TWI872667B

TWI872667B - 貝萊斯芽孢桿菌ｍ４０１９、其醱酵萃取液、其製造方法、含其之淋病抑制劑及其用於製備抑制淋病之組成物的用途

Info

Publication number: TWI872667B
Application number: TW112132323A
Authority: TW
Inventors: 王亮鈞; 劉重義; 邱于哲; 李柏森
Original assignee: 國立中山大學
Priority date: 2023-08-28
Filing date: 2023-08-28
Publication date: 2025-02-11
Also published as: TW202509207A

Abstract

本發明是有關於一種貝萊斯芽孢桿菌M4019、其醱酵萃取液、其製造方法、含其之淋病抑制劑及其用於製備抑制淋病之組成物的用途。貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵液及/或醱酵萃取液可專一性抑制淋病雙球菌的生長活性，並維持生殖道微生物叢的平衡，故可作為淋病抑制劑，從而用於製備抑制淋病之組成物的用途。

Description

貝萊斯芽孢桿菌M4019、其醱酵萃取液、其製造方法、含其之淋病抑制劑及其用於製備抑制淋病之組成物的用途

本發明是有關於一種貝萊斯芽孢桿菌，特別是關於一種貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵萃取液、其製造方法、含其之淋病抑制劑及其用於製備抑制淋病之組成物的用途。

淋病是一種由淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)所致的性傳播疾病(sexually transmitted disease，STD)，其病原體是淋病雙球菌，並可藉由帶有病原體的體液(如：精液、陰道分泌物、血液或其他黏膜分泌物)傳播，是全球常見的傳染病之一。

目前治療淋病的方法包含肌肉注射或口服抗生素。然而，抗生素不僅會抑制淋病雙球菌，還可能抑制生殖道其他益生菌之生長活性，導致生殖道的微生物叢失衡，並引發其他有害菌的繁殖。

其次，由於抗生素長期遭濫用及誤用，淋病雙球菌出現了抗藥株，甚至多重抗藥株，使得淋病的治療變得越來越困難，不僅延長更多人感染的時間，還增加具有淋病感染所致的長期併發症的人數，從而帶來醫療負荷。

因此，亟需一種淋病抑制劑，以解決上述問題。

因此，本發明之一態樣是提供一種貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)M4019。

本發明之又一態樣是提供一種淋病抑制劑的活性成分之製造方法，包含對貝萊斯芽孢桿菌M4019進行醱酵步驟及固液分離步驟，以獲得醱酵液。

本發明之另一態樣是提供一種淋病抑制劑，包含由上述製造方法所製得之醱酵液。

本發明之再一態樣是提供一種貝萊斯芽孢桿菌M4019用於製備抑制淋病之組成物的用途，包含以貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵液及/或醱酵萃取液抑制淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)之生長活性。

根據本發明之上述態樣，提出一種貝萊斯芽孢桿菌M4019，其係於2023年6月7日寄存於台灣食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)，且寄存編號是BCRC 911189。

根據本發明之又一態樣，提出一種淋病抑制劑的活性成分之製造方法，包含於35℃至40℃、120rpm至180rpm下，對貝萊斯芽孢桿菌M4019(BCRC 911189)進行醱酵步驟達12小時至30小時，以獲得醱酵物。接著，對醱酵物進行固液分離步驟，以獲得醱酵液作為活性成分。

在本發明之一實施例中，製造方法可選擇性包含以溶劑對醱酵液進行溶劑萃取步驟，以獲得醱酵萃取液作為活性成分。

在本發明之一實施例中，溶劑係選自於由乙酸乙酯、環己酮、3-甲基-2-丁酮、環戊醇、仲丁醇、2-甲基-2-丁醇、異丁醇、丁醛、丁酸及上述任意組合所組成之群組。

在本發明之一實施例中，其中製造方法可選擇性包含對醱酵液進行-20℃至125℃之溫度處理。

根據本發明之另一態樣，提出一種淋病抑制劑，包含貝萊斯芽孢桿菌M4019(BCRC 911189)的醱酵液及/或醱酵萃取液作為活性成分，其中醱酵液及醱酵萃取液係由上述製造方法製得。

在本發明之一實施例中，淋病抑制劑可選擇性包含食品或醫療上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、輔助劑、防腐劑、填充劑及/或添加劑。

根據本發明之再一態樣，提出一種貝萊斯芽孢桿菌M4019用於製備抑制淋病之組成物的用途，包含以安全劑量之貝萊斯芽孢桿菌M4019(BCRC 911189)的醱酵液及/或醱酵萃取液抑制淋病雙球菌之生長活性，其中醱酵液及醱酵萃取液是由上述製造方法製得。

在本發明之一實施例中，淋病雙球菌係多重抗藥株。

在本發明之一實施例中，對於表皮細胞，安全劑量是大於0體積百分率(%(v/v))且小於或等於10%(v/v)。

應用本發明之貝萊斯芽孢桿菌M4019，其醱酵液及/或醱酵萃取液可專一性抑制淋病雙球菌的生長活性，故可作為淋病抑制劑，並維持生殖道微生物叢的平衡，從而用於製備抑制淋病之組成物的用途。

210a,210b,210c,212a,212b,212c,214a,214b,214c,310a,310b,320a,320b,410a,410b,420a,420b,610a,610b,610c,612a,612b,612c,614a,614b,614c:圓圈

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：

[圖1A]及[圖1B]係分別繪示根據本發明之一實施例之菌株M4019的16s rRNA序列及RpoB基因序列的系統發生樹。

[圖2A]、[圖2B]及[圖2C]係分別顯示菌株M4019的醱酵液、頭孢曲松及阿奇黴素分別對淋病雙球菌的野生株、WHO Y株及WHO Z株的紙錠擴散法之評估結果。

[圖3A]及[圖3B]係分別顯示經不同溫度處理之菌株M4019的醱酵液對淋病雙球菌的紙錠擴散法之評估結果。

[圖4A]及[圖4B]係分別顯示菌株M4019的醱酵液之乙酸乙酯萃取物及水萃取物對淋病雙球菌WHO Y株及WHO Z株之紙錠擴散法之評估結果。

[圖5]係根據本發明之一實施例之不同濃度之菌株M4019的醱酵液施予ME-180細胞後之細胞存活率的直條圖。

[圖6A]至[圖6C]係分別顯示菌株M4019的醱酵液、頭孢曲松及阿奇黴素對捲曲乳桿菌(圖6A)、加氏乳桿菌(圖6B)及詹氏乳酸菌(圖6C)之紙錠擴散法之評估結果。

如前所述，本發明提供一種貝萊斯芽孢桿菌M4019、其醱酵萃取液、其製造方法、含其之淋病抑制劑及其用於製備抑制淋病之組成物的用途，其中利用貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵液及/或醱酵萃取液作為淋病抑制劑的活性成分，可於體外抑制淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)之生長活性，但維持生殖道微生物叢的平衡。

本發明所述之「淋病」是由淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)所致的疾病。在一些實施例中，淋病雙球菌是野生株，其不具抗藥性。在一些實施例中，淋病雙球菌是抗藥株，其對特定抗生素具抗藥性，其中此些抗生素可包含但不限於盤尼西林G(Penicillin G)、氨苄青黴素(ampicillin)、頭孢克肟(cefixime)、頭孢曲松(ceftriaxone)、阿奇黴素(azithromycin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、四環黴素(tetracycline)及/或其他臨床使用的抗生素。在一些實施例中，淋病雙球菌是多重抗藥株，其對多種特定抗生素具抗藥性。在一些具體例中，抗藥株可為WHO Y株、WHO Z及/或其他淋病雙球菌的抗藥株。

本發明所述之「淋病抑制劑」是指對淋病雙球菌具有抑菌活性之物質。換言之，淋病抑制劑可抑制淋病雙球菌之生長活性。抑菌活性的評估方式可以習知方法進行。在一些具體例中，抑菌活性係將淋病抑制劑對淋病雙球菌進行紙錠擴散法，藉由抑菌圈的存在評估。

本發明所述之「專一性」係指淋病抑制劑的抑菌頻譜窄，對淋病雙球菌具有抑菌活性，但對其他益生菌及/或致病菌不具抑菌活性。經實驗證實，貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵液及/或醱酵萃取液對生殖道的益生菌，如：陰道之乳桿菌，不具抑菌活性。在一些具體例中，益生菌可包含但不限於捲曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳桿菌(L.gasseri)及/或詹氏乳酸菌(L.jensenii)。

其次，經實驗證實，貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵液及/或醱酵萃取液對其他致病菌不具抑菌活性。上述致病菌可包含但不限於無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)及乳酸鏈球菌(Lactococcus garvieae)等格蘭氏陽性菌，及/或創傷性弧菌(Vibrio vulnificus)、親水性產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)等格蘭氏陰性菌。

補充說明的是，無乳鏈球菌又稱為B型鏈球菌，可感染人類皮膚、軟組織、呼吸道、口咽部、消化道、泌尿道及/或生殖道，嚴重者甚至可引發敗血症。乳酸鏈球菌是水產動物常見的致病菌，但也可感染人類。創傷性弧菌及親水性產氣單胞菌可藉由攝食及/或接觸傷口進入人體，從而引發腸胃炎、壞死性筋膜炎、蜂窩性組織炎及/或敗血症。綠膿桿菌是常見的伺機性致病菌，可造成泌尿生殖道、呼吸道、關節、眼睛、皮膚傷口、中耳的感染，甚至可引起敗血症，是院內感染常見的菌種。

經實驗證實，貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵液及/或醱酵萃取液對淋病雙球菌具有抑菌活性。此貝萊斯芽孢桿菌M4019是於2023年6月7日寄存於台灣食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)，且寄存編號是BCRC 911189。

上述貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵液是貝萊斯芽孢桿菌M4019經醱酵步驟及固液分離步驟後製得。申言之，醱酵步驟係利用培養液對貝萊斯芽孢桿菌M4019進行，藉以獲得醱酵物。其中，醱酵步驟可利用習知培養液進行。在一些實施例中，培養液可包含但不限於腦心浸出(brain heart infusion，BHI)培養液、Luria Bertani(LB)培養液及/或其他任何適用的培養液。在一些實施例中，貝萊斯芽孢桿菌M4019接種於培養液可例如為10⁶CFU/mL至10⁸CFU/mL，以確使所製得之醱酵液具有足量的活性物質。

醱酵步驟可在35℃至40℃、180rpm至220rpm下進行12小時至30小時，如在36℃至38℃、190rpm至210rpm下進行20小時至25小時。如果醱酵步驟的溫度過低，貝萊斯芽孢桿菌M4019的生長活性不佳。如果醱酵步驟的溫度過高，貝萊斯芽孢桿菌M4019會失去生長活性。如果震盪速率過低，貝萊斯芽孢桿菌M4019醱酵物中的菌體容易聚集，從而影響其生長活性。如果震盪速率過高，貝萊斯芽孢桿菌M4019醱酵物可能濺出容器中。如果醱酵步驟的時間過短或過長，所獲得之醱酵物之生長活性不佳。

醱酵物經固液分離步驟後，可獲得醱酵液。固液分離步驟的方法沒有特別限制，可例如為離心處理或過濾處理。在一些實施例中，離心處理可例如為以11000×g至13000×g之轉速進行20分鐘，所獲得之上清液即醱酵液。在一些實施例中，過濾處理可利用孔徑為0.22μm之濾紙進行，以過濾醱酵物中的菌體，從而獲得醱酵液。在一些實施例中，對醱酵物進行離心處理後，可再進行過濾處理，以進一步移除醱酵液中的菌體。

如上所述，貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵萃取液對淋病雙球菌亦具有抑菌活性。在一些實施例中，醱酵萃取液可例如為利用溶劑對醱酵液進行溶劑萃取步驟後製得。在一些實施例中，溶劑的辛醇/水分配係數(Octanol-water partition coefficient，Kow)對數值可例如0.1至1，較佳為0.6至0.9。在一些具體例中，溶劑可例如為選自於由乙酸乙酯(ethyl acetate)、環己酮(cyclohexanone)、3-甲基-2-丁酮(3-methyl-2-butone)、環戊醇(cyclopentanol)、仲丁醇(2-butanol)、2-甲基-2-丁醇(2-methyl-2-butanol)、異丁醇(2-methyl-1-propanol)、丁醛(butyraldehyde)、丁酸(butyric acid)及上述任意組合所組成之群組。在一些具體例中，溶劑萃取步驟可例如為利用上述溶劑及水進行液液萃取步驟，以由溶劑層獲得醱酵萃取液，其中溶劑與水的比例沒有特別限制。

經實驗證實，醱酵液及醱酵萃取液經溫度處理後，對淋病雙球菌仍具有抑菌活性。在一些實施例中，溫度處理可包含進行低溫處理、室溫處理或高溫處理。在一些具體例中，低溫處理是在-20℃至10℃之溫度下進行。在上述具體中，低溫處理可在冷凍櫃、冰箱或水浴中進行。在一些具體例中，室溫處理係在大於10℃且小於或等於50℃之溫度下進行。在上述具體例中，室溫處理可例如為靜置在室內、水浴或細胞培養箱中。在一些具體例中，高溫處理是在大於50℃至125℃之溫度下進行。在上述具體例中，高溫處理可例如為在水浴或滅菌釜中進行。經-20 ℃至125℃進行溫度處理後，醱酵液及醱酵萃取液對淋病雙球菌仍具有抑菌活性，表示醱酵液及醱酵萃取液之抑菌活性不受溫度影響，故後續製程較不受溫度限制。

補充說明的是，一般而言，蛋白質、胜肽等生物分子之生物活性容易受到高溫(如：65℃、121℃)的影響。因此，醱酵液及醱酵萃取液中具有抑菌活性的活性物質可排除以蛋白質及胜肽等容易因溫度而變性的物質之可能性。

值得注意的是，貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵液及/或醱酵萃取液對生殖道的表皮細胞及益生菌具安全性。換言之，貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵液及/或醱酵萃取液不影響生殖道的表皮細胞及益生菌之生長活性，且可維持生殖道微生物叢的平衡。在一些實施例中，貝萊斯芽孢桿菌M4019對生殖道的表皮細胞之安全劑量是大於0體積百分率(%(v/v))且小於或等於10%(v/v)。

由於貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵液及/或醱酵萃取液對淋病雙球菌具有抑菌活性，且可維持生殖道微生物叢的平衡，貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵液及/或醱酵萃取液可用於製備抑制淋病之組成物的用途。在一些實施例中，此些組成物可為醫藥組成物或食品組成物，如：淋病抑制劑。在一些實施例中，組成物可選擇性包含食品或醫療上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、輔助劑、防腐劑、填充劑及/或添加劑。

以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。

實施例一、製備菌株M4019

自海水養殖室的海水中分離出菌株M4019。菌株M4019可在37℃、220rpm、兼性厭氧環境的下，利用腦心浸出(BHI)瓊脂培養基或Luria Bertani(LB)瓊脂培養基培養24小時。BHI瓊脂培養基包含17.5g/L的心腦浸出混合液、10.0g/L的胰蛋白酶、2.0g/L的葡萄糖、5.0g/L的氯化鈉、2.5g/L的磷酸氫二鈉(disodium phosphate)、12.0g/L之瓊脂及二次水(ddH₂O)。LB瓊脂培養基包含10.0g/L的氯化鈉、10.0g/L的蛋白腖、5.0g/L的酵母萃取物、20.0g/L之瓊脂及二次水。

菌株M4019為兼性厭氧菌、格蘭氏陽性菌、且可形成內孢子。菌株M4019的菌落成乳白色、卵圓形、平坦、不透明、表面粗糙有皺紋，且邊緣不規則。在光學顯微鏡下觀察，菌株M4019成短桿狀。

利用分子生物技術獲得菌株M4019的16s rRNA序列及RpoB基因序列，其中16s rRNA序列是如序列識別號(SEQ ID NO.)：1所示，且RpoB基因序列是如SEQ ID NO.：2所示。利用分子生物技術獲得16s rRNA序列及RpoB基因序列為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知，且不影響後續評估，於此不再贅述。

接著，將SEQ ID NOs：1至2所示的序列分別比對與NCBI(National Center for Biotechnology Information)資料庫中的已知序列進行比對，並利用MEGA 11軟體繪製系統發生樹。

請參閱圖1A及圖1B，其是分別繪示根據本發明之一實施例之菌株M4019的16s rRNA序列(圖1A)及RpoB基因序列(圖1B)的系統發生樹。如圖1A及圖1B所示，菌株M4019為貝萊斯芽孢桿菌。

於2023年6月7日將菌株M4019寄存在財團法人食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC，地址：新竹市食品路331號)，寄存編號為BCRC 911189，並於2023年6月21日測試並確認當時存活。

實施例二、製備菌株M4019的醱酵液及醱酵萃取液

將10⁷CFU/mL的菌株M4019接種於LB培養液中，並於37℃、150rpm之震盪速率下，對菌株M4019進行醱酵步驟達24小時，以獲得菌株M4019的醱酵物。LB培養液的配方與LB瓊脂培養基的配方相同，差異在於LB培養液未添加瓊脂。接著，將菌株M4019的醱酵物以12000×g之轉速離心20分鐘，從而獲得醱酵液。進一步以孔徑為0.22μm的濾紙過濾醱酵液，以確保醱酵液中無菌體。

利用乙酸乙酯及水對菌株M4019的醱酵液進行液液萃取處理，以在乙酸乙酯層獲得菌株M4019的醱酵液之乙酸乙酯萃取物，並在水層獲得菌株M4019的醱酵液之水萃取物，其中乙酸乙酯及水的體積比例為1：1，並使用層析方法及生物活性導向分離法(bioactivity-guided principle)進行分離，再依分子量及極性交互分離。

實施例三、評估菌株M4019的醱酵液之抑菌活性

利用紙錠擴散法(disk diffusion method)評估菌株M4019的醱酵液對不同致病菌的抑菌活性。此些致病菌包含淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)的野生株及多重抗藥株(WHO Y株及WHO Z株)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、乳酸鏈球菌(Lactococcus garvieae)、創傷性弧菌(Vibrio vulnificus)、親水性產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)，其中無乳鏈球菌及乳酸鏈球菌是格蘭氏陽性菌，且創傷性弧菌、親水性產氣單胞菌及綠膿桿菌格蘭氏陰性菌。

在每個塗佈不同致病菌的培養皿上，放置三個紙錠，並利用微量吸管，將50μL的菌株M4019的醱酵液、頭孢曲松(ceftriaxone，CFX，30μg)及阿奇黴素(azithromycin，AZI，15μg)分別轉移至不同紙錠上，再將培養皿移置細胞培養箱(37℃)中進行培養達20±4小時。如果紙錠所含之物質對某一致病菌具有抑菌活性，在此致病菌的培養皿上此紙錠的周圍會出現抑菌圈(inhibition zone)。抑菌圈的直徑越大，表示此物質對此致病菌之抑菌活性越佳。

請參閱圖2A、圖2B及圖2C，其係分別顯示菌株M4019的醱酵液、頭孢曲松及阿奇黴素分別對淋病雙球菌的野生株(圖2A)、WHO Y株(圖2B)及WHO Z株(圖2C)的紙錠擴散法之評估結果，其中圓圈210a、圓圈210b及圓圈210c分別表示在菌株M4019的醱酵液之紙錠周圍的抑菌圈，圓圈212a、圓圈212b及圓圈212c表示在頭孢曲松(CFX)之紙錠周圍的抑菌圈，且圓圈214a、圓圈214b及圓圈214c表示在阿奇黴素(AZI)之紙錠周圍的抑菌圈。

如圖2A、圖2B及圖2C所示，淋病雙球菌的菌株M4019的醱酵液、頭孢曲松及阿奇黴素之紙錠周圍皆會出現抑菌圈，表示的野生株、WHO Y株及WHO Z株皆具有抑菌活性。

將菌株M4019的醱酵液在不同致病菌是否形成抑菌圈及所形成之抑菌圈直徑記錄於表1中。

「-」表示沒有形成抑菌圈

如表1所示，菌株M4019的醱酵液可分別在淋病雙球菌野生株、WHO Y株及WHO Z株的培養皿上，分別形成直徑為20mm、20mm及15mm的抑菌圈，但菌株M4019的醱酵液無法在其他格蘭氏陽性菌(無乳鏈球菌及乳酸鏈球菌)及格蘭氏陰性菌(創傷性弧菌、親水性產氣單胞菌及綠膿桿菌)的培養皿上形成抑菌圈，表示菌株M4019的醱酵液之抑菌活性對淋病雙球菌具有專一性。

實施例四、評估菌株M4019的醱酵液經不同溫度處理後之抑菌效果

對菌株M4019的醱酵液分別進行-20℃、4℃、37℃、65℃及121℃的溫度處理15分鐘，以獲得實驗組1至實驗組5之菌株M4019的醱酵液。其中，-20℃、4℃、37℃及65℃之溫度處理是在水浴中進行，且121℃之溫度處理是在高壓高溫的滅菌釜進行。

接著，利用上述紙錠擴散法分別評估實驗組1至實驗組5之菌株M4019的醱酵液對淋病雙球菌的抑菌活性。上述以未經溫度處理的菌株M4019的醱酵液作為紙錠擴散法的對照組。

圖3A及圖3B係分別顯示經不同溫度處理之菌株M4019的醱酵液對淋病雙球菌之紙錠擴散法之評估結果，其中圓圈310a及圓圈310b表示在對照組的菌株M4019之醱酵液紙錠周圍的抑菌圈，圓圈320a表示在實驗組4(溫度處理是在65℃下進行)的菌株M4019之醱酵液紙錠周圍的抑菌圈，且圓圈320b表示實驗組5(溫度處理是在121℃下進行)的菌株M4019之醱酵液紙錠周圍的抑菌圈。

如圖3A及圖3B所示，在淋病雙球菌的培養皿上，實驗組4、實驗組5及對照組之菌株M4019的醱酵液之周圍皆具有抑菌圈，表示菌株M4019的醱酵液經65℃及121℃的溫度處理後，對淋病雙球菌仍具有抑菌活性。由此結果可推測，菌株M4019的醱酵液之具抑菌活性的活性成分，其抑菌活性不受溫度影響。

將實驗組1至實驗組5菌株M4019的醱酵液是否對淋病雙球菌具有抑菌活性之結果記錄於表2，其中「+」表示在菌株M4019的醱酵液之周圍具有抑菌圈。如表2所示，菌株M4019的醱酵液經-20℃及121℃的溫度處理後，對淋病雙球菌仍具有抑菌活性。補充說明的是，此實施例所使用之淋病雙球菌的菌株是野生株，但經不同溫度處理之菌株M4019的醱酵液對淋病雙球菌的野生株、WHO Y株及WHO Z株之抑菌功效應一致。

實施例五、評估菌株M4019之醱酵萃取液的抑菌活性

分別利用紙錠擴散法評估菌株M4019的醱酵液之乙酸乙酯萃取物及水萃取物對不同淋病雙球菌的多重抗藥株(WHO Y株及WHO Z株)是否具有抑菌活性。

請參閱圖4A及圖4B，其係分別顯示菌株M4019的醱酵液之乙酸乙酯萃取物及水萃取物對淋病雙球菌WHO Y株(圖4A)及WHO Z株(圖4B)之紙錠擴散法的評估結果，其中圓圈410a及圓圈410b表示在乙酸乙酯萃取物紙錠周圍的抑菌圈，且圓圈420a及圓圈420b表示在水萃取物紙錠周圍的區域。

如圖4A及圖4B所示，在淋病雙球菌WHO Y株及WHO Z株的培養皿上，在乙酸乙酯萃取物紙錠周圍具抑菌圈，但水萃取物則否，表示菌株M4019的醱酵液之活性物質係存在於乙酸乙酯萃取物中，但無法以水萃取後獲得。

實施例六、評估菌株M4019的醱酵液之安全性

1.菌株M4019的醱酵液對生殖道上皮細胞具有安全性

分別將0.1體積百分率(%(v/v))、1.0%(v/v)、5.0%(v/v)及10%(v/v)的菌株M4019的醱酵液施予子宮上皮癌細胞ME-180(以下簡稱為ME-180細胞)，並於37℃培養24小時後，獲得細胞培養物。利用TOOLS Cell Counting(CCK-8)套組對ME-180細胞進行細胞存活率分析，以評估菌株M4019的醱酵液對ME-180細胞之安全性，其方法簡述如下：將CCK-8溶液加入細胞培養物中，於37℃培養細胞培養物1小時至4小時後，可獲得測試液。上述CCK-8溶液含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽(WST-8)，如果細胞培養物存在具有活性的細胞，此些細胞可藉由脫氫酶將WST-8還原成甲瓚染劑(Formazan dye)。甲瓚染劑的水溶性高且呈黃色，因此如果測試液在450nm波長下的吸光值越高，表示細胞培養物中所含之具有活性的細胞越多。以未施予菌株M4019的醱酵液的ME-180細胞的細胞存活率為100%，並以施予200μM過氧化氫之ME-180細胞作為正對照組。

請參閱圖5，其係根據本發明之一實施例之不同濃度之菌株M4019的醱酵液施予ME-180細胞後之細胞存活率的直條圖，其中橫軸表示菌株M4019的醱酵液濃度(單位：0%(w/w))，0%(w/w)表示未施予菌株M4019的醱酵液，且氫氧化鈉表示正對照組；縱軸表示ME-180細胞之細胞存活率(單位%)；圖號「***」表示與菌株 M4019的醱酵液未施予之ME-180細胞之細胞存活率有統計上的顯著差異。

如圖5所示，施予0.7%(w/w)至10.0%(w/w)之菌株M4019的醱酵液之ME-180細胞與未施予菌株M4019的醱酵液之ME-180細胞的細胞存活率沒有統計上的顯著差異，然而施予過氧化氫之正對照組的ME-180細胞之細胞存活率與未施予菌株M4019的醱酵液之ME-180細胞的細胞存活率有統計上的顯著差異，表示菌株M4019的醱酵液對ME-180細胞確實具安全性。

2.菌株M4019的醱酵液對陰道益生菌具有安全性

分別利用紙錠擴散法評估菌株M4019的醱酵液對陰道益生菌的抑菌活性，其中陰道益生菌包含捲曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳桿菌(L.gasseri)及詹氏乳酸菌(L.jensenii)。

圖6A至圖6C係分別顯示菌株M4019的醱酵液、頭孢曲松及阿奇黴素對捲曲乳桿菌(圖6A)、加氏乳桿菌(圖6B)及詹氏乳酸菌(圖6C)之紙錠擴散法的評估結果，其中圓圈610a、圓圈610b及圓圈610c表示菌株M4019的醱酵液之紙錠的周圍區域，圓圈612a、圓圈612b及圓圈612c表示在頭孢曲松紙錠周圍的抑菌圈，且圓圈614a、圓圈614b及圓圈614c表示在阿奇黴素紙錠周圍的抑菌圈。

如圖6A至圖6C所示，頭孢曲松及阿奇黴素可在捲曲乳桿菌、加氏乳桿菌及詹氏乳酸菌的培養皿上形成抑菌圈，但菌株M4019的醱酵液則否，表示菌株M4019的醱酵液不破壞生殖道益生菌的生長，可維持生殖道微生物叢的平衡。

綜言之，上述特定的培養液、特定的培養條件、特定的致病菌、特定的淋病雙球菌菌株或特定的評估方法僅用於例示說明本發明的貝萊斯芽孢桿菌M4019、其醱酵萃取液、其製造方法、含其之淋病抑制劑及其用於製備抑制淋病之組成物的用途。然而，本發明所屬技術領域中具有通常知識者應可理解，在不脫離本發明的精神及範圍內，其他的培養液、其他的培養條件、其他的致病菌、其他的淋病雙球菌菌株以及其他的評估方法亦可用於本發明，並不限於上述。舉例而言，在不影響抑菌活性的前提下，可使用其他的培養基進行醱酵步驟。

由上述實施例可知，本發明之貝萊斯芽孢桿菌M4019、其醱酵萃取液、其製造方法、含其之淋病抑制劑及其用於製備抑制淋病之組成物的用途，其優點在使用貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵液及/或醱酵萃取液，不僅可專一性抑制淋病雙球菌，而可避免抗生素的濫用，還維持生殖道微生物叢的平衡，故可應用於淋病抑制劑，並應用於製備抑制淋病之組成物的用途。

雖然本發明已以數個特定實施例揭露如上，但可對前述揭露內容進行各種潤飾、各種更動及替換，而且應可理解的是，在不脫離本發明之精神和範圍內，某些情況將採用本發明實施例之某些特徵但不對應使用其他特徵。因此，本發明的精神和權利要求範圍不應限於以上例示實施例所述。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)M4019於2023年6月7日寄存於台灣食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 911189。

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Claims

一種貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)M4019，其係於2023年6月7日寄存於台灣食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)，且寄存編號是BCRC 911189。
一種貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵萃取液之製造方法，包含：於35℃至40℃、120rpm至180rpm下，對貝萊斯芽孢桿菌M4019(BCRC 911189)進行一醱酵步驟達12小時至30小時，以獲得一醱酵物；對該醱酵物進行一固液分離步驟，以獲得一醱酵液；以及以一溶劑對該醱酵液進行一溶劑萃取步驟，其中該溶劑係選自於由乙酸乙酯、環己酮、3-甲基-2-丁酮、環戊醇、仲丁醇、2-甲基-2-丁醇、異丁醇、丁醛、丁酸及上述任意組合所組成之群組，以獲得一醱酵萃取液。
如請求項2所述之貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵萃取液之製造方法，更包含對該醱酵液進行-20℃至125℃之一溫度處理。
如請求項2所述之貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵萃取液之製造方法，其中該固液分離步驟包含一離心處理及/或一過濾處理，該離心處理係以11000×g至13000×g之轉速進行20分鐘，且該過濾處理係利用孔徑為0.22μm之濾紙進行。
一種貝萊斯芽孢桿菌M4019的醱酵萃取液，其係由請求項2至請求項4任一項所述之製造方法獲得。
一種淋病抑制劑，包含如請求項5所述之貝萊斯芽孢桿菌M4019的一醱酵萃取液作為一活性成分。
如請求項6所述之淋病抑制劑，更包含食品或醫療上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、輔助劑、防腐劑、填充劑及/或添加劑。
一種貝萊斯芽孢桿菌M4019用於製備抑制淋病之組成物的用途，其中該組成物包含以一安全劑量之如請求項5所述之貝萊斯芽孢桿菌M4019(BCRC 911189)的一醱酵萃取液作為一活性成分，藉以抑制淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)之生長活性。
如請求項8所述之貝萊斯芽孢桿菌M4019用於製備抑制淋病之組成物的用途，其中該淋病雙球菌係多重抗藥株。
如請求項8所述之貝萊斯芽孢桿菌M4019用於製備抑制淋病之組成物的用途，其中對於一表皮細胞，該安全劑量是大於0體積百分率(%(v/v))且小於或等於10%(v/v)。