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TWI890893B - 用於人類乳突病毒的ｄｎａ疫苗及其使用方法 - Google Patents

用於人類乳突病毒的ｄｎａ疫苗及其使用方法

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TWI890893B
TWI890893B TW110143625A TW110143625A TWI890893B TW I890893 B TWI890893 B TW I890893B TW 110143625 A TW110143625 A TW 110143625A TW 110143625 A TW110143625 A TW 110143625A TW I890893 B TWI890893 B TW I890893B
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永年 張
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佳揚生物科技股份有限公司
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Abstract

本發明涉及提供一種DNA疫苗，其用於具有人類乳突病毒(human papillomavirus, HPV)相關疾病的個體。該DNA疫苗可包括DNA構築體，其包括融合基因。該融合基因可為該DNA構築體的子片段，並且包括優化的HPV子序列，該優化的HPV子序列編碼至少一HPV抗原。該優化的HPV子序列可包括以下一或多個：HPV-16 E6表現基因，其記載於SEQ ID NO: 1，HPV-16 E7表現基因，其記載於SEQ ID NO: 2，HPV-18 E6表現基因，其記載於SEQ ID NO: 3，以及HPV-18 E7表現基因，其記載於SEQ ID NO: 4。

Description

用於人類乳突病毒的DNA疫苗及其使用方法
本發明涉及DNA疫苗，特別是針對HPV相關疾病的疫苗，更具體地，其涉及通過密碼子優化來改良DNA疫苗。
人類乳突病毒(Human papillomavirus, HPV)是在幾種人類癌症中常見到的病原體，包括子宮頸癌、肛門癌、陰莖癌、陰門癌、陰道癌和頭頸癌。 目前針對HPV的疫苗，如Gardasil ®和Cervarix ®，已顯示出預防HPV感染的臨床療效，但其對於已被HPV感染或HPV相關癌症的患者的治療是無效的。因此，目前迫切需要為感染HPV或甚至患有HPV相關疾病的患者開發治療性疫苗。
接種去氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)疫苗是一種通過注射含有編碼一種或多種抗原的DNA序列的基因工程質體，來預防感染或治療疾病的技術。在理論上，DNA疫苗比傳統疫苗更具有優勢，包括在製造上的安全性、速度和可預測性、溫度穩定性、設計的靈活性、以及誘導更廣泛的免疫反應類型的能力。儘管有著上述優點，但是一般來說，DNA疫苗在動物體內誘導強烈的抗原特異性免疫反應方面是具有困難的。舉例來說，具有HPV E6和E7基因的 DNA疫苗的免疫原性可能很差，因為病毒已經演化出了逃避宿主識別的機制，其包括E6/E7的低表現量。因此，用來增強DNA疫苗免疫原性的許多不同策略已經過了試驗，其包括改進載體的設計、抗原密碼子的優化、使用傳統佐劑和分子佐劑、電穿孔(electroporation, EP)、分子佐劑的共同表現和首次接種-加強策略(L. Li and N. Petrovsky, Expert Rev Vaccines. 2016;15(3):313-29)。
密碼子的優化是指利用同義突變來增加所欲的基因(例如DNA疫苗中的抗原表現基因)的蛋白質表現的方法。然而，密碼子的優化並非總是與 DNA疫苗功效呈正相關。許多研究表明，稀有密碼子可能並不總是為速率決定步驟，並且經常使用的密碼子也不能保證增加蛋白質產量。此外，編碼區不僅指明的胺基酸序列，而且通常還包含重疊的遺傳訊息，其中包括可以影響蛋白質折疊的RNA二級結構。這表示同義密碼子可能會改變蛋白質的構象和功能(L. Li and N. Petrovsky, Expert Rev Vaccines. 2016;15(3):313-29, V. P. Mauro and S. A. Chappell, Methods Mol Biol.2018;1850:275-288)。因此，通過密碼子的優化來增強DNA疫苗中編碼抗原的表現可能會導致無法預料的有害結果，故需要仔細考慮。此外，更加困難之處在於難以預測包含密碼子優化序列的DNA疫苗是否可以實現所需的免疫原性。
有鑑於上述原因，提供一種療效更好的DNA疫苗以治療HPV相關疾病的需求尚未得到滿足。然而，通過密碼子優化來提高DNA疫苗針對 HPV相關疾病的功效仍然是高度不可預測的，因此仍然是該領域中有待解決的問題。
在本發明涉及的一些實施例中，提供一種DNA疫苗，其用於具有人類乳突病毒(human papillomavirus, HPV)相關疾病的個體。該DNA疫苗可包括DNA構築體，其包括融合基因。該融合基因可為該DNA構築體的子片段，並且包括優化的HPV子序列，該優化的HPV子序列編碼至少一HPV抗原。該優化的HPV子序列可包括以下一或多個：HPV-16 E6表現基因，其記載於SEQ ID NO: 1，HPV-16 E7表現基因，其記載於SEQ ID NO: 2，HPV-18 E6表現基因，其記載於SEQ ID NO: 3，以及HPV-18 E7表現基因，其記載於SEQ ID NO: 4。
在一些實施例中，該融合基因可更包括編碼免疫刺激劑的子序列。
在一些實施例中，該免疫刺激劑可為70 千道耳頓(kilodalton, kDa) 的熱休克蛋白(70 kDa heat shock protein, HSP70) 或人類鈣網伴護蛋白(human calreticulin (CRT) protein)。
在一些實施例中，該優化的HPV子序列包括該HPV-16 E6、該HPV-16 E7、該 HPV-18 E6和該 HPV-18 E7表現基因，以及該融合基因包括SEQ ID NO: 5。
在一些實施例中，該融合基因可更包括優化的訊息序列，該融合基因可包括SEQ ID NO: 6。
本發明的另一方面提供一種治療有HPV相關疾病的個體的方法。該方法包括將前述之DNA疫苗施用於該個體。
在一些實施例中，該方法更包括將表現HPV-16 和 HPV-18 的E6 和 E7 的重組痘苗病毒 (vaccinia virus)施用於該個體，其中該DNA疫苗作為首次接種疫苗(priming vaccine)施用於該個體，該表現HPV-16和HPV-18的E6和E7的重組痘苗病毒作為追加疫苗(boosting vaccine)施用於該個體。
在一些實施例中，該表現 HPV-16 和 HPV-18 的E6和E7的重組痘苗病毒是TA-HPV。
在一些實施例中，該TA-HPV的給藥劑量範圍為1 × 10 4斑點形成單位(plaque-forming units, pfu)至2 × 10 8pfu。
在一些實施例中，該DNA 疫苗的給藥劑量範圍為每名個體100 微克至每名個體20 毫克。
以下將參考圖式更全面地描述本發明，其中示出了本發明的示例性實施方式。然而，本發明可以以許多不同的形式體現，並且不應被解釋為限制於此闡述的示例性實施方式。反而，提供這些示例性實施方式是為了使本發明詳細且完整，並將本發明的範圍充分傳達給本領域通常知識者。相同的圖式標號代表相同的元件。
本發明中的各詞彙僅用於描述特定示例性實施方式，且並非限制本發明之內容。除非內文有特別指明，在此所使用的單數形式 「一」以及 「該」也包含複數形式。本文使用之術語「包含」或「包括」或「具有」，係指明存在一特徵、區域、整數、步驟、操作、元件、及/或組件，但不排除存在或添加更多其他特徵、區域、整數、步驟、操作、元件、組件、及/或其群組。
除非另外定義，本文所使用的所有術語(包含技術及科學術語)可被具有本發明所屬技術領域通常知識者理解成相同含義。還應當理解，該術語，例如在常用詞典中定義的那些，應被解釋為具有與本發明相關技術的內文一致的意涵，除非在此明確定義，其將不會被解釋為理想化或過於正式的意義。
本發明的DNA疫苗是提供給患有人乳突病毒(human papillomavirus, HPV)相關疾病的個體。患有HPV相關疾病的個體可以是患有但不限於疣、乳頭狀瘤、上皮內瘤變、陰莖癌、陰道癌、外陰癌、肛門癌、口咽癌、非黑色素瘤皮膚癌、結膜癌或宮頸癌的哺乳動物(例如，人、小鼠等)。
DNA疫苗可以包括DNA構築體，該DNA構築體含有融合基因，其中融合基因包括人乳突病毒(HPV)子序列，該子序列的密碼子被優化。DNA疫苗在本文所述的上下文中也可以稱為優化的DNA疫苗。
本發明的合成的融合基因，其包括密碼子被優化的子序列(例如優化的HPV子序列)，該子序列編碼至少一種HPV抗原。具體而言，優化的HPV子序列可以包括以下中的一種或多種：記載於SEQ ID NO：1的HPV-16 E6表現基因，其編碼HPV-16 E6抗原；記載於SEQ ID NO: 2的HPV-16 E7表現基因，其編碼 HPV-16 E7 抗原； 記載於SEQ ID NO: 3的HPV-18 E6表現基因，其編碼HPV-18 E6抗原，和記載於SEQ ID NO: 4的HPV-18 E7表現基因，其編碼HPV-18 E7抗原。
在一些實施例中，融合基因可以選殖到pNGVL4a質體，該pNGVL4a質體係作為載體，以提供DNA構築體，因此融合基因可以為DNA構築體的子片段。在其他的實施例中，可用替代的和/或額外的質體提供本文所述的載體。
在一些實施例中，DNA疫苗還可以包括一成分，例如佐劑，以在接種疫苗的個體中產生更強的免疫反應。
在一些實施例中，DNA疫苗可以作為首次接種疫苗施打，並且表現HPV-16和HPV-18兩者的E6和E7的重組痘苗病毒可以作為加強疫苗隨後施打，以提供組合治療，該組合治療可用於異源首次接種-加強方案(heterologous prime-boost regimen)以增強個體對於HPV相關疾病的免疫反應。例如，DNA疫苗的給藥劑量範圍為每名個體100微克至每名個體20毫克，表現HPV-16和HPV-18的E6和E7的重組痘苗病毒的給藥劑量範圍為1 ×10 4pfu 至 2 ×10 8pfu。
在一些實施例中，表現HPV-16和HPV-18的E6和E7的重組痘苗病毒可以是TA-HPV。 TA-HPV是一種重組痘苗病毒疫苗，其表現HPV 16型和18型的致癌基因E6和E7。HPV-16和HPV-18致癌基因E6和E7可以在痘苗病毒Wyeth 株基因體中的中性位點的p7.5和H6啟動子控制下以頭對頭方向插入(L. K, Borysiewicz et al, Lancet., 1996 Jun 1;347(9014):1523-7)。對於HPV-16和HPV-18 基因，可以改變E6終止密碼子以產生 E6/E7融合開讀框(open reading frame)，並引入定義的突變以使E7中的Rb結合位點失去活性。TA-HPV的給藥劑量範圍為 1 × 10 4pfu 至 2 × 10 8pfu。TA-HPV較佳地給藥劑量可以為2×10 4pfu至5×10 7pfu。
DNA疫苗的DNA構築體的例子描述如下。圖1繪示了四種不同的DNA構築體(pBI-1、pBI-10.1、pBI-11和pBI-12)。每個 DNA構築體包括融合基因，該融合基因包括編碼訊息肽的子序列(在圖1中表示為“S”)、編碼免疫刺激劑(例如，圖 1 中的 HSP70)的子序列和編碼一個或多個HPV抗原的子序列(例如， HPV-16 E7(或圖1中的E7 (16))、HPV-18 E7(或圖1中的E7 (18))、HPV-16 E6 (或圖1中的E6 (16))，和/或 HPV-18 E6 (或圖1中的 E6 (18))。在一些實施例中，免疫刺激劑可包括但不限於70 千道耳頓(kilodalton, kDa) 的熱休克蛋白(HSP70) 或人類鈣網伴護蛋白(human calreticulin (CRT) protein)。
在一些實施例中，pBI-1為包含融合基因的DNA構築體，其具有記載於SEQ ID NO: 8的核苷酸序列，該融合基因包括：編碼訊息肽的子序列、編碼“解毒 (detox)”形式的 HPV-16 E7 表現基因的HPV子序列，以及編碼 HSP70 的子序列。 術語“解毒”是指HPV致癌基因(例如，E6 或 E7)DNA通過突變修飾以表現無法進行致癌轉化的蛋白質。在一些實施例中，pBI-10.1是包含融合基因的DNA構築體，其具有記載於SEQ ID NO：7的核苷酸序列，該融合基因包括： 編碼訊息肽的子序列；編碼“解毒”形式的HPV-16 E7 表現基因、“解毒”形式的HPV-18 E7 表現基因、“解毒”形式的HPV-16 E6 表現基因和“解毒”形式的 HPV-18 E6 表現基因的HPV子序列；和編碼 HSP70 的子序列。
為了增加HPV抗原的表現量並且進一步獲得針對HPV相關疾病具有安全性和較高免疫原性的DNA疫苗，分別編碼HPV-16 E6、HPV-16 E7、HPV-18 E6和HPV-18 E7的優化的HPV子序列可以通過突變和密碼子優化設計來表現不能致癌轉化的蛋白質。優化的HPV-16 E6表現基因可以包括記載於SEQ ID NO：1的核苷酸序列。優化的HPV-16 E7表現基因可以包括記載於SEQ ID NO：2的核苷酸序列。優化的HPV-18 E6 表現基因可以包括記載於SEQ ID NO: 3的核苷酸序列。優化的HPV-18 E7表現基因可以包括記載於SEQ ID NO: 4的核苷酸序列。
DNA構築體可被設計為包含融合基因，該融合基因可包含編碼至少一種HPV抗原的優化的HPV子序列，該優化的HPV子序列係選自：記載於SEQ ID NO：1的HPV-16 E6表現基因；記載於SEQ ID NO: 2的 HPV-16 E7 表現基因；記載於SEQ ID NO: 3的 HPV-18 E6 表現基因和記載於SEQ ID NO: 4 中的 HPV-18 E7 表現基因。在一些實施例中，pBI-11具有記載於SEQ ID NO：5的核苷酸序列，其是包含融合基因的DNA構築體，該融合基因包括：編碼訊息肽的子序列；優化的HPV子序列，其編碼SEQ ID NO: 2 所示的HPV-16 E7表現基因、SEQ ID NO: 4所示的HPV-18 E7表現基因、SEQ ID NO: 1所示 HPV-16 E6 表現基因和SEQ ID NO: 3 所示的 HPV-18 E6 表現基因；以及編碼HSP70的子序列。在一些實施例中，pBI-12具有記載於SEQ ID NO: 6的核苷酸序列，其是包含融合基因的DNA構築體，該融合基因包括：優化的訊息序列，其編碼訊息肽；優化的 HPV子序列，其編碼SEQ ID NO: 2所示的HPV-16 E7表現基因、SEQ ID NO: 4所示的HPV-18 E7表現基因、SEQ ID NO: 1所示的HPV-16 E6 表現基因和SEQ ID NO: 3 所示的HPV-18 E6表現基因；以及編碼 HSP70 的子序列。
實施例1：HPV DNA疫苗構築體的設計和合成。
pBI-1 DNA構築體在先前已有相關描述，其為pNGVL4a-SigE7(detox)HSP70(C. Trimple et al. Vaccine2003, 21:4036-4042)。在一實施例中，pBI-10.1 DNA構築體是來自Gibson assembly，其DNA片段是由Bio Basic (Markham, ON, Canada)合成的，該片段編碼融合蛋白，該融合蛋白包含訊息肽、HPV-16 E7 (detox)、HPV-18的E7(detox)、HPV-16 E6(detox)和 HPV-18 E6(detox)以及HSP70 的5'部分(至 Tth111I 位點)，其5'處為EcoRI 和Kozak位點，3'處為Tth111I位點。將合成的DNA片段選殖到pBI-1中，替換EcoRI和Tth111I 之間的片段，並符合HSP70的讀框 (in frame with HSP70)。
與pBI-10.1類似，pBI-11 DNA構築體包括合成的DNA片段，其編碼訊息肽、HPV-16 E7、HPV-18 E7、HPV-16 E6、HPV-18 E6和 HSP70的融合蛋白，但pBI-11中HPV-16 E7、HPV-18 E7、HPV-16 E6和HPV-18 E6的表現基因進一步進行了密碼子優化。pBI-12 DNA構築體也包括合成的DNA片段，其編碼訊息肽、HPV-16 E7、HPV-18 E7、HPV-16 E6、HPV-18 E6和HSP70的融合蛋白，但pBI-12中的訊息肽、HPV-16 E7、HPV-18 E7、HPV-16 E6和HPV-18 E6表現基因都進一步進行了密碼子優化。將pBI-11或pBI-12的合成DNA片段選殖到pBI-1中，替換EcoRI和Tth111I之間的片段，並符合HSP70的讀框 (in frame with HSP70)。
如圖1所示，各個DNA構築體的合成DNA片段中的基因有針對基因表現進行了優化(圖 1，片段101)，為解毒而突變(圖 1，片段102)，或天然的乳突病毒序列(圖1，片段103)。
實施例2：HPV抗原的表現量藉由密碼子優化而提高。
為了確定各個以DNA構築體轉染的細胞能適當的產生編碼的抗原，而進行了西方點墨分析。用10微克(μg) 的pBI-1、pBI-10.1、pBI-11或 pBI-12 DNA構築體的其中之一轉染HEK 293細胞。轉染48小時後，收集細胞裂解物(cell lysates)以用於西方點墨法分析，其結果示於圖2。pBI-1、pBI-10.1、pBI-11 或 pBI-12 在 Precast Tris-HCl蛋白凝膠(Life Technology, Rockville, MD, USA)上分離，然後轉移到硝化纖維素膜(Bio-Rad® Laboratories, Hercules, CA)。阻斷(blocking)後，膜與抗HPV-16-E7單株抗體(在圖2中表示為HPV16 E7 ab)( 8C9 clone from Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)、或抗HPV-18/16 -E6(在圖 2 中表示為HPV18/16 E6 ab)( (CIP5 clone from Abcam PLC, Cambridge, UK)或抗 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)(在圖2中表示為GAPDH)( catalog number [no.] 60004-1-Ig; Proteintech® Group, Rosemont, IL)雜合，以用於鑑定含有HPV-16 E7的融合蛋白、含有HPV-16/18 E6的融合蛋白或作為對照的GAPDH(Cat:60004-1-Ig, Proteintech® Group, Rosemont, IL)的表現。使用過氧化物酶接合的綿羊抗小鼠二級抗體(peroxidase-conjugated sheep anti-mouse secondary antibody)( Amersham TM, Piscataway, NJ, USA)和化學發光(ECL +detection kit; Amersham TM, Piscataway, NJ, USA)來檢測抗體結合。
結果如圖2所示，所有DNA構築體均顯示融合蛋白表現出含有HPV-16 E7抗原。與轉染pBI-10.1的細胞相比，轉染 pBI-11和pBI-12的細胞有更高的 HPV-16 E7表現量，表示通過優化pBI-11和pBI-12中的HPV子序列成功提高了 HPV-16 E7的表現量。
此外，在以pBI-10.1、pBI-11或pBI-12轉染的細胞中檢測到HPV-16 E6和/或HPV-18 E6。相比之下，轉染pBI-11和pBI-12的細胞中HPV-16 E6和/或HPV-18 E6的表現量高於轉染pBI-10.1的細胞，表示優化pBI-11和 pBI-12中的HPV子序列使細胞能夠提高HPV-16 E6和HPV-18 E6表現量。
綜合結果表明，pBI-11和pBI-12中優化的HPV子序列能夠使得HPV抗原表現量升高。
實施例 3：以pBI-11或pBI-12轉染的細胞能夠增強MHC I類分子對 HPV抗原肽的呈現。
為了比較以pBI-10.1、pBI-11或pBI-12 DNA構築體轉染的細胞的 HPV抗原呈現能力，而進行了體外T細胞活化測定。
以pBI-10.1、pBI-11或 pBI-12 DNA構築體轉染293-D b或293 K b細胞，或使用Lipofectamine 2000轉染細胞以作為空白對照(mock)。24小時後，收集這些細胞並與鼠H-2D b-限制性HPV-16 E7 (aa 49-57)肽-特異性CD8 +T細胞(如圖 3A所示)或鼠H-2K b-限制性HPV-18 E6 (aa 67-75)肽-特異性CD8 +T細胞(如圖 3B 所示)在加入GolgiPlug TM(BD Biosciences, San Diego, CA)的情況下共同培養。接著收集細胞，並進行IFN-γ細胞內染色以確定HPV-16 E7或HPV-18 E6抗原特異性CD8 +T細胞的活化。
結果如圖3A和3B所示，比起用pBI-10.1轉染的細胞，用pBI-11或pBI-12轉染的細胞能夠活化更多的HPV-16 E7肽(aa 49-57)-特異性CD8 +T細胞和HPV-18 E6肽(aa 67 -75)-特異性CD8 +T細胞。空白對照轉染的細胞不產生任何明顯的HPV抗原肽(例如，E7 肽(aa 49-57)-特異性CD8 +T細胞和E6肽(aa 67-75)-特異性CD8 +T細胞)的活化。 因此，數據顯示HPV-16/18 E6/E7融合蛋白在轉染pBI-11或pBI-12的細胞中增強的表現量，促進了主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex, MHC)I類分子呈現HPV抗原，以活化HPV抗原-特異性 CD8 +T細胞。
實施例 4：pBI-11和pBI-12增強HPV-16 E7-特異性 CD8 +T細胞媒介的免疫反應。
為了比較接種pBI-10.1、pBI-11或pBI-12的小鼠的免疫反應，而進行體內T細胞活化檢測( in vivoT cell activation assay)。
圖4A是實驗設計的示意圖。給予6至8週大的雌性C57BL/6小鼠(從Taconic Biosciences (Germantown, NY) 購買的)肌肉注射25微克 (µg)/小鼠的pBI-1、pBI-10.1、pBI-11或pBI-12 DNA構築體，並以每隔7天，共3次的方式接種。在最後一次接種疫苗的一週後，收集脾細胞以用於分析CD8 +T細胞反應，其用HPV-16 E6和E7和HPV-18 E6中已知的MHC-I肽刺激後，對干擾素-γ(interferon-γ)進行細胞內細胞激素染色，再進行流式細胞分析技術(flow cytometry)測定。
結果如圖4B所示，接種pBI-11和pBI-12的小鼠均顯示出比接種pBI-10.1的小鼠顯著更高的E7-特異性CD8 +T細胞媒介的免疫反應。也就是說，pBI-11和pBI-12(其包含優化的HPV子序列)，可以在體內誘導增強的抗原特異性 CD8 +T細胞媒介的免疫反應。
根據融合蛋白表現量和體內T細胞活化試驗的數據，其顯示出與轉染pBI-10.1的細胞相比，轉染pBI-11或pBI-12的細胞中HPV抗原的表現量增強了，這是由於密碼子的優化有助於在接種疫苗的小鼠中對HPV抗原產生更有效的T細胞媒介的免疫反應。
實施例5：pBI-11 DNA構築體在表現HPV-16 E6/E7的腫瘤模型(TC-1)中引發治療性抗腫瘤反應。
為了解本發明的DNA構築體產生針對HPV相關疾病的治療性抗腫瘤作用的能力，而以HPV-16 E6/E7 +TC-1腫瘤模型進行檢測。
圖5A是實驗設計的示意圖。在第0天，對6至8週大的雌性C57BL/6小鼠皮下注射2 x 10 5個TC-1腫瘤細胞。在第3、6和10天，對帶有腫瘤的小鼠以肌肉內(intramuscular, I.M.)注射接種pBI- 10.1、pBI-11或pBI-12(25 μg/50 微升 (ul)/小鼠)或不作處理作為對照。在一些實施例中，替代的和/或額外的疫苗，例如TA-HPV，可作為本文所述的加強疫苗用於給小鼠接種。
在最後一次接種的一週後，收集PBMC以進行四聚體染色。關於四聚體染色，首先用純化的抗-小鼠 CD16/32染色小鼠的PBMC，然後用 FITC-接合的抗-小鼠CD8a和 PE-接合的HPV-16 E7 (aa 49-57)肽 H-2D b四聚體或 PE-接合的HPV-18 E6 (aa 67-75) 肽H-2K b四聚體在4°C下染色1小時。洗滌後，用7-AAD染色細胞。以FACSCalibur TM流式細胞儀採集細胞，並用CellQuest Pro軟體(BD Biosciences, Mountain View, CA) 進行分析。 四聚體染色的結果顯示於圖5B和圖5C中。
每週兩次通過觸診和數位卡尺測量腫瘤的生長情況。使用公式[最大直徑×(垂直直徑) 2]×3.14/6來計算腫瘤體積，並呈現於圖5D中。而如圖5E所呈現的，其記錄帶有腫瘤的小鼠的存活率，其中自然死亡和腫瘤直徑大於2cm而導致死亡的均被計為死亡。
圖5B和5C表明，與未處理的小鼠相比，以pBI-10.1處理的帶有腫瘤的小鼠顯示出HPV-16 E7特異性和HPV-18 E6特異性CD8 +T細胞媒介的免疫反應。此外，與接種pBI-10.1的小鼠相比，以pBI-11或pBI-12處理的帶有腫瘤的小鼠表現出顯著更高的HPV-16 E7特異性和HPV-18 E6特異性CD8 +T細胞媒介的免疫反應。另外，如圖5C所示，接種pBI-11或pBI-12的小鼠的腫瘤生長明顯慢於接種pBI-10.1的小鼠。 此外，接種pBI-11或pBI-12的小鼠也有比接種pBI-10.1的小鼠更好的存活率(圖5D)。因此，本發明的DNA疫苗包括了DNA構築體，該DNA構築體包括具有優化的HPV子序列的融合基因，例如pBI-11和pBI-12，可以有效地增強帶有腫瘤的小鼠對抗TC-1腫瘤的抗腫瘤免疫反應，並延長其存活率。
綜上所述，與沒有優化的HPV子序列的DNA疫苗相比，本發明的DNA疫苗具有優化的HPV子序列，其編碼HPV-16 E6 (SEQ ID NO: 1)、HPV-16 E7 (SEQ ID NO: 2)、HPV-18 E6 (SEQ ID NO: 3) 和/或 HPV-18 E7(SEQ ID NO：4)，顯著地誘導HPV抗原表現量提升和提高免疫反應。令人驚訝的是，本發明的優化的HPV子序列成功地實現了在體內更強的抗原特異性免疫反應，並進一步轉化為更有效的抗腫瘤功效。
本領域技術人員將容易地觀察到，在保有本發明的教示的同時，可以對裝置和方法進行多種修改和改造。因此，上述發明應被解釋為僅受所附申請專利範圍的界線的限制。
101、102、103:DNA片段
為了能夠以詳細理解本發明所記載特徵的方式，可以通過參考實施方式對以上簡要概括本發明進行更具體的描述，其中一些在實施方式被圖式所繪示。然而，要注意的是，圖式僅顯示出了本發明的典型實施方式，因此不應被認為是對其範圍的限制，因為本發明可以接受其他同樣有效的實施方式。
圖1係根據本發明的實施例呈現的DNA構築體的示意圖。
圖2係西方點墨 (western blot) 圖，其根據本發明的實施例呈現以pBI-1、pBI-10.1、pBI-11或pBI-12轉染的人胚腎(Human Embryonic Kidney, HEK) 293細胞中的HPV抗原表現量。
圖3A及3B係長條圖，其根據本發明的實施例比較對照組、pBI-10.1組、pBI-11組和pBI-12組的IFN-γ +CD8 +T細胞/總CD 8 +T細胞的百分比。其使用鼠H-2D b限制性HPV-16 E7肽(aa 49-57)特異性CD8 +T細胞(murine H-2Db-restricted HPV-16 E7 peptide (aa 49-57)-specific CD8+ T cells) (圖 3A)，或H-2K b限制性HPV-18 E6肽(aa 67-75)特異性CD8 +T細胞(H-2K b-restricted HPV-18 E6 peptide(aa 67-75)-specific CD8 +T cells)(圖3B)進行體外T細胞活化測定( in vitroT cell activation assay)，以比較用每種DNA構築體轉染的細胞的HPV抗原呈現能力。
圖4A係根據本發明的實施例呈現的實驗設計的示意圖，其用於比較由各種DNA構築體產生的HPV-16 E7-特異性CD8 +T細胞反應。
圖4B係長條圖，其根據本發明的實施例，比較每3×10 5個脾細胞中HPV-16 E7特異性IFN-γ +CD8 +T細胞的數量，該脾細胞是從接種pBI-10.1、pBI-11或pBI-12的小鼠取得，再經過HPV-16 E7 (aa 49-57)肽的刺激所製備而得。
圖5A是根據本發明的實施例呈現的體內腫瘤治療實驗的實驗設計的示意圖，其使用HPV-16 E6/E7 +TC-1腫瘤模型。
圖5B係長條圖，其根據本發明的實施例呈現周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中HPV-16 E7-特異性CD8 +T細胞/總CD8 +T細胞百分比，該PBMCs係由未處理的小鼠或以pBI-10.1、pBI-11或pBI-12處理的小鼠取得，並使用HPV-16 E7 (aa 49-57) 肽四聚體染色(HPV-16 E7 (aa 49-57) peptide-loaded tetramer staining)所製備，使用雙側學生t檢驗(two-tailed Student’s t-test)。
圖5C係長條圖，其根據本發明的實施例呈現PBMCs中HPV-18 E6特異性CD8 +T細胞/總CD8 +T細胞的百分比，該PBMCs係由未處理的小鼠或用pBI-10.1、pBI-11或pBI-12處理的小鼠取得，並以HPV-18 E6 (aa 67-75)肽四聚體染色(HPV-18 E6 (aa 67-75) peptide-loaded tetramer staining)所製備，使用雙側學生t檢驗。
圖5D是曲線圖，其根據本發明的實施例呈現在體內腫瘤治療實驗中未處理的小鼠和用pBI-10.1、pBI-11或pBI-12處理的小鼠中的TC-1腫瘤體積。
圖5E是Kaplan-Meier存活曲線，其根據本發明的實施例呈現在體內腫瘤治療實驗中未處理的小鼠和用pBI-10.1、pBI-11或pBI-12處理的小鼠的存活率。
根據慣例，所描述的各種特徵不是按比例繪製的，而是為了強調與本發明相關的特徵而繪製的。相同的元件符號在整個圖式和文本中表示相同的元件。
101、102、103:DNA片段

Claims (8)

  1. 一種DNA疫苗，包括：DNA構築體，其包括融合基因，其中，該融合基因包括優化的人類乳突病毒(human papillomavirus,HPV)子序列，該優化的HPV子序列包括HPV-16 E6、HPV-16 E7、HPV-18 E6和HPV-18 E7表現基因，且其中該融合基因包括SEQ ID NO：5。
  2. 如請求項1所述之DNA疫苗，其中，在該SEQ ID NO：5中編碼免疫刺激劑係70千道耳頓(kilodalton,kDa)的熱休克蛋白(70kDa heat shock protein,HSP70)的子序列替換成編碼人類鈣網伴護蛋白(human calreticulin(CRT)protein)的子序列。
  3. 如請求項1或2之DNA疫苗，其中，該融合基因更包括優化的訊息序列，其中，該融合基因包括SEQ ID NO：6。
  4. 一種使用如請求項1-3中任一項所述之DNA疫苗在製備用於治療有HPV相關疾病的個體的藥物的用途。
  5. 一種使用(a)如請求項1-3中任一項所述之DNA疫苗；以及(b)表現HPV-16和HPV-18的E6和E7的重組痘苗病毒的組合在製備用於治療有HPV相關疾病的個體的藥物的用途，其中，該DNA疫苗作為首次接種疫苗(priming vaccine)施用於該個體，該表現HPV-16和HPV-18的E6和E7的重組痘苗病毒作為追加疫苗(boosting vaccine)施用於該個體。
  6. 如請求項5所述之用途，其中，該表現HPV-16和HPV-18的E6和E7的重組痘苗病毒是TA- HPV。
  7. 如請求項6所述之用途，其中，該TA-HPV的給藥劑量範圍為1×104斑點形成單位(plaque-forming units,pfu)至2×108pfu。
  8. 如請求項6所述之用途，其中，該DNA疫苗的給藥劑量範圍為每名個體100微克至每名個體20毫克。
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