TWI880351B - 純化乙醯肝素-n-硫酸酯酶的新方法 - Google Patents

Abstract

本發明關於一種從包括至少一種雜質的包含乙醯肝素-N-硫酸酯酶的溶液中純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的方法，該方法包括進行多模式層析(MMC)以獲得洗脫液；並且進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液。根據本發明的方法能夠非常有效地去除HCP(宿主細胞蛋白質)，並極大地提高純化的乙醯肝素-N-硫酸酯酶的純度和穩定性。

Description

純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的新方法

本發明涉及一種純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶(heparan-N-sulfatase，HNS)的新方法，該方法能夠極大地降低雜質的含量並極大地提高乙醯肝素-N-硫酸酯酶的穩定性，一種由該方法製備的包括乙醯肝素-N-硫酸酯酶的藥物組合物，以及一種使用其治療聖菲利波(Sanfilippo)症候群的方法。

黏多糖儲積症(MPS)是罕見的遺傳性溶酶體儲積病，其由某些溶酶體酶的缺乏或缺少所引起。

正常表達溶酶體酶的正常人透過由溶酶體酶的代謝過程將多糖分子轉化為體內可用的物質。然而，缺乏或缺少溶酶體酶的患者由於細胞、組織和稱為溶酶體的細胞器中多糖分子的積累而患有各種類型的疾病。

聖菲利波症候群，其以1963年首次發現該病的美國醫生「聖菲利波(Sanfilippo)」命名，是一種黏多糖儲積症。聖菲利波症候群是一種常染色體隱性遺傳病，稱為MPS III，且其特徵為臨床上無角膜混濁，以及有輕微的身體變化諸如肝脾腫大或骨骼系統變化，但有非常嚴重且進行性的中樞神經系統症狀。

聖菲利波症候群是由降解多糖，特別是糖胺聚糖(GAG)所需的四種不同酶的缺陷引起的，並根據缺陷酶分為MPS IIIA(聖菲利波 A)、MPS IIIB(聖菲利波 B)、MPS IIIC(聖菲利波 C)和MPS IIID(聖菲利波 D)。每種聖菲利波症候群的缺陷酶和遺傳圖譜位點如下。

A型(MPS IIIA)：乙醯肝素N-硫酸酯酶-17號染色體(17q25.3)

B型(MPS IIIB)：n-乙醯-α-D-胺基葡萄糖苷酶-17號染色體(17q21)

C型(MPS IIIC)：乙醯輔酶A:α-胺基葡萄糖苷-N-乙醯轉移酶-14號染色體

D型(MPS IIID)：n-乙醯-α-D-胺基葡萄糖苷-6-硫酸酯酶-12號染色體(12q14)

從上面可以看出，MPS IIIA是由於缺乏乙醯肝素-N-硫酸酯酶引起的，乙醯肝素-N-硫酸酯酶是一種參與硫酸乙醯肝素降解的酶，並且水解與胺基葡萄糖殘基的胺基相連的硫酸部分。MPS IIIA(聖菲利波A)的症狀通常出現在2至6歲之間，但可能在13歲後被診斷出來。通常，眾所周知，患有MPS IIIA的患者具有明顯的發育遲緩以及長期生存的困難。

目前，對於MPS IIIA還沒有經批准的療法，只是在進行用於緩解症狀的對症療法。酶替代療法(ERT)，即一種向MPS IIIA患者外部給藥所製備的乙醯肝素-N-硫酸酯酶的療法，其預期對治療MPS IIIA非常有用。

為了使用乙醯肝素-N-硫酸酯酶透過酶替代療法治療MPS IIIA患者，乙醯肝素-N-硫酸酯酶的大量生產是必需的，而大量生產需要培養和分離/純化重組細胞的工藝。

已經開發了分離和純化工藝，包括固定化的金屬親和層析(immobilized metal affinity chromatography，IMAC)(亦稱為金屬螯合親和層析(metal chelate affinity chromatography，MCAC))、陽離子交換層析(cation exchange chromatography，CEX)和陰離子交換層析(anion exchange chromatography，AEX)，用於重組產生的乙醯肝素-N-硫酸酯酶的分離和純化(參見韓國專利號2,286,260)。

此外，還開發了包括陰離子交換層析(anion exchange chromatography，AEX)、疏水作用層析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)、羥基磷灰石層析(hydroxyapatite chromatography，HA)和陽離子交換層析(CEX)在內的分離和純化工藝(參見美國專利公開號2012/0329133)。

然而，傳統工藝仍然存在純化過程期間乙醯肝素-N-硫酸酯酶穩定性低的問題，並且由於在使用重組細胞生產乙醯肝素-N-硫酸酯酶期間沒有充分除去HCP(宿主細胞蛋白質)和其它雜質，最終產生的乙醯肝素-N-硫酸酯酶的品質和安全性變差。故仍然迫切需要能夠解決這些問題的新的乙醯肝素-N-硫酸酯酶分離/純化工藝。

為了解決分離和純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的傳統方法的問題，本發明的一個目的是提供一種用於純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的新的方法和工藝，該方法和工藝能夠在分離和純化過程期間將乙醯肝素-N-硫酸酯酶的穩定性變差最小化並極大地去除HCP和其它雜質；一種包括由該方法製備的乙醯肝素-N-硫酸酯酶的藥物組合物；以及一種使用其治療聖菲利波症候群的方法。

為了實現上述目的，本發明提供了一種從包括至少一種雜質的含乙醯肝素-N-硫酸酯酶的溶液中純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的方法，該方法包括進行多模式層析(multi-mode chromatography，MMC)以獲得洗脫液；並且進行辛酸鹽沉澱，從而得到上清液。

乙醯肝素-N-硫酸酯酶是本領域已知的溶酶體酶，稱為N-磺基葡糖胺磺基水解酶(N-sulphoglucosamine sulphohydrolase)(SGSH；EC 3.10.1.1)；N-磺基葡糖胺磺基水解酶(N-sulfoglucosamine sulfohydrolase)；2-去氧-D-葡糖苷-2-胺基磺酸鹽磺基水解酶(胺基磺酸鹽磺基水解酶)(2-desoxy-D-glucoside-2-sulfamate sulphohydrolase(sulphamate sulphohydrolase))；肝素磺醯胺酶(heparin sulfamidase)；硫葡糖胺硫醯胺酶(sulfoglucosamine sulfamidase)；磺醯胺酶(sulfamidase)；以及HNS、rhHNS、磺醯胺酶、rhNS和rhSGSH，並且特別優選來源於人類。

在本發明中，人乙醯肝素-N-硫酸酯酶具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，或其中在SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的N-末端和/或C-末端缺失一個或多個胺基酸殘基的胺基酸序列，同時具有乙醯肝素-N-硫酸酯酶的活性，並且特別地，被解釋為與SEQ ID NO: 1的胺基酸序列具有90%或更高，優選95%或更高，更優選99%或更高的序列同源性的序列，或其中在SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的N-末端和/或C-末端缺失一個或多個胺基酸殘基的胺基酸序列。

包括一種或多種雜質的包括乙醯肝素-N-硫酸酯酶的溶液優選但不限於細胞培養液，其中所述細胞培養液是能夠重組產生乙醯肝素-N-硫酸酯酶的宿主細胞的培養液。

宿主細胞可以是本領域已知的任何宿主細胞，並且宿主細胞的實例包括但不限於芽孢桿菌屬菌株諸如大腸桿菌( Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)和蘇雲金芽孢桿菌( Bacillus thuringiensis)，原核宿主細胞諸如鏈黴菌屬( Streptomyces)、假單胞菌屬( Pseudomonas)(例如，惡臭假單胞菌)、奇異變形桿菌( Proteus mirabilis)或葡萄球菌屬( Staphylococcus)(例如，肉葡萄球菌( Staphylococcus carnosus))，真菌諸如麯黴屬物種，酵母菌諸如巴斯德畢赤酵母( Pichia pastoris)、釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母屬( Schizosaccharomyces)和粗糙鏈孢黴( Neurospora crassa)，其它低等真核細胞，高等真核細胞諸如來源於昆蟲的細胞，以及來源於植物或哺乳動物的細胞。

優選地，宿主細胞可以是猴腎細胞(COS7)、NSO細胞、SP2/0、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、W138、敘利亞幼地鼠腎(BHK)細胞、MDCK、骨髓瘤細胞系細胞、HuT 78細胞或293細胞。

此外，可以透過深層過濾等去除細胞和細胞碎片來澄清細胞培養液。

在本發明中，多模式層析法可以透過同時進行陽離子交換層析(CEX)和疏水作用層析(HIC)來實現，但不限於此。

透過多模式層析可以去除各種雜質。特別地，可以選擇性洗脫具有不同含量的M6P(甘露糖-6-磷酸)的酶，並且透過除去具有與乙醯肝素-N-硫酸酯酶的雜質相似的性質的雜質，可以提高最終純化的乙醯肝素-N-硫酸酯酶的純度，並顯著增加其穩定性。

在本發明中，用於多模式層析的樹脂可以不受限制地使用，只要它同時適用於陽離子交換層析和疏水作用層析。例如，可以使用具有式1和式2結構的Capto MMC和Capto adhere樹脂，但不限於此。

在根據本發明進行多模式層析時，用於上樣和平衡的緩衝液(溶液)的pH為4.5±1.0，優選4.5±0.5，更優選4.5±0.1，但不限於此。

緩衝液含有200±100 mM，優選200±50 mM，更優選200±20 mM的NaCl，並且為5至100 mM，優選10至50 mM，更優選15至30 mM的常規乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、甘胺酸或Tris緩衝液等，但不限於此。

在進行根據本發明的多模式層析的步驟中，在樹脂與乙醯肝素-N-硫酸酯酶結合後用於洗滌和洗脫的緩衝液是5至100 mM，優選10 mM至50 mM，更優選15至30 mM的常規組胺酸、甘胺酸、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽或Tris緩衝液等，但不限於此。

洗滌步驟中所用的緩衝液的pH可以是5.0至8.0，優選6.0至7.5，更優選6.3至7.0。

特別地，根據本發明的洗滌可以包括兩個或更多個洗滌步驟。在這種情況下，在隨後的洗滌步驟中所用的緩衝液的pH可以高於在初步洗滌步驟中所用的緩衝液的pH。

具體地，當洗滌包括兩個洗滌步驟時，第一洗滌步驟的pH為6.0至6.6，優選6.2至6.6，更優選6.4至6.5，而第二洗滌步驟的pH為6.6至7.2，優選6.7至7.0，更優選6.75至6.9，但不限於此。

此外，洗脫步驟中所用的緩衝液的pH可以是6.6至9.0，優選6.9至8.8，更優選8.0至8.4，但不限於此。

根據本發明進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液的步驟具有透過有效去除具有相對低pH的HCP來提高雜質去除效率的效果。

辛酸鹽沉澱透過將辛酸或其鹽，優選辛酸鈉，加入到目標溶液中來進行，在具體實例中，加入到多模式層析洗脫液或親和層析洗脫液中，以在pH 3.5至6.0，優選4.0至5.5，更優選4.3至5.0下獲得1至50 mM，優選5至30 mM，更優選8至12 mM的濃度。

根據本發明的純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的方法，在進行多模式層析以獲得洗脫液和進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液之間，還包括進行親和層析以獲得洗脫液。

因此，該方法可以包括進行多模式層析以獲得洗脫液；進行親和層析以獲得洗脫液；進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液。

根據本發明，使用親和層析的步驟包括除去雜質，特別是，HCP諸如組織蛋白酶X，其具有與乙醯肝素-N-硫酸酯酶相似的物理和化學性質諸如pI(等電點)或疏水性，以增強除去雜質的效果。

用於根據本發明的親和層析的樹脂優選為肝素瓊脂糖凝膠或藍色瓊脂糖凝膠，但不限於此。

用於上樣、平衡、洗滌和洗脫的緩衝液(溶液)的pH可以是4.5±1.0，優選4.5±0.5，更優選4.5±0.1，但不限於此，並且緩衝液為5至100 mM，優選10至50 mM，更優選15至30 mM的常規乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、甘胺酸或Tris緩衝液等，但不限於此。

特別地，用於洗滌的緩衝液可以含有150±100 mM，優選150±50 mM，更優選150±20 mM的NaCl，而用於洗脫的緩衝液可以含有300±100 mM，優選300±50 mM，更優選300±20 mM的NaCl。

根據本發明的純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的方法，在進行多模式層析以獲得洗脫液之前，還可以包括進行初級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液，進行溶劑/洗滌劑處理，以及進行陽離子交換層析(CEX)以獲得洗脫液。

因此，該方法可以包括進行初級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液；溶劑/洗滌劑處理；進行陽離子交換層析(CEX)以獲得洗脫液；進行多模式層析以獲得洗脫液；進行親和層析以得到洗脫液；以及進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液。

初級陰離子交換層析是用於從細胞培養液中最大限度地回收乙醯肝素-N-硫酸酯酶的步驟，並且用於根據本發明的初級陰離子交換層析的樹脂是弱陰離子交換樹脂或者是強陰離子交換樹脂，並且樹脂的實例包括，但不限於，弱陰離子交換樹脂諸如DEAE瓊脂糖凝膠，以及強陰離子交換樹脂諸如Q瓊脂糖凝膠、Fractogel TMAE、Fractogel TMAE和Poros XQ，等等。

在根據本發明的初級陰離子交換層析期間，用於上樣、平衡、洗滌和洗脫的緩衝液(溶液)的pH為7.5±1.0，優選7.5±0.7，更優選7.5±0.5，但不限於此，並且在沒有限制的情況下，樹脂為5至100 mM，優選10至70 mM，更優選40至60 mM的常規Tris、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸或甘胺酸緩衝液等，但不限於此。此外，洗脫緩衝液可以含有200±100 mM，優選200±70 mM，以及更優選200±50 mM的NaCl。

溶劑/洗滌劑處理是用於滅活病毒的步驟，優選地使用聚山梨醇酯(特別是聚山梨醇酯20和/或80)和磷酸三正丁酯(TnBP)的組合，但不限於此。

溶劑/洗滌劑處理在pH為7.5±1.0，優選7.5±0.5，更優選7.5±0.2下，於18至28°C，優選20至25°C下進行1小時或更長或者6小時或更短。

陽離子交換層析是一種最大限度地回收乙醯肝素-N-硫酸酯酶並除去雜質諸如工藝相關的雜質和在溶劑/洗滌劑處理期間形成的HCP的工藝。

在根據本發明的陽離子交換層析中所用的樹脂可以是弱陽離子交換樹脂或強陽離子交換樹脂，其實例包括羧甲基(CM)、磺丙基(SP)和甲基磺酸(S)樹脂，並且該樹脂優選為SP瓊脂糖凝膠等，但不限於此。

在根據本發明的陽離子交換層析期間，用於上樣、平衡、洗滌和洗脫的緩衝液(溶液)的pH為4.5±0.7，優選4.5±0.5，更優選4.5±0.1，但不限於此，並且在沒有限制的情況下，樹脂為5至100 mM，優選10至50 mM，更優選15至30 mM的常規乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、甘胺酸或Tris緩衝液等，但不限於此。

此外，用於上樣或平衡的緩衝液可以包含100±70 mM，優選100±50 mM，更優選100±20 mM的NaCl，並且洗脫緩衝液可以含有200±100 mM，優選200±50 mM的NaCl，更優選200±20 mM的NaCl。

根據本發明的純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的方法，在進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液之後，還可以包括進行二級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液。

因此，該方法可以包括進行初級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液；溶劑/洗滌劑處理；進行陽離子交換層析(CEX)以獲得洗脫液；進行多模式層析以獲得洗脫液；進行親和層析得到洗脫液；進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液；以及進行二級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液。

二級陰離子交換層析是一種最大限度地回收乙醯肝素-N-硫酸酯酶並除去工藝相關雜質諸如肝素、辛酸鹽或溶劑/洗滌劑的工藝。在根據本發明的陰離子交換層析中所用的樹脂優選為強陰離子交換樹脂諸如Q瓊脂糖凝膠、Fractogel TMAE(M)、Fractogel TMAE(S)或Poros XQ，但不限於此。

在根據本發明的二級陰離子交換層析期間，用於上樣、平衡、洗滌和洗脫的緩衝液(溶液)的pH為7.5±1.0，優選7.5±0.7，更優選7.5±0.5，但不限於此，並且在沒有限制的情況下，並且樹脂為5至100 mM，優選10至50 mM，更優選15至30 mM的常規組胺酸、甘胺酸、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽或Tris緩衝液等，但不限於此。

此外，平衡緩衝液可以包含50±20 mM，優選50±10 mM，更優選50±5 mM的NaCl，並且洗脫緩衝液可以包含150±50 mM，優選150±30 mM，更優選150±10 mM的NaCl。

根據本發明的純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的方法，在進行二級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液之後，還可以包括奈米過濾。

因此，該方法可以包括進行初級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液；溶劑/洗滌劑處理；進行陽離子交換層析(CEX)以獲得洗脫液；進行多模式層析以獲得洗脫液；進行親和層析以得到洗脫液；進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液；進行二級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液；以及奈米過濾。

奈米過濾的目的在於去除病毒，並且可以使用通常用於去除病毒的奈米過濾器來進行。

根據本發明的純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的方法還可以包括超濾/滲濾(UF/DF)；在選自以下組成步驟的情況下進行至少一次：在進行初級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液之前；在進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液和進行二級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液之間；以及在奈米過濾之後。

因此，當超濾/滲濾(UF/DF)包括在進行初級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液之前、進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液和進行二級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液之間、以及在奈米過濾之後的所有步驟中時，整體方法可以包括： 初級超濾/滲濾(UF/DF)； 進行初級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液； 溶劑/洗滌劑處理； 進行陽離子交換層析(CEX)以獲得洗脫液； 進行多模式層析以獲得洗脫液； 進行親和層析以獲得洗脫液； 進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液； 二級超濾/滲濾(UF/DF)； 進行二級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液； 奈米過濾；以及 三級超濾/滲濾(UF/DF)。

初級超濾/滲濾旨在濃縮細胞培養液，優選已經過純化過程的細胞培養液，並交換緩衝液以減少目標培養液的體積，縮短上樣時間，並提高後續過程的便利性。

用於初級超濾/滲濾的膜的截斷值可以是10至100 kDa，優選20至70 kDa，更優選30至50 kDa，但不限於此。

用於初級超濾/滲濾的緩衝液的pH可以是7.5±1.0，優選7.5±0.7，更優選7.5±0.5，但不限於此，並且使用5至100 mM，優選10至80 mM，更優選30至70 mM的常規Tris、組胺酸、甘胺酸、乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液等，但不限於此。

二級超濾/滲濾在辛酸鹽沉澱和二級陰離子交換層析之間進行，目的是轉換pH和電導率。

用於二級超濾/滲濾的膜的截斷值可以是10至100 kDa，優選20至70 kDa，更優選30至50 kDa，但不限於此。

用於二級超濾/滲濾的緩衝液的pH可以是7.5±1.0，優選7.5±0.7，更優選7.5±0.5，但不限於此，並且使用5至50 mM，優選10至40 mM，更優選15至30 mM的常規組胺酸、甘胺酸、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽或Tris緩衝液，但不限於此。

當二級超濾/滲濾的電導率為10 mS/cm或更低，優選8 mS/cm或更低，以及更優選6 mS/cm或更低時，回收工藝溶液，並將pH調節至7.5±1.0。

三級超濾/滲濾在奈米過濾後進行，以及目的是最終將結果濃縮至高濃度並交換緩衝液。

用於三級超濾/滲濾的膜的截斷值可以是10至100 kDa，優選20至70 kDa，更優選30至50 kDa，但不限於此。

用於三級超濾/滲濾的緩衝液的pH可以是8.0±1.0，優選8.0±0.7，更優選8.0±0.5，但不限於此，並且使用1至20 mM，優選2至10 mM，更優選3至8 mM的常規組胺酸、甘胺酸、乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽或Tris緩衝液，但不限於此。

除非另有說明，否則根據本發明的所有純化步驟皆在室溫下進行，具體地說是15至30°C，優選18至25°C。

在下文中，將參考實施例更詳細地描述本發明。然而，對於本領域具有通常知識者來說，顯然這些實施例僅用於說明本發明，而不應被解釋為限制本發明的範圍。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解的相同含義。

[實施例]

實施例1：細胞培養液的澄清

使用深層過濾器對包含重組產生的乙醯肝素-N-硫酸酯酶和一種或多種雜質的細胞培養液進行深層過濾。

特別地，允許蒸餾水完全流入至來自Merck KGaA的深層過濾器Cat. No. MD0HC054H1或Cat. No. MX0HC027H1以及來自Pall Corporation的深層過濾器Cat. No. NP6PDK516或Cat. No. NP5LPDD16中以除去過濾器所包含的溶液，允許pH 7.5、50 mM Tris緩衝液流動以達到平衡狀態，然後在≤2.0巴的範圍內過濾細胞培養液。

回收率為95%或更高，而HCP的去除能力為約0.4 LRV(對數下降值)。

實施例2：初級超濾/滲濾(UF/DF)

對澄清的細胞培養液進行初級超濾/滲濾，以進行濃縮和緩衝液交換。

特別地，使pH 7.5、50 mM的Tris緩衝液流入至來自Merck KGaA的具有30至50 kDa的截斷值的Pellicon 3 Ultracel C screen(Cat. No.  P3C030C01)或來自Poll Corporation的歐米茄T系列30 kDa(OS030T12)薄膜(Omega T-series 30 kDa (OS030T12) membrane)中以達到平衡狀態，並且將培養物濾液與初始體積相比濃縮10倍，透過用3 DV(滲濾體積)或更高的pH 7.5、50 mM Tris緩衝液進行緩衝液交換，將培養物濾液與初始體積相比濃縮高達13倍，以及然後回收。

濃縮係數為7至13倍，並且緩衝液交換體積為3 DV或更高。最後，回收率為95%或更高，以及HCP的去除能力為約0.1 LRV(對數下降值)或更高。

實施例3：初級陰離子交換層析

3.1 對基礎陰離子交換層析(AEX)的驗證

使用Q瓊脂糖凝膠6 Fast Flow、Fractogel EMD TMAE (M)或Poros XQ作為強陰離子交換樹脂，並使用DEAE Sepharose Fast Flow作為弱陰離子交換樹脂，將初步超濾/滲濾的溶液進行陰離子交換層析。

特別地，用5 CV(柱體積)的0.5N NaOH對樹脂進行CIP(原位清洗)、允許15 CV的pH 7.5±0.5、50 mM Tris平衡緩衝液(EQ緩衝液)流動以達到平衡狀態，並上樣初級UF/DF溶液。然後，注射5 CV的pH 7.5±0.5、50 mM Tris平衡緩衝液以再次達到平衡狀態，注射5 CV的50 mM Tris洗脫緩衝液(pH 7.5±0.5、200±50 mM的NaCl)，當層析期間的UV訊號為50 mAu時，收集洗脫液最多至2.5 CV(132.5 mL)。

然後，注射5 CV的pH 7.5±0.5、2000±200 mM的NaCl和50 mM Tris柱洗滌緩衝液(CW緩衝液)並使用5 CV的0.5 N NaOH進行CIP，並允許15 CV的平衡緩衝液流動以達到平衡狀態。

在上述條件下的陰離子交換層析的結果顯示，當未結合時，除了在層析中洗脫之外，還注入了CW和NaOH，檢測到UV訊號，這意味著雜質被去除(參見圖1)，並且SDS-PAGE的結果顯示，在洗脫液(泳道3)中，與上樣的樣品(泳道1)相比，至少與泳道2和泳道4一樣多的雜質被去除(參見圖2)。

整體來說，產率為約90%或更高，純度為約70%或更高，以及HCP去除能力為約0.2 LRV或更高。所有使用的樹脂在工藝優化後具有相似的回收率。因此，考慮到工藝穩定性和經濟可行性，Q瓊脂糖凝膠是優選的。

3.2 對陰離子交換層析(AEX)的優化

如表1中所示，在改變工藝pH和洗脫緩衝液中的NaCl濃度時，測試了AEX工藝的性能。

特別地，基於初始實驗pH(pH 7.5)以±0.5的差值進行測試，並且用100、150和200 mM的NaCl濃度進行逐步洗脫，以根據在每個pH下的洗脫緩衝液中的NaCl濃度來確定對目標蛋白質(即乙醯肝素-N-硫酸酯酶)的洗脫性能。

[表1]

根據工藝pH值和洗脫緩衝液中的NaCl濃度的AEX的性能

工藝 pH	樣品 (NaCl 濃度 )	體積	目標蛋白質含量 (ELISA)
含量 (mg/mL)	產率 (%)
7.0	上樣	60.0	1.851	N/A
未結合	210.0	0.099	18.7
洗脫 1(100 mM)	300.0	0.279	75.4
洗脫 2(150 mM)	150.0	0.046	12.4
洗脫 3(200 mM)	150.0	0.003	0.4
CW	150.0	0.003	0.4
7.5	上樣	60.0	1.822	N/A
未結合	210.0	0.084	16.2
洗脫 1(100 mM)	300.0	0.269	73.9
洗脫 2(150 mM)	300.0	0.065	17.9
洗脫 3(200 mM)	150.0	0.006	0.9
CW	150.0	0.003	0.4
8.0	上樣	60.0	1.896	N/A
未結合	210.0	0.016	2.9
洗脫 1(100 mM)	300.0	0.344	90.8
洗脫 2(150 mM)	300.0	0.046	12.1
洗脫 3(200 mM)	150.0	0.006	0.8
CW	150.0	0.003	0.4
驗收標準	N/A	≥80

結果顯示乙醯肝素-N-硫酸酯酶在pH 7.0至8.0下與樹脂結合，並且大部分乙醯肝素-N-硫酸酯酶從100 mM的NaCl中洗脫。此外，大部分的乙醯肝素-N-硫酸酯酶從150 mM的NaCl級分中回收。因此，發現當洗脫緩衝液中的NaCl濃度為100 mM，優選150 mM或更高時，可以獲得令人滿意的結果。

實施例4：溶劑/洗滌劑處理

透過溶劑/洗滌劑處理(S/D處理)，透過初級AEX獲得的洗脫液中的病毒被滅活。

特別地，將S/D儲備溶液加入到透過初級AEX獲得的洗脫液中，以獲得1%聚山梨醇酯80和0.3% TnBP，並在20至25°C下攪拌1小時。

此時，在pH 7.3、7.5和7.7的三種條件下進行S/D處理最長達6小時，並且證實在以上定義的pH範圍內可以進行充分的S/D處理。然而，當處理時間超過6小時時，洗脫液混濁可能導致工藝風險。因此，優選將處理時間調節至小於6小時。

實施例5：陽離子交換層析

5.1 對基礎陽離子交換層析(CEX)的驗證

使用SP瓊脂糖凝膠Fast Flow樹脂進行陽離子交換層析，以最大限度地從S/D處理的溶液中回收乙醯肝素-N-硫酸酯酶，並除去雜質，特別是溶劑和洗滌劑，它們是工藝雜質。

特別地，用5 CV(柱體積)的0.5 N NaOH對樹脂進行CIP(原位清洗)，允許10 CV的20 mM乙酸鈉(S.A.)平衡緩衝液(EQ緩衝液，pH 4.5±0.1，100±20 mM NaCl)流動以達到平衡狀態，並上樣S/D處理的溶液。

然後，注射5 CV的20 mM乙酸鈉平衡緩衝液(pH 4.5±0.1，100±20 mM NaCl)以再次達到平衡狀態，注入5 CV的20 mM乙酸鈉洗脫緩衝液(pH 4.5±0.1，200±20 mM NaCl)，以及最初以3 CV的量收集洗脫液，然後以2 CV的剩餘量作為廢物丟棄。

然後，注入5 CV的20 mM乙酸鈉柱洗滌緩衝液(CW緩衝液，pH 4.5±0.1，2000±200 mM NaCl)，用5 CV的0.5N NaOH進行CIP，並使10 CV的平衡緩衝液流動以達到平衡狀態。

在上述條件下的陽離子交換層析的結果顯示，當未結合時，除了在層析中的洗脫之外，還注入了CW和NaOH，檢測到UV訊號，這意味著雜質被去除(參見圖3)，這可以從SDS-PAGE的結果中看出。在洗脫液(泳道3)中，與上樣的樣品(泳道1)相比，除去了至少與泳道2和泳道4一樣多的雜質(參見圖4)，並且與初級陰離子交換層析洗脫液相比，純度增加了約20%。

整體來說，產率為約90%或更高，純度為約93%或更高，以及HCP去除能力為約1.2 LRV或更高。

5.2 對陽離子交換層析(CEX)的優化

如表2中所示，在改變工藝pH和洗脫緩衝液中的NaCl濃度時，測試了CEX工藝的性能。

特別地，基於初始實驗pH(pH 4.5)，在4.0至5.4的範圍內進行測試，並且根據2至300 mM的濃度進行測試，以根據每個pH下的洗脫緩衝液中的NaCl濃度來確定對目標蛋白質(即乙醯肝素-N-硫酸酯酶)的洗脫性能。

[表2]

根據工藝pH值和洗脫緩衝液中的NaCl濃度的CEX的性能

工藝	pH	條件
pH 研究1	平衡	4.5	20 mM S.A.+100 mM NaCl (pH 4.5)
上樣	20 mM S.A. (pH 4.5) ≒10 mS/cm
再平衡	20 mM S.A.+100 mM NaCl (pH 4.5)
洗脫	20 mM S.A.+200 mM NaCl (pH 4.5)
柱洗滌	20 mM S.A.+ 2 M NaCl (pH 4.5)
平衡	5.0~5.4	20 mM S.A.+20 mM NaCl (pH 5.0~5.4)
上樣	20 mM S.A. (pH 5.0~5.4) ≒4 mS/cm
再平衡	20 mM S.A.+20 mM NaCl (pH 5.0~5.4)
洗脫	20 mM S.A.+50~300 mM NaCl (pH 5.0~5.4)
柱洗滌	20 mM S.A.+ 2 M NaCl (pH 5.0~5.4)
pH 研究2	平衡	4.4~4.6	20 mM S.A.+100 mM NaCl (pH 4.4~4.6)
上樣	20 mM S.A. (pH 4.5) ≒10 mS/cm
再平衡	20 mM S.A.+100 mM NaCl (pH 4.4~4.6)
洗脫	20 mM S.A.+200 mM NaCl (pH 4.4~4.6)
柱洗滌	20 mM S.A.+ 2 M NaCl (pH 4.4~4.6)

從表3可以看出，結果顯示此時洗脫緩衝液中的最佳NaCl濃度為50(在pH 5.4下)至210 mM NaCl(在pH 4.6或更低下)。

[表3]

根據工藝pH值和洗脫緩衝液中的NaCl濃度的洗脫結果

工藝	運行編號	pH	產率 (%)	純度 (%)
pH 研究1	3	4.5	86.7	89.7
4	5.0	87.5	81.5
4-1	5.0	64.6	91.3
5	5.4	71.6	94.9
pH 研究2	1	4.4	88.5	99.8
2	4.6	82.3	97.3
驗收標準	≥78.0	≥83.0

實施例6：多模式層析

使用能夠同時進行陽離子交換層析(CEX)和疏水作用層析(HIC)的Capto MMC樹脂進行多模式層析，以便更有效地從CEX洗脫液中除去雜質，並選擇性地純化含有M6P(甘露糖5-磷酸酯)的乙醯肝素-N-硫酸酯酶。

具體地，用5 CV的0.5 N NaOH對樹脂進行CIP，允許10 CV的20 mM乙酸鈉(S.A.)平衡緩衝液(EQ緩衝液，pH 4.5，200 mM NaCl)流動以達到平衡狀態，並上樣CEX洗脫液。

然後，注入5 CV的20 mM組胺酸平衡緩衝液(pH 5.5±0.1)以達到再平衡狀態，用5 CV的20 mM組胺酸初級洗滌緩衝液(pH 6.5±0.1)初次洗滌該柱，以及然後用10 CV的20 mM組胺酸二級洗滌緩衝液(pH 6.85±0.1)進行二次洗滌。

當洗滌緩衝液的pH為6.5至6.9時，洗滌後的溶液含有大量的HCP，但是乙醯肝素-N-硫酸酯酶的含量相當低。洗滌分兩步進行，第一洗滌緩衝液的pH為6.45，第二洗滌緩衝液的pH增加到6.85，以更有效地去除HCP並增加乙醯肝素-N-硫酸酯酶的回收率。

然後，注入10 CV的組胺酸洗脫緩衝液(pH 6.8±0.1至8.3±0.1，20 mM)並回收所有洗脫液。

結果顯示，目標蛋白(即乙醯肝素-N-硫酸酯酶)在洗脫緩衝液pH為6.7時被初次回收，而乙醯肝素-N-硫酸酯酶在洗脫緩衝液pH最高達8.4時可能被適當回收(見圖5)。

此外，隨著洗脫緩衝液的pH增加，乙醯肝素-N-硫酸酯酶的pI範圍逐漸增加，並且在級分之間FGly含量沒有顯著差異，但是M6P含量隨著洗脫pH增加而降低。也就是說，具有較低pI值的乙醯肝素-N-硫酸酯酶包含較大量的M6P(參見圖6和表4)。

[表4]

根據洗脫緩衝液的pH值的M6P的純化效率

樣品 pH	FGly (%)	M6P (mol/mol)	HCP (ppm)	純度 (%)
6.9	54.24	3.43	1365	97.8
7.1	54.72	3.10	485	98.5
7.3	54.64	2.97	304	98.4
7.5	53.82	2.61	223	97.9
7.7	54.45	2.56	199	97.8
CW	57.85	1.93	729	97.4

然後，注入5 CV的20 mM組胺酸柱洗滌緩衝液(CW緩衝液，pH 7.5，2000 mM NaCl)，用5 CV的0.5 N NaOH進行CIP，並使10 CV的平衡緩衝液流動以達到平衡狀態。

整體來說，產率為約70-90%或更高，純度為約97%或更高，HCP去除能力為約1.8 LRV或更高。

實施例7：親和層析

7.1 對基礎親和層析的驗證

使用肝素瓊脂糖凝膠或藍色瓊脂糖凝膠樹脂進行親和層析以除去雜質，例如組織蛋白酶X，其大部分包含在MMC洗脫液中。

具體地，用5 CV的0.1 N NaOH對樹脂進行CIP，允許10 CV的20 mM乙酸鈉(S.A.)平衡緩衝液(EQ緩衝液，pH 4.5，200 mM NaCl)流動以達到平衡狀態，並上樣MMC洗脫液。

隨後，注入5 CV的20 mM乙酸鈉(S.A.)平衡緩衝液(pH 4.5±0.1)以達到再平衡狀態，並用10 CV的20 mM乙酸鈉洗滌緩衝液(pH 4.5±0.1，150±20 mM NaCl)二次洗滌該柱。

然後，注入10 CV的20 mM乙酸鈉洗脫緩衝液(pH 4.5±0.1，300±20 mM NaCl)，回收所有洗脫液，注入5 CV的20 mM乙酸鈉洗滌緩衝液(CW緩衝液，pH 4.5±0.1，2000±200 mM NaCl)，用5 CV的0.1 N NaOH進行CIP，並使10 CV的平衡緩衝液流動以達到平衡狀態。

根據上述過程的親和層析的結果顯示，乙醯肝素-N-硫酸酯酶被純化到非常高的純度，如圖7中所示。

整體來說，產率為約90%或更高，純度為約99%或更高，以及HCP去除能力為約1.0 LRV或更高。

7.2 對親和層析的優化

如表5中所示，在改變工藝pH和洗脫緩衝液中的NaCl濃度時，測試了親和層析的性能。

特別地，基於初始條件測試，將pH設定為pH 4.5±0.1，將洗滌緩衝液的中心NaCl濃度設定為150 mM，並且將洗脫緩衝液的中心NaCl濃度設定為300 mM。

[表5]

根據工藝pH值和洗脫緩衝液中的NaCl濃度的洗脫結果

運行編號	樣品	HNS含量	HCP含量	純度(%)
mg/mL	產率(%)	ng/mg	LRV
運行1	上樣	0.5	-	947.4	-	98.31
洗滌(130 mM)	0.01	1.8	-	-	-
洗脫(300 mM)	0.54	86.9	154.8	0.8	100
運行2	上樣	0.50	-	947.4	-	-
洗滌(150 mM)	0.01	1.84	-	-	-
洗脫(300 mM)	0.55	88.2	158.0	0.8	100
運行3	上樣	0.50	-	947.4	-	-
洗滌(170 mM)	0.01	1.94	-	-	-
洗脫(300 mM)	0.55	89.0	115.2	0.9	100
運行4	上樣	0.50	-	947.40	-	-
洗滌(150 mM)	0.01	1.94	-	-	-
洗脫(280 mM)	0.49	79.2	77.80	1.1	99.99
運行5	上樣	0.50	-	947.4	-	-
洗滌(150 mM)	0.01	2.05	-	-	-
洗脫(320 mM)	0.58	93.1	66.5	1.2	99.97
驗收標準	N/A	≥70	N/A	≥0.5	≥96

從表5中可以看出，結果顯示當洗滌緩衝液的NaCl濃度在130至170 mM的範圍內並且洗脫緩衝液中的NaCl濃度在280至320 mM的範圍內時，HCP被有效去除並且獲得了高純度的乙醯肝素-N-硫酸酯酶。

實施例8：辛酸鹽沉澱

進行辛酸鹽沉澱以沉澱並除去具有較低pI的HCP。

具體地，製備500 mM辛酸鈉的儲備溶液，並加入至親和層析洗脫液中，以將濃度調節至10 mM。

然後，在pH值為4.5±0.1和在20至25°C下的條件下進行1至3小時的沉澱，同時以200±20 rpm的速度攪拌，並透過過濾除去沉澱的雜質。

從表6中可以看出，結果顯示，與不進行辛酸鹽沉澱的情況相比，當進行辛酸鹽沉澱時，作為大部分雜質的HCP的含量極大地降低。幾乎沒有檢測到組織蛋白酶X，即主HCP，並且溶酶體Pro-X羧肽酶極大地減少。

[表6]

透過辛酸鹽沉澱的雜質去除效果

雜質 (HCP)	測量的值 (ppm)
不進行沉澱	進行沉澱
組織蛋白酶X	3,100	N.D
溶酶體Pro-X羧肽酶	2,758	705
α-甘露糖苷酶	839	286
α-L-岩藻糖苷酶	749	N.D
去氧核糖核酸酶II(片段)	683	284
跨膜蛋白	443	N.D
β-葡萄糖醛酸酶	419	N.D
RNA結合蛋白34	413	N.D
β-半乳糖苷酶(片段)	338	N.D
羧肽酶	292	N.D
Attractin	289	251
二-N-乙醯二糖酶( Di-N-acetylchitobiase)	267	N.D
AGA	265	N.D
α-半乳糖苷酶	264	N.D

N.D. : 未確定

整體來說，產率為約90%或更高，純度為約99%或更高，以及HCP去除能力為約1.0 LRV或更高。

實施例9：二級超濾/滲濾(UF/DF)

透過二級超濾/滲濾，將辛酸鹽沉澱的上清液調節至適合二級陰離子交換層析的pH和電導率。在二級超濾/滲濾後，濃縮因數增加了約2倍，緩衝液交換體積為3 DV或更大，pH從4.5增加到約7.5，並且電導率從25 mS/cm降低到6 mS/cm或更小。

具體而言，使用來自Merck的具有30至50 kDa截斷值的Pellicon 3 Ultracel C screen(Cat No. P3C030C01)膜，使pH 7.5、20 mM組胺酸緩衝液流動，以達到平衡狀態，與初始體積相比，將辛酸鹽沉澱的上清液濃縮2倍，用2 DV或更高的pH 7.5，20 mM組胺酸緩衝液交換緩衝液，當電導率達到6 mS/cm或更低時回收處理溶液，然後然後將回收的處理溶液的pH值調節至7.5。

實施例10：二級陰離子交換層析

為了從二級超濾/滲濾溶液中除去工藝相關的雜質，諸如肝素、辛酸鹽、溶劑和洗滌劑，使用Fractogel EMD TMAE (M)和Fractogel EMD TMAE (S)作為強陰離子交換樹脂進行二級陰離子交換層析。

具體而言，用5 CV的0.5 N NaOH對樹脂進行CIP，允許15 CV的20 mM組胺酸平衡緩衝液(pH 7.5±0.5，50 mM NaCl)流動以達到平衡狀態，並上樣二級UF/DF溶液。然後，注入10 CV的20 mM組胺酸平衡緩衝液(pH 7.0±0.5，50 mM NaCl)以達到平衡狀態，並注入7 CV的20 mM組胺酸洗脫緩衝液(pH 7.0±0.5，150±10 mM NaCl)。

然後，注入5 CV的20 mM組胺酸柱洗滌緩衝液(CW緩衝液，pH 7.0±0.5，2000±200 mM NaCl)，用5 CV的0.5 N NaOH進行CIP，並允許平衡緩衝液以10 CV流動以達到平衡狀態。

整體來說，產率為約90%或更高，純度為約99%或更高，並且樹脂之間幾乎沒有差異。

此外，在將洗脫液中的NaCl濃度固定在150 mM並將pH從6.8改變到7.7時進行的測試結果顯示，在所有情況下皆可以有效地純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶，如表7中所示。

[表7]

根據pH值的AEX的淨化效果

實驗 編號	上樣 溶液pH	蛋白質含量(UV)
上樣樣品	洗脫池	產率 (%)
體積(mL)	濃度(mg/mL)	體積(mL)	濃度(mg/mL)
1	7.5	117.8	1.10	78.5	1.53	92.73
2	7.3	117.8	1.15	78.5	1.56	90.43
3	7.7	117.8	1.12	78.5	1.55	92.26
4	7.0	25	1.73	39.3	1.05	95.29
5	6.8	22	1.98	39.3	1.04	93.71
6	7.2	26	1.61	39.3	1.03	96.58

此外，將pH固定在7.5並將洗脫液中的NaCl濃度改變為130至150 mM時進行的測試結果顯示，在所有情況下皆可以有效地純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶，如表8中所示。

[表8]

依賴於洗脫液中NaCl的濃度的AEX的純化效果

NaCl濃度(mM)	蛋白質含量(UV)	純度
上樣樣品	洗脫池	產率 (%)	洗脫池
體積 (mL)	濃度 (mg/mL)	體積 (mL)	濃度 (mg/mL)		純度 (%)
1	142.7	0.55	80	1.03	106.0	99.19
2	142.7	0.55	80	0.93	95.7	99.06
3	142.7	0.55	160	0.51	104.9	99.96

實施例11：奈米過濾

最後，為了透過過濾去除病毒，使用來自Merck KGaA、Asahi和Sartorius的奈米過濾器進行奈米過濾。儘管製造商的產品之間沒有差異，但Sartorius的奈米過濾器的回收率相當高，總收率超過90%。

實施例12：三級超濾/滲濾(UF/DF)

對最終製劑進行三級超濾/滲濾，以實現高濃度和緩衝液交換。

具體而言，使用來自Merck KGaA的具有30至50 kDa的截斷值的Pellicon 3 Ultracel C screen(Cat. No. P3C030C01)膜，允許4.2 mM組胺酸緩衝液(pH 8.2，93.75 mM NaCl)流動以達到平衡狀態，將二級AEX洗脫液濃縮至約5 mg/mL，以及然後回收。

圖8示出了根據本發明具體實施方式的整體工藝流程圖。

儘管已經詳細描述了本發明的具體配置，但是本領域具有通常知識者將會理解，在不脫離本發明的基本特徵的情況下，本發明可以以修改的形式實現。因此，應該從說明性而非限制性的角度來考慮上述實施方式。本發明的範圍是在請求項中限定，而不是在前面的描述中限定，並且與其等同的所有差異將被解釋為落入本發明的範圍內。

根據本發明的純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的方法透過有效地去除HCP和其他雜質，可以極大地提高所產生的乙醯肝素-N-硫酸酯酶的純度、安全性和穩定性，因此非常適合用於酶替代療法的乙醯肝素-N-硫酸酯酶的有效生產。

無

圖1是說明使用初級陰離子交換層析純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的過程的層析圖。

圖2示出了初級陰離子交換層析的每個步驟溶液的SDS-PAGE的結果。

圖3是說明使用陽離子交換層析純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的過程的層析圖。

圖4示出了陽離子交換層析的每個步驟溶液的SDS-PAGE的結果。

圖5是在多模式層析中基於洗脫液的pH的層析圖。

圖6是說明在多模式層析中基於洗脫液的pH的SDS-PAGE結果的圖。

圖7示出了親和層析中的洗脫結果。

圖8示出了根據本發明的實施方式的純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的整個過程。

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Claims (12)

1. 一種從包括至少一種雜質的包含乙醯肝素-N-硫酸酯酶的溶液中純化乙醯肝素-N-硫酸酯酶的方法，所述方法包括：進行多模式層析(MMC)以獲得洗脫液；以及進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液；其中，所述辛酸鹽沉澱透過加入濃度為1至20 mM的辛酸鹽來進行。
2. 根據請求項1所述的方法，其中，所述包含乙醯肝素-N-硫酸酯酶的溶液是細胞培養液。
3. 根據請求項1所述的方法，其中，所述多模式層析透過同時進行陽離子交換層析(CEX)和疏水作用層析(HIC)來實現。
4. 根據請求項3所述的方法，其中，用於所述多模式層析(MMC)的樹脂是Capto MMC樹脂或Capto adhere樹脂。
5. 根據請求項4所述的方法，其中，在所述乙醯肝素-N-硫酸酯酶與所述樹脂結合後，所述多模式層析(MMC)包括兩個或更多個洗滌步驟。
6. 根據請求項5所述的方法，其中，在兩個洗滌步驟中，在後續洗滌步驟中所用的緩衝液的pH值高於在初步洗滌步驟中所用的緩衝液的pH值。
7. 根據請求項1所述的方法，還包括：在進行多模式層析(MMC)以獲得洗脫液和進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液之間，進行親和層析以獲得洗脫液。
8. 根據請求項7所述的方法，還包括：進行初級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液；溶劑/洗滌劑處理；以及進行陽離子交換層析(CEX)以獲得洗脫液，之後進行多模式層析以獲得洗脫液。
9. 根據請求項8所述的方法，其中，用於所述初級陰離子交換層析(AEX)的樹脂是弱陰離子交換樹脂或強陰離子交換樹脂。
10. 根據請求項8所述的方法，還包括：在進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液之後，進行二級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液。
11. 根據請求項10所述的方法，還包括在進行二級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液之後，進行奈米過濾。
12. 根據請求項11所述的方法，還包括超濾/滲濾(UF/DF)，在選自由以下組成的步驟的情況下進行至少一次：在進行初級陰離子交換層析以獲得洗脫液之前；在進行辛酸鹽沉澱以獲得上清液和進行二級陰離子交換層析(AEX)以獲得洗脫液之間；以及在奈米過濾之後。