TWI865459B - 具pH選擇性之條件活性蛋白質 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種自親本多肽產生條件活性多肽之方法，其包含以下步驟：(i)藉由將突變引入至該親本多肽中來進化該親本多肽以產生pI等於或低於該親本多肽之pI的突變多肽；(ii)使該等突變多肽經受正常生理條件下之第一分析以量測該等突變多肽在該正常生理條件下之活性，及使該等突變多肽經受在異常條件下之第二分析以量測該等突變多肽在該異常條件下之活性，其中該正常生理條件及該異常條件為相同條件但具有不同值；及(iii)自該等突變多肽中選擇該條件活性多肽，相比於在該第一分析中之相同活性，該條件活性多肽在該第二分析中表現出增加的活性。本發明亦提供條件活性多肽及用途。

Description

具pH選擇性之條件活性蛋白質

本發明係關於具有條件活性之多肽領域。特定言之，本發明係關於具有pH依賴性活性之條件活性多肽及一種自親本多肽產生條件活性多肽之方法。

存在相當多文獻描述進化蛋白質之方法，以便各種特徵(尤其酶或抗體)在不同條件下具有活性或穩定性。舉例而言，酶已經進化成在較高溫度下為穩定的。在較高溫度下存在酶活性提高之情形下，實質大部分提高可歸因於通常由Q10規則所描述之較高動力活性，其中據估計在酶的情況下，每增加10℃轉換加倍。

另外，存在使蛋白質在其正常操作條件下不穩定之自然突變，由此降低在正常操作條件下之蛋白質活性。舉例而言，存在在較低溫度下具有活性但與衍生其之野生型蛋白質相比通常處於降低水準之已知溫度突變。

將親本多肽進化成在其常用操作條件下為無活性或幾乎無活性(活性低於50%、30%或10%及尤其活性為1%)，同時保持與其在異常條件下之活性相等或更佳之活性可能需要一或多個不穩定突變與一或多個不會對抗不穩定效應之活性增加突變共存。預期該等不穩定突變將降低比由標準規則(諸如Q10)所預測之效應更大的多肽活性，因而進化在異常條件下有效運行(例如同時在其正常操作條件下為較低活性或失活)之多肽的能力能產生條件活性多肽。

期望產生作為條件活性(例如在一個條件下為較低活性或幾乎無活性及在另一條件下具有活性)之多肽。亦期望產生在某些環境中經活化或失活或隨時間推移經活化或失活之多肽。除溫度以外，多肽可進化或改善條件活性之其他條件包括pH、滲透壓、滲透壓度、氧化應激以及電解質濃度。除多肽之活性之外，常常需要在進化期間提高包括耐化學性及抗蛋白水解之其他特性。

此外，已觀察到，多肽之等電點(pI)與多肽之半衰期(t_½ )反比相關，參見Momany等人，「Relationship betweenin vivo degradative rates and isoelectric points of proteins」，PNAS ，第73卷，第3093-3097頁，1976。此對於抗體而言尤其如此，因為血漿中抗體之半衰期已與其等電點值正相關。特定言之，與具有較低pI值之抗體相比，具有較高pI值之抗體不僅具有更快的全身清除率，而且具有較低生物可用性。抗體之pI降低1至2個單位已表明與血漿清除率之降低相關(亦即較長半衰期)。參見Ryman，Pharmacometrics Syst . Pharmacol . ，第6卷，第576-588頁，2017。

已經描述用於改變多肽之pI的策略。舉例而言，美國專利第9,908,932號揭示一種轉變具有七個蛋白質亞群之重組蛋白質之等電分佈之方法，其中pI在約5.45與約6.55之間。該方法包含以下步驟：(a)將包含編碼重組蛋白質之核酸的哺乳動物細胞培養在足以產生產物之條件下的生產用生物反應器中持續第一時間段；及(b)在足以將產物之等電分佈朝向更多酸性分佈轉變之條件下培育產物第二時間段，該第二時間段由至少6個小時組成。具有經轉變等電分佈之產物展示七個蛋白質亞群中之第四及第五大部分酸性蛋白質亞群的數量增加，及七個蛋白質亞群中之第一及第二大部分鹼性蛋白質亞群的數量減少。

美國專利第9,605,061號揭示一種用於藉由引入至少6個胺基酸突變來調節抗體之pI的方法，該方法包括在選自重鏈恆定域及輕鏈恆定域中之一者或兩者的恆定域中用非天然胺基酸取代。取代胺基酸具有低於天然胺基酸之pI，使得突變型抗體之pI相對於親本抗體之pI降低至少0.5 log。

US 2009/0324589揭示一種藉由經由修飾暴露在抗體表面上之殘基來控制抗體之表面電荷從而增加血液中之IgG抗體之半衰期的方法，該等殘基包括可變區中之殘基。該方法包含以下步驟：(a)調節包含FcRn結合域之編碼親本多肽之核酸以改變暴露在親本多肽之表面上的至少一個胺基酸殘基之電荷；(b)培養宿主細胞以表現經修飾核酸從而表現突變多肽；以及(c)自宿主細胞培養物收集包含FcRn結合域之經表現突變多肽。

仍需要在特定環境及/或在特定條件下具有較高活性及/或選擇性，且在血漿中亦較佳具有增加的半衰期之條件活性多肽。亦具有增加的半衰期之條件活性多肽將不僅優先作用於存在異常條件之位置，諸如腫瘤微環境，而且由於其增加之半衰期亦提供延長作用或整體活性之增加。另外，此等條件活性多肽將潛在地對存在正常生理條件之正常組織/器官造成較小的有害副作用。減小副作用之潛力允許用條件活性多肽或更高劑量之條件活性多肽進行更長期的治療，導致更高功效。

WO 2010/104821及WO 2011/009058揭示用於進化及篩選條件活性蛋白質之方法。

在一個態樣中，本發明係關於一種自親本多肽產生條件活性多肽之方法，該方法包含以下步驟：(i)藉由將一或多個突變引入至該親本多肽中來進化該親本多肽以產生pI等於或低於該親本多肽之pI的一或多個突變多肽；(ii)使該一或多個突變多肽經受正常生理條件下之第一分析以量測該一或多個突變多肽在該正常生理條件下之活性，及使該一或多個突變多肽經受異常條件下之第二分析以量測該一或多個突變多肽在該異常條件下之活性，其中該正常生理條件及該異常條件為相同條件但具有不同值；及(iii)自該一或多個突變多肽選擇該條件活性多肽，相比於在該第一分析中之相同活性，該條件活性多肽在該第二分析中表現出增加的活性。

在前述實施例中，條件活性多肽之pI可低於親本多肽之pI。

在前述實施例中之任一者中，條件地活性多肽可具有低於7.4之pI、或低於7.3之pI、或低於7.2之pI、或低於7.1之pI或低於7.0之pI。

在前述實施例中之任一者中，一或多個突變可包含針對親本多肽中之胺基酸殘基的至少一個胺基酸殘基之胺基酸取代，該胺基酸殘基之pI比經取代至親本多肽中之胺基酸的pI高。

在前述實施例中之任一者中，一或多個突變可包含該等取代中之2、3、4、5、6、7、8、9或10個取代。

在前述實施例中之任一者中，一或多個突變可包含pI低於親本多肽之pI之胺基酸殘基的至少一個插入。

在前述實施例中之任一者中，一或多個突變可包含該等插入中之2、3、4或5個插入。

在前述實施例中之任一者中，一或多個突變可包含pI高於親本多肽之pI之胺基酸殘基的至少一個缺失。

在前述實施例中之任一者中，一或多個突變可包含該等缺失中之2、3、4或5個缺失。

在前述實施例中之任一者中，該等突變中之一或多個突變可定位於暴露在突變多肽表面上之位置中。

在前述實施例中之任一者中，進化步驟可包含將一或多個額外突變引入至突變多肽中。

前述實施例中之任一者可進一步包含步驟(ii)之前的用於確定至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%或至少98%之突變多肽之pI等於或低於親本多肽之pI的步驟。

前述實施例可進一步包含在步驟(ii)之前捨棄pI大於親本多肽之pI之突變多肽的步驟。

前述實施例中之任一者可進一步包含量測條件活性多肽之pI之步驟。

在前述實施例中之任一者中，條件活性多肽之pI可低於親本多肽之pI至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.8、或至少1.0、或至少1.2、或至少1.4、或至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.5、或至少4.0、或至少5.0個單位。

在前述實施例中之任一者中，親本多肽可係選自抗體、酶、激素、生長因子、細胞介素、調節蛋白、功能肽、生物類似物、免疫調節劑、受體及配位體。

在前述實施例中之任一者中，親本多肽可為選自全長抗體、單鏈抗體、抗體片段、重鏈、輕鏈、Fab及Fc域之抗體。

在前述實施例中之任一者中，親本多肽可為治療性抗體或研發用於醫療用途之候選抗體。

在前述實施例中之任一者中，親本多肽可為IgG抗體。

在前述實施例中之任一者中，一或多個突變可處於IgG抗體之可變區中。

在前述實施例中之任一者中，一或多個突變可處於IgG抗體之恆定區中。

在前述實施例中之任一者中，一或多個突變可處於IgG抗體之一或多個互補決定區中。

在前述實施例中之任一者中，條件可係選自pH、溫度、滲透壓、滲透壓度、氧化應激及電解質濃度。

在前述實施例中之任一者中，條件可為pH。

在前述實施例中，第一分析之pH可大於7.2至低於7.6，且第二分析之pH低於7.2或大於7.6。

在前述實施例中之任一者中，條件活性多肽在第二分析中之活性與在第一分析中之相同活性的比率可為至少1.3、或1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少3.0、或至少4.0、或至少6.0、或至少8.0、或至少10.0、或至少20.0、或至少40.0、或至少60.0或至少100.0。

在前述實施例中之任一者中，第一分析及第二分析兩者可在分子量小於900 a.m.u.、小於500 a.m.u.、小於200 a.m.u.或小於100 a.m.u.之分子或離子存在的情況下執行。

在前述實施例中，分子或離子可係選自組胺酸、組胺、氫化二磷酸腺苷、氫化三磷酸腺苷、檸檬酸鹽、碳酸氫鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、二硫化物、硫化氫、銨、磷酸二氫鹽及其任何組合。

在前述實施例中，分子或離子可為濃度在約3 mM至約200 mM、約5 mM至約150 mM、約5 mM至約100 mM、約10 mM至約100 mM、約20 mM至約100 mM、約25 mM至約100 mM、約30 mM至約100 mM、約35 mM至約100 mM、約40 mM至約100 mM或約50 mM至約100 mM之範圍內的碳酸氫根離子。

在前述實施例中，分子或離子可為濃度在1 mM至100 mM、2nM至500 nM、3 nM至200 nM、5 nM至100 nM之範圍內的二硫化物離子。

在前述實施例中之任一者中，分子或離子可係選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、二硫化鈉或二硫化鉀。

在前述實施例中之任一者中，生理條件可為正常生理pH且異常條件為與正常生理pH不同之異常pH，且分子或離子具有在正常生理pH與異常pH之間的pKa。

在前述實施例中，分子或離子之pKa可距離異常pH至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8或1.0、2.0個單位。

在一第二態樣中，本發明係關於一種衍生自具有pI之親本多肽之條件活性多肽，該條件活性多肽具有：(a)等於或低於親本多肽之pI的pI；及(b)在異常條件下之第二分析中之活性與在正常生理條件下之第一分析中的相同活性的比率為至少1.3，其中條件活性多肽之活性在至少一種分子量小於900 a.m.u.之分子或離子存在的情況下經量測。

在第二態樣中，分子量可小於500 a.m.u.、小於200 a.m.u.或小於100 a.m.u.。

在前述實施例中之任一者中，在異常條件下之第二分析中之活性與在正常生理條件下之第一分析中之相同活性的比率可為至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少3.0、或至少4.0、或至少6.0、或至少8.0、或至少10.0、或至少20.0、或至少40.0、或至少60.0、或至少100.0。

在前述實施例中之任一者中，條件活性多肽之pI可低於親本多肽之pI至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.8、或至少1.0、或至少1.2、或至少1.4、或至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.5、或至少4.0、或至少5.0個單位。

在前述實施例中之任一者中，條件活性多肽可係選自抗體、酶、激素、生長因子、細胞介素、調節蛋白、功能肽、生物類似物、免疫調節劑、受體及配位體。

在前述實施例中之任一者中，條件活性多肽可為選自全長抗體、單鏈抗體、抗體片段、重鏈、輕鏈、Fab及Fc域之抗體。

在前述實施例中，抗體可為IgG抗體。

在前述實施例中之任一者中，條件可係選自pH、溫度、滲透壓、滲透壓度、氧化應激及電解質濃度。

在前述實施例中之任一者中，正常生理條件可為在大於7.2至小於7.6範圍內之pH，且異常條件為在5.5至小於7.2範圍內之pH。

在前述實施例中，分子或離子可具有在正常生理pH與異常pH之間的pKa。

在前述實施例中，該分子或離子之該pKa可距離該異常pH至多0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8或1.0、2.0個單位。

在前述實施例中之任一者中，該分子或離子可係選自組胺酸、組胺、氫化二磷酸腺苷、氫化三磷酸腺苷、檸檬酸鹽、碳酸氫鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、二硫化物、硫化氫、銨、磷酸二氫鹽及其任何組合。

在前述實施例中之任一者中，該分子或離子可為濃度在約3 mM至約200 mM、約5 mM至約150 mM、約5 mM至約100 mM、約10 mM至約100 mM、約20 mM至約100 mM、約25 mM至約100 mM、約30 mM至約100 mM、約35 mM至約100 mM、約40 mM至約100 mM或約50 mM至約100 mM之範圍內的碳酸氫根離子。

在前述實施例中之任一者中，該分子或離子可為濃度在1 mM至100 mM、2nM至500 nM、3 nM至200 nM、5 nM至100 nM之範圍內的二硫化物離子。

在前述實施例中之任一者中，該分子或離子可係選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、二硫化鈉或二硫化鉀。

在又另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含有效量之該條件活性多肽及醫藥學上可接受之載劑。

在又另一態樣中，本發明係關於一種用於治療實體腫瘤、發炎關節或腦部疾病或病症之該條件活性多肽之用途。

在又另一態樣中，本發明係關於一種治療實體腫瘤、發炎關節或腦部疾病或病症之方法，該方法包含將該條件活性多肽投與需要該治療之患者。

定義

為了促進對本文所提供之實例的理解，本文將對某些頻繁出現之方法及/或術語加以定義。以下術語之定義以全文引用之方式併入美國專利第8,709,755 B2號：「試劑」、「不明確的基本要求」、「胺基酸」、「擴增」、「嵌合特性」、「同源」、「比較窗」、「保守胺基酸取代」、「對應於」、「降解有效」、「已確定序列構架」、「已確定序列內核」、「消化」、「定向連接」、「DNA改組」、「藥物或藥物分子」、「有效量」、「抗原決定基」、「酶」、「進化(evolution)」或「進化(evolving)」、「片段」或「衍生物」或「類似物」、「全範圍之單胺基酸取代」、「基因」、「基因不穩定性」、「異源」、「同源(homologous)」或「同源(homeologous)」、「工業應用」、「一致」或「一致性」、「一致性區域」、「經分離」、「經分離核酸」、「配位體」、「連接」、「連接基團」或「間隔基」、「微環境」、「待進化之分子特性」、「突變」、「N,N,G/T」、「正常生理條件」或「野生型操作條件」、「核酸分子」、「核酸序列編碼」或「DNA編碼序列」或「核苷酸序列編碼」、「編碼酶(蛋白質)之核酸」或「編碼酶(蛋白質)之DNA」或「編碼酶(蛋白質)之聚核苷酸」、「特異性核酸分子物種」、「將工作核酸樣本組裝至核酸庫中」、「核酸庫」、「構築」、「寡核苷酸」(或同義「寡核苷酸(oligo)」)、「同源(homologous)」、「可操作地連接」、「親本聚核苷酸組」、「患者」或「個體」、「生理條件」、「群體」、「前形式」、「偽隨機」、「準重複單位」、「隨機肽庫」、「隨機肽序列」、「受體」、「重組」酶、「合成」酶、「相關聚核苷酸」、「還原再配」、「參考序列」、「重複索引(RI)」、「限制位點」、「可選擇聚核苷酸」、「序列一致性」、「相似性」、「特異性結合」、「特異性雜交」、「特異性聚核苷酸」、「嚴格雜交條件」、「實質上一致」、「實質上純的酶」、「實質上純的」、「治療」、「可變區段」及「變異體」。

以下術語之定義以全文引用之方式併入WO 2017/078839：「大約」、「活性」、「抗體」、「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」、「抗原」或「Ag」、「反義RNA」、「生物類似物(biosimilar)」或「生物類似物(follow-on biologic)」、「生物類似物抗體」、「癌」或「癌性」、「嵌合抗原受體」或「CAR」或「CARs」、「細胞介素(cytokine)」或「細胞介素(cytokines)」、「電解質」、「全長抗體」、「成長因子」、「激素」、「免疫調節劑」、「個體(individual)」或「個體(subject)」、「庫」、「配位體」、「受體」、「微RNA」或「miRNA」、「多特異性抗體」、「奈米粒子」、「天然存在的」、「重組抗體」、「調節蛋白」、「小干擾RNA」或「siRNA」、「治療蛋白」、「治療有效量」、「腫瘤微環境」、「野生型」。

如本文所使用之術語「暴露在多肽之表面上之胺基酸殘基」係指多肽之胺基酸殘基，當多肽存在於液體(例如血液、人類血清、細胞質等)中時，該胺基酸殘基具有其與液體接觸之側鏈的至少一部分。可藉由X射線結晶學判定暴露在多肽之表面上的胺基酸殘基。可暴露在表面上之胺基酸殘基亦可例如使用自抗體之三維模型的座標，使用諸如InsightII程式(Accelrys)之電腦程式來判定。可用於此類目的之其他軟體包括例如SYBYL生物聚合物模組軟體(Tripos Associates)。當演算法需要使用者輸入大小參數時，用於計算中之探針之「大小」可設定為約1.4埃(Å)或小於半徑。舉例而言，用於使用個人電腦之軟體來判定表面暴露之胺基酸殘基及區域的方法已由Pacios (Pacios，Comput . Chem ，第18卷，第377-386頁，1994；J . Mol . Model . ，第1卷，第46-53頁，1995)描述。

術語「條件活性多肽」係指相比於親本多肽在至少一個條件(例如異常條件)下更有活性及相比於親本多肽在第二條件(例如正常生理條件)下活性較低的親本多肽之變異體或突變體，或係指在至少一個條件(例如異常條件)下比在第二條件(例如正常生理條件)下更有活性的親本多肽之變異體或突變體。在一個實施例中，條件活性多肽在第二異常條件下比在第一正常生理條件下更有活性至少1.3、或至少1.5、或至少2.0、或至少2.5、或至少3.0、或至少5.0、或至少10、或至少15、或至少20、或至少40、或至少60、或至少80或至少100倍。此條件活性多肽可在身體之一或多個所選位置中表現出活性及/或在體內之另一個位置表現出增加或降低之活性。舉例而言，在一個態樣中，條件活性多肽在體溫下幾乎無活性，但在低溫下有活性。條件活性多肽包括條件活性蛋白質、蛋白質片段、抗體、抗體片段、酶、酶片段、受體及受體片段、細胞介素及其片段、激素及其片段、配位體及其片段、調節蛋白及其片段、生長因子及其片段，以及包括應力蛋白、穹窿相關蛋白、神經元蛋白、消化道蛋白、生長因子、粒線體蛋白質、胞漿蛋白、動物蛋白、結構蛋白、植物蛋白及此等蛋白質中之任一者之片段的蛋白質。本文所描述之條件活性多肽中之各者較佳地為條件活性生物多肽。

如本文所使用之多肽之術語「血漿中之半衰期的增加」或「血漿中之半衰期的延長」係指多肽在血漿中之滯留時間增加(血漿中之半衰期(t_{1 / 2} ))，或血漿中清除率(CL)降低。此可表示為隨時間推移之濃度曲線下面積(AUC)。

如本文所使用之多肽之術語「等電點」或「pI」係指多肽不攜載淨電荷之pH。多肽之pI可以實驗方式來確定，或基於多肽之胺基酸序列來計算。舉例而言，可藉由多肽之等電聚焦電泳來確定pI，此為熟習此項技術者已知的。pI之理論計算值可基於多肽之胺基酸使用胺基酸序列分析軟體(GENETYX等)來確定。

親本多肽之術語「等電點變異體」或「pI變異體」係指與衍生突變多肽之親本多肽相比具有降低pI的親本多肽之突變多肽，，該突變多肽係經由用具有較低pI之胺基酸殘基取代具有較高pI之胺基酸殘基、使pI高於親本多肽之pI的胺基酸殘基缺失，或插入pI低於親本多肽之pI的胺基酸殘基而衍生。本發明延伸至條件活性pI變異體以及具有與親本多肽相同pI之條件活性多肽兩者。

如本文所使用之術語「親本多肽」及「親本蛋白」係指可進化以使用本文所描述之方法產生條件活性多肽之多肽或蛋白質。親本多肽可為非天然存在之蛋白質。舉例而言，治療性多肽或蛋白質或突變體或變異體多肽可用作親本多肽。親本多肽之實例包括抗體、抗體片段、酶、酶片段、細胞介素及其片段、激素及其片段、配位體及其片段、受體及其片段、調節蛋白及其片段，及生長因子及其片段。

如本文所使用之術語「pH依賴性」係指在不同pH值下具有不同特性或活性之多肽。

如本文所使用之術語「多肽」係指胺基酸聚合物，其中胺基酸經由肽或雙硫鍵連接在一起。多肽可為全長天然存在之胺基酸鏈或其片段、突變體或變異體，諸如在結合交互作用中所關注之胺基酸鏈之所選區域。多肽亦可為合成胺基酸鏈，或天然存在之胺基酸鏈或其片段與合成胺基酸鏈之組合。片段係指作為全長蛋白質之一部分的胺基酸序列，且通常長度將在約8與約500個胺基酸之間，較佳為約8至約300個胺基酸，更佳地約8至約200個胺基酸，且甚至更佳長度為約10至約50或100個胺基酸。另外，除天然存在之胺基酸以外的胺基酸(例如β-丙胺酸、苯基甘胺酸及高精胺酸)可包括於多肽中。非基因編碼之常見胺基酸亦可包括於多肽中。胺基酸可為D-或L-光學異構體中之任一者。D-異構體較佳用於下文進一步所描述之特定上下文中。另外，其他肽模擬物亦適用於例如多肽之連接序列中(參見Spatola，1983，在Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins中，Weinstein編，Marcel Dekker，New York,第267頁)。大體而言，除旨在包括包含藉由共價或非共價鍵結而固持在一起的兩個或若干多肽鏈之結構以外，術語「蛋白質」不旨在表達與術語「多肽」的任何顯著差異。

術語「小分子」係指通常分子量低於900 a.m.u.、或更佳低於500 a.m.u.或更佳低於200 a.m.u.或甚至更佳地低於100 a.m.u.之分子。相同分子量範圍適用於此等分析中所使用之離子。在本發明之分析及環境中，小分子或離子通常可以分子與分子之去質子化離子的混合物形式存在，其主要視分析或環境之pH而定。

本發明提供一種用於自親本多肽產生條件活性多肽之方法。該方法包含以下步驟：(i)藉由將一或多個突變引入至親本多肽中來進化親本多肽以產生pI等於或低於親本多肽之pI的一或多個突變多肽；(ii)使一或多個突變多肽經受正常生理條件下之第一分析以量測一或多個突變多肽在正常生理條件下之活性，及使一或多個突變多肽經受異常條件下之第二分析以量測一或多個突變多肽在異常條件下之活性，其中正常生理條件及異常條件為相同條件但具有不同值；及(iii)自一或多個突變多肽選擇條件活性多肽，相比於在正常生理條件下於第一分析中之相同活性，該條件活性多肽在異常條件下於第二分析中表現出增加的活性。 A.突變影響多肽之 pI

親本多肽可經突變以產生具有與親本多肽之pI相比相同或降低之pI的條件活性多肽。較佳地，條件活性多肽將具有與親本多肽之pI相比降低的pI。替代地，或同時，條件地活性多肽可具有低於7.4、或低於7.3、或低於7.2、或低於7.1或低於7.0之pI。此條件活性多肽亦將表現pH選擇性，亦即在需要活性之pH下比在正常生理pH下具有更高活性，該正常生理pH可在大於7.2至低於7.6之範圍內。

可使用任何適合之突變誘發技術，包括胺基酸殘基取代、缺失、插入及其組合。胺基酸殘基取代用另一個胺基酸殘基來置換親本多肽中之天然胺基酸殘基，該另一個胺基酸殘基之pI低於經置換之天然胺基酸殘基之胺基酸的pI。胺基酸之pI展示於表1中。儘管此表將胺基酸之pI展示為單個分子而非定位於多肽中之胺基酸殘基，但當多肽之部分遵循表1中胺基酸之pI的趨勢時胺基酸殘基之pI的效應。因此，舉例而言，用pI低於天然胺基酸之較高pI的胺基酸殘基置換具有較高pI之天然殘基胺基酸將降低多肽之pI。實際上，親本多肽中之天然胺基酸殘基可經pI低於天然胺基酸之pI的另一個胺基酸殘基取代。舉例而言，若天然胺基酸殘基為鹼性胺基酸殘基，則其可經弱酸性胺基酸殘基或強酸性胺基酸殘基取代，以便降低多肽之pI。在另一實例中，若天然胺基酸殘基為弱酸性胺基酸殘基，則其可經強酸性胺基殘基取代以降低多肽之pI。表 1. 胺基酸 之 pI

在一些實施例中，兩個或更多個胺基酸殘基經取代至親本多肽中以影響親本多肽之pI。舉例而言，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸殘基取代可引入至親本多肽中。在一些實施例中，各取代用具有較高pI之胺基酸殘基來取代具有較低pI之胺基酸殘基。在其他實施例中，僅一部分取代用具有較高pI之胺基酸殘基來取代具有較低pI之胺基酸殘基。在後者情況下，選擇取代之組合使得多重取代之整體效應將保持突變多肽之pI與親本多肽之pI相同，或為突變多肽提供比親本多肽之pI更低的pI。

在一些實施例中，用於影響pI之胺基酸殘基取代可為保守取代、非保守取代或其組合。

降低親本多肽之pI之胺基酸殘基缺失包括使具有比親本多肽之pI更高之pI的胺基酸殘基缺失。舉例而言，當親本多肽之pI為約7.2時，自親本多肽缺失任何一或多個鹼性胺基酸殘基將降低親本多肽之pI。在一些實施例中，至少兩個、三個、四個、五個或多於五個胺基酸殘基自親本多肽缺失。在一些實施例中，各缺失使pI低於親本多肽之pI的胺基酸殘基缺失。在其他實施例中，僅一部分缺失使pI高於親本多肽之pI的胺基酸殘基缺失。在後者情況下，選擇缺失之組合使得多重缺失之整體效應將保持或降低多肽之pI。

降低親本多肽之pI之胺基酸殘基插入包括插入pI低於親本多肽之pI的胺基酸殘基。舉例而言，當親本多肽之pI為約7.2時，將任何一或多個弱酸性胺基酸殘基或強酸性胺基酸插入至親本多肽中將導致親本多肽之pI降低。在一些實施例中，至少兩個、三個、四個、五個或多於五個胺基酸殘基插入至親本多肽中。在一些實施例中，各插入插入pI低於親本多肽之pI的胺基酸殘基。在其他實施例中，僅一部分插入插入pI低於親本多肽之pI的胺基酸殘基。在後者情況下，選擇插入組合使得多重插入之整體效應將保持或降低多肽之pI。

在一些實施例中，上述胺基酸殘基取代、胺基酸殘基缺失及胺基酸殘基插入中之兩者或多於兩者之組合用於影響親本多肽之pI。舉例而言，突變多肽可包括一或多個胺基酸殘基取代及一或多個胺基酸殘基缺失。在另一實例中，突變多肽可具有一或多個胺基酸殘基取代及一或多個胺基酸殘基插入。在又另一實例中，突變多肽可具有一或多個胺基酸殘基缺失及一或多個胺基酸殘基插入。在又其他實例中，突變多肽可皆具有一或多個胺基酸殘基取代、一或多個胺基酸殘基缺失及一或多個胺基酸殘基插入。在各情況下，所有或僅一部分插入、取代及/或缺失可使用pI低於多肽之pI或將取代之胺基酸之pI的胺基酸殘基。在各情況下，選擇插入、取代及/或缺失之組合使得多重插入、取代及/或缺失之整體效應將保持或降低多肽之pI。

所需突變多肽將具有與親本多肽之pI相同或低於其之pI。一些突變多肽將具有與親本多肽之pI相同之pI。其他突變多肽可具有低於親本多肽之pI至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.8、或至少1.0、或至少1.2、或至少1.4、或至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.5、或至少4.0、或至少5.0個單位的pI。

在一些實施例中，將取代之天然胺基酸殘基、將缺失之胺基酸殘基及/或插入胺基酸殘基之位置暴露在親本多肽之表面上。應理解，在經暴露胺基酸殘基或位置之突變具有較低機率破壞親本多肽之三維結構。

胺基酸殘基取代、插入及缺失可在編碼親本多肽之核苷酸序列上例如藉由定點突變誘發(Kunkel等人，Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:488-492 (1985))或重疊延伸PCR來執行。當親本多肽為抗體時，突變亦可藉由抗體之親和力成熟；或藉由抗體重鏈或輕鏈之鏈改組；或藉由使用噬菌體呈現庫進行基於抗原淘選之選擇(Smith等人，Methods Enzymol . 217:228-257 (1993))來達成。此等突變誘發方法可單獨執行或以適當之組合執行。

在一些其他實施例中，除相對於親本多肽之pI保持或降低pI的突變之外，突變多肽亦可在除具有經引入以保持或降低pI之突變之位置以外的位置經受額外突變誘發。額外突變誘發可使用任何已知突變誘發方法，例如已在US 2013/0116125中詳細描述之綜合位置進化、綜合位置缺失、綜合位置插入或其組合。

舉例而言，親本多肽可經突變以包括一或多個相對於親本多肽之pI保持或降低pI之胺基酸殘基取代。舉例而言，經突變多肽亦可在除具有一或多個已經引入以降低多肽之pI之突變之位置以外的位置經受綜合位置進化，包括例如綜合位置取代、綜合位置缺失及綜合位置插入。

任何多肽之pI可藉由等電聚焦凝膠電泳(例如毛細管等電聚焦凝膠電泳)或其他方法(參見例如描述於Righetti等人，Methods Biochem . Anal . 5 4:379-409，2011；Friedman等人，Methods Enzymol . 463:515-540，2009；Koshel等人，Proteomics 12:2918-2926，2012；Sommer等人，Electrophoresis 30:742-757，2009；Shimura等人，Electrophoresis 30:11-28，2009中之方法)而確定。此外，存在可基於其胺基酸序列來評估或計算多肽之pI之方法，諸如描述於Ribeiro J M. Sillero A.，Computers in Biology &Medicine 20(4):235-42，1990；Ribeiro J M. Sillero A.，Computers in Biology &Medicine 21(3):131-41，1991；以及Sillero A. Ribeiro J M.，Analytical Biochemistry 179(2):319-25，1989中之方法。

任何蛋白質(包括抗體、酶、激素、生長因子、細胞介素、調節蛋白、功能肽、生物類似物、免疫調節劑、治療蛋白、受體及配位體)可用作本發明之親本多肽。親本多肽亦可為以上蛋白質中之任一者之片段。舉例而言，親本多肽可為組織纖維蛋白溶酶原活化因子、鏈球菌激酶、尿激酶、腎素、玻尿酸酶、降血鈣素基因相關肽(CGRP)、物質P (SP)、神經肽Y (NPY)、血管活性腸肽(VTP)、升壓素或血管抑制素。另舉例而言，親本多肽可為應力蛋白、穹窿相關蛋白、神經元蛋白、消化道蛋白、生長因子、粒線體蛋白質、胞漿蛋白、動物蛋白、結構蛋白、植物蛋白或此等蛋白質中之任一者之片段。

在一個例示性實施例中，親本多肽為抗體。親本抗體可為治療性抗體，或研發用於醫療用途之候選抗體。親本抗體之實例包括利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan®，IDEC/Genentech/Roche) (參見例如美國專利第5,736,137號)，一種經審批通過以治療非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma)之嵌合抗CD20抗體；HuMax-CD20，目前由Genmab所研發之抗CD20，描述於美國專利第5,500,362號中之抗CD20抗體；AME-133 (Applied Molecular Evolution)；hA20 (Immunomedics,Inc.)；HumaLYM (Intracel)；及PRO70769 (PCT/US2003/040426，名稱為「Immunoglobulin Variants and Uses Thereof」)。多種靶向表皮生長因子受體家族成員之抗體(包括EGFR (ErbB-1)、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4))可得益於本發明之pI工程化恆定區。舉例而言，本發明之pI工程化恆定區可用於實質上類似於以下之抗體中：曲妥珠單抗(trastuzumab) (Herceptin®，Genentech)(參見例如美國專利第5,677,171號)，一種經審批通過以治療乳癌之人源化抗Her2/neu抗體；帕妥珠單抗(pertuzumab) (rhuMab-2C4，Omnitarg™)，目前由Genentech研發；抗HER2抗體，其描述於美國專利第4,753,894號中；西妥昔單抗(cetuximab) (Erbitux®，Imclone) (美國專利第4,943,533號；PCT WO 96/40210)，一種用於多種癌症之臨床試驗中之嵌合抗EGFR抗體；ABX-EGF (美國專利第6,235,883號)，目前由Abgenix-Immunex-Amgen研發；HuMax-EGFR (美國專利申請案第10/172,317號)，目前由Genmab研發；425、EMD55900、EMD62000及EMD72000 (Merck KGaA) (美國專利第5,558,864號；Murthy等人1987，Arch Biochem Biophys . 252(2):549-60；Rodeck等人，1987，J Cell Biochem . 35(4):315-20；Kettleborough等人，1991，Protein Eng. 4(7):773-83)；ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045；Modjtahedi等人，1993，J . Cell Biophys . 1993，22(1-3):129-46；Modjtahedi等人，1993，Br J Cancer . 1993，67(2):247-53；Modjtahedi等人，1996，Br J Cancer ，73(2):228-35；Modjtahedi等人，2003，Int J Cancer ，105(2):273-80)；TheraCIM hR3 (YM Biosciences，Canada and Centro de Immunologia Molecular，Cuba) (美國專利第5,891,996號；美國專利第6,506,883號；Mateo等人，1997，Immunotechnology ，3(1):71-81)；mAb-806 (Ludwig Institute for Cancer Research，Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth等人2003，Proc Natl Acad Sci USA . 100(2):639-44)；KSB-102 (KS Biomedix)；MR1-1 (WAX，National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2)；以及SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138)中。在另一較佳實施例中，本發明之pI工程化恆定區可用於阿侖單抗(alemtuzumab) (Campath®，Millenium)，一種目前批准用於治療B細胞慢性淋巴球性白血病之人源化單株抗體。本發明之工程化恆定區可用於實質上類似於其他臨床產物及候選物之多種抗體，該等抗體包括但不限於莫羅莫那-CD3 (muromonab-CD3) (Orthoclone OKT3®)，由Ortho Biotech/Johnson & Johnson研發之抗CD3抗體；替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan) (Zevalin®)，由IDEC/Schering AG研發之抗CD20抗體；吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin) (Mylotarg®)，由Celltech/Wyeth研發之抗CD33 (p67蛋白質)抗體；阿法賽特(alefacept) (Amevive®)，由Biogen研發之抗LFA-3 Fc融合物；阿昔單抗(abciximab) (ReoPro®)，由Centocor/Lilly研發；巴利昔單抗(basiliximab) (Simulect®)，由Novartis研發；帕利珠單抗(palivizumab) (Synagis®)，由MedImmune研發；英利昔單抗(infliximab) (Remicade®)，由Centocor研發之抗TNFα抗體；阿達木單抗(adalimumab) (Humira®)，由Abbott，Humicade™研發之抗TNFα抗體，由Celltech研發之抗TNFα抗體；依那西普(etanercept) (Enbrel®)，由Immunex/Amgen研發之抗TNFα Fc融合物；ABX-CBL，由Abgenix研發之抗CD147抗體；ABX-IL8，由Abgenix研發之抗IL8抗體；ABX-MA1，由Abgenix研發之抗MUC18抗體；潘妥莫單抗(Pemtumomab) (R1549，90Y-muHMFG1)，由Antisoma研發之抗MUC1；Therex (R1550)，由Antisoma研發之抗MUC1抗體；AngioMab (AS1405)，由Antisoma所研發；HuBC-1，由Antisoma所研發；Thioplatin (AS1407)，由Antisoma所研發；Antegren® (那他珠單抗(natalizumab))，由Biogen研發之抗α-4-β-1 (VLA-4)及α-4-β-7抗體；VLA-1 mAb，由Biogen研發之抗VLA-1整聯蛋白抗體；LTBR mAb，由Biogen研發之抗淋巴毒素β受體(LTBR)抗體；CAT-152，由Cambridge Antibody Technology研發之抗TGF-132抗體；J695，由Cambridge Antibody Technology及Abbott研發之抗IL-12抗體；CAT-192，由Cambridge Antibody Technology及Genzyme研發之抗TGFβ1抗體；CAT-213，由Cambridge Antibody Technology研發之抗Eotaxin1抗體；LymphoStat-B™，由Cambridge Antibody Technology及Human Genome Sciences Inc.研發之抗Blys抗體；TRAIL-R1mAb，由Cambridge Antibody Technology及Human Genome Sciences,Inc.研發之抗TRAIL-R1抗體；Avastin™ (貝伐單抗(bevacizumab)，rhuMAb-VEGF)，由Genentech研發之抗VEGF抗體，由Genentech研發之抗HER受體家族抗體；抗組織因子(ATF)，由Genentech研發之抗組織因子抗體；Xolair™ (奧馬珠單抗(Omalizumab))，由Genentech研發之抗IgE抗體；Raptiva™ (艾法珠單抗(Efalizumab))，由Genentech及Xoma研發之抗CD11a抗體；MLN-02抗體(先前LDP-02)，由Genentech及Millenium Pharmaceuticals研發；HuMax CD4，由Genmab研發之抗CD4抗體；HuMax-IL15，由Genmab及Amgen研發之抗IL15抗體；HuMax-Inflam，由Genmab及Medarex研發；HuMax-癌症，由Genmab及Medarex及Oxford GcoSciences研發之抗肝素酶I抗體；HuMax-淋巴瘤，由Genmab及Amgen研發；HuMax-TAC，由Genmab研發；IDEC-131及由IDEC Pharmaceuticals研發之抗CD40L抗體；IDEC-151 (克立昔單抗(Clenoliximab))，由IDEC Pharmaceuticals研發之抗CD4抗體；IDEC-114，由IDEC Pharmaceuticals研發之抗CD80抗體；IDEC-152，由IDEC Pharmaceuticals研發之抗CD23，由IDEC Pharmaceuticals研發之抗巨噬細胞移轉因子(MIF)抗體；BEC2，由Imclone研發之抗個體基因型抗體；IMC-1C11，由Imclone研發之抗KDR抗體；DC101，由Imclone研發之抗flk-1抗體，由Imclone研發之抗VE鈣黏素抗體；CEA-Cide™ (拉貝珠單抗(labetuzumab))，由Immunomedics研發之抗癌胚抗原(CEA)抗體；LymphoCide™ (依帕珠單抗(Epratuzumab))，由Immunomedics研發之抗CD22抗體；AFP-Cide，由Immunomedics研發；MyelomaCide，由Immunomedics研發；LkoCide，由Immunomedics研發；ProstaCide，由Immunomedics研發；MDX-010，由Medarex研發之抗CTLA4抗體；MDX-060，由Medarex研發之抗CD30抗體；MDX-070，由Medarex研發；MDX-018，由Medarex研發；Osidem™ (IDM -1)及由Medarex及Immuno-Designed Molecules研發之抗Her2抗體；HuMax™-CD4，由Medarex及Genmab研發之抗CD4抗體；HuMax-IL15，由Medarex及Genmab研發之抗IL15抗體；CNTO 148，由Medarex及Centocor/J&J研發之抗TNFα抗體；CNTO 1275，由Centocor/J&J研發之抗細胞介素抗體；MOR101及MOR102，由MorphoSys研發之抗細胞間黏附分子1 (ICAM-1) (CD54)抗體；MOR201，由MorphoSys研發之抗纖維母細胞生長因子受體3 (FGFR-3)抗體；Nuvion® (維西珠單抗(visilizumab))，由Protein Design Labs研發之抗CD3抗體；HuZAF™，由Protein Design Labs研發之抗γ干擾素抗體；抗α5β1整聯蛋白，由Protein Design Labs研發；抗IL-12，由Protein Design Labs研發；ING-1，由Xoma研發之抗Ep-CAM抗體；及MLN01，由Xoma研發之抗β2整聯蛋白抗體；pI-ADC抗體，由Seattle Genetics研發，此段落中所有以上所引用之文獻明確地以引用之方式併入本文中。

親本抗體可為全長抗體、抗體片段、單鏈抗體、Fab或Fc域。親本抗體可為IgG抗體。在若干同型抗體中，IgG抗體具有足夠較大分子量，且因此其主要代謝路徑不經由腎排泄。已知IgG抗體藉由FcRn經由補救路徑再循環，且因此具有較長的活體內半衰期。IgG抗體經假定為主要經由內皮細胞中之代謝路徑而代謝(He等人，J . Immunol . ，第160卷，第1029-1035頁，1998)。特定言之，咸信當非特異性地將IgG抗體吸收至內皮細胞中時，IgG抗體藉由結合至FcRn再循環，同時降解未結合至FcRn之IgG抗體。如例如WO2007/114319及WO2009/041643中所描述，IgG抗體之血漿半衰期與其pI反相關。

在IgG抗體中，親本抗體可為IgG1抗體，由於多種原因(包括高效應功能)，該抗體為治療性抗體之常見同型。然而，IgG1之重恆定區之pI高於IgG2之pI (8.10對比7.31)。藉由在特定位置利用胺基酸殘基取代將一些IgG2胺基酸殘基引入至IgG1主鏈中，所得IgG1之pI降低，且另外相比於親本IgG1抗體在血漿中表現出更長的半衰期。舉例而言，IgG1具有在位置137之甘胺酸，且IgG2具有在相同位置之麩胺酸(強酸性胺基酸)。用麩胺酸取代IgG1之位置137之甘胺酸將降低突變IgG1抗體之pI，其將延長IgG1抗體的半衰期。

在一些實施例中，本文所描述之用於相對於親本多肽之pI保持或降低pI之突變或突變組合中的一或多者位於抗體重鏈、抗體輕鏈中或位於抗體重鏈及抗體輕鏈兩者中。 B.抗體重鏈中之突變

在一些實施例中，本文所描述之出於保持或降低多肽之pI之目的的突變或突變組合至少在IgG抗體之重鏈之CH1區域中進行。在此等實施例中，突變可獨立地選自在CH1區之位置119、131、133、137、138、164、192、193、196、199、203、205、208、210、214、217及219之突變及在此等位置之任何突變組合。突變可藉由在此等17個位置中之一者或此等17個位置之所有可能組合及亞組合上的取代、缺失或插入來引入。舉例而言，突變型抗體可在此等17個位置中之一或多者具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個CH1取代。因此，CH1區中之任何單個突變或突變組合為可能的。此外，CH1區中之一或多個突變可視情況與CH2、CH3、鉸鏈及LC區中之任一者中的一或多個其他突變或突變組合合併。在此情況下，CH1、CH2、CH3、鉸鏈及LC區中之突變組合可經選擇以相對於親本抗體之pI降低突變型抗體之pI。

可降低重鏈之pI之適用取代包括在IgG抗體重鏈之CH1區中之位置121、124、129、132、134、126、152、155、157、159、101、161、162、165、176、177、178、190、191、194、195、197、212、216及218之一或多個位置之天冬胺酸或麩胺酸殘基的取代。

抗體重鏈之CH1區中之特定取代可包括(但不限於)位置119之非天然麩胺酸；位置131之非天然半胱胺酸；位置133之非天然精胺酸、離胺酸或麩醯胺酸；位置137之非天然麩胺酸；位置138之非天然絲胺酸；位置164之非天然麩胺酸；位置192之非天然天冬醯胺；位置193之非天然苯丙胺酸；位置196之非天然離胺酸；位置199之非天然蘇胺酸；位置203之非天然天冬胺酸；位置205之非天然麩胺酸或麩醯胺酸；位置208之非天然天冬胺酸；位置210之非天然麩胺酸或麩醯胺酸；位置214之非天然蘇胺酸；位置217之非天然精胺酸及位置219之非天然半胱胺酸及其任何組合。

在一些實施例中，突變在抗體重鏈之鉸鏈區中進行，該鉸鏈區包括在位置221、222、223、224、225、233、234、235及236處。特定言之，1、2、3、4或5個突變及尤其1、2、3、4或5個取代可在位置221至225進行。此外，涵蓋單獨或與其他區域中之其他突變一起的所有可能組合。

抗體重鏈之鉸鏈區中之特定突變可包括(但不限於)位置221之缺失、位置222之非天然纈胺酸或蘇胺酸、位置223之缺失、位置224之非天然麩胺酸、位置225之缺失、位置235之缺失、位置236之缺失或非天然丙胺酸及其任何組合。在一些情況下，僅一或多個此等突變經引入於抗體重鏈之鉸鏈區中，且在其他實施例中，此等突變中之一或多者與親本抗體之其他區中的突變中之一或多者以任何組合合併。

在一些實施例中，突變可在抗體重鏈之CH2區中進行，該CH區包括在位置274、296、300、309、320、322、326、327、334及339處。特定言之，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變可在抗體重鏈之CH2區之此等10個位置中以任何組合進行。

抗體重鏈之CH2區中之特定取代可包括(但不限於)位置274之非天然麩醯胺酸或麩胺酸、位置296之非天然苯丙胺酸、位置300之非天然苯丙胺酸、位置309之非天然纈胺酸、位置320之非天然麩胺酸、位置322之非天然麩胺酸、位置326之非天然麩胺酸、位置327之非天然甘胺酸、位置334之非天然麩胺酸、位置339之非天然蘇胺酸及此等取代之任何組合，以及與其他抗體區中之一或多個其他突變組合。

突變可獨立地選自在抗體重鏈之CH3區之位置355、359、362、384、389、392、397、418、419、444及447之突變。突變型抗體可以任何組合在CH3區中之此等位置具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個突變。另外，如本文所描述，CH3區中之任何一或多個突變可與抗體之CH2、CH1、鉸鏈及LC區中之一或多個其他突變合併。

抗體重鏈之CH3區中之特定取代可包括(但不限於)位置355之非天然麩醯胺酸或麩胺酸、位置384之非天然絲胺酸、位置392之非天然天冬醯胺或麩胺酸、位置397之非天然甲硫胺酸、位置419之非天然麩胺酸、位置359之非天然麩胺酸、位置362之非天然麩胺酸、位置389之非天然麩胺酸、位置418之非天然麩胺酸、位置444之非天然麩胺酸及位置447之非天然天冬胺酸以及此等取代中之兩者或多於兩者的任何組合。

因此，可進行以下抗體重鏈缺失或取代之所有可能，其中各突變視情況包括或排除：位置119之非天然麩胺酸；位置131之非天然半胱胺酸；位置133之非天然精胺酸、離胺酸或麩醯胺酸；位置137之非天然麩胺酸；位置138之非天然絲胺酸；位置164之非天然麩胺酸；位置192之非天然天冬醯胺位置193之非天然苯丙胺酸；位置196之非天然離胺酸；位置199之非天然蘇胺酸；位置203之非天然天冬胺酸；位置205之非天然麩胺酸或麩醯胺酸；位置208之非天然天冬胺酸；位置210之非天然麩胺酸或麩醯胺酸；位置214之非天然蘇胺酸；位置217之非天然精胺酸及位置219之非天然半胱胺酸；位置221之缺失；位置222之非天然纈胺酸或蘇胺酸；位置223之缺失；位置224之非天然麩胺酸；位置225之缺失；位置235之缺失；位置221之缺失；位置222之非天然纈胺酸或蘇胺酸；位置223之缺失；位置224之非天然麩胺酸；位置225之缺失及位置235之缺失；位置274之非天然麩醯胺酸或麩胺酸；位置296之非天然苯丙胺酸；位置300之非天然苯丙胺酸；位置309之非天然纈胺酸；位置320之非天然麩胺酸；位置322之非天然麩胺酸；位置326之非天然麩胺酸；位置327之非天然甘胺酸；位置334之非天然麩胺酸；位置339之非天然蘇胺酸；位置355之非天然麩醯胺酸或麩胺酸；位置384之非天然絲胺酸；位置392之非天然天冬醯胺或麩胺酸；位置397之非天然甲硫胺酸；位置419之非天然麩胺酸；位置359之非天然麩胺酸；位置362之非天然麩胺酸；位置389之非天然麩胺酸；位置418之非天然麩胺酸；位置444之非天然麩胺酸及位置447之非天然天冬胺酸。C. 抗體輕鏈中之突變

在一些實施例中，突變可在IgG抗體之輕鏈中。突變可位於獨立地選自輕鏈之位置126、145、152、156、169、199、202及207之位置處。抗體可在任何組合中之此等位置處的輕鏈中具有1、2、3、4、5、6、7或8個突變。另外，任何單個或輕鏈突變之組合可與上述抗體重鏈突變中之任一者或多者合併。

抗體輕鏈中之特定取代可包括(但不限於)位置126之非天然麩醯胺酸或麩胺酸；位置145之非天然麩醯胺酸、麩胺酸或蘇胺酸；位置152之非天然天冬胺酸；位置156之非天然麩胺酸；位置169之非天然麩醯胺酸或麩胺酸；位置199之非天然麩胺酸；位置202之非天然麩胺酸及位置207之非天然麩胺酸。D. 重鏈及輕鏈突變

在一些實施例中，突變型抗體可具有如上文所描述之在重鏈及輕鏈兩者中之突變。在一些實施例中，突變型抗體可具有僅在重鏈中之突變，在此情況下突變型抗體將具有親本抗體之輕鏈。在一些實施例中，突變型抗體可具有僅在輕鏈中之突變，在此情況下突變型抗體將具有親本抗體之重鏈。

因此，可進行以下突變在抗體重鏈及輕鏈中之任何可能組合，其中各突變視情況包括或排除：a)重鏈：位置119之非天然麩胺酸；位置131之非天然半胱胺酸；位置133之非天然精胺酸、離胺酸或麩醯胺酸；位置137之非天然麩胺酸；位置138之非天然絲胺酸；位置164之非天然麩胺酸；位置192之非天然天冬醯胺；位置193之非天然苯丙胺酸；位置196之非天然離胺酸；位置199之非天然蘇胺酸；位置203之非天然天冬胺酸；位置205之非天然麩胺酸或麩醯胺酸；位置208之非天然天冬胺酸；位置210之非天然麩胺酸或麩醯胺酸；位置214之非天然蘇胺酸；位置217之非天然精胺酸及位置219之非天然半胱胺酸；位置221之缺失；位置222之非天然纈胺酸或蘇胺酸；位置223之缺失；位置224之非天然麩胺酸；位置225之缺失；位置235之缺失；位置221之缺失；位置222之非天然纈胺酸或蘇胺酸；位置223之缺失；位置224之非天然麩胺酸；位置225之缺失及位置235之缺失；位置274之非天然麩醯胺酸或麩胺酸；位置296之非天然苯丙胺酸；位置300之非天然苯丙胺酸；位置309之非天然纈胺酸；位置320之非天然麩胺酸；位置322之非天然麩胺酸；位置326之非天然麩胺酸；位置327之非天然甘胺酸；位置334之非天然麩胺酸；位置339之非天然蘇胺酸；位置355之非天然麩醯胺酸或麩胺酸；位置384之非天然絲胺酸；位置392之非天然天冬醯胺或麩胺酸；位置397之非天然甲硫胺酸；位置419之非天然麩胺酸；位置359之非天然麩胺酸；位置362之非天然麩胺酸；位置389之非天然麩胺酸；位置418之非天然麩胺酸；位置444之非天然麩胺酸及位置447之缺失或非天然天冬胺酸；以及輕鏈：b) 位置126之非天然麩醯胺酸或麩胺酸；位置145之非天然麩醯胺酸、麩胺酸或蘇胺酸；位置152之非天然天冬胺酸；位置156之非天然麩胺酸；位置169之非天然麩醯胺酸或麩胺酸；位置199之非天然麩胺酸；位置202之非天然麩胺酸及位置207之非天然麩胺酸。E. 抗體之恆定區中之突變

在一些實施例中，一或多個突變可位於抗體(諸如IgG抗體)之重鏈恆定區、輕鏈恆定區或兩者中。舉例而言，在抗體之重鏈恆定區及/或輕鏈恆定區中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變。

相比於親本抗體之pI，重鏈恆定區及/或輕鏈恆定區中之突變可足以降低親本抗體之pI至少0.2、0.4、0.6、08、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0個單位。F. 親本抗體之可變區

在一些實施例中，一或多個突變位於抗體(諸如IgG抗體)之重鏈可變區、輕鏈可變區或兩者中。在一個實施例中，突變位於互補決定區(CDR)中之一或多者(例如CDR1、CDR2及CDR3中之一或多者)及/或構架區(FR)，例如抗體之重鏈及/或輕鏈之FR1、FR2、FR3及FR4中之一或多者。將突變引入至可變區中可提供相比於恆定區中之突變的優勢，因為恆定區中之突變可潛在地導致免疫原性增加。

在一個實例中，經定位之突變位於可變區內未由抗原結合遮罩之位置。未由抗原結合遮罩之位置為仍暴露在抗原結合抗體之表面上的位置。或者，可在不會實質上干擾抗原結合之位置進行突變。

用於識別CDR及FR之方法為已知的(Kabat等人，Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987)，National Institute of Health，Bethesda, Md.；Chothia等人；Nature ，第342卷，第877頁，1989)。FR中之可修飾胺基酸殘基包括經由非共價鍵直接鍵結至抗原之殘基(Amit等人，Science ，233:747-53，1986)，對CDR結構有一些影響或效應的殘基(Chothia等人，J . Mol . Biol . ，196:901-917，1987)，及涉及重鏈可變區與輕鏈可變區之間的交互作用的殘基(專利公開案EP 239400A1)。

上文所描述之突變誘發方法產生一或多個突變多肽之集合。此等突變多肽之pI可等於或低於親本多肽之pI。可使用上文所描述之各種突變誘發方法產生之一些突變多肽之pI可等於或大於親本多肽之pI。此可藉由例如由綜合位置進化、綜合位置缺失、綜合位置插入或其組合引入之額外突變所引起，此可克服出於保持或降低pI之目的而引入之突變之效應。出於此原因，在一些實施例中，本發明確定特定突變多肽或至少大部分突變多肽的pI低於親本多肽之pI。此可藉由等電聚焦凝膠電泳來實現，該等電聚焦凝膠電泳表明大部分突變多肽聚焦於pH低於親本多肽之pI的區域。舉例而言，至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%、或至少98%之突變多肽之pI可低於親本多肽的pI。

在一些實施例中，本發明視情況過濾突變多肽以排除pI等於或高於親本多肽之pI之突變多肽中的一些或全部。此等突變多肽之過濾亦可藉由等電聚焦凝膠電泳來實現，藉此聚焦於pH低於親本多肽之pI之區域的突變多肽可經收集且用於進一步處理。聚焦於pH等於或高於親本多肽之pI之區域的突變多肽可經排除。G. 篩選條件活性多肽

篩選突變多肽之條件活性。以此方式，可識別相比於親本多肽具有條件活性及較低pI之多肽。此為期望之特徵組合，尤其對於諸如治療性抗體之抗體。

用於選擇條件活性多肽之篩選突變多肽之方法已描述於WO 2017/078839中。條件活性多肽可藉由以下來選擇：相比於同一突變多肽在相對應正常生理條件下之相同活性，篩選在自正常生理條件偏離之異常條件下的增加活性，且視情況， (a)相比於在相同異常條件下之親本多肽之相同活性，篩選在自正常生理條件偏離之異常條件下之增加活性， (b)與在相同正常生理條件下之親本多肽之相同活性相比，篩選在正常生理條件下之降低活性，或 (c)上文(a)及(b)之組合。

條件活性多肽可具有選擇性，亦即在異常條件下之活性與在正常生理條件下之活性的比率為至少約1.3、或至少約1.5、或至少約1.7、或至少約2.0、或至少約3.0、或至少約4.0、或至少約6.0、或至少約8.0、或至少約10.0、或至少約20.0、或至少約40.0、或至少約60.0或至少約100.0。

異常條件及正常生理條件為相同條件之不同值。舉例而言，異常及正常生理條件可為兩種不同溫度或兩種不同pH值。條件可選自溫度、pH、滲透壓、滲透壓度、氧化應激、電解質濃度以及兩個或大於兩個此類條件之組合。

舉例而言，溫度之正常生理條件可為37.0 ℃之正常人體溫度，而溫度之異常條件可為不同於溫度37.0 ℃的溫度，諸如腫瘤微環境中之溫度可高於正常生理溫度1至2 ℃。在另一實例中，正常生理條件可為在腫瘤微環境中可發現之7.2至7.8或7.2至7.6範圍內之正常人類生理pH及諸如5.5至7.2、6至7或6.2至6.8範圍內的異常pH。

在正常生理條件及異常條件兩者下之分析可在分析培養基中執行。分析培養基可為可含有例如緩衝液以及其他組分之溶液。可用於分析培養基中之常見緩衝液包括檸檬酸鹽緩衝劑(諸如檸檬酸鈉)、磷酸鹽緩衝劑、碳酸氫鹽緩衝劑(諸如Krebs緩衝液)、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)緩衝液、漢克氏緩衝液(Hank's buffer)、Tris緩衝液、HEPES緩衝液等。可使用適用於分析之熟習此項技術者已知的其他緩衝液。此等緩衝液可用於模擬人類或動物體液(諸如血漿或淋巴液)之組合物之特徵或組分。

適用於本發明之方法的分析溶液可含有至少一種選自無機化合物、離子及有機分子之組分，較佳為通常發現於諸如人類或動物之哺乳動物之體液中的組分。此類組分之實例包括營養組分及代謝物，以及可在體液中發現之任何其他組分。本發明設想此組分可為或可不為緩衝液系統之部分。舉例而言，分析溶液可為添加碳酸氫鹽之PBS緩衝液，其中碳酸氫鹽不為PBS緩衝液之部分。或者，碳酸氫鹽為Krebs緩衝液中之組分。

組分可以實質上相同的濃度存在於兩種分析溶液中(對於第一及第二條件)，而兩種分析溶液在諸如pH、溫度、電解質濃度或滲透壓之其他態樣中不同。因此，組分用作常數，而非第一及第二條件之兩種條件，或各別正常生理條件與異常條件之間的差。

在一些實施例中，組分以接近或相同於哺乳動物(尤其在人體內)之組分之正常生理濃度的濃度存在於兩種分析溶液中。

無機化合物或離子可選自以下中之一或多者：硼酸；氯化鈣；硝酸鈣；磷酸二銨；硫酸鎂；磷酸一銨；磷酸一鉀；氯化鉀；硫酸鉀；硫酸銅；硫酸鐵；硫酸錳；硫酸鋅；硝酸鈣；鈣、銅、鐵、錳及鋅之螯合物；鉬酸銨；硫酸銨；碳酸鈣；磷酸鎂；二硫化鈉；二硫化鉀；碳酸氫鈉；碳酸氫鉀；硝酸鉀；鹽酸；二氧化碳；硫酸；磷酸；碳酸；尿酸；氯化氫；尿素；磷離子；硫離子；氯離子；鎂離子；鈉離子；鉀離子；銨離子；鐵離子；鋅離子及銅離子。

無機化合物中之一些的正常生理濃度之實例包括：2至7.0 mg/dL濃度範圍內之尿酸、8.2至11.6 mg/dL濃度範圍內之鈣離子、355至381 mg/dL濃度範圍內之氯離子、0.028至0.210 mg/dL濃度範圍內之鐵離子、12.1至25.4 mg/dL濃度範圍內之鉀離子、300至330 mg/dL濃度範圍內之鈉離子、15至30 mM濃度範圍內之碳酸、約80 μM之檸檬酸根離子、0.05至2.6 mM範圍內之組胺酸離子、0.3至1 μM範圍內之組胺、1至20 μM範圍內之HAPT離子(氫化三磷酸腺苷)及1至20 μM範圍內之HADP離子。

在一些實施例中，存在於第一條件及第二條件兩者下或各別正常生理條件及異常條件下之分析溶液中之離子係選自氫氧根離子、鹵素離子(氯、溴、碘)、鹵氧根離子、硫酸根離子、鎂離子、鈣離子、硫酸氫根離子、碳酸根離子、碳酸氫根離子、磺酸根離子、硝酸根離子、亞硝酸根離子、磷酸根離子、磷酸氫根離子、磷酸二氫根離子、過硫酸根離子、單過氧硫酸根離子、硼酸根離子、銨離子或有機離子，諸如羧酸根離子、磺酸根離子(諸如甲基硫酸鹽之有機硫酸鹽)、釩酸根離子、鎢酸根離子、硼酸根離子、有機硼酸根離子、檸檬酸根離子、草酸根離子、乙酸根離子、五硼酸根離子、組胺酸根離子及酚鹽離子。

存在於第一條件及第二條件兩者下或各別正常生理條件及異常條件之分析溶液中之有機化合物可係選自例如胺基酸及其混合物，該等胺基酸諸如組胺酸、丙胺酸、異白胺酸、精胺酸、白胺酸、天冬醯胺、離胺酸、天冬胺酸、甲硫胺酸、半胱胺酸、苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、甘胺酸、纈胺酸、吡咯離胺酸、脯胺酸、硒半胱胺酸、絲胺酸、酪胺酸。

胺基酸中之一些的正常生理濃度之實例包括：3.97±0.70 mg/dL之丙胺酸、2.34±0.62 mg/dL之精胺酸、3.41±1.39 mg/dL之麩胺酸、5.78±1.55 mg/dL之麩醯胺酸、1.77±0.26 mg/dL之甘胺酸、1.42±0.18 mg/dL之組胺酸、1.60±0.31 mg/dL之異白胺酸、1.91±0.34 mg/dL之白胺酸、2.95±0.42 mg/dL之離胺酸、0.85±0.46 mg/dL之甲硫胺酸、1.38±0.32 mg/dL之苯丙胺酸、2.02±6.45 mg/dL之蘇胺酸、1.08±0.21 mg/dL之色胺酸、1.48±0.37 mg/dL之酪胺酸及2.83±0.34mg/dL之纈胺酸。

存在於第一條件及第二條件兩者下或各別正常生理條件及異常條件下之分析溶液中之有機化合物可係選自非蛋白質含氮化合物，諸如肌酸、肌酸酐、胍基乙酸、尿酸、尿囊素、腺苷、尿素、氨及膽鹼。此等化合物中之一些的正常生理濃度之實例包括：1.07±0.76 mg/dL之肌酸、0.9至1.65 mg/dL之肌酸酐、0.26±0.24 mg/dL之胍基乙酸、4.0±2.9 mg/dL之尿酸、0.3至0.6 mg/dL之尿囊素、1.09±0.385 mg/dL之腺苷、27.1±4.5 mg/dL之尿素及0.3至1.5 mg/dL之膽鹼。

存在於正常生理條件及異常條件下之分析溶液中之有機化合物可係選自有機酸，諸如檸檬酸、α-酮基戊二酸、琥珀酸、蘋果酸、反丁烯二酸、乙醯乙酸、β-羥基丁酸、乳酸、丙酮酸、α-酮酸、乙酸及揮發性脂肪酸。此等有機酸中之一些的正常生理濃度之實例包括：2.5±1.9 mg/dL之檸檬酸、0.8 mg/dL之α-酮基戊二酸、0.5 mg/dL之琥珀酸、0.46±0.24 mg/dL之蘋果酸、0.8至2.8 mg/dL之乙醯乙酸、0.5±0.3 mg/dL之羥基丁酸、8至17 mg/dL之乳酸、1.0±0.77 mg/dL之丙酮酸、0.6至2.1 mg/dL之α-酮酸、1.8 mg/dL之揮發性脂肪酸。

存在於正常生理條件及異常條件兩者下之分析溶液中之有機化合物可係選自糖(碳水化合物)以及雙醣，該糖諸如葡萄糖、己醣、木糖、核糖、甘露糖及半乳糖，該雙醣包括乳糖、GlcNAcβ1-3Gal、Galα1-4Gal、Manα1-2Man、GalNAcβ1-3Gal及O-、N-、C-或S-醣苷。此等糖中之一些的正常生理濃度之實例包括：83±4 mg/dL之葡萄糖、102±73 mg/dL之多醣(如己醣)、77±63 mg/dL之葡糖胺、0.4至1.4 mg/dL之己醣醛酸(如葡糖醛酸)及2.55±0.37 mg/dL之戊糖。

存在於正常生理條件及異常條件兩者下之分析溶液中之有機化合物可係選自脂肪或其衍生物，諸如膽固醇、卵磷脂、腦磷脂、鞘磷脂及膽酸。此等化合物中之一些的正常生理濃度之實例包括：40至70 mg/dL之游離膽固醇、100至200 mg/dL之卵磷脂、0至30 mg/dL之腦磷脂、10至30 mg/dL之鞘磷脂及0.2至0.3 mg/dL之膽汁酸(作為膽酸)。

存在於正常生理條件及異常條件兩者下之分析溶液中之有機化合物可係選自蛋白質，諸如血纖維蛋白原、抗血友病球蛋白、免疫γ球蛋白、免疫優球蛋白、同種凝集素、β假球蛋白、醣蛋白、脂蛋白及白蛋白。舉例而言，哺乳動物血清白蛋白之正常生理濃度為3.5至5.0 g/dL。在一個實施例中，白蛋白為牛血清白蛋白。

存在於正常生理條件及異常條件兩者下之分析溶液中之有機化合物可係選自維生素，諸如維生素A、胡蘿蔔素、維生素E、抗壞血酸、硫胺素、肌醇、葉酸、生物素、泛酸、核黃素。此等維生素中之一些的正常生理濃度之實例包括：0.019至0.036 mg/dL之維生素A、0.90至1.59 mg/dL之維生素E、0.42至0.76 mg/dL之肌醇、0.00162至0.00195 mg/dL之葉酸及0.00095至0.00166 mg/dL之生物素。

分析溶液(在正常生理條件及異常條件下之兩種分析液)中之無機化合物、離子或有機分子之濃度可在人類或動物血清中之無機化合物、離子或有機分子之生理濃度的正常範圍內。然而，亦可使用正常生理範圍之外的濃度。舉例而言，人類血清中之鎂離子之正常範圍為1.7至2.2 mg/dL，且鈣為8.5至10.2 mg/dL。分析溶液中之鎂離子之濃度可為約0.17 mg/dL至約11 mg/dL。分析溶液中之鈣離子濃度可為約0.85 mg/dL至約51 mg/dL。一般情況下，分析溶液中之無機化合物、離子或有機分子之濃度可低至人類血清中之無機化合物、離子或有機分子之正常生理濃度的5%、或10%、或20%、或30%、或40%、或50%、或60%、或70%、或80%，或高至人類血清中之無機化合物、離子或有機分子之正常生理濃度的1.5倍、或2倍、或3倍、或4倍或5倍、或7倍或9倍或10倍亦或20倍。分析溶液之不同組分可以相對於其各別正常生理濃度之不同濃度水準使用。

在正常生理條件及異常條件下之分析用於量測突變多肽之活性。在分析期間，突變多肽及其結合配偶體皆存在於分析溶液中。突變多肽與其結合配偶體之間的關係可為例如抗體-抗原、配位體-受體、酶-受質或激素-受體。為了使突變多肽表現其活性，突變多肽應能夠與其結合配偶體接觸及結合。突變多肽在其結合配偶體上之活性隨後經表現出且在突變多肽與其結合配偶體結合之後經量測。

在一些實施例中，用於分析中之離子可在經篩選突變多肽與其結合配偶體(尤其包括帶電荷胺基酸殘基之彼等)之間形成橋鍵中起作用。由此，離子可能夠經由氫鍵及/或離子鍵結合至突變多肽及其結合配偶體。此可藉由允許離子到達大分子(突變多肽或其結合配偶體)可能難以到達之位點來幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合。在一些情況下，分析溶液中之離子可增加突變多肽與其結合配偶體彼此結合之機率。此外，離子可另外地或可替代地藉由結合至大分子(突變多肽或其結合配偶體)來幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合。此結合可更改大分子之構形及/或使得較大分子保持有助於與其結合配偶體結合之特定構形。

已觀察到，離子可幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合，有可能藉由與突變多肽及其結合配偶體形成離子鍵。因此，相比於無離子之相同分析，篩選可為更加高效且愈多命中(候選條件活性多肽)可經識別。適合之離子可係選自鎂離子、硫酸根離子、硫酸氫根離子、碳酸根離子、檸檬酸根離子、HAPT離子、HADP離子、碳酸氫根離子、硝酸根離子、亞硝酸根離子、磷酸根離子、磷酸氫根離子、磷酸二氫根離子、過硫酸根離子、單過氧硫酸根離子、硼酸根離子、乳酸根離子、組胺酸根離子、組胺根離子及銨離子。

已發現，在靠近離子之pKa的pH下，離子用以幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合。相對於突變多肽之大小，此類離子較佳地相對較小。

在一個實施例中，當異常條件為不同於在正常生理條件下之正常生理pH之pH時，適用於增加候選條件活性多肽之命中數之離子可係選自pKa接近在分析中待測試之異常pH的離子。舉例而言，離子之pKa可距離異常pH至多2個pH單位、距離異常pH至多1個pH單位、距離異常pH至多0.8個pH單位、距離異常pH至多0.6個pH單位、距離異常pH至多0.5個pH單位、距離異常pH至多0.4個pH單位、距離異常pH至多0.3個pH單位、距離異常pH至多0.2個pH單位或距離異常pH至多0.1個pH單位。

適用於本發明之例示性離子pKa (離子pKa在不同溫度下可略微變化)如下：銨離子具有約9.24之pKa、磷酸二氫鹽具有約7.2之pKa、乙酸具有約4.76之pKa、組胺酸具有約6.04之pKa、碳酸氫根離子具有約6.4之pKa、檸檬酸鹽具有6.4之pKa、乳酸根離子具有約3.86之pKa、組胺具有約6.9之pKa、HATP具有6.95之pKa (HATP^3- ó ATP^4- + H⁺ )及HADP具有6.88之pKa (HADP^3- ó ADP^4- + H⁺ )。

在一個實施例中，在二硫化物存在下分析且選擇條件活性多肽。二硫化物具有7.05之pKa。在一些實施例中，不同濃度之二硫化物可用於表示正常及異常生理條件之分析。替代地，正常生理條件及異常條件下之分析培養基具有大致相同之二硫化物濃度，且亦在特定條件值中具有一些偏差，例如分析可在不同pH下進行。待用於分析中之二硫化物濃度可為1 mM至100 mM。較佳地，分析培養基具有2至500 nM、或3至200 nM或5至100 nM之二硫化物濃度。在一些態樣中，二硫化物濃度可為1 mM至20 mM，或2 mM至10 mM。在二硫化物存在之情況下所進行之分析為已知的。

在某些實施例中，一旦異常條件下之pH (亦即異常pH)為已知的，則適用於增加候選條件活性多肽之命中的離子可係選自pKa處於或接近異常pH的離子，例如候選離子可具有距離異常pH至多4個pH單位、距離異常pH至多3個pH單位、距離異常pH至多2個pH單位、距離異常pH至多1個pH單位、距離異常pH至多0.8個pH單位、距離異常pH至多0.6個pH單位、距離異常pH至多0.5個pH單位、距離異常pH至多0.4個pH單位、距離異常pH至多0.3個pH單位、距離異常pH至多0.2個pH單位或距離異常pH至多0.1個pH單位之pKa。

如上文所陳述，在處於或接近離子pKa之pH下，離子最有效地幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合。舉例而言，已發現，在pH 7.2至7.6下之分析溶液中，碳酸氫根離子(具有約6.4之pKa)不會非常有效地幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合。隨著分析溶液中之pH降低至6.7且進一步降低至約6.0，碳酸氫根離子變得愈加有效地幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合。因此，相比於在pH 7.2至7.6下之分析，在pH 6.0下之分析中愈多命中可經識別。類似地，組胺酸在pH 7.4下不會非常有效地幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合。隨著分析溶液之pH降低至6.7且進一步降低至約6.0，組胺酸變得愈加有效地幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合，例如亦允許在約6.2至6.4範圍內之pH下識別更多命中。

已發現，當正常生理條件(亦即正常生理pH)及異常條件(亦即異常pH)下之分析溶液之pH不同時，具有在約正常生理pH及異常pH之中點至約異常pH範圍內之pKa的離子可極大地幫助所篩選之突變多肽與其結合配偶體之間的結合。因此，篩選分析更加高效地發現更多命中或在異常條件下具有高活性之候選條件多肽。

在一些實施例中，pKa甚至可距離異常pH之至少一個pH單位。當異常pH為酸性pH時，適合離子之pKa可在(異常pH -1)至異常pH與正常生理pH之間的中點範圍內。當異常pH為鹼性pH時，適合離子之pKa可在(異常pH+1)至異常pH與正常生理pH之間的中點範圍內。離子可係選自描述於本申請中之彼等離子。然而，亦可使用更多本申請案中尚未明確描述之離子。應理解，一旦選擇異常pH及正常生理pH用於篩選分析，則熟習此項技術者可使用本文所描述之導引原理來選擇任何具有適合pKa之離子，用於增加在異常條件下識別更多具有高活性之命中的篩選效率。

舉例而言，當異常pH為8.4且正常生理pH為7.4時，對於例示性篩選，任何具有在約7.9 (中點)至9.4 (亦即8.4+1)範圍內之pKa的離子可用於篩選。一些具有此範圍中之pKa的離子包括衍生自麥黃酮(pKa 8.05)、肼(pKa 8.1)、二甘胺酸(pKa 8.26)、N-(2-羥基乙基)哌嗪-N'-(4-丁磺酸) (pKa 8.3)、N-參[羥基甲基]甲基-3-胺基丙烷磺酸(pKa 8.4)、牛磺酸(pKa 9.06)之離子。另舉例而言，當異常pH為6且正常生理pH為7.4時，對於例示性篩選，任何具有在約5 (亦即6-1)至6.7 (中點)範圍內之pKa的離子可用於篩選。一些具有此範圍中之pKa的離子包括衍生自蘋果酸鹽(pKa 5.13)、吡啶(pKa 5.23)、哌嗪(pKa 5.33)、二甲胂酸鹽(pKa 6.27)、琥珀酸(pKa 5.64)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(pKa 6.10)、檸檬酸鹽(pKa 6.4)、組胺酸(6.04)及bis-tris (6.46)之離子。熟習此項技術者將能夠查閱大量化學手冊及課本以識別可轉化為具有屬於該等範圍中之pKa之離子的已知化學化合物，包括化學無機化合物及有機化學化合物。在具有適合pKa之化學化合物中，具有較小分子量之化學化合物可為較佳的。

因此，本發明未預期地發現最終經識別之條件活性多肽之生產不僅取決於產生正確的多肽突變體，而且取決於在分析溶液中使用具有適合pKa之離子。本發明設想除產生突變多肽之較大文庫之外(例如經由CPE及CPS)，亦應努力尋找用於分析溶液中之適合離子(具有適當pKa)，此係因為離子可有助於有效地自較大文庫選擇具有高活性之突變體。進一步設想，在無適合離子之情況下，篩選為不太高效的且發現具有高活性之突變體之機率降低。因此，在無適合離子之情況下可能需要多重回合之篩選以達成相同數目之具有高活性的突變體。

分析溶液中之離子可由分析溶液之組分原位形成或直接包括於分析溶液中。舉例而言，來自空氣之CO₂ 可溶解於分析溶液中以提供碳酸根及碳酸氫根離子。另舉例而言，磷酸二氫鈉可添加至分析溶液中以提供磷酸二氫根離子。

分析溶液中之此組分之濃度(用於在正常生理條件下之分析及在異常條件下之分析)可與通常在哺乳動物(諸如人類)之天然存在之體液中發現之相同組分的濃度相同或實質上相同。在其他實施例中，組分之濃度可為較高的，尤其當組分為可用以幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合之離子時，此係因為已觀察到，較高濃度之此類離子可與突變多肽及其結合配偶體形成離子鍵，實際上有助於結合及增加發現更多命中或候選條件活性多肽之機率。

在一些實施例中，分析溶液中之離子之濃度可與使用分析發現更多命中之機率正相關，尤其當使用超過正常生理濃度之濃度時。舉例而言，人類血清具有約15至30 mM之碳酸氫根離子的濃度。在一個實例中，隨著分析溶液中之碳酸氫根離子之濃度自3 mM增加至10 mM、至20 mM、至30 mM、至50 mM及至100 mM，分析中之命中數目亦隨碳酸氫根濃度之每次增加而增加。考慮到此情況，分析溶液可使用在約3 mM至約200 mM、或約5 mM至約150 mM或約5 mM至約100 mM、或約10 mM至約100 mM或約20 mM至約100 mM或約25 mM至約100 mM或約30 mM至約100 mM或約35 mM至約100 mM或約40 mM至約100 mM或約50 mM至約100 mM之範圍內的碳酸氫根濃度。

在另一實施例中，分析溶液中之檸檬酸鹽濃度可為約30 μM至約120 μM、或約40 μM至約110 μM、或約50 μM至約110 μM、或約60 μM至約100 μM。

在一個實施例中，正常生理條件為在7.2至7.6範圍內之正常生理pH，且異常條件為在5.5至7.2、6至7或6.2至6.8範圍內之異常pH。在正常生理條件下之用於分析之分析溶液具有正常生理pH及50 mM之碳酸氫根離子。在異常條件下之用於分析之分析溶液具有異常pH及50 mM之碳酸氫根離子。因為碳酸氫根離子之pKa為約6.4，所以碳酸氫根離子可在6.0至6.4之異常pH (諸如pH 6.0或6.2)下幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合。

在又一實施例中，正常生理條件為在7.2至7.6的範圍內之正常生理pH，且異常條件為在5.5至7.2、6至7或6.2至6.8範圍內之異常pH。在正常生理條件下之用於分析之分析溶液具有正常生理pH及80 μM之檸檬酸根離子。在異常條件下之用於分析之分析溶液具有異常pH及80 μM之檸檬酸根離子。因為檸檬酸根離子具有6.4之pKa，所以檸檬酸根離子可在具有pH 6.0至6.4之異常條件下之分析溶液中有效地幫助突變多肽與結合配偶體之間的結合。因此可識別更多候選條件活性多肽，其在pH 6.0至6.4之條件下具有較高結合活性，且在7.2至7.8之pH條件下具有較低活性。其他離子(包括乙酸根、組胺酸根、碳酸氫根、HATP及HADP)以相似方式起作用，使得含有離子之分析溶液能夠有效地篩選在約為離子之pKa之pH下具有較高結合活性及在不同於離子之pKa的pH (例如正常生理pH)下具有較低結合活性之突變多肽。

在又一實施例中，正常生理條件為37℃之正常生理溫度，且異常條件為38至39℃之異常溫度(一些腫瘤微環境中之溫度)。在正常生理條件下之用於分析之分析溶液具有正常生理溫度及20 mM之碳酸氫根離子。在異常條件下之用於分析之分析溶液具有異常溫度及20 mM之碳酸氫根離子。

在又一實施例中，正常生理條件為在正常人類血清中之電解質之特定濃度，且異常條件為相同電解質在不同異常濃度下之濃度，該異常濃度可存在於動物或人類中之不同部位或可由改變人類血清中之電解質之正常生理濃度之動物或人類條件所造成。

突變多肽及/或其結合配偶體之間的結合亦可以大量其他方式受到影響。通常，此影響將藉由在分析溶液中包括一或多個額外組分來施加。此等額外組分可經設計成與突變多肽、結合配偶體或兩者交互作用。另外，此等額外組分可使用兩種或大於兩種交互作用之組合以及兩種或大於兩種類型交互作用之組合以影響結合。

在一個實施例中，所關注之結合交互作用處於抗體與抗原之間。在此實施例中，一或多個額外組分可包括於分析溶液中以對抗體、抗原或兩者施加影響。以此方式，所需結合交互作用可經增強。

除可與突變多肽及/或其結合配偶體形成離子鍵以幫助突變多肽與結合配偶體之間的結合之離子之外，本發明亦包括可用以幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合之其他組分。在一個實施例中，使用可與突變多肽及/或其結合配偶體形成氫鍵的分子。在另一實施例中，可使用能夠與突變多肽及/或其結合配偶體進行疏水性交互作用之分子。在又一實施例中，涵蓋能夠與突變多肽及/或其結合配偶體進行凡得瓦(Van der Waals)交互作用之分子。

氫鍵為共價鍵結於負電性原子(諸如碳、氮、氧、硫、氯或氟) (氫鍵供體)之氫與電子供體原子(諸如氮、氧、硫、氯或氟) (氫鍵受體)之非共享電子對之間相對弱的非共價交互作用。

能夠與突變多肽及/或其結合配偶體形成氫鍵之組分包括有機分子以及具有極性鍵之無機分子。突變多肽及/或用於突變多肽之結合配偶體通常含有可形成氫鍵之胺基酸。適合之胺基酸具有能夠形成氫鍵之帶有極性基之側鏈。適合之胺基酸之非限制性實例包括麩醯胺酸(Gln)、麩胺酸(Glu)、精胺酸(Arg)、天冬醯胺(Asn)、天冬胺酸(Asp)、離胺酸(Lys)、組胺酸(His)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、酪胺酸(Tyr)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)及色胺酸(Trp)。

此等胺基酸可充當氫供體及氫受體。舉例而言，諸如可在Ser、Thr及Tyr中發現之-OH基團中之氧原子、諸如可在Glu及ASP中發現之-C=O基團中之氧原子、諸如可在Cys及Met中發現之-SH基團或-SC-中之硫原子、諸如可在Lys及Arg中發現之-NH₃ ⁺ 基團中之氮原子及諸如可在Trp、His及Arg中發現之-NH-基團中之氮原子皆可充當氫受體。另外，此列表中之包括氫原子之基團(例如-OH、-SH、NH₃ ⁺ 及-NH-)可充當氫供體。

在一些實施例中，突變多肽及/或其結合配偶體之主鏈亦可參與形成一或多個氫鍵。舉例而言，主鏈可具有諸如在肽鍵中之-(C=O)-NH-之重複結構。在此結構中之氧及氮原子可充當氫受體，而氫原子可參與氫鍵。

具有至少一個包含可用於氫鍵之氫或氧原子之極性鍵的無機化合物可包括例如H₂ O、NH₃ 、H₂ O₂ 、肼、碳酸鹽、硫酸鹽及磷酸鹽。有機化合物，諸如醇；酚；硫醇；脂族、胺、醯胺；環氧化物、羧酸；酮、醛、醚、酯、有機氯化物及有機氟化物。可形成氫鍵之化合物在化學文獻中為已知的，諸如在例如「The Nature of the Chemical Bond」，由Linus Pauling，Cornell University Press，1940，第284至334頁中所論述之彼等化合物。

在一些實施例中，醇可包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、戊醇、l-己醇、2-辛醇、l-環己醇及高級醇；二醇，諸如乙二醇、丙二醇、甘油、二甘醇及聚伸烷二醇。適合之酚包括對苯二酚；間苯二酚；兒茶酚；苯酚；鄰、間及對甲酚；瑞香草酚；α-及β-萘酚；連苯三酚；愈創木酚及間苯三酚。適合之硫醇包括甲硫醇、乙硫醇、1-丙硫醇、2-丙硫醇、丁硫醇、第三丁基硫醇、戊硫醇、己硫醇、硫酚、二巰基丁二酸、2-巰基乙醇及2-巰基吲哚。適合之胺包括甲胺；乙胺；丙胺；異丙胺；苯胺；二甲胺及甲基乙基胺；三甲胺；氮丙啶；哌啶；N-甲基哌啶；聯苯胺；環己胺；乙二胺；己二胺；鄰、間及對甲苯胺及N-苯基哌啶。適合之醯胺包括乙醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基甲氧基乙醯胺及N-甲基-N-對氰乙基甲醯胺。環氧化物可包括環氧乙烷、環氧丙烷、第三丁基過氧化氫物、氧化苯乙烯、環氧縮水甘油、氧化環己烯、二第三丁基過氧化物、氫過氧化異丙苯或氫過氧化乙苯、環氧異丁烷及1,2-環氧辛烷。羧酸可包括對苯二甲酸；間苯二甲酸；鄰苯二甲酸；水楊酸；苯甲酸；乙酸；月桂酸；己二酸；乳酸；檸檬酸；丙烯酸；甘胺酸；六氫苯甲酸；鄰、間及對甲苯甲酸；菸鹼酸；異菸酸及對胺基苯甲酸。酮可包括丙酮、3-丙酮、丁酮、戊酮、甲乙酮、二異丁酮、乙基丁基酮、甲基異丁基酮、甲基第三丁基酮、環己酮、丙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、甲基丁基酮、甲基戊基酮、甲基己基酮、二乙基酮、乙基丁基酮、二丙基酮、二異丁基酮、二丙酮醇、佛爾酮、異佛爾酮、環己酮、甲基環己酮及苯乙酮。醛可包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、苯甲醛、桂皮醛、異丁醛、戊醛、辛醛、苯甲醛、環己酮、水楊醛及糠醛。酯包括乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸丁酯、甲酸戊酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、乙酸甲酯異戊酯、乙酸甲氧基丁酯、乙酸己酯、乙酸環己酯、乙酸苄酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丙酸戊酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯、丁酸戊酯、乙醯乙酸甲酯及乙醯乙酸乙酯。可用於本發明中之醚包括二甲醚、甲基乙基醚、二乙醚、甲基丙基醚及二甲氧乙烷。醚可為環狀，諸如環氧乙烷、四氫呋喃及二噁烷。

有機氯化物包括氯仿、五氯乙烷、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、四氯甲烷、四氯乙烷、五氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯及二氯乙烯。有機氟化物可包括氟甲烷、二氟甲烷、三氟甲烷、三氟乙烷、四氟乙烷、五氟乙烷、二氟丙烷、三氟丙烷、四氟丙烷、五氟丙烷、六氟丙烷及七氟丙烷。

氫鍵可由鍵之強度劃分：強、中或弱氫鍵(Jeffrey，George A.；An introduction to hydrogen bonding，Oxford University Press，1997)。強氫鍵具有2.2至2.5 Å之供體-受體距離及在14至40 kcal/mol範圍內之能量。中氫鍵具有2.5至3.2 Å之供體-受體距離及在4至15 kcal/mol範圍內之能量。弱氫鍵具有3.2至4.0 Å之供體-受體距離及在＜ 4 kcal/mol範圍內之能量。具有能階之氫鍵之一些實例為F−H…:F (38.6 kcal/mol)、O−H…:N (6.9 kcal/mol)、O−H…:O (5.0 kcal/mol)、N−H…:N (3.1 kcal/mol)及N−H…:O (1.9 kcal/mol)。更多參見Perrin等人「Strong」hydrogen bonds in chemistry and biology，Annual Review of Physical Chemistry ，第48卷，第511-544頁，1997；Guthrie，「Short strong hydrogen bonds:can they explain enzymic catalysis?」Chemistry & Biology 1996年3月，3:163-170。

在一些實施例中，本發明中所使用之組分可與突變多肽及/或其結合配偶體形成強氫鍵。此等組分傾向於具有帶有強負電性之原子。已知具有最強負電性之原子以此次序為F ＞ O ＞ Cl ＞ N。因此，本發明較佳地使用包括氟、羥基或羰基之有機化合物來形成氫鍵。在一個實施例中，有機氟可用於本發明中以形成強氫鍵。

在另一實施例中，可使用能夠與突變多肽及/或其結合配偶體進行疏水性交互作用之組分。此類組分包括具有疏水性基團之有機化合物。

疏水性交互作用為疏水性化合物或化合物之疏水域與另一個疏水性化合物或其他化合物之疏水域之間的可逆吸引交互作用。此類型交互作用已描述於「Hydrophobic Interactions」，A. Ben-Nairn (1980)，Plenum Press，New York中。

疏水性材料由於其非極性本質而受水分子排斥。當水溶液中之相對非極性分子或基團與其他非極性分子或基團而非水結合時，此稱為「疏水性交互作用」。

突變多肽及其結合配偶體通常包括能夠進行疏水性交互作用之胺基酸。胺基酸將通常表徵為具有至少一個帶有能夠進行疏水性交互作用之非極性基團的側鏈。疏水性胺基酸包括例如丙胺酸(Ala)、異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、苯丙胺酸(Phe)、纈胺酸(Val)、脯胺酸(Pro)、甘胺酸(Gly)，較小程度上包括甲硫胺酸(Met)及色胺酸(Trp)。

能夠與突變多肽及/或其結合配偶體進行疏水性交互作用之組分包括作為疏水性分子或含有至少一個疏水性部分之分子的有機化合物。在一些實施例中，此等疏水性組分可為選自芳族烴、經取代之芳族烴、聚芳族烴、芳族或非芳族雜環、環烷烴、烷烴、烯烴及炔烴之烴。疏水性基團可包括芳族基團、烷基、環烷基、烯基及炔基。如本文所使用之術語「烷基」、「烯基」及「炔基」係指具有一至三十個碳原子之不飽和脂族基，包括直鏈烯基/炔基、分支鏈烯基/炔基、環烯基(脂環)、經烷基取代之環烷基及經環烷基取代之烯基/炔基。此類烴部分亦可在一或多個碳原子上經取代。

可理解，疏水性交互作用之強度係基於可彼此交互作用之「疏水物」的可用量。因此，可藉由例如增加涉及疏水性交互作用之分子中之疏水性部分的量及/或「疏水性」性質來調節疏水性交互作用。舉例而言，疏水性部分在其原始形式中可包括烴鏈，可藉由將疏水性側鏈附接至其碳主鏈之碳中之一者而經改質，以增加其疏水性(增加該部分所涉及之疏水性交互作用之強度的能力)。在一較佳實施例中，此可包括各種多環化合物之附接，包括例如各種甾族化合物及/或其衍生物，諸如固醇類型化合物，更特定而言膽固醇。大體而言，側鏈可為直鏈、芳族、脂族、環狀、多環或由熟習此項技術者所設想之任何各種其他類型的疏水性側鏈。

能夠與突變多肽及/或其結合配偶體進行凡得瓦交互作用之組分類型通常但不始終為具有極性部分之化合物。如本文中所使用，「凡得瓦交互作用」係指原子、部分、分子及表面之間的吸引力，該吸引力由於量子機構動力學所導致之偶極子-偶極子交互作用及/或附近原子、部分、分子之波動極化中的相關性所引起。

本發明中之凡得瓦交互作用為突變多肽或結合配偶體與組分之間的吸引力。凡得瓦交互作用可產生於三個來源。首先，儘管一些分子/部分為電中性，但可為永久性電偶極子。由於一些分子/部分之結構中之電子電荷分佈的固定畸變，分子/部分之一側始終為略微陽性而相對側略微陰性。此類永久性偶極子彼此對準之傾向產生淨吸引力。此為兩種永久性偶極子之間的交互作用(基桑力(Keesom force))。

其次，作為永久性偶極子之分子的存在可暫時使在其他附近極性或非極性分子中之電子電荷畸變，由此誘發進一步極化。額外吸引力由永久性偶極子與相鄰感應偶極子的交互作用而產生。此為永久性偶極子與相對應感應偶極子之間的交互作用，可稱為德拜(Debye)力。第三，即使無所涉及分子為永久性偶極子(例如有機液態苯)，但吸引力存在於分子中具有兩種瞬時感應偶極子之分子間。此為兩種瞬時感應偶極子之間的交互作用，可稱為倫敦分散力(London dispersion force)。

在能夠進行凡得瓦交互作用之突變多肽及/或結合配偶體中存在許多胺基酸。此等胺基酸可具有極性側鏈，包括麩醯胺酸(Gln)、天冬醯胺(Asn)、組胺酸(His)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、酪胺酸(Tyr)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、色胺酸(Trp)。此等胺基酸亦可具有帶有非極性基團之側鏈，包括丙胺酸(Ala)、異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、苯丙胺酸(Phe)、纈胺酸(Val)、脯胺酸(Pro)、甘胺酸(Gly)。

能夠與突變多肽及/或其結合配偶體進行凡得瓦交互作用之組分包括可溶於分析溶液中之極性或非極性無機化合物。分析溶液通常為水溶液，且因此此等極性或非極性無機化合物較佳地可溶於水。用於凡得瓦交互作用之較佳材料為彼等極性材料，使得其能夠進行偶極子-偶極子交互作用。舉例而言，AlF₃ 具有極性AL-F鍵且可溶於水(在20℃下約0.67g/100ml水)。HgCl₂ 具有極性Hg-Cl鍵且在20℃下可以7.4 g/100ml溶於水中。PrCl₂ 具有極性Pr-Cl鍵且在20℃下可以約1g/100ml溶於水中。

能夠進行凡得瓦交互作用之適合極性化合物包括醇、硫醇、酮、胺、醯胺、酯、醚及醛。上文已結合氫鍵描述此等化合物之適合實例。能夠進行凡得瓦交互作用之適合非極性化合物包括芳族烴、經取代之芳族烴、聚芳族烴、芳族或非芳族雜環、環烷烴、烷烴、烯烴、炔烴。

可使用氫鍵組分、疏水性組分及凡得瓦組分來以多種方式影響突變多肽及其結合配偶體之結合。在一個實施例中，氫鍵、疏水性交互作用及/或凡得瓦交互作用可在突變多肽與其結合配偶體之間形成橋鍵。此種橋鍵可使得突變多肽及結合配偶體彼此更接近以有助於結合之方式將突變多肽及/或結合配偶體相對於彼此結合及/或定位。

在另一實施例中，藉由例如使多肽及結合配偶體以增加結合機率之方式彼此組合或結合，氫鍵及/或疏水性交互作用可增加突變多肽結合至其結合配偶體之機率。因此，此等交互作用中之一或多者可單獨或以組合形式使用以使突變多肽及結合配偶體更近地組合在一起，或以有助於結合之方式佈置突變多肽及結合配偶體，例如藉由使結合位更近地拉伸在一起或使分子之非結合部分佈置得更遠離彼此，由此允許結合位更靠近彼此定位。

在又一實施例中，氫鍵及/或疏水性相互作用可影響突變多肽及/或其結合配偶體之構形以提供更有利於突變多肽與其結合配偶體結合的構形。特定言之，與突變多肽及/或結合配偶體之胺基酸中之一或多者結合或交互作用可在突變多肽或結合配偶體中產生一或多個有利於突變多肽/結合配偶體結合反應之構形變化。

本發明進行兩對分析，一對分析尋找當與在正常生理條件下衍生突變多肽之親本多肽相比時在該正常生理條件下之分析中之突變多肽之活性的降低，及第二對分析尋找當與在異常條件下衍生突變多肽之親本多肽相比時在該異常條件下之分析中之突變多肽活性的增加。描述於WO 2017/078839中之實例說明選擇條件活性多肽，該條件活性多肽在需要活性之異常pH下比在正常生理pH下更有活性。

在一個實施例中，突變多肽經受在正常生理條件下之分析及在異常條件下之分析。條件活性多肽係選自突變多肽，與在正常生理條件下之分析中之突變多肽的相同活性相比，該突變多肽在異常條件下之分析中之活性增加。

用於本發明之分析對中之條件可係選自溫度、pH、滲透壓、滲透壓度、氧化應激、電解質濃度及分析溶液或培養基之任何其他組分之濃度。因此，分析培養基之特定組分可以實質上相同的濃度用於兩對分析中。在此情況下，通常存在用於模擬人類或動物中之特定環境(諸如血清、腫瘤微環境、滑膜環境、類神經環境或在投藥點可遇到、投與治療可經由或在治療點可遇到之任何其他環境)的組分。選擇一或多種模擬此等環境之組分的一個重要態樣為使用分析對可改善所執行之選擇過程之結果。舉例而言，模擬特定環境允許在選擇過程中評估彼環境之特定組分對突變多肽之各種影響。特定環境之組分可例如更改突變多肽或與突變多肽結合，抑制突變多肽之活性，使突變多肽不活化等。

在一些實施例中，分析溶液之一或多種組分較佳為小分子或離子，諸如二硫化物、硫化氫、組胺酸、組胺、檸檬酸鹽、碳酸氫鹽、乳酸鹽及乙酸鹽。在一個實施例中，小分子或離子組分較佳地以約100 µm至約100 mM、或更佳地約0.5至約50 mM或約1至約10 mM之濃度存在於分析溶液中。

分析溶液中之組分之濃度可與通常在哺乳動物(諸如人類)之天然存在之體液中發現的相同組分之濃度相同或實質上相同。此可稱為體液中之組分之正常生理濃度。在其他實施例中，分析溶液中之特定組分之濃度可低於或大於通常在哺乳動物(諸如人類)之天然存在之體液中發現的相同組分之濃度。

在另一實施例中，組分可以實質上不同的濃度存在於分析對中之各者中。在此情況下，組分之存在、不存在或濃度變成將分析之條件，此係因為組分之濃度為區分用於在正常生理條件下分析之分析溶液與用於在異常條件下分析之分析溶液之間的條件。因此，藉由本發明之方法之此實施例所產生的條件活性多肽將選擇至少部分取決於組分之濃度的活性。

在一些實施例中，組分可存在於一對分析溶液中，但在另一對分析溶液中完全不存在。舉例而言，異常條件下之分析溶液中之乳酸鹽濃度可設定為模擬腫瘤微環境中之乳酸鹽濃度之水準。乳酸鹽可不存在於正常生理條件下之該對分析溶液中。

在一個實施例中，正常生理條件為表示正常生理條件之第一乳酸鹽濃度，且異常條件為表示存在於體內特定位置中之異常條件的第二乳酸鹽濃度。

在另一實例中，葡萄糖可不存在於異常條件下之分析溶液中，以模擬可在腫瘤微環境中發現之葡萄糖之缺失，同時葡萄糖可設定為模擬在正常生理條件下之一對分析溶液中之血漿葡萄糖濃度的水準。此特徵可用於將條件活性多肽較佳遞送至輸送中無活性或活性極低之位置或環境，及當其到達異常條件下之分析溶液中之組分濃度存在之環境時，活化條件活性多肽。

舉例而言，與人類血清相比，腫瘤微環境通常具有較低葡萄糖濃度及較高乳酸鹽濃度。血清中之葡萄糖之正常生理濃度在約2.5 mM至約10 mM範圍內。另一方面，在腫瘤微環境中，葡萄糖濃度在0.05 mM至0.5 mM範圍內通常極低。在一個實施例中，用於正常生理條件下之分析之分析溶液具有在約2.5 mM至約10 mM之範圍內的葡萄糖濃度，且用於異常條件下之分析之分析溶液具有在約0.05 mM至約0.5 mM之範圍內的葡萄糖濃度。與在較高葡萄糖環境中(在正常組織或血液中)相比，由此產生之條件活性多肽在低葡萄糖環境中(在腫瘤微環境中)具有較高活性。此條件活性多肽將在腫瘤微環境中起作用，但在血流中之輸送中具有低活性。

血清中之乳酸鹽之正常生理濃度在約1 mM至約2 mM範圍內。另一方面，在腫瘤微環境中，乳酸鹽濃度通常在10 mM至20 mM範圍內。在一個實施例中，用於正常生理條件下之分析之分析溶液具有在約1 mM至約2 mM之範圍內的乳酸鹽濃度，且用於異常條件下之分析之分析溶液具有在約10 mM至約20 mM之範圍內的乳酸鹽濃度。與在較低乳酸鹽環境中(在正常組織或血液中)相比，由此產生之條件活性多肽在高乳酸鹽濃度環境中(在腫瘤微環境中)具有較高活性。此條件活性多肽將由此在腫瘤微環境中起作用，但在血流中之輸送中具有低活性。

類似地，眾所周知，酸痛肌肉相比於正常肌肉具有較高(異常)乳酸鹽濃度。因此，當尋求在酸痛肌肉環境中將具有活性之突變多肽時，在異常條件下之一對分析可在存在較高乳酸鹽濃度之情況下進行以模擬酸痛肌肉環境，而在正常生理條件下之一對分析可在較低乳酸鹽濃度或不存在乳酸鹽之情況下進行。以此方式，突變多肽可經選擇在乳酸鹽濃度增加之酸痛肌肉環境中增強活性。舉例而言，此種條件活性多肽可用作抗炎劑。

在另一實施例中，兩種或大於兩種組分可用於兩對分析溶液中。在此類型分析中，可使用上文所描述之兩種類型分析之特徵來選擇條件活性多肽。替代地，可使用兩種或大於兩種組分來增加條件活性多肽之選擇性。舉例而言，返回至腫瘤微環境，在異常條件下之一對分析可在具有高乳酸鹽濃度及低葡萄糖濃度之分析培養基中進行，而在正常生理條件下之相應一對分析可在具有相對較低乳酸鹽濃度及相對較高葡萄糖濃度之分析培養基中進行。

本發明設想選自無機化合物、離子及有機分子之各組分可單獨或以組合形式使用以選擇在組分之一種濃度下比在相同組分之不同濃度下更有活性之條件活性多肽。

依賴於一或多種代謝物之不同濃度作為正常環境(正常生理條件)與異常環境(異常條件)之間的區分條件之分析可尤其適用於選擇在腫瘤微環境中比在血漿中更有活性的條件活性多肽，因為腫瘤微環境通常具有大量代謝物，該等代謝物具有與血漿中之相同代謝物濃度相比不同的濃度。

Kinoshita等人，曾以「Absolute Concentrations of Metabolites in Human Brain Tumors UsingIn Vitro Proton Magnetic Resonance Spectroscopy」(NMR IN BIOMEDICINE ，第10卷，第2-12頁，1997)一文，比較正常腦部及腦瘤中之代謝物。此研究組發現N-乙醯基天冬胺酸鹽在正常腦部中具有5000至6000 μM之濃度，但濃度在神經膠母細胞瘤中僅為300至400 μM、在星形細胞瘤中為1500至2000 μM，及在分化不良星形細胞瘤中為600至1500 μM。此外，肌醇在正常腦部中具有1500至2000 μM之濃度，但濃度在神經膠母細胞瘤中為2500至4000 μM、在星形細胞瘤中為2700至4500 μM，及在分化不良星形細胞瘤中為3800至5800 μM。磷酸乙醇胺在正常腦部中具有900至1200 μM之濃度，但濃度在神經膠母細胞瘤中為2000至2800 μM，在星形細胞瘤中為1170至1370 μM，及在分化不良星形細胞瘤中為1500至2500 μM。甘胺酸在正常腦部中具有600至1100 μM之濃度，但濃度在神經膠母細胞瘤中為4500至5500 μM、在星形細胞瘤中為750至1100 μM，及在分化不良星形細胞瘤中為1900至3500 μM。丙胺酸在正常腦部中具有700至1150 μM之濃度，但濃度在神經膠母細胞瘤中為2900至3600 μM、在星形細胞瘤中為800至1200 μM，及在分化不良星形細胞瘤中為300至700 μM。此等代謝物也會在血液中具有不同濃度，例如N-乙醯基天冬胺酸鹽在血液中具有約85000 μM之濃度；肌醇在血液中具有約21700 μM之濃度；甘胺酸在血液中具有約220至400 μM之濃度；丙胺酸在血液中具有約220至300 μM之濃度。

因此，此等代謝物(包括至少N-乙醯基天冬胺酸鹽、肌醇、甘胺酸及丙胺酸)可以不同濃度用於分析溶液中以選擇在腦瘤中有活性但在血液或正常腦組織中不具有活性之條件活性多肽。舉例而言，具有濃度為85000 μM之N-乙醯基天冬胺酸鹽的分析溶液可用於在正常生理條件下之一對分析，且具有濃度為350 μM之N-乙醯基天冬胺酸鹽的分析溶液可用於在異常條件下之一對分析以選擇在神經膠母細胞瘤之腫瘤微環境中有活性但在血液或正常腦組織中無活性或至少活性較低之條件活性多肽。

Mayers等人，曾以「Elevated circulating branched chain amino acids are an early event in pancreatic adenocarcinoma development」(Nature Medicine ，第20卷，第1193-1198頁，2014)一文，研究胰臟患者之預診斷血漿中之各種不同代謝物(包括支鏈胺基酸)的濃度。渠等發現在胰臟腫瘤患者中，相對於無胰臟癌之人類的血液中之代謝物之濃度，存在以不同濃度存在於血流中之若干種相同之代謝物。前述Mayers等人亦發現與正常個體相比，胰臟癌患者在其血漿中具有顯著升高之支鏈胺基酸。以升高濃度存在之支鏈胺基酸包括異白胺酸、白胺酸及纈胺酸(上述Mayers等人之表1)。存在Mayers等人(同前文獻)之圖1中所展示之其他代謝物，該等代謝物以與正常健康人類中之濃度明顯不同的濃度存在於胰臟癌患者之血漿中。此等代謝物包括至少乙醯基甘胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、2-胺基己二酸、牛磺去氧膽酸酯/牛磺鵝去氧膽酸酯、烏頭酸鹽、異檸檬酸鹽、乳酸鹽、α-甘油磷酸鹽及尿酸鹽。因此，基於某些代謝物以不同濃度存在於胰臟癌患者及正常健康患者之血漿中的發現，可預測，胰臟癌之腫瘤微環境對於此等代謝物亦將具有不同於存在於健康患者之胰臟微環境中之濃度。

因此，在一個實施例中，此等代謝物中之一或多者可以接近於健康個體中之血漿中的此等代謝物濃度(亦即代謝物之正常生理濃度)之量用於正常生理條件下之分析溶液。舉例而言，健康個體血漿中之已知正常生理濃度為異白胺酸約1.60±0.31 mg/dL、白胺酸約1.91±0.34 mg/dL及纈胺酸約2.83±0.34 mg/dL。正常生理條件下之分析溶液可具有在此等支鏈胺基酸中之一或多者的此等範圍內之正常生理濃度。異常條件下之分析溶液可具有以下濃度之相同支鏈胺基酸，其比相應支鏈胺基酸在健康個體中之正常生理濃度高約5倍、或約10倍、或約20倍、或約50倍、或約70倍、或約100倍、或約150倍、或約200倍或約500倍。此將反映事實，該事實為基於Mayers等人在上文之發現，胰臟腫瘤微環境將預期具有明顯升高之此等支鏈胺基酸濃度，此係因為由Mayers等人在上述偵測之血漿中發現此等支鏈胺基酸的較高濃度來源於腫瘤微環境且在血流中經稀釋。類似地，在異常條件下之分析可反映胰臟癌患者之血液中之其他代謝物的濃度，即使特定代謝物之濃度在癌症患者中明顯低於正常個體中之濃度。以此方式，篩選可模擬實際環境且藉此確保選擇用於其特定環境之最高活性突變體。

在一些其他實施例中，正常生理條件下之分析溶液可包含一或多種支鏈胺基酸，該等胺基酸之濃度模擬胰臟癌患者之血漿中之濃度以模擬此等患者之實際血漿環境。在此類實施例中，異常條件下之分析溶液可具有相同支鏈胺基酸，該等胺基酸之濃度相比於胰臟癌患者血漿中之相對應支鏈胺基酸之濃度高約2倍、或約3倍、或約4倍、或約5倍、或約7倍、或約8倍、或約10倍、或約15倍、或約20倍或約50倍以反映事實，該事實為此等較高濃度起源於腫瘤微環境且血流中之濃度表示腫瘤微環境之實際濃度的稀釋。類似地，其他代謝物亦可在正常生理條件及異常條件下之分析溶液中具有不同濃度以反映自血流所收集之資料預期的實際差異。在一些個例中，可在胰臟患者之血流中注意到特定代謝物之缺乏，在此情況下反映血流中之經量測濃度的濃度可用於正常生理條件下之分析，且甚至較低濃度可用於異常條件下之分析中以解釋該代謝物很可能在腫瘤微環境中消耗的預期。與在胰臟癌患者之血漿中相比，由此使用分析溶液而選擇之條件活性多肽將在胰臟癌微環境中更有活性。

在一些實施例中，胰臟癌患者之全部血漿可用於本發明中。舉例而言，在一個實施例中，胰臟癌患者之血漿之一或多種組分之模擬可用於在正常生理條件及異常條件下之分析中之一或兩者的分析溶液。在一例示性實施例中，正常生理條件下之分析溶液之pH在7.2至7.6範圍內且具有30 wt%經添加胰臟癌患者之血漿，且異常條件下之分析溶液之pH在6.2至6.8範圍內且具有30 wt%經添加胰臟癌患者之血漿。在此實施例中，存在胰臟癌患者之血漿以(1)確保條件活性多肽在pH 7.2至7.6下之血液中不經活化，及(2)亦確保條件活性多肽在腫瘤微環境中由pH 5.5至7.2、6至7或6.2至6.8活化，即使在胰臟癌患者之血液中發現此代謝物之組合物存在的情況下。此將為胰臟癌患者定製治療方案。

在另一例示性實施例中，正常生理條件下之分析溶液之pH在7.2至7.6範圍內且具有30 wt%經添加胰臟癌患者之血漿，且異常條件下之分析溶液之pH在5.5至7.2或6.2至6.8範圍內且不含任何經添加胰臟癌患者之血漿。

選自無機化合物、離子及有機分子之相同組分可用於如上文所述之若干種分析中之各者中。舉例而言，在乳酸鹽之情況下，乳酸鹽可以實質上相同濃度用於正常生理條件及異常條件下之一對分析溶液中。正常生理條件及異常條件隨後將在一或多個其他態樣(諸如另一組分之溫度、pH、濃度等)中不同。在一不同實施例中，乳酸鹽可用作正常生理條件與異常條件之間的區分因素中之一者以反映乳酸鹽在異常腫瘤微環境中比在正常生理條件(非腫瘤微環境)中具有較高濃度的事實。

在一些實施例中，將兩種或大於兩種組分以實質上相同濃度添加至正常生理條件及異常條件下之分析溶液中。舉例而言，將檸檬酸鹽及牛血清白蛋白(BSA)兩者添加至分析溶液中。在兩種分析溶液中，檸檬酸鹽濃度可為約80 μM且BSA濃度可為約10-20%。更特定言之，用於正常生理條件下之一對分析之分析溶液可具有在7.2至7.6範圍內之pH，其中檸檬酸鹽濃度為約80 μM及BSA濃度為約10-20%。用於異常條件下之一對分析之分析溶液可具有在6.2至6.8範圍內之pH，其中檸檬酸鹽濃度為約80 μM及BSA濃度為約10-20%。

在一個實施例中，血清可添加至處於實質上相同濃度之正常生理條件及異常條件下的兩種分析溶液中。因為血清具有大量無機化合物、離子、有機分子(包括多肽)，所以分析溶液將具有多種及大量選自無機化合物、離子、有機分子之組分，該等組分在兩種分析溶液之間以實質上相同之濃度存在。分析溶液可具有5至30 vol%、或7至25 vol%、或10至20 vol%、或10至15 vol%之血清。在一些其他實施例中，正常生理條件及異常條件下之分析溶液不含血清。血清可為人類血清、牛血清或來自任何其他哺乳動物之血清。在一些其他實施例中，分析溶液不含血清。

正常生理條件及異常條件下之分析溶液可具有不同pH。可經由使用碳酸氫鹽利用緩衝液中之CO₂ 及O₂ 含量來調節此類分析溶液之pH。

在一些其他實施例中，將兩種或大於兩種組分中之至少一者以不同濃度添加至正常生理條件及異常條件下之分析溶液中。舉例而言，將乳酸鹽及牛血清白蛋白(BSA)兩者添加至分析溶液中。乳酸鹽濃度可在正常生理條件及異常條件下之分析溶液之間不同，而BSA在兩種分析溶液中可具有相同濃度。乳酸鹽可在異常條件下之分析溶液中具有在30至50 mg/dL範圍內之濃度且在正常生理條件下之分析溶液中具有在8至15 mg/dL範圍內的濃度。另一方面，BSA在兩種分析溶液中具有相同濃度，諸如約10-20%。因此在存在BSA之情況下，使用此等分析溶液選擇之條件活性多肽在30至50 mg/dL之高乳酸鹽濃度下比在8至15 mg/dL之低乳酸鹽濃度下更有活性。

在一些實施例中，分析溶液可經設計用於選擇活性取決於兩種或大於兩種條件之條件活性多肽。在一個例示性實施例中，條件活性多肽可具有取決於pH及乳酸鹽之活性。用於選擇此種條件活性多肽之分析溶液可為具有7.2至7.6之pH、乳酸鹽濃度在8至15 mg/dL範圍內的正常生理條件下之分析溶液。異常條件下之分析溶液可具有6.2至6.8之pH，乳酸鹽濃度在30至50 mg/dL範圍內。視情況，正常生理條件及異常條件下之分析溶液亦可包含離子以幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合，由此以增加候選生物活性多肽之命中數。

在另一例示性實施例中，條件活性多肽可具有取決於pH、葡萄糖及乳酸鹽之活性。用於選擇此種條件活性多肽之分析溶液可為具有7.2至7.6之pH、葡萄糖濃度在2.5到10 mM範圍內、乳酸鹽濃度在8至15 mg/dL範圍內的正常生理條件下之分析溶液。異常條件下之分析溶液可具有6.2至6.8之pH、葡萄糖濃度在0.05至0.5 mM範圍內、乳酸鹽濃度在30至50 mg/dL範圍內。視情況，正常生理條件及異常條件下之分析溶液亦可包含離子以幫助突變多肽與其結合配偶體之間的結合，由此以增加在pH 6.2至6.8下結合至結合配偶體之候選生物活性多肽之數目。相比於在pH 7.2至7.6、葡萄糖濃度為2.5至10 mM及乳酸鹽濃度為8至15 mg/dL之環境中，使用此類分析溶液之經選擇條件活性多肽在pH 6.2至6.8、葡萄糖濃度為0.05至0.5 mM及乳酸鹽濃度為30至50 mg/dL之環境中更有活性。

選自無機化合物、離子及有機分子之兩種或大於兩種組分係用於製造異常條件下之分析溶液，該分析溶液模擬所選擇條件活性多肽將遞送至位置/位點(亦即靶位)處之環境。在一些實施例中，可將存在於靶位之環境中之至少三種組分添加至分析溶液中，或可將存在於靶位之環境中之至少四種組分添加至分析溶液中，或可將存在於靶位之環境中之至少五種組分添加至分析溶中，或可將存在於靶位之環境中之至少六種組分添加至分析溶液中。

在一個實施例中，自靶位(其中條件活性多肽將更有活性)所擷取之液體可直接用作分析溶液以在異常條件下分析。舉例而言，可自個體，較佳地自需要治療之患有關節病症之個體擷取滑液。視情況經稀釋之所擷取之滑液可用作在異常條件下之一對分析中之分析溶液以選擇條件活性多肽。藉由使用視情況經稀釋之所擷取之滑液作為在異常條件下分析之分析溶液，及模擬在正常生理條件下之用於分析之人類血漿的分析溶液，相比於在其他位置或器官，經選擇之條件活性多肽(例如TNF-α)在關節處將更有活性。舉例而言，患有發炎性關節(諸如關節炎)之個體可用TNF-α治療。然而，TNF-α通常具有損害其他組織及器官之嚴重副作用。在滑液中更有活性但在血液中無活性或活性較低之條件活性TNF-α將遞送TNF-α之活性至關節，同時減小或潛在地消除TNF-α對身體之其餘部分的副作用。

具有依賴於多種條件之活性之條件活性多肽之研發將導致條件活性多肽對個體體內之靶位的選擇性提高。理想地，在僅存在條件中之一些的其他位置，條件活性多肽不具有活性或至少活性明顯降低。在一個實施例中，在pH 6.2至6.8、葡萄糖濃度為0.05至0.5 mM及乳酸鹽濃度為30至50 mg/dL時具有活性之條件活性多肽可特異性地遞送至腫瘤微環境，此係因為此等條件皆存在於腫瘤微環境中。其他組織或器官可存在一或兩個此等條件而非全部三個，由此不足以徹底地活化另一組織或器官中之條件活性多肽。舉例而言，經鍛煉肌肉可具有在6.2至6.8範圍內之低pH。然而，其可能不具有另一分析條件。由此條件活性多肽在經鍛煉肌肉中不具有活性或至少活性較低。

在一些實施例中，可採取步驟以確認條件活性多肽之活性真正地取決於用於選擇條件活性多肽之條件。舉例而言，選擇取決於三個條件之條件活性多肽：pH 6.2-6.8、葡萄糖濃度為0.05至0.5 mM及乳酸鹽濃度為30至50 mg/dL。所選擇之條件活性多肽可隨後在三個條件中之各者下單獨測試及在具有該三個條件對之環境中測試，以確認條件活性多肽在此等測試條件或環境中不具有活性或活性較低。

在一些實施例中，可將血清之某些組分有目的地降至最低或自分析培養基省略。舉例而言，當篩選抗體時，與抗體結合或吸附抗體之血清組分可在分析培養基中降至最低或自其省略。此類結合抗體可產生偽陽性，從而包括結合突變抗體，其不具有條件活性而僅在多種不同條件下結合至存在於血清中之組分。因此，謹慎選擇分析組分以使可潛在地與分析中之突變體結合之組分降至最低或省略，此可用於降低由於在分析中結合至除所需結合配偶體以外的組分而無意地鑑別為條件活性為陽性之非功能性突變體數目。舉例而言，在篩選傾向於與人類血清中之組分結合之突變多肽的一些實施例中，BSA可用於分析溶液中以便減小或消除由突變多肽與人類血清之組分結合所引起之偽陽性的可能性。在特定情況下亦可進行其他類似替代以達成相同目標。

在一些實施例中，分析條件模擬細胞膜附近(諸如細胞膜內部、細胞膜處或細胞膜外部)之環境或關節中之環境。當在細胞膜環選境中篩選時可影響結合活性之一些因素包括受體表現、內化、抗體藥物複合物(ADC)效能等。

分析之形式可為任何熟習此項技術者已知之適合分析。實例包括ELISA、酶活性分析、活體外真實組織篩選(器官等)、組織切片、整個動物、細胞株及3D系統之使用。舉例而言，適合之基於細胞之分析描述於WO 2013/040445中，基於組織之分析描述於US 7,993,271中，基於整個動物之篩選方法描述於US 2010/0263599中，基於3D系統之篩選方法描述於US 2011/0143960中。

在一些實施例中，進化步驟可產生可同時具有除如上文所述之條件活性特徵以外的其他所需特性之突變多肽。可進化之其他適合所需特性可包括結合活性、表現、人源化等。因此，本發明可用於產生條件活性多肽，該條件活性多肽在此等其他所需特性中之至少一或多者中亦得到提高。

在一些實施例中，所選擇條件活性多肽可使用本文中所揭示之突變誘發技術中之一者在例如第二進化步驟中進一步突變，以提高所選擇條件活性多肽之另一特性，諸如結合活性、表現、人源化等。在第二進化步驟之後，可針對條件活性及改良特性篩選突變多肽。

在一些實施例中，在進化親本多肽以產生突變多肽之後，選擇第一條件活性多肽，相比於在正常生理條件中之第一活性，該第一條件活性多肽在異常條件下之分析中表現出第一活性之增加。第一條件活性多肽可隨後進一步經受一或多種額外進化、表現及選擇步驟以選擇至少第二條件活性多肽，(1)與在正常生理條件下之分析中的第二活性相比，該第二條件活性多肽在異常條件下之分析中表現出第二活性增加，或(2)與第一條件活性多肽及/或親本多肽相比，在異常條件下之第一活性與在正常生理條件下之第一活性之間的比率較大。與在正常生理條件下之各別活性相比，第二條件活性多肽在異常條件下可具有較高的第一活性及第二活性，以及與親本多肽相比，在正常生理條件下可具有較低的第一活性及第二活性。

在某些實施例中，本發明旨在產生條件活性多肽，其具有異常條件下之活性與正常生理條件下之活性的較大活性比率(例如異常與正常生理條件之間的較大選擇性)。異常條件下之活性與正常生理條件下之活性的比率或選擇性可為至少約2:1、或至少約3:1、或至少約4:1、或至少約5:1、或至少約6:1、或至少約7:1、或至少約8:1、或至少約9:1、或至少約10:1、或至少約11:1、或至少約12:1、或至少約13:1、或至少約14:1、或至少約15:1、或至少約16:1、或至少約17:1、或至少約18:1、或至少約19:1、或至少約20:1、或至少約30:1、或至少約40:1、或至少約50:1、或至少約60:1、或至少約70:1、或至少約80:1、或至少約90:1或至少約100:1。

在一個實施例中，條件活性多肽為抗體，其可具有至少約5:1、或至少約6:1、或至少約7:1、或至少約8:1、或至少約9:1、或至少約10:1、或至少約15:1、或至少約20:1、或至少約40:1或至少約80:1之異常條件下之活性與正常生理條件下之活性之間的比率。在一個實施例中，條件活性多肽用於靶向腫瘤部位，其中條件活性多肽在腫瘤部位(在腫瘤微環境中)有活性，且在非腫瘤部位(正常生理條件)活性明顯較低或無活性。

在一個實施例中，條件活性多肽為意欲與另一試劑(諸如本文中別處揭示之彼等試劑)共軛之抗體。條件活性抗體可具有異常條件下之活性與正常生理條件下之活性的較高比率。舉例而言，將與另一試劑共軛之條件活性抗體可具有至少約10:1、或至少約11:1、或至少約12:1、或至少約13:1、或至少約14:1、或至少約15:1、或至少約16:1、或至少約17:1、或至少約18:1、或至少約19:1或至少約20:1之異常條件下之活性與正常生理條件下之活性的比率。當共軛試劑為例如毒性或放射性時此可尤其重要，此係因為此種共軛試劑宜集中於病症或治療部位(其中存在異常條件)。H. 確定條件活性多肽之 pI

在一些實施例中，使用上文所描述之技術中之任一者確認所選擇條件活性多肽之pI低於親本多肽之pI。舉例而言，條件活性多肽之pI可低於親本多肽之pI至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.8、或至少1.0、或至少1.2、或至少1.4、或至少1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少2.5、或至少3.0、或至少3.5、或至少4.0個單位或低於親本多肽之pI至少5.0個單位。I. 條件活性多肽

在另一態樣中，本發明提供pI低於親本多肽之pI之條件活性多肽。相比於相同突變多肽在相對應正常生理條件下之相同活性，條件活性多肽具有在自正常生理條件偏離之異常條件下之增加的活性，且可視情況亦具有， (a)與在相同異常條件下之親本多肽之相同活性相比，在自正常生理條件偏離之異常條件下之增加活性， (b)與在相同正常生理條件下之親本多肽之相同活性相比，在正常生理條件下之降低活性，或 (c)上文(a)及(b)之組合。

條件活性多肽在正常生理條件下可以可逆或不可逆地失活，而在異常條件下具有活性。在一些實施例中，此等條件活性多肽在異常條件下之活性可等於或高於在正常生理條件下之親本多肽之活性。

條件活性多肽對於研發在宿主體內有限時間段有效之療法尤其有價值。此在治療之延長作用將對宿主有害，但需要有限之活性以執行所需治療之情況下尤其有價值。有益應用之實例包括局部或全身性治療以及局域化治療。條件活性多肽之一個優勢為由於其潛在地減小有害副作用之能力，其能夠在治療性應用中使用較高劑量。在正常生理條件下之失活可用於減小有害副作用。

在正常生理條件下之失活可由投藥及多肽之失活速率之組合來判定。此基於條件之失活對於酶療法尤其重要，該療法可在相對短時間段內造成顯著負面的副作用。

條件活性多肽亦可隨時間推移可逆或不可逆地活化或失活，或僅當其位於體內特定微環境(包括在體內特定器官中)時活化或失活。例示性微環境可包括(但不限於)腫瘤、滑液及膀胱或腎臟之微環境。

在一些實施例中，條件活性多肽為如本文所描述之針對一或多種靶抗原之抗體或抗體片段。

異常條件及正常生理條件如上文所論述且可為選自溫度、pH、滲透壓、滲透壓度、氧化應激、電解質濃度以及兩種或大於兩種此類條件之組合的條件。在一些實施例中，條件為pH且條件活性多肽具有pH依賴性之活性。特定言之，與在正常生理pH下相比，條件活性多肽在異常pH下具有增加的活性。

在一個態樣中，本發明係關於條件活性多肽，其在pKa在所需活性之pH的0.5、1、1.5、2、2.5、3或4個單位內之物種存在之情況下具有pH依賴性活性。在另一態樣中，本發明係關於條件活性多肽，其在pKa為約4至約10、或約4.5至約9.5或約5至約9、或約5.5至約8或約6.0至約7.0之物種存在之情況下具有pH依賴性活性。

存在於分析培養基中之對條件活性多肽之活性具有顯著影響之物種往往為具有至少兩種電離狀態之物種：不帶電荷或帶電荷較少之狀態及帶電荷或帶電荷較多之狀態。因此，影響條件活性多肽之活性之物種的pKa可在判定物種將在特定pH下對多肽之特定活性之影響程度中起作用。

在另一態樣中，本發明係關於條件活性多肽，其在選自組胺酸、組胺、氫化二磷酸腺苷、氫化三磷酸腺苷、檸檬酸鹽、碳酸氫鹽、醋酸鹽、乳酸鹽、二硫化物、硫化氫、銨、磷酸二氫鹽及其任何組合之物種存在之情況下具有pH依賴性活性。在一些實施例中，相比於在第一不同pH下，pH依賴性條件活性多肽在第二pH下具有較高活性，該兩種活性在此等物種存在下之分析中經量測。為判定條件活性多肽之pH依賴性，在相同分析培養基中以兩種不同pH值分析多肽之相同活性。

在相同分析培養基中，第二pH下之活性與第一pH下之相同活性的比率稱為pH依賴性條件活性多肽之選擇性。pH依賴性條件活性多肽具有至少約1.3、或至少約1.5、或至少約1.7、或至少約2.0、或至少約3.0、或至少約4.0、或至少約6.0、或至少約8.0、或至少約10.0、或至少約20.0、或至少約40.0、或至少約60.0或至少約100.0之選擇性。

已觀察到，與衍生條件活性多肽之親本多肽之胺基酸殘基相比，通常地pH依賴性條件活性多肽含有增加數目(或比例)之帶電胺基酸殘基。存在三種帶正電荷胺基酸殘基：離胺酸、精胺酸及組胺酸；及兩種帶負電荷胺基酸殘基：天冬胺酸及麩胺酸。在一些實施例中，與衍生pH依賴性條件活性多肽之親本多肽相比，此等帶電胺基酸殘基在pH依賴性條件活性多肽中過度表現。因此，pH依賴性條件活性多肽更可能在分析培養基中與帶電物種交互作用，此係因為帶電胺基酸殘基之數目相對於親本多肽已增加。此又影響條件活性多肽之活性。

亦已觀測到，在分析培養基中存在不同物質之情況下，pH依賴性條件活性多肽通常具有不同活性。取決於其pKa值，具有至少兩種電離狀態(不帶電荷或帶電荷較少之狀態及帶電荷或帶電荷較多之狀態)的物種可在特定pH下更大程度地分解，從而增加與存在於條件活性多肽中之帶電胺基酸殘基進行交互作用之機率。此特徵可用於增強條件活性多肽之選擇性及/或pH依賴性活性。

條件活性多肽上之電荷性質可為用於判定影響條件活性多肽之活性之適合物種的一個因素。在一些實施例中，與親本多肽相比，條件活性多肽可具有更多帶正電荷胺基酸殘基：離胺酸、精胺酸及組胺酸。替代地，與親本多肽相比，條件活性多肽可具有更多帶負電荷胺基酸殘基：天冬胺酸及麩胺酸。因此，條件活性多肽可經選擇以與存在於所需活性之環境中之特定物種進行所需程度之交互作用及/或與存在於需要經降低活性之環境中之特定物種進行所需程度之交互作用。

pH依賴性條件活性多肽上之帶電荷胺基酸殘基之位置亦可對條件活性多肽之活性有影響。舉例而言，帶電荷胺基酸殘基接近條件活性多肽之結合位點可影響多肽之結合活性。

在一些實施例中，帶電荷環境物種與條件活性多肽之交互作用可阻斷或妨礙pH依賴性條件活性多肽之活性。舉例而言，與帶電荷環境物種進行交互作用之帶電荷胺基酸可在條件活性多肽之結合位點上表現變構效應。

在其他實施例中，帶電荷環境物種與條件活性多肽之交互作用可在多肽上之不同部分(尤其帶電荷或極化部分)之間形成鹽橋。已知鹽橋之形成以穩定多肽結構(Donald等人，「Salt Bridges: Geometrically Specific, Designable Interactions」，Proteins ，79(3):898-915，2011；Hendsch等人，「Do salt bridges stabilize proteins? A continuum electrostatic analysis」，Protein Science ，3:211-226，1994)。鹽橋可穩定或固定蛋白質結構，其通常經歷稱為「呼吸」之恆定微小結構變化(Parak，「Proteins in action: the physics of structural fluctuations and conformational changes」，Curr Opin Struct Biol .，13(5):552-557，2003)。蛋白質結構「呼吸」對蛋白質功能及其結合為重要的，此係因為結構性波動可准許蛋白質有效識別且與其配偶體結合(Karplus等人，「Molecular dynamics and protein functions」，PNAS ，第102卷，第6679-6685頁，2015)。藉由形成鹽橋，條件活性多肽上之結合位點(尤其結合袋)可不太可能進入其配偶體，可能此係因為鹽橋可直接阻斷配偶體進入結合位點或可減少蛋白質結構「呼吸」。即使鹽橋遠離結合位點，但鹽橋之變構效應可更改結合位點之構形以抑制結合。因此，在鹽橋穩定(固定)條件活性多肽之結構之後，多肽在結合至其配偶體時可變得不太有活性，導致活性降低。

具有由鹽橋穩定之結構之多肽的一個已知實例為血紅素。結構性及化學研究已揭露，至少兩組化學基團對血紅素中之鹽橋負責：組胺酸β146及α122之胺基端及側鏈，其具有接近pH 7之pKa值。在去氧血紅素中，β146之末端羧酸酯基團與另一αβ二聚體之α次單位中之離胺酸殘基形成鹽橋。此交互作用將組胺酸β146之側鏈鎖定在其可參與相同鏈中具有帶負電荷天冬胺酸94之鹽橋的位置上，其限制條件為組胺酸殘基之咪唑基經質子化(圖1)。在高pH下，組胺酸β146之側鏈不經質子化且鹽橋不會形成。然而，當pH下降時，組胺酸β146之側鏈變得質子化且在組胺酸β146與天冬胺酸β94之間形成鹽橋，由此穩定去氧血紅素之四級結構，導致在活性代謝組織(較低pH)釋放氧的更大傾向。血紅素對氧展示pH依賴性結合活性，因此在低pH下，針對氧之結合活性由於鹽橋之形成而降低。另一方面，在高pH下，針對氧之結合活性由於缺失此等鹽橋而增加。

類似地，諸如碳酸氫根離子之離子可藉由在條件活性多肽中形成鹽橋來降低條件活性多肽與其配偶體之結合活性。舉例而言，在大於碳酸氫根離子之pKa之pH下，碳酸氫根離子帶負電荷。帶負電荷之碳酸氫根離子可在條件活性多肽上之帶正電荷部分或極性部分之間形成鹽橋。此等鹽橋可阻斷或減少條件活性多肽與其配偶體之結合。在低於其pKa 6.4之pH下，碳酸氫根離子經質子化且因此經中和。不帶電荷之碳酸氫根不能夠形成鹽橋，且因此不會以此方式影響條件活性多肽與其配偶體之結合。在此情境下，相比於在大於6.4之較高pH下，條件活性多肽可在低於碳酸氫根之pKa 6.4之pH下與其配偶體具有較高結合活性。在此實例中，條件活性多肽在碳酸氫根離子存在之情況下為條件活性，亦即表現出pH依賴性活性。

當分析培養基中不存在諸如碳酸氫鹽之物種時，條件活性多肽可失去其條件活性。此可能由於在條件性活性多肽上缺乏鹽橋以穩定(固定)多肽之結構。因此，在缺乏碳酸氫鹽的情況下，結合配偶體可在任何pH下對條件活性多肽上之結合位點具有類似進入水準，由此在任何pH下產生類似活性及消除條件活性。

在其他實施例中，小分子或離子與條件活性多肽之間的交互作用可以改變其活性之方式改變多肽之結構。舉例而言，結構中之改變可藉由改變結合位點之位置、位阻或結合能來提昇條件活性多肽之結合親和力。在此類情況下，可能需要選擇在所需活性之pH下與條件活性多肽結合之小分子或離子。

應理解，儘管鹽橋(離子鍵)為化合物及離子影響條件活性多肽之活性的最強效且最常見方式，但此類化合物及離子與條件活性多肽之間的其他交互作用亦可有助於穩定或固定條件活性多肽之結構。此類其他交互作用包括氫鍵、疏水性交互作用及凡得瓦交互作用。

在一些實施例中，為選擇適合之化合物或離子，將條件活性多肽與進化其之親本多肽進行比較，以判定條件活性多肽是否具有較高比例之帶負電荷胺基酸殘基或帶正電荷胺基酸殘基。分別在所需活性之pH及正常生理pH下具有適合之電荷的化合物或離子可隨後基於其大小及pKa值來選擇，以用於影響條件活性多肽之活性。舉例而言，當條件活性多肽具有比親本多肽更高比例之帶正電荷胺基酸殘基時，適合之小分子或離子應通常在正常生理pH下帶負電荷以與條件活性多肽交互作用，且應在所需活性之pH下為中性的。另一方面，當條件活性多肽具有比親本多肽更高比例之帶負電荷胺基酸殘基時，適合之小分子或離子應通常在正常生理pH下帶正電荷以與條件活性多肽交互作用，且在所需活性之pH下為中性的。

在其他實施例中，條件活性多肽之活性受小分子或離子與作為條件活性多肽之結合配偶體的靶多肽之交互作用的控制。在此情況下，除目標為在小分子或離子與靶多肽之間形成交互作用之外，如上文所論述之相同原理亦為可適用的。靶多肽可為例如條件活性抗體之抗原或條件活性受體之配位體。

適合之小分子或離子可為任何無機或有機化合物或離子，其自在所需活性之pH下之不帶電荷或帶電荷較少之狀態轉變至在正常生理pH下之帶電荷或帶較多電荷之狀態。因此，小分子或離子應通常具有在所需活性之pH與正常生理pH之間的pKa。舉例而言，碳酸氫鹽具有6.4之pKa。因此，在諸如pH 7.4下，帶負電荷碳酸氫鹽將與條件活性多肽中之帶電荷胺基酸殘基結合且降低活性。另一方面，在諸如pH 6.0之較低pH下，帶較少電荷之碳酸氫鹽將不以相同數量與條件活性多肽結合，且因此允許條件活性多肽之更高活性。

二硫化物具有pKa 7.05。因此，在諸如pH 7.4之正常生理pH下，帶較多負電荷之二硫化物將與條件活性多肽中之帶正電荷胺基酸殘基結合且降低其活性。另一方面，在諸如pH 6.2至6.8之較低pH下，帶較少電荷之硫化氫/二硫化物將不以相同水準與條件活性多肽結合，且因此允許條件活性多肽之更高活性。

具有所需活性之pH與正常生理pH之間的pKa之小分子或離子較佳用於本發明中。較佳物種係選自二硫化物、硫化氫、組胺酸、組胺、檸檬酸鹽、碳酸氫鹽、醋酸鹽及乳酸鹽。此等小分子或離子中之各者之pKa在6.2與7.0之間。此外，亦可使用其他小分子，諸如麥黃酮(pKa 8.05)及二甘胺酸(pKa 8.26)。其他適合之小分子或離子可發現於教科書中，諸如由CRC出版之CRC Handbook of Chemistry and Physics，第96版，2015及使用本申請案之原理的Chemical Properties Handbook，McGraw - Hill Education，1998中。

分析培養基或環境中之小分子或離子之濃度較佳地為處於或接近個體內小分子或離子之生理濃度。舉例而言，人類血清內之碳酸氫鹽之生理濃度在15至30 mM之範圍內。因此，分析培養基中之碳酸氫鹽濃度可為10 mM至40 mM、或15 mM至30 mM、或20 mM至25 mM或約20 mM。分析培養基中之二硫化物濃度可為3至500 nM、或5至200 nM、或10至100 nM或10至50 nM。

在本發明中，以一定濃度選擇及使用條件活性多肽，藉此環境中之特定物種之正常生理濃度將對條件活性多肽在所關注之pH範圍內之活性有顯著影響。因此，在許多治療處理中，對於血液或人類血清之約pH 7.2至7.4的條件活性多肽，具有低活性可為有利的，以允許經由血流遞送治療性處理同時最小化或防止條件活性多肽活化。因此，對於此類處理，選擇pKa低於pH 7.2至7.4之小分子或離子將為有利的，以便確保在血流pH下足夠量的小分子電離以對條件活性多肽之活性有顯著影響。同時，小分子或離子之pKa應等於或高於所需條件活性多肽之活性之pH，以便確保藉由質子化小分子或離子來活化條件活性多肽，從而釋放條件活性多肽上之結合位點。

分子或離子較佳具有低分子量及/或相對較小構形以藉由最小化位阻來確保最大化進入靶多肽或條件活性多肽上之小袋。出於此原因，小分子或離子通常具有低於900 a.m.u.、或更佳低於500 a.m.u.、或更佳低於200 a.m.u.或甚至更佳地低於100 a.m.u.之分子量。舉例而言，硫化氫、二硫化物及碳酸氫鹽皆具有低分子量及小結構，該等小結構提供進入靶多肽或條件活性多肽上之小袋，如下文中實例13及14中示出。

小分子或離子可以實質上相同的濃度存在於用於選擇條件活性之分析或環境中，例如約20 μM之碳酸氫鹽。在一些實施例中，小分子或離子可以不同濃度存在於不同環境中且因此可能需要在分析中模擬此情形。舉例而言，二硫化物在腫瘤微環境中比在人類血清中具有更高濃度。因此，第二分析可模擬具有酸性pH及更高濃度之二硫化物的腫瘤微環境，而第一分析可模擬具有中性或略微鹼性pH及較低濃度之二硫化物的人類血清。酸性pH可在6.0至6.8之範圍內而中性或略微鹼性pH可為約7.4。用於模擬腫瘤微環境之第二分析的更高濃度之二硫化物可為30 μM，而用於模擬人類血清之第一分析的較低濃度之二硫化物可為10 μM或更低，或5 μM。

在一些實施例中，當兩種或大於兩種不同小分子及/或離子(例如碳酸氫鹽及組胺酸之組合)存在時，條件活性多肽為pH依賴性。

當小分子或離子不存在時，條件活性多肽可失去其pH依賴性。因此，在缺乏小分子或離子的情況下，條件活性多肽可在所需活性之異常pH與正常生理pH之間具有相似活性。

在一些實施例中，所需活性之異常pH為酸性pH，而正常生理pH為鹼性或中性pH。舉例而言，異常pH可為在約5.5至7.2、或約6.0至7.0、或約6.2至6.8範圍內之pH。正常生理pH可為在大於7.2至低於7.6範圍內之pH。在酸性pH下更有活性且在鹼性或中性pH下活性較低之條件活性多肽可靶向腫瘤微環境，其中異常pH為約5.5至7.2或約6.2至6.8之酸性。

在其他實施例中，所需活性之異常pH為鹼性pH，而正常生理pH為酸性或中性pH。舉例而言，pH依賴性多肽更有活性之異常pH可為例如7.6至7.9之鹼性pH，諸如在滑液中，(參見Jebens等人，「On the viscosity and pH of synovial fluid and pH of blood」，Journal of Bone and Joint Surgery，第41 B卷，第388-400頁，1959)。正常生理pH可為大於7.2至低於7.6之血液pH，在該pH下條件活性多肽為較低活性。此等條件活性多肽可適用於靶向關節疾病及關節發炎。

在其他實施例中，條件活性多肽可設計成靶向大腦。在血腦障壁兩側存在pH差異，其中大腦側上之pH低於血液或人類血清之pH約0.2個pH單位。因此，條件活性多肽更有活性之大腦異常pH可為約7.0至7.2(大腦pH)，而正常生理pH可為大於7.2至低於7.6。

條件活性多肽可為酶、細胞介素、受體(尤其細胞受體)、調節多肽、可溶多肽、抗體或激素。

條件活性多肽可為親本多肽之片段。舉例而言，條件活性多肽可為抗體片段、單鏈抗體、酶片段、受體片段、細胞介素片段或激素片段。抗體片段可為抗體之Fc片段。

Fc片段可用作親本多肽，以用於產生條件活性Fc片段。Fc片段與互補序列之結合可用於提供抗體依賴性細胞介導之細胞毒性。異常pH可為5.5至7.2或6.2至6.8之範圍內的酸性，諸如腫瘤微環境中之pH，而正常生理pH在大於7.2至低於7.6之範圍內。異常pH不同於溶酶體中之pH，在該溶酶體中pH通常為約4.0。此外，溶酶體為Fc片段(如任何其他多肽)經靶向用於降解之位置。在溶酶體中不存在互補序列及無細胞介導之細胞毒性經由溶酶體而引起。

條件活性多肽可具有兩個功能域，其中至少一個(較佳兩個)功能域具有pH依賴性活性。此等兩個功能域可同時進化且可以識別同一突變多肽中之兩個功能域之方式來執行選擇。替代地，兩個功能域可各自進化且經選擇。在此情況下，兩個功能域可稠合至嵌合多肽中。

在一個態樣中，在諸如蛋白質之因素存在之情況下，條件活性多肽展示與親本多肽相比在所需活性之異常pH下活性增加，及與親本多肽相比在正常生理pH下活性降低。蛋白質可為存在於血液、人類血清或身體之微環境(諸如腫瘤微環境、發炎區域、滑液、大腦等)中之蛋白質。一種適合之蛋白質可為白蛋白，尤其哺乳動物白蛋白，諸如牛白蛋白或人類白蛋白。

在一個態樣中，諸如白蛋白之蛋白質存在於用於篩選及選擇條件活性多肽之分析溶液中。在另一態樣中，具有諸如白蛋白之蛋白質的分析溶液亦可用於在相同或不同條件下測試所選擇條件活性多肽之活性。J . 條件活性多肽之工程化

可使用WO 2017/078839中名稱為「Engineering of conditionally active polypeptides」、「Engineering masked conditionally active polypeptide」及「Engineering of conditionally active antibodies」之章節中描述的方法中之任一者來進一步工程化本發明之所選擇條件活性多肽。此外，如WO 2017/078839中所描述，本發明之條件活性多肽及經工程化之條件活性多肽可插入至作為溶瘤病毒之病毒顆粒中。K . 條件活性多肽之生產

可使用WO 2017/078839中名稱為「Production of the Conditionally Active polypeptides」之章節中描述之方法來產生本發明之所選擇條件活性多肽及經工程化之條件活性多肽，以用於治療用途、預防用途、診斷用途、研究及相關目的。G . 醫藥組合物

包含條件活性多肽或經工程化之條件活性多肽之醫藥組合物以及此種醫藥組合物之用途描述於WO 2017/078839中。本發明延伸至含有條件活性多肽或條件活性多肽之另一工程化版的醫藥組合物，其可用於治療、預防及診斷應用。L . 條件活性多肽之用途

本發明亦包括用於實體腫瘤、發炎關節或腦部疾病或病症之治療性或防治性治療之條件活性多肽之用途。

本發明之範疇亦包括藉由向需要該治療之患者投與本發明之條件活性多肽來治療實體腫瘤、發炎關節或腦部疾病或病症之方法。

必須注意，除非上下文另外明確說明，否則如本文及隨附申請專利範圍所用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。此外，術語「一(a或an)」、「一或多個」及「至少一個」可在本文中互換使用。術語「包含」、「包括」、「具有」及「由…建構」亦可互換使用。

除非另外指示，否則說明書及申請專利範圍中使用之表現成分數量、特性(諸如分子量、百分比、比率、反應條件等)之所有數字應理解為在所有情況下由術語「約」修飾，無論術語「約」是否存在。因此，除非有相反指示，否則說明書及申請專利範圍中所闡述之數值參數為近似值，其可視本發明設法獲得之所需特性而變化。至少且不試圖將等效物原則之應用限制於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位之個數且藉由應用普通捨入技術來解釋。儘管闡述本發明之廣泛範疇之數值範圍及參數為近似值，但儘可能精確地報導特定實例中所闡述之數值。然而，任何數值均固有地含有因其各別測試量測值中發現之標準差所必然引起的某些誤差。

應理解，本文所揭示之各組分、化合物、取代基或參數應解釋為單獨或與本文所揭示之每一種其他組分、化合物、取代基或參數中之一或多者組合使用來進行揭示。

亦應理解，本文所揭示之各組分、化合物、取代基或參數之各量/值或量/值範圍應解釋為亦與針對本文揭示之任何其他組分、化合物、取代基或參數所揭示之各量/值或量/值範圍組合進行揭示，且因此兩種或更多種本文所揭示之組分、化合物、取代基或參數之量/值或量/值範圍的任何組合亦出於本說明書之目的彼此組合進行揭示。

應進一步理解，本文中所揭示之各範圍應解釋為揭示具有相同數目之有效數位之所揭示範圍內的各特定值。因此，1至4之範圍應解釋為表示值1、2、3及4之揭示內容。應進一步理解，本文所揭示之各範圍的各下限應解釋為與在本文所揭示之相同組分、化合物、取代基或參數之各範圍內之各上限及各範圍內的各特定值組合進行揭示。因此，本發明應解釋為藉由將各範圍之各下限與各範圍之各上限或與各範圍內之各特定值組合或藉由將各範圍之各上限與各範圍內之各特定值組合所導出的所有範圍之揭示內容。

此外，本說明書或實例中所揭示之組分、化合物、取代基或參數之特定量/值應解釋為範圍之下限或上限之揭示內容，且因此可與範圍之任何其他下限或上限或本申請案中別處所揭示之相同組分、化合物、取代基或參數之特定量/值組合，以形成組分、化合物、取代基或參數之範圍。

本文中提及之所有文獻均以全文引用之方式併入本文中，或者提供其特定依賴之本發明。本申請人並不意欲將任何所揭示之實施例均貢獻於公眾，且達到任何所揭示之修飾或變化字面上均不屬於申請專利範圍之範疇內，但其在等效物原則下視為其一部分之程度。

然而，應瞭解，儘管已於先前描述中連同本發明之結構及功能之細節一起闡述本發明之許多特徵及優勢，但本發明僅為例示性的，且可詳細地作出改變，尤其關於本發明之原理內之部分之形狀、大小及配置，以最大程度地藉由表現所附申請專利範圍之術語的廣泛一般含義指示。

圖1為展示在去氧血紅素中形成鹽橋之圖式，其中三個胺基酸殘基形成兩個鹽橋，此使去氧血紅素之T四級結構穩定，導致對氧之親和力降低。

Claims (21)

1. 一種自親本多肽產生條件活性多肽之方法，其包含以下步驟：(i)藉由將一或多個突變引入至該親本多肽中來進化該親本多肽以產生pI低於該親本多肽之pI的一或多個突變多肽；(ii)使該一或多個突變多肽經受正常生理pH下之第一分析以量測該一或多個突變多肽在該正常生理pH下之活性，及使該一或多個突變多肽經受異常pH下之第二分析以量測該一或多個突變多肽在該異常pH下之活性，其中該正常生理pH與該異常pH不同；以及(iii)自該一或多個突變多肽中選擇該條件活性多肽，相比於在該第一分析中之相同活性，該條件活性多肽在該第二分析中表現出增加的活性，且該條件活性多肽之pI比該親本多肽之該pI低至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.8、或至少1.0個單位。
2. 如請求項1之方法，其中該一或多個突變包含針對該親本多肽中之胺基酸殘基的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸殘基之胺基酸取代，該胺基酸殘基之pI比經取代至該親本多肽中之該胺基酸的pI高。
3. 如請求項1之方法，其中該一或多個突變包含1個、2個、3個、4個或5個胺基酸殘基之插入，該胺基酸殘基之pI低於該親本多肽之該pI，或該胺基酸殘基之該pI比該親本多肽之該pI低至少0.1、或至少0.2、或至少 0.3、或至少0.4、或至少0.5、或至少0.6、或至少0.8、或至少1.0個單位。
4. 如請求項1之方法，其中該一或多個突變包含1個、2個、3個、4個或5個胺基酸殘基之缺失，該胺基酸殘基之pI高於該親本多肽之該pI。
5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該等突變中之一或多個突變定位於暴露在該突變多肽之表面上的位置中。
6. 如請求項1至4中任一項之方法，其進一步包含步驟(ii)之前的用於確定至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%、或至少98%之該突變多肽之pI等於或低於該親本多肽之該pI的步驟。
7. 如請求項6之方法，其進一步包含在步驟(ii)之前捨棄pI大於該親本多肽之該pI之突變多肽的步驟。
8. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該親本多肽係選自抗體、酶、激素、生長因子、細胞介素、調節蛋白、功能肽、生物類似物、免疫調節劑、受體及配位體。
9. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該親本多肽為選自全長抗體、單鏈抗體、抗體片段、重鏈、輕鏈、Fab及Fc域之抗體。
10. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該親本多肽為治療性抗體或研發用於醫療用途之候選抗體。
11. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該親本多肽為IgG抗體。
12. 如請求項11之方法，其中該一或多個突變處於該IgG抗體之可變區。
13. 如請求項11之方法，其中該一或多個突變處於該IgG抗體之恆定區。
14. 如請求項11之方法，其中該一或多個突變處於一或多個該IgG抗體之互補決定區。
15. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該第一分析之該pH大於7.2至小於7.6，且該第二分析之該pH小於7.2或大於7.6。
16. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該條件活性多肽在該第二分析中之該活性與在該第一分析中之相同活性的比率為至少1.3、或1.5、或至少1.7、或至少2.0、或至少3.0、或至少4.0、或至少6.0、或至少8.0、或至少10.0、或至少20.0、或至少40.0、或至少60.0或至少100.0。
17. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該第一分析及該第二分析皆在分子量小於900a.m.u.、小於500a.m.u.、小於200a.m.u.或小於100 a.m.u.之分子或離子存在的情況下執行。
18. 如請求項17之方法，其中該分子或離子係選自組胺酸、組胺、氫化二磷酸腺苷、氫化三磷酸腺苷、檸檬酸鹽、碳酸氫鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、二硫化物、硫化氫、銨、磷酸二氫鹽及其任何組合。
19. 如請求項17之方法，其中該分子或離子為濃度在3mM至200mM、5mM至150mM、5mM至100mM、10mM至100mM、20mM至100mM、25mM至100mM、30mM至100mM、35mM至100mM、40mM至100mM或50mM至100mM之範圍內的碳酸氫根離子。
20. 如請求項17之方法，其中該分子或離子為濃度在1mM至100mM、2nM至500nM、3nM至200nM、5nM至100nM之範圍內的二硫化物離子。
21. 如請求項17之方法，其中該分子或離子係選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、二硫化鈉或二硫化鉀。