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TWI878554B - 結合ｔｎｆｒ２的抗體及其用途 - Google Patents

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TWI878554B
TWI878554B TW110121495A TW110121495A TWI878554B TW I878554 B TWI878554 B TW I878554B TW 110121495 A TW110121495 A TW 110121495A TW 110121495 A TW110121495 A TW 110121495A TW I878554 B TWI878554 B TW I878554B
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Abstract

本發明涉及特異性結合TNFR2的新型抗體其抗原特異性結合片段以及包含所述抗體或其抗原特異性結合片段的組成物。此外，本發明涉及編碼抗體或其抗原特異性結合片段的核酸和包含其的宿主細胞，以及其相關用途。此外，本發明涉及抗體和抗原特異性結合片段用於治療和診斷的用途。

Description

結合TNFR2的抗體及其用途
本發明涉及特異性結合TNFR2的新型抗體或其抗體片段，以及涉及包含所述抗體或其抗體片段的組成物。此外，本發明涉及編碼該抗體或其抗體片段的核酸和包含其的宿主細胞，以及其相關用途。此外，本發明涉及抗體和抗體片段用於治療和診斷的用途。
腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)是一大類具有相關結構的29種受體，能夠介導一系列免疫和非免疫細胞功能(Mayes PA等人，Nat Rev Drug Discov.2018 Jul；17(7)：509-52)。幾種受體已被表徵為具有作為免疫共刺激劑(TNFRSF5(也稱為CD40)、TNFRSF4(也稱為OX40)、TNFRSF9(也稱為4-1BB)、TNFRSF7(也稱為CD27)和TNFRSF18(也稱為GITR))的作用。這些共刺激受體可以在多種免疫細胞類型上表達，包括T細胞、B細胞和自然殺傷(NK)細胞以及抗原呈遞細胞(APC)，並已被證明可以驅動免疫細胞功能、增殖和存活。
腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種高度多效性的細胞因子，幾乎影響任何類型的細胞。它觸發細胞反應，從炎症基因表達程式的誘導、遍及細胞增殖和分化的刺激到諸如細胞凋亡和壞死性凋亡等細胞自殺程式的啟動 (Wajant H等，Cell Death Differ.2003 Jan；10(1))：45-65.)。TNF-α的跨膜和可溶形式都與兩種已知的TNF-α受體TNFR1和TNFR2相互作用。這兩種受體屬於TNFRSF的不同亞組。TNFR1是死亡受體(DR)，具有死亡結構域。TNFR2沒有死亡結構域，是一種原型的TNF受體相關因子(TRAF)相互作用的TNFRSF受體(Xie P,J Mol Signal.2013 Jun 13；8(1)：7)。因此，在TNFR2的C端附近有一個短胺基酸基序，它能夠募集接頭蛋白TRAF2和TRAF2相關蛋白諸如TRAF1和細胞凋亡抑制蛋白1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1,cIAP1)和cIAP2的細胞抑制劑。因此，TNFR2沒有內在的細胞死亡誘導活性，但會刺激NF-κB信號轉導和各種激酶的啟動。
TNFR1由幾乎任何細胞類型表達。然而TNFR2的表達則僅限於某些細胞類型，包括骨髓細胞、調節性T細胞、神經膠質細胞和一些內皮細胞類型，但也可以在上皮細胞、成纖維細胞和某些T和B細胞亞群中被誘導(Medler and Wajant,Expert Opin Ther Targets.2019 Apr；23(4)：295-307)。
Heather Torrey等人(Sci Signal.2017 Jan 17；10(462))最近的研究表徵了使用拮抗性抗體抑制TNFR2的效果。在基於培養的分析中，他們發現兩種TNFR2拮抗劑抑制了Treg增殖，減少了正常細胞的可溶性TNFR2分泌，並使T效應細胞擴增。這些TNFR2抗體殺死從卵巢癌腹水中分離的Treg比殺死來自健康供體樣本的Treg更有效，這表明這些抗體可能對腫瘤微環境具有特異性。
在另一項研究中，Eric M.Tam(Sci Transl Med.2019 Oct 2；11(512))描述了他們的抗TNFR2抗體提供共刺激信號，導致在體外CD4+和 CD8+ T細胞中增殖、啟動標誌物和細胞因子的增加，在人源化小鼠模型中也具有抗腫瘤作用。
儘管靶向抑制性受體CTLA-4、PD-1或PD-L1的免疫治療在癌症方面取得了實質性的臨床進展，但相當一部分患者仍然對治療無反應。單獨針對新的免疫腫瘤學通路的免疫治療，或與當前的免疫療法相結合，可能會改善臨床結果。目前沒有抗TNFR2抗體正在進行臨床研究，因此，需要可以啟動效應T細胞功能並增強T細胞增殖和/或抑制Treg功能的TNFR2靶向療法，其旨在用於癌症。
本發明涉及結合TNFR2的抗體或它的片段或其抗原結合片段。在一個實施方案中，TNFR2來源於人或食蟹猴。在另一個實施方案中，TNFR2包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50。在另一個實施方案中，抗體可結合的TNFR2片段包含TNFR2的胞外區，例如，該區域包含或由SEQ ID NO：50組成。在進一步的實施方案中，抗體可結合的TNFR2的片段包含SEQ ID NO：50的1L至31C的胺基酸序列或SEQ ID NO：50的1L至96C的胺基酸序列或SEQ ID NO：50的17T至54D的胺基酸序列。在進一步的實施方案中，抗體可結合的TNFR2片段包含人TNFR2蛋白上的Q26，或對應於人TNFR2蛋白上26位的位置處的胺基酸Q。
在一個實施方案中，本發明的抗體結合TNFR2的表位。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體結合的TNFR2的表位包含人TNFR2的Q26或對應於人TNFR2蛋白上26位的位置處的胺基酸Q。在一個實施方案中，表位包含在人TNFR2的胞外區中，例如，由SEQ ID NO：50組成或包含SEQ ID NO：50 的區域。在另一個實施方案中，表位包含在人TNFR2或其對應的片段中SEQ ID NO：58的1L至31C的胺基酸序列中。在另一個實施方案中，表位包含在人TNFR2或其對應片段中SEQ ID NO：62的1L至96C的胺基酸序列中。在另一個實施方案中，表位的一個或多個胺基酸包含在人TNFR2或其對應片段中SEQ ID NO：52的17T-54D的胺基酸序列中。
在一方面，抗TNFR2抗體或其抗原結合片段具有以下一種或多種特性：(1)在體外與人和/或食蟹猴TNFR2蛋白或其片段具有高親和力結合；(2)與表達於細胞表面的人和/或食蟹猴TNFR2結合，例如293T細胞的細胞表面，或活化的細胞，諸如抗CD3刺激的PBMC；(3)阻斷TNF-α與表達於細胞(例如293T細胞)上的人和/或食蟹猴TNFR2之間的相互作用/結合；(4)啟動(例如，人)T-細胞(例如，CD8+T細胞或CD 4+T細胞)，例如，增加細胞因子如IFN-γ的分泌，增加CD4+T細胞或CD8+T細胞的增殖；(5)刺激TNFR2(例如人或食蟹猴TNFR2)的下游信號通路；(6)增強免疫反應；(7)在誘導的T細胞，如誘導的Treg細胞或誘導的CD8+T細胞上，不誘導ADCC作用；(8)由於具有良好的藥物代謝動力學參數，適合作為藥物中的活性成分使用；(9)具有抗腫瘤作用，例如藉由減小腫瘤體積，例如可以使腫瘤體積減小至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多。
一方面，本發明涉及抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其包含三個重鏈互補決定區(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3。
另一方面，本發明涉及抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其包含三個輕鏈互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在另一方面，本發明涉及抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其包含三個重鏈互補決定區(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3；和三個輕鏈互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3。
另一方面，本發明涉及抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區。
另一方面，本發明涉及抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區。
在另一方面，本發明涉及抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區。
在一個實施方案中，重鏈可變區包含三個重鏈互補決定區(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在另一個實施方案中，輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一個實施方案中，三個重鏈互補決定區HCDRl、HCDR2和HCDR3是 (i)源自重鏈可變區HCVR的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCVR包含或由SEQ ID NO：7、15、25或37表示的序列組成，或 (i)(i)的HCDR1、HCDR2和HCDR3，與(i)的三個CDR相比，進一步包含總共至少一個且不超過5個胺基酸變化(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)。
在一個實施例中，三個輕鏈互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3是(i)源自輕鏈可變區LCVR的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCVR包含或由SEQ ID NO：8、16、26、28或38表示的序列組成，或(ii)(i)的LCDR1、LCDR2和LCDR3，與(i)的三個CDR相比，其進一步包含總共至少一個且不超過5個胺基酸變化(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)。
在一個實施方案中，本發明涉及一種抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其包含源自重鏈可變區HCVR的三個重鏈互補決定區(CDRs)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCVR由SEQ ID NO：7、15、25或37表示的序列組成；和源自輕鏈可變區LCVR的三個輕鏈互補決定區(CDRs)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCVR由SEQ ID NO：8、16、26、28或38表示的序列組成。
在另一個實施方案中，本發明涉及抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其包含(1)源自由SEQ ID NO：7或25表示的序列組成的重鏈可變區HCVR的三個HCDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；和源自由SEQ ID NO：8或26或28表示的序列組成的輕鏈可變區LCVR的三個LCDR LCDR1、LCDR2和LCDR3；(2)源自由SEQ ID NO：15或37表示的序列組成的重鏈可變區HCVR的三個HCDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；和源自由SEQ ID NO：16或38表示的序列組成的輕鏈可變區LCVR的三個LCDR LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一個實施方案中，HCDRl包含SEQ ID NO：1或9的胺基酸序列，或由其組成，或者HCDRl包含與選自由SEQ ID NO：1或9的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個變化(較佳胺基酸取代，較佳保守性取代)的胺基酸序列，或由其組成。
在一個實施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO：2或10的胺基酸序列，或由其組成，或HCDR2包含與選自由SEQ ID NO：2或10組成的組的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個變化(較佳胺基酸取代、較佳保守性取代)的胺基酸序列，或由其組成。
在一個實施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO：3或11的胺基酸序列，或由其組成，或HCDR3包含與選自由SEQ ID NO：3或11的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個變化(較佳胺基酸取代、較佳保守性取代)的胺基酸序列，或由其組成。
在一個實施方案中，LCDRl包含SEQ ID NO：4或12的胺基酸序列，或由其組成，或者LCDRl包含與選自由SEQ ID NO：4或12的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個變化(較佳胺基酸取代、較佳保守性取代)的胺基酸序列，或由其組成。
在一個實施方案中，LCDR2包含SEQ ID NO：5或13的胺基酸序列，或由其組成，或者LCDR2包含與選自由SEQ ID NO：5或13的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個變化(較佳胺基酸取代、較佳保守性取代)的胺基酸序列，或由其組成。
在一個實施方案中，LCDR3包含SEQ ID NO：6或14的胺基酸序列，或由其組成，或者LCDR3包含與選自由SEQ ID NO：6或14的胺基酸序列相比具 有一個、兩個或三個變化(較佳胺基酸取代、較佳保守性取代)的胺基酸序列，或由其組成。
在一個實施方案中，三個重鏈互補決定區HCDRl、HCDR2和HCDR3是(i)分別由SEQ ID NO：1、2和3表示的序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或(ii)分別由SEQ ID NO：9、10和11表示的序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或(iii)(i)或(ii)的HCDR1、HCDR2和HCDR3，，進一步包含與(i)或(ii)的三個CDR相比總共至少一個且不超過5個胺基酸變化(較佳胺基酸取代，較佳保守性取代)。
在一個實施方案中，三個輕鏈互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3是(i)分別由SEQ ID NO：4、5和6表示的序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或(ii)分別由SEQ ID NO：12、13和14表示的序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或(iii)(i)的LCDR1、LCDR2和LCDR3，，其進一步包含與(i)的三個CDR相比總共至少一個且不超過5個胺基酸變化(較佳胺基酸取代，較佳保守性取代)。
在另一個實施方案中，本發明涉及抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其包含 (i)分別由SEQ ID NO：1、2和3表示的序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分別由SEQ ID NO：4、5和6表示的序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3。(ii)分別由SEQ ID NO：9、10和11表示的序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分別由SEQ ID NO：12、13和14表示的序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一個實施方案中，重鏈可變區(i)包含或由與選自由SEQ ID NO：7、15、25或37組成的組的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列組成；或(ii)包含或由選自由SEQ ID NO：7、15、25或37組成的組的胺基酸序列組成；或(iii)包含與選自SEQ ID NO：7、15、25或37組成的組的胺基酸序列相比具有一個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5個)胺基酸變化(較佳胺基酸取代，更佳保守性取代)的胺基酸序列，或由其組成，較佳地，所述胺基酸變化不發生在CDR區，更佳地，所述胺基酸變化發生在FR區，例如FR1、FR2、FR3或FR4區。
在另一個實施方案中，輕鏈可變區(i)包含或由與選自由SEQ ID NO：8、16、26、28或38組成的組的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列組成；或 (ii)包含或由選自由SEQ ID NO：8、16、26、28或38組成的組的胺基酸序列組成；或(iii)包含與選自SEQ ID NO：8、16、26、28或38組成的組的胺基酸序列相比具有一個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5個)胺基酸變化(較佳胺基酸取代，更佳保守性取代)的胺基酸序列，或由其組成，較佳地，所述胺基酸變化不發生在CDR區，更佳地，所述胺基酸變化發生在FR區，例如FR1、FR2、FR3或FR4區域，較佳地，變化發生在FR1中的Q38，特別地該變化是從Q到H或它的保守性胺基酸。
在另一個實施方案中，本發明涉及抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區，其包含或由SEQ ID NO：7、15、25或37表示的胺基酸序列組成，和/或輕鏈可變區，其包含或由SEQ ID No：8、16、26、28或38表示的胺基酸序列組成。
在另一個實施方案中，本發明涉及抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其包含：(1)重鏈可變區，其包含或由SEQ ID NO：7表示的胺基酸序列組成，和/或輕鏈可變區，其包含或由SEQ ID NO：8表示的胺基酸序列組成；(2)包含或由SEQ ID NO：15表示的胺基酸序列組成的重鏈可變區，和/或包含或由SEQ ID NO：16表示的胺基酸序列組成的輕鏈可變區；(3)包含或由SEQ ID NO：25表示的胺基酸序列組成的重鏈可變區，和/或包含或由SEQ ID NO：26表示的胺基酸序列組成的輕鏈可變區； (4)包含或由SEQ ID NO：25表示的胺基酸序列組成的重鏈可變區，和/或包含或由SEQ ID NO：28表示的胺基酸序列組成的輕鏈可變區；(5)包含或由SEQ ID NO：37表示的胺基酸序列組成的重鏈可變區，和/或包含或由SEQ ID NO：38表示的胺基酸序列組成的輕鏈可變區。
在另一方面，抗TNFR2抗體或其抗原結合片段是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的形式。較佳地，本發明的抗體是IgG1的形式。
在另一方面，抗TNFR2抗體或其抗原結合片段進一步包含重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區。
在一個實施方案中，重鏈恆定區是或源自人IgG恆定區，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，較佳IgGl恆定區。
在另一個實施方案中，重鏈恆定區(i)包含或由與SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：73所表示的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列組成；或者(ii)包含或由SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：73所表示的胺基酸序列組成；或者(iii)包含與SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：73所表示的胺基酸序列相比具有一個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5個)胺基酸變化(較佳胺基酸取代，更佳保守性取代)的胺基酸序列，或由其組成。
在一個實施方案中，輕鏈恆定區是或源自κ或λ輕鏈恆定區，例如人κ或λ輕鏈恆定區，較佳人κ輕鏈恆定區。
在另一個實施方案中，輕鏈恆定區 (i)包含或由與SEQ ID NO：42所表示的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列組成；或者(ii)包含SEQ ID NO：42所表示的胺基酸序列或由其組成；或者(iii)包含與SEQ ID NO：42所表示的胺基酸序列相比具有一個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5個)胺基酸變化(較佳胺基酸取代，更佳保守性取代)的胺基酸序列或由其組成。
在一個實施方案中，本發明的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段的重鏈還包含信號肽序列。
在另一個實施方案中，本發明的抗TNFR2抗體是單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
在另一個實施方案中，本發明的抗原結合片段是選自由Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、單鏈抗體(例如，scFv)、(Fab')2、單域抗體(例如，VHH)、域抗體(dAb)或線性抗體組成的組的抗體片段。
在另一個實施方案中，本發明的抗TNFR2抗體是雙特異性或多特異性抗體分子，較佳地，該雙特異性抗體分子結合TNFR2和免疫檢查點。
在另一方面，本發明進一步涉及編碼本發明抗TNFR2抗體的任一或更多鏈的分離的核酸。
在另一方面，本發明進一步涉及包含本發明核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體。
在另一方面，本發明進一步涉及包含本發明的核酸或載體的宿主細胞。較佳地，宿主細胞是原核或真核細胞，更佳地選自酵母細胞、哺乳動 物細胞(例如，CHO細胞或CHO-S細胞或293細胞或293T細胞)，或適用於製備抗體或抗原結合片段的其他細胞。
在另一方面，本發明進一步涉及製備抗-TNFR2抗體或其抗原結合片段的方法，包括在適合表達編碼本發明的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段核酸的條件下培養根據本發明的宿主細胞。任選地，所述方法進一步包括從宿主細胞回收抗TNFR2抗體或其抗原結合片段。
在另一方面，本發明進一步涉及免疫綴合物，其包含根據本發明的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段和其他藥劑，例如治療劑或標誌物，諸如細胞毒劑。
在另一方面，本發明進一步涉及藥物組成物，其包含根據本發明的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，或本發明的免疫綴合物，以及任選的藥學上可接受的輔助劑。
在另一方面，本發明進一步涉及組合產品，其包含本發明的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，或本發明的免疫綴合物，以及一種或多種其他治療劑，例如化學治療劑、其他抗體、細胞毒類藥物、疫苗、抗感染劑、小分子實體或免疫調節劑。
在進一步的方面，本發明進一步涉及在受試者中啟動T細胞、或誘導T細胞介導的抗腫瘤活性、或增強T細胞介導的免疫、或刺激T細胞增殖的方法，包括向所述受試者施用本發明的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段、或免疫綴合物、或藥物組成物、或組合產品。
在另一方面，本發明進一步涉及在受試者中預防或治療癌症或感染的方法，包括向所述受試者施用本發明的抗-TNFR2抗體或其抗原結合片段，或免疫綴合物，或藥物組成物或組合產品。
在一個實施方案中，癌症是具有高水準TNFR2(例如，高蛋白質或核酸水準的TNFR2)的癌症。在另一個實施方案中，所述癌症是非小細胞肺癌、乳腺癌、腎細胞癌、何杰金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚非何杰金氏淋巴瘤和卵巢癌、胃腸道癌症，例如結直腸癌、直腸癌或結腸癌。
在一個實施方案中，感染是病毒感染、細菌感染、真菌感染或原生動物諸如寄生蟲感染。
在一個實施方案中，本發明的方法進一步包括向所述受試者聯合施用一種或多種療法，例如治療方式和/或其他治療劑，較佳地，所述治療方式包括手術和/或放射療法，和/或其他選自由化學治療劑、其他抗體、細胞毒類藥物、疫苗、抗感染劑、小分子實體或免疫調節劑組成的組的治療劑。
在另一方面，本發明進一步涉及一種檢測樣品中TNFR2的方法，所述方法包括：(a)使樣品與根據本發明的任何抗TNFR2抗體或其抗原結合片段接觸；(b)檢測抗TNFR2抗體或其抗原結合片段與TNFR2之間的複合物的形成；任選地，抗TNFR2抗體被可檢測地標記。
在另一方面，本發明進一步涉及用於檢測TNFR2的試劑盒，其包含本發明的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，或免疫綴合物。
本發明還包含本文所述的任何實施例的任意組合。本文所述的任何實施方案或其任意組合適用於本文所描述的本發明的任何和所有抗TNFR2抗體或片段及其方法和用途。
圖1顯示嵌合抗體與人和食蟹猴TNFR2蛋白的結合。
圖2顯示嵌合抗體與細胞表面上的食蟹猴或人TNFR2結合，並阻斷TNF-α與細胞表面上的人TNFR2的結合。
圖3顯示了人源化抗體結合到人TNFR2並阻斷人TNFR2結合TNF-α。
圖4顯示了人源化抗體與細胞表面的食蟹猴TNFR2結合以及阻斷人TNFR2與TNF-α的結合。
圖5顯示了人源化抗體對人CD8+T細胞的共刺激。
圖6顯示人源化抗體共同刺激T細胞的增殖。
圖7顯示人源化抗體以Fc交聯形式啟動T細胞。
圖8顯示了人源化抗體與TNFRSF蛋白的結合。
圖9顯示了在SEC-HPLC中人源化抗體hu32-C和hu32C-V1的純度。
圖10顯示了抗TNFR2抗體hu3-E的表位作圖
圖11顯示了抗-TNFR2抗體hu32C-V1的表位作圖
圖12顯示了抗TNFR2抗體hu3-E與活化的PBMC細胞上的TNFR2結合。
圖13顯示了抗人TNFR2抗體對Treg細胞的ADCC作用。
圖14顯示了抗人TNFR2抗體對CD8+T細胞的ADCC作用。
定義
為了解釋說明書的目的，將使用以下定義，並且如果合適，以單數形式使用的術語還可以包括複數，反之亦然。應當理解，這裡使用的術語是為了描述特定實施方案的目的而不是限制性的。
在此使用的術語“和/或”將被視為兩個或更多個指定特徵或元件中的每一個的具體揭露，其中包含或不包含另一個。因此，在諸如“A和/或B”的短語中使用的術語“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A(單獨的)”和“B(單獨的)”。
應當理解，無論在何處用語言“包括”在本文中描述方面，還提供了在“由......組成”和/或“基本上由......組成”方面描述的其他類似方面。
當與數值結合使用時，術語“約”意在涵蓋在比指定數值小10%或5%的下限和大於指定的數值10%或5%的上限之間的範圍內的數值。
“2型腫瘤壞死因子受體(TNFR2)”在腫瘤浸潤性免疫抑制性CD4+FoxP3+調節性T細胞(Treg)高度表達，並且已證明為介導腫瘤壞死因子(TNF)對這些細胞的刺激作用。最近的研究表明，TNFR2在刺激Treg的啟動和增殖方面起著至關重要的作用，Treg是抗腫瘤免疫反應的主要檢查點(Chen和Oppenheim，Sci Signal 10：eaal2328，2017)。TNFR2也由某些類型的惡性細胞表達，並且這些腫瘤細胞的存活和生長由TNFR2的配體促進。在一個實施方案中，本發明中的TNFR2源自人，例如，其具有SEQ ID NO：48所表示的胺基酸序列。在另一個實施方案中，TNFR2源自食蟹猴，例如，其具有SEQ ID NO：49所表示的胺基酸序列。本文所用的TNFR2片段是指TNFR2的任何部分，尤其是本發明的抗TNFR2抗體所結合的部分。在一個實施方案中，該片段是TNFR2的胞外區，例如具有由SEQ ID NO：50表示的胺基酸序列的區域。
“抗-抗原”抗體是指與抗原特異性結合的抗體。例如，抗TNFR2抗體與TNFR2特異性結合。
“分離的”抗體是已經與其自然環境的成分分開的抗體。在一些實施方案中，抗體被純化至大於90%或95%或99%的純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或色譜法(例如，離子交 換或反相HPLC)所確定的純度。在本發明的一個實施方案中，抗TNFR2抗體是分離的。
如本文所用，術語“抗-TNFR2抗體”、“抗-TNFR2”、“TNFR2抗體”或“結合TNFR2的抗體”是指這樣的抗體，其能夠以足夠的親和力地結合到(例如，人或食蟹猴)TNFR2或其片段，以致該抗體可用作靶向(人或食蟹猴)TNFR2的診斷和/或治療劑。在一個實施方案中，抗TNFR2抗體以小於約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%或約90%或更高的抗體與(例如，人或食蟹猴)TNFR2的結合的程度結合非TNFR2蛋白(例如，非人或非食蟹猴TNFR2)，如藉由例如放射免疫測定(RIA)或Bio-light干涉測量法或MSD分析法所測量的。在一個實施方案中，抗體與人或食蟹猴TNFR2或其片段在體外以高親和力方式結合，從而與結合到非TNFR2蛋白(例如，分別地非人或非食蟹猴TNFR2)相比，結合高出約70%、約80%或約90%或更高。在一個實施方式中，抗體與食蟹猴TNFR2或其片段在體外以高親和力方式結合，從而該抗體與食蟹猴TNFR2結合的KD低於100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM，或在以上所列值之間，例如約0.5nM-10nM、0.5nM-8nM、0.5nM-6nM。在一個實施方式中，抗體與人TNFR2或其片段在體外以高親和力方式結合，從而該抗體與人TNFR2結合的KD低於100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM，或在以上所列值之間，例如約0.3nM至5nM或0.3nM至4nM。
抗體可以是已經變化的抗體(例如，藉由插入，缺失，取代，與非抗體部分綴合)。例如，抗體可以包括一種或多種改變抗體特性(例如功能特性)的變體胺基酸(與自然形成的抗體相比)。例如，若干變化，其影響例如抗體在患者體內的半衰期、效應子功能和/或免疫反應，在本領域是已知的。
術語“單株抗體”(“mAb”)是指單分子組成的抗體分子的製備物，即對特定抗原表現出單一結合特異性和親和力的抗體分子。單株抗體是分離抗體的一個例子。MAb可以藉由融合瘤、重組、轉基因或其他所屬技術領域中具有通常知識者已知的技術產生。
“人”抗體(HuMAb)是指具有其中框架區和CDR區均源自人種系(germline)免疫球蛋白序列的可變區的抗體。術語“人”抗體和“完全人”抗體同義使用。
“人源化抗體”是指這樣一種抗體，其中非人抗體的CDR結構域外的一些、大部分或全部胺基酸被源自人免疫球蛋白的相應胺基酸取代。在抗體的人源化形式的一個實施方案中，CDR域外的一些、大部分或全部胺基酸已被來自人免疫球蛋白的胺基酸替換，而一個或多個CDR區內的一些、大部分或全部胺基酸未改變。胺基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修飾是允許的，只要它們不會破壞抗體與特定抗原結合的能力。“人源化”抗體保留了與原始抗體相似的抗原特異性。
“嵌合抗體”是指其中可變區源自一個物種而恆定區源自另一物種的抗體，例如其中可變區源自小鼠抗體且恆定區源自人抗體的抗體。
抗體的“抗原結合片段”是指抗體的一個或多個片段，其保留與被完整抗體結合的抗原特異性結合的能力。包含在術語抗體的“抗原結合片段”內的結合片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙體抗體 (diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；單域抗體；和由抗體片段形成的多特異性抗體。
這些抗體片段使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的一般技術獲得，並且以與完整抗體相同的方式篩選其效用。抗原結合片段可以藉由重組DNA技術產生，或者藉由完整免疫球蛋白的酶促或化學裂解產生。
如本文所用，術語“表位”是指與抗體分子特異性相互作用的抗原(例如，TNFR2)的一部分。該部分(在本文中稱為表位決定簇)通常包含諸如胺基酸側鏈或糖側鏈或其組分的元件。表位元決定簇可以根據本領域已知的或本文揭露的方法(例如，藉由晶體學或藉由氫-氘交換)來定義。通常，表位元具有特定的三維結構特徵。通常，表位具有特定的電荷特性。一些表位元是線性表位元，而其他表位是構象表位。在本發明的一個實施方案中，本發明的抗體結合的TNFR2的表位包含人TNFR2的Q26或對應於人TNFR2蛋白上26位的位置處的胺基酸Q。在一個實施方案中，表位包含在人TNFR2的胞外區(例如，由SEQ ID NO：50組成或包含SEQ ID NO：50的區域)中。在另一個實施方案中，表位包含在人TNFR2或其對應的片段中SEQ ID NO：58的從1L至31C的胺基酸序列中。在另一個實施方案中，表位包含在人TNFR2或其對應片段中SEQ ID NO：62的從1L至96C的胺基酸序列中。在另一個實施方案中，表位包含在人TNFR2或其對應片段中SEQ ID NO：52的從17T至54D的胺基酸序列中。
作為參考抗體的“結合相同或重疊表位的抗體”是指在競爭測定中阻斷參考抗體與其抗原的結合達50%或更多的抗體，反之，參考抗體在競爭測定中阻斷該抗體與其抗原的結合達50%或更多。
與參考抗體競爭結合其抗原的抗體是指在競爭測定中阻斷參考抗體與其抗原的結合的50%、60%、70%、80%、90%或95%或更多的抗體。 換言之，在競爭測定中，參考抗體阻斷了該抗體與其抗原的結合的50%、60%、70%、80%、90%或95%或更多。許多類型的競爭性結合測定可用於確定抗原結合蛋白是否與另一種競爭，諸如固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定。
抑制(例如，競爭性抑制)參考抗體與其抗原結合的抗體是指抑制參考抗體與其抗原的50%、60%、70%、80%、90%或95%或更多的結合的抗體。相反，參考抗體抑制該抗體與其抗原的結合達50%、60%、70%、80%、90%或95%或更多。抗體與其抗原的結合可以藉由親和力來測量。確定親和力的方法是本領域已知的。
表現出與參考抗體相同或相似的結合親和力和/或特異性的抗體是指具有至少50%、60%、70%、80%、90%或95%或更多參考抗體的結合親和力和/或特異性。這可以藉由本領域已知的用於確定結合親和力和/或特異性的任何方法來確定。
“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中序列高度可變並形成結構限定環(“高變環”)和/或包含抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責結合表位。重鏈和輕鏈的CDR通常稱為CDR1、CDR2和CDR3，從N端開始依次編號。位於抗體重鏈可變結構域的CDR被稱為HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域的CDR被稱為LCDR1、LCDR2和LCDR3。在給定的輕鏈可變區或重鏈可變區的胺基酸序列中，每個CDR的確切胺基酸序列邊界可以使用多種眾所周知的抗體CDR分配系統的任何一種或組合來確定，包括，例如，基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲結構的Chothia(Chothia等人(1989)Nature 342：877-883；Al-Lazikani等人，"Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins"，Journal of Molecular Biology,273：927-948(1997))，基於抗體序列變異性的Kabat (Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，美國衛生與人類服務部，美國國立衛生研究院(1987))、AbM(巴斯大學)、Contact(倫敦大學學院)、國際ImMunoGeneTics資料庫(IMGT)(萬維網上的imgt.cines.fr/)，以及基於使用大量晶體結構的親和傳播聚類的North CDR定義。
例如，根據不同的CDR確定格式，每個CDR的殘基如下。
Figure 110121495-A0305-12-0021-1
CDR還可以基於具有與參考CDR序列(例如，本發明的任何示例性CDR)相同的Kabat編號位置來確定。
除非另有說明，在本發明中，術語“CDR”或“CDR序列”包括藉由上述任何方式確定的CDR序列。
除非另有說明，在本發明中，當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時，均指按照Kabat編號系統的編號位置(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.公共衛生服務，國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991年))。
在一個實施方案中，本發明抗體的CDR的邊界由Kabat方案確定。
需要說明的是，藉由不同的分配系統獲得的抗體可變區CDR的邊界可能不同。即，由不同分配系統定義的抗體可變區的CDR序列不同。因此，當涉及定義具有本發明定義的特定CDR序列的抗體時，該抗體的範圍還包括其可變區序列包含特定CDR序列、但由於應用了不同方案而具有不同於本發明定義的具體CDR邊界的要求保護的CDR邊界的抗體。
具有不同特異性(即，不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR(在相同的分配系統下)。然而，儘管CDR因抗體而異，但CDR中只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。可以使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少兩種方法確定最小重疊區域，從而為抗原結合提供“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的子部分。所屬技術領域中具有通常知識者清楚，其餘CDR序列的殘基可以藉由抗體結構和蛋白質折疊來確定。因此，在本發明中也將考慮本文給出的CDR的任何變體。例如，在一個CDR變體中，最小結合單位中的胺基酸殘基可能保持不變，而由Kabat或Chothia定義的其他CDR殘基可能被保守性胺基酸殘基取代。
本領域已知的抗體主要有五類：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些抗體中的一些可以進一步分為亞類(同種型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應於不同類別免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分 別稱為α、δ、ε、γ和μ。所屬技術領域中具有通常知識者可以根據實際需要選擇並獲得本發明的合適類別的抗體。
“IgG形式的抗體”是指抗體的重鏈恆定區所屬的IgG形式。所有同類型抗體的重鏈恆定區都是相同的，不同類型抗體的重鏈恆定區不同。例如，IgGl形式的抗體是指重鏈恆定區Ig結構域為IgGl的Ig結構域。
“分離的”核酸是指已經與其自然環境的成分分開的核酸分子。分離的核酸包括包含在細胞中的核酸分子，該細胞通常含有該核酸分子，但存在於染色體外或在不同於其天然染色體位置的染色體位置。
如本文所用，術語“載體”是指能夠傳播與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體，以及整合到它被引入的宿主細胞基因組中的載體。某些載體能夠指導與它們有效連接的核酸的表達。此類載體在本文中稱為“表達載體”。
術語“宿主細胞”是指已引入外源核酸的細胞，包括此類細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化細胞”，它們包括初級轉化細胞和由其衍生的後代，無論傳代次數如何。後代在核酸含量上可能與親本細胞不完全相同，但可能包含突變。具有與在最初轉化的細胞中篩選或選擇的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突變後代包括在本文中。
相對於參考多肽序列的“百分比(%)胺基酸序列同一性”定義為候選序列中的胺基酸殘基與參考多肽序列中的胺基酸殘基在比對之後的相同的百分比，並在必要時引入缺口以實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮任何保守性取代作為序列同一性的一部分。用於確定胺基酸序列同一性百分比的比對可以以本領域中多種方式實現，例如，使用公開可用的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)軟體。所屬技術領域 中具有通常知識者可以確定用於比對序列的合適參數，包括在被比較序列的全長上實現最大比對所需的任何演算法。
當在本申請中提及序列同一性的百分比時，除非另外特別指明，這些百分比是相對於較長序列的全長計算的。相對於較長序列全長的計算適用於核酸序列和多肽序列。
術語“藥品組成物”，是指以使得其所含有效成分的生物活性有效，且不含有對被施予物件具有不可接受毒性的額外成分的形式的製劑。
術語“藥學上可接受的輔助劑”是指與治療劑共同給藥的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全))、賦形劑或載體。
如本文所用，“治療”是指減緩、中斷、阻止、減輕、停止、減少或逆轉現有症狀、病症、病況或疾病的進展或嚴重程度。
如本文所用，“預防”包括抑制疾病或病症的發作或進展或特定疾病或病症的症狀。在一些實施方案中，具有癌症家族史的受試者是預防方案的候選者。通常，在癌症的上下文中，術語“預防”是指在癌症的體徵或症狀出現之前給予藥物，特別是在有患癌症風險的受試者中。"
“啟動T細胞”是指誘導、引起或刺激效應T細胞或記憶T細胞具有更新的、持續的或放大的生物學功能。增強T細胞功能的例子包括：與干預前的水準相比，CD8+T細胞分泌γ-干擾素(例如，IFN-γ)增加，CD4+T細胞增殖增加，CD8+T細胞增殖增加。
如本文所述的術語“治療劑”包括有效預防或治療腫瘤(例如癌症)和感染的任何物質，包括化學治療劑、細胞毒類藥物、疫苗、其他抗體(例如，針對免疫檢查點分子的抗體))、活性抗感染劑、免疫調節劑、小實體。
“化學治療劑”包括可用於治療癌症的化合物。
術語“免疫檢查點分子”是指CD4 T細胞和CD8 T細胞的細胞表面上的一組分子。這些分子可以有效地充當“刹車”，下調或抑制抗腫瘤免疫反應。
術語“抗感染劑”包括在施用濃度和施用間隔下特異性抑制或消除微生物諸如病毒、細菌、真菌或原生動物(例如寄生)的生長並且對宿主不致死的任何分子。如本文所用，術語抗感染劑包括抗生素、抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑和抗原生動物劑。在一個具體方面，抗感染劑以施用濃度和施用間隔對宿主無毒。
免疫調節劑包括免疫檢查點分子抑制劑和共刺激分子啟動劑。
術語“小分子”是指任何分子量為約2000道爾頓或更小，較佳為約500道爾頓或更小的分子。
術語“組合產品”是指用於組合給藥的劑量單位形式或試劑盒的部件的固定或非固定組合，其中兩種或多種治療劑可以同時獨立給藥或在一個時間間隔內分別給藥，尤其是當這些時間間隔允許這些組合夥伴表現協作(例如，協同效應)時。術語“固定組合”是指本發明的抗體和組合夥伴(例如，其他治療劑，例如免疫調節劑，例如免疫抑制劑或抗炎劑)被以單一實體或劑量的形式同時施用於患者。術語“非固定組合”是指本發明的抗體和組合夥伴(例如，其他治療劑，例如免疫調節劑，例如免疫抑制劑或抗炎劑)以單獨的實體同時、同步或序貫地施用於患者，並且沒有具體的時間限制，其中這種施用在患者體內提供治療有效水準的兩種化合物。後者也適用於雞尾酒療法，諸如施用三種或更多種治療劑。在較佳的實施方案中，藥物組合是非固定組合。
術語“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳動物中的生理疾病，其通常以不受調節的細胞生長為特徵。
術語“腫瘤”是指所有贅生性細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，以及所有癌前和癌變細胞和組織。當在本文中提及時，術語“癌症”、“癌性的”、“細胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“腫瘤”並不相互排斥。
術語“感染性疾病”是指由病原體引起的疾病，包括例如病毒感染、細菌感染、真菌感染或原生動物諸如寄生蟲感染。
術語“腫瘤免疫逃逸”是指腫瘤逃避免疫識別和清除。因此，作為治療的概念，腫瘤免疫被“治療”，腫瘤在逃逸減弱時被免疫系統識別和攻擊。腫瘤識別的例子包括腫瘤結合、腫瘤縮小和腫瘤清除。
本文使用的術語“標記物”是指直接或間接偶聯或融合至試劑，例如多核苷酸探針或抗體，並有助於檢測與其偶聯或融合的試劑的化合物或組成物。標記本身可以是可檢測的(例如，放射性同位素標記或螢光標記)或在酶促標記的情況下可以催化可檢測受質化合物或組成物的化學變化。該術語旨在包括藉由將可檢測物質偶聯(即物理連接)到探針或抗體來直接標記探針或抗體，以及藉由與直接標記的另一種試劑反應來間接標記探針或抗體。
術語“有效劑量”是指在對需要治療或預防的患者進行一次或多次給藥後，本發明的抗體或片段或綴合物或組成物產生預期效果的量或劑量。有效劑量可以很容易地由一名作為所屬技術領域中具有通常知識者的主治醫生藉由考慮以下各種因素來確定：物種，如哺乳動物；它的大小、年齡和一般健康狀況；所涉及的特定疾病；疾病的程度或嚴重程度；單個患者的反應；特定的抗體施用；給藥途徑；所給製劑的生物利用度特徵；選擇劑量方案；以及任何伴隨治療的使用。
“治療有效量”是指在所需時間段內以所需劑量有效實現所需治療結果的量。抗體或抗體片段、或其綴合物或組成物的治療有效量可根據多種因素而變化，例如個體的病態、年齡、性別和體重，以及抗體或抗體部分在個人 中引起所需的反應的能力。治療有效量也是這樣的量，其中抗體或抗體片段、或其綴合物或組成物的任何毒性或不希望的作用次於治療有益作用。“治療有效量”較佳地將可測量的參數(例如，腫瘤生長速率)相對於未治療的受試者抑制至少約20%，更佳地至少約40%，甚至更佳地至少約50%、60%或70%，並且仍然更佳至少約80%或90%。
“預防有效量”是指在所需時間段內以所需劑量有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防劑量是在疾病發生之前或早期階段對受試者施用，因此預防有效量將小於治療有效量。
“個體”或“受試者”包括哺乳動物。哺乳動物包括但不限於家養動物(例如牛、山羊、貓、狗和馬)、靈長類動物(例如人和非人靈長類動物諸如猴子)、兔、和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)。在一些實施例中，個體或受試者是人。
如本文所用，術語“施用”或“給藥”是指使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的多種方法和遞送系統中的任一種將包含治療劑(例如抗TNFR2抗體)的組成物物理引入受試者和。給藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內、脊髓或其他腸胃外給藥途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所用，短語“腸胃外給藥”是指腸內和局部給藥以外的給藥方式，通常藉由注射，包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋巴管內、病灶內、囊內、眶內、心臟內、皮內、腹膜內。經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、椎管內、硬膜外和胸骨內注射和輸注，以及體內電穿孔。其他非腸胃外給藥(non-parenteral)途徑包括局部、表皮或黏膜給藥途徑，例如鼻內、陰道、直腸、舌下或局部。
來自受試者/患者的“樣品”是指從癌症患者或癌症受試者獲得的細胞或流體的集合。組織或細胞樣品的來源可以是來自新鮮、冷凍和/或保存的 器官或組織樣品或活檢或抽吸物的固體組織；血液或任何血液成分；體液，例如腦脊液、羊水、腹膜液或間質液；物件妊娠或發育過程中任何時間的細胞。組織樣品可包含在自然界中不與組織自然混合的化合物，例如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、固定劑、營養物、抗生素等。本文的腫瘤樣品的例子包括但不限於腫瘤活檢、細針抽吸物、細支氣管灌洗液、胸水、痰、尿液、手術標本、迴圈腫瘤細胞、血清、血漿、迴圈血漿蛋白、腹水、原代細胞培養物或源自腫瘤或表現出腫瘤樣特性的細胞株，以及保存的腫瘤樣品，例如福馬林固定、石蠟包埋的腫瘤樣品或冷凍腫瘤樣品。
本發明的抗體
在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸變化包括胺基酸取代、插入或缺失。較佳地，本文所述的胺基酸變化是胺基酸取代，較佳保守性取代。
在一個較佳的實施方案中，本文所述的胺基酸變化發生在CDR之外的一個或多個區域中(例如，在FR中)。在一個實施方案中，胺基酸改變發生在HCVR或LCVR的FR區，較佳LCVR，例如，在LCVR的FR1、FR2、FR3和/或FR4。在一些實施例中，FR區有一個、兩個或三個變化。在一個特定的實施方案中，變化是在FR1的Q38處，例如，在位置38處的從Q替換為H或它的保守性胺基酸。
更佳地，本文所述的胺基酸變化發生在重鏈可變區之外和/或輕鏈可變區之外的一個或多個區域中。
在一些實施例中，取代是保守性取代。保守性取代是指一個胺基酸被同類的另一個胺基酸取代，例如，酸性胺基酸被另一個酸性胺基酸取 代，鹼性胺基酸被另一個鹼性胺基酸取代，或中性胺基酸由另一種中性胺基酸取代。示例性取代如下表所示：
Figure 110121495-A0305-12-0029-2
任選地，本發明的抗TNFR2抗體包含對輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈或重鏈的翻譯後修飾。示例性的翻譯後修飾包括二硫鍵形成、糖基化、聚乙二醇化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作，例如與標記成分的偶聯。
在某些實施方案中，本文提供的抗體被改變以增加或減少抗體被糖基化的程度。藉由改變胺基酸序列以產生或去除一個或多個糖基化位點，可以方便地實現向抗體添加或刪除糖基化位點。
本發明涵蓋的對本文所述的抗體或其片段的另一種修飾是聚乙二醇化。抗體可以聚乙二醇化到例如增加抗體的生物學(例如血清)半衰期。為了使抗體聚乙二醇化，抗體或其片段通常在一個或多個PEG基團連接到抗體或抗體片段的條件下與聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反應性酯或醛衍生物)反應。
在某些實施方案中，可以將一個或多個胺基酸修飾引入此處提供的抗體的Fc區，從而產生Fc區變體，例如，增強抗體治療癌症或細胞增生性疾病的功效。例如，可以結合修飾來消除或增加抗體的ADCC功能，或消除抗體與Fcγ受體的結合。在一個實施例中，L234A、L235A、D265A和/或P329A(EU編號)或L234A/L235A/D265A/P329A(EU編號)可以併入Fc區域。
在一個實施方案中，可以改變抗體的半胱胺酸殘基的數量以改變抗體特性。
在一個實施方案中，可以將一個或多個胺基酸修飾引入FR區以提高抗體的產生，例如提高抗體在細胞中的表達或提高所產生抗體的純度。例如，在FR1、FR2、FR3或FR4區域，例如FR1區域，例如在位置Q38處可以有修飾。具體地，修飾可以是從第38位的Q替換為H或它的保守性胺基酸。
在一些實施方案中，本發明的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段表現出與本發明的抗體hu32-C、hu32C-V1或hu3-E相同或相似的結合親和力和/或特異性；和/或抑制(例如，競爭性抑制)本發明的抗體hu32-C、hu32C-V1或hu3-E與TNFR2的結合和/或結合與本發明的抗體hu32-C、hu32C-V1或hu3-E相同或重疊的表位；和/或與本發明的抗體hu32-C、hu32C-V1或hu3-E競爭結合TNFR2；和/或具有本發明的抗體hu32-C、hu32C-V1或hu3-E的一種或多種生物學特性。
本發明的核酸和包含其的宿主細胞
一方面，本發明提供了編碼任何上述抗TNFR2抗體或其片段的核酸。核酸可編碼包含抗體輕鏈可變區和/或重鏈可變區的胺基酸序列，或包含抗體輕鏈和/或重鏈的胺基酸序列。
在一個實施方案中，本發明的示例性核酸包括編碼選自SEQ ID NO：7、8、15、16、25、26、28、37、38中任一項的胺基酸序列的核酸，或編碼與選自SEQ ID NO：7、8、15、16、25、26、28、37、38中任一項的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列的核酸。
在另一個實施方案中，本發明的核酸包含選自SEQ ID NO：23、24、27、35或36中任一個的核苷酸序列，或與選自SEQ ID NO：23、24、27、35或36中任一個的核苷酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的核苷酸序列。
在一個實施方案中，提供了一種或多種含有任一核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體，例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質粒、黏粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。可以使用多種載體系 統。在一個較佳的實施方案中，本發明的表達載體是pCDNA，例如pCDNA3.1表達載體。
在一個實施方案中，本發明提供一種宿主細胞，其含有編碼本文所述抗體區域或本文所述載體的核酸。用於選殖或表達編碼抗體的核酸或載體的合適宿主細胞包括如本文所述的原核或真核細胞。例如，可以在細菌中產生抗體。表達後，抗體可以從可溶部分的細菌糊狀物中分離出來，並可以進一步純化。在一個實施例中，宿主細胞是大腸桿菌。
在另一個實施方案中，宿主細胞是真核細胞。宿主細胞可選自酵母、哺乳動物細胞(例如，人細胞)、昆蟲細胞、植物細胞或適合製備抗體或其抗原結合片段的其他細胞。例如，真核微生物如絲狀真菌或酵母是編碼抗體的載體的合適純株或表達宿主，包括真菌和酵母菌株。有用的哺乳動物宿主細胞株的實例是用SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)、人胚胎腎系(293HEK或293或293T細胞)等。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和骨髓瘤細胞株，例如Y0、NS0和Sp2/0。
本發明的抗體或抗原結合片段的製備和純化方法
在一個實施方案中，本發明提供了一種製備抗-TNFR2抗體的方法，其中該方法包括在適合表達抗體或抗原結合片段的條件下孵育含有編碼本發明的抗體或抗原結合片段的核酸(任何一個或多個抗體區域或抗體鏈)，以及任選地從宿主細胞(或宿主細胞培養物)中回收抗體或片段。
對於抗體的重組生產，分離編碼抗體的核酸(例如，編碼VH或VL或重鏈或輕鏈的核酸)並插入一種或多種載體中用於進一步選殖和/或在宿主細胞中表達。藉由使用一般程式(例如，藉由使用能夠特異性結合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)，可以容易地分離和測序核酸。
在一個實施方案中，宿主細胞含有載體，該載體包括編碼抗體VL的胺基酸序列的核酸和編碼抗體VH的胺基酸序列的核酸。在一個實施方案中，宿主細胞含有包含編碼抗體的VL的胺基酸序列的核酸的第一載體和包含編碼抗體的VH的胺基酸序列的核酸的第二載體。
如本文所述製備的抗體分子可以藉由已知技術純化，例如高效液相色譜、離子交換色譜、凝膠電泳、親和色譜(例如蛋白A)、尺寸排阻色譜等。用於純化特定蛋白質的實際條件還取決於諸如淨電荷、疏水性和親水性等因素，這些對所屬技術領域中具有通常知識者來說是顯而易見的。本發明的抗體分子的純度可以藉由多種眾所雜交知的分析方法中的任一種來確定，包括尺寸排阻色譜、凝膠電泳、高效液相色譜等。
測定
本文提供的抗TNFR2抗體可以藉由本領域已知的多種測定對於其物理/化學特性和/或生物活性進行鑑定、篩選或表徵。在一個方面，本發明的抗體的抗原結合活性藉由例如已知方法如酵素免疫分析法(ELISA)、西方墨點法、流式細胞術和用抗體分子包被的磁珠來測試。
另一方面，競爭性結合測定可用於鑑定與本文揭露的任何抗TNFR2抗體競爭結合TNFR2的抗體。在一些實施方案中，此類競爭性抗體與本發明的任何抗TNFR2抗體結合相同的表位元(例如，線性或構象表位元)。
本發明進一步提供了用於鑑定具有上述一種或多種特性的抗TNFR2抗體的測定法。進一步提供了在體內和/或體外具有這種生物活性的抗體。
在一些實施方案中，測試本發明的抗體的一種或多種上述特性。
用於任何所述體外測定的細胞包括天然表達TNFR2或被工程化以表達TNFR2的細胞或細胞株。在一個實施方案中，細胞是293或293T細胞株或T細胞。
值得注意的是，上述任何檢測都可以使用本發明的免疫綴合物來代替或補充抗TNFR2抗體。
值得注意的是，上述任何一種檢測方法都可以使用抗TNFR2抗體和其他試劑進行。
免疫綴合物
在一些實施方案中，本發明提供了一種免疫綴合物，其包含本文提供的任何抗TNFR2抗體或其抗原結合片段和其他藥劑，例如治療劑，包括化療劑、其他抗體、細胞毒類藥物、疫苗、抗感染劑、小分子實體或免疫調節劑(例如，抗炎劑或免疫抑制劑)。在一個實施方案中，其他藥劑例如細胞毒類藥物包括對細胞有害的任何藥劑。在一些實施方案中，免疫綴合物用於診斷、預防或治療癌症或感染。
藥物組成物、製劑或組合產品
本發明進一步提供了一種藥物組成物，或藥物製劑，或它們的組合產品，其包含抗TNFR2抗體或其抗原結合或其免疫綴合物，或所述核酸編碼抗TNFR2抗體或其片段。
這樣的組成物、製劑或組合產品可以進一步包含合適的藥物輔助劑，例如藥物載體、賦形劑等本領域已知的，包括緩衝劑。
適用於本發明的藥物載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油，或動物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻 油，等等。當靜脈內施用藥物組成物時，水是較佳的載體。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油水溶液也可以用作液體載體，特別是用於注射溶液。
合適的賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。
如果需要，該組成物還可包含少量潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑的小實體。
對於藥物輔助劑的用途，參見“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第八版，R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。
組成物可以採用溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、緩釋製劑等形式。
本發明的組成物可以是各種形式。這些形式包括，例如，液體、半固體和固體形式，例如液體溶液(例如，可注射溶液和不溶性溶液)、分散體或懸浮液、脂質體和栓劑。較佳的形式取決於預期的給藥方式和治療用途。通常較佳的是可注射溶液或不溶性溶液的形式。較佳的給藥方式是腸胃外(例如，靜脈內、皮下、腹膜內(i.p.)、肌肉內)注射或輸注。在一個較佳的實施方案中，抗體分子藉由靜脈輸注或注射給藥。在另一個較佳的實施方案中，藉由肌內、腹膜內或皮下注射施用抗體分子。
具有所需純度的本發明抗體或其抗原結合片段可以與一種或多種任選的藥物佐劑混合以製備本發明抗體的藥物製劑。藥物製劑較佳為凍乾製劑或水溶液的形式。
本發明的藥物組成物或製劑還可以包含多於一種待治療的特定適應症所需的活性成分，較佳具有互補活性而不會對彼此產生不利影響的活性 成分。例如，需要進一步提供其他治療劑，例如化療劑、其他抗體、細胞毒類藥物、疫苗、抗感染劑、小分子實體或免疫調節劑。活性成分以對預期目的有效的量適當地組合。活性成分可以是本領域已知的並且能夠與抗TNFR2抗體組合的任何物質。在一個實施方案中，另一種抗體是PD-1抗體或PD-L1抗體，例如人PD-1抗體或人PD-L1抗體。
可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質為成型製品的形式，例如薄膜或微膠囊。
本發明進一步提供組合產品，其包含本發明的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，以及其他治療劑，例如化療劑、其他抗體、細胞毒類藥物、疫苗、抗-感染劑、小分子實體或免疫調節劑。在一個實施方案中，另一種抗體是PD-1抗體或PD-L1抗體。
用途及方法
一方面，本發明提供了一種調節受試者免疫反應的方法。
另一方面，本發明提供了一種用於啟動T細胞或誘導T細胞介導的抗腫瘤活性的方法。在一個實施方案中，T細胞是CD4+T細胞或CD8+T細胞。
在一個實施方案中，T細胞的活化包括刺激T細胞的細胞因子分泌，例如T細胞的IFN-γ分泌。
在另一個實施方案中，T細胞的活化包括刺激T細胞的增殖。
另一方面，本發明涉及預防或治療受試者的腫瘤(例如，癌症)的方法。在一些實施方案中，腫瘤是腫瘤免疫逃逸。
在一個實施方案中，癌症患者的TNFR2蛋白表達水準增加，或編碼TNFR2蛋白的核酸水準增加。
在一些實施方案中，腫瘤，例如癌症，包括實體瘤和血液腫瘤和轉移性病變。在一個實施例中，實體瘤的實例包括惡性腫瘤。癌症可以是早期、中期或晚期或轉移性癌症。在一些實施方案中，腫瘤是需要T細胞活化的腫瘤，例如癌症，例如伴隨T細胞功能障礙的腫瘤或癌症。
較佳地，所述癌症是非小細胞肺癌、乳腺癌、腎細胞癌、何杰金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚非何杰金氏淋巴瘤和卵巢癌、胃腸道癌症，例如結直腸癌、直腸癌或結腸癌.
在一些實施方案中，腫瘤治療將受益於(i)TNFR2核酸或蛋白質水準的抑制；(ii)阻斷TNFR2與其配體如TNF-α的結合，(iii)T細胞的活化，例如增加細胞因子如IFN-γ的分泌，增加CD4+T細胞或CD8+T細胞的增殖；(iv)以上任何一項或多項的組合。
在另一方面，本發明涉及一種用於預防或治療受試者的感染性疾病的方法。
在一些實施例中，感染是急性的或慢性的。在一些實施方案中，慢性感染是持續感染、潛伏感染或緩慢感染。在一些實施方案中，慢性感染由選自細菌、病毒、真菌和原生動物的病原體引起。
在一些實施方案中，上述方法包括施用本發明的抗體或抗原結合片段、免疫綴合物、藥物組成物或製劑、組合產品或核酸。
在一些實施方案中，上述方法還包括向所述受試者聯合一種或多種療法，例如治療方式和/或其他治療劑，較佳地，所述治療方式包括手術和/或放射療法，和/或其他選自由化學治療劑、其他抗體、細胞毒類藥物、疫苗、抗感染劑、小分子實體或免疫調節劑組成的組的治療劑。
在一個實施例中，調節劑包括免疫抑制劑或抗炎劑。
在一個實施方案中，抗體可以是結合免疫檢查點分子的抗體。在一個實施方案中，另一種抗體是PD-1抗體或PD-L1抗體。
在一些實施方案中，本文所述的抗體組合可以單獨施用，例如，作為單獨的抗體，或連接的(例如，作為雙特異性或三特異性抗體分子)。
此類聯合治療包括聯合施用(例如，兩種或更多種治療劑包含在同一製劑或分開的製劑中)和分開施用。在一個實施方案中，本發明的抗體的施用發生在其他一種或多種療法的施用之前、同時和/或之後。
受試者可以是哺乳動物，例如靈長類動物，較佳高等靈長類動物，例如人(例如患有或有患本文所述疾病的風險的患者)。在一個實施方案中，受試者需要增強的免疫反應。在一些實施方案中，免疫反應是抗腫瘤反應。在一個實施方案中，受試者患有或有風險患有本文所述的疾病(例如，本文所述的腫瘤或感染性疾病)。
在其他方面，本發明提供了抗TNFR2抗體或其片段或其免疫綴合物在製造或製備用於上述用途例如預防或治療上述相關疾病或適應症的藥物中的用途。
實施例
實施例1 藉由融合瘤篩選產生TNFR2結合抗體
藉由交替注射hTNFR2-mFc蛋白(SEQ ID NO：45)和表達人TNFR2(SEQ ID NO：48)的CHO-K1細胞株來免疫五隻SJL(Charles River)小鼠。根據表1中的免疫程式，藉由每2週交替注射蛋白質和細胞實施4輪免疫。藉由針對TNFR2蛋白HuTNFR2-huFc(SEQ ID NO：46)的ELISA和針對穩 定表達人TNFR2(SEQ ID NO：48)的293T細胞株的FACS測試第2次、第3次和第4次免疫後免疫小鼠的血液。
Figure 110121495-A0305-12-0039-3
根據ELISA和FACS的結果，選擇小鼠5#作為隨後融合步驟的脾細胞來源。結果表明，5#小鼠血清在細胞阻斷試驗中抑制TNF-α(ACRO Biosystem，Cat#TNA-H5228)與TNFR2結合的能力最強。
進行一次電融合。融合的細胞接種在96孔盤上。藉由ELISA和FACS篩選陽性純株。人TNFR1蛋白(Acro Biosystem，Cat#TN1-H5222)、人LTBR(ACRO Biosystem，Cat#LTR-H5251)、人骨保護素(ACRO Biosystem，Cat#TNB-H5220)用於反向篩選。陽性選殖擴增到24孔盤中。收集上清液用於進一步確認篩選。根據結果篩選出15個純株進行測序。實施例4詳細說明了篩選的具體程式。
實施例2 融合瘤的測序和相應序列
藉由聚合酶鏈反應(PCR)擴增技術獲得小鼠抗人TNFR2抗體輕鏈和重鏈可變區的序列。使用RNAprep pure Cell Kit(TIANGEN,Cat#DP430) 從15種抗體中分離出總RNA，並使用Fast King gDNA Dispelling RT Super Mix(TIANGEN,Cat#KR118)合成cDNA。藉由PCR選殖重鏈和輕鏈可變區。所有PCR均使用高保真聚合酶進行。將PCR擴增的每種抗體的DNA選殖到TA選殖載體中，由金唯智公司(GENEWIZ Inc.)進行測序。
小鼠抗體純株32A1D5和43B7A4可變區的胺基酸序列如下：>32A1D5重鏈可變區(32A1D5-VH)：SEQ ID NO：7
>32A1D5輕鏈可變區(32A1D5-VL)：SEQ ID NO：8
>43B7A4重鏈可變區(43B7A4-VH)：SEQ ID NO：15
>43B7A4輕鏈可變區(43B7A4-VL)：SEQ ID NO：16.
實施例3 嵌合抗體的表達和純化
建立了產生15種嵌合IgGl抗體的方法。序列分析後，嵌合抗體的可變區是基於上述序列藉由基因合成(金斯瑞)產生的。將輕鏈可變區插入包含編碼SEQ ID NO：42所表示的輕鏈恆定區的核酸(SEQ ID NO：41)的表達載體pcDNA3.1(Invitrogen)中，以構建表達抗體輕鏈的載體，將重鏈可變區插入包含編碼SEQ ID NO：40所表示的重鏈恆定區的核酸(SEQ ID NO：39)的表達載體pcDNA3.1(Invitrogen)中，以構建表達抗體重鏈的載體。使用EndoFree Midi Plasmid Kit(TIANGEN,Cat#DP108)提取質粒。此外，根據製造商的說明，使用ExpiCHOTM表達系統(ThermoFisher，Cat#A29133)將重鏈和輕鏈載體以1：1的比例共轉染到CHO-S細胞中。將轉染的細胞在ExpiCHOTM表達培養基中培養12天，然後收集培養上清液並用蛋白A親和層析(GE Healthcare)進行純化。
在尺寸排阻色譜法中測試了所有15個純株。將來自每個純株的20μg樣品注射到TSK G3000SWXL柱中，使用100mM磷酸鈉+100mM Na2SO4，pH 7.0，作為運行緩衝液。執行時間為30分鐘。所有測量均在Waters e2695 HPLC上進行。使用OpenLAB軟體分析資料。13個純株的主峰在SEC中均在95%以上，表明純化的嵌合抗體具有高純度和完整性。
實施例4 嵌合抗體的篩選和鑑定
藉由ELISA結合、細胞水平阻斷實驗進一步測試了所有15種嵌合抗體。還測試了抗體與TNFR2陰性細胞的非特異性結合，這表明抗體不與細胞表面上沒有人TNFR2表達的細胞結合。
抗TNFR2抗體與人/食蟹猴TNFR2蛋白結合
人TNFR2，人Fc標籤蛋白(huTNFR2-huFc，SEQ ID NO：46)或食蟹猴TNFR2，人Fc標籤蛋白(cyno-TNFR2-huFc，SEQ ID NO：47)藉由在PBS(Hyclone，Cat#SH30256.01)中於4℃孵育過夜被固定在96-孔盤(杭州欣友，Cat#100096H)。然後藉由與PBS中的1% BSA在37℃下孵育1小時來封閉盤。封閉後，將盤用PBST(含有0.05% Tween20的PBS)洗滌3次。在稀釋緩衝液(含有0.05%吐溫和0.5% BSA的PBS)中製備逐級稀釋的實施例3中獲得的抗TNFR2抗體和陰性對照IgG(重鏈：SEQ ID NO：43，輕鏈：SEQ ID NO：44，WO2008068246A1)，並與上述固定蛋白在稀釋緩衝液中37℃孵育1小時。然後，將盤用PBST洗滌3次，與在稀釋緩衝液中1/20000稀釋的Peroxidase AffiniPure山羊抗人IgG,F(ab')2片段特異性(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-097)一起在37℃下孵育一小時，然後再次用 PBST洗滌。將50μL/孔TMB(Thermo，Cat#34028)加入盤中，15分鐘後，用1M H2SO4終止反應。測定在450nm至620nm處的吸光度。與人/食蟹猴TNFR2結合的純株的EC50和代表性結合曲線如圖1所示。
結果表明兩種嵌合抗體32A1D5和43B7A4可以結合人(EC50分別為0.04820nM和0.06272nM)和食蟹猴TNFR2蛋白(EC50為0.008201nM和0.008)。
抗TNFR2抗體與在293T細胞的細胞表面上表達的食蟹猴TNFR2結合
建立了基於細胞的結合測定以確定本發明的抗人TNFR2抗體是否可以結合在細胞表面上表達的食蟹猴TNFR2。使用LipofectamineTM 2000轉染試劑(Invitrogen，Cat#11668019)，用編碼食蟹猴TNFR2蛋白(SEQ ID NO：49)的核苷酸轉染293T細胞株。在使用二鹽酸嘌呤黴素(Gibco,Cat#A1113802)篩選細胞後，選擇了高表達食蟹猴TNFR2的細胞庫。將抗TNFR2抗體32A1D5的八點逐級稀釋液(逐級稀釋液，濃度從20μg/mL開始，稀釋4倍)加入細胞中，所得混合物在PBS中4℃孵育30分鐘。然後用PBS洗滌細胞兩次。使用R-PE偶聯的AffiniPure山羊抗人IgG，Fcγ片段特異性(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-116-098)作為二級試劑檢測抗TNFR2抗體與293T細胞上表達的食蟹猴TNFR2的結合活性，其中混合物在4℃下孵育30分鐘，然後用PBS洗滌兩次。然後，將細胞重新懸浮在PBS中。使用BD Accuri C5流式細胞儀(BD Bioscience)進行TNFR2結合分析。結果如圖2A所示。
結果表明，抗體32A1D5特異性結合細胞表面表達的食蟹猴TNFR2，EC50為0.9682nM。
抗-TNFR2抗體阻斷了TNF-α與293T細胞細胞表面表達的人TNFR2的結合
進行基於細胞的測定以確定本發明的抗人TNFR2抗體是否可以阻斷TNF-α與細胞表面表達的人TNFR2的結合。使用LipofectamineTM 2000轉染試劑(Invitrogen，Cat#11668019)用編碼人TNFR2蛋白(SEQ ID NO：48)的核苷酸分子轉染293T細胞株。使用二鹽酸嘌呤黴素(Gibco,Cat#A1113802)篩選後選擇高表達人TNFR2的細胞純株。將濃度從20μg/mL開始和4倍稀釋的抗TNFR2抗體(32A1D5和43B7A4)的八點逐級稀釋液加入細胞中，並將混合物在PBS中於4℃孵育30分鐘。然後將細胞與50μg/mL生物素-TNF-α(ACRO Biosystems,Cat#TNA-H8211)在4℃下孵育30分鐘，然後用PBS洗滌兩次。使用PE-鏈黴親和素(Biolegend，Cat#405203)作為二級試劑檢測生物素-TNF-α與293T細胞表面表達的人TNFR2的結合，其中混合物在PBS中4℃孵育30分鐘然後用PBS洗滌兩次。然後，將細胞重新懸浮在PBS中。使用BD Accuri C5流式細胞儀(BD Bioscience)進行生物素-TNF-α結合分析。結果示於圖2B(對於32A1D5)和圖2C(對於43B7A4)。
結果表明，兩種嵌合抗體可以阻斷細胞表面表達的TNFR2與TNF-α的結合。
實施例5 人源化抗體的產生和表徵
分別對兩種嵌合抗體32A1D5和43B7A4進行人源化。小鼠抗體可變域的序列用於鑑定與鼠框架具有最高同源性的人種系序列。人源化採用CDR移植和回復突變。
32A1D5人源化
根據IMGT資料庫(http：//www.imgt.org)，藉由將6個CDR插入到最合適的人種系框架序列中來人源化抗體。輕鏈的人種系框架序列IGKV1-27*01和重鏈的IGHV2-5*09分別用於CDR移植。變異重鏈可變區(VH/HCVR)Hu32-H1和Hu32-H2是藉由將三個CDRs移植到種系序列上獲得的，並對於Hu32-H2在HCVR上進行S30N的回復突變。
>IGHV2-5*09(32A1D5 VH種系序列)
Figure 110121495-A0305-12-0044-4
Figure 110121495-A0305-12-0044-6
(SEQ ID NO：63)
>Hu32-H1 VH序列：SEQ ID NO：25
>Hu32-H2 VH序列：
Figure 110121495-A0305-12-0044-7
Figure 110121495-A0305-12-0044-8
(SEQ ID NO：64)
輕鏈可變區(LCVR/VL)Hu32-L1、Hu32-L2、Hu32-L3和Hu32-L2V是藉由將三個CDRs移植到種系序列獲得，並且Hu32-L2的回復突變Q38H、Y49H、T69S、F71Y和V83I，Hu32-L3的回復突變Y49H、T69S和F71Y，以及Hu32-L2V的回復突變Q38H、Y49H、T69S和F71Y在各自LCVR上進行。
>IGKVI-27*01(32A1D5 VL種系序列)
Figure 110121495-A0305-12-0045-9
Figure 110121495-A0305-12-0045-10
(SEQ ID NO：65)
>Hu32-L1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKFIAWYQQKPGKVPKLLIYYTSTLQPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQYGVLWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：66)
>Hu32-L2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKFIAWYQHKPGKVPKLLIHYTSTLQPGVPSRFSGSGSGSDYTLTISSLQPEDIATYYCLQYGVLWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：67)
>Hu32-L3：SEQ ID NO：26
>Hu32-L2V：SEQ ID NO：28.
43B7A4人源化
輕鏈的人種系框架序列IGKV3D-7*01和重鏈的IGHV1-18*01分別用於CDR移植。
變體重鏈可變區(HCVR/VH)Hu3-H1、Hu3-H2和Hu3-H3藉由將三個CDR移植到種系序列上獲得，Hu3-H1的回復突變V2I、V67F、M69F、T71L，Hu3-H2的V2I、M69F、T71L和Hu3-H3的V2I、V67F、T68A、M69F、T71L在各自HCVR上進行。
>IGHV1-18*01(43B7A4 VH種系序列)
Figure 110121495-A0305-12-0046-11
Figure 110121495-A0305-12-0046-13
(SEQ ID NO：68)
>Hu3-H1
Figure 110121495-A0305-12-0046-14
Figure 110121495-A0305-12-0046-15
(SEQ ID NO：69)
>Hu3-H2
Figure 110121495-A0305-12-0046-16
Figure 110121495-A0305-12-0046-18
(SEQ ID NO：70)
>Hu3-H3：SEQ ID NO：37
輕鏈可變區(LCVR/VL)Hu3-L1和Hu32-L2藉由將三個CDR直接移植到種系序列上獲得，Hu3-L1的G68A回復突變，Hu3-L2的I58V、A60D、S63T、G68A在各自LCVR上改造。
>IGKV3D-7*01(43B7A4 VL種系序列)
Figure 110121495-A0305-12-0046-19
Figure 110121495-A0305-12-0046-20
(SEQ ID NO：71)
>Hu3-L1：SEQ ID NO：38
>Hu3-L2
Figure 110121495-A0305-12-0047-21
Figure 110121495-A0305-12-0047-22
(SEQ ID NO：72)
將上述重鏈和輕鏈可變區的DNA合成並分別亞選殖到包含編碼人IgGl重鏈恆定區(SEQ ID NO：40，登錄號#P01857)的核苷酸(SEQ ID NO：39)的表達載體pcDNA3.1(Invitrogen)和包含編碼人κ輕鏈恆定區(SEQ ID NO：42，登錄號#P01834)的核苷酸(SEQ ID NO：41)的pcDNA3.1之中。使用EndoFree Midi Plasmid Kit(TIANGEN,Cat#DP108)提取質粒。抗體的表達和純化遵循實施例3中所述的程式。
人源化抗體hu32-C包含VH Hu32-H1和VH Hu32-L3，人源化抗體hu3-E包含VH Hu3-H3和VL Hu3-L1。hu32-C的變體hu32C-V1包含VH Hu32-H1和VL Hu32-L2V。
實施例6 抗TNFR2人源化抗體的評價
初步評價與嵌合抗體的篩選和鑑定程式相符，包括ELISA結合、ELISA封閉、細胞封閉，如實施例4所述。基於這些結果，人源化抗體hu32-C和hu3-E被選擇用於進一步的體外和體內功能評估。
ELISA結合測定按照實施例4進行，不同之處在於抗TNFR2抗體是hu32-C和hu3-E，包被蛋白被人TNFR2、小鼠Fc-標籤(SEQ ID NO：45)替代。
人源化抗體與人TNFR2蛋白結合的結果見圖3A(hu32-C)和圖3B(hu3-E)。
結果顯示兩種人源化抗體均能特異性結合人TNFR2，EC50為0.06970nM(hu32-C)和0.05079nM(hu3-E)。
抗-TNFR2抗體阻斷了TNFR2和TNF-α之間的相互作用
高結合透明聚苯乙烯96孔盤用在碳酸鹽緩衝液中的1μg/mL人TNF-α蛋白、his標籤(Acro Biosystem,Cat#TNA-H5228)以50μL/孔在4℃孵育過夜包被。然後使用洗滌緩衝液(PBS+0.05%吐溫(Tween)20)在自動洗盤機上洗滌盤一次。每孔加入200μL封閉緩衝液(PBS+1% BSA)，室溫孵育1小時。用稀釋緩衝液(PBS+0.5%牛血清白蛋白+0.05%吐溫20)製備逐級稀釋抗體(hu32-C和hu3-E)和陰性對照IgG(起始濃度：20μg/mL(混合前濃度)，4倍稀釋)並以1：1的體積比與0.1μg/mL(混合前濃度)hTNFR2-mFc(SEQ ID NO：45)混合，然後將混合稀釋液加入96孔盤中並在稀釋緩衝液(含有0.05%吐溫20和0.5%牛血清白蛋白的PBS)中在室溫下孵育1小時。在自動洗盤機上用洗滌緩衝液將盤洗滌兩次。然後將稀釋緩衝液中的50μL/孔的HRP偶聯山羊抗小鼠Fc抗體(Jackson Immunoresearch，目錄號#115-035-164)加入盤的每個孔中。之後，將ELISA板在RT溫育60分鐘，然後用250μL/孔洗滌緩衝液洗滌盤兩次。最後，每孔加入50μL/孔的TMB，用1M H2SO4終止反應。測定在450nm-620nm處的吸光度。
人源化抗體阻斷人TNFR2與TNFα結合的結果可見於圖3A(hu32-C)和圖3B(hu3-E)。
結果顯示兩種人源化抗體可以阻斷TNFR2與TNF-α的結合。
還檢測了人源化抗體結合細胞表麵食蟹猴TNFR2和阻斷TNF-α結合細胞表面人TNFR2的能力。測定步驟與實施例4一致。基於細胞的測定結果如圖4所示。
基於細胞的測定結果顯示人源化抗體hu32-C和hu3-E均具有結合TNFR2和阻斷TNF-α-TNFR2相互作用的能力。
實施例7 抗TNFR2抗體的結合親和力
在該實施例中，使用ForteBio Octet RED 96(生物層干涉測量法)測定抗人TNFR2抗體的結合親和力(單價KD)。
簡而言之，IgG Fc捕獲感測器尖端(ForteBio，Cat#18-5060)在室溫下在PBS中水合10分鐘。動力學分析在96孔盤中進行，每個步驟使用以下時間進行：a)在PBS中平衡基線100秒，b)載入抗人TNFR2抗體(hu3-E、hu32-C和hu32C-V1)至至少0.3納米，c)平衡基線1000秒，d)與帶有His標籤的人TNFR2(Sino Biological，Cat#10417-H08H)或食蟹猴TNFR2(Sino Biological，Cat#90102-C08H)以逐級濃度為100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM和1.56nM分別締合80秒，和e)在PBS中解離600秒。使用Octet軟體對資料集進行1：1全域擬合模型擬合。
測定了三種抗人TNFR2抗體的親和力並將其列於如下表3中。
Figure 110121495-A0305-12-0050-23
結果表明，這三種抗體都與人類TNFR2特異性結合。其中，抗體hu3-E顯示出對人TNFR2的5.32nM的單價KD，對食蟹猴TNFR2為3.62nM；抗體hu32-C顯示出對人TNFR2的0.61nM的單價KD，對食蟹猴TNFR2為0.37nM；抗體hu32C-V1顯示出對人TNFR2的0.91nM的單價KD，對食蟹猴TNFR2為0.41nM。
實施例8人源化抗體的體外評價
Figure 110121495-A0305-12-0051-160
共刺激人CD8+T細胞釋放IFNγ
人PBMC獲自健康供體。在含有Lymphoprep密度梯度試劑(StemCell Technologies)的SepMate-50管(StemCell Technologies)中分離單個核細胞。
根據製造商的說明，用陰性選擇試劑盒(Miltenyi,Cat#130-096-495)純化總CD8+T細胞。96孔盤(Corning，Cat#3799)用0.5μg/mL功能級抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)和逐級稀釋的抗TNFR2抗體(hu3-E和hu32-C)或陰性對照IgG(從60μg/mL的起始濃度稀釋和3倍逐級稀釋)在PBS中於4℃過夜包被。第二天，用DPBS緩衝液(Hyclone，Cat#SH30256.01)洗滌包被的盤兩次。向每個孔中加入200μl培養基(包含90% RPMI 1640(Gibco，Cat#22400)完全培養基，10% FBS(Gibco，Cat#10099-141)和1μg/ml可溶性抗CD28(Biolegend，Cat #302934))中的1×105 CD8+T細胞，，37℃培養72h。收集培養物上清液並用ELISA試劑盒(R&D Systems，Cat#DY202)測試IFNγ水準。結果如圖5所示。圖中的測定緩衝液指PBS中僅含有0.5μg/ml功能級抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)。
結果表明，hu3-E可以以劑量依賴性方式刺激CD8+T細胞釋放IFNγ，而hu32-C在上述濃度下無明顯作用。
Figure 110121495-A0305-12-0051-161
抗TNFR2抗體共刺激介導的T細胞增殖
人PBMC獲自健康供體。在含有Lymphoprep密度梯度試劑(StemCell Technologies)的SepMate-50管(StemCell Technologies)中分離單個核細胞，如上所述。使用陰性選擇試劑盒(Miltenyi，Cat#130-096-495和 Cat#130-096-533)純化總CD8+和CD4+T細胞以備後用。96孔盤(Corning，Cat#3799)用0.5μg/ml功能級抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)和逐級稀釋的抗TNFR2抗體(hu3-E和hu32-C)或陰性對照IgG(從60μg/mL的起始濃度稀釋和3倍逐級稀釋)在PBS中於4℃過夜包被。第二天，用DPBS緩衝液(Hyclone，Cat#SH30256.01)洗滌包被的盤兩次。在每孔中加入200μl培養基(包含90% RPMI 1640(Gibco，Cat#22400)完全培養基，10% FBS(Gibco，Cat#10099-141)和1μg/ml可溶性抗CD28(Biolegend),Cat#302934))中的1×105 CD8+或CD4+ T細胞，37℃培養72h。72小時後，棄去每孔100μl細胞培養上清液，加入100μl CellTiter-Glo®發光細胞活力測定試劑(Promega，Cat#G7572)並充分混合。5分鐘後，將100μl混合物轉移到新的96孔檢測盤(Corning，Cat#3917)。使用酶標儀F200(Tecan,Cat#F200)讀取測定盤。結果如圖6所示。圖中的檢測緩衝液指僅含有0.5μg/ml功能級抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)包被緩衝液。
結果進一步證實了hu3-E可以刺激T細胞增殖，而hu32-C在上述濃度下沒有明顯作用。
Figure 110121495-A0305-12-0052-159
體外抗TNFR2抗體共刺激介導的T細胞活化依賴於Fc交聯
人PBMC獲自健康供體。在含有Lymphoprep密度梯度試劑(StemCell Technologies)的SepMate-50管(StemCell Technologies)中分離單個核細胞。
總CD8+T細胞用陰性選擇試劑盒(Miltenyi，Cat#130-096-495)純化以備後用。96孔盤(Corning，Cat#3799)用0.5μg/ml功能級抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)和逐級稀釋的抗TNFR2抗體(hu3-E和hu32 -C)或陰性對照IgG(從30μg/mL的起始濃度稀釋，並3倍逐級稀釋)在4℃過夜包被，用於盤結合抗體測定。對於可溶性抗體測定，96孔盤僅用0.5μg/ml功能級抗CD3包被。
第二天，用DPBS緩衝液(Hyclcne，Cat#SH30256.01)洗滌包被的盤兩次。對於盤結合抗體測定，向每孔加入200μl培養基(包含90% RPMI 1640(Gibco,Cat#22400)完全培養基、10% FBS(Gibco,Cat#10099-141)和1μg/ml可溶性抗CD28(Biolegend，Cat#302934))中的1×105 CD8+ T細胞，37℃培養72h。
對於可溶性抗體測定，向每個孔中添加在200μl培養基(包含90% RPMI 1640(Gibco,Cat#22400)完全培養基、10% FBS(Gibco,Cat#10099-141)和1μg/ml可溶性抗CD28(Biolegend,Cat#302934))中的1 x 105 CD8+ T細胞，然後分別加入逐級稀釋的抗TNFR2抗體(hu3-E和hu32-C)和陰性對照IgG(從30μg/mL的起始濃度稀釋和3倍逐級稀釋)培養物於37℃培養72h。72小時後，收集培養上清液並用ELISA試劑盒(R&D Systems，Cat#DY202)檢測IFNγ水準，結果如圖7所示。
結果表明hu3-E可以藉由體外共刺激啟動T細胞，這取決於Fc交聯。
實施例9 人源化抗體在大鼠體內的藥物代謝動力學
評價了大鼠中抗TNFR2人源化抗體的藥物代謝動力學特徵。研究中涉及動物護理和使用的程式由PhamaLagancy審查和批准。
每種抗體使用三隻未經處理的大鼠(上海Sippr-BK實驗動物有限公司)。在研究中，抗TNFR2抗體(hu3-E、hu32-C)分別以10mg/kg的單劑量靜脈注射到大鼠體內。在0到336小時的一系列時間點(0-14天，第0天、第1天的10分鐘、30分鐘、1小時、4小時、6小時和第2天、第4天、第7、第10天和第14天)獲取血樣。所有樣品均經處理獲得血清，血清在-70至-86℃冷凍保存待分析。測定血清中存在的抗-TNFR2抗體的濃度。藥物代謝動力學參數列於表4中。
人TNFR2，人Fc標籤蛋白(huTNFR2-huFc，SEQ ID NO：46)藉由在PBS(Hyclone,Cat#SH30256.01)中以0.5μg/mL的濃度4℃過夜固定在96孔盤上(Costar,Cat#42592))。然後藉由與PBS中的1% BSA在37℃下孵育1小時來封閉盤。封閉後，將板用PBST(含有0.05% Tween20的PBS)洗滌3次。抗TNFR2抗體(hu32-C或hu3-E)在血清稀釋緩衝液(含有0.05% Tween 20和0.5% BSA的PBS，包括2% v/v大鼠血清)中稀釋為0.12μg/mL，並3倍逐級稀釋6次，共7個濃度的抗體溶液獲取作為標準曲線。同時用血清稀釋緩衝液分別稀釋40ng/mL、4ng/mL和0.4ng/mL抗體作為高、中、低質控。所有大鼠血清樣品均用預劑量混合大鼠血清和稀釋緩衝液(含0.05% Tween 20和0.5% BSA的PBS)稀釋，使終濃度保持在40-0.4ng/mL範圍內，並在樣品稀釋液中含有2% v/v大鼠血清。將標準曲線、質控品和樣品加入平盤中，37℃孵育1小時。然後，將板用PBST洗滌3次，與以1/20,000稀釋在稀釋緩衝液中的過氧化物酶AffiniPure羊抗人IgG,F(ab')2片段特異性(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-097)一起在37℃下孵育一小時，然後再次用PBST洗滌。將50 μL/孔TMB(Thermo，Cat#34028)加入盤中，15分鐘後，用1M H2SO4停止反應。測定在450nm-620nm處的吸光度。
Figure 110121495-A0305-12-0055-24
兩種人源化抗體hu32-C和hu3-E在大鼠體內的藥物代謝動力學均正常。
實施例10 與TNFR超家族蛋白的同家族交叉結合
雖然融合瘤純株不能與TNFR1、LTβR和骨保護素結合，但存在其他類型的TNFR超家族蛋白。在這裡，我們測試了人源化抗體hu3-E和hu32-C與人4-1BB、CD40、OX40、GITR、CD27和HVEM蛋白的結合。
4-1BB(Sino Biological,Cat#10041-H08H)、CD40(Sino Biological,Cat#10774-H08H)、OX40(Sino Biological,Cat#10481-H08H)、GITR(Sino Biological,Cat#13643-H08H)、CD27(Sino Biological,Cat# 10039-H31H)和HVEM(Sino Biological,Cat# 10334-H03H)藉由與PBS(Hyclone,Cat#SH30256.01)在4℃下孵育過夜而固定在96孔盤上。將平板與PBS中的1% BSA在37℃下孵育1小時進行封閉。封閉後，將盤用PBST(含有0.05% Tween20的PBS)洗滌3次。在稀釋緩衝液(含0.05% Tween20和0.5% BSA的PBS)中製備逐級稀釋的抗TNFR2抗體(起始濃度0.4μg/mL，3倍稀釋)並加入平盤中，然後在37℃下孵育1小時。然後用PBST(含有0.05% Tween20的PBS)洗滌板3次。然後將在稀釋緩衝液中以1：20000稀釋的過氧化物酶標記的山羊抗人F(ab’)2 IgG(JacksonImmuno Research，Cat# 109-035-097)添加到盤的每個孔中，作為ELISA盤。之後，將ELISA盤在RT溫育60分鐘，然後用PBST洗滌3次。最後，將50μL/孔TMB(Thermo,Cat#34028)添加到每個孔中，並使用1M H2SO4終止反應。在微孔盤讀數器上在450nm處讀取盤。
結果顯示在圖8中。這表明人源化抗體hu3-E和hu32-C不結合人4-1BB、CD40、OX40、GITR、CD27或HVEM蛋白。
實施例11 抗TNFR2抗體具有體內抗腫瘤作用
在患有結腸癌的hTNFR2 KI小鼠中研究了抗TNFR2抗體的體內功效。
對於本文的實驗，使用了表達人TNFR2細胞外部分的4-5週人源化小鼠C57BL/6J-Tnfrsf1b em2(hTNFRSF1B)Smoc (上海南方模式生物科技股份有限公司)
使用逆轉錄病毒轉導，用編碼卵清蛋白(OVA GenBank：AAB59956.1)的核酸轉導MC38細胞(和元生物技術(上海)股份有限公司)。隨後藉由有限稀釋選殖細胞。選擇高表達OVA蛋白的純株作為MC38-OVA純株。MC38-OVA純株保持在含有10%胎牛血清和4μg/mL嘌呤黴素(Gibco，Cat#A11138-03)的DMEM(Gibco，Cat#11995-065)中。
將5-6週的C57BL/6J-Tnfrsf1b em2(hTNFRSF1B)Smoc 小鼠皮下植入1x106 MC38-OVA細胞，並在第0天平均腫瘤體積達到約60mm3(LengthxWidth2/2)時隨機分為3組。在第0、3、7、10天分別腹腔注射hu32-C(15mg/kg)、hu3-E(15mg/kg)和PBS。在研究過程中，每週兩次使用卡尺測量腫瘤體積。
與PBS組相比，用兩種抗TNFR2抗體處理均導致顯著的腫瘤生長抑制。資料如下表5所示。
Figure 110121495-A0305-12-0057-25
a 腫瘤體積資料表示為平均值±SEM；
b TGI=(1-治療組相對腫瘤體積/PBS組相對腫瘤體積)*100%
c 與PBS組相比，進行雙向方差分析，然後進行Tukey多重比較檢驗.
實施例12 hu32-C純度的改進
在FR區上進行單點突變以提高hu32-C的純度。在hu32-C輕鏈的FR區進行Q38H取代，得到抗體，命名為hu32C-V1。hu32-C和hu32C-V1都在相同的產物下表達和純化，如實施例3中所述。產物的純度藉由SEC-HPLC測定並且親和力藉由Fortebio測定(如實施例7中所述)。SEC-HPLC結果見圖9，親和結果見表3。
從結果可以看出，hu32C-V1的親和力與hu32-C一致，而表達產物的純度得到顯著改進。在SEC-HPLC上，抗體主峰的比例從91.4%(hu32-C)增加到97.0%(hu32C-V1)。
結果表明，Q38H突變可以提高抗體hu32-C的純度，同時不影響其性質如親和力。
實施例13 表位作圖
為了檢測本發明的人源化抗體與其靶蛋白人TNFR2上結合的表位，構建了來自人TNFR2(SEQ ID NO：50)胞外域的11個片段以分別替換小鼠TNFR2蛋白的胞外結構域(SEQ ID NO：51)的相應部分。結果，獲得了11個小鼠TNFR2變體(SEQ ID NO：52-62)，其中人TNFR2的每個片段替換了相應區域。
構建了十一個TNFR2蛋白質區段序列並列在下表6中，如下。
Figure 110121495-A0305-12-0059-26
根據結合測定ELISA，測試了11個變體、人TNFR2和小鼠TNFR2蛋白與本發明的抗體(hu3-E和hu32C-V1)的結合。將不同的TNFR2蛋白以0.5μg/mL包被在盤上並封閉過夜。抗體從0.4μg/mL的起始濃度開始稀釋，3倍逐級稀釋，加入微量板中，37℃孵育。後續步驟與ELISA結合方法一致(見實施例4)。
結合測定的結果顯示hu3-E和hu32C-V1均與人TNFR2結合，但不與小鼠TNFR2結合。
結果進一步表明，人源化抗體hu3-E結合人TNFR2在1L-31C上的表位(結合019-0-0.5)。人源化抗體hu3-E不與人TNFR2蛋白變體019-1、019-2、019-3、019-4、019-5、019-6、019-0.5-1和019-0.5-2結合，除了019-0-0.5和019-0-1.因此，根據人TNFR2的晶體結構分析，對人TNFR2分別進行Q4A、E13A、S16A和Q26A的胺基酸突變，並按照上述步驟在ELISA結合法中檢測與hu3-E的結合。結果表明，人TNFR2序列第26位穀胺醯胺是hu3-E與人TNFR2結合的關鍵胺基酸。hu3-E抗體結合不同TNFR2的結果見圖10。
另一種人源化抗體hu32-C結合1L-96C(結合019-12)TNFR2蛋白。突變體hu32C-V1具有與hu32-C相同的人TNFR2結合表位。hu32C-V1抗體與不同TNFR2片段結合的結果如圖11所示。人源化抗體hu32C-V1僅結合019-12，其他人TNFR2蛋白變體019-2、019-3、019-4、019-5、019-6、019-0.5-1、019-0.5-2和019-0-0.5不與hu32C-V1結合。此外，019-1和019-0-1顯示出微弱但不可忽略的與hu32C-V1結合的信號，這表明序列17T-54D可能包含了hu32C-V1的表位中的胺基酸。
實施例14 與或不與抗小鼠PD1抗體組合、和有或沒有Fc效應的抗TNFR2抗體在體內的抗腫瘤作用
在患有結腸癌的hTNFR2 KI小鼠中研究了抗TNFR2抗體的體內功效。
構建了具有L234A，L235A，D265A，P329A(EU編號)的胺基酸突變(去除Fc功能)的抗TNFR2抗體Hu3-E(mu)。抗體的表達和純化遵循如實施例3中所述的步驟。
對於此實驗，表達人TNFR2胞外部分的4-5週人源化小鼠C57BL/6J-Tnfrsf1bem2(hTNFRSF1B)Smoc 購自上海南方模式生物科技股份有限公司。
使用逆轉錄病毒轉導，用編碼卵清蛋白(OVA GenBank：AAB59956.1)的核酸轉導MC38細胞(和元生物技術(上海)股份有限公司)。隨後藉由有限稀釋選殖細胞。選擇高表達OVA蛋白的純株作為MC38-OVA純株。將MC38-OVA純株維持在含有10%胎牛血清和4μg/mL嘌呤黴素(Gibco，Cat#A11138-03)的DMEM(Gibco，Cat#11995-065)中。
5-6週的C57BL/6J-Tnfrsf1b em2(hTNFRSF1B)Smoc 小鼠皮下植入1x106 MC38-OVA細胞，並在第0天平均腫瘤體積達到80-100mm3(LxW2/2)時隨機分為6組。在第0、3、7、10、14天，分別對小鼠腹腔注射hu3-E(mu)(10mg/kg)、hu3-E(3mg/kg)、hu3-E(10mg/kg)、抗PD1抗體(Bio X Cell，Cat#BE0146)(1mg/kg)、抗PD1抗體(1mg/kg)與hu3-E(10mg/kg)聯用以及PBS。在研究期間每週兩次藉由卡尺測量監測腫瘤體積。每組6隻小鼠。
與PBS組相比，兩種抗TNFR2抗體的處理都導致顯著的腫瘤生長抑制。Fc部分與hu3-E的功效直接相關。藉由突變去除Fc-FcγR相互作用會降低抗TNFR2抗體的抗腫瘤作用；同時，抗TNFR2抗體與抗PD1抗體聯用顯示出顯著的抗腫瘤作用。聯合使用效果優於單獨使用這兩種抗體。分組細節和結果如下表7所示。
Figure 110121495-A0305-12-0062-27
a 腫瘤體積資料表示為平均值±SEM；
b TGI=(1-治療組相對腫瘤體積/PBS組相對腫瘤體積)*100%
c P<0.01與PBS組顯著不同(Dunnett的多重比較檢驗).
實施例15 抗TNFR2抗體與活化的PBMC上表達的人TNFR2結合
建立了基於細胞的結合測定以確定本發明的抗人TNFR2抗體是否可以結合在活化的PBMC上表達的人TNFR2。人PBMC來自健康供體。PBMC藉由包被的功能級抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85，1μg/mL)刺激2天，然後用完全培養基(包含90% RPMI 1640 HEPES(Gibco，Cat#22400089)和10% FBS(Gibco，Cat#10099-141))培養。然後再將100IU/mL IL-2添加到培養基中再培養7天。然後收集PBMC並使用PBS(Hyclone，Cat#SH30256.01)洗滌兩次。1.5×105 PBMC細胞分別用逐級稀釋的抗TNFR2抗體hu3-E(從起始濃度20μg/ml稀釋，4倍逐級稀釋)和陰性對照 IgG重新懸浮，4℃孵育30分鐘。使用PBS洗滌後，用R-PE偶聯的AffiniPure山羊抗人IgG、Fcγ片段特異性(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-116-098)作為二級試劑(1：200稀釋)重新懸浮細胞。將混合物在PBS中於4℃孵育30分鐘，然後用PBS洗滌兩次。然後，將細胞重新懸浮於PBS中。使用BD Accuri C5流式細胞儀(BD Bioscience)進行特異性結合的分析。
結果顯示在圖12中。顯示hu3-E可以結合在來自兩個供體的活化PBMC上表達的TNFR2。而IgG對照對來自兩個供體的活化的PBMC沒有特異性結合能力。
實施例16 體外對Treg的ADCC效應
96孔盤(Corning，Cat#3599)在4℃下用3μg/ml功能級抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)包被過夜。第二天，丟棄包被的緩衝液並且將盤洗滌兩次以備後用。從Schbio Biotech購買的來自健康供體的PBMC細胞被解凍並收集。根據製造商的說明，使用陰性選擇試劑盒(Miltenyi，Cat#130-096-533)純化來自PBMC細胞的總CD4+ T細胞。並將純化的CD4+T細胞以1~5×104個細胞/孔在200μL Treg誘導緩衝液(RPMI1640培養基，含10% FBS、20ng/mL TGFβ1、100IU/mL IL-2、2μg/mL anti-CD28和0.04mM β-巰基乙醇)中接種於抗CD3包被的96孔盤中，並培養5天，以獲得誘導的Treg細胞供後續使用。
用陰性選擇試劑盒(Miltenyi,Cat#130-092-657)根據製造商的說明從PBMC細胞中純化總NK細胞。在ADCC測定中，體外誘導的Treg細胞在50μl測定緩衝液(含1% FBS(Gibco，Cat#10099-141)的99% MEM-α (Gibco，Cat#41061-029))中以20,000個細胞/孔添加到96孔測定盤(Corning，Cat#3599)。hu3-E或hu32-C的6點逐級稀釋液(逐級稀釋液，最終測定濃度從1.2μg/mL開始並5倍稀釋)和抗TNFR2抗體-001-H10(BioInvent，WO2020089474A1，重鏈：SEQ ID NO：74；輕鏈：SEQ ID NO：75)作為陽性對照按50μl/孔分別加入細胞。然後的純化人NK效應細胞在100μl含有1% FBS(Gibco，Cat#10099-141)的99% MEM-α(Gibco，Cat#41061-029)中以200,000個細胞/孔和200IU/ml人重組IL-2測定緩衝液加入盤中。將96孔盤在37℃、5%CO2下孵育24小時。孵育後，將96孔盤以低速(2000rpm)離心3分鐘，使細胞沉澱。然後，從盤中小心地吸出50μL/孔的上清液並轉移到新的96孔盤中。將等體積的LDH細胞毒性檢測溶液(Roche，Cat#11644793001)加入盤中並在室溫下孵育30分鐘。藉由Infinite F50讀板儀在490nm波長處讀取吸光度。結果如圖13所示。
結果表明hu3-E不能對誘導的Treg細胞誘導ADCC作用，而hu32-C可以誘導對細胞的ADCC作用。
實施例17 體外對CD8+T細胞的ADCC效應
96孔盤(Corning，Cat#3599)在4℃下用1μg/ml功能級抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)包被過夜。第二天，丟棄包被的緩衝液並且將盤洗滌兩次以備後用。從Schbio Biotech購買的來自健康供體的PBMC細胞被解凍並收集。根據製造商的說明，使用陰性選擇試劑盒(Miltenyi，Cat#130-096-495)從PBMC細胞純化總CD8+ T細胞。將純化的CD8+T細胞以1×105個細胞/孔在200μL檢測緩衝液(含10% FBS、1μg/mL抗CD28的RPMI1640培 養基)中接種到抗CD3包被的96-孔盤中並培養4天獲得活化的CD8+T細胞供後續使用。
用陰性選擇試劑盒(Miltenyi,Cat#130-092-657)根據製造商的說明從PBMC細胞中純化總NK細胞。在ADCC測定中，體外活化CD8+T細胞在50μl測定緩衝液(99% MEM-α(Gibco，Cat#41061-029，含有1% FBS(Gibco，Cat#10099-141))以15,000個細胞/孔加入96孔測定盤(Corning,Cat#3599)。hu3-E或hu32-C的6點逐級稀釋液(逐級稀釋液，最終測定濃度從1.2μg/mL開始並5倍稀釋)和抗TNFR2抗體-001-H10(BioInvent，WO2020089474A1，重鏈：SEQ ID NO：74；輕鏈：SEQ ID NO：75)作為陽性對照以50μl/孔分別加入細胞。然後純化人NK效應細胞在含有1% FBS(Gibco，Cat#10099-141)的100μl 99% MEM-α(Gibco，Cat#41061-029)中以150,000個細胞/孔，和200IU/ml人重組IL-2加入盤中。將96孔盤在37℃、5%CO2下孵育24小時。孵育後，將96孔盤以低速(2000rpm)離心3分鐘，使細胞沉澱。然後，從盤中小心地吸出50μL/孔的上清液並轉移到新的96孔盤中。將等體積的LDH細胞毒性檢測溶液(Roche，Cat#11644793001)加入盤中並在室溫下孵育30分鐘。藉由Infinite F50讀盤儀在490nm波長處讀取吸光度。結果如圖14所示。
結果表明hu3-E對誘導的CD8+T細胞不能誘導ADCC作用，而hu32-C可以誘導對細胞的ADCC作用。
序列表
Ig blast and abysis序列分析，結果以Kabat格式描述。
Figure 110121495-A0305-12-0066-155
嵌合抗體序列
Figure 110121495-A0305-12-0066-156
32A1D5序列
Figure 110121495-A0305-12-0066-28
>32A1D5-VH：SEQ ID NO：7
Figure 110121495-A0305-12-0066-30
>32A1D5-VL：SEQ ID NO：8 DIQMTQSPSSLSASLGDKVTITC KASQNINKFIA WYQHKPGEGPRLLIH YTSTLQP GIPSRFSGSGSGSDYSFSINNLEPEDIASYYC LQYGVLWT FGGGTKLEIK
Figure 110121495-A0305-12-0066-157
43B7A4序列
Figure 110121495-A0305-12-0066-29
>43B7A4-VH：SEQ ID NO：15 QAQIQLVQSGPELKKPGETVLISCKASGYTFT TYGMS WVKQAPGKGLKWMG WIHTYSGVPTYADDFKG RFAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTATYFCAR GLYGVDY WGQGTTLTVSS
>43B7A4-VL：SEQ ID NO：16 NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSC KASENVVTYVS WYQQKPEQSPKLLIY GASNRYT GVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHC GQSYTYPYT FGGGTTLEIK
Figure 110121495-A0305-12-0066-158
hu32-C序列(Hu32-H1/Hu32-L3)
Figure 110121495-A0305-12-0067-31
>VH核酸序列(Hu32-H1)：SEQ ID NO：23
Figure 110121495-A0305-12-0067-32
>VL核酸序列(Hu32-L3)：SEQ ID NO：24
Figure 110121495-A0305-12-0067-33
>hu32-C(Hu32-H1/Hu32-L3)
>VH胺基酸序列(Hu32-H1)：SEQ ID NO：25
Figure 110121495-A0305-12-0067-34
>VL胺基酸序列(Hu32-L3)：SEQ ID NO：26 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC KASQNINKFIA WYQQKPGKVPKLLIH YTSTLQP GVPSRFSGSGSGSDYTLTISSLQPEDVATYYC LQYGVLWT FGGGTKVEIK
Figure 110121495-A0305-12-0068-154
hu32C-V1序列(Hu32-H1/Hu32-L2V)(Igblast and abysis分析，結果以Kabat格式描述)
Figure 110121495-A0305-12-0068-35
>hu32C-V1(Hu32-H1/Hu32-L2V)
VH核酸序列(Hu32-H1)：SEQ ID NO：23
Figure 110121495-A0305-12-0068-36
>VL核酸序列(Hu32-L2V)：SEQ ID NO：27
Figure 110121495-A0305-12-0068-37
>VH胺基酸序列(Hu32-H1)：SEQ ID NO：25
Figure 110121495-A0305-12-0068-39
>VL胺基酸序列(Hu32-L2V)：SEQ ID NO：28 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC KASQNINKFIA WYQHKPGKVPKLLIH YTSTLQP GVPSRFSGSGSGSDYTLTISSLQPEDVATYYC LQYGVLWT FGGGTKVEIK
Figure 110121495-A0305-12-0069-153
hu3-E(Hu3-H3/Hu3-L1)(Igblast and abysis分析，結果以Kabat格式描述)和Hu3-E(mu)((Hu3-H3/Hu3-L1，只突變Fc區，L234A，L235A，D265A，P329A(Eu編號)突變)序列
Figure 110121495-A0305-12-0069-41
>VH核酸序列(Hu3-H3)：SEQ ID NO：35
Figure 110121495-A0305-12-0069-42
>VL核酸序列(Hu3-L1)：SEQ ID NO：36
Figure 110121495-A0305-12-0069-43
>VH胺基酸序列(Hu3-H3)：SEQ ID NO：37 QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT TYGMS WVRQAPGQGLEWMG WIHTYSGVPTYADDFKG RFAFTLDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR GLYGVDY WGQGTLVTVSS
>VL胺基酸序列(Hu3-L1)：SEQ ID NO：38 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSC KASENVVTYVS WYQQKPGQAPRLLIY GASNRYT GIPARFSGSGSATDFTLTISSLQPEDFAVYYC GQSYTYPYT FGQGTKLEIK
Figure 110121495-A0305-12-0070-150
嵌合抗體32A1D5和43B7A4，和人源化抗體hu32-C(Hu32-H1/Hu32-L3)hu32C-V1(Hu32-H1/Hu32-L2V)和hu3-E(Hu3-H3/Hu3-L1)的CH：P01857 https：//www.uniprot.org/uniprot/P01857
>CH核酸序列：SEQ ID NO：39
Figure 110121495-A0305-12-0070-44
>CH胺基酸序列：SEQ ID NO：40
Figure 110121495-A0305-12-0070-45
Figure 110121495-A0305-12-0070-151
hu3-E(mu)CH(Hu3-H3/Hu3-L1)
>CH胺基酸序列：SEQ ID NO：73
Figure 110121495-A0305-12-0070-46
Figure 110121495-A0305-12-0070-152
嵌合抗體32A1D5和43B7A4，和人源化抗體hu32-C(Hu32-H1/Hu32-L3)hu32C-V1(Hu32-H1/Hu32-L2V)和hu3-E(Hu3-H3/Hu3-L1)和Hu3-E(mu)(Hu3-H3/Hu3-L1)的CL：P01834 https：//www.uniprot.org/uniprot/P01834
>CL核酸序列：SEQ ID NO：41
Figure 110121495-A0305-12-0071-47
>CL胺基酸序列：SEQ ID NO：42 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
Figure 110121495-A0305-12-0072-148
IgG(陰性對照)
WO2008068246A1福抗韋單抗
>重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：43
Figure 110121495-A0305-12-0072-48
>輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：44
Figure 110121495-A0305-12-0072-49
Figure 110121495-A0305-12-0072-149
huTNFR2胺基酸序列
>huTNFR2-mFc胺基酸序列：SEQ ID NO：45
Figure 110121495-A0305-12-0072-50
>huTNFR2-huFc胺基酸序列：SEQ ID NO：46
Figure 110121495-A0305-12-0072-51
>cyno-TNFR2-huFc胺基酸序列：SEQ ID NO：47
Figure 110121495-A0305-12-0073-52
Figure 110121495-A0305-12-0073-145
細胞篩選和細胞免疫表達序列
>HuTNFR2：SEQ ID NO：48
Figure 110121495-A0305-12-0073-53
>CynoTNFR2：SEQ ID NO：49
Figure 110121495-A0305-12-0073-54
Figure 110121495-A0305-12-0073-146
抗人TNFR2抗體表位作圖
Figure 110121495-A0305-12-0073-147
(信號肽加底線)
>人TNFR2胞外域：SEQ ID NO：50
Figure 110121495-A0305-12-0073-55
>小鼠TNFR2胞外域：SEQ ID NO：51
Figure 110121495-A0305-12-0073-56
Figure 110121495-A0305-12-0074-57
>019-1：SEQ ID NO：52
Figure 110121495-A0305-12-0074-58
>019-2：SEQ ID NO：53
Figure 110121495-A0305-12-0074-59
>019-3：SEQ ID NO：54
Figure 110121495-A0305-12-0074-60
>019-4：SEQ ID NO：55
Figure 110121495-A0305-12-0074-61
Figure 110121495-A0305-12-0075-62
>019-5：SEQ ID NO：56
Figure 110121495-A0305-12-0075-63
>019-6：SEQ ID NO：57
Figure 110121495-A0305-12-0075-64
>019-0-0.5：SEQ ID NO：58
Figure 110121495-A0305-12-0075-65
>019-0-1：SEQ ID NO：59
Figure 110121495-A0305-12-0075-66
Figure 110121495-A0305-12-0076-67
>019-0.5-1：SEQ ID NO：60
Figure 110121495-A0305-12-0076-68
>019-0-0.5-2：SEQ ID NO：61
Figure 110121495-A0305-12-0076-69
>019-12：SEQ ID NO：62
Figure 110121495-A0305-12-0076-70
>抗TNFR2抗體-001-H10
重鏈：SEQ ID NO：74
Figure 110121495-A0305-12-0076-71
Figure 110121495-A0305-12-0077-72
輕鏈：SEQ ID NO：75
Figure 110121495-A0305-12-0077-73
Figure 110121495-A0305-15-0001-74
Figure 110121495-A0305-15-0002-75
Figure 110121495-A0305-15-0003-76
Figure 110121495-A0305-15-0004-77
Figure 110121495-A0305-15-0005-78
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Claims (32)

  1. 一種抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：(i)分別由SEQ ID NO：1、2和3所表示的序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分別由SEQ ID NO：4、5和6所表示的序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3；(ii)分別由SEQ ID NO：9、10和11所表示的序列組成的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分別由SEQ ID NO：12、13和14所表示的序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  2. 根據請求項1所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：7、15、25或37所表示的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
  3. 根據請求項1所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：8、16、26、28或38表示的胺基酸序列或由其組成。
  4. 根據請求項1所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其包含：(1)包含或由SEQ ID NO：7表示的胺基酸序列組成的重鏈可變區，和包含或由SEQ ID NO：8表示的胺基酸序列組成的輕鏈可變區；(2)包含或由SEQ ID NO：15表示的胺基酸序列組成的重鏈可變區，和包含或由SEQ ID NO：16表示的胺基酸序列組成的輕鏈可變區； (3)包含或由SEQ ID NO：25表示的胺基酸序列組成的重鏈可變區，和包含或由SEQ ID NO：26表示的胺基酸序列組成的輕鏈可變區；(4)包含或由SEQ ID NO：25表示的胺基酸序列組成的重鏈可變區，和包含或由SEQ ID NO：28表示的胺基酸序列組成的輕鏈可變區；(5)包含或由SEQ ID NO：37表示的胺基酸序列組成的重鏈可變區，和包含或由SEQ ID NO：38表示的胺基酸序列組成的輕鏈可變區。
  5. 根據請求項1至4中任一項所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其進一步包含重鏈恆定區或輕鏈恆定區，或重鏈恆定區和輕鏈恆定區。
  6. 根據請求項5所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈恆定區是或源自人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4重鏈恆定區。
  7. 根據請求項5所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈恆定區包含(a)與SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：73所表示的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；或者(b)由SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：73所表示的胺基酸序列組成。
  8. 根據請求項5所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其中所述輕鏈恆定區是或源自人κ或λ輕鏈恆定區。
  9. 根據請求項8所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈恆定區包含(a)與SEQ ID NO：42所表示的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；或者(b)SEQ ID NO：42所表示的胺基酸序列或由其組成。
  10. 根據請求項1至4和6至9中任一項所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體是單株抗體。
  11. 根據請求項1至4和6至9中任一項所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
  12. 根據請求項1至4和6至9中任一項所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗原結合片段選自Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、單鏈抗體scFv、(Fab')2、或雙體域抗體(dAb)。
  13. 根據請求項1至4和6至9中任一項所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體是雙特異性或多特異性抗體分子。
  14. 根據請求項13所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其中，所述雙特異性抗體分子結合TNFR2和免疫檢查點。
  15. 一種分離的核酸，其編碼根據請求項1至14中任一項所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段的任何一條或多條鏈。
  16. 一種包含根據請求項15的核酸的載體，其中，所述載體是表達載體。
  17. 一種包含請求項15所述的分離的核酸或請求項16所述的載體的宿主細胞。
  18. 一種製備抗TNFR2抗體或其抗原結合片段的方法，包括在適合於表達編碼根據請求項1至14任一項的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段的核酸的條件下培養請求項17所述的宿主細胞，任選地所述方法進一步包括從宿主細胞回收所述抗TNFR2抗體或其抗原結合片段。
  19. 一種免疫綴合物，其包含根據請求項1至14中任一項的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段和其他活性劑。
  20. 根據請求項19所述的免疫綴合物，其中，該活性劑為治療劑 或標記物或細胞毒類藥物。
  21. 一種藥物組成物，其包含根據請求項1至14中任一項所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，或根據請求項19或20所述的免疫綴合物，以及任選的藥學上可接受的輔助劑。
  22. 一種組合產品，包含根據請求項1至14中任一項的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，或根據請求項19或20的免疫綴合物，以及一種或多種其他治療劑。
  23. 根據請求項22所述的組合產品，其中，該治療劑選自化療劑，其他抗體、細胞毒類藥物、疫苗、抗感染劑、小分子實體或免疫調節劑。
  24. 根據請求項23所述的組合產品，其中，該其他抗體是PD-1或PD-L1抗體。
  25. 一種根據請求項1至14中任一項的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，或根據請求項19或20的免疫綴合物，或根據請求項21的藥物組成物，或根據請求項22至24中任一項的組合產品在製備藥物中的用途，該藥物用於在受試者中啟動T細胞或誘導T細胞介導的抗腫瘤活性或刺激T細胞增殖。
  26. 一種根據請求項1至14中任一項的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，或根據請求項19或20的免疫綴合物，或根據請求項21的藥物組成物，或根據請求項22至24中任一項的組合產品在製備藥物中的用途，該藥物用於在受試者中預防或治療癌症或感染。
  27. 根據請求項26所述的用途，其中，所述癌症選自非小細胞肺癌、乳腺癌、腎細胞癌、何杰金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌或胃腸道癌症。
  28. 根據請求項25至27中任一項所述的用途，其中，所述藥物與一種或多種療法聯合施用，其中所述療法包括治療方式和/或其他治療劑，所 述治療方式包括手術和/或放射療法，和/或其他治療劑選自化療劑、其他抗體、細胞毒類藥物、疫苗、抗感染劑、小分子實體或免疫調節劑。
  29. 根據請求項28所述的用途，其中，所述其他抗體是PD-1或PD-L1抗體
  30. 一種用於檢測TNFR2的試劑盒，其包含根據請求項1至14中任一項所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，或根據請求項19或20的免疫綴合物。
  31. 根據請求項1至4和6至9中任一項所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其結合到被包含在人TNFR2胞外區之中的表位，所述人TNFR2胞外區包含SEQ ID NO：50或由其組成，其中所述表位包含在人TNFR2中SEQ ID NO：58的1L至31C的胺基酸序列中，或包含在人TNFR2中SEQ ID NO：62的1L至96C的胺基酸序列或SEQ ID NO：52的17T-54D的胺基酸序列中。
  32. 根據請求項1至4和6至9中任一項所述的抗TNFR2抗體或其抗原結合片段，其具有下列一種或多種特性：(1)在體外與人和/或食蟹猴TNFR2蛋白或其片段具有高親和力結合；(2)與表達於細胞表面的人和/或食蟹猴TNFR2結合；(3)阻斷TNF-α與表達於細胞表面的人和/或食蟹猴TNFR2之間的相互作用/結合；(4)啟動人T-細胞；(5)刺激人或食蟹猴TNFR2的下游信號通路；(6)增強免疫反應；(7)在誘導的T細胞上，不誘導ADCC作用；(8)由於具有良好的藥物代謝動力學參數，適合作為藥物中的活性成分使用； (9)具有抗腫瘤作用。
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