TWI889871B - 抗α-４-β-７抗體 - Google Patents
抗α-４-β-７抗體Info
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Abstract
本揭示案提供結合人類α4β7之抗α4β7抗體、其製備方法及其治療感染HIV之患者的用途。
Description
序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本創建於2021年7月14日產生，命名為483WO_SL.txt且大小為106,797個位元組。
本申請案尤其係關於新穎抗α4β7抗體、編碼該等抗體之聚核苷酸、其製備方法及使用此等抗體之方法。
現今，總體上有超過3700萬人感染人類免疫缺陷病毒（HIV）且流行人群在持續增長。隨著組合抗逆轉錄病毒療法（cART）的出現，在HIV管理方面已取得顯著進展。cART需要HIV感染者終生一直服藥。cART具有風險益處限制，且另外，其不會減少HIV潛伏病毒儲庫。迫切需要能夠保持病毒負荷低於偵測水準而無需終生治療的改進之治療。
在急性人類HIV感染中，咸信高水準病毒複製及經感染CD4+ T細胞之完全耗盡在與HIV感染相關之免疫缺陷的發展中起到關鍵作用。α4β7係一種在T細胞（CD4+或CD8+）、B細胞及其他免疫細胞上表現的腸道歸巢型整合素，並在HIV感染之發病機制中起到重要作用。另外，據報導，當病毒粒子自經感染之宿主細胞出芽時，α4β7被併入HIV之包膜中（Guzzo等人, 《科學免疫學（Sci.Immunol.）》, 2017）。
α4β7整合素係在T細胞亞群、B細胞、NK細胞及其他免疫細胞上表現之異二聚體受體。此整合素藉由結合至在腸黏膜內皮微靜脈上表現之其配體黏膜地址素細胞黏附分子1（MAdCAM-1）介導淋巴球運輸至腸道相關淋巴組織（GALT）中。高水準表現α4β7之CD4+ T細胞係活體外HIV感染之目標（Cicala等人, PNAS 2009），該等T細胞在急性HIV感染期間受感染且因此被耗盡（Sivro等人, 《科學轉化醫學（Sci Transl Med）》2018）。感染HIV之CD4+細胞以及HIV病毒粒子中存在之α4β7可介導其運輸至GALT中（Guzzo等人, 《科學免疫學》2017）。歸巢至GALT的CD4+ T細胞甚至在抗逆轉錄病毒療法期間亦構成體內之最大HIV儲庫（Brenchley及Douek, 《黏膜免疫學（Mucosal Immunol）》2008）。
本揭示案提供特異性結合至人類α4β7之抗α4β7抗體及其結合片段。例示性抗α4β7抗體的例示性CDR之胺基酸序列，以及其重鏈及輕鏈之V
H及V
L區之胺基酸序列提供於以下
具體實施方式中。
本文提供包括編碼本揭示案之抗α4β7抗體之核苷酸序列的聚核苷酸，以及包括聚核苷酸之載體。另外，本文亦提供用包括編碼所揭示之抗α4β7抗體之核苷酸序列的載體轉型之原核細胞及用該載體轉染之真核細胞，以及工程改造成表現該等核苷酸序列之真核（諸如哺乳動物）宿主細胞。亦提供藉由培養宿主細胞及回收抗體來產生抗體之方法。
本揭示案提供用抗α4β7抗體治療經診斷患有HIV感染之受試者，諸如人類受試者的方法。該方法大體上涉及向該受試者投與有效提供治療益處之量的本文所描述之抗α4β7抗體。該受試者可經診斷患有任何臨床類別之HIV感染。
由於本文所描述之抗α4β7抗體靶向人類α4β7而非病毒蛋白，故其提供一種有利的治療方法，該方法不會誘導基於HIV突變之抗性機制，而該基於HIV突變之抗性常常會在靶向病毒蛋白之治療時因HIV之高突變頻率而發生。
基於本文所呈現之資料，預期本文所描述之抗α4β7抗體將向經診斷患有HIV感染之受試者提供治療益處。
不受理論束縛，假設本發明之實施例經由兩個主要作用機制發揮針對HIV感染之病毒控制：1)Fab依賴性機制：阻斷α4β7與其配體，諸如MAdCAM-1及HIV gp120之相互作用，由此抑制由此等配體之信號傳導介導的CD4+ T細胞之共刺激，以及分別抑制此等經刺激細胞中之HIV複製（Nawaz等人, 《黏膜免疫》2018；Livia等人, PNAS.2020）、腸道組織之HIV感染（Guzzo等人, 《科學免疫學》2017），及細胞間病毒傳播（Arthos等人, 《自然·免疫學（Nat. Immunol.）》2008）；及2) Fc依賴性機制：誘導「疫苗接種作用」，其中抗α4β7 mAb結合至α4β7+ HIV病毒粒子，形成免疫複合物，該等免疫複合物經由mAb Fc域與抗原呈現細胞（APC）上之FcγR相互作用而內化並經歷加工，且所得到的病毒肽隨後呈現於APC之表面上，引起新的且持久的HIV特異性免疫反應以抑制病毒複製（Parsons等人, 《逆轉錄病毒學（Retrovirology）》2018；Naranjo-Gomez等人, 《HIV與AIDS新見（Curr.Opin.HIV AIDS）》 2019）。
α4β7整合素通常呈靜止（無活性）狀態，且對其配體具有低親和力。一旦其活化，其即可以高親和力結合至其配體（例如MAdCAM-1及gp120）（Ye等人, 《血液（Blood）》, 2012；Lertjuthaporn等人, 《公共科學圖書館·綜合（PloS One）》, 2018）。在HIV感染期間，HIV gp120之V2區中的模體模擬MAdCAM-1且能夠結合至α4β7（Peachman等人, 《公共科學圖書館·綜合》, 2015）。α4β7與gp120相互作用誘導淋巴球功能相關抗原-1（LFA-1）之活化，潛在地誘導病毒學突觸之形成並因此增強HIV之細胞間傳播（Arthos等人, 《自然-免疫學（Nat Immunol）》2008）。細胞間傳播對於促進組織中病毒擴散至關重要，且對於病毒傳播而言，其重要性要高於游離病毒。在結合至α4β7後，本發明之實施例可藉由破壞α4β7與gp120之相互作用，誘導細胞中α4β7-抗體結合複合物之內化來減少α4β7介導的細胞間HIV傳播，或可使α4β7失活。因此，本發明之實施例展示抑制組織中HIV複製及病毒擴散的能力。
藉由靶向具有α4β7之人類蛋白而非病毒蛋白，本發明之實施例不誘導病毒抗性突變之出現，由於HIV之高突變頻率，病毒抗性突變之出現通常與靶向病毒蛋白之治療相關。
6.1. 縮寫
在許多實施例中，本文所描述之抗體係藉助於其各別多肽序列描述。除非另外指示，否則多肽序列係N→C取向提供。
在許多實施例中，本文所描述之聚核苷酸係藉助於其各別聚核苷酸序列描述。除非另外指示，否則聚核苷酸序列呈5'→3'取向。
對於多肽序列，如下表1中所述，可使用基因編碼之胺基酸的習知三字母或單字母縮寫。
| 表 1 編碼胺基酸之縮寫 | ||
| 胺基酸 | 三字母縮寫 | 單字母縮寫 |
| 丙胺酸 | Ala | A |
| 精胺酸 | Arg | R |
| 天冬醯胺 | Asn | N |
| 天冬胺酸 | Asp | D |
| 半胱胺酸 | Cys | C |
| 麩胺酸 | Glu | E |
| 麩醯胺酸 | Gln | Q |
| 甘胺酸 | Gly | G |
| 組胺酸 | His | H |
| 異白氨酸 | Ile | I |
| 白氨酸 | Leu | L |
| 離胺酸 | Lys | K |
| 甲硫胺酸 | Met | M |
| 苯丙胺酸 | Phe | F |
| 脯胺酸 | Pro | P |
| 絲胺酸 | Ser | S |
| 蘇胺酸 | Thr | T |
| 色胺酸 | Trp | W |
| 酪胺酸 | Tyr | Y |
| 纈胺酸 | Val | V |
某些序列係藉由指定胺基酸殘基屬於某些種類（例如脂族、疏水性等）之結構式定義。本文所使用的基因編碼之胺基酸所屬之各個種類於下表2中註明。一些胺基酸可能屬於不止一個種類。含有硫氫基之半胱胺酸及受構象限制之脯胺酸未指定種類。
| 表 2 編碼胺基酸之種類 | |
| 種類 | 胺基酸 |
| 脂族 | A、I、L、V |
| 芳族 | F、Y、W |
| 非極性 | M、A、I、L、V |
| 極性 | N、Q、S、T |
| 鹼性 | H、K、R |
| 酸性 | D、E |
| 小型 | A、G |
各個例示性實施例通篇使用的縮寫包含下表3中所提供者。
6.2. 定義
| 表 3 縮寫 | |
| 縮寫 | 定義 |
| Ab-h1.9d-WT | 抗人類α4β7 (AC-166667) hu IgG1/k WT mAb |
| Ab-h1.9d-LALA | 與人類FcγR之結合減少的抗人類α4β7 hu IgG1/k LALA mAb |
| α4β7 | α4β7整合素 |
| αEβ7 | αEβ7整合素 |
| α4β1 | α4β1整合素 |
| Ab或mAb | 抗體或單株抗體 |
| ADCC | 抗體依賴性細胞毒性 |
| ADCP | 抗體依賴性細胞吞噬作用 |
| AF647 | Alexa螢光染料647染料 |
| ATI | 抗逆轉錄病毒治療中斷 |
| APC | 別藻藍蛋白螢光染料；或抗原呈現細胞 |
| BSA | 牛血清白蛋白 |
| BV421 | 亮紫色螢光染料 |
| Ca | 鈣 |
| CDB | 細胞解離緩衝液 |
| CDC | 補體依賴性細胞毒性 |
| CellTrace™ | 細胞增殖螢光染料 |
| CFSE | 羧基螢光素琥珀醯亞胺酯螢光染料 |
| CHOK1 | 中國倉鼠卵巢細胞株 |
| CM5 | BIAcore中使用之羧甲基-聚葡萄糖感測器晶片 |
| CMV | 巨細胞病毒 |
| Conc | 濃度 |
| Cyno | 食蟹獼猴 |
| DMEM | Dulbecco改良型Eagle培養基 |
| DMSO | 二甲亞碸 |
| DPBS | Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水 |
| E | 效應細胞 |
| EC 50 | 半數最大有效濃度 |
| ECL | 電化學發光 |
| EDTA | 乙二胺四乙酸 |
| FACS | 螢光活化細胞分選 |
| FBS | 胎牛血清 |
| Fc | 片段可結晶 |
| FcRn | 新生兒Fc受體 |
| Fcγ | Fc gamma |
| FcγR | Fcγ受體 |
| FcγRIIa | Fcγ受體IIa（H131及R131） |
| FcγRIIb | Fcγ受體IIb |
| FcγRIIc | Fcγ受體IIc |
| FcγRIIIa | Fcγ受體IIIa（F158/176或V158/176） |
| FcγRIIIb | Fcγ受體IIIb（NA1、NA2及SH） |
| FITC | 異硫氰酸螢光素螢光染料 |
| FVD | 可固定的細胞活力螢光染料 |
| FMO | 螢光扣除對照 |
| FR | 構架 |
| G418 | 遺傳黴素（Geneticin）（用於穩定細胞株選擇之抗生素） |
| HBS | 用於（HBS-EP）的含有EDTA及NaCl之基於Hepes之緩衝液 |
| HBSS | Hank平衡鹽溶液 |
| HEK293 | 人類胚胎腎細胞株 |
| HER2 | 人類表皮生長因子受體2 |
| HI | 熱滅活 |
| hIL-2 | 人類介白素2 |
| HIV | 人類免疫缺陷病毒 |
| hr | 小時 |
| hu Fc | 人類片段可結晶 |
| HuT78 | 內源性表現α4β7之人類皮膚t細胞淋巴瘤病毒株 |
| IC 50 | 半數最大抑制濃度 |
| IgG | G型免疫球蛋白 |
| IgG1 | G1型免疫球蛋白 |
| IgG1/κ | 具有κ輕鏈之人類免疫球蛋白γ1 |
| IMDM | Iscove改良型Dulbecco培養基 |
| K D | 平衡解離常數 |
| mAb | 單株抗體 |
| MES | MES緩衝液：2-乙烷磺酸 |
| MESF | 等量可溶性螢光染料分子 |
| MAdCAM-1 | 黏膜地址素細胞黏附分子1 |
| MFI | 平均螢光強度 |
| µg | 微克 |
| µL | 微升 |
| mg | 毫克 |
| Mg | 鎂 |
| mL | 毫升 |
| mM | 毫莫耳濃度 |
| Min | 分鐘 |
| MnCl 2 | 氯化錳 |
| MOA | 作用機制 |
| MSD | 中尺度發現 |
| N | 樣本量 |
| ND | 未測定 |
| NaCl | 氯化鈉 |
| nM | 奈莫耳濃度 |
| NFAT | 活化T細胞核因子 |
| NK | 自然殺手 |
| PBMCs | 周邊血液單核細胞 |
| PBS | 磷酸鹽緩衝鹽水 |
| PE | 藻紅素螢光染料 |
| PFA | 多聚甲醛 |
| pg | 皮克 |
| PHA | 植物血球凝集素 |
| Puro | 嘌呤黴素（Puromycin）（用於穩定細胞株選擇之抗生素） |
| RA | 視黃酸 |
| RBC | Research Blood Components |
| R Max | 最大反應，即藉由BIAcore測定之分析物結合能力 |
| RPM | 每分鐘轉數 |
| RPMI8866 | 內源性表現α4β7之人類B細胞淋巴瘤病毒株 |
| RLU | 相對發光單位 |
| RT | 室溫 |
| RU | BIAcore中使用的結合反應 |
| SPR | 允許經由BIAcore測定即時結合的表面電漿子共振 |
| T | 目標細胞或T細胞 |
| VCAM-1 | 血管細胞黏附分子1 |
| WT | 野生型 |
除非本文中另外定義，否則結合本揭示案使用之科學與技術術語應具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。
除非另外指明，否則如本文所使用，抗體胺基酸殘基之編號係根據Eu編號方案進行。
6.3. 抗 α4β7 抗體
在一個態樣中，本揭示案係關於特異性結合α4β7異二聚體整合素受體（又稱為a4b7、LPAM-1、淋巴球Peyer淋巴結黏附分子1及整合素α-4與整合素β-7之二聚體）的抗體。
如本文所使用，術語「抗體」（Ab）係指特異性結合至例如α4β7之類特定抗原的免疫球蛋白分子。在一些實施例中，本揭示案之抗α4β7抗體結合至人類α4β7並由此調節免疫系統。本揭示案之抗α4β7抗體在輕鏈及重鏈可變域中均包括互補決定區（CDR），又稱為高變區。可變域之保守性較高的部分稱為構架（FR）。如此項技術中所知，描繪抗體高變區之胺基酸位置/邊界可取決於情形及此項技術中已知之各種定義而變化。可變域內之一些位置可視為混合高變位置，因為此等位置根據一組標準可視為在高變區範圍內，而根據一組不同標準可視為在高變區外。此等位置中之一或多個亦可見於擴展之高變區中。本揭示案提供在此等混合高變位置中包括修飾之抗體。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包括四個FR區，主要呈β-片層組態，藉由三個CDR連接，形成連接β-片層結構之環且在一些情況下形成β-片層結構之一部分。各鏈中之CDR藉由FR區緊密保持在一起且與來自另一條鏈之CDR一起促成抗體之目標結合位點的形成。參見Kabat等人, 《免疫學感興趣蛋白質之序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）》(馬里蘭州貝塞斯達的美國國立衛生研究院（National Institute of Health, Bethesda, Md.）1987）。
本揭示案之抗體可為多株的、單株的、經基因工程改造的及/或在性質上以其他方式修飾的，包含但不限於嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、單鏈抗體等。在各種實施例中，該等抗體包括抗體恆定區之全部或一部分。在一些實施例中，恆定區係選自以下之同型：IgA（例如IgA
1或IgA
2）、IgD、IgE、IgG（例如IgG
1、IgG
2、IgG
3或IgG
4）及IgM。在特定實施例中，本文所描述之抗α4β7抗體包括IgG
1。在其他實施例中，抗α4β7抗體包括IgG
2。在又其他實施例中，抗α4β7抗體包括IgG
4。如本文所使用，抗體之「恆定區」包含人類IgG
1中之天然恆定區、同種異型物或變異體，諸如T250Q、L234A、L235A、D356E、L358M、M428L及/或A431G中之任一個。
抗α4β7抗體之輕鏈恆定區可為κ輕鏈區或λ區。λ輕鏈區可為已知亞型中之任一種，例如λ
1、λ
2、λ
3或λ
4。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括κ輕鏈區。
如本文所使用，術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。單株抗體係藉由任何可用或此項技術中已知的手段，自單一純系得到，該純系包含任何真核、原核或噬菌體純系。可用於本揭示案之單株抗體可使用此項技術中已知之多種技術製備，該等技術包含使用融合瘤、重組及噬菌體展示技術，或其組合。
如本文所使用，術語「嵌合」抗體係指這樣一種抗體，其具有來源於非人類免疫球蛋白，諸如大鼠或小鼠抗體之可變序列，以及典型地選自人類免疫球蛋白模板之人類免疫球蛋白恆定區。
非人類（例如鼠類）抗體之「人類化」形式包括至少一個且典型地兩個可變域之實質上全部，其中CDR區之全部或實質上全部對應於非人類免疫球蛋白之CDR區且FR區之全部或實質上全部係人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體亦可包括免疫球蛋白恆定區（Fc），典型地人類免疫球蛋白共同序列之Fc的至少一部分。
「人類抗體」包含具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的抗體且包含自人類免疫球蛋白庫或自針對一或多個人類免疫球蛋白轉殖基因之動物分離且不表現內源性功能性免疫球蛋白的抗體。人類抗體可藉由包含噬菌體展示方法在內的此項技術中已知之多種方法，使用來源於人類免疫球蛋白序列之抗體庫製備。
本揭示案之抗α4β7抗體包含全長（完整）抗體分子。
抗α4β7抗體可為序列經修飾以改變至少一種恆定區介導之生物效應功能的抗體。舉例而言，在一些實施例中，相對於未修飾之抗體，抗α4β7抗體可經修飾以減弱至少一種恆定區介導之生物效應功能，例如減少與一或多種Fc受體（FcγR），諸如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb之結合。可藉由使抗體之免疫球蛋白恆定區區段在FcγR相互作用所需之特定區域突變來減少FcγR結合（參見例如Canfield及Morrison, 1991, 《實驗醫學雜誌（J. Exp. Med.）》173:1483-1491；及Lund等人, 1991, 《免疫學雜誌（J. Immunol.）》147:2657-2662）。減弱抗體結合FcγR之能力亦可減弱依賴於FcγR相互作用之其他效應功能，諸如調理素化、吞噬作用及抗原依賴性細胞毒性（「ADCC」）。
本文所描述之抗α4β7抗體包含經修飾以相對於未修飾之抗體，獲得或改善至少一種恆定區介導之生物效應功能，例如增強FcγR相互作用的抗體（參見例如美國專利申請案第2006/0134709號）。舉例而言，本揭示案之抗α4β7抗體可具有以比相應未修飾恆定區要高的親和力結合FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb的恆定區。
可改變抗α4β7抗體之FcγR結合及/或ADCC效應功能的額外取代包含Fc區中之K322A取代或L234A及L235A雙取代。參見例如Hezareh等人, 《病毒學雜誌（J.Virol.）》, 75(24):12161-12168(2001)。
本揭示案之抗α4β7抗體可包括包含相較於相應野生型CH2或Fc區之結合，增加與FcγRIIb之結合及/或減少與FcγRIIIa之結合之胺基酸取代的經修飾（或變異）之CH2域或完整Fc域。變異CH2或變異Fc域可在263位、266位、273位及305位處包含一或多個取代。在一些實施例中，相對於野生型CH2域，抗α4β7抗體包括一或多個選自以下之取代：V263L、V266L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S、V273Y、V305K及V305W。
相較於相應野生型CH2或Fc區之結合，可使與FcγRIIb之結合增加及/或使與FcγRIIIa之結合減少的變異CH2或變異Fc域的其他實例包含Vonderheide等人, 《臨床癌症研究（Clin.Cancer Res.）》, 19(5), 1035-1043 (2013)中所見者，諸如人類IgG
1中之S267E或S267E/L328F。
包括人類IgG
4恆定區之抗α4β7抗體可包括S228P突變，據報導，該突變可防止Fab臂交換。參見例如Silva, JP等人, 《生物化學雜誌（Journal of Biological Chemistry）》, 290(9), 5462-5469(2015)。
在一些實施例中，抗α4β7抗體包含藉由使免疫球蛋白恆定區區段在參與FcRn相互作用之特定區域處突變來增加或減小其與例如胎兒Fc受體FcRn之結合親和力的修飾。在特定實施例中，IgG種類之抗α4β7抗體經突變以使得重鏈恆定區之胺基酸殘基250、314及428中的至少一個經單獨或其任何組合經取代。對於250位，取代胺基酸殘基可為除蘇胺酸外的任何胺基酸殘基，包含但不限於丙胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、離胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺、脯胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、絲胺酸、纈胺酸、色胺酸或酪胺酸。對於314位，取代胺基酸殘基可為除白胺酸外的任何胺基酸殘基，包含但不限於丙胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺、脯胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、色胺酸或酪胺酸。對於428位，取代胺基酸殘基可為除甲硫胺酸外的任何胺基酸殘基，包含但不限於丙胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、離胺酸、白胺酸、天冬醯胺、脯胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、色胺酸或酪胺酸。已知改變Fc效應功能之例示性取代係Fc取代M428L，其可與Fc取代T250Q組合出現。適合胺基酸取代之額外特定組合標識於美國專利第7,217,797號之表1中。此類突變增加與FcRn之結合，由此保護抗體免於降解並增加其半衰期。
對人類α4β7具有高親和力之抗α4β7抗體對於治療及診斷用途可為合乎需要的。因此，本揭示案涵蓋對人類α4β7具有高結合親和力之抗體。在特定實施例中，抗α4β7抗體以至少約100 nM之親和力結合至人類α4β7，但亦可展現更高親和力，例如至少約90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM或甚至更高。在一些實施例中，該等抗體以在約1 pM至約10 nM範圍內、在約100 pM至約10 nM範圍內、約100 pM至約1 nM範圍內之親和力或在任何前述值之間之範圍內的親和力結合人類α4β7。
抗α4β7抗體對人類α4β7之親和力可使用此項技術中熟知或本文所描述之技術，諸如但非作為限制，ELISA、等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）、表面電漿子共振或螢光偏振分析測定。
抗α4β7抗體一般包括：包括可變區（V
H）之重鏈，該可變區具有三個互補決定區（「CDR」），在本文中（以N→C次序）稱為V
HCDR#1、V
HCDR#2及V
HCDR#3；及包括可變區（V
L）之輕鏈，該可變區具有三個互補決定區，在本文中（以N→C次序）稱為V
LCDR#1、V
LCDR#2及V
LCDR#3。例示性抗α4β7的例示性CDR之胺基酸序列以及重鏈及輕鏈之V
H及V
L區的胺基酸序列提供於本文中。抗α4β7抗體之具體實施例包含此等例示性CDR及/或V
H及/或V
L序列，以及與此類抗體競爭結合人類α4β7之抗體。
在一些實施例中，抗α4β7抗體適於投與人類。在特定實施例中，抗α4β7抗體係人類化的。
在一些實施例中，抗α4β7抗體CDR之胺基酸序列係選自表4之序列。
| 表 4 特定實施例之 CDR 序列 | ||
| CDR | 序列（ N→C ） | 序列標識符 |
| V HCDR#1： | NTYMH | SEQ ID NO:12 |
| GFNIKNTYMH | SEQ ID NOS:32、42、52、62、72、82 | |
| V HCDR#2： | RIDPANGHTEYAP | SEQ ID NO:13 |
| RIDPANGHTEYAPKFQG | SEQ ID NO:33 | |
| RIDPANKHTEYAPKFLG | SEQ ID NO:43 | |
| RIDPARGHTEYAPKFSG | SEQ ID NO:53 | |
| RIDPARGHTEYAPKFEG | SEQ ID NO:63 | |
| RIDPAKGHTEYAPKFLG | SEQ ID NO:73 | |
| RIDPAGGHTEYAPKFIG | SEQ ID NO:83 | |
| V HCDR#3: | YYVDS | SEQ ID NO:14 |
| VDS | SEQ ID NO:34 | |
| VAS | SEQ ID NOS:44、64、84 | |
| VDQ | SEQ ID NO:54 | |
| VDV | SEQ ID NO:74 | |
| V LCDR#1： | HASQGISDNIG | SEQ ID NO:15、35 |
| HASQEISDNIG | SEQ ID NO:45、85 | |
| HASQDISDNIG | SEQ ID NO:55、65、75 | |
| V LCDR#2： | HGTNLED | SEQ ID NO:16、36、46、56、66、76、86 |
| V LCDR#3： | VQYAQFPWT | SEQ ID NO:17、37、47、57、67、77、87 |
具有以上CDR之抗α4β7抗體的特定例示性實施例在本文中有描述。在一些實施例中，抗α4β7抗體具有SEQ ID NO:12、13、14、15、16及17之CDR。在一些實施例中，抗α4β7抗體具有SEQ ID NO:32、33、34、35、36及37之CDR。在一些實施例中，抗α4β7抗體具有SEQ ID NO:42、43、44、45、46及47之CDR。在一些實施例中，抗α4β7抗體具有SEQ ID NO:52、53、54、55、56及57之CDR。在一些實施例中，抗α4β7抗體具有SEQ ID NO:62、63、64、65、66及67之CDR。在一些實施例中，抗α4β7抗體具有SEQ ID NO:72、73、74、75、76及77之CDR。在一些實施例中，抗α4β7抗體具有SEQ ID NO:82、83、84、85、86及87之CDR。
在一些實施例中，抗α4β7抗體包括選自表5之序列的V
H鏈及V
L鏈：
| 表 5 特定實施例之可變區序列 | |
| 類型 | 序列 ID |
| V H ： | SEQ ID NO:10 |
| SEQ ID NO:20 | |
| SEQ ID NO:21 | |
| SEQ ID NO:22 | |
| SEQ ID NO:23 | |
| SEQ ID NO:40 | |
| SEQ ID NO:50 | |
| SEQ ID NO:60 | |
| SEQ ID NO:70 | |
| SEQ ID NO:80 | |
| V L ： | SEQ ID NO:11 |
| SEQ ID NO:25 | |
| SEQ ID NO:26 | |
| SEQ ID NO:27 | |
| SEQ ID NO:28 | |
| SEQ ID NO:41 | |
| SEQ ID NO:51 | |
| SEQ ID NO:61 | |
| SEQ ID NO:71 | |
| SEQ ID NO:81 |
在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO: 10之V
H鏈；及序列對應於SEQ ID NO: 11之V
L鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO:20或22-23中之任一個的V
H鏈；及序列對應於SEQ ID NO:25或27-28中之任一個的V
L鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO: 21之變異體的V
H鏈；及序列對應於SEQ ID NO:26之變異體的V
L鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO: 40之V
H鏈；及序列對應於SEQ ID NO: 41之V
L鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO: 50之V
H鏈；及序列對應於SEQ ID NO: 51之V
L鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO: 60之V
H鏈；及序列對應於SEQ ID NO: 61之V
L鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO: 70之V
H鏈；及序列對應於SEQ ID NO: 71之V
L鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO: 80之V
H鏈；及序列對應於SEQ ID NO: 81之V
L鏈。
熟習此項技術者應理解本文所描述之抗α4β7抗體中V
H或V
L序列之某些突變以提供在本揭示案之範圍內的抗α4β7抗體。突變可包含如本文所揭示之V
H或V
L序列中的胺基酸取代、添加或缺失，同時仍保持相當大的抗α4β7活性。因此，在一些實施例中，抗α4β7抗體包括與表5中所示抗體中任一種之V
H序列具有至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的V
H序列。抗α4β7抗體可包括與表5中所示抗體中任一種的V
H序列相比較具有至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個突變的V
H序列。在一些實施例中，抗α4β7抗體可包括與表5中所示抗體中任一種的V
H序列相比較具有5個或更少、4個或更少、3個或更少、或2個或更少突變的V
H序列。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括具有單一胺基酸取代之V
H序列。在一些實施例中，V
H序列中之突變位於V
HCDR#1、V
HCDR#2或V
HCDR#3中。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括與表5中所示抗體中任一種之V
L序列具有至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的V
L序列。抗α4β7抗體可包括與表5中所示抗體中任一種的V
L序列相比較具有至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個或至多2個突變的V
L序列。在一些實施例中，抗α4β7抗體可包括與表5中所示抗體中任一種的V
L序列相比較具有5個或更少、4個或更少、3個或更少、或2個或更少突變的V
L序列。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括具有單一胺基酸取代之VL序列。在一些實施例中，VL序列中之突變位於VL CDR#1、VL CDR#2或VL CDR#3中。
在一些實施例中，抗α4β7抗體包括選自表6之序列的重鏈胺基酸序列及/或輕鏈胺基酸序列。
| 表 6 全長鏈 | |
| 鏈 | 序列 ID |
| 重鏈 | SEQ ID NO:90 |
| SEQ ID NO:91 | |
| SEQ ID NO:92 | |
| SEQ ID NO:93 | |
| SEQ ID NO:94 | |
| SEQ ID NO:95 | |
| SEQ ID NO:96 | |
| SEQ ID NO:97 | |
| SEQ ID NO:98 | |
| SEQ ID NO:99 | |
| 輕鏈 | SEQ ID NO:100 |
在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO:90之重鏈；及序列對應於SEQ ID NO:100之輕鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO:92之重鏈；及序列對應於SEQ ID NO:100之輕鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO:94之重鏈；及序列對應於SEQ ID NO:100之輕鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO:96之重鏈；及序列對應於SEQ ID NO:100之輕鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO:98之重鏈；及序列對應於SEQ ID NO:100之輕鏈。
可對抗α4β7抗體之序列進行轉譯後修飾，諸如裂解抗體重鏈C末端上之一或多個（例如1、2、3個或更多個）胺基酸殘基，產生截短之形式。
在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO:91之重鏈；及序列對應於SEQ ID NO:100之輕鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO:93之重鏈；及序列對應於SEQ ID NO:100之輕鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO:95之重鏈；及序列對應於SEQ ID NO:100之輕鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO:97之重鏈；及序列對應於SEQ ID NO:100之輕鏈。在一些實施例中，抗α4β7抗體包括序列對應於SEQ ID NO:99之重鏈；及序列對應於SEQ ID NO:100之輕鏈。
在一些實施例中，抗α4β7抗體在活體外分析中與參考抗體競爭結合人類α4β7。在一些實施例中，抗α4β7抗體競爭結合表現人類α4β7之細胞上的人類α4β7。參考抗體可為本文所描述之抗α4β7抗體中的任一種。在一些實施例中，參考抗體係表4-6中所提供之抗體。在一些實施例中，參考抗體係表8中所提供之抗體。在特定實施例中，參考抗體選自使用來自抗人類α4β7抗體之胺基酸序列產生的研究級抗體，或具有與其等效之胺基酸序列的抗體，諸如維多珠單抗（vedolizumab）。
在一些實施例中，抗α4β7抗體拮抗，例如抑制一個α4（SEQ ID NO:1-2）及一個β7（SEQ ID NO:3-4）之人類α4β7異二聚體。α4β7受體拮抗作用可藉由多種機制發生，例如藉由抑制α4β7與至少一個其配體，諸如人類MAdCAM-1（SEQ ID NO: 5）或人類VCAM-1（SEQ ID NO: 6）之結合來發生。
本文所描述之抗α4β7抗體結合至人類α4β7。抗體結合至來自其他物種，例如來自猴，例如食蟹獼猴之α4β7的交叉反應性可提供優勢，諸如能夠在猴動物模型中測試生物活性。此類動物模型測試可用於篩選抗α4β7抗體以選擇與功效，例如與有利的藥物動力學相關的特性，或與安全性，例如與肝臟毒性降低相關之特性。在一些實施例中，抗α4β7抗體結合至食蟹獼猴α4β7以及人類α4β7。
競爭分析包含但不限於放射性物質標記之免疫分析（RIA）、酶聯結免疫吸附劑分析（ELISA）、夾心ELISA、螢光活化細胞分選（FACS）分析及表面電漿子共振分析。
在進行參考抗體與測試抗體（無論何種物種或同型）之間之抗體競爭分析時，可先用可偵測標記，諸如螢光團、生物素或酶（或甚至是放射性）標記對參考物進行標記以便能隨後鑑別。在此情況下，將表現人類α4β7之細胞與未標記之測試抗體一起培育，添加經標記之參考抗體，並量測經結合標記之強度。若測試抗體藉由結合至重疊抗原決定基與經標記之參考抗體競爭，則相對於在無測試抗體存在下進行之對照反應，強度將降低。
在此分析之一個具體實施例中，先測定在分析條件（例如指定細胞密度）下產生80%最大結合的經標記參考抗體之濃度（「conc
80%」），且用10× conc
80%之未標記測試抗體及conc
80%之經標記參考抗體進行競爭分析。
抑制可藉由抑制常數或K
i表示，其係根據下式計算：
K
i=IC
50/(1+[參考Ab濃度]/K
d)，
其中IC
50係使參考抗體之結合減少50%的測試抗體之濃度，且K
d係參考抗體之解離常數，作為其對人類α4β7之親和力的量度。與本文所揭示之抗α4β7抗體競爭的抗體在本文所描述之分析條件下可具有10 pM至10 nM之K
i。
在各個實施例中，若在所用特定分析條件下引起80%最大結合的參考抗體濃度及比參考抗體濃度高10倍之測試抗體濃度下，測試抗體使參考抗體之結合減少至少約20%或更高百分比，例如減少至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至更高百分比，或在任何前述值之間範圍內之百分比，則認為該測試抗體與參考抗體競爭。
本揭示案之另一個態樣包含能夠特異性結合人類α4β7之抗α4β7抗體結合片段。在一些實施例中，此等抗α4β7結合片段包括本文所揭示之抗α4β7抗體的至少一個且至多所有CDR。抗體結合片段之實例包含例如但不限於Fab、Fab'、F(ab')
2、Fv片段、單鏈Fv片段及單域片段。
抗α4β7抗體或其結合片段可具有一或多個胺基酸插入其CDR中之一或多個中，例如Jung及Plückthun, 1997, 《蛋白質工程（Protein Engineering）》10:9, 959-966；Yazaki等人, 2004, 《蛋白質工程、設計及選擇（Protein Eng. Des Sel.）》17(5):481-9, Epub 2004年8月17日；及美國專利申請案第2007/0280931號中所描述。
6.4. 編碼抗 α4β7 抗體之聚核苷酸、製備該等抗體之表現系統及方法
本揭示案涵蓋編碼抗α4β7抗體之免疫球蛋白輕鏈及重鏈基因的聚核苷酸分子、包括此類聚核苷酸之載體及能夠製備本揭示案之抗α4β7抗體之宿主細胞。
本揭示案之抗α4β7抗體可藉由在宿主細胞中重組表現免疫球蛋白輕鏈及重鏈基因來製備。為重組表現抗體，用攜帶編碼該抗體之免疫球蛋白輕鏈及重鏈之DNA片段的一或多個重組表現載體轉染宿主細胞，由此使該輕鏈及重鏈在宿主細胞中表現且視情況，分泌至培養宿主細胞之培養基中，可自該培養基回收該等抗體。
為產生編碼此類抗α4β7抗體之聚核苷酸，先獲得編碼輕鏈及重鏈可變區之DNA片段。可藉由例如使用聚合酶鏈反應（PCR）擴增及修飾編碼輕鏈及重鏈可變序列之生殖系DNA或cDNA來獲得此等DNA。
一旦獲得編碼抗α4β7抗體相關V
H及V
L區段之DNA片段，即可藉由標準重組DNA技術進一步操作此等DNA片段，例如將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操作中，編碼V
L或V
H之DNA片段操作性地連接至編碼另一蛋白質，諸如抗體恆定區或柔性連接子之另一DNA片段。如在此情形中所使用，術語「操作性地連接」意圖指將兩個DNA片段接合，以使得該兩個DNA片段所編碼之胺基酸序列保持同框。
編碼V
H區的經分離之DNA可藉由將編碼V
H之DNA操作性地連接至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2、CH3及視情況，CH4)之另一DNA分子而轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列係此項技術中已知的(參見例如Kabat, E.A.等人，1991, 《免疫感興趣蛋白質之序列》, 第五版, 美國衛生及公共服務部（U.S.Department of Health and Human Services）, NIH出版號91-3242)，且包含此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG
1、IgG
2、IgG
3、IgG
4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但在某些實施例中為IgG
1或IgG
4。對於Fab片段重鏈基因，編碼V
H之DNA可操作性地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
編碼V
L區的經分離之DNA可藉由將編碼V
L之DNA操作性地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子而轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列係此項技術中已知的(參見例如Kabat, E.A.等人，1991, 《免疫感興趣蛋白質之序列》, 第五版、 美國衛生及公共服務部, NIH出版號91-3242)，且包含此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但在某些實施例中為κ恆定區。
為表現本揭示案之抗α4β7抗體，將如上文所述獲得的編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA插入至表現載體中，以使得基因操作性地連接至轉錄及轉譯控制序列。在此情形中，術語「操作性地連接」意圖指將抗體基因接合至載體，以使得載體內之轉錄及轉譯控制序列發揮其調控抗體基因之轉錄及轉譯的預期功能。選擇與所用表現宿主細胞相容的表現載體及表現控制序列。抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因可插入至獨立載體中，或更典型地，將兩個基因插入至同一表現載體中。
抗體基因係藉由標準方法(例如接合抗體基因片段及載體上之互補限制位點，或在無限制位點存在時之鈍端接合)插入至表現載體中。在插入抗α4β7抗體相關輕鏈或重鏈序列之前，表現載體可能已攜帶抗體恆定區序列。舉例而言，將抗α4β7單株抗體相關V
H及V
L序列轉化成全長抗體基因之一種方法係將其分別插入已編碼重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中，以使得V
H區段操作性地連接至載體內之一或多個CH區段且V
L區段操作性地連接至載體內之CL區段。另外或替代地，重組表現載體可編碼信號肽，其促進抗體鏈自宿主細胞分泌。可將抗體鏈基因選殖至載體中，以使得信號肽與抗體鏈基因之胺基末端同框連接。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽（亦即，來自非免疫球蛋白蛋白質之信號肽）。
除了抗體鏈基因之外，本揭示案之重組表現載體攜帶調控序列，該等調控序列控制宿主細胞中抗體鏈基因之表現。術語「調控序列」意欲包含啟動子、強化子及控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯的其他表現控制元件（例如聚腺苷酸化信號）。
除抗體鏈基因及調控序列之外，本揭示案之重組表現載體可攜帶額外序列，諸如調控宿主細胞中載體之複製的序列（例如複製起點）及選擇性標記物基因。選擇性標記基因促進已引入載體之宿主細胞之選擇。對於輕鏈及重鏈之表現，將編碼重鏈及輕鏈之一或多個表現載體藉由標準技術轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中的多種技術，例如電穿孔、脂質體轉染、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技術。
可在原核或真核宿主細胞中表現本揭示案之抗體。在某些實施例中，抗體之表現係在真核細胞，例如哺乳動物宿主細胞中執行，以最佳地分泌正確摺疊的免疫活性抗體。用於表現本揭示案之重組抗體的例示性哺乳動物宿主細胞包含中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）（包含Urlaub及Chasin(1980)《美國國家科學院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)）》77:4216-4220中描述之DHFR
-CHO細胞，用於DHFR選擇性標記物，例如Kaufman及Sharp, 1982, 《分子生物學（Mol.Biol.）》159:601-621中所描述)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由培養宿主細胞一段足以允許在宿主細胞中表現該抗體或將抗體分泌至生長宿主細胞之培養基中的時間來產生抗體。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。亦可使用宿主細胞產生完整抗體之部分，諸如Fab片段或scFv分子。應理解，以上程序之變化在本揭示案之範圍內。舉例而言，可能希望用編碼本揭示案之抗α4β7抗體之輕鏈或重鏈（但非兩者）的DNA轉染宿主細胞。
亦可使用重組DNA技術移除並非結合至人類α4β7所需的編碼輕鏈及重鏈中之任一個或兩個的DNA之一部分或全部。本揭示案之抗體亦涵蓋自此類截短之DNA分子表現的分子。
對於重組表現本揭示案之抗α4β7抗體，可用兩種本揭示案之表現載體共轉染宿主細胞，第一載體編碼重鏈源性多肽且第二載體編碼輕鏈源性多肽。該兩種載體可含有相同的選擇性標記物，或其可各自含有獨立的選擇性標記物。或者，可使用編碼重鏈及輕鏈多肽兩者之單一載體。
一旦獲得了編碼抗α4β7抗體之一或多個部分的聚核苷酸，即可將其他改變或突變引入編碼序列中，例如以產生編碼具有不同CDR序列之抗體、對Fc受體之親和力減小的抗體或不同亞類之抗體的聚核苷酸。
本揭示案之抗α4β7抗體亦可藉由化學合成或藉由使用無細胞平台產生。
6.5. 抗 α4β7 抗體之純化
一旦藉由重組表現產生本揭示案之多肽，亦可藉由此項技術中已知用於純化蛋白質之任何方法對其進行純化。
多肽可以單體形式或以二聚體形式，例如以包括兩個多肽之抗α4β7抗體形式純化。
一旦分離，即可對抗α4β7抗體進一步純化。
6.6. 使用方法 6.6.1. 治療益處
本文所提供之資料展示，所揭示之抗人類α4β7抗體展示出有利的針對α4β7之結合親和力、特異性及效力，以及在初代免疫細胞上之有利結合特徵、FcγR結合以及針對人類α4β7+細胞之ADCC及ADCP活性的缺失。經顯示，此等抗人類α4β7抗體結合至不同的實驗室生長之HIV病毒株以及來自患者HIV樣本之病毒粒子中的α4β7，且隨後形成免疫複合物。此等免疫複合物可結合至不同FcγR且由人類單核球細胞株THP-1經吞噬作用吸收。此等抗體亦阻斷α4β7與其配體，諸如MadCAM-1及HIV gp120蛋白之相互作用。因此，抗α4β7抗體、結合片段及/或包括其之醫藥組合物可在治療上使用，藉由Fc依賴性及Fab依賴性機制，在感染HIV之受試者中誘導HIV感染之病毒抑制或減小病毒負荷。在一些實施例中，HIV感染之病毒抑制涉及減弱HIV病毒之功能及/或減少HIV病毒之複製。
所揭示之抗人類α4β7抗體可用於治療有需要受試者之HIV感染的方法中。在一些實施例中，該方法涉及減小受試者體內之病毒負荷。在一些實施例中，受試者體內之病毒負荷減小至不可偵測之量。在一些實施例中，受試者係感染HIV之人類受試者。
在一些實施例中，該方法涉及向患有HIV感染之人類受試者投與拮抗α4β7之抗α4β7抗體以提供治療益處。在一些實施例中，該方法涉及向患有HIV感染之人類受試者投與抗α4β7抗體，該抗體結合至HIV病毒粒子。在一些實施例中，該方法涉及向患有HIV感染之人類受試者投與抗α4β7抗體，其結合至HIV病毒粒子中之α4β7以形成免疫複合物。在一些實施例中，該方法涉及向患有HIV感染之人類受試者投與抗α4β7抗體以與HIV病毒粒子形成免疫複合物。在一些實施例中，此等免疫複合物由APC經吞噬作用吸收。在一些實施例中，該方法涉及向患有HIV感染之人類受試者投與抗α4β7抗體，該抗體阻斷α4β7與其配體，諸如MadCAM-1及HIV gp120之相互作用。在一些實施例中，該方法涉及向患有HIV感染之人類受試者投與抗α4β7抗體，該抗體阻斷α4β7與HIV gp120之相互作用，由此抑制細胞間HIV傳播。在一些實施例中，該方法涉及向患有HIV感染之人類受試者投與抗α4β7抗體，該抗體阻斷由MadCAM-1或HIV gp120介導的CD4 T細胞刺激。在一些實施例中，該方法涉及向患有HIV感染之人類受試者投與抗α4β7抗體，該抗體抑制藉由MadCAM-1或HIV gp120共刺激之CD4 T細胞中HIV之複製。在一些實施例中，該方法涉及向患有HIV感染之人類受試者投與抗α4β7抗體，該抗體誘導HIV複製之病毒抑制。在一些實施例中，該方法涉及向患有HIV感染之人類受試者投與抗α4β7抗體，該抗體誘導免疫介導之HIV抑制。
6.7. 序列描述表
表7中顯示所併入之序列表中所揭示之序列及其簡要描述的相關性。
7. 實例
| 表 7 序列表簡述 | |||
| 序列 | 描述 | 序列 | 描述 |
| SEQ ID NO:1 | 人類α4 | SEQ ID NO:50 | Ab-h1.9b VH |
| SEQ ID NO:2 | 人類α4 | SEQ ID NO:51 | Ab-h1.9b VL |
| SEQ ID NO:3 | 人類β7 | SEQ ID NO:52 | Ab-h1.9b VH-CDR1 |
| SEQ ID NO:4 | 人類β7 | SEQ ID NO:53 | Ab-h1.9b VH-CDR2 |
| SEQ ID NO:5 | MAdCAM-1 | SEQ ID NO:54 | Ab-h1.9b VH-CDR3 |
| SEQ ID NO:6 | VCAM-1 | SEQ ID NO:55 | Ab-h1.9b VL-CDR1 |
| SEQ ID NO:7 | gp120-V2 WT | SEQ ID NO:56 | Ab-h1.9b VL-CDR2 |
| SEQ ID NO:8 | gp120-V2對照 | SEQ ID NO:57 | Ab-h1.9b VL-CDR3 |
| SEQ ID NO:10 | Ab-m1 VH | SEQ ID NO:60 | Ab-h1.9c VH |
| SEQ ID NO:11 | Ab-m1 VL | SEQ ID NO:61 | Ab-h1.9c VL |
| SEQ ID NO:12 | Ab-m1 VH-CDR1 | SEQ ID NO:62 | Ab-h1.9c VH-CDR1 |
| SEQ ID NO:13 | Ab-m1 VH-CDR2 | SEQ ID NO:63 | Ab-h1.9c VH-CDR2 |
| SEQ ID NO:14 | Ab-m1 VH-CDR3 | SEQ ID NO:64 | Ab-h1.9c VH-CDR3 |
| SEQ ID NO:15 | Ab-m1 VL-CDR1 | SEQ ID NO:65 | Ab-h1.9c VL-CDR1 |
| SEQ ID NO:16 | Ab-m1 VL-CDR2 | SEQ ID NO:66 | Ab-h1.9c VL-CDR2 |
| SEQ ID NO:17 | Ab-m1 VL-CDR3 | SEQ ID NO:67 | Ab-h1.9c VL-CDR3 |
| SEQ ID NO:20 | Ab-h1 VH.1 | SEQ ID NO:70 | Ab-h1.9d VH |
| SEQ ID NO:21 | Ab-h1 VH.1可變序列 | SEQ ID NO:71 | Ab-h1.9d VL |
| SEQ ID NO:22 | Ab-h1 VH.1.a | SEQ ID NO:72 | Ab-h1.9d VH-CDR1 |
| SEQ ID NO:23 | Ab-h1 VH.1b | SEQ ID NO:73 | Ab-h1.9d VH-CDR2 |
| SEQ ID NO:25 | Ab-h1 VL.1 | SEQ ID NO:74 | Ab-h1.9d VH-CDR3 |
| SEQ ID NO:26 | Ab-h1 VL.1可變序列 | SEQ ID NO:75 | Ab-h1.9d VL-CDR1 |
| SEQ ID NO:27 | Ab-h1 VL.1.a | SEQ ID NO:76 | Ab-h1.9d VL-CDR2 |
| SEQ ID NO:28 | Ab-h1 VL.1b | SEQ ID NO:77 | Ab-h1.9d VL-CDR3 |
| SEQ ID NO:32 | Ab-h1.9 VH-CDR1 | SEQ ID NO:80 | Ab-h1.9e VH |
| SEQ ID NO:33 | Ab-h1.9 VH-CDR2 | SEQ ID NO:81 | Ab-h1.9e VL |
| SEQ ID NO:34 | Ab-h1.9 VH-CDR3 | SEQ ID NO:82 | Ab-h1.9e VH-CDR1 |
| SEQ ID NO:35 | Ab-h1.9 VL-CDR1 | SEQ ID NO:83 | Ab-h1.9e VH-CDR2 |
| SEQ ID NO:36 | Ab-h1.9 VL-CDR2 | SEQ ID NO:84 | Ab-h1.9e VH-CDR3 |
| SEQ ID NO:37 | Ab-h1.9 VL-CDR3 | SEQ ID NO:85 | Ab-h1.9e VL-CDR1 |
| SEQ ID NO:40 | Ab-h1.9a VH | SEQ ID NO:86 | Ab-h1.9e VL-CDR2 |
| SEQ ID NO:41 | Ab-h1.9a VL | SEQ ID NO:87 | Ab-h1.9e VL-CDR3 |
| SEQ ID NO:42 | Ab-h1.9a VH-CDR1 | SEQ ID NO:90、91* | Ab-h1.9d-hIgG1（*末端離胺酸截斷） |
| SEQ ID NO:43 | Ab-h1.9a VH-CDR2 | SEQ ID NO:92、93* | Ab-h1.9d-WT HC（*K截斷） |
| SEQ ID NO:44 | Ab-h1.9a VH-CDR3 | SEQ ID NO:94、95* | Ab-h1.9d-LALA HC（*K截斷） |
| SEQ ID NO:45 | Ab-h1.9a VL-CDR1 | SEQ ID NO:96、97* | Ab-h1.9d-QL HC（*K截斷） |
| SEQ ID NO:46 | Ab-h1.9a VL-CDR2 | SEQ ID NO:98、99* | Ab-h1.9d-LALA/QL HC（*K截斷） |
| SEQ ID NO:47 | Ab-h1.9a VL-CDR3 | SEQ ID NO:100 | Ab-h1.9d LC（*K截斷） |
以下實例係出於說明而非限制之目的提供，該等實例突出顯示本文所描述之抗體及結合片段之例示性實施例的某些特徵及特性。
抗體
表8中列出整個實例中使用之測試抗體，包含Ab-h1.9d-WT、陽性對照及同型對照。
統計學
| 表 8 所製備之抗體的部分清單 | ||
| 名稱 | 用途 | 描述 |
| Ab-h1.9d-WT | 例示性抗體 | 傾向工程改造之人類化抗人類α4β7[hu IgG1/k, WT] |
| Ab-h1.9(x) 系列 | 例示性抗體 | 傾向工程改造之人類化抗人類α4β7[hu IgG1/k] |
| Ab-h1.(x) 系列 | 例示性抗體 | 人類化抗人類α4β7[hu IgG1/k; WT] |
| Ab-h1 | 例示性抗體 | 人類化抗人類α4β7[hu IgG1/k; WT] |
| Ab-c1 | 例示性抗體 | 嵌合抗人類α4β7[hu IgG1/k; WT] |
| Ab-m1 | 例示性抗體 | 小鼠抗人類α4β7[mu IgG1/k; WT] |
| Ab-Vedo | 比較劑 | 人類化抗人類α4β7 mAb [hu IgG1/k; LALA]； 具有維多珠單抗（Entyvio®）可變域之內部型式 |
| Ab-Abri | 比較劑 | 人類抗人類α4β7 mAb；[IgG2/k; WT]； 具有阿利魯單抗（abrilumab）（AMG181）可變域之內部型式 |
| Ab-Etro | 比較劑 | 人類化抗人類β7 mAb [hu IgG1/k; WT]； 具有依曲利組單抗（RG7413）可變域之內部型式 |
| Ab-Nata | 比較劑 | 人類化抗人類α4 mAb [hu IgG4/k; WT] 那他珠單抗（Natalizumab）（Tysabri®） |
| Ab-Ritu | 比較劑 | 嵌合抗人類CD20 mAb [hu IgG1/k; WT] 利妥昔單抗（Rituximab）（Rituxan®） |
| Ab-Tras | 比較劑 | 抗人類HER2 mAb 曲妥珠單抗（Trastuzumab）（HERCEPTIN®） |
| Ab-Ctet | 同型對照 | 抗破傷風類毒素（破傷風梭菌（ Clostridium tetani））mAb[hu IgG1/k; WT] |
| Ab-CMV | 同型對照 | 抗CMV gH MSL109 mAb [hu IgG1/k; WT] |
| Ab-Alem | ADCC對照 | 抗人類CD52 mAb（Campath‑1H）[hu IgG1/k; WT] |
藉由使用GraphPad Prism對濃度反應曲線進行非線性回歸分析來測定半數最大抑制濃度（IC
50）及半數最大有效濃度（EC
50）值。藉由Mann-Whitney雙尾檢定確定比較之顯著性。除非註明，否則所有值係至少三個獨立實驗之結果的平均值或標準差。
7.1. 實例 1 ：抗人類 α4β7 抗體之產生 7.1.1. 融合瘤篩選
利用基於融合瘤之技術產生一組初始的小鼠抗人類α4β7抗體。用表現人類α4β7之HEK293、CHO-K1或BaF3重組細胞以及佐劑對小鼠進行免疫接種。候選融合瘤源性抗體之選擇係基於表9之標準：
| 表 9 候選物選擇標準 | |
| 結合 | 結合至HuT78細胞，即表現內源性細胞表面α4β7之人類T淋巴瘤細胞株 |
| 結合至人類及食蟹獼猴CD4+及CD8+T細胞 | |
| 效力 | 阻斷HuT78細胞黏附至盤結合之人類MAdCAM-1-Fc蛋白質 |
| 阻斷MAdCAM-1-Fc與人類及食蟹獼猴CD4+中樞記憶型T細胞之結合 | |
| 結合特異性 | 結合至表現人類α4β7之重組細胞 |
| 不結合至人類α4β1 | |
| 極少結合或完全不結合至表現人類及食蟹獼猴αEβ7之重組細胞 | |
| 物種交叉反應性 | 結合至表現食蟹獼猴α4β7之重組細胞 |
| 結合至表現大鼠及小鼠α4β7之重組細胞 |
由此篩選鑑別出一組功能性融合瘤mAb，其中所有候選物均展示有利的特徵。然而，所有抗體均無嚙齒動物交叉反應性，其可藉由以下解釋：1)與食蟹獼猴α4/β7具有96%/97%胺基酸序列同源性，但與大鼠及小鼠α4/β7僅具有84%/85%序列同源性的人類α4/β7；及2)所有選擇的功能性融合瘤mAb均對α4β7具有高選擇性，且可結合至α4β7異二聚體上之一或多個構形抗原決定基。
7.1.2. 抗體表徵
藉由200-300 ml滾瓶培養及蛋白質A親和純化對次選殖之穩定融合瘤細胞株執行小規模抗體製造。藉由SDS-PAGE及質譜法驗證mAb之純度。經由結合及功能分析表徵純化抗體以確定同功型及物種交叉反應性。
結合篩選
藉由FACS，利用濃度為1 µg/ml之BaF3-hα4β7、BaF3-hαEβ7、BaF3-cαEβ7、BaF3、CHOK1-cα4β7、CHOK1-mα4β7及CHOK1-hα4β1細胞株表徵純化抗體的同功型及物種交叉反應性。FACS特徵，包含例示性mAb Ab-m1之FACS特徵，概述於表10中。
功能驗證
| 表 10 同功型及物種交叉反應性 | ||||||||
| 抗體 | 同型 | FACS MFI | ||||||
| BaF3 | BaF3-hα4β7 | BaF3-hαEβ7 | BaF3-cαEβ7 | CHOK1-cα4β7 | CHOK1-mα4β7 | CHOK1-hα4β1 | ||
| Ab-m1 | IgG1/k | 3.97 | 453.71 | 17.35 | 54.31 | 45.14 | 3.6 | 3.72 |
| Ab-Vedo | hIgG1/k | 3.53 | 706.72 | 11.60 | 57.21 | 100.88 | 2.91 | 4.23 |
| Ab-Abri | hIgG2/k | 3.54 | 623.52 | 9.81 | 68.35 | 89.85 | 2.87 | 4.25 |
| Ab-Etro | hIgG1/k | 5.78 | 439.75 | 73.21 | 247.12 | 97.21 | 92.16 | 4.53 |
藉由針對HuT78細胞中MadCAM-1之黏附分析來表徵純化抗體。Ab‑m1在MadCAM-1分析中顯示出潛在的阻斷效力且因此在功能上得到驗證。由關於Ab-m1之三個獨立實驗得到的資料概述於表11中。代表性資料顯示於圖1中。
功能表徵
| 表 11 功能分析 | ||||
| 抗體 | HutT78 細胞黏附分析 | CHOK1-cα4β7 黏附分析 | ||
| IC50/MadCAM-1 （ pM ） | 最大抑制 （ % ） | IC50/MadCAM-1 （ pM ） | 最大抑制 （ % ） | |
| Ab-m1 | 55.5±6.3 | 88.9±3.0 | 201.1±51.2 | 84.6±15.6 |
| Ab-Vedo | 94.9±4.5 | 86.5±13.5 | 562.3±249.5 | 76.0±12.6 |
| Ab-Abri | 12.87 | 103.28 | 99.40 | 95.94 |
| Ab-Etro | 17.83 | 103.5 | 241.5±38.6 | 91.5±7.0 |
使用針對CHOK1-cα4β7中MadCAM-1之黏附分析對Ab-m1執行進一步功能表徵以檢查食蟹獼猴交叉反應性。CHOK1-cα4β7中之黏附分析資料概述於上表11中。代表性資料顯示於圖2中。
為測定Ab-m1與人類α4β7結合之親和力，在BaF3-hα4β7中執行基於FACS之滴定。測定EC50，概述於表12中。
| 表 12 對人類 α4β7 之親和力 | |||
| 抗體 | 同型 | BaF3-hα4β7 FACS 滴定 | |
| EC50 （ pM ） | 最大 MFI | ||
| Ab-m1 | IgG1/k | 474 | 255.6 |
| Ab-Vedo | hIgG1/k | 713.2±100.9 | 848.0±289.4 |
| Ab-Abri | hIgG2/k | 679 | 775.3 |
| Ab-Etro | hIgG1/k | 704.8±66.8 | 950.7±202.0 |
藉由競爭性FACS，使用與Alexa488螢光團結合之比較抗體，在50×過量的表13中所指示之非標記Ab存在下執行抗原決定基分組。基於非標記Ab對Alexa488標記之Ab之結合抑制百分比，將Ab-m1表徵為屬於維多珠單抗（Ab-Vedo）樣群組（表13）。
候選物特徵分析
| 表 13 抗原決定基分組 | ||||
| 抗體 | Ab-m1 | Ab-Vedo | Ab-Abri | Ab-Etro |
| Ab-Vedo-Alexa488 | 76 | 88 | 89 | 18 |
| Ab-Abri-Alexa488 | 73 | 88 | 89 | 80 |
| Ab-Etro-Alexa488 | -1 | 6 | 60 | 93 |
| IC50(pM) HuT78 | 44.7±19.3 | 89±10.7 | 12.9 | 17.8 |
在初代人類CD4+記憶型T細胞中確認mAb與人類α4β7結合之親和力。Ab-m1亦能夠以高效力（IC50=63.7 pM，最大抑制100%）阻斷人類MadCAM-1與初代人類CD4+記憶型T細胞之結合（圖3）。
7.1.3. VH/VL 定序、嵌合抗體產生及表徵
回收融合瘤純系並使其在完全融合瘤培養基（含10% FBS之DMEM）中擴增。藉由在室溫下，以1000 rpm離心5分鐘來收集細胞並用pH 7.4之PBS洗滌兩次。利用Trizol，自細胞沈澱物（約1×10
7個細胞）提取RNA。
藉由RT-PCR，使用小鼠Ig引子集（Novagen, 69831-3）分別自融合瘤總RNA擴增抗體VH及VL片段。將適當大小的陽性PCR產物插入T載體中進行VH及VL區之定序及鑑別（表14）。使用VH/VL序列連同理論恆定區序列之組合構建全長抗體序列。
在引子設計之後，使VL/VH個別地擴增並將其選殖至表現載體中，經由同源重組製備嵌合抗體構築體。VH及VL中CDR之胺基酸序列顯示於表14中。
| 表 14 例示性鼠類可變鏈 | |||
| Ab-m1 | 重鏈 | ||
| CDR1 | CDR2 | CDR3 | VH |
| NTYMH SEQ ID NO:12 | RIDPANGHTEYAP SEQ ID NO:13 | VDS SEQ ID NO:14 | SEQ ID NO:10 |
| 輕鏈 | |||
| CDR1 | CDR2 | CDR3 | VL |
| HASQGISDNIG SEQ ID NO:15 | HGTNLED SEQ ID NO:16 | VQYAQFPWT SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:11 |
藉由在HEK293細胞中短暫轉染來產生嵌合抗體。在表現之後，純化出蛋白質。藉由SEC-HPLC確認嵌合抗體中之高百分比單體。
Ab-c1係具有Ab-m1之可變區及人類IgG1/k恆定區的嵌合抗體。藉由FACS測定Ab-c1與來自一份代表性人類全血之人類初代CD4+CD45RO+ T細胞的結合親和力，其結合EC50值為3.9 pM（顯示於圖4及表15中）。亦在HuT78細胞及CHOK1-cα4β7細胞中評價Ab-c1阻斷α4β7整合素與MadCAM-1結合之能力（表15）。
| 抗體 | 初代 CD4+ 記憶型 T 細胞 mAb 結合 EC50 （ pM ） |
| Ab-m1 | 9.8 |
| Ab-c1 | 3.9 |
| Ab-Vedo | 43.2±4.5 |
| Ab-Etro | 5.4±0.2 |
| Ab-Abri | 4.9±1.6 |
藉由FACS，利用一種濃度（1 µg/ml）之BaF3-hα4β7、BaF3-hαEβ7、BaF3-cαEβ7、BaF3、CHOK1-cα4β7及CHOK1-hα4β1細胞株進一步表徵純化之嵌合抗體Ab-c1以確認其結合特異性及食蟹獼猴交叉反應性。測試嵌合體之FACS特徵概述於表16中。
| 表 16 FACS 特徵 | |||||||
| 抗體代碼 | 同型 | FACS MFI | |||||
| BaF3 | BaF3-hα4β7 | BaF3-hαEβ7 | BaF3-cαEβ7 | CHOK1-cα4β7 | CHOK1-hα4β1 | ||
| Ab-m1 | mIgG1/k | 1.37 | 153.69 | 7.35 | 38.09 | 34.36 | 2.96 |
| Ab-c1 | hIgG1/k | 2.85 | 357.77 | 20.65 | 67.81 | 49.40 | 2.95 |
| Ab-Vedo | hIgG1/k | 2.78 | 153.43 | 19.5 | 60.87 | 46.47 | 2.87 |
使用HuT78研究嵌合Ab-c1是否能夠阻斷MadCAM-1介導的與hα4β7整合素之黏附。如表17中所示，Ab-c1展示出抑制HuT78細胞黏附至MadCAM-1的能力。
使用CHOK1-cα4β7研究嵌合抗體是否能抑制MadCAM-1介導的與cα4β7之黏附。如表17中所示，Ab-c1展示出抑制CHOK1-cα4β7細胞黏附至MadCAM-1的能力。
7.1.4. 人類化
| 表 17 黏附分析 | ||||
| MadCAM-1/HuT78 (hα4β7) | MadCAM-1/CHOK1 (cα4β7) | |||
| 抗體代碼 | IC50 （ pM ） | 最大抑制（ % ） | IC50 （ pM ） | 最大抑制（ % ） |
| Ab-m1 | 22.8 | 99.44% | 65.8 | 92.78% |
| Ab-c1 | 13.7 | 98.06% | 86.4 | 85.54% |
| Ab-Vedo | 57.4 | 94.67% | 540.8±336.5 | 94.41% |
抗體Ab-m1係基於對HuT78細胞及人類初代CD4+ T記憶細胞之結合及效力、食蟹獼猴交叉反應性、CDR序列多樣性、結合選擇性、序列傾向（亦即，糖基化）及抗原決定基群組選擇。關於指定特徵，參見表18。
| 表 18 Ab-m1 表徵 | |||||
| 抗體 | MadCAM-1/HuT78 效力（ pM ） | MadCAM-1/cα4β7 效力（ pM ） | 食蟹獼猴交叉反應性 | 人類 CD4+CD45RO+ | |
| 結合 EC50 （ pM ） | MadCAM-1 抑制 IC50 （ pM ） | ||||
| Ab-m1 | 55.5±6.3 | 201.1±51.2 | 4x | 9.8 | 63.7 |
根據表19，藉由組裝VH及VL片段，且併入人類IgG1及κ恆定區來設計人類化抗體。
| 表 19 人類化 Ab-h1 之 VH 及 VL 鏈 | |||
| 嚙齒動物親本抗體 | 人類化 Ab | VH | VL |
| Ab-m1 | Ab-h1.1 | Ab-h1VH.1 (SEQ ID NO:20) | Ab-h1VL.1 (SEQ ID NO:25) |
| Ab-h1.2 | Ab-h1VH.1 (SEQ ID NO:20) | Ab-h1VL.1a (SEQ ID NO:27) | |
| Ab-h1.3 | Ab-h1VH.1 (SEQ ID NO:20) | Ab-h1VL.1b (SEQ ID NO:28) | |
| Ab-h1.4 | Ab-h1VH.1a (SEQ ID NO:22) | Ab-h1VL.1 (SEQ ID NO:25) | |
| Ab-h1.5 | Ab-h1VH.1a (SEQ ID NO:22) | Ab-h1VL.1a (SEQ ID NO:27) | |
| Ab-h1.6 | Ab-h1VH.1a (SEQ ID NO:22) | Ab-h1VL.1b (SEQ ID NO:28) | |
| Ab-h1.7 | Ab-h1VH.1b (SEQ ID NO:23) | Ab-h1VL.1 (SEQ ID NO:25) | |
| Ab-h1.8 | Ab-h1VH.1b (SEQ ID NO:23) | Ab-h1VL.1a (SEQ ID NO:27) | |
| Ab-h1.9 | Ab-h1VH.1b (SEQ ID NO:23) | Ab-h1VL.1b (SEQ ID NO:28) |
產生此等人類化抗α4β7 mAb，其具有良好表現，藉由SEC測定，其顯示＞95%單體。藉由MS確認身分，且藉由DSC量測人類化抗α4β7之穩定性。評價四種人類化Ab-h1阻斷MAdCAM-1介導之HuT78細胞黏附的能力且其全部展示出較強效力，且其IC50值在一位數或較小二位數pM之範圍內（表20）。
7.1.5. Ab-h1.9 之傾向工程改造
| 表 20 人類化 α4β7 mAb 特性 | ||
| 人類化 Ab | HuT78 細胞黏附效力 IC50 （ pM ） | 食蟹獼猴交叉反應性 CHOK1/cα4β7 與 MAdCAM-1 之黏附， IC50 （ pM ） |
| Ab-h1.5 | 9.1 | |
| Ab-h1.6 | 8.1 | |
| Ab-h1.8 | 13.8 | |
| Ab-h1.9 | 11.4 | 36.5 |
| Ab-Vedo | 31; 60 | 120 |
| Ab-Abri | 50.9 | |
| Ab-Etro | 49.9 |
選擇抗體Ab-h1.9以產生關於脫醯胺、異構化、氧化、糖基化、水解及裂解具有降低之化學傾向的變異VH及VL鏈。
Ab-h1.9 VH之序列係：
且Ab-h1.9 VL之序列係：
其中選擇的傾向突變位點加下劃線且CDR加粗。傾向存在於VH-CDR2、VH-CDR3及VL-CDR1中。
使用生物素化人類α4β7細胞外域蛋白質執行兩輪無傾向抗α4β7純系選擇。對來自每個庫之群落定序，並移除任何CDR中具有額外傾向之群落。相較於親本Ab-h1.9，藉由FACS，針對與酵母上表面α4β7抗原之結合來篩選來自每個庫之純系。
鑑別為結合與親本類似的傾向工程改造之純系（圖5）呈現於表21中。將此等傾向工程改造之純系以及其可變區轉化成IgG型式。
| 表 21 自 Ab-H1.9 之傾向工程改造選擇之純系的序列 | ||||
| 抗體 | 重鏈 | |||
| CDR1 | CDR2 | CDR3 | VH | |
| Ab-H1.9 （親本抗體） | GFNIKNTYMH SEQ ID NO:32 | RIDPANGHTEYAPKFQG SEQ ID NO:33 | VDS SEQ ID NO:34 | SEQ ID NO:30 |
| Ab-h1.9a | GFNIKNTYMH SEQ ID NO:42 | RIDPAN K HTEYAPKF L G SEQ ID NO:43 | V A S SEQ ID NO:44 | SEQ ID NO:40 |
| Ab-h1.9b | GFNIKNTYMH SEQ ID NO:52 | RIDPA R GHTEYAPKF S G SEQ ID NO:53 | VD Q SEQ ID NO:54 | SEQ ID NO:50 |
| Ab-h1.9c | GFNIKNTYMH SEQ ID NO:62 | RIDPA R GHTEYAPKF E G SEQ ID NO:63 | V A S SEQ ID NO:64 | SEQ ID NO:60 |
| Ab-h1.9d | GFNIKNTYMH SEQ ID NO:72 | RIDPA K GHTEYAPKF L G SEQ ID NO:73 | VD V SEQ ID NO:74 | SEQ ID NO:70 |
| Ab-h1.9e | GFNIKNTYMH SEQ ID NO:82 | RIDPA G GHTEYAPKF I G SEQ ID NO:83 | V A S SEQ ID NO:84 | SEQ ID NO:80 |
| 輕鏈 | ||||
| CDR1 | CDR2 | CDR3 | VL | |
| Ab-H1.9 （親本抗體） | HASQGISDNIG SEQ ID NO:35 | HGTNLED SEQ ID NO:36 | VQYAQFPWT SEQ ID NO:37 | SEQ ID NO:31 |
| Ab-h1.9a | HASQ E ISDNIG SEQ ID NO:45 | HGTNLED SEQ ID NO:46 | VQYAQFPWT SEQ ID NO:47 | SEQ ID NO:41 |
| Ab-h1.9b | HASQ D ISDNIG SEQ ID NO:55 | HGTNLED SEQ ID NO:56 | VQYAQFPWT SEQ ID NO:57 | SEQ ID NO:51 |
| Ab-h1.9c | HASQ D ISDNIG SEQ ID NO:65 | HGTNLED SEQ ID NO:66 | VQYAQFPWT SEQ ID NO:67 | SEQ ID NO:61 |
| Ab-h1.9d | HASQ D ISDNIG SEQ ID NO:75 | HGTNLED SEQ ID NO:76 | VQYAQFPWT SEQ ID NO:77 | SEQ ID NO:71 |
| Ab-h1.9e | HASQ E ISDNIG SEQ ID NO:85 | HGTNLED SEQ ID NO:86 | VQYAQFPWT SEQ ID NO:87 | SEQ ID NO:81 |
藉由FACS測試傾向工程改造之mAb Ab-h1.9a至Ab-h1.9e與表現α4β7之HuT78細胞的結合。此等抗體保留結合活性，具有在253 pM至702 pM範圍內之EC50值。鑒於傾向工程改造之mAb中大部分的VH-CDR3（例如CDR中三分之一的胺基酸殘基）突變，故α4β7結合之此種保留係出人意料的。Ab-h1.9d顯示最強的結合親和力（253 pM）且展現良好的藥物樣特性。
亦測試呈人類IgG1 Fc LALA型式之抗體Ab-h1.9(a)-(e)的蛋白質製造特性，且Ab-h1.9d展示優良的特性。
7.1.6. 抗體
例示性Ab-h1.9d源性IgG1抗體轉化顯示於表22中。Ab‑h1.9d-HuIgG1係人類IgG1/κ型抗體，該抗體具有SEQ ID NO:90之HC，該HC之特徵為標準人類重鏈恆定區；及SEQ ID NO:100之LC，該LC之特徵為標準人類κ輕鏈恆定區。Ab‑h1.9d-HuIgG1亦可具有SEQ ID NO:91的C末端離胺酸截短之HC。Ab‑h1.9d-WT係IgG1/κ型抗體，該抗體具有SEQ ID NO:92之HC，該HC特徵為變異CH3取代D356E及L358M；及SEQ ID NO:100之LC。Ab‑h1.9d-WT亦可具有SEQ ID NO:93的C末端離胺酸截短之HC。Ab-h1.9d-LALA係IgG1/κ型抗體，該抗體具有SEQ ID NO:94之HC，該HC之特徵為變異CH2取代L234A及L235A，以及變異CH3取代D356E及L358M；及SEQ ID NO:100之LC。Ab-h1.9d-LALA亦可具有SEQ ID NO:95的C末端離胺酸截短之HC。Ab-h1.9d-QL係IgG1/κ型抗體，該抗體具有SEQ ID NO:96之HC，該HC之特徵為變異CH2取代T250Q，以及變異CH3取代D356E、L358M及M428L；及SEQ ID NO:100之LC。Ab-h1.9d-QL亦可具有SEQ ID NO:97的C末端離胺酸截短之HC。Ab-h1.9d-LALA/QL係IgG1/κ型抗體，該抗體具有SEQ ID NO:98之HC，該HC之特徵為變異CH2取代T250Q以及變異CH3取代L234A、L235A、D356E、L358M及M428L；及SEQ ID NO:100之LC。Ab-h1.9d-LALA/QL亦可具有SEQ ID NO:99的C末端離胺酸截短之HC。
| 表 22 例示性選定抗體 | |||
| 抗體 | 特徵 | HC | LC （ κ ） |
| Ab‑h1.9d-hIgG1 | IgG1/k | 90或91 | 100 |
| Ab‑h1.9d-WT | IgG1/k，具有 D356E及L358M | 92或93 | 100 |
| Ab-h1.9d-LALA | IgG1/k，具有 L234A、L235A、D356E及L358M | 94或95 | 100 |
| Ab-h1.9d-QL | IgG1/k，具有 T250Q、D356E、L358M及M428L | 96或97 | 100 |
| Ab-h1.9d-LALA/QL | IgG1/k，具有 L234A、L235A、T250Q、D356E、L358M及M428L M428L | 98或99 | 100 |
| EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKNTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKGHTEYAPKFLGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCYYVDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:90) EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKNTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKGHTEYAPKFLGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCYYVDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:91) EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKNTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKGHTEYAPKFLGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCYYVDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:92) EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKNTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKGHTEYAPKFLGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCYYVDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:93) EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKNTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKGHTEYAPKFLGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCYYVDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:94) EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKNTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKGHTEYAPKFLGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCYYVDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:95) EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKNTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKGHTEYAPKFLGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCYYVDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:96) EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKNTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKGHTEYAPKFLGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCYYVDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:97) EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKNTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKGHTEYAPKFLGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCYYVDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:98) EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKNTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKGHTEYAPKFLGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCYYVDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:99) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQDISDNIGWLQQKPGKSFKLLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:100) |
在產生後，Ab‑h1.9d-WT顯示抗人類α4β7抗體之優良特性，展示高特異性（與αEβ7之結合較低）及所希望之PK/PD（低ADA力價及高血漿暴露量）。
7.2. 實例 2 ：在來自健康供體或 HIV+ 個體之 CD4+ 及 CD8+ T 細胞亞群上之 α4β7 表現 7.2.1. 材料及方法
在急性HIV感染期間，表現α4β7之CD4+ T細胞優先被感染且因此耗盡（Sivro等人, 《科學轉化醫學（Sci Transl Med）》2018）。為了研究在接受cART之HIV+個體中表現α4β7之周邊細胞是否隨時間恢復，藉由流式細胞分析技術分析，使用針對CD3、CD4、CD8、CD28、CD45RO、CCR7及α4β7之抗體的混合液，比較來自10位健康（HIV-）供體及45位接受cART之HIV+個體（年齡：26至66歲，中值年齡42歲；HIV感染持續時間：1至36年，中值持續時間12年）之PBMC的CD4+及CD8+ T細胞亞群上α4β7之百分比及表現量。分析CD4+及CD8+ T細胞群中α4β7之百分比（%）及表現量（MESF）。CD4+及CD8+ T細胞亞群定義為：CD28+CD45RO-初始細胞、CD28-CD45RO-終末效應型細胞、CD28-CD45RO+效應記憶型細胞、CD28+CD45RO+CCR7+中樞記憶型細胞及CD28+CD45RO+CCR7-短期記憶型細胞。
7.2.2. 結果
對於HIV-個體及接受cART之HIV+個體，相較於記憶T細胞亞群，初始CD4+或CD8+ T細胞中表現α4β7之細胞的百分比較高，而相較於初始細胞，中樞記憶型細胞、短期記憶型細胞及效應記憶型細胞上之α4β7表現量（如藉由MESF量測）較高（圖6A至圖6F）。HIV-及HIV+個體中周邊CD4+及CD8+ T細胞表現類似量的α4β7（MESF量測）。此分析展示，接受cART之HIV+個體中在周邊CD4+或CD8+ T細胞上之α4β7表現儘管變化極大，但與未感染個體中之表現並無不同。此等結果表明，HIV+個體中周邊CD4+ T細胞之α4β7表現可證實α4β7併入出芽HIV病毒粒子中。
7.3. 實例 3 ：用 Ab-h1.9d-WT 捕捉 HIV 病毒粒子 7.3.1. 材料及方法
為了確認α4β7存在於HIV病毒粒子包膜中，且為了測試Ab-h1.9d-WT是否能結合至併入HIV病毒粒子包膜中之α4β7以形成免疫複合物，先根據公開之方法（Guzzo等人, 《科學免疫學》2017），在病毒粒子捕捉分析（珠粒型式）中，使用實驗室生長之HIV-1病毒株或來自病毒血症HIV+個體之樣本測試Ab-h1.9d-WT。對於實驗室生長之HIV-1病毒株，在視黃酸（RA）存在下，在活化之初代人類PBMC[例如藉由OKT3抗體或植物血球凝集素（PHA）活化]中產生一組代表不同群組、基因亞型及輔助受體用法之六個病毒株（BCF06、CMU08、NL4-3、RU507、YBF30及IIIB）（表23），以誘導細胞中α4β之表現。用適當抗體裝載蛋白質G結合之免疫磁性珠粒（Dynabeads, 賽默飛世爾（Thermo Fisher））且接著，將其與各HIV病毒株之病毒儲備液（約2 ng p24 gag/反應）一起培育。培育之後，洗滌經裝載之珠粒以移除未結合之病毒顆粒，且隨後，用Triton X-100處理以溶解捕捉之病毒粒子進行p24 gag定量。對於HIV患者之樣本，藉由COBAS Taqman 2.0分析測定樣本之病毒力價（拷貝數/毫升）。將裝載10 µg適當抗體的蛋白質G結合之免疫磁性珠粒與400 µL患者血清一起培育2小時。接著，洗滌珠粒以移除未結合之病毒顆粒，且隨後，使用Qiagen之病毒RNA提取套組，根據製造商之說明書提取經結合病毒粒子之RNA。隨後，藉由數位微滴式PCR，使用靶向B亞型HIV之LTR-gag中保守區的引子及探針對自患者樣本捕捉之病毒粒子的拷貝數定量。
為了測定抗體捕捉HIV病毒粒子之EC
50值，在修改成96孔盤型式之病毒粒子捕捉分析中測試Ab-h1.9d-WT。將連續稀釋之抗體添加至預洗滌的塗有PierceTM蛋白質G之盤（賽默飛世爾）中。培育之後，洗滌各盤以移除未結合之抗體。將各HIV病毒株之病毒儲備液（約2 ng p24 gag）添加至各孔中並培育。洗滌各盤以移除未結合之病毒顆粒，且接著，用Triton X-100處理以溶解捕捉之病毒粒子進行p24 gag定量。藉由高靈敏度AlphaLISA p24 gag偵測套組（珀金埃爾默（Perkin Elmer））偵測HIV p24 gag。
7.3.2. 結果
如由捕捉之病毒粒子中病毒p24 gag蛋白質所指示，Ab-h1.9d-WT能夠捕捉來自測試的全部六個實驗室生長之HIV病毒株的病毒粒子，不管其為臨床病毒株抑或實驗室適應之病毒株（圖7A至圖7F）。捕捉之病毒粒子中p24 gag蛋白質之量對該分析中使用之抗體濃度（5及15 nM）展示劑量反應。如由與Ab-h1.9d-WT反應之樣本中的HIV RNA拷貝數高於與陰性對照抗體反應之樣本所指示，Ab-h1.9d-WT亦能夠自HIV-1患者之樣本捕捉病毒粒子（圖7G-1中所示之病毒輸入）（圖7G-2）。
接下來，在修改成96孔盤型式之病毒粒子捕捉分析中測試Ab-h1.9d-WT以測定其用於捕捉HIV病毒粒子之EC
50值。針對所有測試病毒之EC
50值係類似的且範圍自0.12 nM（0.019 µg/mL）至0.25 nM（0.038 µg/mL）（表23）。當針對相同組病毒進行測試時，Ab-Vedo在捕捉HIV病毒粒子方面之效力不如Ab-h1.9d-WT，其針對每一個別病毒之EC
50值比Ab-h1.9d-WT之EC
50值要高約2-3倍（表23）。可使用珠粒型式分析，藉由Ab-h1.9d-WT（圖7F）及Ab-Vedo（資料未示出）捕捉HIV IIIB病毒株，但由於病毒儲備液之力價較低，其EC
50值無法藉由該盤型式分析測定。
EC
50=半數最大有效濃度；IC
50=半數最大抑制濃度；ND=未測定
a. 可在珠粒分析型式中，利用Ab-h1.9d-WT及Ab-Vedo捕捉IIIB病毒株，但由於病毒儲備液之力價較低，其EC
50值無法以盤分析型式測定。
| 表 23 在活體外用 Ab-h1.9d-WT 進行之 HIV 病毒粒子捕捉及中和 | ||||||||
| 病毒粒子捕捉， EC 50 | 病毒中和， IC 50 | |||||||
| HIV 病毒株 | 群組 | 亞型 | 輔助受體 | Ab-h1.9d-WT | Ab-Vedo | Ab-h1.9d-WT | ||
| nM | µg/mL | nM | µg/mL | µg/mL | ||||
| BCF06 | O | - | X4/R5 | 0.18 ± 0.03 | 0.027 ± 0.005 | 0.37 ± 0.07 | 0.056 ± 0.010 | ＞ 50 |
| CMU08 | M | AE | X4 | 0.25 ± 0.02 | 0.038 ± 0.003 | 0.50 ± 0.08 | 0.075 ± 0.012 | ＞ 50 |
| NL4-3 | M | B | X4 | 0.16 ± 0.03 | 0.024 ± 0.005 | 0.34 ± 0.02 | 0.050 ± 0.002 | ＞ 50 |
| RU570 | M | G | R5 | 0.12 ± 0.06 | 0.019 ± 0.010 | 0.32 ± 0.03 | 0.048 ± 0.005 | ＞ 50 |
| YBF30 | N | - | R5 | 0.14 ± 0.06 | 0.021 ± 0.009 | 0.48 ± 0.15 | 0.072 ± 0.022 | ＞ 50 |
| IIIB | M | B | X4 | ND a | ND a | ND a | ND a | ND |
綜合而言，此等資料確認α4β7存在於測試的所有實驗室生長之HIV病毒株及HIV-1患者樣本的病毒粒子中，且展示Ab-h1.9d-WT在與HIV病毒粒子上之α4β7結合形成免疫複合物方面的效力要高於Ab-Vedo，該形成免疫複合物係誘導所提出之「疫苗接種作用」實現持久HIV病毒控制所需的一系列步驟之第一步。
Ab-h1.9d-WT係可結合至測試的所有HIV病毒株及HIV-1患者樣本之病毒粒子包膜上之α4β7的強效抗α4β7抗體。
7.4. 實例 4 ： Ab-h1.9d-WT 及 HIV 病毒粒子之免疫複合物與 FcγR 的結合 7.4.1. 材料及方法
為了測試由Ab-h1.9d-WT及HIV病毒粒子形成之免疫複合物是否能在活體外結合至FcγR，先將適當抗體與HIV NL4-3病毒（在活化之人類PBMC中，在誘導α4β7表現之RA存在下製備）混合以形成免疫複合物，隨後將其與固定在塗有鎳之盤上的His標記之FcγR[對於FcγRI及FcγRIIIa（V158），其對Ab-h1.9d-WT具有相對較高之親和力，如表32中所示]或固定在塗有中性抗生物素蛋白之盤上的生物素化FcγR一起培育以增加偵測靈敏度[對於FcγRIIa（H131或R131）及FcγRIIIa（F158），其對Ab-h1.9d-WT具有相對較低之親和力，如表32中所示]。在培育之後，洗滌各盤以移除不結合至FcγR之免疫複合物，且接著，用溶解緩衝液處理以溶解所捕捉之免疫複合物，由此釋放病毒蛋白進行p24 gag定量。
7.4.2. 結果
如由結合至FcγR之蛋白質複合物中HIV p24衣殼蛋白之存在所示，由HIV病毒粒子及具有WT Fc域之Ab-h1.9d-WT形成的免疫複合物能夠結合至不同FcγR（圖8A至圖8E）。單獨HIV病毒粒子並不結合至FcγR（資料未示出），由HIV病毒粒子及Ab-h1.9d-LALA形成之免疫複合物也不結合至FcγR，Ab-h1.9d-LALA係除在Fc域中具有工程改造之LALA突變以明顯減少其與FcγR之結合外，其餘與Ab-h1.9d-WT相同之抗體（圖8A至圖8E）。此外，由HIV病毒粒子及Ab-Vedo形成之免疫複合物展示與FcγR之最少結合（圖8A至圖8E）。此與Ab-Vedo對不同FcγR之結合親和力明顯低於Ab-h1.9d-WT相符，因為在Ab-Vedo之Fc域中存在工程改造之突變。歸因於Ab-h1.9d-WT對人類FcγRIIa（H131或R131）及FcγRIIIa（F158，又稱為F176）之結合親和力低於對FcγRI及FcγRIIIa（V158，又稱為V176）之結合親和力（圖19A），將生物素化FcγRIIa（H131或R131）及FcγRIIIa（F158）固定於塗有中性抗生物素蛋白之盤上以增強此等FcγR與Ab-h1.9d-WT之免疫複合物的捕捉，由此代替使用固定於鎳盤上的相應His標記之FcγR。
由Ab-h1.9d-WT及HIV病毒粒子形成之免疫複合物可結合至不同FcγR，包含FcγRIIa（引起ADCP），這一步驟使該等複合物能夠被APC吸收以誘導所提出之「疫苗接種作用」進行HIV控制。
7.5. 實例 5 ： Ab-h1.9d-WT 介導 THP-1 細胞中塗有 α4β7 之珠粒的 Fc 依賴性吸收 7.5.1 材料及方法 細胞培養
在37℃及5% CO
2下，在補充有10% FBS（西格瑪（Sigma））之RPMI培養基（Gibco）中培養THP-1細胞。使細胞每二至三天傳代並維持500,000-1,000,000個細胞/毫升之密度。
珠粒製備
在4℃下，使用3.5 kDa MWCO透析裝置（賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific Inc.）），使重組人類α4β7蛋白質（R & D systems）在1×PBS中透析隔夜。接著，在4℃下，用100x莫耳過量之NHS-生物素（賽默飛世爾科技公司）使所得α4β7生物素化，保持2小時。在4℃下，藉由隔夜透析移除過量的生物素。對於塗有α4β7之珠粒，將NeutrAvidin標記之螢光珠粒（賽默飛世爾科技公司）與生物素化α4β7一起在4℃下培育1-24小時。除非另外規定，否則珠粒-蛋白質結合反應係以每1 ml儲備珠粒2 mg α4β7蛋白質之比率發生。用含有1% BSA（西格瑪）之1×PBS洗滌蛋白質結合之珠粒兩次，接著稀釋100x待用。在吞噬作用分析中，藉由將抗aα5}4β7與同型對照條件相比較，確認蛋白質與珠粒之成功結合。
吞噬作用分析
使用塗有蛋白質之珠粒及THP-1細胞進行的吞噬作用分析係改編自先前所描述之研究（Ackerman等人, 2011）。分析係在96孔盤中執行。藉由將10 μl所製備的塗有α4β7之珠粒與10 μl指定抗體（10 µg/ml）組合來形成免疫複合物。將其在37℃及5% CO
2下培育1-2小時。接著，THP-1細胞（100,000個/孔）與免疫複合物一起培育指定時間量，最終體積為200 μl。培育之後，將細胞用可固定之活細胞/死細胞染色劑（賽默飛世爾）染色，隨後用FACS緩衝液洗滌並固定。使用來自BD之LSR Fortessa X20收集關於所得細胞之資料。分別用PE-CF594及BV510設置偵測螢光珠粒及活細胞/死細胞染色劑螢光。接著，使用FlowJo軟體分析資料。吞噬作用分數計算如下：
吞噬作用分數=(MFI×珠粒陽性細胞百分比)/1000。
正規化：將來自3個獨立實驗之資料正規化並標繪於一個圖上。為進行正規化，藉由將此值除以相同值（針對各實驗進行），將「僅珠粒」條件中之一個重複設定為1。將所有其他值除以此正規化值以展示正規化之吞噬作用分數，該分數表示相對於「僅珠粒」條件之倍數變化。
成像流式細胞分析技術
使用成像流式細胞分析技術確認珠粒之內化情況。在ImagestreamX Mark II成像流式細胞儀（Luminex Corp.）上，在40×放大倍率以及中等靈敏度及中等速度設置下分析固定之細胞。使用488 nm（5 mW）/560-595nm（激發/發射）使螢光珠粒成像。使用405 nm（5mW）/430-480nm（激發/發射）使活細胞/死細胞染色劑成像。在通道2（攝像機1）中收集明場圖像。使用IDEAS分析軟體v6.1（Luminex Corp.）分析資料。使用標準閘控策略發現適當細胞群。簡言之，使用針對明場圖像清晰度之高（＞40）梯度RMS（均方根）鑑別聚焦細胞。藉由明場圖像之高縱橫比及低目標區域來鑑別單細胞。在明場圖像中鑑別細胞目標區域並自細胞邊界腐蝕4個像素以界定『細胞內遮罩（intracellular mask）』。在細胞內遮罩中具有陽性螢光信號之細胞被鑑別為真實內化事件。使用斑點計數特徵對具有真實內化事件之細胞中內化珠粒之數量進行計數。分析每個樣本中具有真實內化事件之至少2000個細胞。
統計分析
使用GraphPad Prism標繪資料。使用單因素ANOVA結合Tukey多重比較檢定來測定顯著性。****
p＜0.0001，***
p=0.0001-0.001，**
p=0.001-0.01，*
p=0.01-0.05。
7.5.2.
結果
抗原呈現細胞對免疫複合物之吸收對於起始下游細胞及體液免疫至關重要。據報導，THP-1細胞以Fc/FcγR依賴性方式吞噬抗體-螢光珠粒免疫複合物（Ackerman等人, 2011）。因此，使用THP-1細胞研究Ab-h1.9d-WT是否介導塗有α4β7之螢光珠粒的吞噬。藉由流式細胞分析技術測定，用α4β7-珠粒/Ab-h1.9d-WT抗體免疫複合物處理3小時之細胞展示與Ab-h1.9d-LALA及Ab-Vedo（特徵為LALA）相關的顯著螢光珠粒吸收（圖9A至圖9B）。已知LALA突變急劇減少IgG Fc與FcγR之結合。此等資料表明，Ab-h1.9d-WT介導含有塗有α4β7之螢光珠粒之免疫複合物的穩健Fc/FcγR依賴性吞噬。
利用Amnis Imagestream執行成像流式細胞分析技術以確認Ab-h1.9d-WT/α4β7-珠粒免疫複合物內化於THP-1細胞中。正如預期，在Ab-h1.9d-WT免疫複合物處理後，螢光珠粒侷限於THP-1細胞內（圖9C
7.6. 實例 6 ： THP-1 細胞中 Ab-h1.9d-WT 誘導的 α4β7+GFP+VLP/Ab 免疫複合物吸收係 α4β7 依賴性及 Fc 依賴性的 7.6.1. 材料及方法 藉由 ELISA 測定的抗體與表現 α4β7 之 GFP+ 病毒樣顆粒（ VLP ）的結合
由依序用α4β7 cDNA構築體及HIV gag-GFP DNA構築體轉染之HEK293細胞產生α4β7+ GFP+VLP，隨後自細胞培養物上清液中純化出VLP。執行ELISA以確認GFP+VLP表面上α4β7之表現及各種測試Ab之結合特異性。簡言之，用50 µL在PBS中濃度為7.5×107個顆粒/毫升之α4β7+GFP+VLP塗佈高結合平底96孔盤中各孔並在4℃下培育隔夜。用PBS+1% FBS洗滌該等孔並在室溫（RT）下，用100 µL超級阻斷溶液阻斷30分鐘。在三次洗滌之後，將各孔與50 µL於PBS+1% FBS中4倍連續稀釋之一次抗體一起在室溫下培育1小時，隨後洗滌，且與50 µL於PBS+1% FBS中HRP結合之驢抗人類IgG-Fcγ特異性二次抗體一起在室溫下培育1小時。最終洗滌之後，將TMB受質添加至各孔中進行顯色，並藉由添加2N H2SO4停止反應。藉由盤讀取器，在450 nm下量測各孔之光學密度（OD）。
THP-1 細胞中 α4β7+GFP+VLPs/ 抗 a4b7 免疫複合物之內化
對於α4β7+GFP+VLP吸收實驗，在最終濃度為1 µg/ml之抗體不存在或存在下，將5×10
4個THP-1細胞及α4β7+ GFP+VLP以1:100之細胞比顆粒比率混合於平底96孔盤中100 µL體積的RPMI、10% FBS中。在CO
2培育箱中，在37℃下將該盤培育16小時。接著，使細胞再懸浮並將其轉移至V形底之96孔盤中，經由離心用200 µL PBS、2% FBS洗滌一次。使細胞沈澱物再懸浮於200 µL PBS、0.5%多聚甲醛中並藉由流式細胞分析技術測定GFP+細胞百分比。
對於VLP吸收之抑制，在CO
2培育箱中，在37℃下利用或不利用最終濃度為240 nM之紅海海綿素A（Lat A），或利用0.1% DMSO（對照）預處理THP-1細胞（0.5×106個/毫升）2小時，隨後將其與或不與抗體及α4β7+GFP+VLP一起培育，如上文所指示。
7.6.2. 結果 THP-1 細胞中 Ab-h1.9d-WT 誘導的 α4β7+GFP+VLP/Ab 免疫複合物之吸收係 α4β7 依賴性及 Fc 依賴性的
由哺乳動物細胞產生之重組病毒樣顆粒（VLP）具有在0.1至0.2微米範圍內之動態大小。因此，相較於先前實驗中所使用的螢光標記之珠粒，該等VLP在大小上更類似於病毒粒子，且其被用作模擬THP-1細胞對α4β7+病毒粒子/Ab免疫複合物之內化/吸收的工具。經由ELISA評價純化的表現α4β7之GFP+VLP結合抗α4β7 Ab之能力。如圖10中所示，Ab-h1.9d-WT、Ab-h1.9d-LALA及Ab-Vedo以類似的結合EC50值（分別為0.050 nM、0.048 nM及0.058 nM）同等地結合至α4β7+GFP+VLP，而同型對照Ab（抗CMV IgG）完全不結合至α4β7+GFP+VLP。此資料表明，各種抗α4β7 Ab可以良好結合親和力及特異性結合α4β7+GFP+VLP。
接下來，在具有或不具有功能性Fc之各種抗α4β7 Ab存在下評價THP-1細胞對α4β7+GFP+VLP之吸收。如圖11A中所示，相較於同型Ab對照處理誘導之1.2% GFP+細胞，Ab-h1.9d-WT處理誘導偵測到超過60%之GFP+ THP-1細胞，表示對GFP+細胞之50倍誘導。此表明，THP-1細胞對α4β7+GFP+VLP之吸收係Ab-h1.9d-WT特異性的且取決於α4β7表現。然而，Ab-h1.9d-LALA或Ab-Vedo（LALA）僅顯示THP-1細胞中最低量之VLP吸收，表明抗α4β7 Ab誘導的此等細胞對α4β7+GFP+VLP之吸收除需要α4β7結合Fab域外，還需要該抗體之功能性Fc域能夠進行Fc/FcγR介導的免疫複合物內化。
為了確認Ab-h1.9d-WT介導的α4β7+GFP+VLP之吸收完全地歸因於內化，而不僅僅是與細胞表面FcγR之結合，使用已知之內化抑制劑紅海海綿素A（Lat-A）預處理THP-1細胞，隨後將其與Ab/VLP免疫複合物一起培育。如圖11B中所示，相較於未處理細胞，Lat A處理之細胞中GFP+細胞有40%減少。此表明，在未處理（模擬）或DMSO處理之對照中觀察到的至少40%之總GFP信號係由THP-1細胞中Ab-h1.9d-WT依賴性VLP內化引起的。
7.7. 實例 7 ： Ab-h1.9d-WT 未展示針對 HIV 之中和活性 7.7.1. 材料及方法
一些能結合至HIV病毒粒子之Ab，例如HIV廣譜中和抗體能夠阻斷病毒感染。為了測試Ab-h1.9d-WT與HIV病毒粒子上α4β7之結合是否能阻止宿主細胞之HIV感染，在病毒中和分析中，使用TZM-bl指示細胞株對其進行評價（Arrildt等人, 《病毒學雜誌》2015）。
HIV 中和分析
將對應於約150,000 RLU（預先藉由病毒滴定法在TZM-bl細胞上測定）的HIV病毒（用PHA及RA製備）與連續稀釋之抗體一起預培育。將含有DEAE‑聚葡萄糖之TZM-bl細胞添加至含有預培育之HIV及抗體的混合物中，且接著在37℃下培育48小時。用Bright-Glo（Promega）處理細胞，並量測螢光素酶信號。
7.7.2. 結果
當測試表23中顯示之HIV病毒株組合時，Ab-h1.9d-WT在至多50 µg/mL濃度下未展示任何中和活性，而靶向CD4+結合位點之HIV廣譜中和抗體針對測試的所有第M組HIV病毒株（亦即，CMU08、NL4-3及RU570）具有約0.1 µg/mL之中和IC
50值（資料未示出）。
儘管Ab-h1.9d-WT結合HIV病毒粒子，但其不中和HIV感染，此與α4β7並非宿主細胞上之病毒受體的觀點一致。此觀察結果證實以下假設：靶向α4β7而非病毒編碼之醣蛋白可避免病毒抗性機制。
7.8. 實例 8 ：不同抗體對 α4β7 與 HIV gp120 之相互作用的抑制 7.8.1. 材料及方法
據報導，α4β7與HIV gp120之間的相互作用使LFA-1活化，潛在地促進HIV之細胞間傳播（Arthos等人, 《自然-免疫學》2008）。為了測試Ab-h1.9d-WT是否能破壞此相互作用，根據公開的方法（Peachman等人, 《公共科學圖書館·綜合》），使用結合至固定於盤上之HIV gp120-V2肽的表現α4β7之RPMI 8866細胞設立α4β7/gp120結合分析。用生物素化HIV gp120-V2 WT或gp120-V2對照肽塗佈塗有NeutrAvidin之高容量96孔盤（賽默飛世爾）（表24）。除所報導的介導α4β7與gp120之間之結合的四個胺基酸在對照肽中突變之外，該兩種生物素化肽之序列係相同的。
| 表 24 生物素化 HIV gp120-V2 肽 | |
| 肽 | 胺基酸序列 * |
| gp120-V2 WT | 生物素-Ttds-CSFNMTTELRDKKQKVHALFYK LDIVPIEDNTSSSEYRLINC-NH2 (SEQ ID NO:7) |
| gp120-V2對照 | 生物素-Ttds-CSFNMTTELRDKKQKVHALFYK AAAAPIEDNTSSSEYRLINC-NH2 (SEQ ID NO:8) |
在添加抗體-細胞混合物之前，洗滌經肽塗佈之盤以移除未結合之肽。為了產生抗體-細胞混合物儲備液，使RPMI 8866細胞（8×10
6個細胞/毫升）再懸浮於補充有最終濃度為2 mM之MnCl
2的冷阻斷緩衝液中以活化α4β7之構形。將連續稀釋之Ab-h1.9d-WT、Ab-Vedo或同型陰性對照抗體與MnCl
2處理之細胞混合，並培育該混合物。將抗體-細胞混合物（於每孔50 µL中之2×10
5個細胞）添加至塗佈有gp120肽之盤的每個孔中並培育。洗滌該盤，並藉由CellTiter-Glo 2.0試劑（Promega）測定附著於塗有肽之盤的活細胞。
7.8.2. 結果
藉由表現α4β7之RPMI 8866細胞與固定於盤上的HIV gp120-V2 WT肽結合，但不與固定之gp120-V2對照肽結合展示此分析之特異性（圖12A），該對照肽在所報導的介導gp120與α4β7之結合的4個胺基酸處帶有突變（表24）。當以此分析型式測試時，Ab-h1.9d-WT阻斷RPMI 8866細胞與HIV gp120-V2 WT肽之結合，其IC
50值為0.022±0.016 µg/mL（圖12B）。Ab-Vedo的IC
50值（0.042±0.023 µg/mL）高於當在相同分析中測試時Ab-h1.9d-WT之IC
50值，指示其在阻斷此相互作用方面不如Ab-h1.9d-WT強效（圖12B）。綜合而言，此等結果指示，Ab-h1.9d-WT可有效地破壞α4β7與gp120之相互作用，由此潛在地抑制細胞間病毒擴散。
當以此分析型式測試時，Ab-h1.9d-WT阻斷RPMI 8866細胞與HIV gp120-V2 WT肽之結合，其IC
50值為0.022±0.016 µg/mL（圖12B）。此等結果指示，Ab-h1.9d-WT可有效地破壞α4β7與gp120之相互作用，由此潛在地抑制細胞間病毒擴散。
7.9. 實例 9 ： Ab-h1.9d-WT 與表現 α4β7 整合素之人類及食蟹獼猴細胞的結合 7.9.1. 材料及方法
HuT78細胞（表現內源性α4β7之人類T淋巴瘤細胞）上Ab-h1.9d-WT之結合係使用ECL結合分析評價且人類及食蟹獼猴周邊淋巴球上該抗體之結合係使用流式細胞分析技術評價。
另外，測定並比較Ab-h1.9d-WT對人類及食蟹獼猴血液源性總、初始及記憶CD4+及CD8+ T細胞之結合EC
50值。
ECL 細胞結合分析
在含有20% FBS、青黴素（50個單位/毫升）/鏈黴素（50 µg/mL）之IMDM培養基中培養表現內源性α4β7之HuT78細胞。收集HuT78細胞，洗滌1次並使其以1.5×10
6個細胞/毫升再懸浮於DPBS中。將細胞（7.5×10
4於50 µL中）添加至一或多個MSD高結合盤各孔中。添加6.7%（在DPBS中稀釋）胎牛血清並在37℃下，將一或多個盤培育一小時。移除上清液並將25 µL經1:4倍8點稀釋製備的在1.5 µg/mL至0.000091 µg/mL（在含有5% FBS及1 mM MnCl
2之DPBS緩衝液中）範圍內之經滴定Ab-h1.9d-WT抗體或同型對照添加至各孔中，且接著，在37℃下將各盤培育一小時。用DPBS洗滌各盤2次，並將25 µL在5% FBS/DPBS/1 mM MnCl
2中1:500稀釋之山羊抗人類Ab磺基標籤添加至各孔中，隨後在37℃下培育30分鐘。用DPBS洗滌細胞兩次，且接著，將150 µL之2×MSD讀取緩衝液T添加至各孔中。在Sector Imager 6000讀取器上讀取一或多個盤，並使用GraphPad Prism 7.0軟體生成結合曲線及結合EC
50值。
人類及食蟹獼猴周邊 T 細胞結合分析
在RPMI1640/10% FBS培養基中將冷凍之人類或食蟹獼猴PBMC（使用標準Ficoll Paque分離方法自血液供體分離）解凍，用FACS緩衝液（不含Ca
+2/Mg
+2之DPBS，1% BSA）洗滌1次且使其再懸浮於含有5%山羊血清之FACS緩衝液中。將約1-2×10
5個（於100 µL中）細胞添加至96孔U形底盤中並在冰上培育30分鐘。對盤進行離心並移除上清液。將在含有5%山羊血清及螢光標記之抗體混合液之FACS緩衝液（25 µL）中稀釋的經由1:5倍稀釋製備之最終濃度在5至0.000016 µg/mL範圍內的經滴定Ab-h1.9d-WT或同型對照（25 µL）添加至各孔中，且接著，在冰上將盤培育一小時。同時，亦製備補償及FMO對照。在培育之後，對細胞離心並用FACS緩衝液洗滌2次。將二次抗體（結合PE）以1:2,000稀釋於含有5%山羊血清之FACS緩衝液中並將50 µL添加至各孔中。將盤在冰上培育一小時。培育之後，用FACS緩衝液洗滌細胞2次，使其再懸浮於200 µL含0.5% PFA之PBS中。在FACS（Canto II, BD）上讀取該盤並基於正向及側向散射對活細胞進行閘控。使用第10版FlowJo軟體分析流式資料（FCS 3.0檔案）並使用GraphPad Prism 7.0軟體生成結合曲線及結合EC
50值。
7.9.2. 結果 ECL 細胞結合
如表25中所概述，Ab-h1.9d-WT對HuT78細胞、人類及食蟹獼猴血液源性淋巴球分別展示26 pM、130 pM、62 pM之結合EC
50值。
* 平均值± SD；N = 3（人類）或N = 5（食蟹獼猴）
人類及食蟹獼猴周邊 T 細胞結合分析
| 表 25 Ab-h1.9d-WT 與 HuT78 細胞及淋巴球之結合 | ||
| *EC 50 （ pM ）（平均值 ± SD ） | ||
| ECL | FACS | |
| HuT78 | 人類淋巴球 | 食蟹獼猴淋巴球 |
| 26 ± 2 | 130 ± 85 | 62 ± 46 |
Ab-h1.9d-WT對人類及食蟹獼猴血液源性總、初始及記憶CD4+及CD8+ T細胞之結合EC
50值顯示於表26中。
CD4+初始= CD4+CD45RA+CCR7+細胞，CD4+記憶 = CD4+CD45RA-細胞
CD8+初始= CD8+CD45RA+CCR7+細胞，CD8+記憶= CD8+CD45RA-細胞
a. 人類PBMC = 3位供體
b. 食蟹獼猴PBMC = 5位供體
| 表 26 Ab-h1.9d-WT 與人類及食蟹獼猴 T 細胞亞群之結合 EC 50 | ||||||
| EC50 （ pM ）（平均值 ± SD ） | ||||||
| 物種 | 總 CD4+ T 細胞 | CD4+ 初始 T 細胞 | CD4+ 記憶 T 細胞 | 總 CD8+ T 細胞 | CD8+ 初始 T 細胞 | CD8+ 記憶 T 細胞 |
| 人類 a | 63 ± 38 | 84 ± 32 | 20 ± 12 | 165 ± 121 | 144 ± 120 | 52 ± 51 |
| 食蟹獼猴 b | 30 ± 16 | 45 ± 27 | 10 ± 12 | 35 ± 25 | 42 ± 26 | 36 ± 30 |
針對評價的所有T細胞亞群之平均結合EC
50值在10至165 pM範圍內。Ab-h1.9d-WT以極其類似之方式結合至人類及食蟹獼猴CD4+及CD8+ T細胞或其亞群，因為針對各相應細胞類型之平均EC
50值在此兩個物種之間僅有2至3倍變化。
亦分析Ab-h1.9d-WT與人類及食蟹獼猴CD4+及CD8+ T亞群之結合以比較Ab-h1.9d-WT結合之T細胞亞群的百分比，顯示於圖13中。總體而言，各T細胞亞群中Ab-h1.9d-WT結合之細胞的百分比在人類與食蟹獼猴之間相當。此等發現並不出人意料，因為來自人類及食蟹獼猴之α4及β7高度同源（97%胺基酸一致性，參見表27）。
| 表 27 物種間 α4 及 β7 之胺基酸一致性（ % ） | ||||
| 整合素 | 食蟹獼猴 | 兔 | 大鼠 | 小鼠 |
| 人類α4 | 97 | 89 | 84 | 84 |
| 人類β7 | 97 | 88 | 86 | 86 |
另外，在活體內研究中確認Ab-h1.9d-WT與食蟹獼猴之功能性交叉反應性。當α4β7受體被完全佔據時，在食蟹獼猴中重複給予Ab-h1.9d-WT引起周邊血液CD4+ T細胞計數之增加。此等資料展示Ab-h1.9d-WT之在靶功能性藥效作用且證實食蟹獼猴係用於Ab-h1.9d-WT之毒理學評價的藥理學上相關之物種。
總體而言，Ab-h1.9d-WT較強地結合至人類及食蟹獼猴CD4+及CD8+ T亞群，展示出優良的食蟹獼猴結合交叉反應性。
7.10. 實例 10 ： Ab-h1.9d-WT 之整合素結合特異性 7.10.1. 材料及方法
表現個別人類及食蟹獼猴異二聚體整合素α4β7、α4β1及αEβ7之重組細胞能夠評價Ab-h1.9d-WT之結合特異性。
亦評價Ab-h1.9d-WT與人類上皮HEK293細胞之非特異性結合。
整合素結合特異性分析
收集除食蟹獼猴α4β1外，表現各種人類及食蟹獼猴整合素（α4β7、α4β1或αEβ7）之CHO-K1或BAF3細胞，計數並在FACS緩衝液（不含Ca
+2/Mg
+2之DPBS、1% BSA）中以1.5×10
6個細胞/毫升之密度製備。將含有1.5×10
5個細胞之100 µL添加至96孔U形底盤的每個孔中並離心以移除上清液。添加於FACS緩衝液中滴定之Ab-h1.9d-WT、分析對照或同型對照（各100 µL）以復原細胞沈澱物。將孔內含物混合，隨後在冰上培育一小時。用FACS緩衝液洗滌細胞2次，且接著，將100 µL以1:600稀釋於FACS緩衝液中之二次抗體（山羊抗人類IgGFcγ特異性Alexa Fluor 488）添加至各孔中並混合。將盤在冰上培育45分鐘。隨後，用FACS緩衝液洗滌細胞2次，並使其再懸浮於200 µL含0.5% PFA之PBS中。在FACS（Canto-II, BD）上讀取該盤並基於正向及側向散射測定活細胞。使用GraphPad Prism 7.0軟體產生細胞結合之抗體的中值螢光強度。
對於表現食蟹獼猴α4β1之CHO-K1細胞，將含有25 µL各自以1:25稀釋的CD29-APC及CD49d-BV421混合物以及25 µL藉由在FACS緩衝液中1:5倍連續稀釋製備之Ab-h1.9d-WT、分析對照或同型對照的抗體染色混合液添加至96孔U形底各孔中以復原食蟹獼猴α4β1細胞沈澱物。將孔內含物混合，隨後在冰上培育45分鐘。同時，亦製備染色對照。用FACS緩衝液洗滌細胞2次，且接著，將50 µL以1:600稀釋於FACS緩衝液中之二次抗體（山羊抗人類IgGFcγ特異性PE）添加至各孔中並混合。將盤在冰上再培育45分鐘。隨後，用FACS緩衝液洗滌細胞2次，並使其再懸浮於200 µL含0.5% PFA之PBS中。在FACS（Canto-II, BD）上讀取該盤並基於正向及側向散射對活細胞進行閘控。接著，對CD29+CD49d+細胞進行閘控，使用第10版FlowJo軟體測定細胞結合之測試抗體的中值螢光強度。使用GraphPad Prism 7.0軟體標繪資料。
非特異性 HEK293 細胞結合分析
在完全DMEM（DMEM+10% FBS+1%丙酮酸鈉）中培養HEK293G細胞。使用非酶解離緩衝液（Gibco，目錄號13151-014）收集細胞，計數並使其以1.5×10
6個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液（2% BSA/PBS）中。使7.5×10
4個細胞分散於96孔U形底盤各孔中。將100 µg/mL Ab-h1.9d-WT、陽性對照抗體或同型對照抗體添加至各孔中並在冰上培育一小時。培育之後，用FACS緩衝液洗滌細胞2次，且再將其與100 µL的1:100稀釋於FACS緩衝液中之山羊抗huIgG Fc-PE（Jackson，目錄號109-116-098）一起在冰上培育30分鐘。隨後，用FACS緩衝液洗滌細胞2次並使其再懸浮於200 µL FACS緩衝液中。藉由FACS（Canto II, BD）讀取該盤。使用GraphPad Prism 7.0軟體分析結合資料。
7.10.2. 結果 整合素結合特異性
如圖14A至圖14C中所示，Ab-h1.9d-WT特異性結合至表現人類α4β7之細胞且並不結合至表現人類α4β1之細胞，而抗α4 mAb、Ab-nata則結合至兩種整合素。相較於關於抗β7 mAb，即研究級依曲利組單抗所觀察到的明顯較強之結合，Ab-h1.9d-WT最低限度地結合至表現人類αEβ7之細胞。Ab-h1.9d-WT對食蟹獼猴整合素展示出類似的結合特異性特徵。此等資料展示，Ab-h1.9d-WT對人類及食蟹獼猴α4β7具有結合特異性。
非特異性 HEK293 細胞結合
亦評價Ab-h1.9d-WT與人類上皮HEK293細胞之非特異性結合。如圖15中所示，Ab-h1.9d-WT在高濃度（100 µg/mL）下不展現與HEK293細胞之任何非特異性結合，與對照抗體相當，而陽性對照mAb展示與此等細胞之較強非特異性結合。
7.11. 實例 11 ： Ab-h1.9d-WT 之兔及嚙齒動物結合交叉反應性 7.11.1. 材料及方法
經由流式細胞分析技術評價Ab-h1.9d-WT與自兔、大鼠及小鼠分離之PBMC的結合。
兔及嚙齒動物交叉反應性結合分析
將兔PBMC解凍，置放於RPMI1640/10% FBS培養基中，用FACS緩衝液（不含Ca
+2/Mg
+2之DPBS、1% BSA）洗滌1次並使其再懸浮於含有5%山羊血清之FACS緩衝液中。將細胞（1×10
5個於100 µL中）施配至96孔U形底盤中並在冰上培育30分鐘。將各盤離心以移除上清液並將25 µL經滴定之Ab-h1.9d-WT或同型對照加25 µL 1:10稀釋之CD4-FITC抗體（所有Ab均於FACS緩衝液中稀釋）添加至各孔中以復原細胞沈澱物。將孔內含物混合，隨後在冰上培育45分鐘。同時，亦製備適當染色對照。隨後，用FACS緩衝液洗滌細胞2次並將50 µL在含有5%山羊血清之FACS緩衝液中以1:2000稀釋的二次抗體-PE添加至細胞沈澱物中。將盤再在冰上培育45分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞2次，並使其再懸浮於200 µL含0.5% PFA之PBS中。在FACS（Canto II, BD）上讀取該盤並基於正向及側向散射對活細胞進行閘控。藉由使用第10版FlowJo軟體測定抗體結合之細胞的百分比，使用GraphPad Prism 7.0軟體生成結合曲線及結合EC
50值。
雌性C57BL/6N小鼠及雌性Lewis大鼠分別獲自Taconic Laboratories及Charles River Laboratories。PBMC係自動物彙集之小鼠及大鼠血液分離。使用RBC溶解緩衝液（eBioscience）溶解紅血球。在PBS中洗滌細胞1次並使其再懸浮於含有5%山羊血清之FACS緩衝液（不含Ca
+2/Mg
+2之DPBS、1% BSA）中。將約2.5×10
5個細胞（100 µL）添加至96孔U形底盤中，接著在冰上培育30分鐘。除Ab-h1.9d-WT或同型對照外，亦將1:50稀釋的適當螢光染料結合之抗體添加至小鼠細胞（CD3-APC、α4β7-PE或IgG2a-FITC對照）或大鼠細胞（CD3-APC、α4-FITC或IgG2a-PE對照）中。充分混合孔內含物，並將盤在冰上培育一小時。同型對照及Ab-h1.9d-WT之最終濃度為10及1 µg/mL。隨後，用FACS緩衝液洗滌細胞2次，並將100 µL二次抗體-PE或二次抗體-AF488以1:800稀釋度添加至各孔中並將盤在冰上培育45分鐘。培育之後，用FACS緩衝液洗滌細胞2次，使其再懸浮於200 µL含0.5% PFA之PBS中。在FACS（Canto II, BD）上讀取該盤並基於正向及側向散射對活細胞進行閘控。藉由使用第10版FlowJo軟體測定與測試抗體或同型對照結合之CD3+細胞百分比並使用GraphPad Prism 7.0軟體繪圖。
7.11.2. 結果
如表28中所概述，相較於人類及食蟹獼猴對應物，Ab-h1.9d-WT對兔淋巴球及CD4+ T細胞展示出類似的結合EC
50值，而Ab-h1.9d-WT未顯示出與大鼠或小鼠PBMC（淋巴球及CD4+ T細胞）之任何可量測的結合。
EC50值係使用表現α4β7之淋巴球及CD4+細胞的百分比測定
a. 人類/兔PBMC=3位供體
b. 食蟹獼猴PBMC = 5位供體
c. 來自彙集之血液的嚙齒動物PBMC
7.12. 實例 12 ： Ab-h1.9d-WT 誘導之 α4β7 內化 7.12.1. 材料及方法
| 表 28 Ab-h1.9d-WT 與兔及嚙齒動物血液淋巴球及 CD4+ T 細胞之結合以及與人類及食蟹獼猴之結合的比較 | ||
| EC 50 （ pM ）（平均值 ± SD ） | ||
| 物種 | 淋巴球 | CD4+ T 細胞 |
| 人類 a | 130 ± 85 | 63 ± 38 |
| 食蟹獼猴 b | 62 ± 45 | 30 ± 16 |
| 兔 a | 89 ± 34 | 97 ± 11 |
| 大鼠 c | 不結合 | 不結合 |
| 小鼠 c | 不結合 | 不結合 |
研究Ab-h1.9d-WT誘導來自兩位PBMC供體之人類初代CD4+及CD8+初始T細胞上細胞表面α4β7之內化的能力。
內化分析
研究Ab-h1.9d-WT內化並使用測定依曲利組單抗之細胞機制的類似FACS方案進行定量（Lichnog等人, 《藥理學前沿（Front Pharmacol）》）。使用Ficoll Paque（GE 17-1440-03）及SepMate管（StemCell 85450）自兩位健康血液供體（RBC，供體KP58219及KP58239）分離周邊血液單核細胞（PBMC），使其再懸浮於含有5% DMSO之FBS（Gibco 10438-026）中並在液氮中冷凍保存。將冷凍之PBMC解凍，計數並在RPMI培養基+10% FBS中以1×10
6個細胞/毫升復原，且將100 µL細胞以每孔1×10
5個細胞塗鋪。接著，將經塗鋪之細胞在4℃下培育或置放於37℃、5% CO
2培育箱中，保持30分鐘，以使其適應盤溫度。在4℃下，將人類PBMC與100 µL的1.25 µg/mL（最終0.625 µg/mL）之2倍濃度未標記之Ab-h1.9d-WT抗體預培育一小時。將細胞離心，洗滌並使其再懸浮於200 µL RPMI+10% FBS中，且在4℃或37℃、5% CO
2下培育18小時。在培育之後，用FACS緩衝液（PBS+1% FBS）洗滌細胞2次，且接著，在AF647標記之非競爭性抗β7抗體存在或不存在下，用CD4+（Biolegend 317410）、CD8+（Biolegend 344710）及CD45RA（Biolegend 304130）染色30分鐘。藉由流式細胞分析技術（LSR-Fortessa）獲取細胞螢光。使用FlowJo 10軟體分析資料，並藉由100×[內化之前總細胞表面α4β7表現量（在4℃下之MFI）-內化之後之剩餘細胞表面α4β7表現量（在37℃下之MFI）/內化之前的總細胞表面α4β7表現量（在4℃下之MFI）]計算內化百分比。
7.12.2. 結果
如圖16A中所示，當Ab-h1.9d-WT在4℃下結合至人類PBMC以最大限度地減少內化之後18小時評價時，來自供體1的73%之CD4+初始T細胞（CD4+CD45RA
+）及49%之CD8+初始T細胞（CD8+CD45RA
+）保持β7陽性。然而，Ab-h1.9d-WT依據相同方案但在37℃下培育以促進內化之後，僅17%的CD4+初始T細胞及7%的CD8+初始T細胞被認為呈β7陽性。此等資料指示，結合至Ab-h1.9d-WT之表面α4β7在37℃下發生顯著內化。利用來自供體2之PBMC觀察到類似結果。基於圖16B中對α4β7在37℃下內化之定量（表面α4β7表現量相對於在4℃下處理後觀察到的表現量減少），Ab-h1.9d-WT能夠誘導α4β7
+初始CD4+及CD8+ T細胞上α4β7之約80%內化。
Ab-h1.9d-WT在誘導α4β7內化方面要比Ab-Vedo強效。
7.13. 實例 13 ： Ab-h1.9d-WT 阻斷 MAdCAM-1 配體 7.13.1. 材料及方法 MAdCAM-1 配體阻斷分析
對於基於FACS之分析，收集HuT78細胞或人類PBMC，用DPBS洗滌1次，將其調整至1.5×10
6個細胞/毫升的密度，並使其再懸浮於FACS緩衝液（不含Ca
+2/Mg
+2之DPBS、1% BSA/1 mM MnCl
2）中。將細胞以每孔1×10
5個（100 µL）施配至96孔U形底盤中並離心以移除上清液。將經滴定之Ab-h1.9d-WT或同型對照（50 µL）加50 µL含有0.3 µg/mL MAdCAM‑1‑mFc、2 mM MnCl
2及1:50稀釋（30 µg/mL）於FACS緩衝液中的Alexa488結合之偵測Ab的混合物添加至各孔中。將該盤在冰上培育一小時，接著離心。用200 µL FACS緩衝液輕緩地洗滌該盤1次，並使細胞在相同緩衝液中復原。藉由FACS（Canto II）讀取該盤並藉由正向及側向散射閘控來測定活細胞。使用第10版FlowJo軟體分析流式資料（FCS 3.0檔案），使用GraphPad Prism 7.0軟體生成結合曲線及抑制IC
50值。
對於基於盤之分析，在4℃下，使用塗佈緩衝液（不含Ca
+2/Mg
+2之PBS、0.1% BSA），用100 µL之20 µg/mLMAdCAM-1 hFc或同型對照（最終濃度為每孔2µg）塗佈96孔平底盤（Greiner，目錄號655077）隔夜。次日，用200 µL洗滌緩衝液（含Ca
+2/Mg
+2之PBS、0.1% BSA）洗滌一或多個盤2次，接著，在37℃下使用阻斷緩衝液（含Ca
+2/Mg
+2之PBS、1% BSA）阻斷一小時。在阻斷培育期間，製備Ab-h1.9d-WT及同型對照之稀釋液並收集HuT78細胞。2×初始濃度係在5 µg/mL下製備且接著，一式兩份或一式三份，執行連續1:4.5的7點稀釋（最終濃度在2.5至0.0003 µg/mL範圍內）。對細胞計數，洗滌並使其以2×10
6個細胞/毫升再懸浮於分析培養基（IMDM、1% BSA）中，向其中添加最終濃度為2 mM之MnCl
2並將100,000個細胞施配至96孔盤各孔中。接著，將經稀釋之抗體添加至細胞中，並將混合物在37℃、5% CO
2下培育30分鐘。自塗有MAdCAM-1 hFc之盤傾析出阻斷溶液並將每孔100 µL預培育之HuT78細胞及mAb混合物分配至塗有MAdCAM-1 hFc之盤的各孔中。將一或多個盤以1,000 rpm短暫離心一分鐘並在37℃、5% CO
2下培育30分鐘。將黏附盤傾析，並用150 µL洗滌緩衝液輕緩地洗滌4次。洗滌後，將每孔100 μL混合物（含有50 μL CellTiter-Glo試劑及50 μL分析培養基）添加至各孔中。將一或多個盤置放於定軌振盪器上，保持兩分鐘，接著在室溫下培育10分鐘。在發光盤讀取器（Topcount, 珀金埃爾默）上讀取盤發光。在GraphPad Prism 7.0中，使用4參數曲線擬合分析來標繪發光信號並測定IC
50值。
7.13.2. 結果
使用基於盤及基於FACS之分析測試Ab-h1.9d-WT阻斷MAdCAM-1蛋白質之重組細胞外域與表現α4β7之HuT78細胞及人類淋巴球（PBMC）之結合的能力。
藉由使用基於FACS及基於盤之分析分別獲得50 pM及25 pM之IC
50值。
此外，在223 pM之IC
50下，觀察到Ab-h1.9d-WT對MAdCAM-1與人類血液源性淋巴球之結合的阻斷作用（表29）。
*平均值± SD；N = 3
| 表 29 Ab-h1.9d-WT 之 MAdCAM-1 阻斷效力 IC 50 | ||
| *IC 50 （ pM ） | ||
| FACS | 發光 | |
| HuT78 | 人類淋巴球 | HuT78 |
| 50 ± 11 | 223 ± 86 | 25 ± 4 |
此等資料展示Ab-h1.9d-WT對MAdCAM-1/α4β7相互作用具有較強抑制作用。
7.14. 實例 14 ： Ab-h1.9d-WT 阻斷 MAdCAM-1 對人類初代 CD4+ T 細胞之共刺激作用 7.14.1. 材料及方法 人類 PBMC 及 CD4+ T 細胞分離
自健康供體收集之新鮮血液分離人類周邊血液單核細胞（PBMC）。接著，使用CD4陰性選擇套組（Stem Cell Technologies）自PBMC分離出人類CD4+ T細胞。
CD4+ T 細胞活化及增殖分析
在4℃下，用在HBSS中每孔200 ng之抗CD3抗體（百進生技（Biolegend））塗佈96孔平底組織培養盤隔夜。次日，用HBSS洗滌塗有抗CD3之盤一次並其與每孔200 ng MAdCAM-1（R&D systems）一起在37℃下培育1小時。在培育之後，用200 μl HBSS洗滌該等盤一次並在1 µg/mL測試抗體存在或不存在下，將50,000個CD4+ T細胞添加至各孔中。在37℃、5% CO2下培養細胞96小時之後，洗滌細胞並用Live-Dead Aqua活力染料（賽默飛世爾）染色，且隨後用細胞活化標記物抗CD25 FITC（純系MA0251，BD bioscience）及抗Ki67 APC（百進生技）染色。在流式細胞儀上分析細胞並用FlowJo軟體分析資料。標繪來自多位供體之資料並使用GraphPad Prism執行統計分析。使用單因素ANOVA結合Tukey多重比較檢定來測定顯著性。**** p＜0.0001，** p=0.001-0.01。
7.14.2. 結果 Ab-h1.9d-WT 阻斷 MAdCAM-1 對人類初代 CD4+ T 細胞之共刺激作用
MAdCAM-1介導的α4β7+CD4+ T細胞之腸道歸巢在GALT（腸道相關淋巴組織）之HIV感染中起到關鍵作用。除此作用外，據報導，MAdCAM-1亦將共刺激信號傳遞至人類初代CD4+ T細胞並促進HIV複製（Nawaz等人, 《黏膜免疫學（Mucosal Immunology）》2018）。鑒於HIV感染及複製需要此等細胞之代謝活化且Ab-h1.9d-WT可以223 pM之IC50值阻斷MAdCAM-1與人類淋巴球之結合（表35），故評價Ab-h1.9d-WT是否能夠阻斷MAdCAM-1針對人類初代CD4+ T細胞之共刺激信號，該阻斷又將抑制此等細胞中MAdCAM-1介導之病毒複製。
當將來自一位代表性健康供體之人類初代CD4+ T細胞與單獨盤結合之抗CD3一起培育96小時的時候，22.6%的細胞經活化，展示出Ki67+CD25+表型（圖17A）。當將細胞與盤結合之抗CD3及MAdCAM-1一起培育時，56.6%的CD4+ T細胞經活化。由此指示，MAdCAM-1藉由與細胞表面α4β7相互作用而介導將共刺激信號傳遞至CD4+ T細胞。在96小時培育期間，將Ab-h1.9d-WT添加至細胞中使得細胞活化降低至20.8%，與單獨抗CD3之量相當，而同型對照Ab對細胞活化不具有任何抑制作用。資料表明，Ab-h1.9d-WT有效地且完全地阻斷由MAdCAM-1施加之共刺激信號。利用來自另外五位個別供體之初代CD4 T細胞重複分析且資料概述於圖17B中。與圖17A中自一位代表性供體獲得的資料一致，Ab-h1.9d-WT幾乎完全阻斷MAdCAM-1/α4β7介導的CD4+ T細胞之共刺激，而同型對照Ab不具有任何抑制作用。
7.15. 實例 15 ： Ab-h1.9d-WT 之 VCAM-1 配體阻斷特異性 7.15.1. 材料及方法
在VCAM-1介導之細胞黏附分析中評估Ab-h1.9d-WT對α4β7/VCAM-1相互作用之影響。
VCAM-1 配體阻斷分析
第1天，在4℃下，使用塗佈緩衝液（不含Ca
+2/Mg
+2之PBS、0.1% BSA），用100 µL之20 µg/mLVCAM-1 hFc或同型對照（最終濃度為每孔2 µg）塗佈各盤（96孔平底盤，Greiner，目錄號655077）隔夜。第2天，用200 µL洗滌緩衝液（含Ca
+2/Mg
+2之PBS、0.1% BSA）洗滌一或多個盤3次，接著使用阻斷緩衝液（含Ca
+2/Mg
+2之PBS、1% BSA）在37℃下阻斷1小時或更長時間。在阻斷培育期間，製備Ab-h1.9d-WT、Ab-nata及同型對照之稀釋液並收集HuT78細胞。2×初始濃度之抗體係以4 µg/mL製備且接著，在分析培養基（IMDM、1% BSA）中製備1:4倍連續稀釋液。對HuT78細胞計數，洗滌並使其以2×10
6個細胞/毫升再懸浮於分析培養基中，向其中添加最終濃度為2 mM之MnCl
2並將100,000個細胞施配至96孔盤各孔中。接著，將經稀釋之抗體添加至細胞中，並將混合物在37℃、5% CO
2下培育30分鐘。自塗有VCAM-1 hFc之盤傾析出阻斷溶液，並將每孔100 µL預培育之HuT78細胞及mAb混合物分配至塗有VCAM-1 hFc之盤的各孔中。將一或多個盤在37℃、5% CO
2下培育30分鐘，且接著使用洗滌緩衝液輕緩地洗滌3次。洗滌後，將每孔100 μL混合物（含有50 μL CellTiter-Glo試劑及50 μL分析培養基）添加至各孔中。將一或多個盤置放於定軌振盪器上，保持兩分鐘，接著在室溫下培育10分鐘。在發光盤讀取器（Topcount, 珀金埃爾默）上讀取盤發光。在GraphPad Prism 7.0中，使用4參數曲線擬合分析來標繪發光信號以測定IC
50值。
7.15.2. 結果
除α4β7結合至MAdCAM-1能夠引起血液淋巴球之腸道歸巢外，α4β7亦可結合至內皮細胞上表現之VCAM-1（表30）。
| 表 30 Ab-h1.9d-WT 之 VCAM-1 阻斷選擇性 | ||||
| mAb | 實驗 1 | 實驗 2 | 實驗 3 | 平均值（ N = 3 ） |
| IC 50 （ pM ） | IC 50 （ pM ） ± SD | |||
| Ab-h1.9d-WT | 無抑制 | 無抑制 | 無抑制 | 無抑制 |
| Ab-nata | 38 | 54 | 77 | 56 ± 20 |
能夠阻斷α4β7及α4β1與VCAM-1之結合的那他珠單抗Ab-nata（一種抗α4 mAb）因阻斷循環淋巴球向腦中之運輸而引起進行性多灶性白質腦病（PML）。因此，在VCAM-1介導之細胞黏附分析中評估Ab-h1.9d-WT對α4β7/VCAM-1相互作用的影響係使用Ab-nata作為陽性對照進行研究的一個必不可少的安全參數。正如預期，Ab-nata阻斷VCAM‑1介導之HuT78細胞黏附，其平均IC
50值為56 pM。相比之下，Ab-h1.9d-WT未顯示出對VCAM-1介導之HuT78細胞黏附的明顯阻斷（圖18）。
儘管Ab-h1.9d-WT以高效力選擇性阻斷α4β7/MAdCAM-1相互作用，但其未顯示對α4β7/VCAM-1相互作用之抑制作用。
7.16. 實例 16 ： Ab-h1.9d-WT 對人類及食蟹獼猴 FcγRI 、 FcγRIIa 、 FcγRIIb 、 FcγRIIIa 及 FcRn 之結合親和力 7.16.1. 材料及方法
藉由BIAcore，相較於抗體IgG1對照曲妥珠單抗，評價Ab-h1.9d-WT對一組重組人類及食蟹獼猴FcγR細胞外域（ECD）蛋白質的結合親和力。
亦經由流式細胞分析技術，藉由使用工程改造成表現各種細胞表面人類FcγR之CHO‑K1細胞評價Ab-h1.9d-WT與人類FcγR之結合。
藉由BIAcore，在pH 6.0及pH 7.4下使用重組人類及食蟹獼猴FcRn ECD蛋白質評價Ab-h1.9d-WT與人類及食蟹獼猴FcRn之結合（表31）。
N = 3
人類及食蟹獼猴 Fc γR1 、 Fc γRIIa 、 Fc γRIIb 及 Fc γRIIIa 表面電漿子共振（ SPR ）結合分析
| 表 31 經由 BIAcore 測定的 Ab-h1.9d-WT 對人類及食蟹獼猴 FcRn 之結合親和力 | ||||
| 抗體 | 人類 FcRn K D （ M ）（平均值 ± SD ） | 食蟹獼猴 FcRn K D （ M ）（平均值 ± SD ） | ||
| pH 6.0 | pH 7.4 | pH 6.0 | pH 7.4 | |
| Ab-h1.9d-WT | 3.3 × 10 -6± 0.2 × 10 -6 | 無顯著結合 | 2.2 × 10 -6± 0.3 × 10 -6 | 無顯著結合 |
| 曲妥珠單抗 | 3.2 × 10 -6± 0.1 × 10 -6 | 無顯著結合 | 2.2 × 10 -6± 0.4 × 10 -6 | 無顯著結合 |
在25℃下，藉由在Biacore T200儀器（GE Healthcare）上進行SPR量測，使用抗His捕捉來測定Ab-h1.9d-WT對加His標籤之人類FcγR的結合動力學。使用標準胺偶合套組，根據製造商之說明書，將在10 mM乙酸鈉（pH 4.5）中稀釋至25 µg/mL的約10000 RU之小鼠抗His抗體（R&D）固定於整個CM5生物感測器晶片上。用1 M乙醇胺阻斷生物感測器表面上未反應之部分。使用流槽1上活化及去活化之表面作為參考。在分析操作緩衝液HBS‑EP+（10 mM Hepes，pH 7.4；150 mM NaCl；3 mM EDTA；0.05% Tween 20）中進行晶片製備及結合動力學量測。接著，將人類及食蟹獼猴FcγR捕捉於流槽2上以獲得250至500 RU之捕捉量。將Ab-h1.9d-WT樣本以50 µL/min之流動速率注射於所有流槽上，保持一至五分鐘（對於人類及食蟹獼猴FcγRIIb及FcγRIIa，保持一分鐘；對於人類FcγRIIIa，保持兩分鐘；以及對於人類及食蟹獼猴FcγRI及食蟹獼猴FcγRIII，保持五分鐘）。分析物濃度範圍對於人類及食蟹獼猴FcγRI食蟹獼猴FcγRIII為0.78至200 nM，對於人類及食蟹獼猴FcγRII為46.9至12000 nM且對於FcγRIII為7.8至4000 nM（2倍連續稀釋）。包含僅緩衝液注射用於雙重參考。監測經結合FcγR解離，保持一至五分鐘（對於FcγRIIb、FcγRIIa，保持一分鐘；對於FcγRIIIa，保持三分鐘；且對於FcγRI，保持五分鐘）。對於全部八個通道，藉由以100 µL/min流動速率注射100 mM HCl使晶片表面再生，保持兩秒。對於各樣本，使用相同CM5晶片執行三個實驗。對此三個實驗之結果求平均值。
人類 FcγR1 、 FcγRIIa 、 FcγRIIb 、 FcγRIIIa 細胞結合分析
使表現hFcγR之CHO-K1細胞在150 cm
2培養燒瓶中生長並根據製造商之說明書，裝載特定量之螢光團，CellTrace CFSE
TM及CellTrace Violet
TM（Molecular Probes）以確定各細胞株之獨特螢光覆蓋區（footprint）（條形碼方法）。將各細胞株混合並在4℃下與在RPMI1640/2 mM L-麩醯胺酸/10%超低IgG熱滅活FBS（結合培養基）中不同濃度（0、0.01、0.1、1、10、50、100及250 µg/mL）之單體Ab-h1.9d-WT一起培育一小時。培育之後，在PBS（pH7.4，不含Ca
+2/Mg
+2）中洗滌細胞2次並在4℃下，與在結合培養基中的與AF647偶合之二次抗體（F(ab')
2山羊抗人類IgG(H+L)一起培育15分鐘以偵測細胞結合之Ab-h1.9d-WT。培育之後，用PBS（pH7.4，不含Ca
+2/Mg
+2）再洗滌細胞2次。使用流式細胞分析技術分析儀（LSR-Fortessa）偵測細胞表面螢光並記錄下來。使用第10版FlowJo軟體（Tristar）分析所記錄之螢光資料並以AF647之螢光幾何平均值報導Ab-h1.9d-WT與CHO-K1 hFcγR細胞之結合（生成gMFI隨Ab-h1.9d-WT濃度變化之結合曲線）。
人類及食蟹獼猴 FcRn 表面電漿子結合分析
對於FcRn結合分析，將Ab-h1.9d-WT直接固定於根據製造商之方案胺偶合之CM5晶片上，達到750 RU密度。將濃度在5.5至12000 nM範圍內（3倍連續稀釋）之人類及食蟹獼猴FcRn重組蛋白以50 µL/min流動速率注射於所有流槽上，保持一分鐘，隨後進行一分鐘解離。藉由注射pH 7.4之HBS-EP+，保持15秒，使表面再生。製備樣本並在兩種操作緩衝液，即MES EP+ pH 6.0及HBS-EP+ pH 7.4中操作。對於各樣本（各一式兩份），使用不同CM5晶片執行三個實驗。對此三個實驗之結果求平均值。將來自人類FcγRI、FcγRIIIa（F158）、FcγRIIIa（V158）及食蟹獼猴FcγRI、FcγRIII與所有樣本之結合的資料擬合至具有固定R
max之1:1全局動力學模型。將來自人類FcyRIIb、FcγRIIa（H131）、FcγRIIa（R131）、食蟹獼猴FcγRIIa、FcγRIIb及FcRn與所有樣本之結合的資料擬合至穩態親和力模型。使用Biacore T200評價軟體2.0版擬合FcγR及FcRn資料。
7.16.2. 結果 人類及食蟹獼猴 Fc γR1 、 Fc γRIIa 、 Fc γRIIb 及 Fc γRIIIa 結合
結合動力學參數概述於表32（對於人類）及表33（對於食蟹獼猴）中。
N = 3
| 表 32 經由 BIAcore 測定的 Ab-h1.9d-WT 對人類 FcγR 之結合親和力 | ||||||
| 抗體 | 捕捉之 FcγR | |||||
| K D （ M ）（平均值 ± SD ） | ||||||
| hFcγRI | hFcγRIIa (H131) | hFcγRIIa (R131) | hFcγRIIb | hFcγRIIIa (F158) | hFcγRIIIa (V158) | |
| Ab-h1.9d-WT | 1.6 × 10 -8± 0.2 × 10 -8 | 5.6 × 10 -6± 0.8 × 10 -6 | 結合，但因結合太弱而無法測定 | 結合，但因結合太弱而無法測定 | 4.6 × 10 -6± 2.1 × 10 -6 | 4.8 × 10 -7± 3.1 × 10 -7 |
| 曲妥珠單抗 | 1.5 × 10 -8± 0.3 × 10 -8 | 6.1 × 10 -6± 0.3 × 10 -6 | 8.9 × 10 -6± 0.3 × 10 -6 | 結合，但因結合太弱而無法測定 | 9.5 × 10 -7± 0.3 × 10 -7 | 9.4 × 10 -8± 0.1 × 10 -8 |
Ab-h1.9d-WT及曲妥珠單抗對hFcγRI及hFcγRII（H131）具有類似的可量測結合親和力，與hFcγRII（R131）及hFcγRIIb受體之結合較弱。正如預期，Ab-h1.9d-WT及曲妥珠單抗對hFcγRIIIa（F158/V158）具有可量測之結合親和力，且其對V158多態變異體具有較高親和力。
N = 3
| 表 33 經由 BIAcore 測定的 Ab-h1.9d-WT 對食蟹獼猴 FcγR 之結合親和力 | ||||
| 抗體 | 捕捉之 FcγR | |||
| K D （ M ）（平均值 ± SD ） | ||||
| 食蟹獼猴 FcγRI | 食蟹獼猴 FcγRIIa | 食蟹獼猴 FcγRIIb | 食蟹獼猴 FcγRIII | |
| Ab-h1.9d-WT | 1.2 × 10 -8± 0.1 × 10 -8 | 結合，但因結合太弱而無法測定 | 結合，但因結合太弱而無法測定 | 2.8 × 10 -7± 4.6 × 10 -7 |
| 曲妥珠單抗 | 1.3 × 10 -8± 0.2 × 10 -8 | 結合，但因結合太弱而無法測定 | 結合，但因結合太弱而無法測定 | 8.0 × 10 -8± 4.6 × 10 -8 |
儘管Ab-h1.9d-WT及曲妥珠單抗展現與食蟹獼猴FcγRI及食蟹獼猴FcγRIII兩者之結合，但可能歸因於與此等受體之結合較弱，無法測定對於食蟹獼猴FcγRIIa及食蟹獼猴FcγRII受體的可量測之結合參數。
人類 FcγR1 、 FcγRIIa 、 FcγRIIb 、 FcγRIIIa 細胞結合分析
Ab-h1.9d-WT展示與人類FcγRI及FcγRIIIa（V176）多態變異體之最高結合，但與其他人類FcγR[FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa（F176）及FcγRIIIb]之結合相對較低（圖19A至圖19B）。
人類及食蟹獼猴 FcRn 表面電漿子結合分析
Ab-h1.9d-WT在酸性條件（pH 6.0）下展現與人類及食蟹獼猴FcRn之可量測結合，但在中性pH值（pH 7.4）下無可量測之結合（表34）。FcRn結合特性與對照（曲妥珠單抗）相當。
N = 3
7.17. 實例 17 ： Ab-h1.9d-WT 活體外 ADCC 、 ADCP 及 CDC 活性 7.17.1. 材料及方法
| 表 34 經由 BIAcore 測定的 Ab-h1.9d-WT 對人類及食蟹獼猴 FcRn 之結合親和力 | ||||
| 抗體 | 人類 FcRn K D （ M ）（平均值 ± SD ） | 食蟹獼猴 FcRn K D （ M ）（平均值 ± SD ） | ||
| pH 6.0 | pH 7.4 | pH 6.0 | pH 7.4 | |
| Ab-h1.9d-WT | 3.3 × 10 -6± 0.2 × 10 -6 | 無顯著結合 | 2.2 × 10 -6± 0.3 × 10 -6 | 無顯著結合 |
| 曲妥珠單抗 | 3.2 × 10 -6± 0.1 × 10 -6 | 無顯著結合 | 2.2 × 10 -6± 0.4 × 10 -6 | 無顯著結合 |
使用表現天然α4β7/CD20之RPMI8866細胞作為目標細胞且表現hFcγRIIIa（V158）或hFcγRIIa（H131）之報導體Jurkat細胞作為效應細胞評價Ab-h1.9d-WT之活體外ADCC及ADCP活性。此Jurkat細胞株具有NFAT反應元件，其驅動作為報導體之螢火蟲螢光素酶的表現。在此等分析中，使用抗CD20 mAb，即Ab-Ritu作為陽性對照。
另外，在基於細胞之細胞毒性的ADCC分析中，使用表現α4β7/CD52之HuT78細胞作為目標，人類初代NK細胞作為效應物且Campath（抗CD52）作為陽性對照抗體來評價Ab-h1.9d-WT。
ADCC 報導體分析
使表現目標α4β7之RPMI8866細胞生長並維持在培養基（RPMI1640，2 mM L-麩醯胺酸及10% FBS）中。收集對數期細胞，計數，洗滌並使其以6×10
5個細胞/毫升儲備液再懸浮於分析培養基（含有低IgG血清之RPMI1640）中並置放於37℃、5% CO
2下待用。製備30 µg/mL之3×初始濃度的Ab-h1.9d-WT及對照mAb，接著在Costar 3956稀釋盤中以1:100連續（2點）稀釋。根據一或多種盤佈置，一式兩份，將抗體（25 µL）與等體積之目標RPMI8866細胞（25 µL）混合。將效應Jurkat細胞（穩定表現人類FcγRIIIa V158變異體及驅動來自Promega
TM之螢火蟲螢光素酶之表現的NFAT反應元件）迅速地解凍並在分析培養基中調至3×10
6個細胞/毫升。接著，將Jurkat效應物（25 µL）添加至含有RPMI8866目標及抗體之96孔分析盤中。對照孔包含單獨培養基、單獨效應物（E）及目標（T）、E+T、E+mAb（30 µg/mL）或T+mAb（30 µg/mL）。根據一或多種盤佈置，將所有孔調至每孔75 µL。最終細胞數量係75,000個Jurkat效應細胞/孔及15,000個RPMI8866目標細胞/孔，對應於5:1之E:T比率。每孔的最終抗體濃度係67 nM（10 µg/mL）、0.67 nM（0.1 µg/mL）及0.0067 nM（0.001 µg/mL）。在37℃、5% CO
2下，將盤培育六小時，在此期間，在使用之前，將Bio‑Glo
TM緩衝液及受質（目錄號7110）平衡至室溫。在培育結束時，用緩衝液使Bio-Glo受質復原以形成酶/受質溶液（Bio-Glo試劑）。將每孔75 µL的等體積Bio-Glo添加至所有孔中。接著，在室溫下將盤培育10分鐘。在發光盤讀取器（Topcount, 珀金埃爾默）上讀取盤發光。使用GraphPad Prism 7.0軟體以RLU標繪發光信號。
ADCP 報導體分析
使表現目標α4β7之RPMI8866細胞生長並維持在培養基（RPMI1640、2 mM L-麩醯胺酸及10% FBS）中。收集對數期細胞，計數，洗滌並使其以2×10
5個細胞/毫升儲備液再懸浮於分析培養基（含有低IgG血清之RPMI1640）中並置放於37℃、5% CO
2下待用。製備30 µg/mL之3×初始濃度的Ab-h1.9d-WT及對照mAb，接著在Costar 3956稀釋盤中以1:100連續（2點）稀釋。根據一或多種盤佈置，一式兩份，將抗體（25 µL）與等體積之目標細胞（25 µL）混合。將效應Jurkat細胞（穩定表現人類FcγRIIa H131變異體及驅動來自Promega
TM之螢火蟲螢光素酶之表現的NFAT反應元件）迅速地解凍並在分析培養基中調至1×10
6個細胞/毫升。接著，將Jurkat效應物（25 µL）添加至含有RPMI8866目標及抗體之96孔分析盤中。對照孔包含單獨培養基、單獨效應物（E）及目標（T）、E+T、E+mAb（30 µg/mL）或T+mAb（30 µg/mL）。根據一或多種盤佈置，將所有孔調至每孔75 µL。最終細胞數量係25,000個Jurkat效應細胞/孔及5,000個目標細胞/孔，對應於5:1之E:T比率。每孔的最終抗體濃度係67 nM（10 µg/mL）、0.67 nM（0.1 µg/mL）及0.0067 nM（0.001 µg/mL）。在37℃、5% CO
2下，將盤培育六小時，在此期間，在使用之前，將Bio‑Glo
TM緩衝液及受質（目錄號7110）平衡至室溫。在培育結束時，用緩衝液使Bio-Glo受質復原以形成酶/受質溶液（Bio-Glo試劑）。將每孔75 µL的等體積Bio-Glo添加至所有孔中。接著，在室溫下將盤培育10分鐘。在發光盤讀取器（Topcount, 珀金埃爾默）上讀取盤發光。使用GraphPad Prism 7.0軟體以RLU標繪發光信號。
CDC 分析
使RPMI8866細胞生長並維持於培養基（RPMI1640、2 mM L‑麩醯胺酸及10% FBS）中。收集對數期細胞，計數，洗滌並使其以4×10
6個細胞/毫升儲備液再懸浮於分析培養基（不含酚紅之RPMI1640，目錄號11835-030）中並置放於37℃、5% CO
2下待用。在Costar 3956稀釋盤中製備45 µg/mL及0.45 µg/mL之3×初始濃度的Ab-h1.9d-WT及對照mAb。使用冷流動水將人類供體血清（HMN19169及HMN19170）解凍且立即置放於冰上。將抗體、對照（25 µL）及培養基添加至分析盤（Costar 3599）中。將供體血清（各25 µL）、目標細胞（25 µL）及稀釋之mAb（25 µL）以含有33%血清補充物、1×10
5個細胞及15 µg/mL mAb之每孔75µL最終體積混合。接著，將一或多個盤在37℃、5% CO
2下培育兩小時。在培育之後，將呈1.5 mg/mL之5×儲備溶液的細胞滲透性染料（西格瑪；刃天青鈉鹽）以1:5稀釋於DPBS中並將25 µL染料添加至各孔中。將盤再培育16小時且接著，使用Clariostar盤讀取器讀取吸光度（545/600）。在Excel中使用下式計算目標特異性細胞溶解百分比：100-100×[(與mAb一起培育之吸光度)/(對照吸光度)]；並使用GraphPad Prism 7.0軟體標繪結果。
ADCC 細胞毒性分析
收集表現目標α4β7之HuT78細胞，用PBS（不含Ca
+2/Mg
+2，1% BSA）洗滌2次，並使其以1×10
7個細胞/毫升再懸浮於PBS中，接著在室溫下用CFSE標記八分鐘，最終濃度為2 µM。培育之後，添加10%最終濃度之FBS以淬滅標記。用RPMI+10% FBS培養基洗滌細胞2次，且接著，在96孔V形底盤中，將CFSE標記之HuT78細胞與100 µL的10 µg/mL之2倍濃度Ab-h1.9d-WT或對照抗體一起在37℃、5% CO
2下培育30分鐘。隨後，將100 µL的2.5×10
5個NK（FcγRIIIa V158+）效應細胞（與200 U/mL IL-2一起預培育）以5:1比率添加至目標細胞中。將孔內含物充分混合，隨後在CO
2培育箱中，在37℃下培育五小時。用PBS洗滌NK及HuT78細胞混合物2次，並使其以1×10
6個細胞/毫升再懸浮於含有1 µL FVD染料/mL的無疊氮化物且不含蛋白質之PBS中，並在室溫下培育20分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞2次，使其再懸浮於200 µL含0.5% PFA之PBS中並在FACS（Canto II, BD）上讀取盤。藉由使用第10版FlowJo軟體分析流式資料（FCS 3.0檔案）。針對所有HuT78目標細胞（活細胞及死細胞）進行閘控以確定總目標細胞群體內死目標的百分比。用於計算ADCC百分比之式係ADCC%=100×[(E+T +Ab)混合物中死目標百分比-(E+T)混合物中死目標百分比]/[100-(E +T)混合物中死目標百分比]。使用GraphPad Prism 7.0軟體繪製ADCC百分比。
7.17.2. 結果 ADCC 報導體活性、 ADCP 報導體活性及 CDC
正如預期，Ab-Ritu展示較強的濃度依賴性活體外ADCC及ADCP活性；然而，Ab-h1.9d-WT及同型對照在三種測試濃度（10、0.1、0.001 µg/mL）下未顯示出此等活性中之任一種（圖20A及圖20B）。對於三種陰性對照分析條件，即單獨目標及效應物、目標加抗體及效應物加抗體，僅偵測到最小信號（資料未示出）。Ab-Ritu在0.15及15 µg/mL（100nM）下亦對RPMI8866細胞展示出較強的活體外CDC活性，而使用兩種人類血清供體，Ab-h1.9d-WT及同型對照在相應濃度下未顯示出CDC信號（圖21）。
ADCC 細胞毒性
在此活體外分析中，Campath（Ab-Alem）針對目標細胞展示出較強的細胞毒性。相比之下，當使用自具有FcγRIIIa V158基因型之兩位不同供體分離的NK效應細胞執行分析時，Ab-h1.9d-WT在10 µg/mL（67 nM）濃度下不誘導任何活體外細胞毒性（圖22）。因此，儘管如以上所示，Ab-h1.9d-WT結合至人類FcγR（實例12），但其在活體外不誘導不合需要的Fc介導之針對未感染α4β7+細胞之ADCC、ADCP及CDC活性。
7.18. 實例 18 ：目標上 Ab-h1.9d-WT 結合位點之同源模型建立 7.18.1. 材料及方法
藉由同源模型建立研究Ab-h1.9d-WT與α4β7之結合模式。已公開重組人類α4β7細胞外域蛋白質與另一抗α4β7抗體維多珠單抗之複合物的晶體結構（Yu等人, 《細胞生物學雜誌（J Cell Biol）》2012）。基於該資料及Ab-h1.9d-WT Fab區之獨特序列，相較於基準抗體維多珠單抗及AMG181，對候選抗體之結合模式建立模型。
7.18.2. 結果
與活體外表徵資料一致，作為融合瘤Ab-m1之人類化變異體及Ab-h1.9d-WT之親本的Ab-h1.9，以及兩種基準mAb主要經由與β7次單元之相互作用，以及與α4次單元之相互作用（儘管微小）結合至α4β7。此模型解釋其不結合至α4β1且與αEβ7之結合極少的原因。值得關注的是，該模型表明Ab-h1.9與兩種基準mAb之間的細微差異，因為Ab-h1.9在α4次單元上結合的殘基略多。該模型中顯而易見的重疊抗原決定基預測Ab-h1.9及維多珠單抗應競爭結合至其目標。實際上，在基於FACS之結合競爭研究中，Ab-m1能夠與Ab-Vedo競爭結合至α4β7+細胞，指示其結合至類似的結合抗原決定基（表13）。
7.19. 論述
來自HIV+及HIV-個體之周邊人類CD4+及CD8+ T細胞亞群上α4β7之表現量係相當的，表明來自HIV+個體之CD4+ T細胞中α4β7之表現量可證實α4β7併入出芽HIV病毒粒子中。
Ab-h1.9d-WT係可結合至測試的所有實驗室生長之HIV病毒株及HIV患者樣本之病毒粒子包膜上之α4β7的強效抗α4β7抗體。由Ab-h1.9d-WT及HIV病毒粒子形成之免疫複合物可經由其Fc域結合至不同FcγR，該步驟可使該等複合物能夠經APC藉由吞噬作用吸收以誘導所提出之「疫苗接種作用」進行HIV控制。
儘管Ab-h1.9d-WT結合HIV病毒粒子，但其不中和HIV感染，此與α4β7並非宿主細胞上之病毒受體的觀點一致。藉由靶向HIV病毒包膜上作為宿主蛋白質之α4β7整合素，相較於靶向在病毒包膜中HIV病毒編碼之gp120/41醣蛋白的其他抗體，諸如HIV廣譜中和抗體，Ab-h1.9d-WT可展現較高的抗性屏障。
Ab-h1.9d-WT可經由Fab依賴性機制破壞α4β7與其配體，諸如MadCAM-1或HIV gp120之間的相互作用，抑制由MadCAM-1及gp120介導之CD4T細胞共刺激，且潛在地抑制此等經刺激細胞中之HIV複製。
Ab-h1.9d-WT可藉由Fab介導之機制，經由其破壞α4β7與HIV gp120之間之相互作用的能力，潛在地抑制細胞間HIV病毒傳播。
當與Ab-h1.9d-WT相比較時，Ab-Vedo在捕捉HIV病毒粒子及破壞α4β7與HIV gp120之間之相互作用方面展示較低活性。另外，歸因於Ab-Vedo Fc域中具有減弱Fc功能的工程改造之突變，故儘管Ab-Vedo能夠結合HIV病毒粒子形成免疫複合物，但此等免疫複合物結合至FcγR的親和力要比由Ab-h1.9d-WT形成之複合物的親和力低得多。
維多珠單抗在HIV研究之兩項臨床研究中展示出適中的功效。此功效可歸於Fab依賴性（例如抗體結合至α4β7，破壞其與其配體諸如MAdCAM-1及HIV gp120之相互作用，由此抑制CD4 T細胞共刺激及此等經刺激細胞中之HIV複製，以及細胞間病毒傳播），但不歸於Fc依賴性作用機制。維多珠單抗與FcγR之結合親和力減小使得其在介導Fc依賴性機制方面存在缺陷。相比之下，具有完整Fc功能性之Ab-h1.9d-WT因能夠經由其Fc依賴性作用機制誘導持續HIV病毒抑制作用，而明顯有別於維多珠單抗。由HIV病毒粒子及抗α4β7抗體（具有完整Fc域）形成之免疫複合物與APC上之FcγR結合係誘導新的且持久的HIV特異性免疫反應（疫苗接種作用）所需的。實際上，Ab-h1.9d-WT可按α4β7依賴性及Fc依賴性方式介導THP-1細胞中塗有α4β7之珠粒或表現α4β7之GFP+VLP（病毒樣顆粒）的吸收。總體而言，Ab-h1.9d-WT藉由若干提出的控制HIV之作用機制，包含Fc依賴性及Fab依賴性作用機制展示活性。因此，預測對於持續降低HIV病毒負荷，Ab-h1.9d-WT係比維多珠單抗強效之藥劑，因為其對α4β7具有較高親和力以及其誘導「疫苗接種作用」之完整Fc功能性。
由全面活體外表徵得到的Ab-h1.9d-WT之關鍵屬性概述於表35中。
| 表 35 Ab-h1.9d-WT 活體外表徵概述 | |
| 結合 EC 50 （ pM ） | |
| HuT78 T細胞 | 26 |
| 人類/食蟹獼猴淋巴球 | 130/62 |
| 人類/食蟹獼猴CD4+記憶T細胞 | 20/10 |
| 人類/食蟹獼猴CD8+記憶T細胞 | 52/36 |
| MAdCAM-1 阻斷效力 IC 50 （ pM ） | |
| HuT78 T細胞 | 50 |
| 人類淋巴球 | 223 |
| 結合特異性 | |
| α4β7 | 是 |
| α4β1 | 否 |
| 非特異性結合 | |
| HEK293 | 否 |
| 人類及食蟹獼猴 FcγR 結合 | |
| 預期的WT IgG1結合 | |
| 人類及食蟹獼猴 FcRn 結合 | |
| 預期在pH 6.0下結合，在pH 7.4下不結合 | |
| 活體外 Fc 介導之效應物活性 | |
| ADCC | 否 |
| ADCC | 否 |
| CDC | 否 |
Ab-h1.9d-WT係結合至α4β7，但不結合至α4β1且最低限度地結合至αEβ7的一種拮抗性抗α4β7人類IgG1/k單株抗體。Ab-h1.9d-WT較強地結合至人類及食蟹獼猴CD4+及CD8+ T亞群，展示出優良的食蟹獼猴結合交叉反應性。然而，Ab-h1.9d-WT不結合至嚙齒動物PBMC。Ab-h1.9d-WT以高效力選擇性阻斷α4β7/MAdCAM-1相互作用，同時不抑制α4β7/VCAM-1相互作用。Ab-h1.9d-WT能夠阻斷MAdCAM-1介導的人類初代CD4+ T細胞之共刺激。正如關於人類IgG1所預期的，Ab-h1.9d-WT結合至人類FcγR（活體內Fc介導之「疫苗接種作用」的必要前提條件），但不觸發在活體外針對未感染之α4β7+細胞的ADCC、ADCP及CDC活性。Ab-h1.9d-WT缺乏活體外Fc效應物活性可部分地藉由因抗體誘導之目標內化引起細胞表面α4β7表現減少來解釋。另外，Ab-h1.9d-WT可按α4β7依賴性及Fc依賴性方式介導THP-1細胞中塗有α4β7之珠粒或表現α4β7之GFP+VLP（病毒樣顆粒）的吸收。Ab-h1.9d-WT展現臨床候選性必需的預期活體外藥理學特性。
如本揭示案中所提供，Ab-h1.9d-WT係有別於維多珠單抗且相較於維多珠單抗有所改善的一種強效α4β7選擇性拮抗劑。相較於Ab-Vedo，Ab-h1.9d-WT之關鍵屬性顯示於表36-40中且概述於表41中。
人類PBMC = 3位供體
食蟹獼猴PBMC = 5位供體
CD4+初始= CD4+CD45RA+CCR7+細胞，CD4+記憶 = CD4+CD45RA-細胞
CD8+初始 = CD8+CD45RA+CCR7+細胞，CD8+記憶 = CD8+CD45RA-細胞
| 表 36 Ab-h1.9d-WT 對人類及食蟹獼猴血液源性 CD4+ 及 CD8+ T 亞群之結合 EC 50 與 Ab-Vedo 的比較 | |||||||
| CD4+ 結合 EC50 pM* | CD8+ 結合 EC50 pM* | ||||||
| CD4+總 | CD4+初始 | CD4+記憶 | CD8+總 | CD8+初始 | CD8+記憶 | ||
| Ab-h1.9d-WT | 人類 | 63 ± 38 | 84 ± 32 | 20 ± 12 | 165 ± 121 | 144 ± 120 | 52 ± 51 |
| 食蟹獼猴 | 30 ± 16 | 45 ± 27 | 10 ± 12 | 35 ± 25 | 42 ± 26 | 36 ± 30 | |
| Ab-Vedo | 人類 | 381 ± 61 | 381 ± 101 | 270 ± 209 | 658 ± 438 | 727 ± 725 | 258 ± 203 |
| 食蟹獼猴 | 202 ± 149 | 228 ± 229 | 148 ± 229 | 199 ± 101 | 256 ± 189 | 204 ± 125 |
| 表 37 Ab-h1.9d-WT 對人類血液源性 CD4+ 及 CD8+ T 亞群之結合 EC 50 與 Ab-Vedo 的比較 | |||||||
| CD4+結合EC50 pM* | CD8+結合EC50 pM* | ||||||
| CD4+總 | CD4+初始 | CD4+記憶 | CD8+總 | CD8+初始 | CD8+記憶 | ||
| Ab-h1.9d-WT | 人類 | 63 ± 38 | 84 ± 32 | 20 ± 12 | 165 ± 121 | 144 ± 120 | 52 ± 51 |
| Ab-Vedo | 人類 | 381 ± 61 | 381 ± 101 | 270 ± 209 | 658 ± 438 | 727 ± 725 | 258 ± 203 |
| 表 38 Ab-h1.9d-WT 對食蟹獼猴血液源性 CD4+ 及 CD8+ T 亞群之結合 EC 50 與 Ab-Vedo 的比較 | |||||||
| CD4+結合EC50 pM* | CD8+結合EC50 pM* | ||||||
| CD4+總 | CD4+初始 | CD4+記憶 | CD8+總 | CD8+初始 | CD8+記憶 | ||
| Ab-h1.9d-WT | 食蟹獼猴 | 30 ± 16 | 45 ± 27 | 10 ± 12 | 35 ± 25 | 42 ± 26 | 36 ± 30 |
| Ab-Vedo | 食蟹獼猴 | 202 ± 149 | 228 ± 229 | 148 ± 229 | 199 ± 101 | 256 ± 189 | 204 ± 125 |
表39-經由BIAcore測定的Ab-h1.9d-WT對人類FcγR之結合親和力與Ab-Vedo的比較.
N=1
| 表 39 經由 BIAcore 測定的 Ab-h1.9d-WT 對人類 FcγR 之結合親和力與 Ab-Vedo 的比較 | ||||||
| FcγRI | FcγRIIb | FcγRIIa 131R | FcγRIIa 131H | FcγRIIIa158F | FcγRIIIa158V | |
| Ab-h1.9d-WT | 7.0E-09 | 1.2E-05 | 5.2E-06 | 4.0E-06 | 3.1E-06 | 1.0E-07 |
| Ab-Vedo | 無顯著結合 |
表40-經由BIAcore測定的Ab-h1.9d-WT對食蟹獼猴FcγR之結合親和力與Ab-Vedo的比較.
N=1
| 表 40 經由 BIAcore 測定的 Ab-h1.9d-WT 對食蟹獼猴 FcγR 之結合親和力與 Ab-Vedo 的比較 | ||||
| 食蟹獼猴FcyRI | 食蟹獼猴FcyRIIa | 食蟹獼猴FcyRIIb | 食蟹獼猴FcyRIII | |
| Ab-h1.9d-WT | 1.4E-09 | 8.2E-06 | 7.1E-06 | 1.6E-07 |
| Ab-Vedo | 結合，但因結合太弱而無法量測 |
表41-Ab-h1.9d-WT與Ab-Vedo之關鍵屬性比較.
1EC50及IC50值係基於≥3個獨立實驗
2結合EC50值係基於自≥3位供體分離之PBMC
| 表 41 Ab-h1.9d-WT 與 Ab-Vedo 之關鍵屬性比較 | ||
| Ab-h1.9d-WT | Ab-Vedo | |
| CDR序列 | 獨特 | |
| 1對HuT78細胞之結合EC50（流式細胞分析技術） | 199 pM | 911 pM |
| 2對人類淋巴球之結合EC50 | 130 ± 85 pM | 502 ± 212 pM |
| 2對人類CD4+ Tm細胞之結合EC50 | 20 ± 12 pM | 270 ± 209 pM |
| 2對食蟹獼猴CD4+ Tm細胞之結合EC50 | 10 ± 12 pM | 148 ± 229 pM |
| 1對HuT 78細胞之效力IC50（基於FACS之MAdCAM-1結合阻斷） | 50 ± 11 pM | 193 ± 46 pM |
| 2對人類淋巴球之效力IC50（針對MAdCAM-1的基於盤之細胞黏附阻斷） | 223 ± 86 pM | 630 ± 193 pM |
| 結合特異性 | 與α4β7結合 不與α4β1結合 | 與α4β7結合 不與α4β1結合 |
| 人類及食蟹獼猴FcγR結合 | 如關於人類IgG1所預期的一般結合 | 無顯著結合 |
| 活體外Fc介導之ADCC、ADCP及CDC活性 | 無活性 | 無活性 |
| 人類及食蟹獼猴FcRn結合 | 在pH 6下結合 | 在pH 6下結合 |
Ab-h1.9d-WT之主要參數，諸如其對α4β7之較佳結合親和力及其結合人類FcγR但不觸發Fc介導之效應功能的能力，係與維多珠單抗之關鍵區分因素，且預期此等特徵驅動相對於維多珠單抗改善之功效。Ab-h1.9d-WT亦具有抗α4β7臨床候選物所需的活體外藥理學屬性。
8.示例性實施例
雖然已說明且描述各種具體實施例，但應瞭解，可在不偏離本發明之精神及範圍的情況下作出各種改變。
1. 一種抗人類α4β7抗體，其包括(i)包括三個CDR之VH鏈；及(ii)包括三個CDR之VL鏈，其中：
VH CDR#1係GFNIKNTYMH (SEQ ID NO:72)；
VH CDR#2係RIDPAKGHTEYAPKFLG (SEQ ID NO:73)；
VH CDR#3係VDV (SEQ ID NO:74)；
VL CDR#1係HASQDISDNIG (SEQ ID NO:75)；
VL CDR#2係HGTNLED (SEQ ID NO:76)；且
VL CDR#3係VQYAQFPWT (SEQ ID NO:77)。
2. 如實施例1之抗人類α4β7抗體，其包括
VH鏈係：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKNTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKGHTEYAPKFLGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCYYVDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:70)；且
VL係：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQDISDNIGWLQQKPGKSFKLLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:71)。
3. 如實施例1或2之抗人類α4β7抗體，其經人類化。
4. 如實施例1至3中任一個之抗人類α4β7抗體，其係IgG。
5. 如實施例1至4中任一個之抗人類α4β7抗體，其包括κ輕鏈恆定區。
6. 如實施例1至5中任一個之抗人類α4β7抗體，其係IgG
1。
7. 如實施例1至6中任一個之抗人類α4β7抗體，其包括具有胺基酸取代D356E及L358M之變異CH3域。
8. 如實施例1至7中任一個之抗人類α4β7抗體，其包括具有SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:93之胺基酸序列的重鏈，及具有SEQ ID NO:100之胺基酸序列的輕鏈。
9. 如實施例1至8中任一個之抗人類α4β7抗體，其包括具有胺基酸取代L234A及/或L235A之變異CH2域。
10. 如實施例1至9中任一個之抗人類α4β7抗體，其包括具有胺基酸取代T250Q之變異CH2域及/或具有胺基酸取代M428L之變異CH3域。
11. 一種聚核苷酸，其包括編碼抗人類α4β7抗體之核苷酸序列，其中該抗體包括(i)包括三個CDR之VH鏈；及(ii)包括三個CDR之VL鏈，其中：
VH CDR#1係GFNIKNTYMH (SEQ ID NO:72)；
VH CDR#2係RIDPAKGHTEYAPKFLG (SEQ ID NO:73)；
VH CDR#3係VDV (SEQ ID NO:74)；
VL CDR#1係HASQDISDNIG (SEQ ID NO:75)；
VL CDR#2係HGTNLED (SEQ ID NO:76)；且
VL CDR#3係VQYAQFPWT (SEQ ID NO:77)。
12. 一種表現載體，其包括如實施例11之聚核苷酸。
13. 一種用如實施例12之載體轉染的真核宿主細胞。
14. 一種經工程改造成表現如實施例11之聚核苷酸的真核宿主細胞。
15. 如實施例13或14之真核宿主細胞，其係哺乳動物宿主細胞。
16. 一種產生抗人類α4β7抗體之方法，其包括：(a)培養如實施例15之真核宿主細胞及(b)回收該抗人類α4β7抗體。
17. 一種用如實施例12之載體轉型的原核宿主細胞。
18. 一種經工程改造成表現如實施例17之聚核苷酸的原核宿主細胞。
19. 如實施例18之原核宿主細胞，其係細菌宿主細胞。
20. 一種產生抗人類α4β7抗體之方法，其包括：(a)培養如實施例19之原核宿主細胞及(b)回收該抗人類α4β7抗體。
21. 一種在感染HIV之受試者中誘導對HIV感染之病毒抑制的方法，其包括向該受試者投與一定量的如實施例1至10中任一個之抗人類α4β7抗體。
22. 如實施例21之方法，其中該病毒抑制係免疫介導的。
23. 一種治療感染HIV之受試者之HIV感染的方法，其包括向該受試者投與一定量的如實施例1至10中任一個之抗人類α4β7抗體。
24. 一種抗人類α4β7抗體，其抑制HIV。
25. 如實施例24之抗人類α4β7抗體，其抑制HIV複製及/或HIV感染。
26. 如實施例24之抗人類α4β7抗體，其使表現人類α4β7之細胞上之人類α4β7失活及/或減少其活化。
27. 如實施例24之抗人類α4β7抗體，其誘導表現人類α4β7之細胞上人類α4β7之內化。
28. 如實施例24之抗人類α4β7抗體，其抑制CD4 T細胞共刺激。
29. 如實施例28之抗人類α4β7抗體，其中CD4 T細胞共刺激係由MAdCAM-1或HIV gp120介導。
30. 如實施例25之抗人類α4β7抗體，其抑制CD4 T細胞中之HIV複製。
31. 如實施例30之抗人類α4β7抗體，其中該等CD4 T細胞係MAdCAM-1刺激之CD4 T細胞或HIV gp120刺激之CD4 T細胞。
32. 如實施例24之抗人類α4β7抗體，其破壞α4β7與至少一個其配體之相互作用。
33. 如實施例32之抗人類α4β7抗體，其中該α4β7配體係MAdCAM-1。
34. 如實施例32之抗人類α4β7抗體，其中該α4β7配體係HIV gp120。
35. 如實施例34之抗人類α4β7抗體，其抑制gp120介導之細胞間HIV傳播。
36. 如實施例24之抗人類α4β7抗體，其結合至HIV病毒粒子。
37. 如實施例36之抗人類α4β7抗體，其中該抗體結合至該HIV病毒粒子形成免疫複合物。
38. 如實施例37之抗人類α4β7抗體，其中該免疫複合物結合至細胞上之FcγR。
39. 如實施例37之抗人類α4β7抗體，其中該免疫複合物結合至抗原呈現細胞（APC）上之FcγR。
40. 如實施例39之抗人類α4β7抗體，其中該免疫複合物由該APC藉由吞噬作用吸收。
41. 如實施例40之抗人類α4β7抗體，其誘導HIV特異性免疫反應。
42. 如實施例40或41之抗人類α4β7抗體，其誘導針對HIV之疫苗接種作用。
43. 如實施例41之抗人類α4β7抗體，其中該HIV特異性免疫反應引起對感染HIV之個體中HIV之病毒控制。
44. 如實施例43之抗人類α4β7抗體，其中該病毒控制使病毒負荷減少。
45. 如實施例43之抗人類α4β7抗體，其中該病毒控制使病毒設定點降低。
46. 如實施例43之抗人類α4β7抗體，其中該病毒控制引起抗逆轉錄病毒治療中斷（ATI）之後病毒反彈之延遲。
47. 如實施例24至46中任一個之抗人類α4β7抗體，其具有一組六個互補決定區（CDR）或選自以下之抗體的可變重鏈區及可變輕鏈區：Ab-m1、Ab-c1、Ab-h1.1、Ab-h1.2、Ab-h1.3、Ab-h1.4、Ab-h1.5、Ab-h1.6、Ab-h1.7、Ab-h1.8、Ab-h1.9、Ab-h1.9a、Ab-h1.9b、Ab-h1.9c、Ab-h1.9d或Ab-h1.9e。
48. 如實施例1至10中任一個之抗人類α4β7抗體，其抑制HIV。
49. 如實施例48之抗人類α4β7抗體，其抑制HIV複製及/或HIV感染。
50. 如實施例48之抗人類α4β7抗體，其使表現人類α4β7之細胞上之人類α4β7失活及/或減少其活化。
51. 如實施例48之抗人類α4β7抗體，其誘導表現人類α4β7之細胞上人類α4β7之內化。
52. 如實施例48之抗人類α4β7抗體，其抑制CD4 T細胞共刺激。
53. 如實施例52之抗人類α4β7抗體，其中CD4 T細胞共刺激係由MAdCAM-1或HIV gp120介導。
54. 如實施例49之抗人類α4β7抗體，其抑制CD4 T細胞中之HIV複製。
55. 如實施例54之抗人類α4β7抗體，其中該等CD4 T細胞係MAdCAM-1刺激之CD4 T細胞或HIV gp120刺激之CD4 T細胞。
56. 如實施例48之抗人類α4β7抗體，其破壞α4β7與至少一個其配體之相互作用。
57. 如實施例56之抗人類α4β7抗體，其中該α4β7配體係MAdCAM-1。
58. 如實施例56之抗人類α4β7抗體，其中該α4β7配體係HIV gp120。
59. 如實施例58之抗人類α4β7抗體，其抑制gp120介導之細胞間HIV傳播。
60. 如實施例48之抗人類α4β7抗體，其結合至HIV病毒粒子。
61. 如實施例60之抗人類α4β7抗體，其中該抗體結合至該HIV病毒粒子形成免疫複合物。
62. 如實施例61之抗人類α4β7抗體，其中該免疫複合物結合至細胞上之FcγR。
63. 如實施例61之抗人類α4β7抗體，其中該免疫複合物結合至抗原呈現細胞（APC）上之FcγR。
64. 如實施例63之抗人類α4β7抗體，其中該免疫複合物由該APC藉由吞噬作用吸收。
65. 如實施例64之抗人類α4β7抗體，其誘導HIV特異性免疫反應。
66. 如實施例64或65之抗人類α4β7抗體，其誘導針對HIV之疫苗接種作用。
67. 如實施例64或65之抗人類α4β7抗體，其中該HIV特異性免疫反應引起對感染HIV之個體中HIV之病毒控制。
68. 如實施例67之抗人類α4β7抗體，其中該病毒控制使病毒負荷減少。
69. 如實施例67之抗人類α4β7抗體，其中該病毒控制使病毒設定點降低。
70. 如實施例67之抗人類α4β7抗體，其中該病毒控制引起抗逆轉錄病毒治療中斷（ATI）之後病毒反彈之延遲。
71. 一種醫藥組合物，其包括如前述實施例中任一個之抗體。
無
圖1顯示鼠類抗體Ab-m1對HuT78細胞黏附至MAdCAM-1之阻斷作用。
圖2顯示使用CHOK1-cα4β7（cyno α4β7）細胞黏附分析針對MAdCAM-1測定的功能性食蟹獼猴Ab-m1之交叉反應性。
圖3顯示Ab-m1阻斷人類MAdCAM-1與初代人類CD4+記憶T細胞之結合。
圖4顯示鼠類-人類嵌合體Ab-c1與人類初代CD4+記憶T細胞（hα4β7+CD4+CD45RO+）之結合。
圖5顯示藉由流式細胞分析技術測定的傾向工程改造之人類化抗α4β7 Ab-h1.9 scFv純系針對展示於酵母上之人類α4β7抗原的結合。純系Ab-h1.9(a-e)具有與親本Ab‑h1.9類似的結合。
圖6A至圖6F顯示針對來自45位HIV+個體及10位健康（HIV-）供體之樣本的α4β7表現分析。將HIV+個體及HIV-個體中之CD4+及CD8+ T細胞上α4β7之表現（以百分比或以藉由MESF量測之量）相比較。圖中僅顯示出藉由Mann-Whitney雙尾檢定確定明顯不同的比較。T細胞群縮寫為：N+ =初始（CD28+CD45RO-），CM=中樞記憶型（CD28+CD45RO+CCR7+），TM=短期記憶型（CD28+CD45RO+CCR7-），EM=效應記憶型（CD28-CD45RO+），TE=終末效應型（CD28-CD45RO-）；MESF=等量可溶性螢光染料分子（Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome）。
圖7A至圖7G-2顯示用Ab-h1.9d-WT捕捉之HIV病毒粒子。所有測試均藉由病毒粒子捕捉分析以珠粒型式進行。Ab-h1.9d-WT係在5 nM及15 nM下用六個實驗室生長之HIV病毒株（圖7A至圖7F）測試，而陰性對照抗體僅在15 nM下測試。捕捉之樣本中HIV p24 gag之量係在10 µL分析體積中，以pg/mL顯示。Ab-h1.9d-WT亦用來自兩位感染HIV之個體的樣本，用塗佈有10 µg抗體之珠粒進行測試（圖7G-1及圖7G-2）。藉由微滴式數位PCR偵測的輸入樣本中（圖7G-1）及捕捉之樣本中（圖7G-2）HIV gag RNA之量以拷貝數/毫升顯示。
圖8A至圖8E顯示結合至FcγR之免疫複合物（HIV病毒粒子與不同抗體之複合物）。首先，藉由將抗體（Ab-h1.9d-WT、具有明顯減少FcγR結合之LALA突變的Ab-h1.9d、Ab-Vedo及同型陰性對照）與HIV NL4-3一起培育來形成免疫複合物，且接著將其捕捉於固定在盤上之FcγR上。FcγRI及FcγRIIIa（V158）被捕捉於鎳盤上，而FcγRIIa（H131）、FcγRIIa（R131）及FcγRIIIa（F158）被捕捉於中性抗生物素蛋白盤上以增加偵測之靈敏度。所偵測之HIV p24 gag之量係在10 µL分析體積中，以pg/mL顯示。顯示出代表性實驗之結果。
圖9A至圖9C顯示THP-1細胞中Ab-h1.9d-WT介導的塗有α4β7之珠粒之吸收的α4β7依賴性及Fc依賴性。標繪出用免疫複合物（含有塗有α4β7之珠粒及指定抗α4β7或對照抗體）處理3小時之THP-1細胞中該等複合物之吞噬作用分數。圖9A顯示由一個代表性實驗得到的資料。圖9B顯示由3個獨立實驗得到的正規化資料。使用單因素ANOVA結合Tukey多重比較檢定來測定顯著性。****
p＜0.0001，***
p=0.0001-0.001，**
p=0.001-0.01，*
p=0.01-0.05，ns≥0.05。圖9C顯示藉由成像細胞分析技術獲取的具有3種內化的塗有α4β7之珠粒的Ab-h1.9d-WT免疫複合物處理之細胞的代表性圖像。
圖10顯示抗α4β7抗體與α4β7+GFP+VLP（病毒樣顆粒）之結合。使用ELISA測定Ab與VLP之結合。Ab-h1.9d-WT、Ab-h1.9d-LALA及Ab-Vedo以類似EC50值結合至塗鋪的經塗佈之a4b7+GFP+VLP。顯示出由兩個獨立實驗得到的代表性資料。
圖11A至11B顯示Ab-h1.9d-WT介導的THP-1細胞對α4β7+GFP+VLP（病毒樣顆粒）之吸收的α4β7依賴性及Fc依賴性。圖11A顯示THP-1細胞對α4β7+GFP+VLP之吸收，以藉由流式細胞分析技術量測的GFP+細胞之百分比表示。圖11B顯示紅海海綿素A（Latrunculin A，Lat A）對α4β7+GFP+VLP吸收之抑制作用。對於圖11B，將THP-1細胞用Lat A預處理2小時，且接著，與VLP及如圖11A中之抗體一起培育。圖10A至圖10B中呈現之平均值±s.d.分別自4個及3個獨立實驗搜集。藉由雙尾史都登氏t檢定（two-tailed student's t-test）計算顯著性（****
p=5.4×10
-5），其中認為
p＜0.05係顯著的。
圖12A至圖12B顯示不同抗體對HIV gp120與α4β7之相互作用的抑制作用。圖12A顯示RPMI 8866細胞與HIV gp120-V2 WT肽結合，但不與對照肽結合。RPMI 8866細胞在細胞表面上組成性表現α4β7。除報導的介導α4β7與gp120之間之結合的四個胺基酸在HIV gp120 V2對照肽中突變外，HIV gp120 V2 WT肽與該對照肽的序列係一致的。圖12B顯示不同抗體對HIV gp120肽與表現α4β7之RPMI 8866細胞之結合的抑制作用。Ab-h1.9d-WT在抑制HIV gp120-V2 WT肽與表現α4β7之RPMI 8866細胞之結合方面要比Ab-Vedo強效。
圖13顯示Ab-h1.9d-WT所結合之人類及食蟹獼猴CD4+及CD8+ T亞群的百分比。藉由流式細胞分析技術分析評估Ab-h1.9d-WT與人類及食蟹獼猴CD4+及CD8+ T細胞之結合。測定Ab-h1.9d-WT所結合的α4β7+T細胞亞群之百分比。資料係自3個人類及5個食蟹獼猴供體獲得。
圖14A至圖14F顯示Ab-h1.9d-WT與各種整合素之結合特異性。評估Ab-h1.9d-WT對表現人類整合素（14A、14C及14E）或食蟹獼猴整合素（14B、14D及14F）之重組細胞之結合特異性。比較與目標整合素α4β7之結合（圖14A/圖14B）以及與α4β1（圖14C/圖14D）及αEβ7（圖14E/圖14F）整合素之結合。Ab-Nata及依曲利組單抗（etrolizumab）源性Ab-Etro分別用作α4及β7整合素特異性陽性對照，且Ab-Ctet用作同型對照。FACS結合結果係以滴定之mAb的MFI表示。N = 1。
圖15顯示HEK293細胞中Ab-h1.9d-WT之非特異性結合評價。藉由流式細胞分析技術分析評估Ab-h1.9d-WT與HEK293細胞之非特異性結合。陽性對照顯示較高結合，而在100 µg/mL測試濃度下觀察到Ab-h1.9d-WT及同型對照Ab-cTet之結合可忽略。呈現結合至測試mAb之HEK293細胞的百分比(A)及測試mAb之結合強度的MFI (B)。N = 2。
圖16A至圖16B顯示α4β7與Ab-h1.9d-WT或Ab-Vedo之複合物在人類初代細胞上之內化情況。圖16A顯示Ab-h1.9d-WT在來自周邊血液人類供體之CD4+ T及CD8+ T初始細胞（naïve cell）上之內化情況。由兩位供體得到之點狀圖指示在4℃或37℃下用Ab-h1.9d-WT處理時，在處理後18小時α4β7細胞之百分比。用Alexa-647標記之抗β7 Ab-Etro偵測細胞表面上之剩餘α4β7。圖16B顯示用Ab-h1.9d-WT處理之T細胞亞群中α4β7內化之定量（表面α4β7表現減少與在4℃下處理後觀察到的表現相關）。（N =兩位供體）。初始細胞定義為CD45RA+。
圖17A至圖17B顯示Ab-h1.9d-WT阻斷人類初代CD4+ T細胞上之MAdCAM-1共刺激信號。對於圖17A，藉由流式細胞分析技術分析，以Ki67+CD25+細胞之百分比（X軸上為Ki67+，Y軸上為CD25+）量測在同型對照Ab及Ab-h1.9d-WT存在下抗CD3及MAdCAM-1對人類初代CD4+ T細胞之活化。資料係來自代表性供體。對於圖17B，以Ki67+CD25+細胞之百分比（在Y軸上）量測在同型對照Ab、Ab-h1.9d-WT及Ab-Vedo存在下抗CD3及MAdCAM-1對人類初代CD4+ T細胞之活化。資料係來自6位個別健康供體。統計分析係使用雙尾參數成對t檢定執行：**P＜0.01，****P＜0.0001）。
圖18顯示Ab-h1.9d-WT不阻斷VCAM-1介導之細胞黏附。使用HuT78細胞黏附分析測定Ab-h1.9d-WT針對VCAM-1之細胞黏附阻斷作用。Ab-Nata，一種抗α4 mAb，充當陽性對照，且Ab-cTet用作陰性對照。顯示出代表性資料，其中發光（RLU）之減少指示細胞結合因配體阻斷而減少。N = 3。
圖19A至圖19B顯示經由流式細胞分析技術測定的Ab-h1.9d-WT及Ab-Vedo與表現人類FcγR之細胞之結合的比較。藉由使用工程改造的表現各種細胞表面人類FcγR之CHO-K1細胞分析Ab-h1.9d-WT（圖19A）及Ab-Vedo（圖19B）與人類FcγR之結合且以螢光之幾何平均值表示。N = 1。
圖20A至圖20B顯示基於報導體的Ab-h1.9d-WT之ADCC及ADCP活性。藉由報導體分析評估Ab-h1.9d-WT誘導Fc介導之活體外ADCC及ADCP活性的能力（圖20A）ADCC活性，使用工程改造之Jurkat人類FcγR IIIaV158+效應物報導體細胞及RPMI8866目標細胞；N=2。（圖20B）ADCP活性，使用工程改造之Jurkat人類FcγRIIa H131+效應物報導體細胞及RPMI8866目標細胞；N=2。Ab-Ritu在該等分析中用作陽性對照。結果係由發光（RLU）表示；高信號指示ADCC及ADCP活性。
圖21顯示Ab-h1.9d-WT之CDC活性。使用RPMI8866目標細胞及作為補體因子源之人類血清評估Ab-h1.9d-WT誘導Fc介導之活體外CDC活性的能力；N=2份測試之供體血清。Ab-Ritu用作陽性對照。結果以細胞殺滅百分比表示；較高的細胞殺滅指示CDC活性。
圖22顯示基於細胞毒性的Ab-h1.9d-WT之ADCC活性。在基於FACS之細胞毒性分析中，使用HuT78細胞作為目標細胞且來自兩位供體之人類初代NK細胞作為效應細胞來評估Ab-h1.9d-WT誘導Fc介導之活體外ADCC的能力。對於兩位供體，目標細胞殺滅（細胞毒性）係以ADCC百分比表示。
Claims (17)
- 一種抗人類α4β7抗體，其包括(i)包括三個CDR之VH鏈；及(ii)包括三個CDR之VL鏈，其中： VH CDR#1係GFNIKNTYMH (SEQ ID NO:72)； VH CDR#2係RIDPAKGHTEYAPKFLG (SEQ ID NO:73)； VH CDR#3係VDV (SEQ ID NO:74)； VL CDR#1係HASQDISDNIG (SEQ ID NO:75)； VL CDR#2係HGTNLED (SEQ ID NO:76)；且 VL CDR#3係VQYAQFPWT (SEQ ID NO:77)。
- 如請求項1之抗人類α4β7抗體，其包括 VH鏈係： EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKNTYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPAKGHTEYAPKFLGRVTITADESTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCYYVDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:70)；且 VL鏈係： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQDISDNIGWLQQKPGKSFKLLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCVQYAQFPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:71)。
- 如請求項2之抗人類α4β7抗體，其係IgG。
- 如請求項3之抗人類α4β7抗體，其包括κ輕鏈恆定區。
- 如請求項4之抗人類α4β7抗體，其係IgG 1。
- 如請求項5之抗人類α4β7抗體，其包括具有胺基酸取代D356E及L358M之變異CH3域。
- 如請求項1之抗人類α4β7抗體，其包括具有SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:93之胺基酸序列的重鏈及具有SEQ ID NO:100之胺基酸序列的輕鏈。
- 如請求項1之抗人類α4β7抗體，其係IgG1抗體，該抗體包括各自由SEQ ID NO:92之胺基酸序列組成的重鏈及各自由SEQ ID NO:100之胺基酸序列組成的輕鏈。
- 如請求項1之抗人類α4β7抗體，其係IgG1抗體，該抗體包括各自由SEQ ID NO:93之胺基酸序列組成的重鏈及各自由SEQ ID NO:100之胺基酸序列組成的輕鏈。
- 一種聚核苷酸，其包括編碼抗人類α4β7抗體之核苷酸序列，其中該抗體包括(i)包括三個CDR之VH鏈；及(ii)包括三個CDR之VL鏈，其中： VH CDR#1係GFNIKNTYMH (SEQ ID NO:72)； VH CDR#2係RIDPAKGHTEYAPKFLG (SEQ ID NO:73)； VH CDR#3係VDV (SEQ ID NO:74)； VL CDR#1係HASQDISDNIG (SEQ ID NO:75)； VL CDR#2係HGTNLED (SEQ ID NO:76)；且 VL CDR#3係VQYAQFPWT (SEQ ID NO:77)。
- 一種表現載體，其包括如請求項10之聚核苷酸。
- 一種用如請求項11之載體轉染的真核宿主細胞。
- 如請求項12之真核宿主細胞，其係哺乳動物宿主細胞。
- 一種產生抗人類α4β7抗體之方法，其包括：(a)培養如請求項13之真核宿主細胞及(b)回收該抗人類α4β7抗體。
- 一種如請求項1至9中任一項之抗人類α4β7抗體之用途，其係用以製備用於在感染HIV之個體中誘導對HIV感染之病毒抑制的藥物。
- 一種如請求項1至9中任一項之抗人類α4β7抗體之用途，其係用以製備用於治療感染HIV之個體之HIV感染的藥物。
- 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至9中任一項之抗體。
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