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TWI872600B - 含血管類骨器官及其壓迫灌流式培養系統 - Google Patents

含血管類骨器官及其壓迫灌流式培養系統 Download PDF

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TWI872600B
TWI872600B TW112125512A TW112125512A TWI872600B TW I872600 B TWI872600 B TW I872600B TW 112125512 A TW112125512 A TW 112125512A TW 112125512 A TW112125512 A TW 112125512A TW I872600 B TWI872600 B TW I872600B
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徐佳福
朱慈暉
羅友志
賴怡廷
蔡裕民
康玉承
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國防醫學院
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Abstract

本發明揭露一種壓迫灌流式培養系統及其培養類器官之方法，該壓迫灌流式培養系統包含：一壓迫裝置、一培養液槽、一灌流裝置以及一微電腦驅動器，該壓迫裝置及該灌流裝置係透過該微電腦驅動器進行控制及調整各項功能參數，使該培養系統同時提供動態機械壓縮力和灌注流體力的刺激，以模擬人體內的動態微環境；本發明進一步透過3D生物列印技術製造含血管類骨器官，培養於該壓迫灌流式培養系統，以實現模擬骨髓腔內骨與血管內皮細胞於體內正常動態生理環境的生長情形。

Description

含血管類骨器官及其壓迫灌流式培養系統
本發明係關於細胞培養技術，尤其係關於含血管類骨器官及其壓迫灌流式培養系統。
類器官(organoid)觀念和技術近年來正逐漸發展，其主要係利用幹細胞生成模仿人體器官功能和組織的3D結構，相較傳統的2D細胞培養或動物模型更符合實際人體器官的生理模型，可作為研究器官發育、疾病機制、藥物篩選和個人化醫療的模型，在藥物研發及病理研究領域，提供了研究疾病的分子和細胞機制以及開發新治療和療法的有力工具，不僅是逼真的藥物療效和毒性測試模型，亦可用於個人化醫療，讓臨床醫師在給予患者治療之前測試潛在治療對患者自身細胞的影響，此技術的應用能更快速、更精確的診斷，以及開發出副作用更少、更有效的治療方法。
類骨器官(bone organoid) 係透過組織工程和幹細胞技術培養出的類似於真實骨組織的結構，類骨器官可以模擬骨骼的結構、功能和生理特性，有助於研究骨骼發育、疾病發展和相關治療方法等，舉例而言，骨質疏鬆症及其相關的骨折一直是重要的全球健康問題，目前仍不具有理想治療骨質疏鬆症的藥物，大部分已開發藥物都有心血管副作用，其中一個重要原因是現階段並未有良好的研發模型，現有的藥物研發模型太著重於對骨組織的影響，而忽略對其他組織的作用，骨生成與血管生成密不可分，骨質疏鬆症藥物的研發必須同時考慮對骨組織和血管的影響，而類骨器官利用組織工程技術和生物學理論創建的一種新的體外概念，能夠模擬複雜的體內器官功能，有潛力成為未來重要的病理或藥物研發模型。
然而，類骨器官由於需礦物化增加其堅硬強度特性，目前相關研究較難有進展，並且骨髓腔竇血管網路分布相當複雜，以至於如何將骨細胞結合血管內膜細胞以模擬人體內實際的器官情形，一直是本領域亟待解決的問題。
再者，實際的骨器官在體內的環境中會遭受固體和流體之壓力、張力、扭力、剪力等物理力量的影響，多項研究指出機械力刺激可以改變骨器官形狀並增加骨堅硬強度，但如何將物理性力量轉化成為分子生物訊號至今仍不清楚， 因此，若要發展有效且接近真實體內環境的病理或藥物研發模型，如何在體外精準模擬出人體內真實骨組織環境包含機械力、流體剪力及組織構造，以進行後續的類器官培養，亦亟待克服。
有鑑於此，本發明提供一種壓迫灌流式培養系統，包含： 一壓迫裝置，包含一細胞生長區、一第一電動夾爪、一第二電動夾爪以及一微型馬達，該細胞生長區係設置於該第一及第二電動夾爪之間，該微型馬達係與該第一及第二電動夾爪電性連接； 一培養液槽，裝載一細胞培養液，該細胞生長區及該第一及第二電動夾爪係設置於該培養液槽之內； 一灌流裝置，包含一培養液瓶、一培養液回收瓶以及一蠕動幫浦，該蠕動幫浦係分別以管線與該培養液槽、該培養液瓶及該培養液回收瓶連接；以及 一微電腦驅動器，包含一控制面板，該微電腦驅動器係分別與該蠕動幫浦、該微型馬達電性連接； 其中，該壓迫裝置及該灌流裝置係透過該微電腦驅動器進行控制及調整各項功能參數，以模擬人體內的動態微環境。
在某些具體實施例中，該壓迫灌流式培養系統包含至少一支架，其係用於固定該壓迫裝置、該培養液槽及該灌流裝置。
在某些具體實施例中，該壓迫灌流式培養系統係用於培養並分化至少一種幹細胞，該幹細胞係選自由下列所組成之群組：骨前趨細胞(osteoprogenitor cells，OPCs)、人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)、間質幹細胞(mesenchymal stem cell，MSC)，以及造血幹細胞(hematopoietic stem cells)。
於一方面，本發明提供一種含血管類骨器官，包含： 一第一成骨網狀支架，係以一第一生物相容性材料製成，其上接種骨前趨細胞(OPCs)； 一第二成骨網狀支架，係以一第二生物相容性材料製成，其上接種骨前趨細胞(OPCs)；以及 一血管網狀支架，係置於該第一及第二成骨網狀支架之間，係以一第三生物相容性材料與人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)製成。
在某些具體實施例中，該第一成骨網狀支架、該第二成骨網狀支架及該血管網狀支架係以3D列印製成。
在某些具體實施例中，該第一、第二、第三生物相容性材料係獨立地選自於由：聚己內酯(polycaprolactone)、明膠甲基丙烯(GelMa)、聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(Pluronic F127)、殼聚糖(Chitosan)、膠原蛋白(collagen)、海藻酸鹽(alginate)所組成的群組。
在某些具體實施例中，該含血管類骨器官係透過如本發明所述之壓迫灌流式培養系統進行培養，其中該含血管類骨器官培養於該細胞生長區。
於另一方面，本發明提供一種培養類器官之方法，包含：提供一如本發明所述之壓迫灌流式培養系統；培養至少一種幹細胞於該細胞生長區上；以及利用該蠕動幫浦進行流體灌流並搭配該微型馬達進行機械力刺激，以模擬細胞培養於人體內的動態微環境。
在某些具體實施例中，該幹細胞係選自由下列所組成之群組：骨前趨細胞(osteoprogenitor cells，OPCs)、人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)、間質幹細胞(mesenchymal stem cell，MSC)，以及造血幹細胞(hematopoietic stem cells)。
在某些具體實施例中，該方法係用於培養一如本發明所述之含血管類骨器官，其中該含血管類骨器官培養於該細胞生長區。
相較於傳統的2D細胞培養，本發明所揭露之含血管類骨器官結合3D生物列印技術及幹細胞生成，模擬人體骨器官功能和組織的3D構造，其更符合人體器官的實際生理態樣。
再者，相較於傳統的靜態培養，本發明所揭露之壓迫灌流式培養系統，透過微電腦驅動裝置調整該培養系統之壓迫力、壓迫時間、壓迫頻率、灌流流量、灌流流速等參數，精準模擬人體內真實骨組織生理環境影響包含機械力及流體剪力，透過本發明所述壓迫灌流式培養系統，研究者可以針對骨組織之疾病模型、藥物篩檢、分子機轉等進行更精確及有效之研究。
本發明後續能進一步使用患者自己的骨髓細胞，配合最新發展之支架材料，3D生物列印製造血管化骨類器官，在機械壓縮力和灌注流體力系統的刺激下，在短時間內促進骨組織內血管生成，和增強細胞外基質礦化作用(增加骨組織堅硬度)，並且成為模擬骨細胞在體內正常生存環境之研究儀器，有利於解開機械和流體力刺激對骨和血管生成的深入機制，有助於為骨質疏鬆症及相關骨折提供更有效和更安全的治療。
有鑑於傳統技術之問題及缺失，本發明透過3D生物列印及細胞培養技術來製造一種含血管類骨器官，同時結合本發明所揭露之壓迫灌流式培養系統，提供壓迫(compression)力學和灌流(perfusion)力學刺激，以模擬真實體內環境的影響，提供一有效的藥物篩選、病理研發模型。
應當理解的是，前述一般描述和下面的詳細描述都是示例性和說明性的，但並非用以限制本發明所請之權利。本發明的一個或多個實施例的某些細節闡述於以下說明中。從以下代表性實施例的非窮舉的列表中，亦從所附的權利要求中，本發明的其它特徵或優點將是顯而易見的。
除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域中的技術人員所通常理解相同的含義。
應注意的是，如本文中所使用，單數形式術語「一個」、「一種」及「該」除非明確地限於一個指示物，否則包括複數個指示物。除非上下文另外明確指出，否則術語「或」與術語「和/或」可互換使用。
本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」一詞實質上代表所述之數值或範圍位於20%以內，較佳為於10%以內，以及更佳者為於5%以內。於本文所提供之數字化的量為近似值，意旨若術語「約」、「大約」或「近乎」沒有被使用時亦可被推得。
如本文中所使用，詞彙「包含」是開放式的，表示此類實施例可包含額外的元素。反之，詞彙「由…組成」是封閉式的，表示此類實施例不包含額外的元素(痕量雜質除外)。詞彙「基本上由…組成」是部分封閉式的，表示此類實施例還可包含非實質改變此類實施例的基本特徵之元素。
除非本文另有定義，否則用以與本文結合的科學與技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行。一般而言，本文所描述之用以連結以下技術的命名法，以及生物化學、酵素學、分子及細胞生物學、微生物學、醫學、藥學、遺傳學與蛋白質及核酸化學、雜合反應及3D列印的技術皆為本領域已知且經常使用者。除非另有說明，本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行，且被描述於在本說明書中被引用且討論的各種一般及更具體的參考文獻中。
為利貴審查委員瞭解本發明之技術特徵、內容與優點及其所能達成之功效，茲將本發明配合附圖，並以實施例之表達形式詳細說明如下，而其中所使用之圖式，其主旨僅為示意及輔助說明書之用，未必為本發明實施後之真實比例與精準配置，故不應就所附之圖式的比例與配置關係解讀、侷限本發明於實際實施上的權利範圍，合先敘明。
於一方面，本發明提供一種壓迫灌流式培養系統，包含： 一壓迫裝置，包含一細胞生長區、一第一電動夾爪、一第二電動夾爪以及一微型馬達，該細胞生長區係設置於該第一電動夾爪及該第二電動夾爪之間，該微型馬達係與該第一電動夾爪及該第二電動夾爪電性連接； 一培養液槽，裝載一細胞培養液，該細胞生長區及該第一電動夾爪及該第二電動夾爪係設置於該培養液槽之內； 一灌流裝置，包含一培養液瓶、一培養液回收瓶以及一蠕動幫浦，該蠕動幫浦係分別以管線與該培養液槽、該培養液瓶及該培養液回收瓶連接；以及 一微電腦驅動器，包含一控制面板，該微電腦驅動器係分別與該蠕動幫浦、該微型馬達電性連接； 其中，該壓迫裝置及該灌流裝置係透過該微電腦驅動器進行控制及調整各項功能參數，以模擬人體內的動態微環境。
在某些具體實施例中，該壓迫灌流式培養系統包含至少一支架，其係用於固定該壓迫裝置、該培養液槽及該灌流裝置。
在某些具體實施例中，該壓迫灌流式培養系統係用於培養並分化至少一種幹細胞，該幹細胞係選自由下列所組成之群組：骨前趨細胞(osteoprogenitor cells，OPCs)、人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)、間質幹細胞(mesenchymal stem cell，MSC)，以及造血幹細胞(hematopoietic stem cells)。
在某些具體實施例中，請參閱圖1，圖1係為本發明所述壓迫灌流式培養系統1之示意圖，壓迫裝置10中的微型馬達103經由支架2支撐，使細胞生長區100、第一電動夾爪101及第二電動夾爪102得以浸泡於培養液槽11中，此外，微型馬達103透過一電線131與微電腦驅動器13電性相連。另一方面，灌流裝置12中的培養液瓶120與培養液回收瓶121經由支架2固定，其中，蠕動幫浦122透過第一管線123由培養液瓶120中抽取培養液，再透過第二管線124將培養液推送至培養液槽11中，且蠕動幫浦122透過第三管線125由培養液槽11中抽取培養液，再透過第四管線126將培養液推送至培養液回收瓶121中，此外，蠕動幫浦122透過一電線131與微電腦驅動器13電性相連。
微電腦驅動器13藉由控制面板130進行操作，以控制微型馬達103及蠕動幫浦122的參數，進而達到調控本發明之壓迫灌流式培養系統中的壓迫力學及灌流力學刺激，實現模擬體內的真實動態生理環境。微電腦驅動器13對於微型馬達103中可調控之參數包含但不限於第一電動夾爪位置、第二電動夾爪位置、第一及第二電動夾爪收縮時間、第一及第二電動夾爪收縮速率、壓迫力大小、壓迫力持續時間、壓迫力頻率、形變量等；微電腦驅動器13對於蠕動幫浦122中可調控之參數包含但不限於液體流速、液體流量、灌流時間等。在某些具體實施例中，微電腦驅動器13進一步含有一流體偵測器以偵測液體之流量及流速等參數。
請參閱圖2A及圖2B，圖2A及圖2B分別為本發明所述壓迫裝置10產生壓迫力前後之前視示意圖，第一電動夾爪101及第二電動夾爪102之間的區域為細胞生長區100，如圖2A所示，第一電動夾爪101及第二電動夾爪102之間的間距為d1，該間距取決於第一電動夾爪101及第二電動夾爪102的位置，該位置透過微型馬達103進行調控，如圖2B所示，當微型馬達103調控第一電動夾爪101及第二電動夾爪102的位置，使其相互收縮靠近，其間距改變為d2 (d1 ＞ d2)，則會對細胞生長區100產生一壓迫力刺激。透過在微電腦驅動器上的操作，能控制微型馬達103調整第一電動夾爪位置、第二電動夾爪位置、第一及第二電動夾爪收縮時間、第一及第二電動夾爪收縮速率等參數，進而產生不同壓迫力大小、壓迫力持續時間及壓迫力頻率。
請參閱圖3，圖3係為本發明所述壓迫裝置10搭載含血管類骨器官之前視示意圖，如圖3所示，含血管類骨器官3設置於細胞生長區，經由兩側的第一電動夾爪101及第二電動夾爪102固定，且浸泡於培養液槽11中，同時經由微型馬達103改變第一電動夾爪101及第二電動夾爪102的位置，使其對該含血管類骨器官3產生一壓迫力，透過在微電腦驅動器上的操作以控制微型馬達103，達到調控該壓迫力大小、持續時間及頻率等參數，進而模擬體內骨細胞遭受壓迫力之動態生理環境。
於另一方面，本發明提供一種含血管類骨器官，包含： 一第一成骨網狀支架，係以一第一生物相容性材料製成，其上接種骨前趨細胞(OPCs)； 一第二成骨網狀支架，係以一第二生物相容性材料製成，其上接種骨前趨細胞(OPCs)；以及 一血管網狀支架，係置於該第一成骨網狀支架及第二成骨網狀支架之間，係以一第三生物相容性材料與人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)製成。
在某些具體實施例中，該第一成骨網狀支架、該第二成骨網狀支架及該血管網狀支架係以3D列印製成。
在某些具體實施例中，該第一、第二、第三生物相容性材料係獨立地選自於由：聚己內酯(polycaprolactone，PCL)、明膠甲基丙烯(GelMa)、聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(Pluronic F127)、殼聚糖(Chitosan)、膠原蛋白(collagen)、海藻酸鹽(alginate)所組成的群組。
請參閱圖4，圖4係為本發明所述含血管類骨器官3之結構示意圖，在第一成骨網狀支架30及第二成骨網狀支架31之間設置血管網狀支架32，第一成骨網狀支架30、第二成骨網狀支架31及血管網狀支架32的製成係透過3D生物列印技術將生物相容性材料列印成中空立方形網狀結構，以做為細胞培養之骨支架，各中空立方形網狀結構約1平方公分，厚度約0.2公分。
在某些具體實施例中，本發明所述含血管類骨器官，其係透過如本發明所述之壓迫灌流式培養系統進行培養，其中含血管類骨器官培養於細胞生長區上。
於又一方面，本發明提供一種培養類器官之方法，包含： 提供一如本發明所述之壓迫灌流式培養系統； 培養至少一種幹細胞於該細胞生長區上；以及 利用該蠕動幫浦進行流體灌流並搭配該微型馬達進行機械力刺激，以模擬細胞培養於人體內的動態微環境。
在某些具體實施例中，本發明所述培養類器官之方法，其中該幹細胞係選自由下列所組成之群組：骨前趨細胞(osteoprogenitor cells，OPCs)、人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)、間質幹細胞(mesenchymal stem cell，MSC)，以及造血幹細胞(hematopoietic stem cells)。
在某些具體實施例中，本發明所述培養類器官之方法係用於培養一如本發明所述之含血管類骨器官，其中該含血管類骨器官培養於該細胞生長區上。
本發明進一步透過以下的實施例闡釋，其不應以任何方式被解釋為進一步的限縮。本申請案中引用的所有引用文件(包括參考文獻、核准的專利、公開的專利申請，以及一同在申請中的專利申請案)的整體內容，在此透過引用的方式明確地併入本案中。
實施例 1 含血管類骨器官的製程
本實施例中之含血管類骨器官製程分為成骨網狀支架列印與骨細胞培養、及血管網狀支架列印與靜脈內皮細胞培養。
1.1 成骨網狀支架列印與骨細胞培養
本實施例中之含血管類骨器官之該第一成骨網狀支架及該第二成骨網狀支架係透過3D支架列印技術製成，並經由3D細胞培養技術將骨前趨細胞(osteoprogenitor cells，OPCs)進行接種培養，具體步驟包含： 透過3D電腦繪圖軟體(Tinkercad)設計並繪製支架圖，以用於後續3D列印； 將聚己內酯(polycaprolactone，PCL)顆粒填入熱塑型噴頭內，再將噴頭裝至生物列印機(BioX bioprinter，Cellink公司，瑞典)上； 使用27G不鏽鋼噴嘴進行列印，列印參數為25%密度、溫度180°C、壓力200千帕、速度1.2毫米/秒，在列印完畢後待PCL冷卻固化從透明轉為白色即可從培養皿上取下； 將列印完成之PCL支架先浸泡於75%酒精10分鐘以滅菌，再將PCL支架浸泡於1：1000 聚-L-賴胺酸(Poly-L-Lysine)溶液，放置於37 °C、5% CO 2培養箱中一小時，有助於提高細胞貼附力，接著以PBS清洗3次； 將含有2 x 10 5個OPCs的50 μL細胞懸浮液接種於PCL支架上，一小時後再加入成骨細胞培養基(Osteoblast medium，ObM)並放進培養箱中培養，隔天將兩片含有OPCs的PCL支架中間夾一片不含細胞的GelMA支架，加入1 mL ObM培養，每三天更換一次培養基。
1.2 血管網狀支架列印與靜脈內皮細胞培養
本實施例中之含血管類骨器官之該血管網狀支架係透過3D支架列印技術製成，並經由3D細胞培養技術將人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)進行接種培養，具體步驟包含： 透過3D電腦繪圖軟體(Tinkercad)設計並繪製支架圖，以用於後續3D列印； 製備明膠甲基丙烯(GelMa)生物墨水，濃度為3毫升含有1 x 10 7個人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，GelMA與HUVECs細胞懸浮液以10：1的比例利用針筒與專用轉接頭均勻混合，再注入已滅菌的專用墨水匣，即完成生物墨水的製備； 將溫控型噴頭裝至生物列印機(BioX)上，再裝上前述含有GelMA生物墨水的墨水匣，使用27G塑膠針頭列印，列印參數為40%密度、溫度為20至25 °C、壓力為85至110千帕、速度為2毫米/秒，在列印完畢後照405 nm紫外光30秒以交聯固化； 經紫外光交聯的GelMA支架在加入磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)後可輕易將之從培養皿上完整取下，並移至24孔盤後加入內皮細胞培養基(Endothelial cell medium，ECM)，置於37 °C、5% CO 2培養箱中培養，隔天將兩片已滅菌未接種細胞的PCL支架中間夾一含有HUVECs的GelMA支架，加入1 mL ECM培養，每三天更換一次培養基。
1.3 含血管類骨器官
經上述製程後，取一片血管網狀支架(含HUVECs的GelMA支架)上下各夾一片成骨網狀支架(含OPCs的PCL支架)，結構如圖4所示，類似於三明治的結構，將兩種網狀支架組合在一起培養即形成本發明所述含血管類骨器官，將該含血管類骨器官透過本發明所述壓迫灌流式培養系統進行培養，加入ECM和ObM混合的培養基於該培養液槽中，放入37 °C、5% CO 2培養箱中，每三天更換一次培養基。
實施例 2 含血管類骨器官之人類臍靜脈內皮細胞 (HUVECs)
在本實施例中，經由如實施例1所述製程，將人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)接種於明膠甲基丙烯(GelMa)血管網狀支架上，觀察其生長情形，並透過本發明所述壓迫灌流式培養系統將本發明所述含血管類骨器官進行培養，以施加壓迫力刺激及灌流刺激，模擬體內的動態微環境，並觀察人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)接受刺激後的細胞存活率。
2.1 人類臍靜脈內皮細胞 (HUVECs) 之生長情形
在本實施例之一實驗中，人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)接種於明膠甲基丙烯(GelMa)血管網狀支架上培養21天後，使用免疫螢光染色法(Immunofluorescence，IF)以CD31抗體標示明膠甲基丙烯(GelMa)血管網狀支架內之人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，結合DAPI核染色法，觀察細胞生長情形。具體免疫螢光染色法實驗步驟包含： 將GelMA血管網狀支架的培養基抽起並用PBS清洗，加入4% 三聚甲醛(Paraformaldehyde)搖晃40分鐘以固定支架中的細胞，PBS再清洗3次，每次配合搖晃10分鐘洗去三聚甲醛； 將抗CD31抗體(Mouse/rat CD31/PECAM-1 antibody，Bio Basic公司，加拿大，分類編號為No. PB0684) 作為一級抗體覆蓋支架，抗體與阻斷液(Blocking buffer)的比例為1：200，放置於4 °C冷房三天； 使用PBS清洗3次，每次搖晃10分鐘，加入二級抗體(Donkey anti-goat IgG FITC，Jackson公司，美國，分類編號為No. 705-095-003)蓋過支架，抗體與阻斷液(Blocking buffer)的比例為1：200，蓋上鋁箔紙避光，置於室溫三天，再以PBS清洗3次，每次搖晃10分鐘； 細胞核染色DAPI (BioLegend公司，美國，分類編號為No. 422801) 與PBS以1：10000稀釋，蓋過支架並搖晃5分鐘，隨後以PBS清洗3次，每次搖晃5分鐘，完成後將支架移至玻璃底培養皿，最終滴上螢光封片劑即可觀察結果。
請參閱圖5A及圖5B，其係為本實施例之人類臍靜脈內皮細胞在明膠甲基丙烯(GelMa)血管網狀支架表面生長的顯微影像圖，圖中參考比例尺(Bar) = 50 μm，圖5A的藍色部分係為經免疫螢光染色標示之HUVECs，圖5B的藍色部分係為經DAPI核染色之結果，如圖5A及圖5B所示，人類臍靜脈內皮細胞在本實施例所述明膠甲基丙烯(GelMa)血管網狀支架中能良好存活且正常生長。
2.2 人類臍靜脈內皮細胞 (HUVECs) 之存活率
在本實施例之一實驗中，將本實施例所述含血管類骨器官透過本發明所述壓迫灌流式培養系統進行培養2天後，再施加壓迫力刺激進行培養，每天刺激2小時，分別刺激培養2、5及7天，後續使用細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK8，Dojindo公司，日本，分類編號為No. CK04-11) 進行計算，觀察人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)經本發明所述壓迫灌流式培養系統施加壓迫力後的細胞存活率。具體實驗步驟包含： 在本發明所述壓迫灌流式培養系統之該培養液槽加入由ECM和ObM混合的培養基，調整壓迫力參數為形變量10%、電壓10 V (頻率0.2 Hz)，以提供壓迫力的刺激，並將該壓迫灌流式培養系統移至37度、5% CO 2培養箱中進行培養； 在細胞計數前，首先，製作標準濃度曲線，準備六個5 ml離心管，第一管加入4 ml培養基，其餘皆加入2 ml培養基，將2 x 10 6個細胞加入第一管，混合均勻後抽起2 ml的細胞懸浮液至第二管，再次混合均勻並重複動作，依序至第五管，最後一管(第六管)不加入細胞懸浮液，完成連續稀釋即得2 x 10 6個/4 毫升、1 x 10 6個/4 毫升、5 x 10 5個/4 毫升、2.5 x 10 5個/4 毫升、1.25 x 10 5個/4 毫升、0個/4 毫升的細胞數量標準品； 將含有細胞的標準品滴入24孔盤，二重複每孔1 ml，細胞濃度分別為5 x 10 5個/毫升、2.5 x 10 5個/毫升、1.25 x 10 5個/毫升、6.25 x 10 4個/毫升、3.125 x 10 4個/毫升、0個/毫升，放置於37 °C、5% CO 2培養箱中培養一天，待細胞貼附於24孔盤，以作為標準濃度曲線； 在含血管類骨器官培養完成後，將支架的培養基抽起，使用PBS清洗後再將支架移至24孔盤中，取500 μL培養基與50 μL CCK8試劑均勻混合(培養基與CCK8試劑比例為10：1)，將CCK8混合液覆蓋過支架，並置於37 °C、5% CO 2培養箱中三小時； 在96孔盤中每孔滴入100 μL混合均勻且培養三小時的CCK8混合液，每個濃度各3重複，最後以波長450 nm測得吸光值； 將吸光值結果與標準濃度曲線作線性迴歸圖，即可回推支架上或支架中的細胞數量。
請參閱圖6，圖6係為本實施例之含血管類骨器官接受壓力刺激後之人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的存活率統計圖，如圖6所示，人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)經本發明所述壓迫灌流式培養系統施加壓迫力刺激2天後，因外在環境壓力使得細胞個數稍微下降，然而持續進行壓迫力刺激培養5及7天後，細胞存活率並未產生明顯的下降，顯示本發明所述含血管類骨器官接受壓力刺激後，其人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)依然能維持良好的存活率；再者，透過本實驗過程可知，本發明所述壓迫灌流式培養系統確實能成為有效的實驗研究平台。
實施例 3 含血管類骨器官之骨前趨細胞 (OPCs)
在本實施例中，經由如實施例1所述製程，將骨前趨細胞(OPCs)接種於聚己內酯(PCL)成骨網狀支架上，觀察其生長及分化情形。
在本實施例中，骨前趨細胞(OPCs)接種於聚己內酯(PCL)成骨網狀支架上培養21天後，使用免疫螢光染色法(Immunofluorescence，IF)以動蛋白(actin)抗體標示聚己內酯(PCL)成骨網狀支架內之成骨細胞(Osteoblast)之細胞骨架，結合DAPI核染色法，觀察細胞生長情形。具體免疫螢光染色法實驗步驟如實施例2.1所述，其中，使用之一級抗體為抗動蛋白抗體(HRP conjugated beta actin mouse monoclonal antibody)，稀釋比例為1：2500。
請參閱圖7A、圖7B、圖7C及圖7D，其係為本實施例之成骨細胞在聚己內酯(PCL)成骨網狀支架表面生長的顯微影像圖，圖中＊表示網狀支架的孔洞位置，圖中參考比例尺(Bar) = 50 μm，圖7A的紅色部分係為經免疫螢光染色標示之成骨細胞的細胞骨架，圖7B的藍色部分係為經DAPI核染色之結果，圖7C係為在像位差顯微鏡觀察下之PCL成骨網狀支架的孔洞，圖7D係為在光學顯微鏡觀察下之PCL成骨網狀支架的成骨細胞表現鹼性磷酸酶，如圖7A、圖7B、圖7C及圖7D所示，骨前趨細胞(OPCs)在本實施例所述聚己內酯(PCL)成骨網狀支架中能良好存活，且正常分化為具有功能性的成骨細胞(Osteoblast)。
實施例 4 壓迫灌流式培養系統之研究應用
在本實施例中，將本發明所述壓迫灌流式培養系統用於人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中的YAP蛋白(yes-associated protein，YAP)磷酸化機轉研究，以證實本發明所述壓迫灌流式培養系統能成為有效的實驗研究平台。
在本實施例中，經由實施例1.2所述製程，做出含有人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)之血管網狀支架，並將上述含有HUVECs之血管網狀支架培養於本發明所述壓迫灌流式培養系統，再分別施加壓迫力刺激0、30、60及120分鐘後，觀察細胞中YAP蛋白的去磷酸化情形，具體實驗步驟包含： 在本發明所述壓迫灌流式培養系統之該培養液槽加入ECM培養基，調整壓迫力參數為形變量10%、電壓10 V (頻率0.2 Hz)，以提供壓迫力的刺激，並將該壓迫灌流式培養系統移至37 °C、5% CO 2培養箱中進行培養； 壓迫培養完畢後，將培養基抽起，以PBS清洗血管網狀支架2至3次，再將該血管網狀支架剪碎，搭配組織研磨棒磨碎，加入200 μl 2X Ripa緩衝液(Bio Basic公司，加拿大，產品編號：No. RB4475) 以及 2 μl 蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor cocktail，FUTURE公司，台灣，產品編號：F1PICool)，在4 °C冷房旋轉混合30分鐘，再以13200 rpm離心30分鐘，其上清夜即為蛋白質樣本； 將各蛋白質樣本進行西方墨點法(western blot)實驗，並以抗磷酸YAP蛋白(Anti-phospho-YAP (Ser127) antibody，Cell Signaling公司，美國，產品編號：#4911) 為一級抗體，稀釋倍率為1:1000，於4 °C冷房搖晃放置一天後，洗去未接合之抗體，再加入二級抗體 (Goat anti rabbit-HRP，Jackson公司，美國，產品編號：111-005-003)，稀釋比例為1：2500，放置於室溫搖晃90分鐘，倒去二級抗體並清洗後，即可進行訊號偵測； 訊號偵測方式係使用化學呈色法，偵測目標蛋白的條帶訊號，使用電化學(Electrochemiluminescence，ECL)冷光呈色劑均勻覆蓋整張轉漬膜(Transfer Membrane)，將膜放上接觸式化學冷光成像儀，調整曝光時間進行影像分析，並使用軟體定量分析蛋白表現量。
請參閱圖8，圖8係為人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中的YAP蛋白透過本發明所述壓迫灌流式培養系統提供壓力刺激並培養後的磷酸化結果圖，如圖8所示，人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中的YAP蛋白受到壓力刺激後會產生去磷酸化作用(30分鐘)，而隨著時間過去YAP蛋白會漸漸恢復磷酸化狀態(60分鐘及120分鐘)；透過上述實驗設計及方法可知，本發明所述壓迫灌流式培養系統能成為實用且有效的實驗研究平台。
本發明所述含血管類骨器官經培養及實驗後證實，該第一及第二成骨網狀支架上接種的骨前趨細胞(OPCs)或該血管網狀支架上接種的人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，皆能良好的存活，且具有正常的細胞分化及反應外在刺激的細胞功能；另一方面，本發明所述壓迫灌流式培養系統經實驗後證實，其能提供機械力、流體剪力的刺激，以模擬體內真實組織環境，並且經該壓迫灌流式培養系統進行培養後的細胞，依然具有良好的存活率及正常的細胞功能，顯示本發明所述壓迫灌流式培養系統能成為有效的藥物開發及研究平台，在細胞培養領域具有廣泛的應用潛力。
綜上所述，本發明使用3D生物列印技術，在中空立方形網狀聚己內酯(PCL)成骨網狀支架上培養人類骨前驅細胞(OPC)，並將混合人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)之丙烯酸甲酯凝膠(GelMA)血管網狀支架結合上述聚己內酯(PCL)成骨網狀支架，成功製造能正常生長且具功能性的含血管類骨器官；另一方面，本發明提供一種培養系統結合壓迫力學和灌流力學刺激細胞支架，藉由此培養系統能有效模擬真實生理動態環境，增加上述兩種細胞活力、促進血管生成和增強細胞外基質礦化作用，進一步增加人工骨器官的強度和培養成功率，可作為有效的實驗動物替代研究平台或個人化藥物篩選平台，甚至有利於未來個人化自體器官移植的發展。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
1: 壓迫灌流式培養系統 10:壓迫裝置 100:細胞生長區 101:第一電動夾爪 102:第二電動夾爪 103:微型馬達 11:培養液槽 12:灌流裝置 120:培養液瓶 121:培養液回收瓶 122:蠕動幫補 123:第一管線 124:第二管線 125:第三管線 126:第四管線 13:微電腦驅動器 130:控制面板 131:電線 2:支架 3:含血管類骨器官 30:第一成骨網狀支架 31:第二成骨網狀支架 32:血管網狀支架
圖1係為本發明之壓迫灌流式培養系統的示意圖。
圖2A及圖2B分別為本發明之壓迫裝置產生壓迫力前後的前視示意圖。
圖3係為本發明之壓迫裝置結合含血管類骨器官的前視示意圖。
圖4係為本發明之含血管類骨器官的結構示意圖。
圖5A及圖5B係為本發明實施例之人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)在明膠甲基丙烯(GelMa)血管網狀支架表面生長的顯微影像圖。圖5A：藍色部分係為經免疫螢光染色標示之HUVECs；圖5B：藍色部分係為經DAPI核染色之結果。比例尺為50 μm。
圖6係為本發明實施例之含血管類骨器官接受壓力刺激後之人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的存活率統計圖。
圖7A、圖7B、圖7C及圖7D係為本發明實施例之成骨細胞在聚己內酯(PCL)成骨網狀支架表面生長的顯微影像圖。圖7A的紅色部分為經免疫螢光染色標示之成骨細胞的細胞骨架；圖7B的藍色部分為經DAPI核染色之結果；圖7C為在像位差顯微鏡觀察下之PCL成骨網狀支架的孔洞；圖7D係為在光學顯微鏡觀察下之PCL成骨網狀支架的成骨細胞表現鹼性磷酸酶。＊表示網狀支架的孔洞位置。比例尺為50 μm。
圖8係為人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中的YAP蛋白透過本發明所述壓迫灌流式培養系統提供壓力刺激並培養後的磷酸化結果圖。
1: 壓迫灌流式培養系統 10:壓迫裝置 100:細胞生長區 101:第一電動夾爪 102:第二電動夾爪 103:微型馬達 11:培養液槽 12:灌流裝置 120:培養液瓶 121:培養液回收瓶 122:蠕動幫補 123:第一管線 124:第二管線 125:第三管線 126:第四管線 13:微電腦驅動器 130:控制面板 131:電線 2:支架

Claims (9)

  1. 一種壓迫灌流式培養系統，包含：一壓迫裝置，包含一細胞生長區、一第一電動夾爪、一第二電動夾爪以及一微型馬達，該細胞生長區係設置於該第一及第二電動夾爪之間，該微型馬達係與該第一及第二電動夾爪電性連接；一培養液槽，裝載一細胞培養液，該細胞生長區及該第一及第二電動夾爪係設置於該培養液槽之內；一灌流裝置，包含一培養液瓶、一培養液回收瓶以及一蠕動幫浦，該蠕動幫浦係分別以管線與該培養液槽、該培養液瓶及該培養液回收瓶連接；以及一微電腦驅動器，包含一控制面板，該微電腦驅動器係分別與該蠕動幫浦、該微型馬達電性連接；其中，該壓迫裝置及該灌流裝置係透過該微電腦驅動器進行控制及調整各項功能參數，以模擬人體內的動態微環境。
  2. 如請求項1所述之壓迫灌流式培養系統，其中該系統包含至少一支架，其係用於固定該壓迫裝置、該培養液槽及該灌流裝置。
  3. 如請求項1所述之壓迫灌流式培養系統，其中該系統係用於培養並分化至少一種幹細胞，該幹細胞係選自由下列所組成之群組：骨前趨細胞(osteoprogenitor cells，OPCs)、人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)、間質幹細胞(mesenchymal stem cell，MSC)，以及造血幹細胞(hematopoietic stem cells)。
  4. 一種含血管類骨器官，其係透過如請求項1所述之壓迫灌流式培養系統進行培養，其中該含血管類骨器官培養於該細胞生長區，該含血管類骨器官包含： 一第一成骨網狀支架，係以一第一生物相容性材料製成，其上接種骨前趨細胞(OPCs)；一第二成骨網狀支架，係以一第二生物相容性材料製成，其上接種骨前趨細胞(OPCs)；以及一血管網狀支架，係置於該第一及第二成骨網狀支架之間，係以一第三生物相容性材料與人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)製成。
  5. 如請求項4所述之含血管類骨器官，其中該第一成骨網狀支架、該第二成骨網狀支架及該血管網狀支架係以3D列印製成。
  6. 如請求項4所述之含血管類骨器官，其中該第一、第二、第三生物相容性材料係獨立地選自於由：聚己內酯(polycaprolactone)、明膠甲基丙烯(GelMa)、聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(Pluronic F127)、殼聚糖(Chitosan)、膠原蛋白(collagen)、海藻酸鹽(alginate)所組成的群組。
  7. 一種培養類器官之方法，包含：提供一如請求項1所述之壓迫灌流式培養系統；培養至少一種幹細胞於該細胞生長區上；以及利用該蠕動幫浦進行流體灌流並搭配該微型馬達進行機械力刺激，以模擬細胞培養於人體內的動態微環境。
  8. 如請求項7所述之方法，其中該幹細胞係選自由下列所組成之群組：骨前趨細胞(osteoprogenitor cells，OPCs)、人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)、間質幹細胞(mesenchymal stem cell，MSC)，以及造血幹細胞(hematopoietic stem cells)。
  9. 如請求項7所述之方法，其中該方法係用於培養一如請求項4所述之含血管類骨器官，其中該含血管類骨器官培養於該細胞生長區。
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