TWI891218B - 核酸檢測系統之質檢套組及其質檢方法與用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種核酸檢測系統之質檢套組及其質檢方法與用途。質檢套組包括大腸桿菌噬菌體MS2及第一序列組。第一序列組包括：如SEQ IQ NO: 1所示之序列之順向引子、如SEQ IQ NO: 2所示之序列之反向引子，以及如SEQ IQ NO: 3所示之序列之探針。質檢方法包括：將檢體與噬菌體MS2混合，進行核酸萃取，以得到洗脫液；以及將洗脫液與貓血黴漿菌質體、該第一序列組及該第二序列組混合，進行多重即時聚合酶連鎖反應。核酸檢測系統之質檢套組用於評估核酸之回收率及核酸檢測系統之全流程質檢。

Description

核酸檢測系統之質檢套組及其質檢方法與用途

本發明係有關一種核酸檢測質檢套組，尤指一種包含大腸桿菌噬菌體MS2之引子對及探針，及貓血黴漿菌Mh之引子對及探針之核酸檢測質檢套組；本發明亦有關一種該核酸檢測質檢套組之檢測方法；及本發明亦有關一種該質檢套組之用途。

現有技術利用定點照護-核酸檢測(point of care-nucleic acid testing,POC-NAT)設備，透過即時聚合酶連鎖反應檢測方法(real-time PCR)來檢測人體中之病毒核酸或用於研究及診斷疾病。監控POC-NAT之全流程步驟是否正常包括(1)監控核酸萃取之效能，例如監控核酸萃取之回收率，及監控核酸萃取後干擾物之殘留，以及(2)監控qPCR過程，例如qPCR之加熱及螢光訊號之接收，及酵素性能。核酸萃取之效能將影響POC-NAT之靈敏度及穩定性，甚至導致假陰性之結果。

基於陽性標準品方便保存，現有技術於核酸萃取前，添加外源性DNA模板至裂解緩衝液中，以作為核酸萃取過程之陽性對照。此外，後續之PCR成功擴增結果，可對照核酸之成功萃取，並證明核酸萃取時並無高濃度之干擾物 殘留。或者，亦可將外源性DNA模板直接摻入PCR反應中，以確認測試樣本是否能夠支持qPCR擴增。然而，於PCR反應中直接加入外源性DNA模板之方法，由於缺乏外套膜保護，於裂解液環境下及物理性的因子(加熱及震盪)存在之條件下，會造成DNA模板的斷裂及降解，進而導致回收率降低。因此，此種POC-NAT之監控方法並無法有效驗證核酸萃取之回收率。

此外，由於現有技術大部分透過單一qPCR來進行POC-NAT之質控，導致無法由單一反應中，區分Cq延後之原因係歸咎於核酸萃取之回收率不佳或過多的干擾物殘留。

因此，開發一種可區分核酸檢測系統之異常訊號係來自核酸萃取端之問題(例如，異常之核酸萃取之回收率，或核酸萃取後干擾物之殘留)或來自qPCR端之問題(例如，qPCR之加熱及螢光訊號之接收，及酵素性能之異常)的核酸檢測質檢套組，以提高核酸檢測系統之靈敏度及穩定性係本領域亟待解決之問題。

為解決上述現有技術之問題，本發明之目的在於提供一種核酸檢測系統之質檢套組，藉由大腸桿菌噬菌體MS2(Enterobacteria phage MS2)RNA及其序列組，以及貓血黴漿菌(Mycoplasma haemofelis)質體及其序列組，以達到核酸檢測系統之質檢之目的。

本發明另一目的在於提供一種核酸檢測系統之質檢方法，透過多重即時聚合酶連鎖反應，來達到區分核酸檢測系統之異常訊號係來自核酸萃取端之問題(例如，異常之核酸萃取之回收率，或核酸萃取後干擾物之殘留)或來自qPCR端之問題(例如，qPCR之加熱及螢光訊號之接收)之目的。

本發明又一目的在於提供一種核酸檢測系統之質檢套組之用途。

為了達成上述目的，本發明提供一種核酸檢測系統之質檢套組，包括大腸桿菌噬菌體MS2及一第一序列組。第一序列組包括一順向引子，具有如SEQ IQ NO：1所示之序列；一反向引子，具有如SEQ IQ NO：2所示之序列；以及一探針，具有如SEQ IQ NO：3所示之序列。

在一具體實施例中，核酸檢測系統之質檢套組進一步包括貓血黴漿菌Mh質體及一第二序列組。第二序列組包括一順向引子，具有如SEQ IQ NO：4所示之序列；一反向引子，具有如SEQ IQ NO：5所示之序列；以及一探針，具有如SEQ IQ NO：6所示之序列。

本發明另提供一種核酸檢測系統之質檢方法，包括步驟：步驟S10：提供核酸檢測系統之質檢套組；步驟S20：提供一檢體；步驟S30：將檢體與已知濃度之大腸桿菌噬菌體MS2顆粒混合於核酸檢測系統之萃取卡匣中，並進行核酸萃取，以得到洗脫液；步驟S40：將洗脫液、貓血黴漿菌Mh質體、第一序列組及第二序列組混合，並進行第一多重即時聚合酶連鎖反應，以得到第一MS2 Cq值及第一Mh Cq值；以及步驟S50：根據該第一MS2 Cq值，決定核酸萃取之回收效能。

在一具體實施例中，此質檢系統搭配Bio Rad CFX96即時定量聚合酶鏈鎖反應儀，先建立大腸桿菌噬菌體MS2 RNA標準曲線的，其定量線性範圍介於10^5與10^1拷貝之間。

在一具體實施例中，每個反應中包含貓血黴漿菌Mh質體的量為10^3拷貝。

在一具體實施例中，核酸檢測系統之質檢方法，進一步包括步驟：步驟S60：將定量過的大腸桿菌噬菌體MS2投入萃取，將貓血黴漿菌Mh質體、第一序列組及第二序列組混合，進行多重即時聚合酶連鎖反應，以得到第二Mh Cq值；當第二Mh Cq值與第一Mh Cq值之間的差異小於或等於1時，則洗脫液中不存在干擾抑制因子；第二Mh Cq值與第一Mh Cq值之間的差異大於1時，則洗脫液中存在干擾抑制因子。

在一具體實施例中，核酸檢測系統之質檢方法，進一步包括以下步驟：步驟S71：將洗脫液進行10倍稀釋，以得到經10倍稀釋之洗脫液；以及步驟S72：各別將原倍及經10倍稀釋之洗脫液、貓血黴漿菌Mh質體、第一序列組及第二序列組混合，並進行多重即時聚合酶連鎖反應，以得到第二MS2 Cq值；當原倍洗脫液MS2 Cq值(即，第一MS2 Cq值)與經10倍稀釋MS2 Cq值(即，第二MS2 Cq值)之間的差異大於或等於3時，當原倍洗脫液MS2 Cq值(即，第一MS2 Cq值)與經10倍稀釋之MS2 Cq值(即，第二MS2 Cq值)之間的差異小於3時，則洗脫液中存在干擾抑制因子。

在一具體實施例中，干擾抑制因子包括洗脫液中的抑制物。

在一具體實施例中，檢體之DNA濃度的上限為200ng。

在一具體實施例中，核酸檢測系統之質檢方法進一步包括以下步驟： 步驟S81：重複多次步驟S10至步驟S40之步驟，以得到多個MS2 Cq值及多個Mh Cq值，並計算多個MS2 Cq值之平均值及多個MS2 Cq值之標準差，以及多個Mh Cq值之平均值及多個Mh Cq值之標準差；其中核酸檢測系統之質檢的標準範圍包括MS2 Cq值之平均值+/-2xMS2 Cq值之標準差，以及與Mh Cq值之平均值+/-2x Mh Cq值之標準差；以及步驟S82：當所得到的MS2 Cq值或Mh Cq值不在標準範圍內，則認定檢測未通過質檢標準。

在一具體實施例中，核酸檢測系統包括一全自動核酸檢測系統，例如一商用品牌：達基/Dagene G1全自動核酸檢測系統。

本發明提供一種核酸檢測系統之質檢套組之用途，核酸檢測系統之質檢套組用於評估檢體經核酸萃取後之回收率、檢體經核酸萃取後所得之洗脫液是否存在干擾抑制因子殘留、核酸檢測系統之萃取卡匣之質檢，或核酸檢測系統之儀器之質檢。

本發明的優勢如下：專一性高：本發明之質檢套組之來自大腸桿菌噬菌體MS2之如SEQ ID NO：1所示之MS2順向引子、如SEQ ID NO：2所示之MS2反向引子，及如SEQ ID NO：3所示之MS2探針，以及來自貓血黴漿菌之如SEQ ID NO：4所示之Mh順向引子、如SEQ ID NO：5所示之Mh反向引子，及如SEQ ID NO：6所示之Mh探針具有高度專一性，無法辨識其他物種之序列。MS2嗜菌體主要存在於污染廢水中，所設計的引子與探針，是基於生物資訊分析，大範圍比對NCBI Database序列進行開發設計，經Primer-Blast結果不會辨識其他種類物種，而搭配的貓血黴漿菌(Mycoplasma haemofelis)引子與探針，其病源主要為寵物，以Primer-Blast分 析結果亦具有良好的專一性，不會辨識到其他序列。上述兩個物種，不存在於實驗環境、試劑配方中，亦非屬於人類病源核酸檢測產品，因此可用來設計做為工廠質檢流程使用。實際應用於G1全自動核酸檢測系統的質檢使用時，不會有非專一的訊號產生。

多功能與應用：如SEQ ID NO：1所示之MS2順向引子、如SEQ ID NO：2所示之MS2反向引子，及如SEQ ID NO：3所示之MS2探針可作為Dagene G1全自動核酸檢測系統之G1萃取卡匣之核酸萃取之標準品，以用於評估核酸萃取之回收率；以及如SEQ ID NO：4所示之Mh順向引子、如SEQ ID NO：5所示之Mh反向引子，及如SEQ ID NO：6所示之Mh探針可用於評估G1萃取卡匣中是否存在干擾抑制因子，及作為qPCR試劑之內源性對照。因此，該質檢套組透過多重qPCR反應可檢測Dagene G1全自動核酸檢測系統之G1萃取卡匣之核酸萃取回收率、評估檢體經核酸萃取後所得之洗脫液是否存在干擾抑制因子、該核酸檢測系統之萃取卡匣之質檢，或該核酸檢測系統之儀器之質檢。

不易受人類基因體核酸濃度干擾：該多重qPCR反應之人類基因組DNA之耐受上限為200ng，因此，當質檢套組用於檢測人類上呼吸道之檢體時，不易受檢體之濃度影響後qPCR反應。

靈敏度高：10 copy MS2 RNA/rxn於G1全自動核酸檢測系統及Bio Rad系統，檢出率皆為100%。對於回收率不佳的萃取系統，皆能估算回收率。

S10:步驟

S20:步驟

S30:步驟

S40:步驟

S50:步驟

S60:步驟

S71:步驟

S72:步驟

S81:步驟

S82:步驟

第1圖係本發明之核酸檢測系統之質檢方法的流程圖。

第2圖係本發明之質檢系統多重即時聚合酶連鎖反應，其大腸桿菌嗜菌體MS2 RNA定量標準曲線線性範圍結果圖。

第3圖係本發明之質檢系統多重即時聚合酶連鎖反應，其MS2 RNA連續稀釋及定量Mh質體核酸擴增曲線結果圖，與上述第2圖為相同實驗。

第4圖顯示本發明之多重即時聚合酶連鎖反應之兩種擴增產物在相同濃度下之核酸擴增曲線結果圖。

第5圖顯示本發明之質檢多重即時聚合酶連鎖反應之靈敏度測試之結果圖。

第6圖係本發明之核酸檢測系統之質檢方法的流程圖。

第7圖係本發明之核酸檢測系統之質檢方法的流程圖。

第8圖係本發明之核酸檢測系統之質檢方法的流程圖。

以下係藉由特定之具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技術之人士可藉由本說明書所揭示之內容瞭解本發明之其他優點與功效。然而，本發明中所揭示之例示性實施例僅出於說明之目的，不應被視為限制本發明之範圍。換言之，本發明亦可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同的觀點與應用，在不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更。

除非本文另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之單數形式「一」及「該」包括數個體。

除非本文另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之術語「或」包括「及/或」之含義。

製備例1 設計用於核酸檢測系統之質檢之大腸桿菌噬菌體MS2(Enterobacteria phage MS2)的引子對及探針

於大腸桿菌噬菌體MS2(以下簡稱「MS2」)之基因組(NCBI基因資料庫之基因存取號：EF204940.1)中的外套蛋白(coat protein)跨裂解蛋白(lysis protien)之區域(位於MS2之基因組的1661bp與1760bp之間)中設計如SEQ ID NO：1所示之MS2順向引子(位於MS2之基因組的1661bp與1683bp之間)、如SEQ ID NO：2所示之MS2反向引子(位於MS2之基因組的1738bp與1760bp之間)，及如SEQ ID NO：3所示之MS2探針(位於MS2之基因組的1692bp與1716bp之間)，其經聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增後之片段大小為100bp。利用NCBI Primer-BLAST檢驗如SEQ ID NO：1所示之順向引子、如SEQ ID NO：2所示之反向引子及如SEQ ID NO：3所示之探針之特異性，結果證實如SEQ ID NO：1所示之順向引子、如SEQ ID NO：2所示之反向引子及如SEQ ID NO：3所示之探針具備物種特異性，無法與其他物種進行非專一性擴增。

製備例2 設計用於核酸檢測系統之質檢之貓血黴漿菌(Mycoplasma haemofelis)的引子對及探針

於貓血黴漿菌(以下簡稱「Mh」)之16S rRNA(NCBI基因資料庫之基因存取號：JQ689951.1)中設計如SEQ ID NO：4所示之Mh順向引子(位於Mh之16S rRNA基因的563bp與583bp之間)、如SEQ ID NO：5所示之Mh反向引子(位於Mh之16S rRNA基因的691bp與710bp之間)，及如SEQ ID NO：6所示之Mh探針(位於Mh之16S rRNA基因的663bp與686bp之間)，其經PCR擴增後之片段大小為148bp。利用NCBI Primer-BLAST檢驗如SEQ ID NO：4所示之順向引子、如SEQ ID NO：5所示之反向引子及如SEQ ID NO：6所示之探針之特異性， 結果證實如SEQ ID NO：4所示之順向引子、如SEQ ID NO：5所示之反向引子及如SEQ ID NO：6所示之探針具備物種特異性，無法與其他物種進行非專一性擴增。

參見第1圖，本發明的一方面提供一種核酸檢測系統之質檢方法，包括步驟：步驟S10：提供核酸檢測系統之質檢套組，包含已知濃度的大腸桿菌噬菌體MS2、MS2第一序列組合混合貓血黴漿菌第二序列組混合及固定濃度Mh質體之多重即時聚合酶連鎖反應試劑；步驟S20：提供一檢體；步驟S30：將檢體與已知濃度的大腸桿菌噬菌體MS2進行混合，進行核酸萃取，以得到洗脫液。

步驟S40：洗脫液再與後端MS2第一序列組合混合貓血黴漿菌第二序列組混合及固定濃度Mh質體之多重即時聚合酶連鎖反應試劑，以得到第一MS2 Cq值及第一Mh Cq值。

步驟S50：根據該第一MS2 Cq值，決定核酸萃取之回收效能。

實施例1 MS2/Mh多重即時聚合酶連鎖反應(multiplex real-time PCR，以下簡稱「多重qPCR」)試劑之靈敏度測試

將1x TOYOBO master mix、1μM MS2順向引子、1μM MS2反向引子、0.25μM MS2探針、0.25μM Mh順向引子、0.25μM Mh反向引子、0.2μM Mh探針以及10^3拷貝(cp)之Mh DNA質體混合，以得到體積為20μL之多重qPCR反應混合液。

多重qPCR係於BioRad即時PCR儀器(CFX-96)或POCT快速核酸檢測儀器Dagene G1全自動核酸檢測系統中進行，且反應條件為：60℃，5分鐘；95℃，30秒；重複45個循環的95℃，5秒及60℃，5秒。

多重qPCR於BioRad即時PCR儀器測試時，需進行定量標準曲線製備。在各個多重qPCR反應中，將多重qPCR混合液中的Mh DNA質體量固定為10^3拷貝，以作為多重qPCR試劑之質控濃度，其Cq可作為干擾判讀標準。另將MS2 RNA進行10倍序列稀釋，並將10、10^2、10^3、10^4、10^5拷貝之MS2 RNA加入多重qPCR混合液中，進行多重qPCR反應，其Cq可作為核酸回收效能評估。而在Dagene G1全自動核酸檢測系統中進行時，固定濃度下的MS2或Mh，其Cq是穩定的。

所獲得的MS2/Mh多重qPCR反應之Cq值得結果請參考表1，10^5個拷貝之MS2 RNA所獲得的Cq值最低，10個拷貝之MS2 RNA所獲得的Cq值最高，且每差10倍的MS2 RNA所獲得的Cq值約差3，符合預期。除此之外每個反應中的Mh DNA質體量固定為10^3拷貝，因此所獲得的Cq值皆為約28.5，符合預期，由此可展現本發明之精確性。

參見第2圖，定量標準曲線結果顯示R²為0.995、斜度為-3.591，且效率為90%。因此，定量可信範圍為10^5至10^1拷貝之MS2 RNA。此外，參見第3圖，擴增曲線顯示未添加MS2 RNA之多重qPCR反應(no template control,NTC)並未擴增出任何產物。

為了確認10^1拷貝之MS2 RNA於MS2/Mh多重qPCR反應中是否呈現穩定之結果，將Mh質體維持於10^3拷貝，並將10^1拷貝之MS2 RNA重複進行8次反應及10^3拷貝之MS2 RNA重複進行2次反應。參見表2、第4圖及第5圖，結果顯示10^3拷貝之MS2 RNA的Cq值極穩定地介於30.1-30.3之間，即便是只有10^1拷貝之MS2 RNA，仍然可以被本發明之引子順利偵測，即本發明的MS2/Mh多重qPCR反應中的MS2 RNA之靈敏度為10拷貝，至於擴增曲線顯示未添加MS2 RNA之多重qPCR反應(NTC)並未擴增出任何產物。此外，維持於10^3拷貝之Mh質體並不影響MS2 RNA之靈敏度。再者，在MS2/Mh多重qPCR反應中的MS2 RNA及Mh質體彼此間無競爭關係，且彼此之訊號不會相互干擾。

實施例2 多重qPCR試劑之DNA干擾測試

為了檢測人類基因組DNA(gDNA)樣本是否會干擾多重qPCR試劑，進而影響多重qPCR之結果，將TF-1a人類紅血球母細胞(erythroblast cell)萃取後的核酸，經Qubit dsDNA定量後，加入100ng或200ng於多重qPCR試劑中，並進行多重qPCR反應。本實施例之干擾測試之判斷標準係基於對照組(未添加人類基因組DNA樣本)之多重qPCR反應的Cq值，倘若添加有人類基因組DNA樣本之多重qPCR試劑之多重qPCR反應的Cq值與對照組之Cq值之間的差異小於或等於1圈(即，△Cq1)，則判斷為無干擾；而倘若添加有人類基因組DNA樣本之多重qPCR試劑之多重qPCR反應的Cq值與對照組之Cq值的差異超過1圈(即延遲一圈以上，△Cq>1)，則判斷為干擾。

參見表3，結果顯示相較於對照組，添加100ng之人類基因組DNA樣本之多重qPCR試劑的MS2 qPCR反應的Cq值差異小於1圈，而添加200ng之人類基因組DNA樣本之多重qPCR試劑的MS2 qPCR反應的Cq值差異則接近1圈。因此，判斷MS2 qPCR之人類基因組DNA耐受上限約為200ng gDNA。

參見表4，結果顯示相較於對照組，添加100ng或200ng之人類基因組DNA樣本之多重qPCR試劑的Mh qPCR反應的Cq值幾乎無差異。因此，判斷Mh qPCR之人類基因組DNA耐受上限大於200ng gDNA。

實施例3：利用多重qPCR反應檢測Dagene G1全自動核酸檢測系統之G1萃取卡匣之萃取回收率及評估G1萃取卡匣中是否存在干擾抑制因子

參見第6圖，本發明的核酸檢測系統之質檢方法進一步包括步驟：步驟S60：將定量過的大腸桿菌噬菌體MS2投入萃取、第一序列組、貓血黴漿菌Mh質體、第一序列組及第二序列組混合，並進行第二多重即時聚合酶連鎖反應，以得到第二Mh Cq值；當第一Mh Cq值與第二Mh Cq值之間的差異小於或等於1時，則洗脫液或核酸檢測系統之萃取卡匣不存在干擾抑制因子；及當第一Mh Cq值與第二Mh Cq值之間的差異大於1時，則洗脫液或核酸檢測系統之萃取卡匣存在干擾抑制因子。

參見第7圖，本發明的核酸檢測系統之質檢方法進一步包括步驟：步驟S71：將洗脫液進行10倍稀釋，以得到經10倍稀釋之洗脫液；以及步驟S72：各別將原倍及經10倍稀釋之洗脫液、貓血黴漿菌Mh質體、第一序列組及第二序列組混合，並進行多重即時聚合酶連鎖反應，以得到第二MS2 Cq 值；當原倍洗脫液MS2 Cq值(即，第一MS2 Cq值)與經10倍稀釋MS2 Cq值(即，第二MS2 Cq值)之間的差異大於或等於3時，當原倍洗脫液MS2 Cq值(即，第一MS2 Cq值)與經10倍稀釋之MS2 Cq值(即，第二MS2 Cq值)之間的差異小於3時，則洗脫液中存在干擾抑制因子。

(1)利用多重qPCR反應檢測Dagene G1全自動核酸檢測系統之G1萃取卡匣之萃取回收率：將10^-5稀釋之大腸桿菌噬菌體與TF-1a人類紅血球母細胞混合，製備模擬檢體，將該檢體取400ul置入G1萃取卡匣中(大腸桿菌噬菌體約8.97E+03拷貝)，以進行核酸之萃取。本實施例利用3台Dagene G1全自動核酸檢測系統分別進行3批次之核酸萃取(共9個G1萃取卡匣)，萃取後，取12μl之10倍稀釋後之洗脫液(eluate)加入含有10^3拷貝之Mh DNA質體的多重qPCR試劑中，進行多重qPCR反應，並利用Bio Rad CFX96儀器定量G1萃取卡匣之回收率。

此外，利用另一商用品牌：圓點4810自動化核酸萃取儀及直接加熱裂解方法進行核酸萃取，以作為對照組，經定量後，計算出核酸萃取之回收率。

參見表5，結果顯示機台G8之批次2之核酸萃取的回收率明顯低於圓點4810自動化核酸萃取儀及直接加熱裂解方法之核酸回收率，因此，多重qPCR反應可用於評估不同批次之G1萃取卡匣之回收效能。

(2)利用多重qPCR反應檢測Dagene G1全自動核酸檢測系統之G1萃取卡匣中是否存在干擾抑制因子：評估G1萃取卡匣中是否存在干擾抑制因子之判斷標準係(a)基於對照組(未添加洗脫液)之多重qPCR反應的Mh Cq值，倘若添加有洗脫液之多重qPCR試劑之多重qPCR反應的Mh Cq值與對照組之Mh Cq值之間的差異小於或等於1圈(即，Mh△Cq1)，則判斷為無干擾；反之，倘若添加有洗脫液之多重qPCR試劑之多重qPCR反應的Mh Cq值與對照組之Mh Cq值之間的差異大於1圈(即，Mh△Cq>1)，則判斷為干擾；以及(b)基於對照組(添加有經1倍稀釋之洗脫液)之多重qPCR反應的MS2 Cq值，倘若添加有經10倍稀釋之洗脫液之多重qPCR試劑之多重qPCR反應的MS2 Cq值與對照組之MS2 Cq值之間的差異大於或等於3圈(即，MS2△Cq3)，則判斷為無干擾；反之，倘若添加有經10倍稀釋之洗脫液之多重qPCR試劑之多重qPCR反應的MS2 Cq值與對照組之MS2 Cq值之間的差異小於3圈(即，MS2△Cq<3)，則判斷為干擾。

為了評估添加與未添加洗脫液之多重qPCR試劑之多重qPCR反應的Mh Cq值之差異，如實施例1之表1所示，未添加洗脫液之多重qPCR試劑之多重qPCR反應的Mh Cq值的平均值為28.59。此外，表6顯示利用3台Dagene G1全自動核酸檢測系統分別進行3批次之添加有洗脫液(經1倍稀釋之洗脫液)之多重qPCR試劑之多重qPCR反應的Mh Cq值，以及各Mh Cq值與未添加洗脫液之多重 qPCR試劑之多重qPCR反應的Mh Cq值的平均值(28.59)之間的差異值。結果顯示，G8機台之批次2及G25機台之批次1之△Cq>1(如底線所示)，據此判斷G8機台之批次2及G25機台之批次1之G1萃取卡匣中存在干擾抑制因子。

為了評估添加有經10倍稀釋與經1倍稀釋之洗脫液之多重qPCR試劑之多重qPCR反應的MS2 Cq值之間的差異，表7顯示利用3台Dagene G1全自動核酸檢測系統分別進行3批次之添加有經10倍稀釋與經1倍稀釋之多重qPCR試劑之多重qPCR反應的MS2 Cq值，以及二者之間的差異值。結果顯示，G8機台之批次2及批次3、G9機台之批次1及批次3，及G25機台之批次1及批次3之△Cq<3，據此判斷G8機台之批次2及批次3、G9機台之批次1及批次3，及G25機台之批次1及批次3之G1萃取卡匣中存在干擾抑制因子。

由上可知，Dagene G1全自動核酸檢測系統之G1萃取卡匣中的洗脫液之干擾抑制因子測試的允收標準為：添加有經1倍稀釋之洗脫液之Mh Cq值與未添加洗脫液之Mh Cq值小於或等於1圈(即，Mh△Cq1)，以及添加有經1倍稀釋與添加有經10倍稀釋之洗脫液之多重qPCR反應的MS2 Cq值之間的差異值大於或等於3(MS2△Cq3)。

實施例4 利用多重qPCR反應進行Dagene G1全自動核酸檢測系統之儀器質檢

參見第8圖，本發明的核酸檢測系統之質檢方法進一步包括步驟：步驟S81：重複多次步驟S10至步驟S40之步驟，以得到多個MS2 Cq值及多個Mh Cq值，並計算多個MS2 Cq值之平均值及多個MS2 Cq值之標準差，以及多個Mh Cq值之平均值及多個Mh Cq值之標準差；其中核酸檢測系統之質檢的標準範圍包括MS2 Cq值之平均值+/-2xMS2 Cq值之標準差，以及與Mh Cq值之平均值+/-2x Mh Cq值之標準差；以及步驟S82：當所得到的MS2 Cq值或Mh Cq值不在標準範圍內，則認定檢測未通過質檢標準。

將10^-5稀釋之大腸桿菌噬菌體MS2與4 x 10^4個TF-1a人類紅血球母細胞混合檢體，投入G1萃取卡匣中，以進行核酸之萃取。本實施例利用4台Dagene G1全自動核酸檢測系統分別進行核酸萃取(共22個G1萃取卡匣，各G1萃取卡匣進行6個反應，共獲得132個結果)。G1卡匣萃取後，將12μl之稀洗脫液直接噴注於含有10^3拷貝之Mh DNA質體的多重qPCR試劑中，進行多重qPCR反應。

此外，利用現有技術之圓點4810自動化核酸萃取儀進行核酸萃取，以得到洗脫液，將12μl之洗脫液加入含有10^3拷貝之Mh DNA質體的多重qPCR試劑中，透過Dagene G1全自動核酸檢測系統進行多重qPCR反應(共獲得42個結果)，作為控制組，確認整個萃取流程使用的檢體、G1 qPCR流程是沒有問題的。

將儀器質檢之檢測結果進行統計，並排除異常數據，得到如表8所示利用Dagene G1全自動核酸檢測系統進行核酸萃取及多重qPCR反應之MS2 Cq值與Mh Cq值之平均值結果。由該等結果推估出合理之質檢標準範圍可設定為： MS2 Cq值之平均值+/-2x標準差(standard deviation,SD)，以及與Mh Cq值之平均值+/-2x SD。

此外，參見表9，由圓點4810自動化核酸萃取儀搭配G1 qPCR控制結果可顯示G25機台之第六反應槽MS2 Cq數值異常，超出MS2 Cq值之平均值+/-2x標準差範圍；G25機台之第五及第六反應槽Mh Cq數值異常，Mh訊號出現超出Mh Cq值之平均值+/-2x標準差範圍，此異常接果發生機率為50%(兩次實驗中，出現一次異常結果)，異常數值如底線所示，顯示G25機台的qPCR系統存在異常因素。

參見表10，G25機台之第五及第六反應槽異常同樣顯示於Dagene G1全自動核酸檢測系統全流程結果，MS2訊號出現超出MS2 Cq值之平均值+/-2x標準差範圍的異常數值，以及Mh訊號出現超出Mh Cq值之平均值+/-2x標準差範 圍的異常數值(如底線所示)。隨後，將該G25機台進行儀器檢驗，結果顯示於G25機台之第五反應槽及第六反應槽之加熱座之孔洞及LED濾光片之孔洞中存在異物，導致產生qPCR之加熱及螢光訊號之接收之問題。因此，多重qPCR反應可檢測Dagene G1全自動核酸檢測系統之儀器是否異常。

實施例5 利用多重qPCR反應進行Dagene G1全自動核酸檢測系統之G1萃取卡匣質檢

將10^5稀釋之大腸桿菌噬菌體MS2與4 x 10^4之TF-1a人類紅血球母細胞混合檢體，投入過期之G1萃取卡匣中，以進行核酸之萃取，已知過期卡匣會影響整體核酸回收率。本實施例利用Dagene G1全自動核酸檢測系統進行六次核酸萃取(共6個結果)。萃取後，將12μl之洗脫液自動噴注於下卡匣含有10^3拷貝之Mh DNA質體的多重qPCR試劑中，進行多重qPCR反應。

表11顯示Dagene G1全自動核酸檢測系統之G1萃取卡匣質檢之檢測結果，結果顯示於第一反應槽、第二反應槽、第三反應槽及第六反應槽中，MS2訊號出現超出MS2 Cq值之平均值+/-2x標準差範圍的異常數值，以及Mh訊號出現超出Mh Cq值之平均值+/-2x標準差範圍的異常數值(如底線所示)。因此，多重qPCR反應可檢測Dagene G1全自動核酸檢測系統之G1萃取卡匣萃取回收率是否異常。

本發明的優勢如下：專一性高：本發明之質檢套組之來自大腸桿菌噬菌體MS2之如SEQ ID NO：1所示之MS2順向引子、如SEQ ID NO：2所示之MS2反向引子，及如SEQ ID NO：3所示之MS2探針，以及來自貓血黴漿菌之如SEQ ID NO：4所示之Mh順向引子、如SEQ ID NO：5所示之Mh反向引子，及如SEQ ID NO：6所示之Mh探針具有高度專一性，無法辨識其他物種之序列。MS2嗜菌體主要存在於污染廢水中，所設計的引子與探針，是基於生物資訊分析，大範圍比對NCBI Database序列進行開發設計，經Primer-Blast結果不會辨識其他種類物種，而搭配的貓血黴漿菌(Mycoplasma haemofelis)引子與探針，其病源主要為寵物，以Primer-Blast分析結果亦具有良好的專一性，不會辨識到其他序列。上述兩個物種，不存在於實驗環境、試劑配方中，亦非屬於人類病源核酸檢測產品，因此可用來設計做為工廠質檢流程使用。實際應用於G1全自動核酸檢測系統質檢使用時，不會有非專一的訊號產生。

多功能與應用：如SEQ ID NO：1所示之MS2順向引子、如SEQ ID NO：2所示之MS2反向引子，及如SEQ ID NO：3所示之MS2探針可作為Dagene G1全自動核酸檢測系統之G1萃取卡匣之核酸萃取之標準品，以用於評估核酸萃取之回收率；以及如SEQ ID NO：4所示之Mh順向引子、如SEQ ID NO：5所示之Mh反向引子，及如SEQ ID NO：6所示之Mh探針可用於評估G1萃取卡匣中是否存在 干擾抑制因子，及作為qPCR試劑之內源性對照。因此，該質檢套組透過多重qPCR反應可檢測Dagene G1全自動核酸檢測系統之G1萃取卡匣之核酸萃取回收率、評估檢體經核酸萃取後所得之洗脫液是否存在干擾抑制因子、該核酸檢測系統之萃取卡匣之質檢，或該核酸檢測系統之儀器之質檢。

不易受人類基因體核酸濃度干擾：該多重qPCR反應之人類基因組DNA之耐受上限為200ng，因此，當該質檢套組用於檢測人類上呼吸道之檢體時，不易受檢體之濃度影響後qPCR反應。

靈敏度高：10 copy MS2 RNA/rxn於G1全自動核酸檢測系統及Bio Rad系統，檢出率皆為100%。對於回收率不佳的萃取系統，皆能估算回收率。

雖然本發明已以較佳實施例揭露，然其並非用以限制本發明，任何熟習此項技藝之人士，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

A0101_OR_PSEQ.xml

S10:步驟

S20:步驟

S30:步驟

S40:步驟

S50:步驟

Claims (9)

1. 一種核酸檢測系統之質檢套組，包括大腸桿菌噬菌體MS2、一第一序列組、貓血黴漿菌Mh質體及一第二序列組，該第一序列組包括： 一順向引子，具有如SEQ IQ NO: 1所示之序列； 一反向引子，具有如SEQ IQ NO: 2所示之序列；以及 一探針，具有如SEQ IQ NO: 3所示之序列；及 該第二序列組包括： 一順向引子，具有如SEQ IQ NO: 4所示之序列； 一反向引子，具有如SEQ IQ NO: 5所示之序列；以及 一探針，具有如SEQ IQ NO: 6所示之序列。
2. 一種核酸檢測系統之質檢方法，包括步驟： 步驟S10:提供如請求項1所述之核酸檢測系統之質檢套組； 步驟S20:提供一檢體； 步驟S30:將該檢體與該大腸桿菌噬菌體MS2混合，並投入該核酸檢測系統之萃取卡匣中，進行核酸萃取，以得到洗脫液； 步驟S40:將該洗脫液、該貓血黴漿菌Mh質體、該第一序列組及該第二序列組混合，並進行第一多重即時聚合酶連鎖反應，以得到第一MS2 Cq值及第一Mh Cq值；以及 步驟S50: 根據該第一MS2 Cq值，決定核酸萃取之回收效能。
3. 如請求項2所述之核酸檢測系統之質檢方法，進一步包括步驟： 步驟S60:將定量過的該大腸桿菌噬菌體MS2投入萃取、該第一序列組、該貓血黴漿菌Mh質體及該第二序列組混合，並進行第二多重即時聚合酶連鎖反應，以得到第二Mh Cq值；當該第一Mh Cq值與該第二Mh Cq值之間的差異小於或等於1時，則該洗脫液或該核酸檢測系統之萃取卡匣不存在干擾抑制因子；及當該第一Mh Cq值與該第二Mh Cq值之間的差異大於1時，則該洗脫液或該核酸檢測系統之萃取卡匣存在該干擾抑制因子。
4. 如請求項2所述之核酸檢測系統之質檢方法，進一步包括步驟： 步驟S71:將該洗脫液進行10倍稀釋，以得到經10倍稀釋之洗脫液；以及 步驟S72:將該經10倍稀釋之洗脫液、該貓血黴漿菌Mh質體、該第一序列組及該第二序列組混合，並進行第三多重即時聚合酶連鎖反應，以得到第二MS2 Cq值；當該第二MS2 Cq值與該第一MS2 Cq值之間的差異大於或等於3時，則該洗脫液或該核酸檢測系統之萃取卡匣不存在干擾抑制因子；及當該第二MS2 Cq值與該第一MS2 Cq值之間的差異小於3時，則該洗脫液或該核酸檢測系統之萃取卡匣存在該干擾抑制因子。
5. 如請求項3或4所述之核酸檢測系統之質檢方法，其中該干擾抑制因子包括該洗脫液中的抑制物。
6. 如請求項2所述之核酸檢測系統之質檢方法，其中該檢體之DNA濃度的上限為200 ng。
7. 如請求項2所述之核酸檢測系統之質檢方法，進一步包括步驟： 步驟S81:重複多次如請求項2所述之步驟，以得到多個該MS2 Cq值及多個該Mh Cq值，並計算多個該MS2 Cq值之平均值及多個該MS2 Cq值之標準差，以及多個該Mh Cq值之平均值及多個該Mh Cq值之標準差；其中該核酸檢測系統之質檢的標準範圍包括MS2 Cq值之平均值+/- 2x該MS2 Cq值之標準差，以及與Mh Cq值之平均值+/- 2x 該Mh Cq值之標準差；以及 步驟S82:當所得到的該MS2 Cq值或該Mh Cq值不在該標準範圍內，則認定該檢測未通過質檢標準。
8. 如請求項2所述之核酸檢測系統之質檢方法，其中該核酸檢測系統包括一全自動核酸檢測系統。
9. 一種如請求項1所述之核酸檢測系統之質檢套組之用途，其中該核酸檢測系統之質檢套組用於評估檢體經核酸萃取後之回收率、該檢體經該核酸萃取後所得之洗脫液是否存在干擾抑制因子殘留、該核酸檢測系統之萃取卡匣之質檢，或該核酸檢測系統之儀器之質檢。