CD79b抗體的表達和純化

通過用含有配對VH和VL序列的pcDNA3.4-huIgG1-Hc和pcDNA3.4-huKappa-Lc轉染細胞，在CHO細胞(ExpiCHO^TM表達系統，Gibco)中表達重組嵌合抗體。ExpiCHO細胞用ExpiCHO表達培養基培養，並保持在0.3至6×106個細胞/ml、37℃、125rpm、5% CO₂和80%濕度。在125ml帶擋板的燒瓶中，以3×106/ml接種25ml新鮮的ExpiCHO細胞(6×106/ml，存活率>95%，在轉染前一天製備)。將含有pcDNA3.4-huIgG1-Hc和pcDNA3.4-huKappa-Lc(每種質粒12ug)的1ml無血清培養基(OptiPRO^TM SFM，Gibco)與含有80ul轉染試劑的1ml OptiPRO^TM SFM(ExpiFectamine^TM CHO試劑，Gibco)。然後將轉染混合物添加到25ml ExpiCHO細胞中並在37℃下培養。第二天，在添加150ul ExpiFectamine^TM CHO Enhancer、6ml ExpiCHO^TM Feed和1×Penicillin-Streptomycin(Gibco)後，將轉染培養物轉移至32℃培養箱。監測轉染培養物的細胞密度和活力，並使用帶有蛋白A生物感測器(Gator Bio的Gator prime)的生物層干涉測量法(BLI)儀器監測培養基中的IgG1抗體滴度。

5天后，收集含有分泌的IgG1抗體的培養基(以2000g離心10分鐘)，過濾(Thermo Scientific^TM Nalgene^TM Rapid-Flow^TM無菌一次性篩檢程式)並使用蛋白A樹脂(TOYOPEARL AF-rProtein Hc-650F)填充重力流柱 (Bio-Rad)。IgG1抗體用3.5ml Glycine-HCl(100mM,pH 2.7)洗脫，立即用1M Tris-HCl(pH8.5)中和，用Thermo Scientific^TM Slide-A-Lyzer^TM G2透析盒(20K MWCO)在1×PBS中透析緩衝液(pH 7.2)，並在4℃下保存。使用NanoDrop^TM One/OneC微量紫外-可見分光光度計(Thermo Scientific^TM)測定純化的IgG1抗體的濃度，並在變性和非變性條件下通過SDS-PAGE凝膠檢查IgG1抗體的品質。

實施例4.通過ELISA和BLI測定的抗CD79b抗體對人和食蟹猴CD79b重組蛋白的結合親和力

通過ELISA測試了抗CD79b抗體與人和獼猴CD79b重組蛋白的結合親和力。將1μg/ml(在PBS緩衝液中)人或獼猴CD79b重組蛋白包被在ELISA板上過夜。洗滌ELISA板並用封閉緩衝液(PBS+1%BSA)封閉，然後與連續稀釋的抗CD79b一抗孵育。使用抗人IgG HRP二抗(Biolegend目錄號410902)和HRP底物定量抗CD79b抗體結合。抗CD79b抗體對人和獼猴CD79b重組蛋白的ELISA結合親和力顯示在表1、圖1和圖2中。

通過BLI測試抗CD79b抗體與人CD79b重組蛋白的結合親和力。抗人IgG Fc探針(Gator Bio Catalog #160024)捕獲了10μg/ml的抗CD79b抗體。測量連續稀釋(146nM至0nM，在PBS+0.05% Tween-20中稀釋2倍)人CD79b重組蛋白的結合和解離。絕對kD是通過應用1：1結合模型(Global Rmax unlinked)確定的。抗CD79b抗體對人CD79b重組蛋白的BLI結合親和力顯示在表1和圖3中。Polatuzumab用於比較目的。對於ch44G2，根據BLI資料，Kon為3.77E+05，但檢測不到koff。這表明ch44G2與CD79b具有很強的結合親和力。

實施例5. 抗CD79b抗體的內化

評估了抗CD79b抗體的內在化。將約50,000個Ramos細胞與20ug/ml標記的抗CD79b抗體一起孵育，並在37℃下孵育。在不同的時間點，洗滌細胞並使用抗人IgG PE二抗(Jackson Research Catalogue #109-116-170)檢測抗CD79b抗體結合受體的存在。為了進行分析，將每種抗體的平均螢光強度(MFI(PE))標準化為其各自的零時間點(100%)，並繪製百分比MFI(PE)隨時間的減少。如圖4所示，所有篩選的抗CD79b抗體的內化都比polatuzumab慢。其中，ch23D8、ch44G2、ch48H10和ch57B9表現出比其他抗體慢得多的內化過程。

實施例6. 腫瘤細胞表面CD79b抗原密度的定量

為了估計惡性B腫瘤細胞和正常B細胞表面的CD79b抗原表達水準，惡性B腫瘤細胞系和來自兩個健康供體的PBMC在冰上以飽和濃度的抗CD79b抗體ch44G2染色30分鐘。用PBS洗滌後，將細胞用二次PE標記的抗人IgG(Invitrogen，目錄號：12-4998-82)在冰上染色30分鐘。然後用PBS洗滌細胞並重懸於FACS緩衝液中，以使用Cytek northern lights進行流式細胞術分析。使用GraphPad prism軟體(版本9.4.1；GraphPad Software Inc.)分析結果並繪製圖表。惡性B腫瘤細胞和正常B細胞表面上CD79b抗原密度的定量顯示在表2和圖5中。

實施例7. 惡性B細胞系結合試驗

測試了抗CD79b抗體與惡性B細胞系的結合親和力。Polatuzumab和IgG1分別用作陽性對照和陰性對照。將96孔板中50,000個細胞/孔的惡性B細胞系(BJAB、Ramos、Daudi、SU-DHL-4和Nalm-6)與抗CD79b抗體(ch22D10、ch23D8、ch29C3、ch44G2、ch48H10、ch57B9和polatuzumab)和IgG1(Biolegend，目錄號：403502)在不同濃度下(從40nM連續1：3稀釋)一起孵育在冰上30分鐘，並用200μl PBS洗滌兩次。然後將細胞與100μl抗人IgG1-PE(Invitrogen，cat：12-4998-82)，1：1000稀釋，在冰上孵育30分鐘，在流式細胞術分析之前用200ul PBS洗滌3次。如圖6-10所示，抗CD79b抗體ch23D8、ch44G2、ch48H10和ch57B9顯示出比Polatuzumab對BJAB(圖6)、Ramos(圖7)、Daudi(圖8)、SU-DHL-4(圖9)和Nalm-6(圖10)更高的細胞表面結合親和力(更低的EC50)。結果表明，ch23D8、ch44G2、ch48H10和ch57B9可以結合具有高水準和低水準CD79b抗原密度的惡性B細胞系。

實施例8. 內源性B細胞結合測定

測試了抗CD79b抗體與內源性B細胞的結合親和力。Polatuzumab和IgG1對照分別用作陽性對照和陰性對照。來自4名供體(斯坦福血液中心)的PBMC在96孔板中分別以200,000個細胞/孔與不同濃度(連續從50nM 1：5稀釋)抗CD79b抗體(ch23D8,ch44G2,ch48H10和polatuzumab)和IgG1(Biolegend，目錄號：403502)的在冰上孵育30分鐘，並用200μl PBS洗滌兩次。然後將細胞與100μl 1：1000稀釋的抗人IgG1-PE(Invitrogen，目錄號：12-4998-82)和CD19-BV421(Biolegend,cat#：302230,1：400稀釋)混合物一起孵育冰浴30min，流式細胞分析前用200ul PBS洗滌3次。如圖11-14所示，ch44G2、ch48H10、ch23D8在所有4個不同的供體中顯示出比Polatuzumab更高的細胞表面結合親和力。

實施例9. CLL患者的PBMC結合測定

為了確定抗CD79b抗體與慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者B淋巴細胞上細胞表面CD79b的結合親和力，進行了基於細胞的結合測定。Polatuzumab和IgG1對照分別用作陽性和陰性對照。CLL患者PBMC購自Bioscience公司。FACS分析表明，PBMC中95%的B淋巴細胞(CD19+)呈陽性。具體而言，將50μl FACS緩衝液(1×PBS+2%BSA+2mM EDTA)中的2.5×104個PBMC細胞接種到V形底96孔板的每個孔中。然後，將50μl連續稀釋的抗CD79b抗體(ch22D10、ch23D8、ch29C3、ch44G2、ch48H10、ch57B9或polatuzumab)或IgG1添加到每個孔中。混合物在冰上孵育30分鐘，然後用FACS 緩衝液洗滌兩次。將細胞重懸於含有PE偶聯山羊抗人IgG Fc(1：1000)和抗人CD19(BV421)的100μl FACS緩衝液中，並在冰上避光孵育30分鐘。用FACS緩衝液洗滌兩次後，將細胞重新懸浮在100μl FACS緩衝液中，並用Cytek細胞儀進行分析。如圖15-16所示，ch23D8、ch44G2、ch48H10和ch57B9表現出比polatuzumab更有效的與CLL患者B淋巴細胞的結合。

實施例10. CD79b mAb與CD79b的長形式和短形式結合

進行了抗CD79b抗體與CD79b的短形式和長形式的表面結合的研究。Polatuzumab用作陽性對照。用分別編碼CD79b短形式(Nalm-6+短形式)和長形式(Nalm-6+長形式)的表達質粒電穿孔約200萬個Nalm-6細胞。48小時後，用選定的抗CD79b抗體(ch23D8、ch44G2或polatuzumab)對細胞進行染色，並使用抗IgM-APCch23D8、ch44G2或polatuzumab進行檢測。如圖17A-17B所示，ch23D8和ch44G2與長形式CD79b以及短形式CD79b具有強結合親和力。

實施例11.抗CD79b抗體的人源化

通過將先導抗體的CDR移植到與IgBLAST(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)和/或IMGT/DomainGapAlig(https：//www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)鑒定的兔框架最接近的選定人種系框架中，將四個兔抗人CD79b單克隆抗體克隆23D8、44G2、48H10和57B9人源化。根據框架和CDR內的序列相似性選擇人種系IGHV、IGKV、IGHJ和IGKJ。一些人種系框架殘基被回復突變為相應的兔殘基，以維持規範的環結構和輕鏈/重鏈介面(Padlan Mol.Immunol.,1994,31：169；Foote and Winter JMB,1992,224：487；Padlan Mol.Immunol.,1994,31：169)。通過人源化，產生了hu23D8、hu44G2、hu48H10和hu57B9人源化抗體。

通過Nano DSF評估人源化抗體克隆的熱穩定性(表3)。在ELISA(圖18)和表達內源CD79b的細胞系(圖19)中，證實人源化抗體與重組人CD79b ECD結合。

結果表明，人源化抗CD79b抗體表現出與嵌合抗CD79b抗體相同的技術效果，如對CD79b的高親和力、緩慢的內化、與高和低CD79b抗原密度的惡性B細胞系的高結合、與內源性B細胞的高細胞表面結合親和力，與CLL患者的B淋巴細胞的高結合力以及與長形式CD79b以及短形式CD79b的強結合親和力。

其他實施例

應當理解，雖然已經結合其詳細描述描述了本發明，但前述描述旨在說明而不是限制本發明的範圍，本發明的範圍由所附的申請專利範圍限定。其他方面、優點和修改在所附的申請專利範圍內。

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Claims

一種結合 CD79b (分化簇 79B) 的抗體或其抗原結合片段，包含：一個重鏈可變區VH和一個輕鏈可變區VL，該VH中的多個互補決定區CDR包含多個所選VH CDR胺基酸序列，並且該VL中的多個互補決定區CDR包含多個所選VL CDR胺基酸序列，其中該等所選VH CDR胺基酸序列和該等所選VL CDR胺基酸序列選自以下CDR胺基酸序列的選項(1)至(2)之一： (1) 根據 Kabat 定義，該等所選VH CDR胺基酸序列分別列於SEQ ID NO:39、41、43，該等所選VL CDR胺基酸序列分別列於SEQ ID NO:44~46； (2) 根據Chothia定義，該等所選VH CDR胺基酸序列分別列於SEQ ID NO:40、42、43，該等所選VL CDR胺基酸序列分別列於SEQ ID NO:44~46。
如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中該VH包含所選VH序列，並且該VL包含所選VL序列，其中該所選VH序列和該所選VL序列選自下列可變區的胺基酸序列選項(1)至(2)之一： (1) 該所選 VH序列列於SEQ ID NO:37，該所選 VL序列列於SEQ ID NO:38; (2) 該所選 VH序列列於SEQ ID NO:71，該所選 VL序列列於SEQ ID NO:72。
如請求項1和2中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段特異性結合人類或猴CD79b。
如請求項1和2中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其抗原結合片段、單鏈可變片段(scFv)、單臂抗體、和/或多特異性抗體。
如請求項1至2中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含人類IgG1恆定區、人類IgG2恆定區或人類IgG4恆定區。
一種核酸，其編碼如請求項1至5中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
一種載體，其包含一種或多種如請求項6中所述的核酸。
一對載體，其中每個載體包含請求項6中所述的核酸，其中該對載體共同編碼並結合CD79b的VL和VH。
一種細胞，其包含請求項7的載體、或請求項8的一對載體。
如請求項9所述的細胞，其中所述細胞是CHO細胞。
一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含請求項1和2中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
一種抗體-藥物綴合物，其包含與治療劑共價結合的請求項1和2中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
如請求項12所述的抗體-藥物綴合物，其中所述治療劑是細胞毒性劑或細胞抑制劑。
一種組合物在製備用於治療癌症之藥物的用途，其中該組合物包含請求項1和2中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、請求項11所述的CAR、或請求項12和13任一項所述的抗體-藥物綴合物。
如請求項14所述的用途，其中所述癌症是淋巴瘤、白血病、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌或尿路上皮癌。
如請求項14所述的用途，其中所述癌症是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、B急性淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、B細胞幼淋巴球白血病 (PLL)、伴隨絨毛淋巴球的脾臟淋巴瘤 (SLVL)、毛細胞白血病 (HCL)、濾泡性淋巴瘤 (FL) 或套細胞淋巴瘤(MCL)。
一種組合物在製備用於治療自體免疫疾病之藥物的用途，其中該組合物包含請求項1和2中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、請求項11所述的CAR、或請求項12和13任一項所述的抗體-藥物綴合物。
如請求項17所述的用途，其中所述自體免疫疾病選自類風濕性關節炎、乾癬、多發性硬化症、免疫性血小板減少性紫斑症、重症肌無力、視神經脊髓炎、IgG4相關疾病、狼瘡、狼瘡性腎炎、鉅細胞動脈炎、高安病、冷凝集素病、溫熱性自體免疫性溶血性貧血、抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關的血管炎、伴隨多血管炎的肉芽腫病 (GPA)（韋格納肉芽腫病）、顯微鏡下多血管炎(MPA)、發炎性腸道疾病(IBD)和自體反應性胰臟炎。
如請求項17所述的用途，其中所述自體免疫疾病是多發性硬化症、狼瘡、類風濕性關節炎、發炎性腸道疾病(IBD)、自體反應性胰臟炎、狼瘡性腎炎。
如請求項18和19中任一項所述的用途，其中所述狼瘡是系統性紅斑狼瘡。
一種藥物組合物，其包含請求項1和2中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，以及藥學上可接受的載體。