TWI877681B - 顯微鏡系統、用於對焦一顯微鏡系統之方法、及用於自動對焦一顯微鏡系統之對焦系統 - Google Patents

Abstract

本文中揭示一種顯微鏡系統及其對焦方法。該顯微鏡系統可包含一物鏡、一成像裝置、一照明源、一落射照明模組及一控制器。該成像裝置經組態以擷取定位在該顯微鏡系統之一載物台上之一樣品之一單一影像。該照明源經組態以照射定位在該載物台上之該樣品。該落射照明模組包含在由該照明源產生之一光之一第一主光學路徑中之一對焦機構。該對焦機構相對於垂直於該第一主光學路徑之一平面傾斜。該控制器與該照明源通信。該控制器經組態以基於由該對焦機構基於由該成像裝置擷取之該單一影像而產生之一圖案來對焦該顯微鏡系統。

Description

顯微鏡系統、用於對焦一顯微鏡系統之方法、及用於自動對焦一顯微鏡系統之對焦系統

本發明大體上係關於用於使用一單一影像自動對焦一顯微鏡系統之系統、設備及方法。

用一顯微鏡觀察之大多數樣品具有遍及其等之表面之高度之小變化。雖然此等變化通常係人眼所不可見的，但其等可導致由一顯微鏡擷取之一樣品之一部分之影像失焦。

一顯微鏡可產生一可用對焦影像之範圍被稱為景深。顯微鏡必須將一樣品之一部分保持在其景深內，以產生有用影像。然而，當從觀察一樣品之一第一部分過渡至觀察該樣品之一第二部分時，樣本高度之小變化可導致第二部分在景深之外。

不同清晰度量測(諸如影像對比度、解析度、熵及/或空間頻率含量等)可用於量測由一顯微鏡擷取之影像之對焦品質。通常，當一樣品對焦時，經擷取影像將展現最佳清晰度品質(例如，大對比度、一高範圍之強度值及清晰邊緣)。可用於判定一樣品何時對焦之不同清晰度量測通常需要擷取一系列影像，且增加或減少顯微鏡物鏡與樣品之間的距離，直至影像出現對焦。此增加各樣品之總顯微掃描時間，從而使使用此量測之方法對於高通量掃描應用非常慢。

因此，需要一種用於在一單一影像中執行自動對焦之系統，其中該系統可提供一方向及距離兩者以達成對焦。

在一些實施例中，本文中揭示一種成像系統。該成像系統包含一透鏡、一成像裝置、一照明源、一落射照明模組及一控制器。該成像裝置經組態以擷取定位於一焦平面處之一物件之一單一影像。該照明源經組態以照射該物件。該落射照明模組包含在由該照明源產生之一光之一第一主光學路徑中之一對焦機構。該對焦機構相對於垂直於該第一主光學路徑之一平面傾斜。該控制器與該成像裝置通信。該控制器包含一或多個程式化指令，該一或多個程式化指令當被執行時，引起該控制器基於由該對焦機構基於由該成像裝置擷取之該單一影像而產生之一圖案來對焦該成像系統。

在一些實施例中，本文中揭示一種顯微鏡系統。該顯微鏡系統包含一物鏡、一成像裝置、一照明源、一落射照明模組及一控制器。該成像裝置經組態以擷取定位在該顯微鏡系統之一載物台上之一樣品之一單一影像。該照明源經組態以照射定位在該載物台上之該樣品。該落射照明模組包含在由該照明源產生之一光之一第一主光學路徑中之一對焦機構。該對焦機構相對於垂直於該第一主光學路徑之一平面傾斜。該控制器與該成像裝置通信。該控制器包含一或多個程式化指令，該一或多個程式化指令當被執行時，引起該控制器基於由該對焦機構基於由該成像裝置擷取之該單一影像而產生之一圖案來對焦該顯微鏡系統。

在一些實施例中，本文中揭示一種用於對焦一顯微鏡系統之方法。一控制器引起該顯微鏡系統之一照明源照射定位於該顯微鏡系統 之一載物台上之一樣品。該控制器接收該樣品之一單一影像。該單一影像包含由定位於該照明源與該載物台之間的一光路徑中之一對焦機構產生之一圖案。該控制器藉由分析由該對焦機構產生之該圖案來判定該單一影像未對焦。基於該判定，該控制器對焦該顯微鏡系統。

在一些實施例中，本文中揭示一種用於自動對焦一顯微鏡系統之對焦系統。該對焦系統包含一照明源及一對焦機構。該對焦機構經組態以定位在由該照明源產生之一光路徑內。該對焦機構經組態以將一圖案投影至待由該顯微鏡系統成像之一樣品上。

100:自動對焦顯微鏡系統

101:樣本平面

102:物鏡

103:鏡筒透鏡

104:影像平面

105:物鏡後焦平面

106:落射照明模組

107:照明源

108:光學元件

110:對焦機構

111:分色鏡

112:激發濾光器

113:發射濾光器

114:載物台

116:成像裝置

128:第二致動器

130:第一致動器

132:定位裝置

300:方法

302:步驟

304:步驟

306:步驟

308:步驟

310:步驟

501:灰度強度

700:顯微鏡系統

701:第一照明源

702:第二照明源

703:分束器

704:對焦機構

705:落射照明模組

708:光學元件

900:對焦機構

910:對焦機構

1100:資料處理系統

1101:匯流排

1105:CPU

1110:唯讀記憶體(ROM)

1115:隨機存取記憶體(RAM)

1120:控制器

1125:記憶體裝置

1130:顯示介面

1135:顯示器

1140:通信埠

1145:介面

1150:鍵盤

1155:輸入裝置

本申請案之態樣及實施例在圖中描繪，其中：圖1繪示根據實例實施例之包含一對焦機構之一顯微鏡系統。

圖2A至圖2C描繪根據實例實施例在與對焦相距之差異距離處來自一顯微鏡系統之實例經擷取影像。

圖3係繪示根據實例實施例之用於判定一顯微鏡系統之一對焦調整之一方法之一流程圖。

圖4係繪示根據實例實施例之一經偵測清晰區之一實例影像。

圖5A係描繪根據實例實施例之沿圖4之經偵測之對焦區之灰度值之X軸之一平均投影之一影像。

圖5B係描繪根據實例實施例之與圖4之投影之一最佳高斯擬合之一影像。

圖6描繪根據實例實施例之一影像中之最清晰區位置對對 焦之一闡釋性標繪圖。

圖7繪示根據實例實施例之包含兩個照明路徑之一顯微鏡系統。

圖8A至圖8B描繪根據實例實施例之來自圖7之系統之實例經擷取影像。

圖9A描繪根據實例實施例之用於一顯微鏡系統之一對焦機構。

圖9B描繪根據實例實施例之用於一顯微鏡系統之一對焦機構。

圖10描繪根據實例實施例之使用圖9B之對焦機構之一實例經擷取影像，描繪用於一顯微鏡系統之一對焦機構。

圖11描繪根據實例實施例之一例示性資料處理系統之一闡釋性方塊圖，描繪用於一顯微鏡系統之一對焦機構。

相關申請案之交叉參考

本申請案主張2022年7月15日申請之美國臨時申請案第63/368,570號及2022年10月7日申請之美國申請案第18/045,007號之優先權，其等兩者之全部內容以引用的方式併入本文中。

本文描述用於自動對焦一顯微鏡系統之系統及方法。一自動對焦系統可經實施為任何合適類型之顯微鏡之部分。例如，在一些實施例中，系統可經實施為使用透射光或反射光之一光學顯微鏡之部分。更特定言之，一系統可經實施為購自俄亥俄州之Cuyahoga Falls之Nanotronics Imaging,Inc.之nSpec®光學顯微鏡之部分。在一些實施例中，一自動對 焦系統可經組態以基於一單一影像對焦一顯微鏡。

在一些實施例中，自動對焦系統可包含一落射照明模組。一落射照明模組可實現與顯微鏡物鏡在同一側上之一樣本之照明。落射照明模組可用於螢光、共焦及反射光顯微鏡。儘管本文提供之實例係關於反射光顯微鏡，但一般技術者將認識到，系統及方法可用作一反射對焦模組以亦促進螢光及共焦顯微鏡中之對焦。在一些實施例中，一落射照明模組可能可移除地介接至一顯微鏡。在其他實施例中，一落射照明模組可整合至該顯微鏡。

儘管下文討論在一顯微鏡之上下文中討論一自動對焦系統，但熟習此項技術者理解，此系統可擴展至顯微鏡之外至其他成像系統。例如，自動對焦系統可用在數位相機中。

圖1繪示根據實例實施例之一自動對焦顯微鏡系統100(以下稱為「顯微鏡系統100」)。顯微鏡系統100可包含一或多個物鏡102、一照明源107、一落射照明模組106、一載物台114、一成像裝置116及一控制器(未展示)。

物鏡102可具有不同放大倍率及/或經組態以結合亮場/暗場顯微鏡、差分干涉對比(DIC)顯微鏡及/或任何其他合適形式之顯微鏡操作。在一些實施例中，用於檢測一載物台114上之一樣本平面101中之一樣品之物鏡102及/或顯微鏡技術可由軟體、硬體及/或韌體控制。在一些實施例中，顯微鏡系統100可代表無限遠校正顯微鏡。在此等實施例中，顯微鏡系統100可進一步包含一鏡筒透鏡103，該鏡筒透鏡103經組態以將來自一無限遠校正物鏡102之平行光對焦至成像裝置116。

在一些實施例中，載物台114可用於沿一XY平面調整樣 本。在一些實施例中，載物台114可由一步進馬達、伺服馬達、線性馬達及/或任何其他合適之機構驅動。

在一些實施例中，成像裝置116可用於擷取一樣本之一或多個影像，以判定顯微鏡系統100是否對焦。例如，在操作中，成像裝置116可經組態以擷取一樣品之一或多個影像，且可將該等影像提供至控制器以供進一步處理。在一些實施例中，一旦一樣本對焦，同一或一分開的成像裝置可用於擷取該樣本之一或多個影像。在一些實施例中，影像感測器可係一CCD、CMOS及/或容許擷取及儲存一樣本之影像之任何其他合適之電子裝置。

在一些實施例中，顯微鏡系統100可進一步包含一第一致動器130。第一致動器130可用於在一Z軸上驅動物鏡102朝向及遠離載物台114。在一些實施例中，第一致動器130可經組態用於物鏡102之高精度及精細對焦調整。在一些實施例中，第一致動器130可代表一步進馬達、伺服馬達、線性致動器、壓電馬達及/或任何其他合適之機構。例如，在一些實施例中，一壓電馬達可用於從0至50微米(μm)、0至100μm或0至200μm、及/或任何其他合適之距離範圍驅動物鏡102。

在一些實施例中，顯微鏡系統100可進一步包含一第二致動器128。第二致動器128可經組態以在一Z軸上調整載物台114朝向及遠離物鏡102。在一些實施例中，第二致動器128可用於進行例如0至100μm、0至5mm、0至10mm、0至30mm及/或任何其他合適距離範圍之粗略對焦調整。在一些實施例中，第二致動器128可用於上下調整載物台114，以容許經由物鏡102觀看不同厚度之樣品。在一些實施例中，第二致動器128可提供例如0至100nm、0至5μm、0至50μm、0至100μm、0 至200μm及/或任何其他合適之距離範圍之精細對焦。

在一些實施例中，顯微鏡系統100亦可包含一定位裝置132。在一些實施例中，定位裝置132可經組態以儲存載物台114之一絕對位置，即使在顯微鏡系統100之重設及/或電力循環時亦係如此。在一些實施例中，定位裝置132可係一線性編碼器、一旋轉編碼器或任何其他合適之機構來追蹤載物台114相對於物鏡102之絕對位置。

提供調整對焦之構件作為一闡釋性實例。一般技術者將注意到，可結合本文描述之系統及方法使用其他構件。

落射照明模組106可經組態以照射定位於載物台114上之一樣本。在一些實施例中，落射照明模組106可進一步經組態以在由成像裝置116收集之一影像中提供一圖案，該圖案可用來自動對焦顯微鏡系統100。在一些實施例中，落射照明模組106係可自顯微鏡系統100移除之一模組。

在一些實施例中，落射照明模組106可介接至一照明源107。照明源107可經組態以照射載物台114。例如，照明源107可經組態以照射載物台114，以用於判定顯微鏡系統100何時對焦。在一些實施例中，落射照明模組106包含一或多個光學元件108，該一或多個光學元件108經組態以產生樣本平面101之均勻照明。在一些實施例中，光學元件108可包含至少一或多個準直及/或對焦透鏡。在進一步實施例中，光學元件108可形成與物鏡後焦平面105共軛之一孔徑光闌。

在一些實施例中，落射照明模組106包含一分色鏡111，該分色鏡111經組態以透過物鏡102將照明源107反射至定位於載物台114上之樣本上。在一些實施例中，落射照明模組106包含一或多個濾光器(例 如，一激發濾光器112及/或一發射濾光器113)。在進一步實施例中，一或多個濾光器之一部分可係偏光的。

在一些實施例中，落射照明模組106可包含一對焦機構110。對焦機構110可定位在落射照明模組106內之照明源107之光學路徑中。在一些實施例中，對焦機構110可定位在一準直透鏡之後，使得通過對焦機構之光以一主要平行方式對準。在一些實施例中，對焦機構110可經組態以在由成像裝置116收集之一影像中提供一圖案，該圖案可用來自動對焦顯微鏡系統100。

在一些實施例中，對焦機構110可代表一網格。在一些實施例中，對焦機構110可代表包含一倫奇刻線圖案(Ronchi ruling pattern)之一塊玻璃。一般技術者將認識到，經組態以容許來自照明源107之光之至少部分透射之任何精細圖案化元件可作為一對焦機構110操作。

在一些實施例中，對焦機構110可包含一部分圖案。在一些實施例中，樣品或物件上之投影及所得影像將在影像之一第一部分上無圖案，且在影像之一第二部分上圖案化(對應於圖案可見之位置)。在一些實施例中，影像之圖案化部分可用於對焦。藉由使用具有一部分圖案之對焦機構110，對焦機構110可始終保持在適當位置，且可使用一單一波長。

在操作中，例如，從照明源107產生之光可在照明載物台114之一路徑上通過對焦機構110。在一些實施例中，對焦機構110可相對於垂直於從照明源107產生之光之主路徑之一平面傾斜。換言之，對焦機構110可傾斜，使得對焦機構110不平行於落射照明模組106中之光學元件108。在一些實施例中，對焦機構110經組態以與共軛至樣本平面101之一 場光闌及共軛至影像平面104之一場光闌相交。在一些實施例中，對焦機構110與未共軛至樣本平面101之多個場光闌相交。

一般技術者將注意，一些落射照明模組可包含經組態以防止上游物件被成像之一漫射器。在一些實施例中，本文描述之系統及方法可需要該漫射器之移除。

在一些實施例中，對焦機構之傾斜將產生遍及一經擷取影像之對焦之一變化。參考圖2A至圖2C，根據一實施例描繪來自包括一對焦機構之一顯微鏡系統之實例經擷取影像。由於對焦機構中之傾斜，僅對焦機構之一部分對焦在顯微鏡內組態之任何給定焦深。圖2A描繪其中對焦機構之一上部分對焦之一經擷取影像。圖2B描繪其中對焦機構之中間部分對焦之一經擷取影像。圖2C描繪其中對焦機構之一下部分對焦之一經擷取影像。在此等實例中，顯微鏡系統內對焦之一調整與影像之對焦部分沿Y軸之一變化相關。

調整對焦機構之傾斜軸可在對焦中產生一不同相關(例如，沿X軸或一對角線)。在一些實施例中，傾斜經組態使得對焦機構之一部分對焦在顯微鏡之整個焦深範圍。在一些實施例中，對焦機構從垂直於落射照明系統之主光學路徑傾斜介於0°與±90°之間。在進一步實施例中，範圍可介於±10°與±80°之間。在其他實施例中，範圍可介於±45°與±60°之間。在一些實施例中，傾斜角可係可調整的。應注意，一更尖銳(較小)角度可等於一較窄之對焦區域。在一些實施例中，基於本文描述之方法，一變窄之對焦區域可產生一更精確之對焦調整。在一些實施例中，對焦機構之一更尖銳(較小)角度可遮擋大量照明源。在一些實施例中，對焦機構110可係非平面的。在進一步實施例中，對焦機構110可係彎曲的。一非平面對焦機構可 提供一光學回應，其中對焦範圍之一部分產生一較窄之對焦區域，且另一部分產生較少之照明遮擋。一般技術者將認識到，可用一對焦機構修改落射照明模組之各種其他組態，以產生類似之光學回應。

控制器可經組態以判定對焦顯微鏡之一方向及距離。在一些實施例中，控制器可經由成像裝置116接收樣本之一影像，該影像具備由對焦機構110投影之圖案。在進一步實施例中，控制器可接收一或多個額外類似影像。在一些實施例中，控制器可從定位裝置132接收載物台114之位置。

在一些實施例中，控制器可透過本文描述之方法處理影像，以判定對焦顯微鏡之方向及距離。在一些實施例中，控制器可直接介接至用於對焦顯微鏡之一構件(例如，一或多個致動器)。在進一步實施例中，控制器可基於所判定之方向及距離，使用該構件自動對焦顯微鏡。在一些實施例中，控制器可介接至一顯示裝置，用於向一使用者顯示對焦方向及距離之一指示。

圖3係繪示根據實例實施例之用於對焦顯微鏡系統100之一方法300之一流程圖。

在步驟302，控制器可接收定位於載物台114上之一樣本之一影像。控制器可經由一或多個有線或無線連接從成像裝置116接收樣本之影像。例如，在操作中，對焦機構110可經放置在顯微鏡系統100之照明路徑內。在一些實施例中，光可經準直。在一些實施例中，光可由對焦機構110部分遮擋，從而導致一照明圖案出現在樣本上，如由成像裝置116成像。在一些實施例中，對焦機構110中之一傾斜可導致施加至樣本之照明圖案中之一變化對焦。

在步驟304，控制器可判定影像之一對焦或最清晰區。簡要參考圖4，根據一實施例描繪一實例經擷取影像中之一經偵測最清晰區。在一些實施例中，偵測一最清晰區可包含應用一特徵增強演算法。在進一步實施例中，特徵增強演算法可係一邊緣偵測演算法。在一些實施例中，特徵增強演算法可包含一高斯差(DoG)。

在步驟306，控制器可針對影像之對焦部分產生沿一軸之一平均投影。在一些實施例中，投影軸與網格之傾斜軸相關。簡要參考圖5A，根據一實施例，描繪來自圖4之經偵測對焦區之灰度值之一平均投影。在此實例中，投影係沿影像之X軸執行。

在步驟308，控制器可判定投影之一峰值(即，沿軸之最對焦像素)。

在一些實施例中，判定一峰值之方法包含判定與投影之一最佳高斯擬合。在一些實施例中，控制器可判定最佳高斯擬合分佈之一峰值。簡要參考圖5B，根據實施例描繪與圖5A中所繪示之投影之一最佳高斯擬合分佈。接著，灰度強度501中之峰值可與沿軸之一像素距離相關。

在步驟310，控制器可基於峰值判定一對焦方向及距離。在一些實施例中，可使用一機器學習演算法來執行判定一對焦方向及距離。在一些實施例中，機器學習演算法可對一資料集進行訓練，該資料集包括在一系列焦距上之清晰度之峰值像素值，該等焦距具有至對焦之帶正負號距離。參考圖6，根據一實施例描繪一影像中之最清晰區與焦距之一闡釋性標繪圖。在一些實施例中，可基於一單一影像向機器學習演算法提供沿一軸之一最清晰位置及一當前焦距，且判定一對焦方向及距離。

在一些實施例中，機器學習演算法訓練可係儀器特定的。 在一些實施例中，最清晰區與焦距之間的關係可係線性的。在一些實施例中，焦距及方向可使用該線之方程式來計算。一般技術者將認識到，最清晰區與焦距之間的其他數學關係可透過對對焦機構110之修改來建置。實例修改可包含改變對焦機構110中之圖案產生元件之間的距離，或引入彎曲或曲線至對焦機構110。

在一些實施例中，可經由一已知儀器之演算法以及已知儀器與類似儀器之間的一偏移來校準類似儀器。

在一些實施例中，系統可基於所判定之對焦方向及距離自動對焦顯微鏡。

在一些實施例中，系統可基於所判定之對焦方向及距離向一使用者提供輸出。在進一步實施例中，輸出可包含一視覺指示器(例如，在一監視器上，或透過指示燈)、一音訊指示器或一觸覺指示器之至少一者。

在一些實施例中，系統可基於反射照明自動對焦，且接著基於透射照明產生一對焦影像。在進一步實施例中，藉由改變照明源，對焦機構110可不再在照明光學路徑中，且因此不出現在所得影像中。

在一些實施例中，該系統可經組態以容許自照明源之光學路徑移除對焦機構110。在一些實施例中，可希望在達成一最佳對焦之後，在無由對焦機構110提供之照明干擾之情況下擷取樣本之一影像。在一些實施例中，移除對焦機構110可包含從光學路徑實體移除對焦機構110。在一些實施例中，對焦機構110之實體移除可係手動的。在其他實施例中，對焦機構110之實體移除可係自動的。在一些實施例中，對焦機構110之自動移動可包含一馬達及/或電磁鐵之使用。在一些實施例中，對 焦機構110可包含用於在光學路徑中對準對焦機構110之一框架。在一些實施例中，對焦機構110可包含一軌道、磁體或鉸鏈之至少一者，用於促進機械移動及/或對準。

圖7繪示根據實例實施例之一顯微鏡系統700，其包含具有兩個照明路徑之一落射照明系統。在一些實施例中，顯微鏡系統700可包含與參考圖1描述之元件相似之元件。顯微鏡系統700可包含一或多個物鏡102、一照明源701、一落射照明模組705、一載物台114、一成像裝置116及一控制器(未展示)。

物鏡102可具有不同放大倍率及/或經組態以使用亮場/暗場顯微鏡、差分干涉對比(DIC)顯微鏡及/或任何其他合適形式之顯微鏡操作。在一些實施例中，用於檢測一載物台114上之一樣本平面101中之一樣品之物鏡102及/或顯微鏡技術可由軟體、硬體及/或韌體控制。在一些實施例中，顯微鏡系統700可代表無限遠校正顯微鏡。在此等實施例中，顯微鏡系統700可進一步包含一鏡筒透鏡103，該鏡筒透鏡103經組態以將來自一無限遠校正物鏡102之平行光對焦至成像裝置116。

在一些實施例中，載物台114可用於沿一XY平面調整樣本。在一些實施例中，載物台114可由一步進馬達、伺服馬達、線性馬達及/或任何其他合適之機構驅動。

在一些實施例中，成像裝置116可用於擷取一樣本之一或多個影像，以判定顯微鏡系統700是否對焦。例如，在操作中，成像裝置116可經組態以擷取一樣品之一或多個影像，且可將該等影像提供至控制器以供進一步處理。在一些實施例中，一旦一樣本對焦，同一或一分開的成像裝置可用於擷取該樣本之一或多個影像。在一些實施例中，影像感測 器可係一CCD、CMOS及/或容許擷取及儲存一樣本之影像之任何其他合適之電子裝置。

在一些實施例中，顯微鏡系統700可進一步包含一第一致動器130。第一致動器130可用於在一Z軸上驅動物鏡102朝向及遠離載物台114。在一些實施例中，第一致動器130可經組態用於物鏡102之高精度及精細對焦調整。在一些實施例中，第一致動器130可代表一步進馬達、伺服馬達、線性致動器、壓電馬達及/或任何其他合適之機構。例如，在一些實施例中，一壓電馬達可用於從0至50微米(μm)、0至100μm或0至200μm、及/或任何其他合適之距離範圍驅動物鏡102。

在一些實施例中，顯微鏡系統700可進一步包含一第二致動器128。第二致動器128可經組態以在一Z軸上調整載物台114朝向及遠離物鏡102。在一些實施例中，第二致動器128可用於進行例如0至100μm、0至5mm、0至10mm、0至30mm及/或任何其他合適距離範圍之粗略對焦調整。在一些實施例中，第二致動器128可用於上下調整載物台114，以容許經由物鏡102觀看不同厚度之樣品。在一些實施例中，第二致動器128可提供例如0至100nm、0至5μm、0至50μm、0至100μm、0至200μm及/或任何其他合適之距離範圍之精細對焦。

在一些實施例中，顯微鏡系統700亦可包含一定位裝置132。在一些實施例中，定位裝置132可經組態以儲存載物台114之一絕對位置，即使在顯微鏡系統700之重設及/或電力循環時亦係如此。在一些實施例中，定位裝置132可係一線性編碼器、一旋轉編碼器或任何其他合適之機構來追蹤載物台114相對於物鏡102之絕對位置。

提供調整對焦之構件作為一闡釋性實例。一般技術者將注 意到，可結合本文描述之系統及方法使用其他構件。

一落射照明模組705可經組態以照射定位於載物台114上之一樣本。在一些實施例中，落射照明模組705可進一步經組態以在由成像裝置116收集之一影像中提供一圖案，該圖案可用來自動對焦顯微鏡系統700。在一些實施例中，落射照明模組705係可從顯微鏡系統700移除之一模組。在進一步實施例中，落射照明模組705可包含多個組件，各組件係可獨立移除的。

在一些實施例中，落射照明模組705可介接至一第一照明源701及一第二照明源702。在一些實施例中，落射照明模組705可包含一對焦機構704。第一照明源701及第二照明源702可經組態以照射載物台114。例如，第一照明源701可經組態以照射載物台114，以用於判定顯微鏡系統100何時對焦。在一些實施例中，落射照明模組705包含一或多個光學元件108、708，該一或多個光學元件108、708經組態以產生樣本平面101之均勻照明。在一些實施例中，光學元件108、708可包含至少一或多個準直及/或對焦透鏡。在進一步實施例中，光學元件108、708可形成與物鏡後焦平面105共軛之一孔徑光闌。

在一些實施例中，落射照明模組705可包含一分束器703，該分束器703經組態以合併來自一第二照明源702之光學路徑。在一些實施例中，分束器可在第一照明源光學路徑701及第二照明源光學路徑702之光學路徑中之一準直透鏡之後插入。在一些實施例中，兩個照明源701、702可具有兩個不同頻率。在一些實施例中，一第二照明源702之光學路徑可不受對焦機構704阻礙。在一些實施例中，第二照明源702可產生白光。在一些實施例中，任何波長範圍之一光可用於一第二照明源 702。應注意，分束器703之引入可旋轉由對焦機構704產生之圖案，且因此旋轉經擷取影像中之最清晰區之軸。

在一些實施例中，落射照明模組705包含一分色鏡111，該分色鏡111經組態以將來自第一及第二照明源701、702之光透過物鏡102反射至定位在載物台114上之樣本上。在一些實施例中，落射照明模組705包含一或多個濾光器(例如，一激發濾光器112及/或一發射濾光器113)。在一些實施例中，一或多個濾光器之一部分可係偏光的。

在一些實施例中，對焦機構704可定位在落射照明模組705內之第一照明源701之光學路徑中。在一些實施例中，對焦機構704可定位在一準直透鏡之後，使得通過對焦機構之光以一主要平行方式對準。在一些實施例中，對焦機構704可經組態以在由成像裝置116收集之一影像中提供一圖案，該圖案可用來自動對焦顯微鏡系統700。

在一些實施例中，對焦機構704可代表一網格。在一些實施例中，對焦機構704可代表包含一倫奇刻線圖案之一塊玻璃。一般技術者將認識到，經組態以容許來自第一照明源701之光之至少部分透射之任何精細圖案化之元件可作為一對焦機構704操作。在操作中，例如，從第一照明源701產生之光可在照明載物台114之一路徑上通過對焦機構704。在一些實施例中，對焦機構704可相對於垂直於從第一照明源701產生之光之主路徑之一平面傾斜。換言之，對焦機構704可傾斜，使得對焦機構704不平行於落射照明模組705中之光學元件108。在一些實施例中，對焦機構704經組態以與共軛至樣本平面101之一場光闌及共軛至影像平面104之一場光闌相交。在一些實施例中，對焦機構704與未共軛至樣本平面101之多個場光闌相交。

一般技術者將注意，一些落射照明模組可包含經組態以防止上游物件被成像之一漫射器。在一些實施例中，本文描述之系統及方法可需要移除該漫射器。

參考圖8A，根據一實施例描繪與對焦機構相關聯之照明源被啟用之一實例影像。藉由關閉與對焦機構相關聯之照明源，可在無對焦圖案之情況下對樣本成像，如圖8B中描繪。

在一些實施例中，在判定一對焦方向及距離之後，可實體地或光學地自動移除對焦機構。在一些實施例中，系統可在移除對焦機構之後自動擷取樣本之一影像。在進一步實施例中，在對樣品成像之後，系統可實體地或光學地重新插入對焦機構。

在一些實施例中，系統可在無對焦機構之情況下分析樣本之一影像以保證品質。在一些實施例中，品質保證可包含定量評估一影像之對焦。在一些實施例中，評估可回饋(例如，驗證)至機器學習演算法中。

在一些實施例中，控制器可控制自動對焦系統之組件(用於對焦之致動器、移動對焦機構之致動器、照明源)之任何設定，以及由自動對焦系統之組件執行以及在該等組件之間執行之通信、操作(例如，拍攝影像、開啟及關閉一照明源、移動載物台及物鏡、儲存與一樣本相關聯之不同值)及計算。在一些實施例中，控制器可包含任何合適硬體(在一些實施例中，其可執行軟體)，諸如例如電腦、微處理器、微控制器、特定應用積體電路(ASIC)及數位信號處理器(其等之任一者可被稱為一硬體處理器)、編碼器、用於讀取編碼器之電路系統、記憶體裝置(包含一或多個EPROM、一或多個EEPROM、動態隨機存取記憶體(「DRAM」)、靜態 隨機存取記憶體(「SRAM」)及/或快閃記憶體)及/或任何其他合適硬體元件。在一些實施例中，自動對焦系統內之個別組件可包含其等自身之軟體、韌體及/或硬體以控制個別組件且與自動對焦系統中之其他組件通信。

在一些實施例中，控制系統(例如，控制器及控制器介面)與自動對焦系統之組件之間的通信可使用類比技術(例如，中繼邏輯)、數位技術(例如，使用RS232、乙太網路或無線)及/或任何其他合適之通信技術。

在一些實施例中，可使用任何合適輸入裝置(例如，一鍵盤、滑鼠或操縱桿)將操作者輸入傳遞至控制系統。

圖9A繪示根據實例實施例之一對焦機構900。可使用對焦機構900來代替對焦機構110或對焦機構704。如展示，對焦機構900可採用一網格之形式。本文描述之一網格可指具有至少部分透光之多個刻線之任何材料。在一些實施例中，該網格可為一金屬絲網格。一般技術者將認識到，替代光學遮罩可提供類似或額外益處。在一些實施例中，網格可經組態使得由網格產生之圖案應用於由系統擷取之一整個影像。在其他實施例中，網格可經組態使得由網格產生之圖案應用於影像之一部分。例如，需要更高精度之一系統可包含將圖案應用於整個影像之一網格。在另一實例中，一替代系統可具備具有有限深度變化之樣本，且擷取具有沿影像之一或多個邊緣可見之網格圖案之可行影像。若影像被判定為失焦，則品質保證可使用本文中揭示之自動對焦方法對一或多個影像重新成像。

圖9B繪示根據實例實施例之一對焦機構910。可使用對焦機構910來代替對焦機構110或對焦機構704。如展示，對焦機構910可採 用包含一倫奇刻線圖案之一透明載玻片(例如，玻璃或塑膠)之形式。一倫奇刻線係具有一高邊緣明晰度及對比度之一恆定間隔條及空間方波光學遮罩。在一些實施例中，一倫奇刻線可充當一網格。在一些實施例中，透過在玻璃上光微影沈積鉻來製造一倫奇刻線。在一些實施例中，歸因於可忽略不計之沈積厚度，一倫奇刻線可容許對焦機構910中之更大傾斜。在一些實施例中，一倫奇刻線可具有一更精細之圖案。作為一實例，倫奇刻線可每毫米具有大約10個線對及一50微米寬度。在一些實施例中，一倫奇刻線可係稍微透明的。

參考圖10，描繪用包含一倫奇刻線之一落射照明系統產生之一影像。在一些實施例中，均勻、適當間隔之圖案容許機器學習演算法之改良效能。

圖11描繪例示性資料處理系統1100之一方塊圖，該資料處理系統1100包括可用於含有或實施如上文討論之各種電腦程序及系統之內部硬體。在一些實施例中，資料處理系統1100可代表與圖1及/或圖7相關聯之控制器。在一些實施例中，例示性內部硬體可包含或可形成為一可程式化邏輯控制器(PLC)系統之部分。在一些實施例中，例示性內部硬體可包含或可形成為一積層製造控制系統，諸如一三維列印系統之部分。一匯流排1101充當互連硬體之其他所繪示組件之主資訊高速通道。CPU 1105係系統之中央處理單元，執行執行一程序所需之計算及邏輯運算。CPU 1105係一例示性處理裝置、運算裝置或處理器，如此等術語在本發明內使用。唯讀記憶體(ROM)1110及隨機存取記憶體(RAM)1115構成例示性記憶體裝置。

一控制器1120經由系統匯流排1101與一或多個任選記憶體 裝置1125介接。此等記憶體裝置1125可包含例如一外部或內部DVD驅動器、CD ROM驅動器、一硬碟機、快閃記憶體、一USB驅動器或類似者。如前文指示，此等不同驅動器及控制器係任選裝置。另外，記憶體裝置1125可經組態以包含用於儲存任何軟體模組或指令之個別檔案、資料、共同檔案或用於儲存資料之一或多個資料庫。

用於執行上文描述之任何功能步驟之程式指令、軟體或互動式模組可儲存在ROM 1110及/或RAM 1115中。任選地，程式指令可儲存在一有形電腦可讀媒體上，諸如一光碟、一數位磁碟、快閃記憶體、一記憶卡、一USB驅動器、一光碟儲存媒體(諸如一Blu-ray^TM光碟)及/或其他記錄媒體。

一任選之顯示介面1130可允許來自匯流排1101之資訊以音訊、視覺、圖形或字母數字格式顯示在顯示器1135上。與外部裝置之通信可使用各種通信埠1140進行。一例示性通信埠1140可附接至一通信網絡，諸如網際網路或一區域網路。

硬體亦可包含一介面1145，該介面1145容許從諸如一鍵盤1150之輸入裝置或諸如一滑鼠、一操縱桿、一觸控螢幕、一遙控器、一指向裝置、一視訊輸入裝置及/或一音訊輸入裝置之其他輸入裝置1155接收資料。

本發明不限於所描述之特定系統、裝置及方法，此係因為此等可變化。本描述中使用之術語僅為了描述特定版本或實施例之目的且不旨在限制本發明之範疇。

為了本申請案之目的，以下術語應具有下文陳述之各自含義。除非另外定義，否則本文中使用之所有技術及科學術語具有相同於一 般技術者所普遍理解之含義。本發明中之內容皆不應被解釋為承認本發明描述之實施例由於先前發明而無權先於此揭示內容。

如本文中使用，單數形式「一」、「一個」及「該」包含複數參考，除非內容脈絡另外清楚指示。因此，例如，對一「胞元」之參考係對熟習此項技術者已知之一或多個胞元及其等之等效物等之一參考。

如本文所使用，術語「大約」意味其所使用之數字之數值之正或負10%。因此，大約50mm意味著在45mm至55mm之範圍中。

如本文所使用，術語「由...構成(consists of或consisting of)」意味著該裝置或方法僅包含在特定主張之實施例或請求項中具體敘述之元件、步驟或成分。

在術語「包括」用作過渡片語之實施例或請求項中，此等實施例亦可被設想用術語「由...構成」或「基本上由...構成」來替換術語「包括」。

如熟習此項技術者將理解，出於任何及所有目的，諸如就提供一書面描述而言，本文中揭示之所有範圍旨在涵蓋該範圍之上限與下限之間的各中介值及該陳述範圍內之任何其他陳述或中介值。本文中揭示之所有範圍亦涵蓋任何及所有可能的子範圍及其等子範圍之組合。任何列出之範圍可經容易地辨識為充分描述且使相同範圍能夠分解成至少相等之一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等等。作為一非限制性實例，本文討論之各範圍可易於分解為下三分之一、中間三分之一及上三分之一等等。如熟習此項技術者亦將理解，所有語言(諸如「至多」、「至少」及類似者)包含所陳述之數字，且係指可隨後分解成如上文討論之子範圍之範圍。最後，如熟習此項技術者將理解，一範圍包含各個別成 員。因此，例如，具有1至3個分量之一群組係指具有1、2或3個分量以及大於或等於1個分量及小於或等於3個分量之值之範圍之群組。類似地，具有1至5個分量之一群組係指具有1、2、3、4或5個分量以及大於或等於1個分量及小於或等於5個分量之值之範圍等等之群組。

另外，即使明確敘述一特定數量，熟習此項技術者仍將認知，此敘述應被解釋為意謂至少所敘述數量(例如，不具有其他修飾語之純粹敘述「兩個敘述」意謂至少兩個敘述或兩個或更多個敘述)。此外，在其中使用類似於「A、B及C之至少一者等」之一慣例之該等例項中，一般言之，在熟習此項技術者將理解該慣例(例如，「具有A、B及C之至少一者之一系統」將包含但不限於僅具有A、僅具有B、僅具有C、共同具有A及B、共同具有A及C、共同具有B及C及/或共同具有A、B及C等之系統)之意義上期望此一構造。在其中使用類似於「A、B或C之至少一者等」之一慣例之該等例項中，一般言之，在熟習此項技術者將理解該慣例(例如，「具有A、B或C之至少一者之一系統」將包含但不限於僅具有A、僅具有B、僅具有C、共同具有A及B、共同具有A及C、共同具有B及C及/或共同具有A、B及C等之系統)之意義上期望此一構造。熟習此項技術者將進一步理解，事實上呈現兩個或更多個替代術語之任何轉折性字詞及/或片語(無論在描述、樣本實施例或圖式中)應被理解為考慮包含術語之一者、術語之任一者或兩個術語之可能性。例如，片語「A或B」將被理解為包含「A」或「B」或「A及B」之可能性。

另外，依據Markush群組描述本發明之特徵的情況下，熟習此項技術者將認知，亦藉此依據Markush群組之任何個別成員或成員之子群組描述本發明。

雖然已藉由本發明之例示性實施例之描述而繪示本發明，且雖然已特定詳細地描述該等實施例，但申請人並不旨在約束或依任何方式將隨附發明申請專利範圍之範疇限制於此細節。熟習此項技術者將容易瞭解額外優勢及修改。因此，本發明在其較廣泛態樣中不限於特定細節、代表性裝置及方法及/或所展示及描述之闡釋性實例之任一者。因此，可在不脫離申請人之一般發明概念之精神或範疇的情況下偏離此等細節。

在以上實施方式中，參考附圖，該等附圖形成實施方式之一部分。在圖式中，除非上下文另有指示，否則類似符號通常識別類似組件。本發明中描述之闡釋性實施例並不意味著係限制性的。在不脫離本文呈現之標的物之精神或範疇的情況下，可使用其他實施例，且可做出其他改變。將容易地理解，如通常在本文中描述且在圖中繪示之本發明之各種特徵可以各種不同組態配置、替換、組合、分離及設計，其等全部皆在本文中明確考慮。

本發明不在本申請案中所描述之特定實施例(其等旨在作為各種特徵之繪示)方面受限。替代地，此申請案旨在涵蓋本教示之任何變化、使用或調適且使用其一般原理。此外，本申請案旨在涵蓋如在此等教示所屬之此項技術中之已知或慣用實踐之範圍內之從本發明之此等偏離。如熟習此項技術者將明白，可在不脫離本發明之精神及範疇的情況下，對所描述之特定實施例做出許多修改及變化。除本文中枚舉之方法及設備以外，熟習此項技術者亦將從前文描述明白在本發明之範疇內之功能等效方法及設備。應理解，本發明並不限於當然可變化之特定方法、試劑、化合物、組合物或生物系統。亦應理解，本文中所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且並不旨在限制。

可將各種上文所揭示及其他特徵及功能、或其等之替代物組合至諸多其他不同系統或應用中。其中各種目前未預見或未預期之替代物、修改、變動、或改良可隨後由熟習此項技術者進行，其等之各者亦旨在由所揭示之實施例涵蓋。

100:自動對焦顯微鏡系統

101:樣本平面

102:物鏡

103:鏡筒透鏡

104:影像平面

105:物鏡後焦平面

106:落射照明模組

107:照明源

108:光學元件

110:對焦機構

111:分色鏡

112:激發濾光器

113:發射濾光器

114:載物台

116:成像裝置

128:第二致動器

130:第一致動器

132:定位裝置

Claims (19)

1. 一種顯微鏡系統，其包括：一物鏡；一成像裝置，其經組態以擷取定位在該顯微鏡系統之一載物台上之一樣品之影像；一照明源，其經組態以照射定位在該載物台上之該樣品；一落射照明模組，其包括在由該照明源產生之一光之一第一主光學路徑中之一對焦機構，其中該對焦機構相對於垂直於該第一主光學路徑之一平面傾斜，該對焦機構經組態用以產生在該樣品上之一圖案；及一控制器，其與該成像裝置通信，其中該控制器包括一或多個程式化指令，該一或多個程式化指令當被執行時，引起該控制器由該成像裝置接收該樣品之一單一影像，該單一影像包含由該對焦機構產生之該圖案，並僅基於由該成像裝置擷取之該單一影像來對焦該顯微鏡系統，該單一影像包含由該對焦機構產生之該圖案。
2. 如請求項1之顯微鏡系統，其中當被執行時引起該控制器對焦該顯微鏡系統之該一或多個程式化指令進一步包括當被執行時引起該控制器基於由該對焦機構產生之該圖案來判定該物鏡至該樣品之一最佳距離之一或多個程式化指令。
3. 如請求項2之顯微鏡系統，其中當被執行時引起該控制器判定該物鏡至該樣品之一最佳距離之該一或多個程式化指令進一步包括當被執行時引 起該控制器判定該單一影像中之一最清晰區之一像素位置之一或多個程式化指令。
4. 如請求項3之顯微鏡系統，其中當被執行時引起該控制器判定該單一影像中之一最清晰區之一像素位置之該一或多個程式化指令進一步包括一或多個程式化指令，該一或多個程式化指令當被執行時引起該控制器：對該單一影像執行特徵增強；基於該特徵增強判定該單一影像之一清晰區；針對該清晰區判定沿一軸之一平均投影；及判定該平均投影之一峰值。
5. 如請求項4之顯微鏡系統，其中當被執行時引起該控制器對該單一影像執行特徵增強之該一或多個程式化指令進一步包括當被執行時引起該控制器對該單一影像應用一邊緣偵測演算法之一或多個程式化指令。
6. 如請求項5之顯微鏡系統，其中當被執行時引起該控制器對該單一影像應用該邊緣偵測演算法之該一或多個程式化指令進一步包括當被執行時引起該控制器計算一高斯差之一或多個程式化指令。
7. 如請求項4之顯微鏡系統，其中當被執行時引起該控制器判定該平均投影之該峰值之該一或多個程式化指令進一步包括一或多個程式化指令，該一或多個程式化指令當被執行時引起該控制器：判定與該平均投影之一最佳高斯擬合；及 判定該最佳高斯擬合之一峰值。
8. 如請求項1之顯微鏡系統，其中該對焦機構經組態以移入及移出該第一主光學路徑。
9. 如請求項5之顯微鏡系統，其中該落射照明模組進一步包括一馬達，以將該對焦機構移入及移出該第一主光學路徑。
10. 如請求項1之顯微鏡系統，其進一步包括：一第二照明源，其具有一第二主光學路徑；及一分束器，其經組態以合併該第一主光學路徑及該第二主光學路徑。
11. 如請求項10之顯微鏡系統，其中該第二照明源產生白光。
12. 如請求項10之顯微鏡系統，其中該照明源產生一獨有光波長。
13. 如請求項1之顯微鏡系統，其中該對焦機構係一網篩。
14. 如請求項1之顯微鏡系統，其中該對焦機構係包括蝕刻在其中之一圖案之一玻璃載玻片。
15. 一種用於對焦一顯微鏡系統之方法，其包括： 由一控制器引起該顯微鏡系統之一照明源照射定位於該顯微鏡系統之一載物台上之一樣品，其中定位在該照明源與該載物台之間的一光路徑中之一對焦機構在該樣品上產生一圖案；由該控制器僅接收該樣品之一單一影像，其中該單一影像包括由定位在該照明源與該載物台之間的一光路徑中之該對焦機構產生之該圖案；及由該控制器僅係基於該單一影像來對焦該顯微鏡系統，其係藉由：藉由分析由該對焦機構產生之該圖案來判定該單一影像未對焦；及基於該單一影像中由該對焦機構產生之該經分析圖案來判定該顯微鏡系統之調整。
16. 如請求項15之方法，其進一步包括：由該控制器分析由該對焦機構產生之該圖案，以判定該顯微鏡系統之一物鏡至該樣品之一最佳距離；及由該控制器基於該最佳距離對焦該顯微鏡系統。
17. 如請求項16之方法，其中由該控制器判定該物鏡至該樣品之該最佳距離包括：藉由以下判定該單一影像中之一最清晰區之一像素位置：對該單一影像執行特徵增強；基於該特徵增強判定該單一影像之一清晰區；針對該清晰區判定沿一軸之一平均投影；及 判定該平均投影之一峰值。
18. 一種用於自動對焦一顯微鏡系統之對焦系統，其包括：一照明源；及一對焦機構，其經組態以定位在由該照明源產生之一光路徑內，該對焦機構經組態以將一圖案投影至待由該顯微鏡系統成像之一樣品上，其中該對焦機構允許僅使用一單一影像來對焦該顯微鏡系統，其中該單一影像包括該樣品上的該圖案。
19. 如請求項18之對焦系統，其中該對焦機構係一網篩或包括蝕刻在其中之該圖案之一玻璃載玻片。