TWI869334B - 一種ｌａｇ-３抗體醫藥組成物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種LAG-3抗體醫藥組成物及其用途，該LAG-3抗體醫藥組成物包含在醋酸鹽緩衝劑或組胺酸鹽緩衝劑中的LAG-3抗體或其抗原結合片段。進一步地，該醫藥組成物還可含有糖、非離子型表面活性劑和其他輔料。本發明醫藥組成物在儲存數月之後展現了良好的抗體穩定性。

Description

一種LAG-3抗體醫藥組成物及其用途

本發明屬於藥物製劑領域，具體地本發明涉及一種包含LAG-3抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為藥物的用途。

淋巴細胞活化基因3(lymphocyteactivationgene-3，也稱LAG-3，CD215)是免疫球蛋白超家族的一員，可負性調節免疫細胞的各項功能和生存週期。已有研究表明，LAG-3在病毒感染、自身免疫疾病以及腫瘤所致的免疫系統功能紊亂中發揮著重要作用，藉由影響LAG-3的功能可以改善這些疾病演進過程中免疫功能失常狀態，從而改善疾病的預後。

LAG-3作為免疫球蛋白超家族的一員，由胞外區、跨膜區和胞質區3個部分組成。成熟的LAG-3分子包括470個胺基酸，相對分子量為70kDa，1990年由Triebel等首次發現(J Exp Med,1990,171(5)：1393-405)。研究發現，LAG-3與CTLA-4、PD-1一樣，是一個負性共刺激分子，其激活可負向調控淋巴細胞功能。LAG-3在結構 上與CD4密切相關，但卻有著與CD4截然相反的功能，表現在LAG-3與CD4分子具有較高的相似性，可與MHC-II(主要組織相容性複合體)類分子結合。但是，LAG-3與MHC-II類分子的結合更為緊密，從而干預CD4⁺T淋巴細胞TCR激活，抑制T淋巴細胞激活(Curr Opin Immunol,2009,21(2)：179-86；Eur J Immunol,2003,33(4)：970-9)。體外研究顯示，LAG-3可抑制抗原誘導的T淋巴細胞增殖反應，而阻斷了LAG-3之後，T淋巴細胞的活化和增殖、1型輔助性T細胞(type1 T helper cells,Th1)分泌細胞因子的情況均有所改善；Huang等研究表明，活化的CD4⁺Treg細胞表面LAG-3水平顯著升高，且LAG-3是CD4⁺Tregs發揮最大免疫抑制作用的必需條件(Immunity,2004,21(4)：503-13)。此外，抗LAG-3抗體還可維持CD4⁺和CD8⁺T淋巴細胞穩態，阻斷LAG-3後CD8⁺T淋巴細胞殺傷腫瘤細胞的能力顯著增強(J Clin Invest,2007,117(11)：3383-92)。一些疾病相關研究也發現，LAG-3在調控疾病發生發展中具有重要作用。Gandhi等證實人類淋巴瘤組織中T淋巴細胞LAG-3的表達水平與T淋巴細胞功能障礙相關，清除LAG-3⁺T淋巴細胞可顯著增強淋巴細胞的腫瘤清除能力(Blood,2006,108(7)：2280-9)。研究結果顯示LAG-3是免疫細胞表面重要的抑制性分子，並且對T淋巴細胞可產生顯著的負向調控作用。

LAG-3主要表達在T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細 胞、Treg細胞以及DC等細胞上(Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(11)：5744-9.Eur J Immunol,2005,35(7)：2081-8；J Immunol,2009,182(4)：1885-91)。LAG-3是一類免疫抑制性分子，是TCR的共受體組成部分之一，它干預T淋巴細胞TCR激活，在T淋巴細胞激活中發揮負性調控功能。在一些疾病中，LAG-3表達均會升高，並且會出現相應的免疫抑制。Gandhi等發現霍奇金淋巴瘤患者血液和腫瘤組織中，淋巴細胞高表達LAG-3；腫瘤組織中特異性CD8⁺T細胞的功能明顯受損，如果去除LAG-3陽性的T細胞，其抗腫瘤功能可以恢復，細胞因子分泌增加。據此推測，LAG-3的表達與特異性T細胞的免疫負調節功能相關，抑制LAG-3分子功能可以增強T細胞的抗腫瘤作用，該分子有可能是一個潛在的腫瘤免疫治療靶點(Blood,2006,108(7)：2280-9)。

目前有多家跨國製藥公司如BMS公司和Novartis公司在研發針對LAG-3的單株抗體，它藉由刺激抗原特異性T細胞應答，增強T細胞的抗腫瘤作用，從而最大限度的提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應，達到對腫瘤細胞進行殺傷的目的。

但是，抗體藥物由於分子量大、結構複雜，容易降解、聚合或發生不希望發生的化學修飾等而變得不穩定。為了使抗體適合於給藥，並且在儲存及隨後使用過程中能保持穩定性，發揮更好的效果，抗體藥物的穩定製劑研究顯得尤為重要。

儘管，目前有多家公司在研發包含LAG3抗體及其製劑，如：WO2018204374、WO2010019570、WO2014008218、WO9530750、WO2004078928、WO2008132601、WO2014140180、WO2015138920等，但對於新的LAG3抗體製劑的研究並不多，因此仍需要研製更適於給藥的包含LAG3的醫藥組成物(製劑)。

本發明提供一種醫藥組成物，其包含LAG3抗體或其抗原結合片段，以及緩衝劑，該緩衝劑選自醋酸鹽緩衝劑、組胺酸緩衝劑、檸檬酸鹽緩衝劑、琥珀酸鹽緩衝劑或Tris緩衝劑。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中該醋酸鹽緩衝劑選自醋酸-醋酸鈉緩衝劑、醋酸-醋酸鉀緩衝劑，醋酸-組胺酸鹽緩衝劑、醋酸-醋酸鈣緩衝劑、醋酸-醋酸鎂緩衝劑，較佳醋酸-醋酸鈉緩衝劑。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中該組胺酸緩衝劑選自組胺酸-鹽酸緩衝劑、組胺酸-醋酸緩衝劑、組胺酸-磷酸緩衝劑、組胺酸-硫酸緩衝劑，較佳組胺酸-鹽酸緩衝劑。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中該檸檬酸鹽緩衝劑選自檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝劑；該琥珀酸鹽緩衝劑選自琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝劑。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中該LAG-3抗體或其抗原結合片段濃度為約1mg/ml至90mg/ml，較佳約10mg/ml至90mg/ml，較佳約20mg/ml至90mg/ml，較佳 約30mg/ml至90mg/ml，較佳約40mg/ml至90mg/ml，較佳約50mg/ml至90mg/ml，較佳約60mg/ml至90mg/ml，較佳約70mg/ml至90mg/ml，較佳約80mg/ml至90mg/ml，較佳約10mg/ml至80mg/ml，較佳約20mg/ml至80mg/ml，較佳約30mg/ml至80mg/ml，較佳約40mg/ml至80mg/ml，較佳約50mg/ml至80mg/ml，較佳約60mg/ml至80mg/ml，較佳約70mg/ml至80mg/ml，較佳約10mg/ml至70mg/ml，較佳約20mg/ml至70mg/ml，較佳約30mg/ml至70mg/ml，較佳約40mg/ml至70mg/ml，較佳約50mg/ml至70mg/ml，較佳約60mg/ml至70mg/ml，較佳約10mg/ml至60mg/ml，較佳約20mg/ml至60mg/ml，較佳約30mg/ml至60mg/ml，較佳約40mg/ml至60mg/ml，較佳約50mg/ml至60mg/ml，較佳約10mg/ml至50mg/ml，較佳約20mg/ml至50mg/ml，較佳約30mg/ml至50mg/ml，較佳約40mg/ml至50mg/ml，較佳約10mg/ml至40mg/ml，較佳約20mg/ml至40mg/ml，較佳約30mg/ml至40mg/ml，較佳約10mg/ml至30mg/ml，較佳約20mg/ml至30mg/ml。作為非限制性實施例，該LAG-3抗體或其抗原結合片段濃度為約40mg/ml、4lmg/ml、42mg/ml、43mg/ml、44mg/ml、45mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml、50mg/ml、51mg/ml、52mg/ml、53mg/ml、54mg/ml、55mg/ml、56mg/ml、57mg/ml、58mg/ml、59mg/ml或60mg/ml，最佳為50mg/ml。

在可選的實施方案中，緩衝劑的濃度約為5mM至30mM，較佳約為10mM至30mM，較佳約為15mM至30mM， 較佳約為20mM至30mM，較佳約為25mM至30mM，較佳約為5mM至25mM，較佳約為10mM至25mM，較佳約為15mM至25mM，較佳約為20mM至25mM，較佳約為5mM至20mM，較佳約為10mM至15mM；該緩衝劑濃度的非限制性實施例為約10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM、22mM、24mM、26mM、28mM或30mM，最佳為10mM。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中該緩衝劑的pH值約為5.0到7.5，較佳約為5.5到7.5，較佳約為6.0到7.5，較佳約為6.5到7.5，較佳約為7.0到7.5，較佳約5.0至7.0，較佳約為5.5到7.0，較佳約為6.0到7.0，較佳約為6.5到7.0，較佳約5.0至6.5，較佳約為5.5到6.5，較佳約為6.0到6.5，較佳約5.0至6.0，較佳約為5.5到6.0，較佳約5.0至5.5，該緩衝劑pH值的非限制性實施例還可選約為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5，更佳為約5.5-6.0，更佳為5.5或6.0。

進一步地，在可選的實施方案中，醫藥組成物還包括輔料，該輔料選自糖和表面活性劑中的一種或多種。

在可選實施方案中，其中該的糖為二糖，較佳為海藻糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇，更較佳為蔗糖。在可選的實施方案中，醫藥組成物中糖的濃度約為30mg/ml至90mg/ml，較佳約為60mg/ml至90mg/ml，35mg/ml至90mg/ml，較佳約為40mg/ml至90mg/ml，較佳約為45mg/ml 至90mg/ml，較佳約為50mg/ml至90mg/ml，較佳約為55mg/ml至90mg/ml，較佳約為60mg/ml至90mg/ml，較佳約為65mg/ml至90mg/ml，較佳約為70mg/ml至90mg/ml，較佳約為75mg/ml至90mg/ml，較佳約為80mg/ml至90mg/ml，較佳約為85mg/ml至90mg/ml，較佳約為30mg/ml至85mg/ml，較佳約為35mg/ml至85mg/ml，較佳約為40mg/ml至85mg/ml，較佳約為45mg/ml至85mg/ml，較佳約為50mg/ml至85mg/ml，較佳約為55mg/ml至85mg/ml，較佳約為60mg/ml至85mg/ml，較佳約為65mg/ml至85mg/ml，較佳約為70mg/ml至85mg/ml，較佳約為75mg/ml至85mg/ml，較佳約為80mg/ml至85mg/ml，較佳約為30mg/ml至80mg/ml，較佳約為35mg/ml至80mg/ml，較佳約為40mg/ml至80mg/ml，較佳約為45mg/ml至80mg/ml，較佳約為50mg/ml至80mg/ml，較佳約為55mg/ml至80mg/ml，較佳約為60mg/ml至80mg/ml，較佳約為65mg/ml至80mg/ml，較佳約為70mg/ml至80mg/ml，較佳約為75mg/ml至80mg/ml，較佳約為30mg/ml至75mg/ml，較佳約為35mg/ml至75mg/ml，較佳約為40mg/ml至75mg/ml，較佳約為45mg/ml至75mg/ml，較佳約為50mg/ml至75mg/ml，較佳約為55mg/ml至75mg/ml，較佳約為60mg/ml至75mg/ml，較佳約為65mg/ml至75mg/ml，較佳約為70mg/ml至75mg/ml，較佳約為30mg/ml至70mg/ml，較佳約為35mg/ml至70mg/ml，較佳約為40mg/ml至70mg/ml，較佳約為45mg/ml至70mg/ml，較佳約為50mg/ml至 70mg/ml，較佳約為55mg/ml至70mg/ml，較佳約為60mg/ml至70mg/ml，較佳約為65mg/ml至70mg/ml，較佳約為30mg/ml至65mg/ml，較佳約為35mg/ml至65mg/ml，較佳約為40mg/ml至65mg/ml，較佳約為45mg/ml至65mg/ml，較佳約為50mg/ml至65mg/ml，較佳約為55mg/ml至65mg/ml，較佳約為60mg/ml至65mg/ml，較佳約為30mg/ml至60mg/ml，較佳約為35mg/ml至60mg/ml，較佳約為40mg/ml至60mg/ml，較佳約為45mg/ml至60mg/ml，較佳約為50mg/ml至60mg/ml，較佳約為55mg/ml至60mg/ml，較佳約為30mg/ml至55mg/ml，較佳約為35mg/ml至55mg/ml，較佳約為40mg/ml至55mg/ml，較佳約為45mg/ml至55mg/ml，較佳約為50mg/ml至55mg/ml，較佳約為30mg/ml至50mg/ml，較佳約為35mg/ml至50mg/ml，較佳約為40mg/ml至50mg/ml，較佳約為45mg/ml至50mg/ml，較佳約為30mg/ml至45mg/ml，較佳約為35mg/ml至45mg/ml，較佳約為40mg/ml至45mg/ml，較佳約為30mg/ml至40mg/ml，較佳約為35mg/ml至40mg/ml，較佳約為30mg/ml至35mg/ml；作為非限制性實施例，醫藥組成物中糖的濃度約為包括60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml或90mg/ml，更佳約為70mg/ml-80mg/ml，最佳75mg/ml。

在可選的實施方案中，醫藥組成物還包含表面活性劑。該表面活性劑可選自聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚羥亞烴、Triton、十二烷基磺酸鈉、月桂基磺酸鈉、辛基糖甙鈉、 月桂基-磺基甜菜鹼、肉豆蔻基-磺基甜菜鹼、亞油基-磺基甜菜鹼、硬脂基-磺基甜菜鹼、月桂基-肌胺酸、肉豆蔻基-肌胺酸、亞油基-肌胺酸、硬脂基-肌胺酸、亞油基-甜菜鹼、肉豆蔻基-甜菜鹼、鯨蠟基-甜菜鹼、月桂醯胺基丙基-甜菜鹼、柯卡醯胺基丙基-甜菜鹼、亞油醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-甜菜鹼、棕櫚醯胺基丙基-甜菜鹼、異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-二甲基胺、棕櫚醯胺基丙基-二甲基胺、異硬脂醯胺基丙基-二甲基胺、甲基可可醯基鈉、甲基油基牛磺酸鈉、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯與丙烯二醇的共聚物等等。較佳的表面活性劑為聚山梨酯80或聚山梨酯20，更佳為聚山梨酯80。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中表面活性劑的濃度約為0.02mg/ml至0.8mg/ml，較佳約0.lmg/ml至0.8mg/ml，較佳約0.2mg/ml至0.8mg/ml，較佳約0.3mg/ml至0.8mg/ml，較佳約0.4mg/ml至0.8mg/ml，較佳約0.5mg/ml至0.8mg/ml，較佳約0.6mg/ml至0.8mg/ml，較佳約0.7mg/ml至0.8mg/ml，較佳約為0.02mg/ml至0.7mg/ml，較佳約0.lmg/ml至0.7mg/ml，較佳約0.2mg/ml至0.7mg/ml，較佳約0.3mg/ml至0.7mg/ml，較佳約0.4mg/ml至0.7mg/ml，較佳約0.5mg/ml至0.7mg/ml，較佳約0.6mg/ml至0.7mg/ml，較佳約為0.02mg/ml至0.6mg/ml，較佳約0.1mg/ml至0.6mg/ml，較佳約0.2mg/ml至0.6mg/ml，較佳約0.3mg/ml至0.6mg/ml，較佳約0.4mg/ml至0.6mg/ml，較佳約0.5mg/ml至0.6mg/ml，較 佳約為0.02mg/ml至0.5mg/ml，較佳約0.1mg/ml至0.5mg/ml，較佳約0.2mg/ml至0.5mg/ml，較佳約0.3mg/ml至0.5mg/ml，較佳約0.4mg/ml至0.5mg/ml，較佳約為0.02mg/ml至0.4mg/ml，較佳約0.1mg/ml至0.4mg/ml，較佳約0.2mg/ml至0.4mg/ml，較佳約0.3mg/ml至0.4mg/ml，較佳約為0.02mg/ml至0.3mg/ml，較佳約0.1mg/ml至0.3mg/ml，較佳約0.2mg/ml至0.3mg/ml，較佳約為0.02mg/ml至0.2mg/ml，較佳約0.1mg/ml至0.2mg/ml，較佳約為0.02mg/ml至0.1mg/ml，作為非限制性實施例，該醫藥組成物中表面活性劑的濃度約為0.2mg/ml、0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml或0.5mg/ml，更佳約為0.3mg/ml-0.5mg/ml。

在一種實施方案中，該醫藥組成物包含如下i)或)ii)所示的組分：i)(a)1mg/ml至90mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)5mM至30mM的醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH約為5.0-6.5，(c)30mg/ml至90mg/ml的蔗糖，和(d)0.02mg/ml至0.8mg/ml的聚山梨酯80；較佳的，該醫藥組成物包含：(e)40mg/ml至80mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(f)10mM至30mM的醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH約為5.2-5.8，(g)70mg/ml至80mg/ml的蔗糖，和(h)0.4mg/ml至0.5mg/ml的聚山梨酯80；或ii)(a)1mg/ml至90mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)5mM至30mM的組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH約為 5.0-6.5，(c)30mg/ml至90mg/ml的蔗糖或海藻糖，和(d)0.05mg/ml至0.6mg/ml的聚山梨酯80，較佳的，該醫藥組成物包含：(e)45mg/ml至60mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(f)10mM至30mM的組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH約為5.5-6.0，(g)60mg/ml至90mg/ml的蔗糖，和(h)0.2mg/ml至0.6mg/ml的聚山梨酯80。

在一種實施方案中，醫藥組成物中該LAG3抗體或其抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3和分別如SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在可選的實施方案中，該醫藥組成物包含：(a)1mg/ml至90mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)5mM至30mM的醋酸鹽緩衝劑，pH較佳約為5.0至6.5，(c)30mg/ml至90mg/ml的蔗糖，和(d)0.02mg/ml至0.8mg/ml的聚山梨酯80。

在可選的實施方案中，該醫藥組成物包含：(a)40mg/ml至80mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)10mM至30mM的醋酸鹽緩衝劑，pH為約5.0-6.0，(c)60mg/ml至90mg/ml的蔗糖，和(d)0.1mg/ml至0.5mg/ml的聚山梨酯80。

在可選的實施方案中，該醫藥組成物包含：(a)50mg/ml至60mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合 片段，(b)10mM至30mM的醋酸-醋酸鈉緩衝劑，且pH約為5.2-5.8。(c)70mg至80mg/ml的蔗糖，和(d)0.4mg/ml至0.5mg/ml的聚山梨酯80。

在可選的實施方案中，該醫藥組成物包含：(a)約50mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)10mM的醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH約為5.5，(c)約75mg/ml的蔗糖，和(d)約0.4mg/ml的聚山梨酯80。

在可選的實施方案中，上述醫藥組成物中該LAG-3抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段、人源化抗體或其抗原結合片段。

在可選的實施方案中，上述醫藥組成物中該LAG3鼠源抗體包含如SEQ ID NO：5所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：6所示的輕鏈可變區。

在可選的實施方案中，上述醫藥組成物中該LAG-3人源化抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區胺基酸序列如SEQID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25任一序列所示或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；其中該輕鏈可變區如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28任一所示或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中該LAG-3抗體的輕鏈可變區與SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的輕鏈胺基酸可變區序列具有至 少85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%的序列同一性，該LAG-3抗體的重鏈胺可變區基酸序列與SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的抗體重鏈可變區具有至少85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%的序列同一性。

在可選的實施方案中，上述醫藥組成物中該LAG3人源化抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區的組合：1)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；2)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；3)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；4)SEQ ID NO：21的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；5)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；6)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；7)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區； 8)SEQ ID NO：23的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；9)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；10)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；11)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；12)SEQ ID NO：24的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區；13)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：22的輕鏈可變區；14)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：26的輕鏈可變區；15)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：27的輕鏈可變區；和16)SEQ ID NO：25的重鏈可變區和SEQ ID NO：28的輕鏈可變區。

在可選的實施方案中，上述醫藥組成物中該LAG-3人源化抗體包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，其中該的重鏈恆定區較佳如SEQID NO：38所示；其中該輕鏈恆定區較佳如SEQ ID NO：39所示。

在可選的實施方案中，上述醫藥組成物中該LAG-3人源化抗體的重鏈選自SEQ ID NO：40所示的序列或與其具 有至少95%的序列同一性胺基酸序列，輕鏈選自SEQ ID NO：41所示的的序列或與其具有至少95%的序列同一性胺基酸序列。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中該LAG-3抗體的重鏈與SEQ ID NO：40所示的重鏈胺基酸序列具有至少95%，96%，97%，98%，99%或100%的序列同一性，該LAG-3抗體的輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO：41所示的抗體輕鏈具有至少95%，96%，97%，98%，99%或100%的序列同一性。

在一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu229-013，10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH 5.5。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu229-013，10mM琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝液，pH 6.0。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu229-013，10mM組胺酸-鹽酸緩衝液，pH 6.0。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu229-013，10mM琥珀酸-琥珀酸鈉，pH6.0和0.1mg/ml聚山梨酯80。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu229-013，10mM琥珀酸-琥珀酸鈉，pH6.0，和70mg/ml蔗糖。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu229-013，10mM醋酸-醋酸鈉，pH 5.5，60mg/ml蔗糖和0.4mg/mL聚山梨酯80。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu229-013，10mM組胺酸-醋酸，pH 6.0，60mg/ml蔗糖和0.4mg/mL聚山梨酯80。

在一些實施方案中，醫藥組成物包含：1mg/ml的LAG3抗體Hu229-013，10-30mM組胺酸-醋酸，pH5.5，75mg/ml蔗糖和0.2mg/mL聚山梨酯80。

在又一些實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu229-013，10-30mM醋酸-醋酸鈉，pH5.2-5.8，75mg/ml蔗糖和0.2mg/mL聚山梨酯80。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：60mg/ml的LAG3抗體Hu229-013，10mM醋酸-醋酸鈉，pH 5.5，60mg/ml蔗糖和0.4mg/mL聚山梨酯80。

在又一些實施方案中，醫藥組成物包含：50-60mg/ml的LAG3抗體Hu229-013，10mM醋酸-醋酸鈉，pH 5.5，30-90mg/ml蔗糖和0.4-0.5mg/mL聚山梨酯80。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu229-013，10mM醋酸-醋酸鈉，pH 5.5，75mg/ml蔗糖和0.4mg/mL聚山梨酯80。

在另一些實施方案中，醫藥組成物中該LAG-3抗體或其抗原結合片段具包含分別如SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3 區和分別如SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3區。

在可選實施方案中，該醫藥組成物包含：(a)1mg/ml至90mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)5mM至30mM的組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH約為5.0-6.5，(c)30mg/ml至90mg/ml的蔗糖或海藻糖，和(d)0.05mg/ml至0.6mg/ml的聚山梨酯80。

在可選實施方案中，該醫藥組成物包含：(a)45mg/ml至60mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)約10mM至30mM的組胺酸-鹽酸鈉緩衝劑，pH約為5.0-6.0，(c)60mg至90mg/ml的蔗糖或海藻糖，和(d)0.2mg/ml至0.6mg/ml的聚山梨酯80。

在可選的實施方案中，該醫藥組成物包含：(a)約50mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)10mM的組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH約為5.0，(c)約75mg/ml的蔗糖或海藻糖，和(d)約0.3mg/ml的聚山梨酯80。

在可選的實施方案中，上述醫藥組成物中該LAG-3抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段、嵌合抗體或其抗原結合片段、人源化抗體或其抗原結合片段。

在可選的實施方案中，上述醫藥組成物中該LAG3鼠源抗體包含如SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區。

在可選的實施方案中，上述醫藥組成物中該LAG-3人源化抗體包含： 選自SEQID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33任意一個所示的重鏈可變區序列或與其具有至少85%序列同一性的氨基酸序列和選自SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37任意一個所示的輕鏈可變區序列或與其具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中該LAG-3抗體的輕鏈可變區與SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID37所示的輕鏈胺基酸可變區序列具有至少85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%的序列同一性，該LAG-3抗體的重鏈胺可變區基酸序列與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33所示的抗體重鏈可變區具有至少85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%的序列同一性。

在可選的實施方案中，上述醫藥組成物中該LAG3人源化抗體包含選自以下的重鏈可變區和輕鏈可變區的組合：1)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；2)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；3)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的 輕鏈可變區；4)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；5)SEQ ID NO：29的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；6)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；7)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；8)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；9)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；10)SEQ ID NO：31的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區；11)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；12)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；13)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；14)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；15)SEQ ID NO：32的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的 輕鏈可變區；16)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：30的輕鏈可變區；17)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：34的輕鏈可變區；18)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：35的輕鏈可變區；19)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：36的輕鏈可變區；和20)SEQ ID NO：33的重鏈可變區和SEQ ID NO：37的輕鏈可變區。

在可選的實施方案中，上述醫藥組成物中該嵌合抗體或人源化抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG4或其變體的重鏈恆定區，最佳如SEQ ID NO：38所示的重鏈恆定區；該嵌合抗體或人源化抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，較佳如SEQ ID NO：39所示的輕鏈恆定區。

在可選的實施方案中，上述醫藥組成物中該LAG-3人源化抗體的重鏈選自SEQ ID NO：42所示的序列或與其具有至少95%的序列同一性胺基酸序列，輕鏈選自SEQ ID NO：43所示的的序列或與其具有至少95%的序列同一性胺基酸序列。

在可選的實施方案中，醫藥組成物中該LAG-3抗體的 重鏈與SEQ ID NO：42所示的重鏈胺基酸序列具有至少95%，96%，97%，98%，99%或100%的序列同一性，該LAG-3抗體的輕鏈胺基酸序列與SEQ ID NO：43所示的抗體輕鏈具有至少95%，96%，97%，98%，99%或100%的序列同一性。

在一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu303-005，10mM組胺酸-鹽酸緩衝液，pH6.0。

在一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu303-005，10mM組胺酸-鹽酸緩衝液，pH5.0。

在一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu303-005，10mM組胺酸-鹽酸緩衝液，pH6.5。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu303-005，10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH5.5。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu303-005，10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH5.5，75mg/ml蔗糖和0.2mg/ml聚山梨酯80。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu303-005，10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH5.5，75mg/ml海藻糖和0.2mg/ml聚山梨酯80。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的 LAG3抗體Hu303-005，10mM醋酸-醋酸鈉緩衝液，pH5.5，和0.4mg/ml聚山梨酯80。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu303-005，10mM組胺酸-鹽酸緩衝液，pH6.0，75mg/ml蔗糖和0.4mg/ml聚山梨酯80。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu303-005，10mM組胺酸-鹽酸緩衝液，pH6.5，75mg/ml蔗糖和0.4mg/ml聚山梨酯80。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：50mg/ml的LAG3抗體Hu303-005，10mM組胺酸-鹽酸緩衝液，pH5.5，75mg/ml蔗糖和0.4mg/ml聚山梨酯80。

在一些實施方案中，醫藥組成物包含：45-60mg/ml的LAG3抗體Hu303-005，10mM組胺酸-鹽酸緩衝液，pH5.5，75mg/ml蔗糖和0.2-0.6mg/ml聚山梨酯80。

在又一種實施方案中，醫藥組成物包含：約50mg/ml的LAG3抗體Hu303-005，約10mM組胺酸-鹽酸緩衝液，約pH6.0，約75mg/ml蔗糖和約0.3mg/ml聚山梨酯80。

本發明還提供一種製備含LAG-3抗體的醫藥組成物的方法，包括將LAG-3抗體或抗原結合片段與藥學上可接受的賦形劑混合。

本發明還提供一種製備含LAG-3抗體的凍乾製劑的方法，其中包括將前述醫藥組成物經冷凍乾燥的步驟。

在可選的實施方案中，製備含LAG-3抗體的凍乾製劑的方法中該冷凍乾燥依次包括預凍、一次乾燥和二次乾燥 的步驟。

在可選的實施方案中，製備含LAG-3抗體的凍乾製劑的方法中該一次乾燥溫度為-5℃至-20℃，較佳為-10℃。

本發明還提供一種經前述製備含LAG-3抗體的凍乾製劑的方法製備所得含LAG-3抗體的凍乾製劑。

在一些實施方案中，該凍乾製劑於2-8℃穩定至少3個月，至少6個月，至少12個月，至少18個月或至少24個月。在一些實施方案中，該凍乾製劑於40℃穩定至少7天，至少14天或至少28天。

本發明還提供一種由上述凍乾方法製備所得含LAG-3抗體的凍乾製劑。

本發明還提供一種一種含LAG3抗體的凍乾製劑，其特徵在於該製劑複溶後可形成上述醫藥組成物。

本發明還提供製備含有LAG-3抗體的凍乾製劑的複溶溶液的方法，其中包括將前述凍乾製劑經複溶的步驟，其複溶所用溶液選自但不限於注射用水、生理鹽水或葡萄糖溶液。

本發明還提供一種經前述含有LAG-3抗體的凍乾製劑的複溶溶液的方法製備所得含有LAG-3抗體的凍乾製劑的複溶溶液。

本發明還提供一種包含LAG3抗體的複溶溶液，其還含有如下成分：(a)1至90mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)5至30mM的醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH約為5.0-6.5，(c) 30至90mg/ml的蔗糖，(d)0.02至0.8mg/ml的聚山梨酯80。

本發明還提供一種包含LAG3抗體的複溶溶液，其還含有如下成分：(a)40至80mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)10至30mM的醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH約為5.2-5.8，(c)70至80mg/ml的蔗糖，(d)0.4至0.5mg/ml的聚山梨酯80。

本發明還提供一種包含LAG3抗體的複溶溶液，其還含有如下成分：(a)50mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)10mM的醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH約為5.5，(c)75mg/ml的蔗糖，(d)0.4mg/ml的聚山梨酯80。

(a)1至90mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)5至30mM的組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH約為5.0-6.5，(c)30至90mg/ml的蔗糖，(d)0.05至0.6mg/ml的聚山梨酯80。

本發明還提供一種包含LAG3抗體的複溶溶液，其還含有如下成分：(a)45至60mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)10至30mM的組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH約為5.5-6.0，(c)60至80mg/ml的蔗糖，(d)0.2至0.6mg/ml的聚山梨酯80。

本發明還提供一種包含LAG3抗體的複溶溶液，其還 含有如下成分：(a)50mg/ml的LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)10mM的組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH約為6.0，(c)75mg/ml的蔗糖，(d)0.3mg/ml的聚山梨酯80。

本發明進一步提供一種製品或試劑盒，其包含裝有本文該任何穩定的醫藥組成物的容器。在一些實施方案中，該玻璃瓶為中性硼矽玻璃管制注射劑瓶。

本發明前述的醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液可用作藥物。

本發明還提供前述的醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液在製備用於治療LAG-3相關的疾病或病症的藥物中的用途，其中該疾病或病症為致病性T細胞參與的相關疾病或病症，較佳為癌症；該癌症包括，但不限於卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、腸癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、子宮癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、腦癌、睾丸癌、皮膚癌、甲狀腺癌以及血液學惡性腫瘤，其中該血液學惡性腫瘤包括包括骨髓瘤和慢性和急性白血病。

本發明還提供一種治療和預防LAG-3相關的疾病或病症的方法，包括給予所需患者治療有效量的前述的醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液，其中該疾病或病症為致病性T細胞參與的相關疾病或病症，較佳為癌症；該癌症包括，但不限於卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、腸癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、子宮 癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、腦癌、睾丸癌、皮膚癌、甲狀腺癌以及血液學惡性腫瘤，其中該血液學惡性腫瘤包括包括骨髓瘤和慢性和急性白血病。

本發明還提供一種製品，其包括容器，該容器中裝有前述的醫藥組成物或凍乾製劑或凍乾製劑的複溶溶液。

如本領域技術人員所熟知的，本公開中該各個實施方案的一項、一些或所有特性可以進一步組合以形成本發明的其它實施方案。本發明的以上實施方案和藉由組合得到的其他實施方案藉由下面的詳述進一步說明。

(術語)

為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

“緩衝劑”指藉由其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的緩衝劑。將pH控制在適當範圍中的緩衝劑的例子包括醋酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘胺醯甘胺酸和其它有機酸緩衝劑。

“組胺酸緩衝劑”是包含組胺酸離子的緩衝劑。組胺酸緩衝劑的實例包括組胺酸-鹽酸鹽，組胺酸-醋酸鹽，組胺酸-磷酸鹽，組胺酸-硫酸鹽等緩衝劑，較佳組胺酸-鹽酸鹽緩衝劑。組胺酸-鹽酸鹽緩衝劑是組胺酸與鹽酸或組胺酸與組胺酸鹽酸鹽配製而成。

“檸檬酸鹽緩衝劑”是包括檸檬酸根離子的緩衝劑。檸檬酸鹽緩衝劑的實例包括檸檬酸-檸檬酸鈉、檸檬酸-檸檬 酸鉀、檸檬酸-檸檬酸鈣、檸檬酸-檸檬酸鎂等。較佳的檸檬酸鹽緩衝劑為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝劑。

“琥珀酸鹽緩衝劑”是包括琥珀酸離子的緩衝劑。琥珀酸鹽緩衝劑的實例包括琥珀酸-琥珀酸鈉、琥珀酸-琥珀酸鉀、琥珀酸-琥珀酸鈣鹽等。較佳的琥珀酸鹽緩衝劑為琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝劑。

“磷酸鹽緩衝劑”是包括磷酸離子的緩衝劑。磷酸鹽緩衝劑的實例包括磷酸氫二鈉酸-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉酸-磷酸二氫鉀等。較佳的磷酸鹽緩衝劑為磷酸氫二鈉酸-磷酸二氫鈉緩衝劑。

“醋酸鹽緩衝劑”是包括醋酸根離子的緩衝劑。醋酸鹽緩衝劑的實例包括醋酸-醋酸鈉、醋酸-組胺酸鹽、醋酸-醋酸鉀、醋酸-醋酸鈣、醋酸-醋酸鎂等。較佳的醋酸鹽緩衝劑為醋酸-醋酸鈉緩衝劑。

“Tris緩衝劑”是指包含三(羥甲基)胺基甲烷的緩衝溶液，Tris緩衝劑也被稱為Tris鹼、Trizma、Trisamine、THAM、胺丁三醇、胺基丁三醇和緩血酸胺。Tris緩衝劑的有效緩衝範圍在pH7.0到9.2之間，Tris鹼的水溶液pH在10.5左右，一般加入鹽酸以調節pH值至所需值，即可獲得該pH值的緩衝劑。

本發明的“糖”包含常規組合物(CH₂O)_n及其衍生物，包括單糖，二糖，三糖，多糖，糖醇，還原性糖，非還原性糖等。可選自葡萄糖，蔗糖，海藻糖，乳糖，果糖，麥芽糖，右旋糖苷，甘油，赤藻糖醇，丙三醇，阿拉伯糖醇， sylitol，山梨糖醇，甘露醇，密裡二糖，松三糖，蜜三糖，甘露三糖，水蘇糖，麥芽糖，乳果糖，麥芽酮糖，山梨醇，麥芽糖醇，乳糖醇，異-麥芽酮糖等。較佳的糖為非還原性二糖，更佳為蔗糖。

“黏度調節劑”是為調節製劑的黏度而加入的常規藥用物料，此處所指的黏度調節劑主要是指無機鹽和胺基酸鹽，其中無機鹽較佳選自氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、醋酸鈣，該胺基酸鹽較佳選自精胺酸鹽酸鹽，組胺酸鹽酸鹽，甘胺酸鹽酸鹽，組胺酸醋酸鹽等。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文該化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。本文中，“醫藥組成物”和“製劑”並不互相排斥。

本發明中所述醫藥組成物的溶液形式，若無特殊說明，其中的溶劑均為水。

“凍乾製劑”表示液體或溶液形式的醫藥組成物或溶液製劑經過真空冷凍乾燥步驟之後獲得的製劑或醫藥組成物。

本公開的冷凍乾燥包括預凍，一次乾燥，二次乾燥。預凍目的是冷凍產品，獲得結晶固體。預凍溫度和預凍速度是兩個重要工藝參數，本發明中將預凍溫度設定為-45℃，預凍速度設定為1℃/min。一次乾燥也稱為主乾燥， 是樣品冷凍乾燥的主要階段。目的是移除產品裡冰的同時，保持產品形狀，最小程度的減少對產品的破壞。若一次乾燥的溫度和真空度選擇不當，會導致製品的塌陷。較高的溫度和真空度均會加快凍乾效率，但同時也會增加製品塌陷的風險。本發明所述一次乾燥的溫度可為本領域常規的溫度，例如-30℃-0℃。二次乾燥也稱為解析乾燥，是藉由抽極限真空(0.01mbar)和升高溫度(20-40℃)除去製品中結合水的主要步驟。由於大多數生物製品對溫度比較敏感，所以二次乾燥溫度選擇在溫度範圍的低點，即25℃。冷凍乾燥的時間與冷凍機，凍乾製劑劑量，凍乾藥劑的容器有關。這種時間的調整是在本領域技術人員所熟知的。

本文所用術語“約”是指數值在由本領域一般技術人員所測定的具體值的可接受誤差範圍內，該數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，在本領域每一次實行中“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多20%的範圍，例如，約5.5的pH意指pH5.5±1.1。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級或數值的至多5倍。除非另外說明，否則當具體值在本申請和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。

本發明所述的醫藥組成物能夠達到一種穩定的效果：其中的抗體在貯藏後基本上保留其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性，較佳地，醫藥組成物在貯藏後基 本上保留其物理和化學穩定性以及其生物學活性。貯藏期一般基於醫藥組成物的預定保存期來選擇。目前有多種測量蛋白質穩定性的分析技術，可測量在選定溫度貯藏選定時間段後的穩定性。

穩定的藥物抗體製劑是在下述情況下沒有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度(2-8℃)保存至少3個月、較佳6個月、更佳1年，且甚至更佳地最多達2年。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃保存包括1個月、3個月、6個月或在40℃保存1個月在內的時段後表現出期望的特徵。穩定性的典型的可接受的標準如下：藉由SEC-HPLC測得，通常不超過約5%、較佳不超過約5%的抗體單體發生降解。藉由視覺分析，藥物抗體製劑是無色的，或澄清至稍微乳白色。該製劑的濃度、pH和重量克分子滲透壓濃度具有不超過±5%變化。通常觀察到不超過約5%、較佳不超過約5%的截短，通常形成不超過約5%、較佳不超過約5%的聚集。

如果在目檢顏色和/或澄清度後，或者藉由UV光散射、尺寸排阻色譜法(SEC)和動態光散射(DLS)測得，抗體沒有顯示出顯著的聚集增加、沉澱和/或變性，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的物理穩定性”。蛋白構象的變化可以藉由螢光光譜法(其確定蛋白三級結構)和藉由FTIR光譜法(其確定蛋白二級結構)來評價。

如果抗體沒有顯示出顯著的化學改變，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的化學穩定性”。藉由檢測和定量化學 上改變的形式的蛋白，可以評估化學穩定性。經常改變蛋白化學結構的降解過程包括水解或截短(藉由諸如尺寸排阻色譜法和SDS-PAGE等方法來評價)、氧化(藉由諸如與質譜法或MALDI/TOF/MS結合的肽譜法等方法來評價)、脫醯胺作用(藉由諸如離子交換色譜法、毛細管等電聚焦、肽譜法、異天冬胺酸測量等方法來評價)和異構化(藉由測量異天冬胺酸含量、肽譜法等來評價)。

如果抗體在給定時間的生物活性是在製備藥物製劑時表現出的生物活性的預定範圍內，那麼該抗體在藥物製劑中“保留它的生物活性”。抗體的生物活性可以例如藉由抗原結合測定來確定。

術語“LAG-3”是指淋巴細胞活化基因3。術語“LAG-3”包含變體、同等型(isoform)、同源物、直系同源體(ortholog)及旁系同源體(paralog)。術語“人LAG-3”指人序列LAG-3，例如具有Uniprot號：P18627的人LAG-3的完整胺基酸序列。本領域中亦已知LAG-3，例如CD215。人LAG-3序列與Uniprot號：P18627的人LAG-3的不同之處可在於具有例如保守突變或在非保守區中的突變，且LAG-3與Uniprot號：P18627的人LAG-3具有實質上相同的生物功能。舉例而言，人LAG-3的生物功能是在LAG-3的胞外域中具有表位，該表位被本公開的抗體特異性結合，或人LAG-3的生物功能是結合MHCII類分子。

特定人LAG-3序列在胺基酸序列中通常與Uniprot號：P18627的人LAG-3至少90%相同，且含有在與其他物種(例 如鼠類)的LAG-3胺基酸序列相比時鑒別為人胺基酸序列的胺基酸殘基。在某些情形下，人LAG-3在胺基酸序列中可與Uniprot號：P18627的LAG-3至少85%或甚至至少95%、96%、97%、98%或99%相同。在某些實施方案中，人LAG-3序列較Uniprot號：P18627的LAG-3序列顯示不超過10個胺基酸差異。在某些實施方案中，人LAG-3可較Uniprot號：P18627的LAG-3序列顯示不超過5或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。可如本文所闡述的測定百分比同一性。

本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

本發明所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。

在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。

在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約15個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異 性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳人源化抗體。

術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人LAG-3的單株抗體。製備時用LAG-3抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。在本發明一個較佳的實施方案中，該LAG-3嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該LAG-3嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR 移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的抗體可變抗體反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本發明的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。

本發明中術語“抗LAG-3抗體”、“抗LAG-3”、“LAG-3抗體”或“結合LAG-3的抗體”是指這樣的抗體，該抗體能夠以足夠的親合力結合LAG-3抗體以致該抗體可以用作靶向LAG-3中的診斷劑和/或治療劑。

本發明中術語“與LAG-3結合”，指能與人LAG-3相互作用。

術語“特異性結合”指如藉由本領域可用的技術，例如競爭ELISA、BIACORE^®測定或KINEXA^®測定所測定的。該術語還適用於當例如本發明抗體的抗原結合結構域對許多抗原攜帶的特定表位特異的情況，在該情況下攜帶抗原 結合結構域的抗體能夠特異性結合攜帶該表位的多種抗原。

術語“競爭結合”是指與本發明的單株抗體識別人LAG-3的胞外區上的相同表位(也稱為抗原決定簇)或相同表位的一部分並與該抗原結合的抗體。與本發明的單株抗體結合相同表位的抗體是指識別並結合於本發明的單株抗體所識別的人LAG-3的胺基酸序列的抗體。

術語“KD”或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本發明的抗體以小於大約10^-7M，例如小於大約10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解離平衡常數(KD)結合LAG-3，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。

本發明中所述的“抗原結合片段”，指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及與人LAG-3結合的scFv片段及其他利用了能與人LAG-3結合的抗體的VH和VL區形成的可結合人LAG-3的片段；其包含本發明所述抗體的選自SEQ ID NO：9、10、11、15、16、17和12、13、14、18、19和20中的一個或多個CDR區。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(sFv)。

術語“表位”指在一個或更多個抗體的抗原結合區中能夠被抗體識別並結合的分子部分。

“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破壞生物學活性。

胺基酸序列“同一性”是指兩個蛋白或多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同胺基酸殘基佔據時，例如如果兩個多肽的一個位置都被同一個胺基酸殘基佔據時，那麼該分子在該位置是一致的。適於確定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的實例是BLAST和BLAST2.0算法，它們分別描述於Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-45和Altschul et al.(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402。用於執行BLAST分析的軟件可在美國國家生物技術信息中心公開獲取(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以 藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟件，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人LAG-3特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝劑的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體 與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，患者的健康狀況、患者的行為、患者的飲食、給藥時間、給藥方式、排泄的速率、藥物的組合等以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症 的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“Tm值”是指蛋白質熱變性溫度，即一半蛋白去折疊時的溫度，此時蛋白的空間結構被破壞，所以Tm值越高，蛋白熱穩定性越高。

發明詳述：

本發明獲得了一種穩定包含LAG3抗體或其抗原結合片段、醋酸鹽緩衝劑或組胺酸鹽、蔗糖和聚山梨酯80的醫藥組成物(製劑)，該醫藥組成物(製劑)更適於給藥。

第1圖顯示人源化抗LAG-3抗體樣品增強對SEB刺激激活的T淋巴細胞分泌IL-2細胞因子的作用。數據結果顯示，LAG-3人源化候選抗體Hu229-013和Hu303-005能夠不同程度增強激活的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2，並且有藥物濃度劑量效應。

第2圖顯示人源化抗LAG-3抗體對U-87MG荷瘤小鼠腫瘤體積的影響。結果顯示，給藥14天後，LAG-3抗體Hu229-0136mpk和Hu303-0056mpk均有一定的抑瘤效果，抑瘤率分別為27.25%(p<0.05)及34.94%(p<0.01)；與對照組有顯著差異(p<0.001vshIGg)

第3圖為Hu229-013抗體40℃ CE純度趨勢圖。

第4圖為Hu229-013抗體40℃ IEC中性峰趨勢圖。

第5圖為Hu303-005抗體40℃非還原CE趨勢圖。

第6圖為Hu303-005抗體40℃ iCE主峰趨勢圖。

第7圖為Hu303-005振搖SEC結果趨勢圖。

第8圖為Hu303-005抗體IEC0℃時與40℃數據差值擬合結果。

第9圖為Hu303-005抗體CE純度0℃時與40℃數據差值擬合圖。

第10圖為Hu303-005抗體製劑25℃和40℃ iCE/CE/DLS擬合結果。

實施例

藉由以下實施例進一步詳細說明本發明。這些實施例僅用於說明性目的，而並不用於限制本發明的範圍。

本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1. LAG-3抗原抗體的製備 1、蛋白設計及表達

以UniProt Lymphocyte activation gene 3 protein(人LAG-3，Uniprot號：P18627)作為本發明LAG-3的模板，設計本發明涉及的抗原及檢測用蛋白的胺基酸序列，可選 的在LAG-3蛋白基礎上融合不同的標簽，分別選殖到pHr載體上(自產)或pTT5載體上(Biovector，Cat#：102762)或pTargeT載體上(promega,A1410)，在293細胞瞬轉表達或CHO-S穩定表達純化，獲得編碼本發明抗原及檢測用蛋白。以下LAG-3抗原未特殊說明的均指人LAG-3。帶Flag標簽的LAG-3胞外區：LAG-3-Flag，用於免疫小鼠

SEQ ID NO：1

註釋：下底線部分為信號肽，斜體部分為Flag-tag標簽。

全長LAG-3：用於構建LAG-3過表達細胞株，免疫小鼠和檢測

SEQ ID NO：2

註釋：信號肽+胞外區+

+胞內區

LAG-3胞外區和hIgG1 Fc的融合蛋白：LAG-3-Fc，用於檢測

SEQ ID NO：3

註釋：下底線部分為信號肽，雙底線部分為接頭，斜體部分為Fc。

LAG-3胞外區和mIgG2a Fc的融合蛋白：LAG-3-mFc，用於檢測

SEQ ID NO：4

註釋：下底線部分為信號肽，雙底線部分為接頭，斜體部分為mFc。

2、LAG-3相關重組蛋白的純化，以及融合瘤抗體、重組抗體的純化 1)帶Flag標簽的LAG-3-Flag重組蛋白的純化步驟：

將樣品高速離心去除雜質，並濃縮至適當體積。利用0.5×PBS平衡flag親和管柱，沖洗2-5倍管柱體積。將除雜後的細胞表達上清樣品上管柱。用0.5×PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用PBS沖洗管柱，沖洗雜蛋白，並收集。用100mM甘胺酸，pH3.0.沖提目的蛋白，並收集，以備後續體外激活和進一步純化。

2)融合瘤、重組抗體、Fc融合蛋白的純化

將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，融合瘤表達上清用Protein G管柱，重組抗體、Fc融合蛋白表達上清 用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用100mM乙酸pH3.0沖提目的蛋白，用1M Tris-HCl,pH8.0中和。沖提樣品適當濃縮後利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，去聚體的峰收集好後分裝備用。

實施例2. 抗人LAG-3融合瘤單株抗體的製備 1．免疫

抗人LAG-3單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL白小鼠，雌性，6週齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原為帶Flag標簽的人LAG-3胞外區(SEQ ID NO：1)。

免疫方案A：用TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)與Thermo Imject® Alum(Thermo Cat No.77161)交叉免疫。抗原與佐劑(TiterMax® Gold Adjuvant)比例為1：1，抗原與佐劑(Thermo Imject® Alum)比例為3：1，50μg/隻/次(首免)，25μg/隻/次(加強免疫)。抗原乳化後進行接種，時間為第0、7、14、21、28、35、42天。第0天皮下(SC)多點注射50μg/隻的乳化後抗原。第7天腹膜內(IP)注射25μg/隻。第14、28、35、42天根據背部結塊和腹部腫脹情況，選擇背部或腹膜內注射抗原。於第21，35，49天取血，用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體滴度。在7免以 後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射50μg/隻的生理鹽水配製的抗原溶液。

免疫方案B：用QuickAntibody-Mouse5W(KX0210041)對小鼠進行免疫。抗原與佐劑比例為1：1，25μg/隻/次(首免/加強免疫)。抗原與佐劑迅速充分混勻後接種，時間為第0、21、35天。第0天小鼠後小腿肌肉(IM)注射25μg/隻的抗原。第21，35天按同樣方式注射25μg/隻(根據滴度決定第3免是否進行)。於第28，42天取血，用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體滴度。選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射50μg/隻的生理鹽水配製的抗原溶液。

2.脾細胞融合

採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287^TM)進行融合得到融合瘤細胞。融合好的融合瘤細胞以0.5-1×10⁶/ml的密度用完全培養基(含20% FBS、1×HAT、1×OPI的DMEM培養基)重懸，100μl/孔種於96孔板中，37℃，5% CO₂孵育3-4天後，補充HAT完全培養基100μl/孔，繼續培養3-4天至形成針尖般純株。去除上清，加入200μl/well的HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培養基)，37℃，5% CO₂培養3天後進行ELISA檢測。

3.融合瘤細胞篩選

根據融合瘤細胞生長密度，用結合ELISA方法進行融合瘤培養上清檢測。並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞上清進行細胞阻斷實驗。結合和阻斷均為陽性的孔細胞及時進行擴增凍存保種和二到三次亞選殖直至獲得單細胞純株。

每次亞選殖細胞均需進行LAG-3結合ELISA、細胞阻斷實驗檢測。藉由以上實驗篩選得到融合瘤純株，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，按純化實例純化抗體，供在檢測例中使用。

4.融合瘤陽性純株序列測定

從陽性融合瘤中選殖序列過程如下。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照試劑盒說明書步驟提取RNA，用PrimeScript^TM Reverse Transcriptase試劑盒反轉錄(Takara,Cat No.2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後送測序公司測序。得到的融合瘤純株mAb229的重鏈、輕鏈的DNA序列對應的胺基酸序列SEQ ID NO：5、6和SEQ ID NO：7、8所示：mAb229-VH

SEQ ID NO：5

mAb229-VL

SEQ ID NO：6

mAb303-VH

SEQ ID NO：7

mAb303-VL

SEQ ID NO：8

對得到的陽性純株進行結合人LAG-3的ELISA實驗(結果見表2中蛋白水平結合活性EC50值)、結合人LAG-3過表達CHO-s細胞的ELISA實驗(結果見表2中細胞水平結合活性EC50值)和阻斷LAG-3抗原與Daudi細胞結合實驗(結果見表2中阻斷活性EC50值)，並檢測其與人LAG-3蛋白的親和力(結果見表3)。

表2數據顯示LAG-3抗體mAb229和mAb303與人LAG-3蛋白均有很好的結合活性。LAG-3抗體mAb229和mAb303與過表達人LAG-3全長蛋白的CHO-S細胞均有很好的結合活性。LAG-3抗體mAb229和mAb303均可顯著阻斷人LAG-3抗原與Daudi細胞的結合。

表3數據表明，本發明LAG-3抗體mAb229和mAb303對人LAG-3蛋白有較強的結合活性和親和力。

實施例3. 抗人LAG-3鼠融合瘤單株抗體mAb229的人源化

藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫和MOE軟體，分別挑選與mAb229同源性高的重鏈和輕鏈可變區種系基因作為模板，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並註釋。

1、融合瘤純株mAb229人源化構架選擇

鼠源抗體mAb229的人源化輕鏈模板為IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重鏈模板為IGHV7-4-1*02和hjh6.1，人源化可變區序列如下： Hu229VH-CDR graft

SEQ ID NO：21

Hu229VL-CDR graft

SEQ ID NO：22

註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下底線為CDR序列。

2、融合瘤純株mAb229的模板選擇和回復突變設計，見下表4：

註：如I48V表示依照Kabat編號系統，將48位I突變回V。Grafted代表鼠抗體CDR植入人種系FR區序列。

註：該表表示各種突變組合所得的序列。如Hu229-005表示，在人源化的鼠抗體Hu229-005上的有輕鏈HumAb229_VL.1A、重鏈HumAb229_VH.1兩種突變。其它類推。

mAb229人源化具體序列如下：Hu229VH.1(同Hu229VH-CDR graft)

SEQ ID NO：21

Hu229VH.1A

SEQ ID NO：23

Hu229VH.1B

SEQ ID NO：24

Hu229VH.1C

SEQ ID NO：25

Hu229VL.1(同Hu229VL-CDR graft)

SEQ ID NO：22

Hu229VL.1A

SEQ ID NO：26

Hu229VL.1B

SEQ ID NO：27

Hu229VL.1C

SEQ ID NO：28

實施例4. 抗人LAG-3鼠融合瘤單株抗體mAb303的人源化

藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫和MOE軟體，分別挑選與mAb303同源性高的重鏈和輕鏈可變區種系基因作為模板，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並註釋。

1、融合瘤純株mAb303人源化構架選擇

鼠源抗體mAb303的人源化輕鏈模板為IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重鏈模板為IGHV1-3*01和hjh6.1，人源化可變區序列如下：Hu303VH-CDR graft

SEQ ID NO：29

Hu303VL-CDR graft

SEQ ID NO：30

註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下底線為CDR序列。

2、融合瘤純株mAb303的模板選擇和回復突變設計，見下表6：

註：如L46R表示依照Kabat編號系統，將46位L突變回R。Grafted代表鼠抗體CDR植入人種系FR區序列。

各突變序列組合如下：

註：該表表示各種突變組合所得的序列。如Hu303-005表示，在人源化的鼠抗體Hu303-005上的有輕鏈HumAb303_VL.1A、重鏈HumAb303_VH.1兩種突變。其它類推。

mAb303人源化具體序列如下：Hu303_VH.1(同Hu303VH-CDR graft)

SEQ ID NO：29

Hu303_VH.1A

SEQ ID NO：31

Hu303_VH.1B

SEQ ID NO：32

Hu303_VH.1C

SEQ ID NO：33

Hu303_VL.1(同Hu303VL-CDR graft)

SEQ ID NO：30

Hu303_VL.1A

SEQ ID NO：34

Hu303_VL.1B

SEQ ID NO：35

Hu303_VL.1C

SEQ ID NO：36

Hu303_VL.1D

SEQ ID NO：37

實施例5. 重組以及人源化抗體的製備

抗體選用人重鏈IgG4/輕鏈kappa的恆定區與各可變區組合，在Fc段做了S228P突變來增加IgG4抗體的穩定性，也可選用本領域其它已知的突變來增加其性能。

重鏈恆定區：

SEQ ID NO：38

輕鏈恆定區：

SEQ ID NO：39

Hu229-013的重鏈胺基酸序列為：

SEQ ID NO：40

Hu229-013的輕鏈胺基酸序列為：

SEQ ID NO：41

Hu303-005的重鏈胺基酸序列為：

SEQ ID NO：42

Hu303-005的輕鏈胺基酸序列為：

SEQ ID NO：43

1.重組抗體的分子選殖

融合瘤篩選所獲得的陽性抗體分子經過測序後，得到可變區編碼基因序列。以測序所得序列設計首尾引物，以測序基因為模板，經過PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及hIgG4/hkappa恆定區基因 (CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建重組抗體全長表達質粒VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr。

2.人源化抗體的分子選殖

人源設計之後的抗體序列，經過密碼子優化後產生人密碼子偏好的編碼基因序列，設計引物PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及hIgG4/hkappa恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建人源化抗體全長表達質粒VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr。

3.重組以及人源化抗體的表達與純化

分別表達抗體輕重鏈的質粒以1：1.2的比例轉染HEK293E細胞，6天後收集表達上清，高速離心去除雜質，用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性沖提液沖提目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。沖提樣品適當濃縮後，利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。

以下用生化測試方法驗證本發明抗體性能及有益效果。

實施例6：LAG-3抗體結合人LAG-3(humanLAG-3)蛋白的ELISA實驗

抗LAG-3抗體的結合力藉由抗體與human LAG-3蛋白的ELISA實驗來檢測。用帶Fc或mFc標簽的LAG-3融合蛋白藉由與包被在酶標板中的抗Fc或mFc抗體結合從而固定到96孔酶標板中，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和LAG-3的結合活性，具體實驗方法如下。

用pH7.4的PBS(Sigma，Cat No.P4417-100TAB)緩衝液將羊抗人Fc抗體(Jackson Immuno Research，Cat No.109-005-008)或羊抗鼠Fc抗體(Sigma，CatNo.M3534-1ML)稀釋至2μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標板中，於37℃孵育箱中放置2小時。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(PH7.4 PBS含1%BSA)稀釋至1μg/ml的LAG-3-Fc融合蛋白(內部生產，SEQ ID NO：3)或LAG-3-mFc融合蛋白(內部生產，SEQ ID NO：4)，置37℃孵育箱孵育1小時或4℃放置過夜。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板6次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體(融合瘤純化抗體或人源化抗體)，放於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板6次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育5-15min，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長450nm處讀取吸收值，計算LAG-3抗體對人LAG-3的結合EC50值。結果如表8所示，數據表明，本發明篩選得到的人源化抗體與人LAG-3蛋白均有較高的結合活性。

實施例7：LAG-3抗體與humanLAG-3過表達CHO-S細胞的結合實驗

抗LAG-3抗體的結合力藉由抗體與過表達LAG-3蛋白的CHO-S細胞的結合實驗來檢測。藉由電轉染的方法將LAG-3全長質粒(內部生產，SEQ ID NO：2)轉染進CHO-S細胞中後加壓篩選兩週後，檢測LAG-3的表達量。將過表達細胞固定於96孔板底後，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和LAG-3過表達CHO-S細胞的結合活性，具體實驗方法如下。

將細胞以4×10⁵/ml密度，100μl/孔接種於96孔板中過夜培養。棄上清，用PBS洗三遍後，加入100μl/孔4% PFA室溫固定半小時，PBS洗三遍。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.05% tween-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體(融合瘤純化抗體或人源化抗體)，放於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板6次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育5-15min，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長450nm處讀取吸收值，計算LAG-3抗體對LAG-3過表達CHO-S細胞的結合EC50值。

實施例8：抗LAG-3抗體阻斷LAG-3抗原和Daudi細胞結合實驗

Daudi細胞(人白血病細胞，購自中科院細胞庫)以3×10⁵/孔的數量接種於96孔培養板中，1000轉離心後棄上清，加入4%PFA室溫固定30分鐘。棄去固定液後用PBS緩衝液洗4遍，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時進行封閉。 封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(pH7.4 PBS含1%BSA)稀釋的已預混合孵育1小時的終濃度為0.4μg/ml的生物素(生物素標記試劑盒，東仁化學，Cat No.LK03)標記的LAG-3-Fc融合蛋白(內部生產，SEQ ID NO：3)和梯度濃度的待測抗體的混合液，置37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋HRP標記的鏈黴親和素(Sigma，Cat No.S2438)，37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，CatNo.52-00-03)，於室溫孵育5-15min，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長450nm處讀取吸收值，計算LAG-3抗體對抗原與daudi細胞結合的阻斷作用。結果如表9所示，數據表明，本發明篩選得到的人源化抗體均可顯著阻斷人LAG-3抗原與Daudi細胞的結合。

實施例9：BIAcore檢測LAG-3抗體親和力實驗

1、按照鼠抗捕獲試劑盒(Cat.# BR-1008-38，GE)說明書中所述的方法將鼠抗捕獲抗體共價偶聯於CM5生物傳感芯片(Cat.# BR-1000-12，GE)上，從而親和捕獲待測抗體，然後於芯片表面流經LAG-3-Flag(內部生產，SEQ ID NO：1)抗原，利用Biacore儀器實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線，藉由擬合得到親和力數值，見上表2。在實驗中每個循環解離完成後，用鼠抗捕獲試劑盒裡配置的再生溶液將生物芯片洗淨再生。結果表明，LAG-3抗體mAb229和mAb303對人LAG-3蛋白有較強的結合活性和親和力。

2、按照人抗捕獲試劑盒(Cat.# BR-1008-39，GE)說明書中該的方法將人抗捕獲抗體共價偶聯於CM5生物傳感芯片(Cat.# BR-1000-12，GE)上，從而親和捕獲待測抗體，然後於芯片表面流經LAG-3-Flag(內部生產，SEQ ID NO：1) 抗原，利用Biacore儀器實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線，藉由擬合得到親和力數值，見下表10。在實驗中每個循環解離完成後，用人抗捕獲試劑盒裡配置的再生溶液將生物芯片洗淨再生。結果表明，本發明篩選得到的人源化抗體對人LAG-3蛋白有較強的結合活性和親和力。

實施例10：PBMC-T淋巴細胞激活實驗

為了研究LAG-3抗體對T淋巴細胞激活，收集和純化人外周血單核細胞(PBMC)，採用超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)體外刺激72小時，檢測IL-2細胞因子的分泌水平。實驗過程簡單描述如下：新鮮分離純化的PBMC，接種至96孔細胞培養板，細胞密度約為1×10⁵/孔，加入100ng/mL SEB超抗原刺激，同時加入梯度稀釋的抗體樣品(用培養基稀釋)或培養基作為空白對照。37℃，5% CO₂培養箱培養72h後，收集細胞培養上清。採用ELISA(BD,CAT# 550611)方法檢測細胞培養上清內IL-2分泌水平。具體操作參考試劑說明書。

結果如第1圖所示，LAG-3人源化候選抗體Hu229-013，Hu303-005能夠不同程度增強激活的T淋巴細胞分泌細胞因子IL-2，並且有藥物濃度劑量效應。

實施例11：LAG-3抗體對U-87MG皮下移植瘤抑制的影響

本實驗用於人源化抗LAG-3抗體對U-87 MG荷瘤小鼠腫瘤體積的影響。

將人腦膠質瘤U-87 MG細胞(3.5×10⁶個)100μl接種於NOD-SCID(購自常州卡文斯實驗動物有限公司)小鼠右肋部皮下，待10-14d腫瘤長至約40mm³後，去除體重、腫瘤過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分為對照組Isotype matched hIgG，LAG-3人源化候選抗體Hu229-013組，Hu303-005組共3組(分組及劑量見表11)，每組8隻(D0)。將經CD3抗體刺激的PBMC以5×10⁵cells/60μl量 注射到腫瘤組織中，並開始腹腔注射抗體，一週三次，共給藥6次。每週測2次瘤體積，記錄數據。腫瘤體積(V)計算公式為：腫瘤體積(TV)=1/2×L_長×L_短 ²

各組動物腫瘤體積均用平均值±標準差(Mean±SEM)表示，並用Graphpad Prism 5軟體作圖，使用two way ANOVA統計分析，並計算抑瘤率，公式為：腫瘤增殖率(T/C %)=(T-T₀/C-C₀)×100%

抑瘤率%TGI=1-T/C %

實驗結果如表11及第2圖所示，給藥14天後，LAG-3抗體Hu229-013 6mpk，Hu303-005 6mpk均有一定的抑瘤效果，抑瘤率分別為27.25%(p<0.05)及34.94%(p<0.01)；與對照組有顯著差異(p<0.001 vs hIGg)。

註：D0：第一次給藥時間；* p<0.05,** p<0.01,***p<0.001 vs hIGg，藉由two way ANOVA分析。

實施例12. 抗LAG-3人源化抗體，Hu229-013和Hu303-005 的小鼠PK測定

ICR小鼠18隻，雄性，體重18-22g，購自西普爾-必凱實驗動物有限公司。飼養期間自由攝取飼料和水，實驗室環境適應性飼養不小於3天，12/12小時光/暗週期調節，溫度16-26℃，相對濕度40-70%。實驗開始前一天，對ICR小鼠進行編號，隨機分組，每組各3隻。實驗當天，兩組小鼠分別靜脈注射人源化候選抗體(Hu229-013)，給藥劑量為3mg/kg和10mg/kg；兩組每隻小鼠分別靜脈注射人源化候選抗體(Hu303-005)，給藥劑量為3mg/kg和10mg/kg。靜脈注射體積為20ml/kg。

給藥後採血時間點為15min、8h、1 d、2 d、4 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d、35 d。每次約取全血0.1ml，不加抗凝劑，取血後在4℃放置30min，1000g離心15min，取上清置於EP管中，-80℃保存。

用ELISA方法檢測血清中的血藥濃度，用Winnolin軟體來計算受試藥物的T1/2及其主要參數。所得主要藥物動力學參數見表12：

LAG-3人源化抗體Hu229-013和Hu303-005在小鼠體內的暴露量相近，且2個抗體在3,10mg/kg劑量下的暴露量、達峰濃度與劑量增長基本呈線性關係，具有線性動力學特徵。

示例性抗體醫藥組成物(製劑)製備工藝

第一步：處方組成LAG-3抗體原液過0.22μm PVDF濾芯，過濾後中控取樣檢測無菌，收集濾液。

第二步：調節裝量至5.3ml，將濾液灌裝於6ml西林瓶中，加塞，分別於灌裝開始、灌裝中間、灌裝結束時取樣中控檢測裝量差異。

第三步：開啟軋蓋機，加鋁蓋，進行軋蓋。

第四步：目檢，確認產品無裝量不准等缺陷。打印、 黏貼西林瓶標簽；打印紙盒標簽，折疊紙盒，裝盒，貼紙盒標簽。

示例性的抗體醫藥組成物製備工藝：

第一步：處方組成Hu303-005原液過0.22μm PVDF濾芯，濾後中控取樣檢測無菌，收集濾液。

第二步：調節裝量至5.3ml，將濾液灌裝於20ml西林瓶中，半加凍乾塞，將西林瓶中原液凍乾，密封膠塞。

第三步：開啟軋蓋機，加鋁蓋，進行軋蓋。

第四步：目檢，確認產品無凍乾塌陷等缺陷。打印、黏貼西林瓶標簽；打印紙盒標簽，折疊紙盒，裝盒，貼紙盒標簽。

實施例13. LAG-3抗體製劑緩衝體系的篩選

在10mM pH5.0-7.5一系列緩衝劑中，配製蛋白濃度為50mg/mL的LAG-3抗體Hu229-013或Hu303-005製劑，將每種製劑過濾灌裝，加塞，軋蓋，封口。將樣品進行40℃高溫、振搖等強制降解實驗，以外觀、分子排阻色譜法(SEC)、非還原十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)-毛細管電泳和離子交換色譜法(IEC)或全管柱成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)為評價指標。結果見表13-1和表13-2，統計分析結果見第3圖至第6圖。

註：振搖D12樣品製備時加入0.01mg/ml聚山梨酯80，其他樣品不含聚山梨酯80；D表示天數。

備註：D表示天；N/A表示未檢測。

結果表明：

(1)Hu229-013抗體在醋酸-醋酸鈉(AA)體系外觀最佳，其次為琥珀酸-琥珀酸鈉(SA)和組胺酸-鹽酸(His-HCl)體系，醋酸-醋酸鈉(AA)，pH5.5、琥珀酸-琥珀酸鈉(SA)，pH6.0、檸檬酸-檸檬酸鈉(CA)，pH6.0、組胺酸-鹽酸(His)，pH6.0體系40℃ CE、IEC純度較高，綜合考慮外觀及CE、IEC 結果，LAG-3抗體Hu229-013在AA(pH5.5)、SA(pH6.0)、His-HCl(pH6.0)體系中較為穩定，見第3圖和第4圖。

(2)Hu303-005抗體的振搖外觀數據顯示，pH較低時外觀較好，緩衝體系組胺酸-鹽酸鹽(His-HCl)和醋酸-醋酸鈉(AA)較優。在40℃加速條件下CE-SDS(非還原)及iCIEF出現明顯下降，其中CE-SDS數據顯示，pH 6.0較優，緩衝體系醋酸-醋酸鈉、組胺酸-鹽酸(His-HCl)和磷酸鹽體系較優。iCE數據顯示，pH較高時中性峰下降較少，見第5圖和第6圖。綜合考慮較佳緩衝體系為10mM His-HCl pH6.0。

實施例14. LAG-3抗體製劑中輔料的篩選

(1)在含下列不同濃度表面活性劑及糖的緩衝劑中，製備蛋白濃度為50mg/mL，含10mM琥珀酸-琥珀酸鈉，pH6.0的LAG-3 Hu229-013製劑，結果見表14-1。具體如下：

1)0.1mg/mL聚山梨酯20(PS20)

2)0.1mg/mL聚山梨酯80(PS80)

3)70mg/mL蔗糖

4)70mg/mL海藻糖

5)50mg/mL甘露醇

6)50mg/mL山梨醇

(2)在含下列不同濃度表面活性劑及糖的緩衝液中，製備Hu303-005抗體濃度為50mg/mL，含10mM醋酸(鈉)，pH5.5的Hu303-005製劑，結果見第7圖和表14-2。

1)75mg/mL蔗糖+0.2mg/mL PS80

2)75mg/mL海藻糖+0.2mg/mL PS80

3)0.05mg/mL聚山梨酯20(PS20)

4)0.05mg/mL聚山梨酯80(PS80)

5)0.2mg/mL PS20

6)0.2mg/mL PS80

7)0.4mg/mL PS20

8)0.4mg/mL PS80

將每種製劑過濾灌裝，加塞，軋蓋，封口。將樣品進行40℃高溫、反復凍融、振搖等強制降解實驗，結果見表14和第7圖。

註：D表示天。

註：D表示天數。

結果表明：

(1)Hu229-013抗體製劑經振搖PS80組外觀優於PS20；凍融1次後，蔗糖組出現少量顆粒，海藻糖組出現大量顆粒；其他數據組間無差異；因此輔料較佳為聚山梨酯80和蔗糖。

(2)Hu303-005抗體製劑外觀結果顯示海藻糖略優，但 SEC結果顯示蔗糖略優，整體蔗糖與海藻糖差異不大。外觀及SEC數據顯示PS80優於PS20，增加聚山梨酯含量可明顯改善外觀及SEC穩定性，見第7圖。因此較佳為PS80，PS濃度應大於0.2mg/ml。

實施例15. LAG-3抗體穩定性評價

(1).在下列不同緩衝劑中，製備蛋白濃度為50mg/mL，含60mg/ml蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80的LAG-3抗體Hu229-013製劑：1)10mM醋酸-醋酸鈉(AA)pH5.5；2)10mM組胺酸-醋酸(His-AA)pH6.0；3)10mM組胺酸-鹽酸(His-HCl)pH6.0；4)10mM琥珀酸-琥珀酸鈉(SA)pH6.0。

(2).在下列不同緩衝液中，製備蛋白含量50mg/ml，含75mg/ml蔗糖，0.4mg/ml PS80的Hu303-005製劑：

1)10mM醋酸-醋酸鈉(AA)pH5.5

2)10mM組胺酸-鹽酸(His-HCl)pH6.0

3)10mM組胺酸-鹽酸(His-HCl)pH6.5

將每種製劑過濾灌裝，加塞，軋蓋，封口。樣品製備完成後將其分別放於25℃或4℃考察穩定性。檢測項為外觀、SEC、IEC或iCE、CE-SDS(非還原)。

註：M3.5表示3.5個月

註：M表示月，N/A表示未檢測。

結果顯示：

(1)LAG-3抗體Hu229-013在10mM AA pH5.5、10mM His-AA pH6.0體系中均較穩定。

(2)Hu303-005抗體在4℃放置3個月後，His-HCl(pH6.5)組CE略有下降，AA pH 5.5、His-HCl pH 6.5組iCE略有變化，His-HCl(pH6.0)時最為穩定。

實施例16. LAG-3抗體製劑的優化

為了進一步對緩衝劑的種類、pH、離子強度進行優化，在過固定Hu229-013抗體濃度為50mg/ml後，運用JMP軟件進行DOE實驗設計，應用RSM模型得到一系列處方，藉由強制降解方法，以IEC、CE(非還原)、微流成像(MFI)為評價指標，採用最小二乘法對結果進行統計分析，DOE 參數見表16，試驗處方及結果見表17、表18。

註：M1表示一個月，D表示天。

將各強制降解數據進行擬合，結果顯示：在10-30mM醋酸-醋酸鈉(AA)緩衝液或組胺酸-醋酸緩衝液(His-AA)，pH5.2-5.8體系中LAG-3抗體Hu229-013穩定性均較好，較佳緩衝體系為10-30mM醋酸-醋酸鈉(AA)，pH5.5。

實施例17. LAG-3抗體製劑穩定性測試

在10mM醋酸-醋酸鈉pH5.5緩衝劑中，製備蛋白濃度為60mg/mL，含60mg/ml蔗糖，0.4mg/mL聚山梨酯80的LAG-3 Hu229-013製劑：將製劑過濾灌裝，加塞，軋蓋，封口。樣品製備完成後將其放於4℃考察穩定性。檢測項為外觀、SEC、IEC、CE-SDS(非還原)。

結果顯示：4℃時該Hu229-013製劑可穩定保持9個月。

實施例18. LAG-3抗體製劑的優化

(1)Hu229-013製劑成分的優化

為了進一步對蛋白、蔗糖和聚山梨酯80濃度進行優化，設定緩衝液為10mM醋酸-醋酸鈉，pH5.5，運用JMP軟件進行DOE實驗設計，應用RSM模型得到一系列處方，藉由強制降解方法，以IEC、CE(非還原)為評價指標，採用最小二乘法對結果進行統計分析，DOE參數見表20，試驗結果見表21，統計分析結果見第8圖、第9圖和表21。

將各強制降解數據進行擬合，結果如下： 用IEC 0時與40℃數據的差值進行擬合，R²>0.98、P<0.06，模型有效，結果見第8圖。用CE純度0時與40℃數據的差值進行擬合，R²>0.99、P<0.05，模型有效，結果見第9圖。40℃ IEC擬合結果顯示較優處方為：蛋白濃度40-60mg/ml，糖濃度30-90mg/ml，PS80濃度0.4-0.5mg/ml；40℃ CE擬合結果顯示較優處方為：蛋白濃度50-80mg/ml，糖濃度30-90mg/ml，PS80濃度0.1-0.5mg/ml。因此最優範圍為：蛋白濃度50-60mg/ml，蔗糖濃度30-90mg/ml，PS80濃度0.4-0.5mg/ml。

(2).Hu303-005抗體製劑成分的優化

在固定蔗糖濃度為75mg/ml後，以10mM His緩衝液pH、蛋白濃度和聚山梨酯濃度為變量進行DOE實驗設計，應用RSM模型得到一系列處方，處方見表22，藉由強制降解方法，以iCIEF、CE(非還原)、DLS為評價指標，採用最小二乘法對結果進行統計分析，結果見表23和第10圖。

將各強制降解數據進行擬合，其中25度和40度iCIEF/CE/DLS擬合較好，模型有效，結果如第10圖所示。

結果顯示，高溫條件下，pH升高粒徑增加，中性峰也增加，iCIEF變化速度隨溫度降低而減緩，pH6.0時CE數 據最優，同時結合前期實驗結果(10mM His pH6.0較為穩定)，確定最優pH為6.0；40度CE數據顯示蛋白濃度45-60mg/ml時較優，因此最優濃度定為50mg/ml；結合各條件下聚山梨酯濃度對蛋白穩定性的影響結果及其他測試例中的聚山梨酯濃度篩選結果(濃度大於0.2mg/ml時較優)，PS80濃度定為0.3mg/ml；對於Hu303-005抗體液體製劑，在該實施例及其他實施例中，高位條件下iCIEF均出現明顯下降，考慮開發為凍乾製劑。為保證凍乾製劑較好的成型性及適宜的滲透壓，蔗糖濃度定為75mg/ml。

實施例19. LAG-3抗體製劑的凍乾

製備蛋白含量50mg/ml，10mM組胺酸-鹽酸，pH5.5或6.0，75mg/ml蔗糖，0.4mg/ml PS80的Hu303-005凍乾製劑。凍乾程序如下：

將樣品置於4℃及25℃條件考察穩定性，於不同時間點取樣，用適量注射用水複溶檢測，結果見表25和表26，結果顯示，Hu303-005製劑25℃加速及4℃長期M3各項 指標無顯著變化，穩定性良好。

同時測定了Hu229-013抗體的製劑凍乾後複溶液的穩定性，用pH5.5的含10mM醋酸-醋酸鈉的緩衝劑，製備LAG-3抗體蛋白濃度為50mg/ml，含75mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80的抗LAG-3抗體製劑。將抗體以 1.1mL/瓶填充入2mL西林瓶中，裝入凍乾箱中，凍乾。對凍乾樣品進行凍乾前後對比及穩定性考察。結果表明，Hu229-013抗體凍乾前後質量無變化，且凍乾製劑在儲存過程中穩定性良好。

實施例20. 凍乾工藝參數的優化

製備Hu303-005抗體含量為50mg/ml，10mM組胺酸-鹽酸，pH 6.0，75mg/ml蔗糖，0.4mg/ml PS80的製劑進行凍乾。藉由凍乾顯微鏡測得Hu303-005的塌陷溫度約為-19℃，一次乾燥溫度是凍乾工藝的重要參數，因此對一次乾燥過程的隔板溫度進行了細緻優化，凍乾參數見表27，結果見表28，各溫度下凍乾粉餅外觀均符合要求，但-5℃組複溶後外觀出現少量顆粒，因此一次乾燥隔板溫度定為-10℃。

最終凍乾工藝如下：

*一次乾燥及二次乾燥時間根據具體批量及壓力升測試而定。

實施例21. 其它可選擇製劑配方

本發明提供的穩定的藥物製劑還可以是任選自以下的穩定組合： (1)LAG-3抗體Hu229-013 90mg/ml，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨酯80，15mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH5.5；(2)LAG-3抗體Hu229-013 90mg/ml，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨酯80，15mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH 6.5；(3)LAG-3抗體Hu229-013 90mg/ml，50mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨酯80，25mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH 5.5；(4)LAG-3抗體Hu229-013 70mg/ml，50mg/ml蔗糖，0.3mg/ml的聚山梨酯80，10mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH 5.5；(5)LAG-3抗體Hu229-013 70mg/ml，80mg/ml蔗糖，0.3mg/ml的聚山梨酯80，15mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH 5.2；(6)LAG-3抗體Hu229-013 40mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨酯80，10mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH 6.0；(7)LAG-3抗體Hu229-013 55mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨酯80，10mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH5.7；(8)LAG-3抗體Hu229-013 30mg/ml，70mg/ml蔗糖，0.5mg/ml的聚山梨酯80，10mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH 5.5； (9)LAG-3抗體Hu229-013 20mg/ml，70mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨酯80，10mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH 5.4；(5)LAG-3抗體Hu229-013 15mg/ml，85mg/ml蔗糖，0.1mg/ml的聚山梨酯80，25mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH 5.6；(11)LAG-3抗體Hu229-013 50mg/ml，85mg/ml蔗糖，0.3mg/ml的聚山梨酯80，25mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH 5.8；(12)LAG-3抗體Hu229-013 50mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨酯80，25mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH 6.0；(13)LAG-3抗體Hu229-013 55mg/ml，90mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨酯80，10mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH 5.3；(14)LAG-3抗體Hu229-013 50mg/ml，90mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨酯80，10mM醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH 5.0；(15)LAG-3抗體Hu303-005 90mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.3mg/ml聚山梨酯80，30mM組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH6.0；(16)LAG-3抗體Hu303-005 90mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.3mg/ml聚山梨酯80，30mM組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH5.5；(17)LAG-3抗體Hu303-005 75mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.3mg/ml聚山梨酯80，30mM組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH5.0； (18)LAG-3抗體Hu303-005 1mg/ml，75mg/ml蔗糖，0.3mg/ml聚山梨酯80，5mM組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH6.0；(19)LAG-3抗體Hu303-005 70mg/ml，30mg/ml蔗糖，0.3mg/ml聚山梨酯80，5mM組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH6.0；(20)LAG-3抗體Hu303-005 50mg/ml，60mg/ml海藻糖，0.3mg/ml聚山梨酯80，10mM組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH6.0；(21)LAG-3抗體Hu303-005 50mg/ml，90mg/ml海藻糖，0.3mg/ml聚山梨酯80，10mM組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH6.0。

<210> 2

<211> 525

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 肽

<223> 全長LAG3

<400> 2

<210> 3

<211> 675

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<223> LAG-3胞外區和hIgG1 Fc的融合蛋白

<400> 3

<210> 4

<211> 677

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 肽

<223> LAG-3胞外區和mIgG2a Fc的融合蛋白

<400> 4

<210> 5

<211> 124

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb229-VH

<400> 5

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb229-VL

<400> 6

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb303-VH

<400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb303-VL

<400> 8

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb229 HCDR1

<400> 9

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb229 HCDR2

<400> 10

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb229 HCDR3

<400> 11

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb303 HCDR1

<400> 12

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb303 HCDR2

<400> 13

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb303 HCD3

<400> 14

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb229 LCDR1

<400> 15

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb229 LCDR2

<400> 16

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb229 LCDR3

<400> 17

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb303 LCDR1

<400> 18

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb303 LCDR2

<400> 19

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 鼠

<220>

<221> 結構域

<223> mAb303 LCDR3

<400> 20

<210> 21

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu229VH.1

<400> 21

<210> 22

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu229VL.1

<400> 22

<210> 23

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu229VH.1A

<400> 23

<210> 24

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu229VH.1B

<400> 24

<210> 25

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu229VH.1C

<400> 25

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu229VL.1A

<400> 26

<210> 27

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu229VL.1B

<400> 27

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu229VL.1C

<400> 28

<210> 29

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu303_VH.1

<400> 29

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu303_VL.1

<400> 30

<210> 31

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu303_VH.1A

<400> 31

<210> 32

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu303_VH.1B

<400> 32

<210> 33

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu303_VH.1C

<400> 33

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu303_VL.1A

<400> 34

<210> 35

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu303_VL.1B

<400> 35

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu303_VL.1C

<400> 36

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> Hu303_VL.1D

<400> 37

<210> 38

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> 重鏈恆定區，S228P突變。

<400> 38

<210> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 結構域

<223> kappa輕鏈恆定區

<400> 39

<210> 40

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> CHAIN

<223> Hu229-013的重鏈胺基酸序列

<400> 40

<210> 41

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> CHAIN

<223> Hu229-013的輕鏈胺基酸序列

<400> 41

<210> 42

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> CHAIN

<223> Hu303-005的重鏈胺基酸序列

<400> 42

<210> 43

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> CHAIN

<223> Hu303-005的輕鏈胺基酸序列

<400> 43

該代表圖無元件符號及其代表之意義。

Claims (26)

1. 一種醫藥組成物，其包含(a)1mg/ml至90mg/ml的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)5mM至30mM的醋酸-醋酸鈉緩衝劑或組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH為5.0-6.5，(c)60mg/ml至90mg/ml的蔗糖或海藻糖；(d)0.02mg/ml至0.8mg/ml的聚山梨酯80；其中，該抗LAG-3抗體的重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：42所示的序列，輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：43所示的序列。
2. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組成物，其中，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的濃度為40mg/ml至60mg/ml。
3. 如申請專利範圍第2項所述的醫藥組成物，其中，該抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的濃度為50mg/ml。
4. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組成物，其中，該醋酸-醋酸鈉緩衝劑或組胺酸-鹽酸緩衝劑的pH為5.0至6.0。
5. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組成物，其中，該醋酸-醋酸鈉緩衝劑或組胺酸-鹽酸緩衝劑濃度為10mM至30mM。
6. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組成物，其中，該糖為蔗糖。
7. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組成物，其中，該蔗糖或海藻糖的濃度為75mg/ml。
8. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組成物，其中，該聚山梨酯80的濃度為0.2mg/ml至0.6mg/ml。
9. 如申請專利範圍第8項所述的醫藥組成物，其中，該聚山梨酯80的濃度為0.3mg/ml至0.5mg/ml。
10. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組成物，其包含如下i)或)ii)所示的組分：i)(a)1mg/ml至90mg/ml的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)5mM至30mM的醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH為5.0-6.5，(c)60mg/ml至90mg/ml的蔗糖和(d)0.02mg/ml至0.8mg/ml的聚山梨酯80；或ii)(a)1mg/ml至90mg/ml的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)5mM至30mM的組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH為5.0-6.5，(c)60mg/ml至90mg/ml的蔗糖或海藻糖和(d)0.05mg/ml至0.6mg/ml的聚山梨酯80；其中，該抗LAG-3抗體的重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：42所示的序列，輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：43所示的序列。
11. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組成物，其包含：(e)40mg/ml至80mg/ml的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段，(f)10mM至30mM的醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH為5.2-5.8，(g)70mg/ml至80mg/ml的蔗糖和(h)0.4mg/ml至0.5mg/ml的聚山梨酯80；或該醫藥 組成物包含：(e)45mg/ml至60mg/ml的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段，(f)10mM至30mM的組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH為5.5-6.0，(g)60mg/ml至90mg/ml的蔗糖或海藻糖和(h)0.2mg/ml至0.6mg/ml的聚山梨酯80；其中，該抗LAG-3抗體的重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：42所示的序列，輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：43所示的序列。
12. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組成物，其中，該醫藥組成物包含：(i)50mg/ml的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段，(j)10mM的組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH為6.0，(k)75mg/ml的蔗糖，(l)0.3mg/ml的聚山梨酯80；其中，該抗LAG-3抗體的重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：42所示的序列，輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：43所示的序列。
13. 一種製備含抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的凍乾製劑的方法，其包括將申請專利範圍第1至12項中任一項所述的醫藥組成物經冷凍乾燥的步驟。
14. 如申請專利範圍第13項所述製備含抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的凍乾製劑的方法，其中，該冷凍乾燥依次包括預凍、一次乾燥和二次乾燥的步驟。
15. 如申請專利範圍第14項所述製備含抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的凍乾製劑的方法，其中，該一次乾燥 溫度為-5℃至-20℃。
16. 如申請專利範圍第14項所述製備含抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的凍乾製劑的方法，其中，該一次乾燥溫度為-10℃。
17. 一種含抗LAG3抗體或其抗原結合片段的凍乾製劑，其特徵在於所述凍乾製劑複溶後可形成申請專利範圍第1至12項中任一項所述的醫藥組成物。
18. 一種製備含有抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的複溶溶液的方法，其包括將申請專利範圍第17項所述的凍乾製劑經複溶的步驟。
19. 如申請專利範圍第18項所述的方法，其中，該複溶所用溶劑為注射用水。
20. 一種由申請專利範圍第18項所述的方法製備所得含有抗LAG-3抗體或其抗原結合片段的複溶溶液。
21. 如申請專利範圍第20項所述的抗LAG3抗體或其抗原結合片段的複溶溶液，其包含如下成分：i)(a)40mg/ml至80mg/ml的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)10mM至30mM的醋酸-醋酸鈉緩衝劑，pH為5.2-5.8，(c)70mg/ml至80mg/ml的蔗糖，和(d)0.4mg/ml至0.5mg/ml的聚山梨酯80；或ii)(a)45mg/ml至60mg/ml的抗LAG-3抗體或其抗原結合片段，(b)10mM至30mM的組胺酸-鹽酸緩衝劑，pH為5.5-6.0，(c)60mg/ml至90mg/ml的蔗糖或海藻糖，和(d)0.2mg/ml至0.6mg/ml的聚山梨酯 80；其中，該抗LAG-3抗體的重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：42所示的序列，輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：43所示的序列。
22. 一種申請專利範圍第1至12項中任一項所述的醫藥組成物或申請專利範圍第17項所述的凍乾製劑或申請專利範圍第20或21項所述的複溶溶液的用途，其係用作藥物。
23. 一種申請專利範圍第1至12項中任一項所述的醫藥組成物或申請專利範圍第17項所述的凍乾製劑或申請專利範圍第20或21項所述的複溶溶液的用途，其用在製備用於治療LAG-3相關的疾病或病症的藥物，其中，該疾病或病症為癌症。
24. 如申請專利範圍第23項所述的用途，其中，該癌症選自卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、腸癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、子宮癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、腦癌、睾丸癌、皮膚癌、甲狀腺癌以及血液學惡性腫瘤。
25. 如申請專利範圍第24項所述的用途，其中，該血液學惡性腫瘤包括骨髓瘤、慢性白血病和急性白血病。
26. 一種製品，其包括容器，該容器中裝有申請專利範圍第1至12項中任一項所述的醫藥組成物或申請專利範圍第17項所述的凍乾製劑或申請專利範圍第20或21項所述的複溶溶液。

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