TWI872951B

TWI872951B - 用於治療、預防或減輕肺功能損傷之類黃酮藥物

Info

Publication number: TWI872951B
Application number: TW113105779A
Authority: TW
Inventors: 郭昭宏; 洪志興; 邱馨瑩; 林明宏; 廖偉廷; 蔡美蘭
Original assignee: 高雄醫學大學
Priority date: 2024-02-19
Filing date: 2024-02-19
Publication date: 2025-02-11
Also published as: TW202533827A

Abstract

本發明提供了一種用於製備治療、預防或減輕肺功能損傷之類黃酮藥物，類黃酮藥物包含黃酮醇、黃烷酮醇或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於由哺乳動物之肺泡上皮細胞暴露於銅之中所造成之肺發炎或肺纖維化，藉由降低肺纖維化相關蛋白或分子標誌的表達，進而抑制該肺泡上皮細胞的該上皮-間質轉換。

Description

用於治療、預防或減輕肺功能損傷之類黃酮藥物

本發明是關於用於治療、預防或減輕由銅誘發之肺功能損傷之類黃酮藥物，特別是關於一種透過抑制自噬誘導的上皮-間質轉換所造成的肺功能損傷之類黃酮藥物。

重金屬銅是工業常用重金屬，鋼的用途很廣，可用於半導體、管道、肥料、殺藻劑等，除職業暴露外，農業的使用也使環境中銅暴露機會增加，環境中重金屬可經由飲水、食物(如深海魚)、甚至乘載在空氣中的懸浮粒子PM2.5上而被人體攝入，增加暴露人群的風險並影響人體健康，因此，銅毒性被認為是人類健康面臨的一個日益嚴重的問題。在一些工業區中，當地居民及工作者由於長期慢性暴露在銅污染的環境中，銅在體內過度積累會增加疾病的罹患風險。經動物實驗證實，向小鼠投予銅會引起肺毒性和肺纖維化。

然而，針對肺部損傷及肺纖維化所使用的藥物治療(例如：Pirfenidone或Nintedanib)的副作用高，造成腹瀉、噁心、肝功能異常及肝臓功能衰竭，患者經過藥物治療後仍無法逆轉肺纖維化的病灶，造成永久性的損傷，無法達到治癒的效果。針對重金屬中毒過去使用重金屬螫合劑治療，副作用包括腎衰竭、低血鈣、低血糖、凝血不全、充血性心衰竭、肝衰竭等，安全性上仍有疑慮。

有鑑於此，為了解決上述先前技術中存在的問題，本發明提供了一種用於製備治療、預防或減輕肺功能損傷之類黃酮藥物，其中類黃酮藥物包含黃酮醇、黃烷酮醇或其醫藥學上可接受之鹽，以解決習知藥物副作用較多且無法治癒肺損傷之問題。

較佳地，黃酮醇係山柰酚，黃烷酮醇係3,3',4',7-四羥基黃烷酮。

較佳地，肺功能損傷係由於哺乳動物之肺泡上皮細胞暴露於銅之中所造成。

較佳地，肺功能損傷係由於肺發炎或肺纖維化所引起。

較佳地，肺纖維化係由哺乳動物之肺泡上皮細胞被誘發之細胞自嗜或上皮-間質轉換所引起。

較佳地，類黃酮藥物係藉由降低肺纖維化相關蛋白或分子標誌的表達，從而抑制肺泡上皮細胞的上皮-間質轉換。

較佳地，肺纖維化相關蛋白或分子標誌係細胞自嗜標記蛋白或上皮-間質轉換標記蛋白，細胞自嗜標記蛋白係PINKI或LC3，上皮-間質轉換標記蛋白為Snail或N-Cadherin。

較佳地，類黃酮藥物係用於投予至一哺乳動物之肺泡上皮細胞。

較佳地，類黃酮藥物之給藥途徑包含口服、經鼻、腸或腸胃外給藥。

本發明之發明人發現類黃酮對重金屬銅(包括氧化銅奈米粒子、硫酸銅)誘發的肺部發炎及肺部纖維他具有保護作用。肺泡上皮細胞(A549)暴露於硫酸銅之下，會誘發細胞自嗜(autophagy)及上皮-間質轉換(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，以及纖維化相關蛋白包括COLlA1、MMP-7、LOXL2及N-Cadherin等特徵。藉由篩選類黃酮化合物中可以抑制上述變化的天然物，結果顯示黃酮醇(Flavonol)及黃烷酮醇(Flavanonol)可以有效抑制以上機轉，黃酮醇(Flavonol)的示例包含山奈酚(kaempferol)，而黃烷酮醇(Flavanonol)的示例包含3,3',4',7-四羥基黃烷酮(fustin)。本發明進一步使用小鼠進行動物實驗，透過使用氧化銅奈米粒子作為銅暴露的來源，首先，經由鼻腔給予氧化銅奈米粒子使小鼠產生肺部發炎(暴露後2週)及肺纖維化(暴露後4週)，接著經口餵食山奈酚(kaempferol) 10mg/kg bw/每日，可以有效改善經鼻腔暴露於氧化銅奈米微粒所造成的肺部免疫細胞浸潤及肺部纖維化。因此，本發明之類黃酮藥物可用於治療、預防或減輕重金屬銅污染所造成的肺部損傷。

以下將以具體的實施例配合所附的圖式詳加說明本發明的技術特徵，以使所屬技術領域具有通常知識者可易於瞭解本發明的目的、技術特徵、及其優點。

本發明的優點、特徵以及達到的技術方法將參照例示性實施例及所附圖式進行更詳細地描述而更容易理解，且本發明可以不同形式來實現，故不應被理解僅限於此處所陳述的實施例，相反地，對所屬技術領域中具有通常知識者而言，所提供的實施例將使本揭露更加透徹與全面且完整地傳達本發明的範疇，且本發明將僅為所附加的申請專利範圍所定義。

除非另有定義，本發明所使用的所有術語(包括技術和科學術語)具有與本發明所屬技術領域的通常知識者通常理解的相同含義。將進一步理解的是，例如在通常使用的字典中定義的那些術語應當被解釋為具有與它們在相關技術和本發明的上下文中的含義一致的定義，並且將不被解釋為理想化或過度正式的意義，除非本文中明確地這樣定義。

黃酮類化合物是一種天然產物，包括黃烷酮類、黃烷醇類、異黃酮類、黃烷類等，在蔬菜和水果中含量豐富，具有廣泛的生物活性。

本發明揭示了幾種黃酮類化合物對銅誘導的肺上皮損傷的治療效果和機制，並且確定不吸煙個體的尿銅濃度與肺纖維化變化的關聯。

材料與方法：

細胞培養、藥物和試劑：

人類肺泡 II 型上皮細胞 (A549 細胞)係購自 ATCC(貨號：CCL-185)，並培養在含有 10% FBS、丙酮酸鈉和 1% 青黴素/鏈黴素的 DMEM 培養基中，將細胞在 37°C 下保持在 5% CO ₂加濕大氣中。CuSO4、氯喹(chloroquine)、N-乙醯半胱氨酸(N-acetylcysteine)、3,3',4',7-四羥基黃烷酮(fusti)、芹菜素(apigenin)、山奈酚(kaempferol)和芫花素(genkwanin)係購自Sigma-Aldrich(美國密蘇里州聖路易斯)。

細胞存活率測定(CCK-8測定)：

將 A549 細胞暴露於不同的類黃酮藥物1、5或10uM 24 小時後，以CCK-8比色分析試劑組測定細胞存活率。使用微量盤分析儀以波長450nm偵測吸收光之光密度(optical density, OD)，並進一步以對照組之光密度進行正規化(normalization)計算吸光度的倍數變化。

西方墨點法(Western Blotting)：

對於處理後的蛋白質表達分析，用冰冷的PBS洗滌細胞兩次，並立即裂解，直接加入含有蛋白酶抑製劑(cOmplete™，Mini，不含EDTA的蛋白酶抑製劑混合物，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA)和磷酸酶抑製劑(PhosStop™，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA)的RIPA緩衝液至培養盤中，通過在4°C下以14,000rpm離心15分鐘沉澱細胞碎片，以收獲蛋白質裂解物。使用BCA雙重範圍BCA蛋白檢測試劑盒(Visual Protein，Neihu，Taiwan) 測定蛋白質濃度。在6~13%SDS-PAGE中分離出共10ug的蛋白質裂解物，並轉移到PVDF膜上(Millipore，Bedford，MA，USA)。在室溫下以5%脫脂牛奶封閉1小時後，將PVDF膜與第一種抗體在4°C下溫育過夜，用0.1%TBST洗滌3次後，將PVDF膜分別與HRP偶聯的抗兔IgG或抗山羊第二種抗體溫育(Jackson ImmunoResearch Laboratories，WestGrove，PA，USA)。該PVDF膜是通過與化學發光HRP底物(Merck，Darmstadt，Germany)反應，並使用ChemiDoc-It810成像儀(Ultra-Violet Products，Up-land，CA，USA)可視化，以捕獲蛋白質條帶。本發明使用的抗體包括N-Cadherin(GTX127345，Genetex，Hsinchu，Taiwan)、E-Cadherin(GTX100443，Genetex，Hsinchu，Taiwan)、GAPDH(GTX100118，GeneTex，Genetex，HsinChu)、PINK1(Cell signaling#6946，USA)、LC3(GTX127375，GeneTex，Hsinchu，Taiwan)、p62(abcam)、Snail(GTX100754，Genetex，Hsinchu，Taiwan)。

細胞跨孔(Transwell)遷移測定：

將 A549 細胞暴露於類黃酮藥物 2 小時，然後暴露於 CuSO ₄24 小時。通過胰蛋白酶(Millipore，Freehold，NJ，USA)分離細胞，並以4×10 ⁴個細胞的密度接種到孔徑為8μm (BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)的transwell上腔室，細胞密度為200 uL無血清DMEM中的10 ⁴個細胞。下腔室充滿含有藥物的完全培養基。溫育24小時後，將細胞在室溫下用甲醇固定10分鐘，然後在室溫下用0.2%結晶紫染色10分鐘。用棉簽去除腔室上側的細胞。通過計算5個隨機選擇區域的細胞數量來確定遷移細胞。

RNA萃取和半定量即時螢光定量PCR：

用 0、1、10 和 100 μM CuSO ₄處理在 12 孔盤中生長的 A549 細胞 48 小時。使用 GENEzolTM TriRNA Pure Kit (Geneaid) 分離總RNA。使用 SuperScriptTM III 逆轉錄酶(ThermoFisher Scientific，MA，USA)合成互補 DNA。使用 Fast SYBR Green MasterMix (Applied Biosystems) 使用 StepOne 系統 (ABI) 檢測基因表達。用於即時螢光定量PCR分析的基因登錄和引物如表1所示。 [表1]

目標基因	正向	反向	序列號碼
COL1A1 (NM_000088)	5t-CCAGAAGAACTGG TACATCAGCA-3t	5t-CGCCATACTCGAACTGGAATC-3t	Sequence Number (ID): 1-2
MMP-7 (NM_002423)	5t-TCGGAGGAGATGCTCACTTCGA-3t	5t-GGATCAGAGGAATGTCC CATACC-3t	Sequence Number (ID): 3-4
LOXL2 (NM_002318)	5t-TGACTGCAAGCACACGGAGGAT-3t	5t-TCCGAATGTCCTCCACCTGGAT-3t	Sequence Number (ID): 5-6
N-Cadherin (NM_001792)	5t-CCTCCAGAGTTTACTGCCATGAC-3t	5t-GTAG GATCTCCGCCACTGATTC-3t	Sequence Number (ID): 7-8

免疫螢光：

用CuSO ₄以不同的時間和劑量處理鋪在蓋玻片上的細胞。處理後，將細胞在室溫下用10%福馬林固定30分鐘。用PBS洗滌3次後，然後用冰冷的100%甲醇將細胞透化10分鐘，然後進行3次PBS洗滌，將細胞與LC3抗體(1：200，Genetex，Hsinchu，Taiwan)在4°C下溫育過夜。用0.02%PBST洗滌非特異性結合，然後與山羊抗兔Alexa488 (Jackson)在室溫下溫育2小時。然後用 0.02% PBST 洗滌細胞，並與 Alexa647-Tomm20 (1：100) 溫育過夜。PBS洗滌後，通過用DAPI封片溶液封片細胞，通過雷射共聚焦顯微鏡(FV1000，OLYMPUS IX-81)分析細胞並拍攝影像。

臨床分析統計之參與者招募：

於2016年和2018年在大林蒲進行了一般人群健康調查和肺癌篩查。大林蒲位於臺灣南部高雄市小港區，周圍環繞著臨源、臨海石化綜合體和煉油廠園區，在大林蒲生活了兩年以上的個數是通過廣告招募的。自我調查問卷(糖尿病、高血壓、高血脂症史、教育水平、身體活動和空氣清淨機使用史)和對所有參與者進行人體測量(包括體重、身高、吸煙、肺炎或肺癌病史)、尿銅和肌酐以及低劑量計算機斷層掃描(LDCT)。身體活動係詢問「您每周至少進行 150 分鐘的中等強度有氧運動還是每周 75 分鐘的劇烈有氧運動或同等組合？」，本統計分析排除了接受肺葉切除術或有肺炎病史(n = 23)和有吸煙史(n = 283)的肺癌受試者。由於WHO的建議是防止尿液樣本過於稀釋或過於濃縮，排除了尿肌酐濃度＜30 mg/dL和肌酐濃度＞300 mg/dL的受試者(n = 88)。本統計分析總共有 1458 人被納入分析，並已獲得高雄醫科大學醫院機構審查委員會的批准(編號：KMUHIRB-G(II)-20190011)。

尿銅分析、血液生化分析以及LDCT圖像採集和解讀：

在15mL聚丙烯管中用9mL1%(v/v)硝酸(J.T. Baker Chemical Company，Phillipsburg，NJ，USA)將血液樣品稀釋10倍。通過耦合等離子體質譜法(ICP-MS，7700系列；Agilent Technologies, Inc.，美國加利福尼亞州聖克拉拉)。品質控制和方法檢測限值均以國家環境實驗室標準為依據。

使用血液學分析儀(XE-2100；Sysmex，日本神戶)。使用化學系統測定血清天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽鹼(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、空腹血糖和HbA1c水平(Advia 1800；Siemens Healthcare GmbH，德國埃爾朗根)。使用ImmunoCAP ^®(Phadia，烏普薩拉，瑞典)測定血清總IgE水平。

所有掃描均在薄層掃描器(Toshiba Aquilion One 640 Slice CT斷層掃描器，日本)上進行，從肺尖到肺底有 320 個探測器，沒有對比增強。此外，所有掃描均使用低劑量方案和以下機器設置獲得：管電壓，120 kVp；管電流，9 (15 mA/0.6 s) 或 21 (35 mA/0.6 s) Ma；變槳比，1.5：1；旋轉時間為0.35秒。有效輻射劑量範圍為0.3至0.8mSv。肺纖維化變化包括肺纖維化模式的實質帶，這些帶被定義為LDCT圖像上特定肺葉中存在曲線或線性密度、細紋或板混濁。所有圖像均由具有10-30年經驗的訓練有素的放射科醫生進行臨床審查和報告。

統計分析：

肺纖維化變化、性別、飲酒和檳榔消費、糖尿病和高血壓被認為是名義變數。Fisher精確檢驗或卡方檢驗用於確定肺纖維化變化之間的差異。 Mann-Whitney U試驗用於檢查肺纖維化和非肺纖維化變化在尿銅和肌酐水平以及血液生化水平方面的差異。採用Spearman相關分析分析尿銅、年齡、BMI與血清生化水平的相關性。我們進行了多元logistic回歸分析，以評估與尿銅水平相關的肺纖維化變化的比值比(OR)和95%置信區間(CI)(連續變數)。我們將尿肌酐水平作為協變數納入回歸模型，以解釋尿液濃度的稀釋依賴性樣本變化。變數(1)與肺纖維化變化相關，(2)與尿銅水平相關，(3)根據文獻進行選擇。AST和ALT都與尿銅水平顯著相關，我們選擇AST作為混雜因素以防止多重共線性。所有分析均使用SPSS軟體(版本22；IBM Corp.， Armonk， NY， USA)。統計學顯著性設定為p ＜ 0.05。在體外和體內研究中，使用GraphPad Prism進行統計分析。使用學生t檢驗和單因素方差分析與Dunnett事後多重比較進行兩組之間的統計學顯著性。數據表示為均值+SEM，p值設置為0.05。

結果：

為了闡明類黃酮藥物是否可以開發為銅中毒的治療劑，對不同類別的類黃酮藥物進行了研究。黃酮類化合物是一種天然化合物，在蔬菜和水果中含量豐富，具有廣泛的生物活性。黃酮類化合物包括：黃酮類、黃酮醇類及黃烷酮醇類等。黃酮類包括芹菜素(apigenin)及芫花素(genkwanin、芹菜素7-甲基醚)；黃酮醇包括山奈酚(kaempferol)；黃烷酮醇包括3,3',4',7-四羥基黃烷酮(fustin)。

請參閱第1圖，其係本發明的類黃酮藥物對於肺泡上皮細胞的存活率測定的結果示意圖，其中API為芹菜素(apigenin)、KAE為山奈酚(kaempferol)、GEN為芫花素(genkwanin)、FUS為3,3',4',7-四羥基黃烷酮(fustin)。

與未處理的細胞相比，以lμM、5μM和10μM的類黃酮藥物對肺泡上皮細胞(A549)處理24小時，不影響細胞存活。

此外，由於肺泡上皮細胞除了作為抵禦外來侮辱的物理屏障外，在協調纖維化過程中也至關重要。上皮細胞在刺激下轉變為間質型(mesenchymal type)細胞，稱為上皮-間質轉換(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程。細胞失去上皮表現型並獲得間質表現型，包括：細胞移動性增加、細胞骨架重組以及細胞外基質的侵襲性增加。轉換的間質細胞貢獻了很大比例的活化成纖維細胞，其釋放的促成纖維細胞將進一步啟動其他成纖維細胞和細胞外基質蛋白的過量堆積，此為組織纖維化的一個特徵。EMT是一個可逆的過程，EMT被認為是罪魁禍首，EMT的靶向是纖維化疾病的治療靶點之一。

為了闡明本發明的類黃酮藥物能否抑制銅誘發的肺泡上皮細胞的上皮-間質轉換，對不同類別的類黃酮藥物進行了以下測定。

請參閱第2A圖及第2B圖，其分別係銅誘發肺泡上皮細胞發生粒線體自噬以及本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的肺纖維化相關蛋白或分子標誌表達的結果示意圖，其中API為芹菜素(apigenin)、KAE為山奈酚(kaempferol)、GEN為芫花素(genkwanin)、FUS為3,3',4',7-四羥基黃烷酮(fustin)。

如第2A圖所示，為了確定銅對肺泡上皮細胞粒線體自噬的影響，用 10 μM 劑量的 CuSO ₄處理肺泡上皮細胞(A549)以模擬銅中毒，表示自噬體的LC3(綠色)和表示粒線體Tomm20(紅色)的共定位以黃色顯示(如箭頭標示)，隨著CuSO ₄處理肺泡上皮細胞(A549)的時間越長，LC3的表達則越來越多，可見，CuSO ₄處理誘發了肺泡上皮細胞的粒線體自噬。

如第2B圖所示，對肺泡上皮細胞(A549)施加10μM的CuSO ₄3小時，此結果同樣發現CuSO ₄誘導肺泡上皮細胞發生自噬作用，提升自噬相關蛋白(LC3及PINK1)的表達，LC3在細胞在自噬的過程中从胞液(LC3-I, 17 kDa)形式逐步轉化為膜結合的脂化(LC3-II, 15 kDa)形式，PINK1是細胞中粒線體自噬特異性標誌物PTEN誘導的激酶1。

與CuSO ₄處理的細胞相比，分別以5μM和10μM的各個類黃酮藥物處理2小時，類黃酮藥物的預處理可抑制銅誘導的細胞自嗜標記蛋白(PINK1、LC3)和上皮-間質轉換標記蛋白(Snail)表達，其中芹菜素(apigenin)及山奈酚(kaempferol)對於上述標記蛋白的表達具有抑制效果，並且具有劑量反應效力。

請參閱第3A圖及第3B圖，其分別係本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的肺泡上皮細胞爬行的結果示意圖及量化示意圖。在第3A圖中，API為芹菜素(apigenin)、KAE為山奈酚(kaempferol)、GEN為芫花素(genkwanin)、FUS為3,3',4',7-四羥基黃烷酮(fustin)。在第3B圖中，a表示相較於控制組具有顯著意義，b表示相較於僅投予CuSO ₄組具有顯著意義。

以10μM的各個類黃酮藥物對肺泡上皮細胞(A549)預處理2小時後，投予10μM的CuSO ₄溫育24小時。從結果看出，銅誘發肺泡上皮細胞(A549)從上孔遷移到下方孔中，而經過類黃酮藥物的預處理可抑制銅誘導的細胞遷移，特別是山奈酚及3,3',4',7-四羥基黃烷酮的效果較為顯著。

請參閱第4A圖及第4B圖，其係銅誘發的上皮-間質轉換(EMT)相關蛋白或分子標誌表達的結果示意圖及量化示意圖。在第4A圖中，API為芹菜素(apigenin)、KAE為山奈酚(kaempferol)、GEN為芫花素(genkwanin)、FUS為3,3',4',7-四羥基黃烷酮(fustin)。

如第4B圖中的量化結果所示，與未處理的細胞相比，暴露於10μM CuSO ₄增加上皮-間質轉換(EMT)相關蛋白N-cadherin和減少E-cadherin表達。

與CuSO ₄處理的細胞相比，分別以10μM的各個類黃酮藥物處理2小時，類黃酮藥物的預處理可逆轉銅誘導的間質轉換標記蛋白(N-Cadherin和E-Cadherin)表達，即減少上皮-間質轉換(EMT)相關蛋白N-cadherin和增加E-cadherin表達，其中山奈酚(kaempferol)及3,3',4',7-四羥基黃烷酮(fustin) 的效果較為顯著。

由第2圖至第4圖的結果可見，本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的肺泡上皮細胞的自噬以及因自噬而誘導的上皮-間質轉換(EMT)。

請參閱第5圖，其係本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的肺纖維化相關蛋白或分子標誌表現的結果示意圖。

通過即時螢光定量PCR測定以1μM、10μM及100μM的CuSO ₄處理48小時的肺泡上皮細胞(A549)的複數個肺纖維化標誌物表達。結果表明，CuSO ₄促進了COL1A1、MMP7、LOXL2和N-Cadherin的表現。這些結果表明，CuSO ₄處理誘導了肺上皮細胞的纖維化。

請參閱第6圖，其係本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的上皮-間質轉換(EMT)相關蛋白(N-Cadherin)表現的結果示意圖，其中KAE為山奈酚(kaempferol)及FUS為3,3',4',7-四羥基黃烷酮(fustin)。

通過即時螢光定量PCR測定以5μM及10μM的山奈酚(kaempferol)及3,3',4',7-四羥基黃烷酮(fustin)預處理2小時的肺泡上皮細胞(A549)，接著以CuSO ₄處理24小時的上皮-間質轉換(EMT)相關蛋白(N-Cadherin)表現。結果表明，山奈酚(kaempferol)及3,3',4',7-四羥基黃烷酮(fustin)抑制銅誘發的N-Cadherin表現。*表示p值小於0.05；**表示p值小於0.01；***表示p值小於0.001；****表示p值小於0.0001。

請參閱第7A圖及第7B圖，其係本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的上皮-間質轉換相關蛋白或分子標誌(波形蛋白(vimentin))表達的結果示意圖及量化示意圖，其中CuONP為氧化銅奈米粒子。

對肺泡上皮細胞(A549)投予另一種銅化合物(0、0.5μM、1μM及5μM的氧化銅奈米粒子)2小時以模擬銅中毒，此結果發現銅誘發肺泡上皮細胞表達大量波形蛋白(vimentin)，波形蛋白(vimentin)是一種中間絲蛋白，在細胞從貼附轉變成移動的上皮-間質轉換中扮演著關鍵作用，因此是上皮-間質轉換相關蛋白或分子標誌，結果表明，銅誘發肺上皮細胞的上皮-間質轉換。

如第7B圖中的量化結果所示，與未處理的細胞相比，以1μM 或5μM的氧化銅奈米粒子處理，可以增加波形蛋白表達，並且具有劑量反應效力。

與氧化銅奈米粒子處理的細胞相比，以5μM的山奈酚預處理2小時再進行上述銅處理，山奈酚的預處理可抑制銅誘發的肺泡上皮細胞的波形蛋白表達，並且具有劑量反應效力。

請參閱第8A圖及第8B圖，其分別係本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的肺泡上皮細胞爬行的結果示意圖及對應的細胞存活率的結果示意圖，其中CuONP為氧化銅奈米粒子。

如第8A圖所示，以2μM及5μM的山奈酚對肺泡上皮細胞(A549)預處理2小時後，投予0.2μM或0.5μM的氧化銅奈米粒子(CuONP)溫育24小時。從結果看出，銅誘發肺泡上皮細胞(A549)從上孔遷移到下方孔中，而經過山奈酚的預處理可抑制銅誘導的細胞遷移。

如第8B圖所示，同時以山奈酚(2μM或5μM)及氧化銅奈米粒子(0.2μM或0.5μM)處理肺泡上皮細胞(A549)，不會對細胞存活率構成影響，可見足以證實上述細胞遷移數量並非因細胞存活數量所導致。

請參閱第9圖，其係本發明的類黃酮藥物在小鼠肺臟中抑制銅誘發的肺纖維化相關蛋白或分子標誌表達的結果示意圖。

為了闡明本發明的類黃酮藥物在小鼠的銅誘發的肺損傷中的功效，本發明以山奈酚作為示例進一步進行了動物實驗，並非以此為限。控制組：小鼠未投予CuONP及類黃酮藥物；CuONP組：小鼠經鼻腔投予2mg/kg的氧化銅奈米粒子，模擬重金屬銅的空氣污染，觀察小鼠的肺臟是否出現發炎及纖維化；CuONP+山奈酚組：同時向小鼠經口投予2mg/kg的CuONP及10mg/kg的本發明的類黃酮藥物(山奈酚)，觀察小鼠的肺臟發炎及肺纖維化是否被減輕或治癒；山奈酚組：觀察山奈酚是否對小鼠的肺臟構成毒性。以上各組經過28天後犧牲小鼠以取得肺臟組織分析肺纖維化相關蛋白或分子標誌的表達情況。

結果顯示小鼠吸取CuONP後使肺臟誘發了肺纖維化相關蛋白或分子標誌a-SMA和N-Cadherin的大量表達，而與同時給予CuONP+山奈酚的小鼠相比，山奈酚可抑制銅誘發的a-SMA和N-Cadherin表達，並且在不同隻小鼠肺臟組織均觀察到相同現象。

請參閱第10圖，其係本發明的類黃酮藥物在小鼠肺臟中抑制銅誘發的肺纖維化和肺臟發炎的結果示意圖。

對上述小鼠的肺臟進行切片，以Masson三色染色法分析肺臟發炎及纖維化的情況，結果顯示小鼠經鼻腔投予氧化銅奈米粒子，使小鼠的肺臟出現發炎及纖維化，而同時向小鼠經口投予CuONP及本發明的類黃酮藥物(山奈酚)抑制銅誘發肺臟發炎及肺纖維化，單獨投予山奈酚不會對小鼠的肺臟構成毒性，可見山奈酚有效治療、預防或減輕銅所造成的肺部損傷。

為了闡明人體尿銅的含量水平與肺纖維化變化之間的關聯性，進行了臨床統計分析，收集總共1458人、年齡和BMI的平均±SD分別為57.7±11.2歲和25.0±3.8Kg/m ²。確定所有受試者的男性性別(32.6%)、糖尿病史(11.2%)、高血壓史(27.6%)、咀嚼檳榔(0.3%)、飲酒(16%)、教育程度(≤初中：51.9%、高中：30.1%、≥大學：18.0%)、空氣清淨機使用(84.5%)和肺纖維化變化(36.2%)。

如表2所示，出現肺纖維化改變的個數年齡較大(＞60歲：82.6% vs. 62.3%，p ＜ 0.001)，高血壓比例較高(32.8% vs. 24.6%，p = 0.001)、高血脂(3.4% vs. 3.4%)。1.2 %，p = 0.004) 及空氣清淨機的使用(88.8% vs. 82.0%，p = 0.001)。此外，患有肺纖維化變化的個體具有顯著較高的AST 水平(IU/mL) (28.5 ± 11.7 與27.8 ± 10.8，p ＜ 0.001)、較高的空腹血糖值(mg/dL)(101.2 ± 28.7 與100.4 ± 27.4，p = 0.026)，較高的HbA1c 水平(%)(5.93 ± 0.92 與5.89 ± 0.98，p = 0.019)和較低的血小板計數(256.5 ± 68.868. 0.001)。 [表2]

特徵	非肺纖維化	肺纖維化	p
	(n = 930)	(n = 528)
類別變量, n(%)
性別			0.383
女性	619 (66.6)	364 (68.9)
男性	311 (33.4)	164 (31.1)
年齡（歲）			＜0.001
≤60	351 (37.7)	92 (17.4)
＞60	579 (62.3)	436 (82.6)
BMI (kg/m ²)			0.543
≤24	379 (40.8)	224 (42.4)
＞24	551 (59.2)	304 (57.6)
教育程度			＜0.001
≤國中	431 (46.3)	325 (61.6)
高中	297 (31.9)	142 (26.9)
≥大學	202 (21.7)	61 (11.6)
糖尿病			0.344
否	831 (89.4)	463 (87.7)
是	99 (10.6)	65 (12.3)
高血壓			0.001
否	701 (75.4)	355 (67.2)
是	229 (24.6)	173 (32.8)
高血脂症			0.004
否	919 (98.8)	510 (96.6)
是	11 (1.2)	18 (3.4)
酗酒			0.882
否	780 (83.9)	445 (84.3)
是	150 (16.1)	83 (15.7)
體力活動			0.083
否	234 (25.2)	111 (21.0)
是	696 (74.8)	417 (79.0)
空氣清淨機			0.001
否	167 (18.0)	59 (11.2)
是	763 (82.0)	469 (88.8)
血清，連續變量，平均值±SD (範圍)
白血球×10 ³(/μL)	5.9 ±1.5 (2.4, 14.0)	5.8 ±1.5 (2.5, 12.2)	0.226
血小板×10 ³(/μL)	260.2 ±68.6 (60.0, 794.0)	256.5 ±68.8 (117.0, 672.0)	0.001
穀草轉氨酶 (IU/mL)	27.8 ±10.8 (12.0, 102.0)	28.5 ±11.7 (14.0, 177.0)	＜0.001
谷丙轉氨酶(IU/mL)	25.9 ±18.7 (3.0, 190.0)	25.8 ±18.5 (4.0, 185.0)	0.852
肌酸酐(mg/dL)	0.9 ±0.3 (0.5, 5.0)	0.9 ±0.3 (0.6, 6.8)	0.071
膽固醇(mg/dL)	200.3 ±36.5 (91.0, 420.0)	200.6 ±36.8 (100.0, 386.0)	0.912
三酸甘油酯(mg/dL)	121.2 ±80.3 (25.0, 1129.0)	121.5 ±79.6 (29.0, 952.0)	0.705
高密度脂蛋白膽固醇(mg/dL)	53.6 ±13.6 (25.0, 100.2)	53.5 ±13.5 (24.4, 94.3)	0.917
低密度脂蛋白膽固醇(mg/dL)	119.6 ±32.7 (25.0, 306.0)	119.6 ±33.0 (34.0, 276.0)	0.978
空腹血糖(mg/dL)	100.4 ±27.4 (57.0, 325.0)	101.2 ±28.7 (72.0, 348.0)	0.026
糖化血紅素 (%)	5.89 ±0.98 (4.20, 12.30)	5.93 ±0.92 (4.20, 12.90)	0.019
嗜酸性球 (/μL)	134.6 ±124.3 (0.1, 1010.0)	127.6 ±128.9 (0.1, 1070.0)	0.090
免疫球蛋白E (IU/mL)	76.5 ±235.1 (0.1, 4439.4)	115.2 ±518.5 (0.1, 7618.3)	0.128

如表3所示，出現肺纖維化改變的受試者的尿銅水平(μg/dL)顯著高於非肺纖維化變化的受試者(幾何平均值：1.45 vs. 1.39，p=0.081)。 [表3]

項目	平均值	標準差	GM	最小值	25 ^th	中位數	75 ^th	最大值	p
尿
銅 (µg/dL)									0.081
非肺纖維化	1.55	0.78	1.39	0.05	1.05	1.43	1.86	8.25
肺纖維化	1.69	0.99	1.45	0.05	1.11	1.48	1.90	9.94
肌酸酐 (mg/dL)	0.107
非肺纖維化	130.13	59.31	115.92	30.20	83.60	124.55	171.83	296.60
肺纖維化	124.68	56.85	111.25	30.40	80.63	116.70	160.95	297.50

如表4所示，尿銅水平與年齡(r = 0.17，p ＜ 0.001)、BMI (r = 0.11，p ＜ 0.001)、WBC (r = 0.11，p ＜0.001)、AST (r = 0.16，p ＜ 0.001) 、ALT (r = 0.10，p ＜ 0.001)、血清肌酸酐(r = 0.13，p ＜ 0.001)、三酸甘油酯(r = 0.13，p ＜ 0.001)、空腹血糖(r = 0.17，p ＜ 0.001)、HbA1c ( r = 0.17，p ＜ 0.001)和嗜酸性粒細胞計數(r = 0.10，p ＜ 0.001)呈顯著正相關。尿銅水平與血小板數(r = -0.07，p = 0.010)和HDL-C (r = -0.14，p ＜ 0.001)呈顯著負相關。男性受試者(平均值 ± SD，μg/dL)(男性：1.64 ± 0.89 對比女性：1.57 ± 0.85，p = 0.014)，年齡較大(＞60 歲：1.66 ± 0.92 對比 ≤60 歲，p ＜ 0.001)、較高的BMI (kg/m2) (＞24: 1.65 ± 0.91 vs. ≤24: 1.52 ± 0.79, p ＜ 0.001)、較低的教育程度(≥大學: 1.39 ± 0.57 vs. ≤初中: 1.68 ± 0.96，p ＜ 0.001)、糖尿病(是：2.12 ± 1.23 vs. 否：1.53 ± 0.78，p ＜ 0.001)、高血壓(是：1.80 ± 1.07 vs. 否：1.51 ± 0.75，p ＜ 0.01)和使用空氣清淨機(是：1.62 ± 0.88 vs. 否：1.47 ± 0.73，p = 0.016)的尿銅含量顯著升高。 [表4]

項目

銅

年齡

BMI

WBC

PLT

AST

ALT

Cr

CHOL

TG

HDL-C

LDL-C

血糖

HbA1c

嗜酸性球

IgE

銅

1

年齡

0.17 ^**

1

BMI

0.11 ^**

0.13 ^**

1

WBC

0.11 ^**

-0.05 ^*

0.25 ^**

1

PLT

0.01 ^**

-0.34 ^**

0.01

0.30 ^**

1

AST

0.16 ^**

0.26 ^**

0.17 ^**

0.06 ^*

-0.16 ^**

1

ALT

0.10 ^**

0.11 ^**

0.35 ^**

0.14 ^**

-0.13 ^**

0.68 ^**

1

Cr

0.13 ^**

0.25 ^**

0.13 ^**

0.09 ^**

-0.21 ^**

0.15 ^**

0.12 ^**

1

CHOL

-0.04

0.03

-0.03

0.01

0.10 ^**

0.01

-0.06 ^*

1

TG

0.13 ^**

0.14 ^**

0.33

0.27 ^**

0.07 ^**

0.14 ^**

0.27 ^**

0.13 ^**

0.18 ^**

1

HDL-C

-0.14 ^**

-0.12 ^**

-0.31 ^**

-0.20 ^**

0.06 ^*

-0.05 ^*

-0.19 ^**

-0.26 ^**

0.34 ^**

-0.51 ^**

1

LDL-C

-0.003

0.01

0.07 ^*

0.09 ^**

-0.003

0.05

-0.01

0.84 ^**

0.15 ^**

0.04

1

血糖

0.17 ^**

0.34 ^**

0.32 ^**

0.15 ^**

-0.09 ^**

0.16 ^**

0.22 ^**

0.11 ^**

-0.02

0.26 ^**

-0.22 ^**

0.01

1

HbA1c

0.17 ^**

0.34 ^**

0.29 ^**

0.22 ^**

-0.02

0.19 ^**

0.08 ^**

-0.01

0.28 ^**

-0.23 ^**

0.01

0.63 ^**

1

嗜酸性球

0.10 ^**

-0.07 ^**

0.10 ^**

0.24 ^**

0.08 ^**

0.06 ^*

0.13 ^**

0.001

0.12 ^**

-0.11 ^**

0.04

0.03

0.15 ^**

1

IgE

0.04

0.01

0.09 ^**

0.06 ^*

0.01

-0.02

0.03

0.08 ^**

-0.08 ^**

-0.01

-0.06 ^**

-0.04

0.05

0.13 ^**

1

縮寫：PLT：血小板計數，AST：天門冬胺酸轉氨酶，ALT：丙胺酸轉氨酶，Cr：肌酸九，TG：三酸甘油酯。 * p ＜ 0.05，** p ＜ 0.01。

如表5所示，在調整尿肌酸酐、年齡、性別、BMI、AST、HbA1c、三酸甘油酯、HDL-C、嗜酸性粒細胞計數、白血球、血小板、血清肌酸酐、教育程度和空氣清淨機的使用後，發現尿銅濃度增加一個單位與肺纖維化變化風險增加有顯著相關(比值比 [OR] = 1.17，95% 信賴區間 [CI] = 1.01–1.36，p = 0.038)。 [表5]

尿銅 (ug/dL)	OR	95% CI	p
肺纖維化改變
模型 1	1.27	(1.10, 1.46)	0.001
模型 2	1.17	(1.01, 1.35)	0.031
模型 3	1.19	(1.03, 1.39)	0.021
模型 4	1.17	(1.01, 1.36)	0.038

模型 1：依尿液肌酸酐進行調整。模型 2：除了年齡、性別和 BMI 之外，還針對模型 1 進行了調整。模型 3：除了 AST、HbA1c、三酸甘油酯、HDL-C、嗜酸性粒細胞計數、WBC、血小板和血清肌酸酐之外，還針對模型 2 進行了調整。模型4：除了教育程度和空氣清淨機使用情況外，還針對模型3進行了調整。

綜上所述，藉由上述各試驗所得到的結果，均明顯可見本發明的類黃酮藥物對於銅誘發之肺功能損傷具有治療、預防或減輕之功效，故對於因銅誘發之肺功能損傷的患者給予含有類黃酮藥物之藥物或保健食品，可在幾乎無副作用的情況下顯著改善其肺功能損傷，特別是肺纖維化病症。

本發明的類黃酮藥物可以使用一個或多個生理學上可接受的載體以常規方式配製，所述多個載體包括多個賦形劑及多個輔佐劑，所述多個賦形劑及多個輔佐劑有助於將所述多個活性成分加工成可以在藥學上使用的多個製劑，適當的配方取決於所選擇的給藥途徑。

本發明的類黃酮藥物的給藥途徑包含口服、經鼻、腸或腸胃外給藥，本發明的類黃酮藥物的劑型沒有特別的限制。例如：液體溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、緩釋製劑、粉劑、栓劑、脂質體、微粒、微膠囊、等滲無菌水性緩衝溶液等均被認為是合適的劑型。

本發明的類黃酮藥物可以包括一個或多個合適的稀釋劑、填充劑、鹽、崩散劑、黏合劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑、控釋基質、著色劑、調味劑、載體、賦形劑、緩衝劑、穩定劑、增溶劑、市售助劑及/或其他本領域已知的添加劑。

本發明所使用的術語「治療」是指抑制、預防或阻止一病理(疾病、病症或病況)的發展和/或導致一病理的減少、緩解或壓制。本領域技術人員將理解，可以使用各種方法及分析來取得一病理的所述發展，相似地，各種方法及分析可用於取得一病理的減少、緩解或壓制。根據多個具體實施例，治療包括增加存活。

本發明亦提供醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之載劑及本發明化合物或其立體異構體、互變異構體、醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物中之至少一者。

如本文所用，「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之衍生物，其中母化合物藉由製備其酸鹽或鹼鹽而經修飾。本發明之醫藥學上可接受之鹽可由含有鹼性或酸性部分之母化合物經習知化學方法合成。一般而言，此類鹽可由此等化合物之游離酸或鹼形式與化學計量之量之適當鹼或酸在水中或在有機溶劑中或在兩者之混合物中反應來製備；一般而言，非水性介質(如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈)較佳。適合鹽之清單見於Remington's Pharmaceutical Sciences第18版, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)中，其揭示內容特此以引用之方式併入。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對本發明實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面所描述的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於所屬技術領域中具有通常知識者來講，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。第1圖係本發明的類黃酮藥物對於肺泡上皮細胞的存活率測定的結果示意圖。第2A圖及第2B圖分別係銅誘發肺泡上皮細胞發生粒線體自噬以及本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的肺纖維化相關蛋白或分子標誌表達的結果示意圖第3A圖及第3B圖分別係本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的肺泡上皮細胞爬行的結果示意圖及量化示意圖。第4A圖及第4B圖分別係銅誘發的肺纖維化相關蛋白或分子標誌表現的結果示意圖及量化示意圖。第5圖係本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的肺纖維化相關蛋白或分子標誌表現的結果示意圖。第6圖係本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的肺纖維化相關蛋白(N-Cadherin)表現的結果示意圖。第7A圖及第7B圖分別係本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的上皮-間質轉換相關蛋白或分子標誌(vimentin)表達的結果示意圖及量化示意圖。第8A圖及第8B圖分別係本發明的類黃酮藥物抑制銅誘發的肺泡上皮細胞爬行的結果示意圖及對應的細胞存活率的結果示意圖。第9圖係本發明的類黃酮藥物在小鼠肺臟中抑制銅誘發的肺纖維化相關蛋白或分子標誌表達的結果示意圖。第10圖係本發明的類黃酮藥物在小鼠肺臟中抑制銅誘發的肺臟發炎及肺纖維化的切片示意圖。

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          	Molecule Type: DNA
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          		- source, 1..22
          			> mol_type, unassigned DNA]]&gt;
          <br/><![CDATA[			> organism, Homo sapiens]]&gt;
          <br/><![CDATA[	Residues:
          	gtaggatctc  cgccactgat  tc                                              22
          END

Claims

一種類黃酮藥物用於抑制細胞自嗜標記蛋白PINK1之表達以預防或減輕肺功能損傷之用途，其中該類黃酮藥物選自山柰酚、3,3',4',7-四羥基黃烷酮或其醫藥學上可接受之鹽；以及該類黃酮藥物之使用劑量為5μM。
一種類黃酮藥物用於抑制上皮-間質轉換標記蛋白Snail之表達以預防或減輕肺功能損傷之用途，其中該類黃酮藥物選自山柰酚或其醫藥學上可接受之鹽；以及該類黃酮藥物之使用劑量為10μM。
如請求項1或請求項2所述之用途，其中該肺功能損傷係由於哺乳動物之肺泡上皮細胞暴露於銅之中所造成。
如請求項1或請求項2所述之用途，其中該肺功能損傷係由於肺發炎或肺纖維化所引起。
如請求項4所述之用途，其中該肺纖維化係由哺乳動物之肺泡上皮細胞被誘發之細胞自嗜或上皮-間質轉換所引起。
如請求項1或請求項2所述之用途，其係將該類黃酮藥物投予至一哺乳動物之肺泡上皮細胞。
如請求項6所述之用途，其給藥途徑包含口服、經鼻、腸或腸胃外給藥。