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TWI874771B - 馬卡萃取物及其用途 - Google Patents

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TWI874771B
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張芳榮
吳志中
陳炳宏
黃聰龍
王士維
克仁 蒲
蔡逸宏
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高雄醫學大學
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Abstract

本發明係關於一種馬卡萃取物及其用途，所述馬卡萃取物使用極性溶劑萃取之部分具有抗血栓生成之活性，使用中低極性溶劑萃取之部分則具有抗中性粒細胞炎症以及抗過敏之活性，而使用低極性溶劑萃取之部分也具有抗中性粒細胞炎症之活性，且也具有促血管生成之活性。

Description

馬卡萃取物及其用途
本發明係關於一種馬卡萃取物及其用途，特別係一種使用特定溶劑所萃取之馬卡萃取物而使其作為抗血栓生成、抗中性粒細胞炎症、抗過敏以及促血管生成等用途。
馬卡，學名為 Lepidium meyenii Walp.，又名祕魯人蔘，屬於十字花科植物，為祕魯安地斯山脈的一種藥用植物，其塊根或塊莖部分被祕魯當地人作為功能性食品及民用藥物，用以提升性功能及生育能力。
近年來，多種藥理學研究指出，馬卡萃取物具有多種活性，舉例而言，如抗疲勞、壯陽、抗骨質疏鬆、抗發炎、抗病毒以及抗腫瘤等活性。
此外，也有研究指出，馬卡萃取物具有免疫功能調節以及護肝之活性，並對停經後綜合徵(postmenopausal syndrome)與良性攝護腺肥大症(benign prostate hyperplasia)也有治療效果。
馬卡可食用部分的塊莖含有大量碳水化合物、蛋白質及脂質作為初級代謝物(primary metabolites)，以及各種次級代謝物(secondary metabolites) 如生物鹼(alkaloids)、黃酮木脂素(flavonolignans)、三萜類化合物(triterpenoids)和硫代葡萄糖苷(glucosinolates)等。
其中，生物鹼衍生物被認為是生物活性成分，其代表了大多數已被研究的馬卡次級代謝物，包括生物鹼醯胺(macamides)、乙內醯脲衍生物(如macahydantoins、meyeniihydantoins、macathiohydantoins等)、六氫咪唑噻唑衍生物(如meyeniins)、咪唑生物鹼(如lepidiline)、吡啶衍生物(macaridine)以及吡咯衍生物(macapyrrolins)。
過去三十年裡，馬卡已成為一種需求量大的天然保健材料及膳食補充劑，在全球的各類產品中具有很高的市場價值，因此導致多數相關學者對馬卡進行廣泛的研究探索，以找出其對於人體有益的成分及實驗證據。
儘管馬卡在天然保健品市場及作為研究標的中廣受歡迎，但馬卡中仍有未被發現的植物化學物質及生物活性。
有鑑於上述問題，本發明之創作者藉由不同溶劑進行萃取分離，並針對各種不同萃取成分進行試驗，以尋找馬卡中尚未被人們發現的活性化合物以及生物活性。
將馬卡塊莖使用乙醇水溶液萃取後，經減壓濃縮獲得一馬卡粗萃物，將馬卡粗萃物利用乙酸乙酯及水進行分相萃取，獲得一乙酸乙酯層以及一第一水層；第一水層再以正丁醇水溶液進行分相萃取，獲得一第二水層以及一正丁醇層；而乙酸乙酯層則再以甲醇及正己烷之混合溶液進行分相萃取，獲得一甲醇層及正己烷層。
接著，使用管柱層析進一步對正己烷層以及甲醇層進行洗脫(elute)純化，獲得如第1圖所示之8種馬卡萃取生物鹼衍生化合物；其中化合物1、5~8為已知的生物鹼衍生化合物，而化合物2~4則為首次分離出的新生物鹼衍生化合物。其中化合物1為(5S)-乙醯基-1-苄基吡咯烷-2-酮(馬卡吡咯烷酮A)，化合物2為(5S)-乙醯基-1-(間-甲氧基苄基)-吡咯烷-2-酮(馬卡吡咯烷酮B)，化合物3為5-甲氧基甲基-1-(間-甲氧基苄基)-2-醛基吡咯(馬卡吡咯啉D)，化合物4為5-羥甲基-1-(間甲氧基苄基)-2-醛基吡咯，化合物5為5-甲氧基甲基-1-(苄基)-2-醛基吡咯，化合物6為5-羥甲基-1-(苄基)-2-醛基吡咯，化合物7為3-(苄基)-1-(羥基)-4-醛基吡啶，化合物8為3-羥基-1-氰甲基苯；後續為方便閱讀，均以化合物1~8代稱各化合物。
而經生物活性測試後，發現馬卡萃取物使用極性溶劑萃取之部分(即第二水層與正丁醇層部分)具有抗血栓生成之活性，使用中低極性溶劑萃取之部分(即甲醇層部分)則具有抗中性粒細胞炎症以及抗過敏之活性，而使用低極性溶劑萃取之部分(即正己烷層部分)除了具有抗中性粒細胞炎症之活性，且也具有促血管生成之活性。
以下將以具體的實施例配合所附的圖式詳加說明本發明的技術特徵，以使所屬技術領域具有通常知識者可易於瞭解本發明的目的、技術特徵及其優點。
以下內容將搭配圖式，藉由特定的具體實施例說明本發明之技術內容，熟悉此技術之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本發明之其他優點與功效。本發明亦可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用。本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不背離本發明之精神下，進行各種修飾與變更。
除非另有定義，本發明所使用的所有術語(包括技術和科學術語)具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。將進一步理解的是，諸如在通常使用的字典中定義的那些術語應當被解釋為具有與它們在相關技術和本發明的上下文中的含義一致的定義，並且將不被解釋為理想化或過度正式的意義，除非本文中明確地這樣定義。
材料
馬卡( Lepidium meyenii Walp.)的乾燥塊莖切片植物材料憑證標本(No. Lepidium-1)已存放於台灣高雄市高雄醫學大學天然藥物研究所。
實施例1
萃取及分離方法
請參照第2圖，第2圖係為本發明對馬卡進行液相萃取之簡略流程示意圖。將馬卡的乾燥塊莖切片(1.5kg)在室溫下以95%的乙醇水溶液進行萃取，每次以4L的乙醇水溶液萃取，連續萃取4次，其後減壓濃縮合併所得萃取物，獲得馬卡粗萃物(400.3g)。將馬卡粗萃物以乙酸乙酯及水(體積比1：1)進行分相萃取，獲得第一水層萃取物(370.1g)及乙酸乙酯層萃取物(27.7g)；第一水層以正丁醇(兩者體積比為1：1)再次進行分相萃取，獲得第二水層萃取物(351.6g)以及正丁醇層萃取物(15.0g)；而乙酸乙酯層萃取物以75%的甲醇水溶液及正己烷(體積比1：1)再次進行分相萃取，獲得甲醇層萃取物(6.7g)以及正己烷層萃取物(3.32g)。
正己烷層萃取物使用Sephadex LH-20開放管柱層析(150cm × 4.0cm i.d.)進行洗脫(elute)，洗脫液為二氯甲烷/甲醇(體積比1：1)，經洗脫後獲得富含生物鹼醯胺(macamides，或稱馬卡醯胺)的流分(fraction)。
再參照第3圖，第3圖係為本發明對馬卡進行液相萃取後，對甲醇層進行管柱層析之簡略流程示意圖。甲醇層萃取物使用矽膠層析管柱(30cm × 5.5cm i.d.)進行洗脫，洗脫液為正己烷/丙酮(共500mL)，兩者體積比依序以4：1、3：1、2：1、1：1及0：1(即僅有丙酮)進行洗脫，其後收集流分合併後，將合併後的流分以層析法分為7個主要流分(F-1至F-7)，取F-2流分(461.01mg)使用矽膠層析管柱(30cm × 3.0cm i.d.)進行洗脫，洗脫液為正己烷/二氯甲烷/甲醇(共200mL)，三者體積比依序以50：10：0、40：10：1、20：10：1、10：10：1、5：10：1及0：10：1進行洗脫，獲得7個流分(F-2-1至F-2-7)；取F-2-2流分(348.40mg)及F-2-3流分(65.84 mg)合併後，使用ODS(OctaDecylSilane，十八烷基矽烷，即碳18)層析管柱(6.5cm × 4.0cm i.d.)進行洗脫，洗脫液為甲醇/水(共160mL)，即甲醇水溶液，依序以體積比10%、30%、50%、60%、70%、80%、90%及100%進行洗脫，獲得7個流分(F-2-2-1至F-2-2-7)；取F-2-2-2流分(115.50mg)以矽膠層析管柱(20cm × 2.5cm i.d.)進行洗脫，洗脫液為二氯甲烷/乙酸乙酯(共100mL)，兩者體積比依序為20：1、10：1、5：1、1：1及0：1進行洗脫，獲得6個流分(F-2-2-2-1至F-2-2-2-6)；取F-2-2-2-4流分(58.14mg)以矽膠層析管柱(14cm × 2.5cm i.d.)進行洗脫，洗脫液為正己烷/乙酸乙酯(共80mL)，兩者體積比依序以5：1、3：1、1：1及0：1進行洗脫，獲得化合物7(23.62mg)及化合物8(8.44mg)；取F-2-2-3流分(23.95mg)以Luna矽膠層析管柱(正己烷/乙酸乙酯體積比3：1，流速2mL/min)，藉由高效能液相層析儀(HPLC)分離獲得化合物5(6.41mg)。
另取F-3流分(728.16mg)以ODS層析管柱(6.5cm × 4.0cm i.d.)進行洗脫，洗脫液為甲醇/水(共200mL)，即甲醇水溶液，依序以體積比10%、30%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%及100%進行洗脫，獲得8個流分(F-3-1至F-3-8)；取F-3-3(203.68mg)以矽膠層析管柱(20cm × 2.5cm i.d.)進行洗脫，洗脫液為二氯甲烷/乙酸乙酯(共100mL)，兩者體積比依序為9：1、4：1、2：1、1：1及0：1進行洗脫，獲得7個流分(F-3-3-1至F-3-3-7)；取F-3-3-3流分(8.86mg)以Luna矽膠層析管柱(正己烷/乙酸乙酯體積比3：2，流速2mL/min)，藉由高效能液相層析儀(HPLC)分離獲得化合物4(2.04mg)及化合物6(2.22mg)；取F-3-3-4流分(94.00mg)以矽膠層析管柱(18cm × 2.5cm i.d.)進行洗脫，洗脫液為正己烷/乙酸乙酯(共100mL)，兩者體積比依序以3：1、2：1、1：1及0：1進行洗脫，獲得4個流分(F-3-3-4-1至F-3-3-4-4)；取F-3-3-4-3流分(51.53mg)以CN層析管柱(正己烷/乙酸乙酯體積比1：1，流速2mL/min)，藉由高效能液相層析儀(HPLC)分離獲得化合物1(9.10mg)及化合物2(0.78mg)；取F-3-4流分(95.45mg)以矽膠層析管柱(20cm × 2.5cm i.d.)進行洗脫，洗脫液為正己烷/乙酸乙酯(共100mL)，兩者體積比依序為5：1、3：1、1：1及0：1進行洗脫，獲得6個流分(F-3-4-1至F-3-4-6)；取F-3-4-2流分(1.66mg)以Luna矽膠層析管柱(正己烷/乙酸乙酯體積比3：1，流速2mL/min)，藉由高效能液相層析儀(HPLC)分離獲得化合物3(0.42mg)。
實施例2
促血管生成試驗
內皮細胞培養：人類CD34-陽性內皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的分離及培養係使用習知之方法(Chen et al., 2018)所進行；人類臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)購自PromoCell (Heidelberg, Germany)；並根據習知方案(Chung et al., 2013)將EPC及HUVEC維持於MV2培養基中。
細胞生長測定：將EPC及HUVEC在96孔板中以每孔5×10 3個細胞的密度培養過夜，接著在測試樣品(即馬卡萃取物)存在，以MV2基礎培養基更換原培養基並培養48小時，EPC細胞生長的測定法如Yang et al., 2019所述。
毛細血管樣管形成測定：將EPC以每孔1.25×10 4個細胞的密度接種於基質膠(matrigel)塗布的96孔板中，並在MV2基礎培養基及測試流分中培養24小時，並根據Yang et al., 2019所述方案，檢查EPC分化與毛細血管樣管形成。
在各細胞培養後於10µg/mL的各液相層、5µg/mL的富含馬卡醯胺流分(即經洗脫後的正己烷層)以及50µM的各分離化合物進行試驗，結果如下表1所示，其結果為平均值±SEM(試驗皆進行三重複)，與對照組(DSMO)相較之下，*表示p ＜ 0.05、**表示p ＜ 0.01、***表示p ＜ 0.001；-表示未經測試。
表1
  樣品 促血管生成試驗
細胞生長率(%)
EPC HUVEC
馬卡粗萃物 - -
正己烷層 120 ± 1 *** 133 ± 6 ***
甲醇層 99 ± 1 106 ± 2
正丁醇層 107 ± 1 119 ± 4 *
第二水層 110 ± 2 * 114 ± 2 *
富含馬卡醯胺流分 128 ± 6 *** -
化合物1 99 ± 1 -
化合物2 - -
化合物3 - -
化合物4 103± 1 -
化合物5 99 ± 5 -
化合物6 104 ± 4 -
化合物7 105 ± 3 -
化合物8 103 ± 2 -
VEGF(20ng/mL) 128 ± 2 *** 122 ± 2 ***
血管內皮生長因子(VEGF)為血管生成的重要介質，將其作為陽性對照組，由表1中可看出正己烷層萃取物顯著增加了EPC及HUVEC的細胞生長；此外，源自正己烷層的富含馬卡醯胺流分則進一步將細胞生長率提升至128 ± 6%，為了評估馬卡萃取物的促血管生成活性，進一步比較了正己烷層以及富含馬卡醯胺流分。
請參考第4圖，第4圖係為正己烷層及富含馬卡醯胺的流分對人類內皮祖細胞管形成的影響，其中第4圖A為正己烷層，第4圖B為富含馬卡醯胺的流分。由圖中可知，正己烷層以及富含馬卡醯胺的流分均為濃度依賴性，即隨其濃度增加，EPC的毛細管狀管的形成長度增加。因此，由上述實驗結果表明正己烷層的萃取物及其富含馬卡醯胺的流分皆有促血管生成的活性，可改善組織缺血及血管再生。
實施例3
抗血栓試驗
體外血栓形成測定：使用Kao et al.,2021所述之方法進行體外血栓形成測定，將載有螢光染料DiOC 6(3)的人類全血通過膠原蛋白圖層流動腔室(µ-Slide VI 0.1)，以1500s -1的壁剪切速率灌注2分鐘，其後以磷酸鹽緩衝液洗滌後，用CCD相機記錄每個腔室的三個隨機視野，並使用ImageJ軟體分析血栓覆蓋的區域。
將濃度50µg/mL的馬卡粗萃物以及各液相萃取之分層(即正己烷層、第二水層、甲醇層以即正丁醇層)處理全血，以測定全血流動條件下的血栓形成，其中甲醇層與正己醇層未進行測試，因其在高濃度使用下會自行引起血小板聚集。結果如下表2所示，其結果為平均值±SEM(試驗皆進行三重複)，*表示p ＜ 0.05、**表示p ＜ 0.01、***表示p ＜ 0.001；N/A表示樣品加入培養基後形成菌絲體，因此結果無法證明。
表2
  樣品 抗血栓試驗
抑制率(%)
馬卡粗萃物 27.8 ± 4.2
正己烷層 N/A
甲醇層 N/A
正丁醇層 59.9 ± 6.1 **
第二水層 50.5 ± 12.1 **
由表2中可看出，經馬卡粗萃物處理的全血樣品，其血栓面積減少了27.8 ± 4.2%，而正丁醇層及第二水層表現出更佳的抗血栓活性，其血栓面積分別減少了59.9 ± 6.1%以及50.5 ± 12.1%。因此，由上述實驗結果表明馬卡以極性溶劑萃取之部分具有抗血栓生成之活性。
實施例4
抗中性粒細胞炎症試驗
人類中性粒細胞分離：根據葡聚糖沉降的標準方法，從外周血中獲得中性粒細胞，接著在Ficoll-Hypaque梯度中離心並進行紅細胞低滲裂解以純化出中性粒細胞；其後使用台盼藍(trypan blue)排除測試以證實純化出的中性粒細胞含有大於98%的活細胞，進行試驗前將純化出的中性粒細胞懸浮在4°C的無鈣HBSS中(Yang et al., 2013)。
超氧陰離子生成測定及彈性蛋白酶釋放抑制測定：藉由中性粒細胞活化確定超氧陰離子生成水平是基於Yang et al., 2013所述的鐵細胞色素c 還原法進行測定，即，將人類中性粒細胞(6×10 5個細胞/mL)與0.6mg/mL的鐵細胞色素c及1mmol/L的CaCl 2在37°C下混合，其後使用不同濃度的測試樣品(即馬卡萃取物)或DMSO(0.1%作為對照組)處理細胞5分鐘；接著用100nM的fMLF活化10分鐘之前，將細胞與細胞鬆弛素B(1µg/mL)一起培養3分鐘，使用分光光度計在不斷攪拌下連續監測500nm波長處隨鐵細胞色素c減少的吸光度變化，並計算基於有無SOD(超氧化物歧化酶，100U/mL)的反應中，除以減少的鐵細胞色素c(21.1mM -1cm -1)還原的消光係數，以獲得其差異值。
使用彈性蛋白酶(elastase)的釋放以測定活化的中性粒細胞上嗜天青顆粒(azurophilic granule)的脫顆粒(Yang et al., 2013)；使用甲氧基琥珀醯-Ala-Ala-Pro-Val-p-硝基苯胺作為彈性蛋白酶基質進行測定。在37°C下，將中性粒細胞(6×10 5個細胞/mL)添加到基質(100µmol/L)及CaCl 2(1 mmol/L)的混合物中，使用不同濃度的測試樣品即馬卡萃取物)或DMSO(0.1%作為對照組)處理5分鐘後，使用fMLF(100nM)/CB(0.5µg/mL)刺激細胞，並連續監測405nm波長處吸光度的變化，以測定彈性蛋白酶的釋放，並以染料木黃酮(Genistein)及LY294002作為陽性對照組。試驗結果如下表3所示，其結果為平均值±SEM(試驗進行三重複或四重複)，*表示p ＜ 0.05、**表示p ＜ 0.01、***表示p ＜ 0.001；-表示未經測試。
表3
  樣品 抗中性粒細胞炎症試驗
抑制率(%)
超氧陰離子生成 彈性蛋白酶釋放
馬卡粗萃物 - -
正己烷層 81.46 ± 5.56 *** 96.39 ± 5.89 ***
甲醇層 101.12 ± 0.26 *** 110.88 ± 0.24 ***
正丁醇層 75.96 ± 2.89 *** 27.86 ± 1.54 ***
第二水層 3.07 ± 6.75 5.54 ± 0.72 **
富含馬卡醯胺流分 - -
化合物1 7.50 ± 1.96 * 1.59 ± 0.99
化合物2 - -
化合物3 - -
化合物4 1.05 ± 0.78 0.00 ± 0.59
化合物5 21.59 ± 5.35 * 3.33 ± 0.50 **
化合物6 5.44 ± 2.18 2.69 ± 0.49 **
化合物7 10.94 ± 1.84 ** 2.48 ± 3.05
化合物8 0.45 ± 4.35 1.78 ± 2.29
染料木黃酮(10µM) 93.37 ± 0.93 *** 44.22 ± 3.72 ***
LY294002(10µM) 95.31 ± 2.78 *** 72.80 ± 4.03 ***
由表3中可看出，甲醇層及正己烷層的抗中性粒細胞炎症活性均非常顯著，藉由完全消除fMLF活化的中性粒細胞功能(分別為101.12 ± 0.26% 和 110.88 ± 0.24%)，可見甲醇層(10µg/mL)在所有液相萃取層中對超氧陰離子生成及彈性蛋白酶釋放表現出最強的抑制作用；此外，正己烷層(10µg/mL)對超氧陰離子生成(81.46 ± 5.56%)和彈性蛋白酶釋放(96.39 ± 5.89%)也表現出有效的抑制作用，而正丁醇層僅對超氧陰離子生成(75.96 ± 2.89%)有顯著抑制作用。
在此試驗中，僅有化合物5(10µM)對fMLF/CB所誘導的中性粒細胞中超氧陰離子生成有輕微的抑制作用(21.59 ± 5.35%)；與甲醇層及正己烷層的結果相比，分離出的化合物對於抗中性粒細胞炎症的活性均不顯著。因此，由上述實驗結果表明馬卡以中低極性溶劑萃取以及低極性溶劑萃取之部分具有抗中性粒細胞炎症的活性。
實施例5
抗過敏試驗
細胞培養：使用Korinek et al., 2017所述之方法培養黏膜肥大細胞(mucosal mast cell)衍生的大鼠嗜鹼性白血病(RBL-2H3)。使用10%FBS補充的DMEM培養基以及額外的100U/mL青黴素與100µg/mL鏈黴素培養細胞，細胞在10cm的培養皿中於37°C的5%CO 2培養箱內培養，細胞在80%融合度的胰蛋白酶中繼代培養，接著以2×10 5個細胞/mL的密度於培養板接種用於分泌測定。
細胞存活測定：將濃度為2×10 4個細胞/孔的RBL-2H3細胞接種在96孔板中隔夜，接著使用不同濃度的樣品(即馬卡萃取物，溶解於DMSO中)或未處理的對照組(1%DMSO於Tyrode緩衝液中；135mM NaCl、5mM KCl、1.8mM CaCl 2、1.0mM MgCl 2、5.6mM葡萄糖、20mM HEPES以及1mg/ml BSA，pH 7.4)處理細胞，在37°C、5%CO 2中培養1小時後，除去每個孔上的培養基，將MTT溶液(5mg/mL)原液在培養基中按1:10稀釋，然後加入孔中(每孔100µL)；其後，將細胞在37°C、5%CO 2中培養1小時，除去培養基，將形成的甲臢晶體(正常健康細胞中方可形成)溶解在100µL DMSO中，使用酶標儀(microplate reader)在574nm波長處測量吸光度之前輕輕搖動板後測量。每個樣品的細胞活力值計算以對照組(未處理細胞)的百分比(%)表示。
A23187與抗原誘導的RBL-2H3細胞中的β-胺基己糖苷酶釋放抑制測定：將RBL-2H3細胞以2×10 4個細胞/孔的密度分配在96孔板中，而抗原誘導實驗的細胞在以3×10 4個細胞/孔的密度接種於48孔板後，用抗DNP IgE(0.05µg/ml)致敏，接著在37°C、5%CO 2中培養隔夜，使細胞完全黏附在孔的底部；其後將不同濃度的樣品(即馬卡萃取物，溶解於DMSO中)或Tyrode緩衝液(1%DMSO，作為未處理的對照組)添加至每個孔(100µL)中，並於37°C、5%CO 2中培育30分鐘；後續去除上清液並藉由鈣離子載體A23187(0.5µM，A23187誘導測定)或交聯抗原DNP-BSA(100ng/ml，抗原誘導測定)刺激細胞，於37°C、5%CO 2中培育30分鐘，而未經刺激的細胞使用0.5%Triton X-100溶液裂解以釋放β-己糖胺酶，抑或不處理以自發釋放β-胺基己糖苷酶。將對照孔及實驗孔的等分上清液(50µL)與在0.1M檸檬酸鹽緩衝液(pH 4.5)中製備的等體積(50µL)的1µM p-NAG 一起培養，該緩衝液成為釋放的β-胺基己糖苷酶的基質；在37°C下培養1小時後，加入100µL終止緩衝液(0.1M Na 2/NaHCO 3，pH 10.0)使反應終止，接著在酶標儀上測量405nm波長處的吸光度。RBL-2H3細胞釋放β-胺基己糖苷酶的抑制百分比計算為對照組(未處理的刺激細胞)的百分比(%)，氮卓斯汀(Azelastine，20µM)作為陽性對照組。試驗結果如下表4至表6所示，其結果為平均值±SEM(試驗進行三重複)，*表示p ＜ 0.05、**表示p ＜ 0.01、***表示p ＜ 0.001；-表示未經測試；N/A表示樣品加入培養基後形成菌絲體，因此結果無法證明。
表4
      樣品 抗過敏試驗
A23187誘導的β-胺基己糖苷酶釋放 抗原誘導的β-胺基己糖苷酶釋放
抑制率(%) IC 50 抑制率(%) IC 50
馬卡粗萃物 14.7 ± 2.7 *** ＞200 6.7 ± 3.6 ＞200
正己烷層 N/A N/A N/A N/A
甲醇層 83.0 ± 2.2 *** 97.1 75.0 ± 5.1 *** 102.7
正丁醇層 22.3 ± 2.6 *** ＞200 28.7 ± 2.9 *** ＞200
第二水層 4.3 ± 2.4 ＞200 0.7 ± 0.5 ＞200
富含馬卡醯胺流分 - - - -
化合物1 4.0 ± 1.7 ＞200 9.0 ± 3.7 ＞200
化合物2 - - - -
化合物3 4.7 ± 0.7 ＞200 10.7 ± 3.3 ＞200
化合物4 6.7 ± 1.4 ＞200 10.0 ± 4.1 ＞200
化合物5 51.3 ± 4.6 *** 96.1 11.7 ± 5.9 ＞200
化合物6 9.7 ± 2.2 ＞200 3.7 ± 3.0 ＞200
化合物7 6.0 ± 0.8 ＞200 8.0 ± 1.2 ＞200
化合物8 8.3 ± 3.4 ＞200 13.0 ± 2.6 ＞200
氮卓斯汀 47.7 ± 3.2 *** - 54.3 ± 1.8 *** -
表5
    樣品 RBL-2H3細胞於200µg/ml下之存活率 A23187誘導的β-胺基己糖苷酶釋放的抑制百分比(%) 抗原誘導的β-胺基己糖苷酶釋放的抑制百分比(%)
20µg/mL 100µg/mL 200µg/mL IC 50(µg/ml) 20µg/mL 100µg/mL 200µg/mL IC 50(µg/ml)
馬卡粗萃物 90.7% 5.3 ± 2.4% - 14.7 ± 2.7% *** - 1.7 ± 1.0% - 6.7 ± 3.6% -
正己烷層 (100µg/mL) 92.3% 17.0 ± 1.2% *** 31.7 ± 2.3% *** - - 9.3 ± 5.0% 33.3 ± 6.4% *** - -
甲醇層 92.3% 23.3 ± 1.0% *** 51.0 ± 3.3% *** 83.0 ± 2.2% ***   23.3 ± 3.9% *** 49.3 ± 5.7% *** 75.0 ± 5.1% *** 102.7
正丁醇層 92.7% 4.0 ± 1.9% - 22.3 ± 2.6% *** 97.1 7.3 ± 2.7% - 28.7 ± 2.9% *** -
第二水層 92.3% 6.3 ± 1.9% - 4.3 ± 2.4% - 8.3 ± 1.7% - 0.7 ± 0.5% -
氮卓斯汀(20µM) 88.0% 47.7 ± 3.2% *** - - - 54.3 ± 1.8% *** - - -
表6
    樣品 RBL-2H3細胞於500µM/ml下之存活率 A23187誘導的β-胺基己糖苷酶釋放的抑制百分比(%) 抗原誘導的β-胺基己糖苷酶釋放的抑制百分比(%)
10µM/mL 100µM/mL 500µM/mL IC 50(µM) 10µM/mL 100µM/mL 500µM/mL IC 50(µM)
化合物1 95.3% 2.7 ± 1.2% 4.0 ± 1.7% 38.0 ± 3.4% *** - 3.7 ± 1.9% 5.7 ± 2.2% 9.0 ± 3.7% -
化合物3 95.0% 3.7 ± 1.5% 4.7 ± 0.7% 12.7 ± 0.7% ** - 13.7 ± 1.9% 10.7 ± 3.3% 5.0 ± 4.1% -
化合物4 96.0% 8.3 ± 1.0% 6.7 ± 1.4% - - 16.7 ± 6.6% * 10.0 ± 4.1% - -
化合物5 94.0% 21.3 ± 3.3% *** 51.3 ± 4.6% *** 57.7 ± 4.3% *** 96.1 9.0 ± 4.8% 11.7 ± 5.9% 8.3 ± 3.5% -
化合物6 100.0% 5.7 ± 1.0% 9.7 ± 2.2% 26.0 ± 2.4% ***   10.3 ± 3.9% 3.7 ± 3.0% 0.3 ± 0.3% -
化合物7 94.7% 2.0 ± 1.6% 6.0 ± 0.8% 18.0 ± 3.4% ***   11.7 ± 2.6% 8.0 ± 1.2% 0.0 ± 0.0% -
化合物8 97.7 11.0 ± 0.8% * 8.3 ± 3.4% 11.7 ± 1.5% *   13.7 ± 3.9% 13.0 ± 2.6% 4.0 ± 3.3% -
氮卓斯汀(20µM) 88.0% 47.7 ± 3.2% *** - - - 54.3 ± 1.8% *** - - -
由表4中可看出，甲醇層在抗過敏試驗中具有顯著的效果，在A23187(IC 5097.1µg/mL)和抗原(IC 50102.7µg/mL)誘導的RBL-2H3細胞中，抑制了β-胺基己糖苷酶的釋放。
由表5中可看出，在甲基噻唑基四唑(MTT)測定中顯示＞90%的活性，而藉由抑制A23187和抗原誘導的RBL-2H3細胞脫粒中的β-胺基己糖苷酶釋放來評估化合物的抗過敏活性，甲醇層的抑制效果依然顯著。
由表4及表6中可看出，化合物5(IC 5096.1µM)對A23187誘導的RBL-2H3細胞脫粒表現出最強的抑制作用，且化合物5的β-胺基己糖苷酶釋放抑制活性在10~500µM之間以劑量依賴性方式增加；此外，化合物1(500µM)對A23187誘導的β-胺基己糖苷酶釋放活性表現出輕度抑制(38.0 ± 3.4%)。然而，在抗原誘導的β-胺基己糖苷酶釋放試驗中，沒有一種化合物表現出顯著的抑制作用，故該些結果表明化合物5係藉由不依賴IgE的過敏基至而發揮作用，特別是與抑制肥大細胞中的鈣流入有關。
因此，由上述實驗結果表明馬卡以中低極性溶劑萃取之部分具有抗中性粒細胞炎症的活性。
綜上各實施例所得之試驗結果，馬卡萃取物使用極性溶劑萃取之部分具有抗血栓生成之活性，使用中低極性溶劑萃取之部分則具有抗中性粒細胞炎症以及抗過敏之活性，而使用低極性溶劑萃取之部分也具有抗中性粒細胞炎症之活性，且也具有促血管生成之活性；此外，於萃取馬卡的過程中，也首次分離出3種的新生物鹼衍生化合物。
本發明所屬技術領域者能夠自前述內容理解，本發明可藉由其他具體形式例式之而不改變本揭露內容之技術概念或本質特徵。就此而言，本文中揭露之例示性態樣係僅用於例示性說明之用，且不應解釋為限制本揭露內容之範疇。反之，本揭露內容係傾向於不僅涵蓋該等例示性態樣，亦涵蓋可包括於如後所附申請專利範圍定義者之本發明內容之精神及範疇內的多種變更、修飾、均等物、及其他態樣。
無
以下搭配圖式，對於本發明進行進一步說明：
第1圖係為本發明所萃取出之馬卡萃取生物鹼衍生物的化合物結構示意圖； 第2圖係為本發明對馬卡進行液相萃取之簡略流程示意圖； 第3圖係為本發明對馬卡進行液相萃取後，對甲醇層進行管柱層析之簡略流程示意圖； 第4圖係為正己烷層及富含馬卡醯胺的流分對人類內皮祖細胞管形成的影響，其中第4圖A為正己烷層，第4圖B為富含馬卡醯胺的流分。

Claims (2)

  1. 一種馬卡萃取物，該馬卡萃取物之萃取流程如下： 將馬卡塊莖在室溫下以95%的乙醇水溶液進行萃取獲得馬卡粗萃物； 將該馬卡粗萃物以乙酸乙酯及水進行分相萃取，獲得第一水層萃取物及乙酸乙酯層萃取物；以及 將該第一水層萃取物以正丁醇進行分相萃取，獲得之第二水層萃取物以及正丁醇層萃取物即為該馬卡萃取物。
  2. 一種馬卡萃取物之用途，其用於製備抗血栓生成之藥物的用途，其中該馬卡萃取物之萃取流程如下： 將馬卡塊莖在室溫下以95%的乙醇水溶液進行萃取獲得馬卡粗萃物； 將該馬卡粗萃物以乙酸乙酯及水進行分相萃取，獲得第一水層萃取物及乙酸乙酯層萃取物；以及 將該第一水層萃取物以正丁醇進行分相萃取，獲得之第二水層萃取物以及正丁醇層萃取物即為該馬卡萃取物。
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