TWI874546B

TWI874546B - 誘導外顯子５０的跳讀的反義核酸

Info

Publication number: TWI874546B
Application number: TW109146242A
Authority: TW
Inventors: 塩谷由輝子; 砂土居裕太; 脇玲子; 鞭馬奏萌; 武田伸一; 青木吉嗣
Original assignee: 日商日本新藥股份有限公司; 國立研究開發法人國立精神神經醫療研究中心
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2025-03-01
Also published as: CO2022008664A2; WO2021132591A1; US11655472B2; EP4083208A4; EP4083208A1; KR20220122673A; IL294271A; PH12022551431A1; JP2022133312A; US20220333112A1; TW202523843A; US20230073008A1; JP7201192B2; MX2022007937A; BR112022012622A2; TW202138560A; CN114901823A; AU2020411964A1; CA3165961A1; CN118109468A

Abstract

本說明書提供將人類肌肉萎縮蛋白基因第50個外顯子以高效率跳讀之藥劑。另外，本說明書提供誘導人類肌肉萎縮蛋白基因第50個外顯子的跳讀的反義寡聚物。

Description

誘導外顯子50的跳讀的反義核酸

本發明係有關誘導人類肌肉萎縮蛋白基因第50個外顯子的跳讀的反義寡聚物及含有該反義寡聚物之醫藥組成物。

裘馨氏型肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy，即DMD)為出生男性約3,500人中有1人發症之頻率最高之嚴重的基因性進行性肌肉萎縮症。其於乳幼兒期顯示與正常人幾乎相同之運動功能，惟於4至5歲時開始可見肌力降低。然後，DMD患者之肌力持續降低，DMD患者在到約12歲為止會變成不能步行，於20幾歲會因心臟衰竭或呼吸器衰竭而導致死亡。現在對於DMD尚無充分之治療法，強烈需求開發有效的治療藥。

己知DMD之原因為肌肉萎縮蛋白基因之突變。肌肉萎縮蛋白基因係存在於X染色體，為由220萬個鹼基之DNA所構成之巨大基因。從DNA轉錄為mRNA前驅物，更進一步藉由剪接而除去內含子，79個外顯子結合，對應轉譯領域之mRNA係成為11,058個鹼基。從該mRNA轉譯為3,685個胺基酸，生成肌肉萎縮蛋白蛋白質。肌肉萎縮蛋白蛋白質會參與維持肌細胞膜之安定性，為了使肌細胞不易被破壞而為必要。由於DMD患者之肌肉萎縮蛋白基因有突變，所以在肌細胞中幾乎未表現具有功能之肌肉萎縮蛋白蛋白質。因此，於DMD患者體內，會變成無法維持肌細胞之結構，大量之鈣離子流入肌細胞內。結果會產生類似炎症之反應，使纖維化進展，導致肌細胞難以再生。

貝克氏肌肉萎縮症(Becker muscular dystrophy，即BMD)也是以肌肉萎縮蛋白基因之突變為其原因，其症狀雖然因肌肉萎縮而呈現肌力降低，惟通常相較於DMD而為症狀較輕，肌力降低之進展亦較慢，多半於成人期發症。關於DMD與BMD之臨床症狀不同處，可認為是取決於因突變而使肌肉萎縮蛋白之mRNA在轉譯為肌肉萎縮蛋白蛋白質時之胺基酸閱讀框架是被破壞或是被維持(非專利文獻1)。亦即，於DMD之情形下，由於有胺基酸閱讀框架偏移之突變，故幾乎未表現具有功能之肌肉萎縮蛋白蛋白質，但於BMD之情形下，則是因突變而使外顯子之一部分缺失，仍維持胺基酸閱讀框架，故會產生僅管不完全但仍具有功能之肌肉萎縮蛋白蛋白質。

就DMD之治療法而言，係期待外顯子跳讀法。此方法為藉由改變剪接而修復肌肉萎縮蛋白之mRNA之胺基酸閱讀框架，誘導部分性功能恢復之肌肉萎縮蛋白蛋白質之表現的方法(非專利文獻2)。作為外顯子跳讀對象之胺基酸序列部分係缺失。因此，於此治療下，所表現之肌肉萎縮蛋白蛋白質會變得比正常者短，但由於維持胺基酸閱讀框架，故能部分性地保持使肌細胞安定化之功能。所以，期待DMD能藉由外顯子跳讀而呈現與較輕症之BMD相同之症狀。外顯子跳讀法係已歷經小鼠或狗之動物實驗，正在進行對於人類DMD患者之臨床試驗。

外顯子跳讀可藉由以5’或3’剪接部點之任一部點或雙方或外顯子之內部作為標的之反義核酸之結合來誘導。外顯子只於雙方剪接部點被剪接體複合物所識別時包含於mRNA。因此，藉由將剪接部點以反義核酸作成標的，而可誘導外顯子跳讀。另外，認為若欲使外顯子被剪接機構所識別則需要SR蛋白質結合於外顯子剪接增強子(exonic splicing enhancer，即ESE)，故亦可藉由將ESE作為標的來誘導外顯子跳讀。

肌肉萎縮蛋白基因之突變係依DMD患者而異，所以，需要對應基因突變之位置或種類之反義核酸。至今，西澳大學之Steve Wilton人等已對於全部79個外顯子製作誘導外顯子跳讀之反義核酸(非專利文獻3)，荷蘭之Annemieke Aartsma-Rus人等已對於39種外顯子製作誘導外顯子跳讀之反義核酸(非專利文獻4)。

可認為所有DMD患者之約4%能藉由將第50個外顯子(以下亦稱為「外顯子50」)跳讀而予以治療(非專利文獻5)。近年來，關於將肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50作為外顯子跳讀之標的之研究，包括本案申請人在內已有複數個研究機關有做相關報告(專利文獻1至6及非專利文獻6)。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2013/100190號

[專利文獻2]國際公開第2004/048570號

[專利文獻3]國際公開第2006/000057號

[專利文獻4]國際公開第2010/050802號

[專利文獻5]國際公開第2010/048586號

[專利文獻6]國際公開第2011/057350號

[非專利文獻1]Monaco A. P. et al., Genomics 2:90-95 (1988)

[非專利文獻2]Matsuo M., Brain and Development 18:167-172 (1996)

[非專利文獻3]Wilton S. D. et al., Molecular Therapy 15:1288-96 (2007)

[非專利文獻4]Annemieke Aartsma-Rus et al., Neuromuscular Disorders 12:S71-S77 (2002)

[非專利文獻5]Bladen C. L. et al., Human Mutation 36:395-402 (2015)

[非專利文獻6]Bo Wu et al., PLosOne 6(5):e19906(2011)

於如上所述之狀況，期待以高效率誘導肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50之跳讀的新穎反義寡聚物。另外，期待可維持以高效率誘導肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50之跳讀之活性且具有作為醫藥之優異物性(例如溶解性)之反義寡聚物。

本發明人等詳細研究上述文獻所記載之技術內容及肌肉萎縮蛋白基因之結構等，結果發現藉由投予具有序列編號3至5中任一表示之鹼基序列之反義寡聚物，可以高效率誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50的跳讀。另外，發現前述反義寡聚物係以高效率誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀且具有優越之溶解性。本發明人等係以此見解為基礎而完成本發明。

亦即，本發明係如下所述。

[1]一種反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，該反義寡聚物係選自由下述(a)至(d)所成群組；(a)一種反義寡聚物，其含有序列編號3至5中任一鹼基序列；(b)一種反義寡聚物，其含有相對於序列編號3至5中任一鹼基序列而有1至5個鹼基缺失、置換、插入及/或加成之鹼基序列，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性；(c)一種反義寡聚物，其含有相對於序列編號3至5中任一鹼基序列而有80%以上之序列同一性之鹼基序列，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性；以及(d)一種反義寡聚物，其係與寡核苷酸在嚴苛條件下進行雜交之反義寡聚物，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性，其中，該寡核苷酸係由與序列編號3至5中任一鹼基序列相補之鹼基序列所構成。

[2]一種反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，該反義寡聚物係選自由下述(e)至(h)所成群組；(e)一種反義寡聚物，其係由序列編號3至5中任一鹼基序列所構成；(f)一種反義寡聚物，其係由相對於序列編號3至5中任一鹼基序列而有1至5個鹼基缺失及/或置換之鹼基序列所構成，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性；(g)一種反義寡聚物，其係由相對於序列編號3至5中任一鹼基序列而有80%以上之序列同一性之鹼基序列所構成，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性；以及(h)一種反義寡聚物，其係與寡核苷酸在高嚴苛條件下進行雜交之反義寡聚物，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性，其中，該寡核苷酸係由與序列編號3至5中任一鹼基序列相補之鹼基序列所構成。

[3]如上述[1]或[2]所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，前述反義寡聚物含有相對於序列編號3至5中任一鹼基序列而有90%以上之序列同一性之核苷酸序列，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性。

[4]如上述[1]至[3]中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，反義寡聚物為寡核苷酸。

[5]如上述[4]所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分及/或磷酸鍵部分係經修飾。

[6]如上述[4]或[5]所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分係2’位之-OH基經選自由OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及I所成群組中之任一個基取代之核糖；上述R表示烷基或芳基，上述R’表示伸烷基。

[7]如上述[4]至[6]中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之磷酸鍵部分係選自由硫代磷酸酯鍵(phosphorothioate bond)、二硫代磷酸酯鍵(phosphorodithioate bond)、烷基磷酸酯鍵(alkylphosphonate bond)、胺基磷酸酯鍵(phosphoroamidate bond)及硼烷磷酸酯鍵(boranophosphate bond)所成群組中之至少一種。

[8]如上述[1]至[3]中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，反義寡聚物為嗎啉基寡聚物(morpholino oligomer)。

[9]如上述[8]所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，反義寡聚物為二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer)。

[10]如上述[8]或[9]所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，5’末端為下述化學式(1)至(3)中任一種基，

[11]如上述[1]至[10]中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，反義寡聚物之長度為19或20個鹼基。

[12]一種肌肉萎縮治療用醫藥組成物，其含有上述[1]至[11]中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物。

[13]如上述[12]所述之醫藥組成物，其更含有醫藥上容許之載體。

[14]一種醫藥組成物，其係用以投予至肌肉萎縮患者之上述[12]或[13]所述之醫藥組成物，其中，前述患者為在肌肉萎縮蛋白基因中具有會成為外顯子50跳讀之對象之突變的患者。

[15]如上述[14]所述之醫藥組成物，其中，前述患者具有肌肉萎縮蛋白基因，該肌肉萎縮蛋白基因具有至少由外顯子50附近之外顯子缺失所引起之框移突變(frameshift mutation)，且同時能藉由外顯子50跳讀而修正胺基酸閱讀框架。

[16]如上述[14]或[15]所述之醫藥組成物，其中，前述患者係於肌肉萎縮蛋白基因具有由外顯子51、51-53、51-55或51-57缺失所引起之框移突變。

[17]如上述[14]至[16]中任一項所述之醫藥組成物，其中，前述患者為人類。

[18]一種上述[1]至[11]中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物之用途，係用於製造肌肉萎縮治療用醫藥。

[19]一種肌肉萎縮之治療方法，其包含對於肌肉萎縮患者投予有效量之上述[1]至[11]中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物或上述[12]至[16]中任一項所述之醫藥組成物之步驟。

[20]如上述[19]所述之治療方法，其中，前述患者為人類。

[21]如上述[1]至[11]中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物或上述[12]至[16]中任一項所述之醫藥組成物，係用於治療肌肉萎縮。

[22]如上述[21]所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物或醫藥組成物，其中，於前述治療中，肌肉萎縮患者為人類。

根據本發明，可提供以高效率誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之反義寡聚物。另外，根據本發明，可提供能維持高效率誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性且具有優越溶解性之反義寡聚物。

圖1係表示PMO No.1及2之反義寡聚物於人類橫紋肌肉瘤細胞(RD細胞)中的人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50之跳讀效率。

圖2係表示PMO No.1、3及4之反義寡聚物於RD細胞中的人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50之跳讀效率。

圖3係表示PMO No.1、5、6及7之反義寡聚物於RD細胞中的人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50之跳讀效率。

以下，針對本發明作詳細說明。以下之實施形態為用於說明本發明之例示，本發明不限定於此實施形態。本發明在不脫離其要旨之情況下可以各種形態進行實施。

1.反義寡聚物

本發明提供將人類肌肉萎縮蛋白基因之第50個外顯子以高效率跳讀之反義寡聚物(以下亦稱為「本發明之反義寡聚物」)。

[人類肌肉萎縮蛋白基因之第50個外顯子]

於本發明中，「基因」除了包含基因組基因以外亦包含cDNA、mRNA前驅物及mRNA。基因係較佳為mRNA前驅物，亦即pre-mRNA。

於人類基因組中，人類肌肉萎縮蛋白基因係存在於基因座Xp21.2。人類肌肉萎縮蛋白基因具有220萬個鹼基對之大小，為已知之人類基因中最大之基因。惟，人類肌肉萎縮蛋白基因之編碼領域係少到僅有14kb，該編碼領域係作為79個外顯子而分散於肌肉萎縮蛋白基因內(Roberts,RG.,et al.,Genomics,16：536-538(1993)；Koenig,M.,et al.,Cell 53 219-228,1988)。屬於人類肌肉萎縮蛋白基因之轉錄物的pre-mRNA，係接受剪接而生成14kb之成熟mRNA。人類之野生型肌肉萎縮蛋白基因之鹼基序列為公知(GenBank Accession No.NM_004006)。

序列編號1表示包含人類野生型肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50及內含子50之5’端附近之序列的鹼基序列。

[反義寡聚物]

本發明之反義寡聚物係以「藉由人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀，將經DMD型肌肉萎縮蛋白基因所編碼之蛋白質改變成BMD型肌肉萎縮蛋白蛋白質」作為目的而製作者。因此，在作為反義寡聚物之外顯子跳讀之對象的肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50中，不僅包含野生型，亦包含突變型。

本發明之反義寡聚物，具體而言係選自由以下之(a)至(d)所成群組中之任一項所述之反義寡聚物。

(a)一種反義寡聚物，其含有序列編號3至5中任一鹼基序列；(b)一種反義寡聚物，其含有相對於序列編號3至5中任一鹼基序列而有1至5個、1至4個、1至3個、1至2個或1個鹼基缺失、置換、插入及/或加成之鹼基序列，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性；(c)一種反義寡聚物，其含有相對於序列編號3至5中任一鹼基序列而有80%以上、84%以上、85%以上、89%以上、90%以上、94%以上或95%以上之序列同一性之鹼基序列，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性；以及(d)一種反義寡聚物，其係與寡核苷酸在嚴苛條件下進行雜交之反義寡聚物，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性，其中，該寡核苷酸係由與序列編號3至5中任一鹼基序列相補之鹼基序列所構成。

於其他態樣中，本發明之反義寡聚物就具體而言係選自由以下之(e)至(h)所成群組中之任一項所述之反義寡聚物。

(e)一種反義寡聚物，其係由序列編號3至5中任一鹼基序列所構成；

(f)一種反義寡聚物，其係由相對於序列編號3至5中任一鹼基序列而有1至5個、1至4個、1至3個、1至2個或1個鹼基缺失及/或置換之鹼基序列所構成，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性；

(g)一種反義寡聚物，其係由相對於序列編號3至5中任一鹼基序列而有80%以上、84%以上、85%以上、89%以上、90%以上、94%以上或95%以上之序列同一性之鹼基序列所構成，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性；以及

(h)一種反義寡聚物，其係與寡核苷酸在高嚴苛條件下進行雜交之反義寡聚物，且具有誘導人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性，其中，該寡核苷酸係由與序列編號3至5中任一鹼基序列相補之鹼基序列所構成。

上述(b)至(d)之反義寡聚物及(f)至(h)之反義寡聚物，具體而言，各自為(a)之反義寡聚物及(e)之反義寡聚物之突變體，係考慮到對應患者之肌肉萎縮蛋白基因突變(例如多型)等者。

本說明書中，「於嚴苛條件下進行雜交之反義寡聚物」係指例如以由與序列編號3至5中任一鹼基序列相補之鹼基序列所構成之寡核苷酸之全部或一部分作為探針，藉由使用菌落雜交法、溶菌斑雜交法或南方雜交法等獲得之反義寡聚物。雜交之方法可利用例如於"Sambrook & Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor,Laboratory Press 2001"及"Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons 1987-1997"等中記載之方法。

本說明書中，「嚴苛條件」可為低嚴苛條件、中嚴苛條件及高嚴苛條件中任一種。「低嚴苛條件」係指例如5×SSC、5×登哈特溶液(Denhardt's solution)、0.5%SDS、50%甲醯胺、32℃之條件。另外，「中嚴苛條件」係指例如5×SSC、5×登哈特溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、42℃，或5×SSC、1% SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50%甲醯胺、42℃之條件。「高嚴苛條件」係指例如(1)5×SSC、5×登哈特溶液、0.5%SDS、50%甲醯胺、50℃，(2)0.2×SSC、0.1% SDS、60℃，(3)0.2×SSC、0.1% SDS、62℃，(4)0.2×SSC、0.1% SDS、65℃，或(5)0.1×SSC、0.1%SDS、65℃之條件，惟不限定於此等。於此等條件下，溫度越高越可期待有效率地獲得具有高序列同一性之反義寡聚物。惟，關於影響雜交之嚴苛程度之要素，可認為有溫度、探針濃度、探針之長度、離子強度、時間、鹽濃度等複數種要素，只要是本發明所屬技術領域中具有通常知識者，即可藉由適當選擇此等要素而實現相同之嚴苛程度。此處，「序列同一性」係指針對某2個核酸之配對，於作為比較對象之鹼基序列之全範圍中之同一性；於本發明之技術領域中，係以在使用公知之數學演算法而作成之鹼基序列之最佳比對中為一致之鹼基之比例(%)來表示。例如，相對於由某20個鹼基之鹼基序列所構成之反義寡聚物，由具有「80%序列同一性」之鹼基序列構成之反義寡聚物係指相對於前述20個鹼基之反義寡聚物而具有16個鹼基以上之相同之鹼基的反義寡聚物。

另外，於雜交中使用市售之套組時，可使用例如鹼性磷酸酶直接標記及檢測系統(Alkphos Direct Labelling and Detection System)(GE Healthcare公司製造)。此時，依照套組附加之計劃書，與經標記之探針進行培養一晚後，將薄膜於55℃條件下以含有0.1%(w/v)SDS之1次洗淨緩衝液洗淨後，可檢測出經雜交之反義寡聚物。或者是，在依據與序列編號3至5中任一鹼基序列相補之鹼基序列之全部或一部分而製作探針時，當使用市售之試劑(例如PCR Labeling mix(羅氏診斷公司(Roche diagnostics Co.,Ltd)製造)等)將該探針進行毛地黃苷(Digoxigenin，即DIG)標記時可使用DIG核酸檢測套組(羅氏診斷公司製造)來檢測雜交。

關於上述以外之可進行雜交之反義寡聚物，可列舉如：藉由FASTA、BLAST等相同性檢索軟體，使用預設之參數計算時，與序列編號3至5中任一鹼基序列有90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上或99.9%以上之序列同一性之反義寡聚物。

另外，序列同一性可使用FASTA(Science 227(4693)：1435-1441,(1985))、或卡林及亞瑟(Karlin and Altschul)之演算法BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873,1993)來決定。已開發以BLAST之演算法為基礎而稱為blastn、blastx、tblastn或tblastx之程式(program)(Altschul SF,et al：JMol Biol 215：403,1990)。當使用blastn分析鹼基序列時，參數係設為例如分數(score)=100、字長(wordlength)=12。使用BLAST及Gapped BLAST程式時係使用各程式之預設參數。

「(可能)誘導人類肌肉萎縮蛋白基因第50個外顯子的跳讀」係指藉由使本發明之反義寡聚物結合於人類肌肉萎縮蛋白基因之轉錄物(例如pre-mRNA)之外顯子50及/或相當於其隣接內含子之部位，而使該轉錄物於接受剪接時發生外顯子50之除外，例如若為外顯子51缺失之DMD患者，則是於相當於外顯子49之3’末端之鹼基序列上連結相當於外顯子52之5’末端之鹼基序列，而形成未發生密碼子之框移的成熟mRNA。

因此，只要是於肌肉萎縮蛋白基因具有作為外顯子50跳讀的對象之突變之DMD患者，即可藉由外顯子50跳讀來治療。如此之DMD患者可列舉例如：具有肌肉萎縮蛋白基因之DMD患者，該肌肉萎縮蛋白基因具有至少由外顯子50附近之外顯子缺失所引起之框移突變，且同時能藉由外顯子50跳讀而修正胺基酸閱讀框架；更具體而言，可列舉例如具有因具有肌肉萎縮蛋白基因之外顯子51、51-53、51-55、51-57等之缺失所引起之框移突變的DMD患者。

此處，前述「結合」係指在將本發明之反義寡聚物與人類肌肉萎縮蛋白基因之轉錄物予以混合時，於生理條件下兩者進行雜交而形成雙股。上述「生理條件下」係指調節成與生體內類似之pH、鹽組成、溫度之條件。可列舉例如25至40℃(較佳為37℃)、pH5至8(較佳為pH7.4)、氯化鈉濃度為150mM之條件。

關於是否發生人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50之跳讀，可藉由在肌肉萎縮蛋白表現細胞(例如人類橫紋肌肉瘤細胞)中導入本發明之反義寡聚物，從上述肌肉萎縮蛋白表現細胞之總RNA，將人類肌肉萎縮蛋白基因之mRNA之外顯子50之週邊領域進行RT-PCR增幅，對於該PCR增幅產物進行巢式聚合酶鏈式反應(nested PCR)或序列分析而確認。關於跳讀效率ES(單位：%)，係可藉由將人類肌肉萎縮蛋白基因之mRNA從被檢測之細胞中回收，測定該mRNA中之外顯子50跳讀之譜帶(band)之多核苷酸量「A」及外顯子50未跳讀之譜帶之多核苷酸量「B」，以此等「A」及「B」之測定值為基礎，根據以下之式(1)而計算。對於跳讀效率之計算可參照國際公開第2012/029986號。

ES=100×A/(A+B)‧‧‧(1)

本發明之反義寡聚物係較佳為將外顯子50以10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上之效率跳讀。

本發明之反義寡聚物可列舉例如具有16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個鹼基之長度的寡核苷酸、嗎啉基寡聚物或肽核酸(Peptide Nucleic Acid，即PNA)寡聚物。反義寡聚物之長度較佳為16至25個鹼基、16至23個鹼基、19個鹼基或20個鹼基之長度，較佳為嗎啉基寡聚物。

上述寡核苷酸(以下亦稱為「本發明之寡核苷酸」)係以核苷酸作為構成單元之本發明之反義寡聚物，該核苷酸可為核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或修飾核苷酸之任一種。

修飾核苷酸係指構成核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸之核酸鹼基、糖部分及磷酸鍵部分之全部或一部分經修飾者。

於本發明中，核酸鹼基可列舉例如腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、脲嘧啶或此等之修飾鹼基。該修飾鹼基可列舉例如假脲嘧啶、3-甲基脲嘧啶、二氫脲嘧啶、5-烷基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)、5-烷基脲嘧啶(例如5-乙基脲嘧啶)、5-鹵脲嘧啶(例如5-溴脲嘧啶)、6-氮雜嘧啶、6-烷基嘧啶(例如6-甲基脲嘧啶)、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)脲嘧啶、5’-羧基甲基胺基甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基脲嘧啶、1-甲基腺嘌呤、1-甲基次黃嘌呤、2,2-二甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氧基胺基甲基-2-硫脲嘧啶、5-甲基胺基甲基脲嘧啶、5-甲基羰基甲基脲嘧啶、5-甲基氧基脲嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、脲嘧啶-5-氧基乙酸、2-硫胞嘧啶、嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、異鳥嘌呤、吲哚、咪唑、黃嘌呤等，惟不限定於此等。

糖部分之修飾，可列舉例如核糖2’位之修飾及糖其他部分之修飾。核糖2’位之修飾可列舉例如將核糖2’位之-OH基置換成OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br、I之修飾。此處，R表示烷基或芳基。R’表示伸烷基。

糖其他部分之修飾，可列舉例如將核糖或去氧核糖4’位之O置換成S者、將糖2'位及4'位交聯者，例如鎖核酸(LNA(Locked Nucleic Acid))或ENA(2'-O,4'-C-乙烯-交聯核酸(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids))等，惟不限定於此等。

磷酸鍵部分之修飾，可列舉例如將磷酸二酯鍵置換成硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵(phosphoroamidate bond)、硼烷磷酸酯鍵(Enya et al：Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,18,9154-9160)之修飾(例如，參照日本專利再公表公報第2006/129594號及第2006/038608號)。

於本發明中，烷基較佳為直鏈狀或支鏈狀之碳數為1至6之烷基。具體而言，可列舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、第三戊基、正己基、異己基。該烷基可經取代，相關之取代基可列舉例如鹵素、烷氧基、氰基、硝基，可取代1至3個此等取代基。

於本發明中，環烷基較佳為碳數5至12之環烷基。具體而言，可列舉例如環戊基、環己基、環庚基、環辛基、環癸基、環十二烷基。

於本發明中，鹵素可列舉氟、氯、溴、碘。

烷氧基可舉例如直鏈狀或支鏈狀之碳數為1至6之烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、正己氧基、異己氧基等。較佳為碳數1至3之烷氧基。

於本發明中，芳基較佳為碳數6至10之芳基。具體而言，可列舉例如苯基、α-萘基、β-萘基。較佳為苯基。該芳基可經取代，相關之取代基可列舉例如烷基、鹵素、烷氧基、氰基、硝基，可取代1至3個此等取代基。

於本發明中，伸烷基較佳為直鏈狀或支鏈狀之碳數1至6之伸烷基。具體而言可列舉例如亞甲基、伸乙基、三亞甲基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、2-(乙基)三亞甲基、1-(甲基)四亞甲基。

於本發明中，醯基可列舉直鏈狀或支鏈狀之烷醯基或芳醯基。烷醯基可列舉例如甲醯基、乙醯基、2-甲基乙醯基、2,2-二甲基乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、2,2-二甲基丙醯基、已醯基等。芳醯基可列舉例如苯甲醯基(benzoyl)、甲苯甲醯基(toluoyl)、萘甲醯基(naphthoyl)。該芳醯基可取代於可經取代之位置，亦可經烷基取代。

本發明之寡核苷酸較佳為以下述通式表示之基作為構成單元之本發明之反義寡聚物，其中，核糖2’位之-OH基經甲氧基取代，且磷酸鍵部分為硫代磷酸酯鍵。

(式中，Base表示核酸鹼基)

本發明之寡核苷酸，可藉由使用各種自動合成裝置(例如AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare公司製造))而容易地合成，或也可委託第三者機關(例如Promega公司、Takara公司或日本Bio Services公司)等製作。

本發明之嗎啉基寡聚物，係以下述通式表示之基作為構成單元之本發明之反義寡聚物。

(式中，Base係與前述者同意義；

W表示以下任一式表示之基；

(式中，X表示-CH₂R¹、-O-CH₂R¹、-S-CH₂R¹、-NR²R³或F；

R¹表示H、烷基；

R²及R³可相同亦可不同，表示H、烷基、環烷基或芳基；

Y₁表示0、S、CH₂或NR¹；

Y₂表示0、S或NR¹；

Z表示0或S))。

關於合成本發明之嗎啉基寡聚物時所使用之嗎啉基單體化合物之例，可列舉下述之嗎啉基單體化合物(A)、嗎啉基單體化合物(C)、嗎啉基單體化合物(T)及嗎啉基單體化合物(G)，惟不限定於此等。

嗎啉基寡聚物較佳為以下式表示之基作為構成單元之寡聚物(二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer，以下亦稱為「PMO」))，

(式中，Base、R²、R³係與前述者同意義)。

本發明之嗎啉基寡聚物包含構成該寡聚物之核酸鹼基、嗎啉基環部分、磷酸鍵部分、3’末端及/或5’末端之全部或一部分經修飾者。

磷酸鍵部分之修飾，可列舉例如置換成二胺基磷酸酯鍵(phosphorodiamidate bond)、硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、烷基磷酸酯鍵、胺基磷酸酯鍵、硼烷磷酸酯鍵(Enya et al：Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,18,9154-9160)之修飾(例如請參照日本專利再公表公報第2006/129594號及第2006/038608號)。

嗎啉基寡聚物可依照例如國際公開第1991/009033號或國際公開第2009/064471號而製造。尤其是PMO，可依照國際公開第2009/064471號中所述之方法製造，或是依照以下所表示之方法製造。

[PMO之製法]

就PMO之1種態樣而言，可列舉例如下述通式(I)表示之化合物(以下亦稱為PMO(I))。

[式中，各Base、R²、R³係與前述者同意義；

n為於1至99範圍內之任意整數，較佳為於15至34、15至24或15至22範圍內之任意整數，更佳為18或19]。

PMO(I)可依照公知之方法製造，例如可藉由實施下述步驟之操作來製造。

下述步驟中使用之化合物及試劑，只要是於製造PMO時通常使用者即可，無特別限定。

另外，下述之所有步驟可依據液相法或固相法(使用手動或市售之固相自動合成機)實施。依據固相法來製造PMO時，從操作步驟之簡便化及合成之正確性之觀點而言，以使用自動合成機之方法為較佳。

(1)步驟A：

藉由使酸作用於下述通式(II)表示之化合物(以下亦稱為化合物(II))，而製造下述通式(III)表示之化合物(以下亦稱為化合物(III))之步驟。

[式中，n、R²、R³係與前述者同意義；

各B^P各自獨立地表示可經保護之核酸鹼基；

T表示三苯甲基(trityl)、單甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基；

L表示氫、醯基或下述通式(IV)表示之基(以下亦稱為基(IV))]

關於B^P之「核酸鹼基」，可列舉與Base相同之「核酸鹼基」。惟，B^P之核酸鹼基之胺基或羥基可經保護。

該胺基之保護基，只要是可作為核酸之保護基使用者即可，無特別限定，具體而言可列舉例如苯甲醯基、4-甲氧基苯甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、苯基乙醯基、苯氧基乙醯基、4-第三丁基苯氧基乙醯基、4-異丙基苯氧基乙醯基、(二甲基胺基)亞甲基。羥基之保護基可列舉例如2-氰基乙基、4-硝基苯乙基、苯基磺醯基乙基、甲基磺醯基乙基、三甲基矽基乙基、可於可經取代之任意位置以1至5個電子吸引性基取代之苯基、二苯基胺基甲醯基、二甲基胺基甲醯基、二乙基胺基甲醯基、甲基苯基胺基甲醯基、1-吡咯啶基胺基甲醯基、嗎啉基胺基甲醯基、4-(第三丁基羧基)苯甲基、4-[(二甲基胺基)羧基]苯甲基、4-(苯基羧基)苯甲基(請參照例如國際公開第2009/064471號公報)。

就「固相載體」而言，只要是可於核酸之固相反應中使用之載體即可，無特別限制，較佳係例如(i)在合成嗎啉基核酸衍生物時所可使用之試劑(例如二氯甲烷、乙腈、四唑、N-甲基咪唑、吡啶、乙酸酐、二甲基吡啶.、三氟乙酸)中為幾乎不溶解，(ii)對於合成嗎啉基核酸衍生物時所可使用之試劑為化學性安定，(iii)可化學修飾，(iv)可裝填所期望之嗎啉基核酸衍生物，(v)具有足以承受處理中所施加之高壓的強度，(vi)為一定之粒徑範圍與分布。具體而言，可列舉膨潤性聚苯乙烯(例如胺基甲基聚苯乙烯樹脂1%二乙烯基苯交聯(200至400網目)(2.4至3.0mmol/g)(東京化成公司製造)、Aminomethylated Polystyrene Resin HCl[二乙烯基苯1%，100至200網目](肽研究所公司製造))、非膨潤性聚苯乙烯(例如Primer Support(GE Healthcare公司製造))、PEG鏈結合型聚苯乙烯(例如NH₂-PEG resin(渡邊化學公司製造)、TentaGel resin)、可控孔徑玻璃(controlled pore glass；CPG)(例如CPG公司製造)、草醯基化-可控孔徑玻璃(參照例如Alul人等，Nucleic Acids Research,Vol.19,1527(1991))、TentaGel支持體-胺基聚乙二醇衍生物化支持體(參照例如Wright人等，Tetrahedron Letters,Vol.34,3373(1993))、Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯之共聚物。

就「連結基(linker)」而言，可使用通常為了將核酸或嗎啉基核酸衍生物予以連結而使用之公知者，可列舉例如3-胺基丙基、琥珀醯基、2,2’-二乙醇磺醯基、長鏈烷基胺基(LCAA)。

本步驟可藉由使酸作用於化合物(II)而實施。

本步驟中可使用之「酸」，可列舉例如三氟乙酸、二氯乙酸或三氯乙酸。酸之使用量係以例如相對於化合物(II)1莫耳而在0.1莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內為適當，較佳係在1莫耳當量至100莫耳當量之範圍內。

另外，可與前述酸一起使用有機胺。有機胺並無特別限制，可列舉例如三乙胺。有機胺之使用量係以例如相對於酸1莫耳而在0.01莫耳當量至10莫耳當量之範圍內為適當，較佳係在0.1莫耳當量至2莫耳當量之範圍內。

於本步驟中使用酸與有機胺之鹽或混合物時，可列舉例如三氟乙酸與三乙胺之鹽或混合物，更具體而言可列舉相對於三氟乙酸2當量將三乙胺1當量混合而成者。

於本步驟中可使用之酸，亦可經適當之溶劑稀釋成0.1%至30%範圍內之濃度來使用。溶劑只要是不會參與反應者即可，無特別限制，可列舉例如二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或此等之混合物。

上述反應之反應溫度係例如較佳為在10℃至50℃之範圍內，更佳為在20℃至40℃之範圍內，再較佳為在25℃至35℃之範圍內。

反應時間係根據使用之酸之種類、反應溫度而異，通常以在0.1分鐘至24小時之範圍內為適當，較佳係在1分鐘至5小時之範圍內。

另外，於本步驟完成後，可視需要而添加鹼以中和存在於系統中之酸。該「鹼」係無特別限制，可列舉例如二異丙基乙基胺。鹼亦可經適當之溶劑稀釋成0.1%(v/v)至30%(v/v)範圍內之濃度來使用。

本步驟中所使用之溶劑，只要是不會參與反應者即可，無特別限制，可列舉二氯甲烷、乙腈、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或此等之混合物。反應溫度係例如較佳為在10℃至50℃之範圍內，更佳為在20℃至40℃之範圍內，再較佳為在25℃至35℃之範圍內。

反應時間係根據使用之鹼之種類、反應溫度而異，通常以在0.1分鐘至24小時之範圍內為適當，較佳係在1分鐘至5小時之範圍內。

另外，化合物(II)中，n=1且L為基(IV)之下述通式(IIa)表示之化合物(以下亦稱為化合物(IIa))係可依照以下之方法來製造。

[式中，B^P、T、連結基、固相載體係與前述者同意義]。

步驟1：

藉由使醯基化劑作用於下述通式(V)表示之化合物，而製造下述通式(VI)表示之化合物(以下亦稱為化合物(VI))之步驟。

[式中，B^P、T、連結基係與前述者同意義；R⁴表示羥基、鹵素、羧基或胺基]。

本步驟可藉由以化合物(V)作為起始原料並依據公知之連結基導入反應而實施。

尤其是下述通式(VIa)表示之化合物，係可藉由使用化合物(V)及琥珀酸酐並實施既知方法來作為酯化反應而製造。

[式中，B^P、T係與前述者同意義]。

步驟2：

藉由使縮合劑等作用於化合物(VI)，而與固相載體進行反應，製造化合物(IIa)之步驟。

[式中，B^P、R⁴、T、連結基、固相載體係與前述者同意義]。

本步驟可藉由使用化合物(VI)及固相載體並依據既知方法作為縮合反應而製造。

於化合物(II)中，n=2至99(較佳為在16至35、16至25或16至23之範圍內之任意整數，較佳為19或20)且L為基(IV)之下述通式(IIa2)表示之化合物，係可藉由以化合物(IIa)作為起始原料並重複實施所期望之次數之本說明書所述PMO製法中之步驟A及步驟B而製造。

[式中，B^P、R²、R³、T、連結基、固相載體係與前述者同意義；n’表示1至98(特定態樣中之n’為例如1至34、1至24、1至23、1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15)]。

(2)步驟B：

藉由在鹼存在下使嗎啉基單體化合物作用於化合物(III)，而製造下述通式(VII)表示之化合物(以下亦稱為化合物(VII))之步驟。

[式中，各B^P、L、n、R²、R³、T係與前述者同意義]。

本步驟可藉由在鹼存在下使嗎啉基單體化合物作用於化合物(III)而實施。

嗎啉基單體化合物係可列舉例如下述通式(VIII)表示之化合物。

[式中，B^P、R²、R³、T係與前述者同意義]。

本步驟中可使用之「鹼」，可列舉例如二異丙基乙基胺、三乙基胺或N-乙基嗎啉。鹼之使用量係以例如相對於化合物(III)1莫耳而在1莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內為適當，較佳係在10莫耳當量至100莫耳當量之範圍內。

本步驟中可使用之嗎啉基單體化合物及鹼，亦可經適當之溶劑稀釋成0.1%至30%之濃度來使用。溶劑只要是不會參與反應者即可，無特別限制，可列舉例如N,N-二甲基咪唑啉酮、N-甲基哌啶酮、DMF、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃或此等之混合物。

反應溫度較佳係例如在0℃至100℃之範圍內，更佳係在10℃至50℃之範圍內。

反應時間係根據使用之鹼之種類、反應溫度而異，通常以在1分鐘至48小時之範圍內為適當，較佳係在30分鐘至24小時之範圍內。

再者，本步驟完成後，可視需要而添加醯基化劑。「醯基化劑」可列舉例如乙酸酐、乙醯氯、苯氧基乙酸酐。醯基化劑係例如亦可經適當之溶劑稀釋成0.1%至30%之範圍內之濃度來使用。溶劑只要是不會參與反應者即可，無特別限制，可列舉例如二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃、醇類(乙醇、異丙醇、三氟乙醇等)、水或此等之混合物。

另外，若有需要，可與醯基化劑一起使用例如吡啶、二甲基吡啶、三甲基吡啶、三乙基胺、二異丙基乙基胺、N-乙基嗎啉等鹼。醯基化劑之使用量較佳係在0.1莫耳當量至10000莫耳當量之範圍內，更佳係在1莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內。鹼之使用量係以相對於例如醯基化劑1莫耳而在0.1莫耳當量至100莫耳當量之範圍內為適當，較佳係在1莫耳當量至10莫耳當量之範圍內。

本反應之反應溫度係較佳為在10℃至50℃之範圍內，更佳為在20℃至40℃之範圍內，再較佳為在25℃至35℃之範圍內。反應時間係根據例如使用之醯基化劑之種類、反應溫度而異，通常以在0.1分鐘至24小時之範圍內為適當，較佳係在1分鐘至5小時之範圍內。

(3)步驟C：

對於步驟B所製造之化合物(VII)使用脫保護劑使保護基脫離，製造通式(IX)表示之化合物之步驟。

[式中，Base、B^P、L、n、R²、R³、T係與前述者同意義]。

本步驟可藉由使脫保護劑作用於化合物(VII)而實施。

「脫保護劑」可列舉例如濃氨水、甲胺。本步驟中可使用之「脫保護劑」係亦可經例如水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃、DMF、N,N-二甲基咪唑啉酮、N-甲基哌啶酮或此等之混合溶劑稀釋而使用。其中以乙醇較佳。脫保護劑之使用量係以相對於例如化合物(VII)1莫耳而在例如1莫耳當量至100000莫耳當量之範圍內為適當，較佳係在10莫耳當量至1000莫耳當量之範圍內。

反應溫度係以在例如15℃至75℃之範圍內為適當，較佳係在40℃至70℃之範圍內，更佳係在50℃至60℃之範圍內。脫保護反應時間係根據化合物(VII)之種類、反應溫度等而異，以在10分鐘至30小時之範圍內為適當，較佳係在30分鐘至24小時之範圍內，更佳係在5小時至20小時之範圍內。

(4)步驟D：

藉由使酸作用於步驟C製造之化合物(IX)，而製造PMO(I)之步驟。

[式中，Base、n、R²、R³、T係與前述者同意義]。

本步驟可藉由對於化合物(IX)添加酸而實施。

本步驟中可使用之「酸」，可列舉例如三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸、磷酸及鹽酸等。酸之使用量係以例如以使溶液之pH成為0.1至4.0之範圍內之方式來使用為適當，更佳係以使pH在1.0至3.0之範圍內之方式來使用。溶劑只要是不會參與反應者即可，無特別限制、可列舉例如乙腈、水或此等之混合溶劑。

反應溫度較佳係在10℃至50℃之範圍內，更佳係在20℃至40℃之範圍內，再較佳係在25℃至35℃之範圍內。脫保護反應時間係根據化合物(IX)之種類、反應溫度等而異，以在0.1分鐘至5小時之範圍內為適當，較佳係在1分鐘至1小時之範圍內，更佳係在1分鐘至30分鐘之範圍內。

從本步驟獲得之反應混合物中，可藉由將通常之分離純化手段，例如萃取、濃縮、中和、過濾、離心分離、再結晶、C₈至C₁₈之逆相管柱層析、陽離子交換管柱層析、陰離子交換管柱層析、凝膠過濾管柱層析、高速液體層析、透析、超過濾等手段予以單獨或組合使用，而獲得PMO(I)，並可將所期望之PMO(I)予以分離純化(請參照例如國際公開第1991/09033號)。

當使用逆相層析來純化PMO(I)時，溶析溶劑可使用例如20mM之三乙胺/乙酸緩衝液與乙腈之混合溶液。

另外，當使用離子交換層析來純化PMO(I)時，可使用例如1M食鹽水與10mM氫氧化鈉水溶液之混合溶液。

肽核酸係以下述通式表示之基作為構成單元之本發明之反義寡聚物。

(式中，Base係與前述者同意義)。

肽核酸可依照例如以下之文獻製造。

1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt，Science, 254, 1497 (1991)

2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg，Jacs., 114, 1895 (1992)

3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt，J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)

4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm，O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)

5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997)

另外，本發明之反義寡聚物中，5’末端可為下述化學式(1)至(3)中任一種基。較佳為(3)-OH。

以下，將上述(1)、(2)及(3)表示之基各自稱為「基(1)」、「基(2)」及「基(3)」。

本發明之反義寡聚物，係由於磷酸鍵部分之磷原子成為不對稱中心，故可包含磷原子之立體化學在光學上為純粹之化合物。只要是本發明所屬技術領域中具有通常知識者，即可從異構物之混合物中獲得純粹之光學活性體(國際公開第2017/024264號)。另外，本發明之反義寡聚物亦可合成為純粹之光學活性體。只要是本發明所屬技術領域中具有通常知識者，即可調控合成反應而獲得純粹之光學活性體(日本專利公表公報第2018-537952號)。

2.肽結合型反義寡聚物

本發明之反義寡聚物，可為形成與以提昇有效性為目的之功能性肽(例如以提昇對於標的細胞之輸送效率為目的之膜透過性肽)的複合體(國際公開第2008/036127號、國際公開第2009/005793號、國際公開第2012/150960號、國際公開第2016/187425號、國際公開第2018/118662號、國際公開第2018/118599號、國際公開第2018/118627號、J.D.Ramsey,N.H.Flynn,Pharmacology & Therapeutics 154,78-86(2015)、M.K.Tsoumpra et al.,EBioMedicine,https：//doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.06.036)。結合部位係無特別限制，較佳為反義寡聚物之5’端或3’端與功能性肽之胺基末端或羧基末端結合。

另外，於其他態樣中，本發明之反義寡聚物與功能性肽係可藉由連結基而形成複合體。連結基係無特別限制，較佳為反義寡聚物之5’端或3’端與連結基之一端結合，功能性肽之胺基末端或羧基末端與連結基之另一端結合。另外，功能性肽與連結基之間可存在加成之胺基酸。

3.醫藥組成物

相較於習知技術之反義寡聚物，本發明之反義寡聚物即使其長度較短時，亦可以高效率誘導外顯子50跳讀。另外，本發明之反義寡聚物可維持以高效率誘導外顯子50跳讀之活性且具有優越之溶解性。因此，只要是於肌肉萎縮蛋白基因中有作為外顯子50跳讀對象之突變(例如框移突變、外顯子50中之誤義突變/無意義突變等)之DMD患者，若藉由投予本發明之反義寡聚物，預測能以高效率緩和肌肉萎縮之症狀。例如，藉由對於具有至少缺失外顯子50附近之外顯子的既定之突變肌肉萎縮蛋白基因之DMD患者投予本發明之反義寡聚物，預測可以高效率緩和肌肉萎縮之症狀。另外，所謂既定之突變肌肉萎縮蛋白基因係指：一種肌肉萎縮蛋白基因，其至少缺失外顯子50附近之外顯子而有框移突變，且同時在省略外顯子50時(跳讀時)會修正胺基酸閱讀框架。可列舉因具有外顯子51、51-53、51-55、51-57等之缺失而有框移突變之DMD患者。

更具體言之，藉由將含有本發明之反義寡聚物之醫藥組成物投予至DMD患者(具有因外顯子50跳讀而in-frame化之突變的患者，例如外顯子51缺失患者、外顯子51-53缺失患者、外顯子51-55缺失患者、外顯子51-57缺失患者等)，預測可以高效率緩和肌肉萎縮之症狀。例如，當使用含有本發明之反義寡聚物之醫藥組成物時，即使是以相較於習知技術之寡聚物而為較少量之投予量，亦可獲得相同程度之治療效果，所以可減輕副作用且符合經濟。

另外，本發明之反義寡聚物係由於可維持以高效率誘導外顯子50跳讀之活性且具有優越之溶解性，故可有用於調製醫藥組成物。

在此，於其他實施態樣中，提供以本發明之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或水合物作為有效成分之肌肉萎縮治療用醫藥組成物(以下亦稱為「本發明之組成物」)。

另外，本發明係提供一種肌肉萎縮之治療方法，其包含將本發明之反義寡聚物投予至DMD患者之步驟。

於該治療方法中，本發明之反義寡聚物可作為前述肌肉萎縮治療用醫藥組成物來投予。

再者，本發明提供用於製造肌肉萎縮治療用醫藥組成物之本發明之反義寡聚物之用途、以及用於治療肌肉萎縮之本發明之反義寡聚物。

本發明之組成物中含有之本發明之反義寡聚物之醫藥上容許之鹽之例可列舉如：如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等鹼金屬鹽；如鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽；如鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等金屬鹽；銨鹽；第三辛基胺鹽、二苯甲基胺鹽、嗎啉鹽、葡糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、胍鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、二環己胺鹽、N,N'-二苯甲基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苯甲基-苯乙胺鹽、哌嗪(piperazine)鹽、四甲基銨鹽、三(羥基甲基)胺基甲烷鹽等有機胺鹽；如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽等氫鹵酸鹽；如硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽等低級烷基磺酸鹽；如苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等芳基磺酸鹽；如乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等有機酸鹽；如甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽等胺基酸鹽等。此等鹽可依據公知之方法製造。或者是，本發明之組成物中所含有之本發明之寡聚物亦可為其水合物之形態。

本發明組成物之投予形態，只要是醫藥上容許之投予形態即可，無特別限制，可對應治療方法而選擇，惟從容易送達至肌組織之觀點而言，較佳為靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮下投予、經口投予、組織內投予、經皮投予等。另外，本發明組成物可採取之劑型係無特別限制，可列舉例如各種注射劑、經口劑、點滴劑、吸入劑、軟膏劑、洗劑等。

對於肌肉萎縮患者投予本發明之反義寡聚物時，本發明之組成物可含有促進該寡聚物送達到肌組織之載體。如此之載體只要是醫藥上容許者即可，無特別限制，其例可列舉如陽離子性脂質體、陽離子性聚合物等陽離子性載體，或利用病毒包膜(virus envelope)之載體。陽離子性脂質體可列舉例如將2-O-(2-二乙基胺基乙基)胺基甲醯基-1,3-O-二油醯基甘油及磷脂質作為必須成分而形成之脂質體(以下亦稱為「脂質體A」)、Oligofectamine(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、Lipofectin(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、Lipofectamine(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、Lipofectamine 2000(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、DMRIE-C(註冊商標)(Invitrogen公司製造)、GeneSilencer(註冊商標)(Gene Therapy Systems公司製造)、TransMessenger(註冊商標)(QIAGEN公司製造)、TransIT TKO(註冊商標)(Mirus公司製造)、Nucleogector II(Lonza)。其中，較佳為脂質體A。陽離子性聚合物可列舉例如JetSI(註冊商標)(Qbiogene公司製造)、Jet-PEI(註冊商標)(聚乙烯亞胺、Qbiogene公司製造)。利用病毒包膜之載體可列舉例如GenomeOne(註冊商標)(HVJ-E脂質體，石原產業公司製造)。亦可使用日本專利第2924179號中所述之醫藥裝置、日本專利再公表公報第2006/129594號及日本專利再公表公報第2008/096690號中所述之陽離子性載體。

詳細而言，可參照美國專利第4,235,871號、美國專利第4,737,323號、國際公開第96/14057號、“New RRC,Liposomes：A practical approach,IRL Press,Oxford(1990)pages 33-104”等。

本發明組成物中含有之本發明之反義寡聚物之濃度，係根據載體之種類等而異，於一種態樣中，係以在0.1nM至100μM之範圍內為適當，較佳係在100nM至10μM之範圍內。另外，本發明組成物中含有之本發明之反義寡聚物與載體之重量比(載體/本發明之反義寡聚物)，係根據該寡聚物之性質及該載體之種類等而異，以在0.1至100之範圍內為適當，較佳係在0.1至10之範圍內。

本發明之組成物亦可為水溶液之形態。此時，本發明之組成物可以2.5至500mg/mL、5至450mg/mL、10至400mg/mL、15至350mg/mL、20至300mg/mL、20至250mg/mL、20至200mg/mL、20至150mg/mL、20至100mg/mL、20至50mg/mL、20至40mg/mL、20至30mg/mL、23至27mg/mL、24至26mg/mL或25mg/mL之濃度含有本發明之反義寡聚物。或者是，本發明之組成物可以10至100mg/mL、15至95mg/mL、20至80mg/mL、25至75mg/mL、30至70mg/mL、35至65mg/mL、40至60mg/mL、45至55mg/mL、47至53mg/mL、48至52mg/mL、49至51mg/mL或50mg/mL之濃度含有本發明之反義寡聚物。

本發明之組成物亦可為乾燥形態。此時，為了調製水溶液形態之本發明之組成物，可將含有例如125mg或250mg乾燥形態之本發明之反義寡聚物的乾燥形態之本發明組成物與0.5mL至100mL之水混合(相當於1.25mg/mL至250mg/mL或2.5mg/mL至500mg/mL之本發明之反義寡聚物濃度)，較佳係與1mL至50mL之水混合(相當於2.5mg/mL至125mg/mL或5mg/mL至250mg/mL之本發明之反義寡聚物濃度)，更佳係與5mL至10mL之水混合(相當於12.5mg/mL至25mg/mL或25mg/mL至50mg/mL之本發明之反義寡聚物濃度)來使用。

本發明之組成物中，除了調配本發明之反義寡聚物及上述之載體以外，亦可配合任意之醫藥上容許之添加劑。該添加劑可列舉例如乳化補助劑(例如碳數6至22之脂肪酸或其醫藥上容許之鹽、白蛋白、葡聚糖)、安定化劑 (例如膽固醇、磷脂酸、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇)、等張化劑(例如氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇)、pH調整劑(例如鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三乙醇胺)。可使用此等之一種或二種以上。本發明組成物中之該添加劑之含量係以在90重量%以下為適當，較佳係在70重量%以下，更佳係在50重量%以下。

本發明之組成物可藉由在載體之分散液中加入本發明之反義寡聚物並適當攪拌而調製。另外，關於添加劑，可於本發明之反義寡聚物之添加前或添加後以適當之步驟添加。本發明之組成物為水溶液形態時，關於添加本發明之反義寡聚物時所可使用之水性溶劑，只要是醫藥上容許者即可，無特別限制，可列舉例如注射用水、注射用蒸餾水、生理食鹽水等電解質液、葡萄糖液、麥芽糖液等糖液。另外，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可適當選擇該情況下之pH及溫度等條件。

本發明之組成物亦可作成例如液劑或其凍結乾燥製劑。就本發明組成物之乾燥形態之一態樣而言，該凍結乾燥製劑可依據常法將具有液劑形態之本發明之組成物進行凍結乾燥處理而調製。例如，可將具有液劑形態之本發明之組成物進行適當之滅菌後，將預定量分注於小瓶，以約-40至-20℃之條件進行預備凍結約2小時，於約0至10℃於減壓下進行一次乾燥，然後於約15至25℃於減壓下進行二次乾燥，而凍結乾燥之。再者，通常可將小瓶內部以氮氣置換並打栓而獲得本發明組成物之凍結乾燥製劑。

本發明組成物之凍結乾燥製劑，通常可藉由添加任意之適當溶液(再溶解液)而再溶解使用。如此之再溶解液可列舉注射用水、生理食鹽水、其他一般輸液。此再溶解液之液量係根據用途等而異，無特別限制，以凍結乾燥前液量之0.5至2倍量或500mL以下為適當。

投予本發明之組成物時之用量，以考慮到所含有之本發明之反義寡聚物之種類、劑型、年齡或體重等患者之狀態、投予路徑、疾病之性質及程度來調製較佳，對於成人，本發明之反義寡聚物之量係每日在0.1mg至10g/人之範圍內，較佳通常係在1mg至1g/人之範圍內。此數值係根據作為標的之疾病之種類、投予形態、根據標的分子而亦有不同之情況。因此，根據情況，有於此等用量以下即充分之情形，相對地也有需要此等用量以上之情形。另外，可以1日1次至數次投予或以1日至數日之間隔投予。

本發明組成物之其他態樣，可列舉一種醫藥組成物，其含有可表現本發明之寡核苷酸的載體(vector)及上述載體。該表現載體可為可表現複數種本發明之寡核苷酸者。該組成物中，與含有本發明之寡聚物之本發明組成物相同地，可添加醫藥上容許之添加劑。該組成物中含有之表現載體之濃度係根據載體之種類等而異，於一種態樣中，以在0.1nM至100μM之範圍內為適當，較佳係在100nM至10μM之範圍內。該組成物中含有之表現載體與載體之重量比(載體/表現載體)係根據表現載體之性質、載體之種類等而異，以在0.1至100之範圍內為適當，較佳係在0.1至10之範圍內。另外，該組成物中含有之載體之含量係與含有本發明之反義寡聚物之本發明組成物之情況相同，其調製方法等亦與本發明之組成物之情況相同。

以下，揭示實施例及試驗例對本發明作更詳細之說明，惟本發明不限定於實施例所示之範圍。

[實施例]

[實施例1：反義寡聚物之製造]

依照國際公開第2013/100190號中所述之方法，將人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50及/或作為其3’側隣接內含子之內含子50之一部分之鹼基序列作為標的，合成表1所示之反義寡聚物(PMO No.1至7(即序列編號2至8))。各反義寡聚物之全長為19至21mer。亦列示各反義寡聚物之分子量之理論值及由ESI-TOF-MS所得之實測值。

表1中，例如「H50_109-129」係表示將人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50之5’末端之鹼基作為第1個鹼基，往3’側對於鹼基依序附記編號時，反義寡聚物為以第109個至第129個鹼基之序列作為標的者。另外，由於外顯子50之全長為109個鹼基，所以，於此例中，標的鹼基序列中之第110個至第130個之鹼基之序列為內含子50中之鹼基序列。

[實施例2：反義寡聚物之外顯子跳讀之活性試驗]

人類肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之體外試驗

(1)試驗方法

對於3.5×10⁵個RD細胞(人類橫紋肌肉瘤細胞株，CCL-136，從ATCC購入)，將表1之各反義寡聚物0.1至1μM使用Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L)並藉由Nucleofector II(Lonza)導入。用於導入之脈衝程式係使用T-030。

將導入後之RD細胞於含有10%牛胎兒血清(FBS)(Invitrogen公司製造)之Eagle’s minimal essential medium(EMEM)培養基(Sigma公司製造，以下亦相同)2mL中，於37℃、5%CO₂條件下培養三晚。

將導入後之RD細胞以PBS(Nissui公司製造，以下亦相同)洗淨1次後，對於上述細胞添加含有1%之2-巰基乙醇(Nacalai Tesque公司製造)之Buffer RA1(Takara-bio公司製造)350μL，於室溫放置數分鐘將上述細胞溶解，回收至NucleoSpin(註冊商標)Filter(Takara-bio公司製造)上。以11,000×g離心1分鐘，製作均質物。依照NucleoSpin(註冊商標)RNA(Takara-bio公司製造)附加之計劃書，從上述細胞萃取全RNA。使用NanoDrop ONE(Thermo Fisher公司製造)測定所萃取之全RNA之濃度。

對於所萃取之全RNA 400ng，使用QIAGEN OneStep RT-PCR套組(QIAGEN公司製造)及熱循環儀(thermal cyclers)進行One-Step RT-PCR。依照於上述套組附加之計劃書調製反應液。熱循環儀係使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch(Takara-bio公司製造)。使用之RT-PCR之程序係如下所示。

50℃、30分鐘：逆轉錄反應

95℃、15分鐘：聚合酶活性化、逆轉錄酵素惰性化、cDNA熱改性

[94℃、30秒鐘；60℃、30秒鐘；72℃、1分鐘]×35個循環：PCR增幅

72℃、10分鐘：最終伸長反應

RT-PCR所使用之前置引子和反置引子之鹼基序列如下所示。

前置引子：5’-AACAACCGGATGTGGAAGAG-3’(序列編號9)

反置引子：5’-TTGGAGATGGCAGTTTCCTT-3’(序列編號10)

將上述PCR之反應產物1μL使用Bioanalyzer(Agilent公司製造)及MultiNA(島津製作所製造)進行分析。

將外顯子50跳讀之譜帶之多核苷酸量「A」及外顯子50未跳讀之譜帶之多核苷酸量「B」作為譜帶的信號強度而測定之。以此等「A」及「B」之測定值為基礎，根據上述式(1)求出跳讀效率。

(2)試驗結果

圖1至3表示關於各反義寡聚物所獲得之外顯子50跳讀效率之結果。另外，下述表2至4表示由此等結果算出之各反義寡聚物顯示50%跳讀效率ES之有效濃度(EC₅₀)之值。根據本試驗可知，在各反義寡聚物中，由於PMO No.1至4之跳讀效率ES高且EC₅₀之值低，故判定可有效地使外顯子50跳讀。

另外，在與PMO No.3及4同樣地全長係短為19mer之反義寡聚物中，PMO No.5至7係跳讀效率低且EC₅₀之值高。由於PMO No.3及4與PMO No.5至7作為標的之鹼基序列重複之程度亦大，故可特別注目PMO No.3及4對於外顯子50跳讀之有效性。

依據此結果可知，相較於習知技術，本發明之反義寡聚物即使在長度為短之情況下，亦顯示可高效率誘導外顯子50跳讀。

[實施例3：反義寡聚物之溶解性試驗]

反義寡聚物對於生理食鹽水之溶解性試驗

在實施例2為跳讀效率ES高之反義寡聚物中，對於全長係短為19至20mer且合成簡便之PMO No.2、3、4之各反義寡聚物，為了更進一步驗證於醫藥用途之有用性，進行對於生理食鹽水之溶解性試驗。

(1)試驗方法

於裝有4.5mg上述各反義寡聚物之試樣瓶中加入生理食鹽水45μL，使用超音波及渦旋(vortex)進行攪拌，作成100mg/mL之生理食鹽水溶液。於室溫放置24小時，將未產生沈澱者評估為溶解性高之序列。

(2)試驗結果

試驗之各反義寡聚物對於生理食鹽水都顯示100mg/mL以上之溶解性。此等反義寡聚物係由於外顯子50跳讀效率高且對於生理食鹽水之溶解性亦高，所以是作為醫藥之利用價值高之反義寡聚物。

依據以上之結果可知，本發明之反義寡聚物可維持以高效率誘導肌肉萎縮蛋白基因之外顯子50跳讀之活性且具有作為醫藥之優越物性。

【產業上之利用可能性】

從試驗例顯示之實驗結果可知，本發明之反義寡聚物係於RD細胞以顯著的高效率誘導外顯子50跳讀。因此，本發明之反義寡聚物於治療DMD上為非常有用。

【序列表自由文本(sequence listing free text)】

序列編號1至10：合成核酸

<110> 日本新藥股份有限公司(Nippon Shinyaku Co.,Ltd.) 國立研究開發法人國立精神，神經醫療研究中心(National Center of Neurology and Psychiatry)

<120> 誘導外顯子50的跳讀的反義核酸(Antisense nucleic acids that induce exon 50 skipping)

<130> G2506W0

<140> TW 109146242

<141> 2020-12-25

<150> JP2019-236704

<151> 2019-12-26

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 139

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Nucleic Acid

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Nucleic Acid

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Nucleic Acid

<400> 3

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Nucleic Acid

<400> 4

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Nucleic Acid

<400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Nucleic Acid

<400> 6

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Nucleic Acid

<400> 7

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Nucleic Acid

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Nucleic Acid

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic Nucleic Acid

<400> 10

Claims

一種反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，該反義寡聚物係由序列編號4或5之鹼基序列所構成。
一種反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，該反義寡聚物係由序列編號4之鹼基序列所構成。
一種反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，該反義寡聚物係由序列編號5之鹼基序列所構成。
如請求項1至3中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，該反義寡聚物為寡核苷酸。
如請求項4所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分及/或磷酸鍵部分係經修飾。
如請求項4所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之糖部分係2’位之-OH基經選自由OR、R、R’OR、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂、N₃、CN、F、Cl、Br及I所成群組中之任一個基取代之核糖，上述R表示烷基或芳基，上述R’表示伸烷基。
如請求項4所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，構成前述寡核苷酸之至少1個核苷酸之磷酸鍵部分係選自由硫代磷酸酯鍵(phosphorothioate bond)、二硫代磷酸酯鍵(phosphorodithioate bond)、烷基磷酸酯鍵(alkylphosphonate bond)、胺基磷酸酯鍵(phosphoroamidate bond)及硼烷磷酸酯鍵(boranophosphate bond)所成群組中之至少一種。
如請求項1至3中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，反義寡聚物為嗎啉基寡聚物(morpholino oligomer)。
如請求項8所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，反義寡聚物為二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer)。
如請求項8所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物，其中，5’末端為下述化學式(1)至(3)中任一種基，
一種肌肉萎縮治療用醫藥組成物，其含有請求項1至10中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物。
如請求項11所述之醫藥組成物，其更含有醫藥上容許之載體、醫藥上容許之添加劑或水性溶劑。
一種請求項11或12所述之醫藥組成物之用途，其係用於製造肌肉萎縮治療用醫藥。
如請求項13所述之用途，其中，前述肌肉萎縮治療用醫藥係用以投予至肌肉萎縮患者之醫藥，前述患者為在肌肉萎縮蛋白基因中具有會成為外顯子50跳讀之對象之突變的患者。
如請求項14所述之用途，其中，前述患者具有肌肉萎縮蛋白基因，該肌肉萎縮蛋白基因具有至少由外顯子50附近之外顯子缺失所引起之框移突變，且同時能藉由外顯子50跳讀而修正胺基酸閱讀框架。
如請求項14或15所述之用途，其中，前述患者係於肌肉萎縮蛋白基因具有由外顯子51、51-53、51-55或51-57缺失所引起之框移突變。
如請求項14或15所述之用途，其中，前述患者為人類。
一種請求項1至10中任一項所述之反義寡聚物、其醫藥上容許之鹽或此等之水合物之用途，係用於製造肌肉萎縮治療用醫藥。