TWI865451B

TWI865451B - 單特異性及多特異性抗ｔｍｅｆｆ２抗體及其用途

Info

Publication number: TWI865451B
Application number: TW108117613A
Authority: TW
Inventors: 飛利浦古柏; 羅賓恩斯特; 拉庫瑪甘尼申; 柯林凱恩; 麥可羅素; 桑加亞辛格; 莎菲亞迪維維加塔拉瑪尼; 勝君吳
Original assignee: 美商健生生物科技公司
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2024-12-11
Also published as: CL2020003032A1; WO2019224713A2; PH12020551948A1; CN112703203A; MX2020012589A; CN112703203B; US11866499B2; CA3101304A1; EA202092849A1; JP2021524255A; IL278862A; CO2020014515A2; EP3802607A2; AR115419A1; UY38243A; CR20200564A; JP2024105476A; JOP20200295A1; AU2019274652A1; KR20210011999A

Abstract

本文中所提供之揭露係關於單特異性及多特異性抗TMEFF2抗體、以及生產及使用所述抗體之方法。

Description

單特異性及多特異性抗TMEFF2抗體及其用途

【序列表】

本申請案含有序列表，其已經以ASCII格式藉由電子方式提交且其全文以引用方式併入本文中。該ASCII副本(建立於2019年1月31日)被命名為JBI5160WOPCT1_SL.txt且檔案大小為144,156位元組。

前列腺癌係在全世界男性中第二常見的癌症，且係癌症相關死亡的第六大主因。全球每年有大約1,100,000個新案例及300,000個死亡數，其構成所有癌症死亡的4百分比。經過評估，每6名男性中有1名將在其一生中經診斷患有該疾病。前列腺癌風險與年齡強烈相關：大約四分之三的案例發生於超過65歲的男性中，其中最多數的案例發生於70至74歲的男性中。經過自死後數據進行的評估，大約一半的五十多歲男性及80%的80歲男性具有前列腺方面癌症的組織學證據。早期的5年存活率接近100%。然而，當癌症已經轉移時，5年存活率會下降至28%，而仍需要針對晚期前列腺癌之有效治療。

睪丸雄性激素剝奪療法常導致疾病的穩定化或消退(在80%的患者中)。用於前列腺癌的目前治療包括手術、輻射、及荷爾蒙療法。一般而言，將癌症疫苗西普鲁塞-T(sipuleucel-T)、放射性藥劑(諸如鐳-223氯化物)、二級荷爾蒙療法(諸如阿比特龍(abiraterone) 或恩雜魯胺(enzalutamide))、及/或化療(歐洲紫杉醇(docetaxel)及卡巴他賽(cabazitaxel))按順序添加至荷爾蒙療法。雖然此等治療之各者可延緩癌症生長數個月並緩和疾病產生的症狀，但最終仍會發展出轉移性前列腺癌之進展。當前列腺癌生長(儘管藉由荷爾蒙療法降低睪固酮水平)時，治療選項受到限制。

因此，需要發展額外治療劑以治療前列腺癌。

本發明提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其結合至TMEFF2之SEQ ID NO：110之近膜區(membrane proximal region)。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其結合至TMEFF2之近膜區，其中該抗體或其抗原結合片段與參考抗體競爭結合至TMEFF2之該近膜區，該參考抗體包含：SEQ ID NO：25之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：28之輕鏈可變區(VL)、SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL、SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL、SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL、SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL、或SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其結合至TMEFF2之近膜區，其中該抗體或其抗原結合片段在殘基HGKCEHSINMQEPSC(SEQ ID NO：57)或DAGYTGQHCEKKDYSVL(SEQ ID NO：58)內結合至TMEFF2之該近膜區。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體，其具有如本文中所述之某些重鏈及輕鏈互補決定區序列。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體，其具有如本文中所述之某些重鏈可變區及輕鏈可變區序列。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體，其具有如本文中所述之某些重鏈及輕鏈序列。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含：分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL；及/或SEQ ID NO：32之HC及SEQ ID NO：35之LC。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含：分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21、及23之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL；及/或SEQ ID NO：33之HC及SEQ ID NO：36之LC。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含：分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20、及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL；及/或SEQ ID NO：34之HC及SEQ ID NO：37之LC。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含：分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL；及/或SEQ ID NO：33之HC及SEQ ID NO：38之LC。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含：分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL；及/或SEQ ID NO：91之HC及SEQ ID NO：92之LC。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含：分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL；及/或SEQ ID NO：93之HC及SEQ ID NO：94之LC。

本發明亦提供一種醫藥組成物，其包含本發明之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。

本發明亦提供一種經單離之多核苷酸，其編碼本發明之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其編碼SEQ ID NO：25、26、27、87、或89之抗TMEFF2抗體VH、及/或SEQ ID NO：28、29、30、31、88、或90之VL，或包含SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、95、96、97、98、99、100、101、或102之多核苷酸序列。

本發明亦提供一種載體，其包含本發明之多核苷酸。

本發明亦提供一種宿主細胞，其包含本發明之載體。

本發明亦提供一種生產本發明之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段之方法，其包含在使該抗體或其抗原結合片段表現之條件下培養本發明之宿主細胞；及回收由該宿主細胞生產之抗體或其抗原結合片段。

本發明亦提供一種治療有需要之對象的TMEFF2陽性癌症之方法，其包含向該對象投予治療有效量的本發明之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段、或本發明之醫藥組成物，以治療該TMEFF2陽性癌症。

本發明亦提供一種抗遺傳型抗體，其結合至本發明之抗TMEFF2抗體。

本發明亦提供一種套組，其包含本發明之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該抗體結合至TMEFF2之SEQ ID NO：110之近膜區。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體與參考抗體競爭結合至TMEFF2之近膜區，該參考抗體包含：SEQ ID NO：25之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：28之輕鏈可變區(VL)、SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL、SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL、SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL、SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL、或SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體結合TMEFF2上的SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58之表位。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、 63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：32之第一重鏈(HC1)、SEQ ID NO：35之第一輕鏈(LC1)、SEQ ID NO：76之第二重鏈(HC2)、及SEQ ID NO：77之第二輕鏈(LC2)。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：32之HC1、SEQ ID NO：35之LC1、SEQ ID NO：78之HC2、及SEQ ID NO：79之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21、及23之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、 63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：36之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21、及23之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：36之LC1、SEQ ID NO：78之HC2、及SEQ ID NO：79之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20、及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、 63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：34之HC1、SEQ ID NO：37之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20、及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：34之HC1、SEQ ID NO：37之LC1、SEQ ID NO：78之HC2、及SEQ ID NO：79之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、 63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：38之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：38之LC1、SEQ ID NO：78之HC2、及SEQ ID NO：79之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、 63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：91之HC1、SEQ ID NO：92之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：91之HC1、SEQ ID NO：92之LC1、SEQ ID NO：78之HC2、及SEQ ID NO：79之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、 63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：93之HC1、SEQ ID NO：94之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：93之HC1、SEQ ID NO：94之LC1、SEQ ID NO：78之HC2、及SEQ ID NO：79之LC2。

本發明亦提供一種醫藥組成物，其包含本發明之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。

本發明亦提供一種多核苷酸，其編碼本發明之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段。

本發明亦提供一種生產雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之方法，其包含在使該抗體表現之條件下培養本發明之宿主細胞；及回收並純化由該宿主細胞生產之該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段。

本發明亦提供一種生產該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段之方法，其包含：將單特異性二價TMEFF2抗體及單特異性二價CD3抗體以約1：1莫耳比之混合物組合，該單特異性二價TMEFF2抗體具有兩個相同的HC1及兩個相同的LC1，該單特異性二價CD3抗體具有兩個相同的HC2及兩個相同的LC2；將還原劑引入該混合物中；將該混合物培養約九十分鐘至約六小時；移除該還原劑；及純化該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含該HC1、該LC1、該HC2、及該LC2。

本發明亦提供一種治療有需要之對象的TMEFF2陽性癌症之方法，其包含向該對象投予治療有效量的本發明之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段、或本發明之醫藥組成物，以治療該TMEFF2陽性癌症。

本發明亦提供一種抗遺傳型抗體，其結合至本發明之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段。

本發明亦提供一種套組，其包含本發明之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體。

〔圖1〕顯示所選抗TMEFF2抗體重鏈可變區(VH)的比對。VH區係以各列開始處之其SEQ ID NO：識別。

〔圖2〕顯示選擇抗TMEFF2抗體輕鏈可變區(VL)的比對。VH區係以各列開始處之其SEQ ID NO：識別。

〔圖3〕顯示LnCaP細胞隨時間的殺滅情形，如藉由所選雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之增加的凋亡蛋白酶3/7活性所測量。

〔圖4〕顯示於雄性NGS小鼠中的離體LnCaP前列腺癌模型中，用所選雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之腫瘤植入後平均腫瘤體積隨時間減少。

〔圖5A〕顯示於雄性NGS小鼠中的離體LnCaP前列腺癌模型中，經0.5mg/kg TMCB93治療的各小鼠之平均腫瘤體積減少。

〔圖5B〕顯示於雄性NGS小鼠中的離體LnCaP前列腺癌模型中，經0.5mg/kg TMCB132治療的各小鼠之平均腫瘤體積減少。

〔圖6〕顯示TMEB762xCD3B376在T細胞人源化NSG小鼠中的所建立之LNCaP異種移植物中的療效。

〔圖7〕顯示回應於TMCB132投予，LnCaP前列腺癌細胞中的T細胞活化。

〔圖8〕顯示TMCB132的T細胞介導之細胞毒性。

〔圖9〕顯示TMCB132在T細胞人源化小鼠中的抗腫瘤療效。

所有在本說明中引用、包括但不限於專利及專利申請文件之發表文獻在此全部併入作為參照。

吾人會理解到本說明書中所使用的用語僅用於描述特定實施例之目的，並且不意欲為限制性。除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學用語，均與具有本發明有關技藝之通常知識者所一般了解之意義相同。

雖然任何類似或等效於本文中所述者之方法及材料可用於測試本發明之實務中，本文中仍描述例示性材料及方法。在描述及請求本發明時，將使用下列用語。

於本說明書及隨附的申請專利範圍中，除非內文另有明確說明，否則單數形式的「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱。因此，例如對於「一細胞(a cell)」之指稱包括兩或更多個細胞之組合與類似者。

除非上下文清楚地作出其他要求，否則整篇說明書及申請專利範圍中之用字「包含(comprise/comprising)」及類似者應被解讀為涵括性意義，此係相對於排他性或窮舉性意義；亦即，「包括但不限於(including,but not limited to)」之意義。

「特異性結合(secific binding/specifically bind/specifically binding)」或「結合(bind)」係指抗體以比對其他抗原更大的親和力結合至抗原或抗原內之表位。一般來說，抗體以下列平衡解離常數(K_D)結合至抗原或抗原內之表位：約5×10^-8M或更低，例如約1×10^-9M或更低、約1×10^-10M或更低、約1×10^-11M或更低、或約1×10^-12M或更低，一般以小於其結合至非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)之K_D至少一百倍的K_D結合。解離常數可使用本文中所述規程測量。然而，結合至抗原或抗原內之表位的抗體可能對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種(諸如人類或猴)的相同抗原(同源物(homolog))，該等猴例如食蟹獼猴(Macaca fascicularis,cynomolgus,cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes,chimpanzee,chimp)。當單特異性抗體結合一種抗原或一種表位時，雙特異性抗體結合二種不同的抗原或二種不同的表位。

「抗體(antibody)」係以廣義的方式意指並包括免疫球蛋白分子，其包括單株抗體(包括鼠類、人類、人源化(humanized)、及嵌合單株抗體)、抗原結合片段、多特異性抗體(諸如雙特異性、三特異性、四特異性等)、二聚體、四聚體、或多聚體抗體、單鏈抗體、域抗體、及任何其他包含具有所需特異性之抗原結合位的免疫球蛋白分子之修飾組態。「全長抗體(full length antibody)」包含藉由雙硫鍵互連之兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(包含域CH1、鉸鏈、CH2、及CH3)。每條輕鏈包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區(CL)。VH及VL區可進一步細分成散佈於架構區(FR)中的多個高變區，其被稱為互補決定區(CDR)。各VH及VL係由三個CDR及四個FR區段組成，按照下列順序從胺基至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4。

「互補決定區(complementarity determining region,CDR)」係結合抗原之抗體區。CDR可使用各種描繪來定義，諸如Kabat(Wu et al.(1970)J Exp Med 132：211-50)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia(Chothia et al.(1987)J Mol Biol 196：901-17)、IMGT(Lefrancet al.(2003)Dev Comp Immunol 27：55-77)、及AbM(Martin and Thornton(1996)J Bmol Biol 263：800-15)。描述各種描繪與可變區編號之間之對應(參見例如，Lefranc et al.(2003)Dev Comp Immunol 27：55-77；Honegger and Pluckthun,(2001)J Mol Biol 309：657-70；國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics,IMGT)資料庫；網路資源，www.imgt.org)。可用程式(諸如UCL Business PLC之abYsis)可用於描繪CDR。本文中所使用之用語「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」、及「LCDR3」包括由上述Kabat、Chothia、IMGT、或AbM中的任何方法定義的CDR，除非在說明書中另有明確說明免疫球蛋白可被分為下列五大類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，視重鏈恆定域(constant domain)胺基酸序列而定。IgA及IgG係進一步被細分為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可被分為兩種明確不同類型(即kappa(κ)及lambda(λ))中之一者，其視其恆定域的胺基酸序列而定。

「抗原結合片段(antigen binding fragment)」係指結合抗原之免疫球蛋白分子之一部分。抗原結合片段可為合成的、可酶促獲得的、或經基因工程改造之多肽，且包括VH、VL、VH及VL、Fab、F(ab')2、Fd、及Fv片段、由一個VH域或一個VL域所組成之域抗體(dAb)、鯊可變IgNAR域(shark variable IgNAR domain)、駱駝化VH域、由模擬抗體之CDR(諸如FR3-CDR3-FR4部分、HCDR1、HCDR2、及/或HCDR3、以及LCDR1、LCDR2、及/或LCDR3)的胺基酸殘基所組成之最小識別單元。VH及VL域可經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單鏈抗體設計，其中VH/VL域可進行分子內配對，或者在VH及VL域係由分開之單鏈抗體建構體所表現之情況下可進行分子間配對，以形成單價抗原結合位，諸如單鏈Fv(scFv)或雙價抗體(diabody)；其描述於例如國際專利公開號WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804、及WO1992/01047中。

「單株抗體(monoclonal antibody)」係指自實質上均一的抗體分子群體獲得之抗體，亦即，除了可能熟知之改變之外包含該群體之個別抗體係同一的，該等改變諸如從抗體重鏈移除C端離胺酸或轉譯後修飾，諸如胺基酸異構化或脫醯胺化、甲硫胺酸氧化或天冬醯胺酸或麩醯胺酸脫醯胺化。單株抗體一般結合一種抗原表位。雙特異性單株抗體會結合兩種不同的抗原表位。單株抗體在抗體群內可能有異源醣化。單株抗體可係單特異性或多特異性的(諸如雙特異性的)、單價、二價、或多價的。

「經單離(isolated)」係指已自製出該分子的系統(諸如重組細胞)的其他組分實質上分離及/或純化出之均一分子群體(諸如合成多核苷酸或蛋白質，諸如抗體)、以及已經受至少一次純化或單離步驟的蛋白質。「經單離之抗體(isolated antibody)」係指實質上不含其他細胞材料及/或化學物的抗體，且涵蓋經單離成更高純度的抗體，諸如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%純度。

「人源化抗體(humanized antibody)」係指至少一個CDR係衍生自非人類物種且至少一個架構係衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體可在架構中包括取代，所以該等架構可能不是所表現人類免疫球蛋白或人類免疫球蛋白生殖系基因序列的確切複製物。

「人類抗體(human antibody)」係指經最佳化以在投予至人類對象時具有最小免疫反應之抗體。人類抗體之可變區係衍生自人類免疫球蛋白序列。若人類抗體含有恆定區或恆定區之一部分，則該恆定區亦衍生自人類免疫球蛋白序列。若人類抗體的可變區係獲自使用人類生殖系免疫球蛋白或重排(rearranged)免疫球蛋白基因的系統，則該人類抗體包含「衍生自(derived from)」人源序列的重鏈及輕鏈可變區。此類例示性系統係經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫、及基因轉殖非人類動物(諸如帶有人類免疫球蛋白基因位點的小鼠或大鼠)。當相較於人類中表現之免疫球蛋白時，「人類抗體」一般含有胺基酸差異，這是由於用於獲得人類抗體及人類免疫球蛋白基因位點之系統之間的差異、引入體細胞突變、或向架構或CDR(或兩者)中刻意引入取代。一般而言，「人類抗體」在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在一些情況下，「人類抗體」可能含有自人類架構序列分析導出的共有架構序列，例如Knappik et al.,(2000)J Mol Biol 296：57-86中所述，或併入經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫的合成HCDR3，例如Shi et al.,(2010)J Mol Biol 397：385-96及國際專利公開號WO2009/085462中所述。

至少一種CDR係衍生自非人類物種的抗體不包括在「人類抗體」的定義中。

「重組(recombinant)」係指當來自不同來源的區段經連接以生產重組DNA、抗體、或蛋白質時，藉由重組手段來製備、表現、建立、或單離的DNA、抗體、及其他蛋白質。

「表位(epitope)」係指與抗體特異性結合的抗原部分。表位一般由分子部分(諸如胺基酸或多醣側鏈)之化學活性(諸如極性、非極性或疏水性)表面分群(grouping)所組成，並且可具有特定三維結構特性以及特定電荷特性。表位可包含形成構形空間單元之鄰接(contiguous)及/或不鄰接(discontiguous)胺基酸。關於不鄰接表位，來自抗原線性序列之相異部分的胺基酸會透過蛋白質分子的摺疊而在3維空間中緊密靠近。

「雙特異性(bispecific)」係指特異性結合二種不同抗原或相同抗原內兩個不同表位的抗體。雙特異性抗體可對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種(諸如人類或猴)的相同抗原(同源物)，該等猴例如食蟹獼猴(Macaca cynomolgus,cynomolgus,cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes)，或者可以結合在二或更多種不同抗原之間共有的表位。

「多特異性(multispecific)」係指特異性結合二或更多種不同抗原或相同抗原內二或更多個不同表位之抗體。多特異性抗體可對於其他相關抗原具有交叉反應性，例如對於來自其他物種(諸如人類或猴)的相同抗原(同源物)，該等猴例如食蟹獼猴(Macaca cynomolgus,cynomolgus,cyno)或黑猩猩(Pan troglodytes)，或者可以結合在二或更多種不同抗原之間共享的表位。

「變異體(variant)」係指藉由一或多個修改(例如一或多個取代、插入或缺失)而不同於參考多肽或參考多核苷酸的多肽或多核苷酸。

「載體(vector)」係指在生物系統內能夠被複製或者可在此等系統之間移動的多核苷酸。載體多核苷酸一般含有元件，諸如複製起點、多腺苷酸化信號或選擇標記，彼等發揮作用以促進這些多核苷酸在利用能夠複製載體的生物組分之生物系統(諸如細胞、病毒、動物、植物、及重構生物系統)中的複製或維持。載體多核苷酸可為DNA或RNA分子或其等之混成物、單股或雙股。

「表現載體(expression vector)」係指可在生物系統或重構生物系統中用以指引多肽轉譯的載體，該多肽係由存在於該表現載體中之多核苷酸序列所編碼。

「多核苷酸(polynucleotide)」係指包含藉由糖-磷酸主鏈或其他等效共價化學共價連接之核苷酸鏈的合成分子。cDNA係例示性合成多核苷酸。

「多肽(polypeptide)」或「蛋白質(protein)」係指包含至少二個以胜肽鍵連接之胺基酸殘基以形成多肽的分子。少於50個胺基酸的小型多肽可稱為「肽(peptide)」。

「TMEFF2」係指具有EGF樣域及兩個濾泡抑素(follistatin)樣域2之人類跨膜蛋白，亦稱為腫瘤調節蛋白(tomoregulin)2。全長人類TMEFF2之胺基酸序列係顯示於SEQ ID NO：1中。TMEFF2之胞外域係顯示於SEQ ID NO：2中，並涵蓋全長TMEFF2之殘基40至374。TMEFF2胞外域具有三個不同次結構域，即Kazal樣1(殘基85至137)、Kazal樣2(殘基176至229)、及EGF域(殘基261至301)。TMEFF2 EGF域係顯示於SEQ ID NO：3中。TMEFF2「近膜區(membrane proximal region)」係指SEQ ID NO：110之TMEFF2區，其涵蓋EGF域及N端、C端連接子區(例如SEQ ID NO：1之全長人類TMEFF2之殘基230至320)。本文中所有對蛋白質、多肽、及蛋白質片段的指稱意欲指各別蛋白質、多肽、或蛋白質片段的人類版本，除非明確指定為來自非人類物種。因此，「TMEFF2」意指人類TMEFF2，除非指定為來自非人類物種，例如「小鼠TMEFF2」或「猴TMEFF2」等。

SEQ ID NO：1(全長人類TMEFF2)

SEQ ID NO：2(人類TMEFF2之胞外域)

TMEFF2 EGF域SEQ ID NO：3 HHIPCPEHYNGFCMHGKCEHSINMQEPSCRCDAGYTGQHCE

TMEFF2近膜區SEQ ID NO：110

「CD3」係指一種抗原，其係表現於T細胞上作為多分子T細胞受體(TCR)複合物之一部分，且其係由自兩個或四個受體鏈締合形成之同二聚體或異二聚體組成：CD3ε、CD3δ、CD3ζ、及CD3γ。人類CD3ε包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列。本文中所有對蛋白質、多肽、及蛋白質片段的指稱意欲指各別蛋白質、多肽、或蛋白質片段的人類版本，除非明確指定為來自非人類物種。因此，「CD3」意指人類CD3，除非指定為來自非人類物種，例如「小鼠CD3」、「猴CD3」等。

SEQ ID NO：4(人類CD3ε)

SEQ ID NO：5(人類CD3ε胞外域)

「雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體(bispecific anti-TMEFF2/anti-CD3 antibody)」、TMEFF2/CD3抗體、TMEFF2xCD3抗體、及類似者係指結合TMEFF2及CD3的抗體。

「與...組合(in combination with)」意指將二或更多種治療劑一起以混合物形式投予至對象，其係同時以單劑投予或以任何順序以單劑依序投予。

「TMEFF2陽性癌症(TMEFF2 positive cancer)」係指展示可測量TMEFF2蛋白水平之癌組織或癌細胞。可以使用熟知的檢定法，使用例如ELISA、免疫螢光、流動式細胞測量術、或放射免疫檢定來在活的或裂解的細胞上測量TMEFF2蛋白水平。

「樣本(sample)」係指自對象單離出的類似流體、細胞、或組織的集合，以及存在於對象內的流體、細胞、或組織。例示性樣本屬生物流體(諸如血液、血清及漿膜液(serosal fluid)、血漿、淋巴液、尿液、唾液、囊液(cystic fluid)、淚滴、糞便、痰、分泌組織及器官的黏膜分泌物、陰道分泌物)、腹水(諸如與非實體腫瘤相關者)、胸膜腔、圍心腔、腹膜腔(peritoneal)、腹腔(abdominal)、及其他體腔的流體、藉由支氣管灌洗(bronchial lavage)收集的流體、與對象或生物來源接觸的液體溶液(例如細胞及器官培養基，其包括細胞或器官條件培養基(conditioned medium)、灌洗液、及類似者)、組織活檢、細針穿刺、或手術切除的組織。

「癌細胞(cancer cell)」或「腫瘤細胞(tumor cell)」係指在體內、離體、或在組織培養物中具有自發或誘導的表型改變的癌性(cancerous)、癌前(pre-cancerous)、或轉化細胞。這些變化不一定涉及新遺傳物質的攝取。儘管轉化可能來自轉化病毒的感染及新基因體核酸的摻入或外源核酸的攝取，其亦可自發地發生或在暴露於致癌物後發生，從而突變內源基因。轉化/癌症的例子如下：在體外(in vitro)、體內(in vivo)、及離體(ex vivo)的形態變化、細胞永生化、異常的生長控制、病灶形成、增殖、惡性腫瘤、腫瘤特異性標記水平的調節、侵襲性、在合適的動物宿主例如裸鼠中的腫瘤生長等等(Freshney,Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique(3rd ed.1994))。

「約(about)」意指在特定值的可接受誤差範圍內，如所屬技術領域中具有通常知識者所判定，其將部分地取決於該值是如何測量或判定的，即測量系統的限制。除非在實例或說明書中的其他地方在一特定檢定、結果、或實施例的上下文中另有明確說明，「約(about)」意指根據在所屬技術領域中的實務在一個標準偏差內，或者至多5%的範圍，以較大者為準。

「對象(subject)」包括任何人類或非人類動物。「非人類動物(nonhuman animal)」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類、爬蟲類等。除非另有說明，用語「患者(patient)」或「對象(subject)」可互換使用。

「治療(treat/treatment)」係指治療性處理及疾病預防性或防治性措施兩者，其中目標係預防或減緩(減輕)非所欲的生理變化或病症。有益或所欲之臨床成果包括緩解症狀、減小疾病程度、使疾病進入穩定化(即不惡化)狀態、延緩或減慢疾病進程、改善或緩和疾病狀態、及緩解(無論部分或完全)，無論可偵測或不可偵測。「治療」亦可意指相較於未接受治療之對象之預期存活而延長存活。該等有治療需要的包括該等已具有狀況或病症的，以及該等易患有狀況或病症的，或者該等要防治狀況或病症的。

「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指有效達成所欲治療成果所需之劑量及時間段的量。治療有效量可依不同因素而異，諸如個體之疾病狀態、年齡、性別、及體重、以及治療劑或治療劑的組合在個體中誘發所欲反應的能力。有效的治療劑或治療劑組合之例示性指標包括例如患者之幸福感改善。

整份說明書中抗體恆定區中的胺基酸殘基編號係根據如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中所述的EU索引(EU index)實施，除非另有明確說明。

習用一字母及三字母胺基酸代碼係於本文中使用且如表1所示。

物質組成

本發明提供抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段；多特異性抗體，其包含本發明之抗TMEFF2抗體之抗原結合片段；及雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段。本發明提供編碼本發明之抗體或其互補核酸的多肽及多核苷酸、載體、宿主細胞、以及製造及使用彼等之方法。

抗TMEFF2抗體

相對於其他正常組織，TMEFF2表現顯著地富集於前列腺組織及前列腺癌中。膜性TMEFF2在整個疾病進展期間保留，其作為抗腫瘤治療劑的可能目標。已知TMEFF2係由蛋白酶裂解，而導致可溶形式的抗原。在本發明中，產生針對TMEFF2之近膜區之抗體，以最大化至膜TMEFF2的抗體結合，並最小化所得抗體結合可溶TMEFF2形式的可能性。

本發明提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其結合至TMEFF2之SEQ ID NO：110之近膜區。結合TMEFF2之近膜區的本發明之抗TMEFF2抗體並未由細胞內化(internalized)。雖然不欲受到任何特定理論束縛，但可預期的是，當相較於內化抗TMEFF2抗體時，非內化抗TMEFF2抗體具有改善的由抗體效應功能介導之致癌效應，這是因為缺乏TMEFF2的內化及降解所導致。

「結合至近膜區(bind to a membrane proximal region)」意指90%使用氫/氘交換(H/D交換)識別的抗體表位殘基位於TMEFF2之近膜區內。表位殘基係以透過H/D交換下至少5%的氘化水平差異而受測試抗體保護的表位殘基。例示性此類抗體係如本文中所述之TMEB675、TMEB570、TMEB674、TMEB565、TMEB762、及TMEB757。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段在殘基HGKCEHSINMQEPSC(SEQ ID NO：57)或DAGYTGQHCEKKDYSVL(SEQ ID NO：58)內結合至TMEFF2之近膜區。在殘基HGKCEHSINMQEPSC(SEQ ID NO：57)內結合的例示性抗TMEFF2 抗體係TMEB570。在殘基DAGYTGQHCEKKDYSVL(SEQ ID NO：58)內結合的例示性抗TMEFF2抗體係TMEB675。亦預期TMEB675變異體TMEB762及TMEB757在殘基DAGYTGQHCEKKDYSVL(SEQ ID NO：58)內結合TMEFF2之近膜區。

在H/D交換檢定中，將重組表現之TMEFF2 ECD在抗體存在或不存在下於氘化水中培養預定時間，導致在可交換的氫原子處(未受抗體保護)摻入氘，隨後以蛋白酶消化蛋白質並使用LC-MS分析肽片段。H/D交換檢定可使用已知規程執行。例示性規程係描述於實例5中。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與參考抗體競爭結合至TMEFF2之近膜區，該參考抗體包含：SEQ ID NO：25之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：28之輕鏈可變區(VL)、SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL、SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL、SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL、SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL、或SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。

測試抗體與參考抗體對於TMEFF2之近膜區結合的競爭情形可使用熟知方法在體外檢定。例如，於未標記參考抗體存在下之MSD Sulfo-Tag^TM NHS-酯標記測試抗體對於TMEFF2之近膜區的結合可藉由ELISA評估，或者Bioacore分析或流動式細胞測量術可用來展示競爭情形。當測試抗體抑制85%或更多(例如90%或更多、或95%或更多)參考抗體至TMEFF2之近膜區的結合時，則該測試抗體與該參考抗體競爭結合至TMEFF2。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含下列之重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2、及LCDR3：分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及22；分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21、及23；分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20、及24；分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20、及22；或分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86。

在一些實施例中，本發明之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段以約0.4×10^-9M或更低的平衡解離常數(K_D)結合至TMEFF2之該近膜區，其中該K_D係在室溫下以pH 4.5至5.0於乙酸鹽緩衝液中使用表面電漿共振來測量。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段以介於約0.1×10^-10M與約0.4×10^-9M之間的K_D結合至TMEFF2之近膜區。

抗體對TMEFF2之近膜區的親和力可使用任何合適方法來實驗判定。一種例示性方法利用ProteOn XPR36、Biacore 3000或KinExA儀器設備、ELISA或所屬技術領域中具有通常知識者已知的競爭性結合檢定。如果在不同條件(例如滲透性、pH)下測量，則所測得之抗體對TMEFF2的親和力可能會有所變化。因此，親和力及其他結合參數(例如，K_D、K_on、及Koff)之測量一般是以標準化條件及標準化緩衝液進行，諸如本文中所述之緩衝液。所屬領域中具有通常知識者會理解到，在典型偵測極限內，親和力測量(例如使用Biacore 3000或ProteOn進行)的內部誤差(測量為標準差，SD)一般可在測量結果的5至33%內。因此，用語「約(about)」在指稱K_D值時，反映檢定中之一般標準偏差。舉例而言，1×10^-9M之K_D的一般SD係至多±0.33×10^-9M。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其結合至TMEFF2之近膜區，該抗體或其抗原結合片段包含衍生自VH3_3-23(SEQ ID NO：53)或VH1_1-69(SEQ ID NO：54)之重鏈可變區(VH)架構。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其結合至TMEFF2之近膜區，該抗體或其抗原結合片段包含衍生自VKI_L11(SEQ ID NO：55)或VKIIII_A27(SEQ ID NO：56)之輕鏈可變區(VL)架構。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其結合至TMEFF2之近膜區，該抗體或其抗原結合片段包含分別衍生自SEQ ID NO：53之VH3_3-23及SEQ ID NO：55之VKI_L11的VH架構及VL架構。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其結合至TMEFF2之近膜區，該抗體或其抗原結合片段包含分別衍生自SEQ ID NO：54之VH1_1-69及SEQ ID NO：56之VKIII_A27的VH架構及VL架構。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其結合至TMEFF2之近膜區，該抗體或其抗原結合片段包含分別衍生自SEQ ID NO：54之VH1_1-69及SEQ ID NO：55之VKI_L11的VH架構及VL架構。

包含「衍生自(derived from)」特定架構或生殖系序列之重鍊或輕鏈可變區的抗體係指自使用人類生殖系免疫球蛋白基因的系統獲得的抗體，例如來自基因轉殖小鼠、大鼠、或雞，或來自如本文中所討論之噬菌體展示庫。由於例如天然存在的體細胞突變或刻意取代，含有衍生自生殖系序列之特定架構的抗體相較於其來源的序列可能含有胺基酸差異。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL。

在一些實施例中，VH係由SEQ ID NO：39之多核苷酸編碼，且VL係由SEQ ID NO：42之多核苷酸編碼。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：32之HC及SEQ ID NO：35之LC。

在一些實施例中，HC係由SEQ ID NO：46之多核苷酸編碼，且VL係由SEQ ID NO：49之多核苷酸編碼。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21、及23之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL。

在一些實施例中，VH係由SEQ ID NO：40之多核苷酸編碼，且VL係由SEQ ID NO：43之多核苷酸編碼。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC及SEQ ID NO：36之LC。

在一些實施例中，HC係由SEQ ID NO：47之多核苷酸編碼，且LC係由SEQ ID NO：50之多核苷酸編碼。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20、及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL。

在一些實施例中，VH係由SEQ ID NO：41之多核苷酸編碼，且VL係由SEQ ID NO：44之多核苷酸編碼。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：34之HC及SEQ ID NO：37之LC。

在一些實施例中，HC係由SEQ ID NO：48之多核苷酸編碼，且LC係由SEQ ID NO：51之多核苷酸編碼。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL。

在一些實施例中，VH係由SEQ ID NO：40之多核苷酸編碼，且VL係由SEQ ID NO：45之多核苷酸編碼。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC及SEQ ID NO：38之LC。

在一些實施例中，HC係由SEQ ID NO：47之多核苷酸編碼，且LC係由SEQ ID NO：52之多核苷酸編碼。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL。

在一些實施例中，VH係由SEQ ID NO：95之多核苷酸編碼，且VL係由SEQ ID NO：96之多核苷酸編碼。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：91之HC及SEQ ID NO：92之LC。

在一些實施例中，HC係由SEQ ID NO：97之多核苷酸編碼，且LC係由SEQ ID NO：98之多核苷酸編碼。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。

在一些實施例中，VH係由SEQ ID NO：99之多核苷酸編碼，且VL係由SEQ ID NO：100之多核苷酸編碼。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：93之HC及SEQ ID NO：94之LC。

在一些實施例中，HC係由SEQ ID NO：101之多核苷酸編碼，且LC係由SEQ ID NO：102之多核苷酸編碼。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段係多特異性抗體。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段係雙特異性抗體。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2雙特異性抗體或其抗原結合片段結合T細胞抗原。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2雙特異性抗體或其抗原結合片段結合CD3。

在一些實施例中，經單離之抗TMEFF2雙特異性抗體或其抗原結合片段結合CD3ε。

本發明之例示性抗TMEFF2抗體之VH、VL、HCDR、LCDR、HC、及LC序列係顯示於表5至表12中。

雖然實例中所說明之實施例包含可變域對(一個來自重鏈，且一個來自輕鏈)，所屬技術領域中具有通常知識者會認知到替代實施例可包含單一重鏈或輕鏈可變域。單一可變域可用來篩選出能夠形成兩域特異性抗原結合片段(能夠結合至TMEFF2)的可變域。此篩選可藉由噬菌體展示篩選方法來達成，例如使用階層式雙組合法(揭示於國際專利公開號WO1992/01047中)。在此法中，含有VH或VL鏈之一者之殖株(clone)的個別集落(colony)係用來感染編碼其他鏈(VL或VH)之殖株的完整庫，並且所得兩鏈特異性抗原結合域係依據噬菌體呈現技術使用習知方法及本文中所述者來選擇。因此，個別VH及VL多肽鏈有用於使用國際專利公開號WO1992/01047中所揭示之方法來識別額外抗TMEFF2抗體。

同源抗體

本發明之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段(包含顯示於表9之VH或VL胺基酸序列)的變異體係在本發明之範疇內。例如，變異體可以在VH及/或VL中包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、或十五個胺基酸取代，只要當相較於親本抗體時，同源抗體保持或改善功能性質，諸如對於TMEFF2的類似結合或改善穩定性。在一些實施例中，對本發明之VH或VL胺基酸序列的序列一致性可係約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

在一些實施例中，本發明之同源抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段以約0.4×10^-9M或更低的平衡解離常數(K_D)結合至TMEFF2之近膜區，其中K_D係在室溫下以pH 4.5至5.0於乙酸鹽緩衝液中使用表面電漿共振來測量。

在一些實施例中，本發明之同源抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段以介於約0.1×10^-10M與約0.4×10^-9M之間的K_D結合至TMEFF2之近膜區。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL，其中VH、VL、或VH及VL兩者可選地包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、或十五個胺基酸取代。可選地，任何取代均不在CDR內。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL，其中VH、VL、或VH及VL兩者可選地包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、或十五個胺基酸取代。可選地，任何取代均不在CDR內。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL，其中VH、VL、或VH及VL兩者可選地包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、或十五個胺基酸取代。可選地，任何取代均不在CDR內。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL，其中VH、VL、或VH及VL兩者可選地包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、或十五個胺基酸取代。可選地，任何取代均不在CDR內。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL，其中VH、 VL、或VH及VL兩者可選地包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、或十五個胺基酸取代。可選地，任何取代均不在CDR內。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL，其中VH、VL、或VH及VL兩者可選地包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、或十五個胺基酸取代。可選地，任何取代均不在CDR內。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含具有與SEQ ID NO：25、26、27、87、或89之VH至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的胺基酸序列之VH。可選地，該等序列號(SEQ ID NO：)之序列中的任何變異均不在CDR內。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含具有與SEQ ID NO：28、29、30、31、88、或90之VL至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列之VL。可選地，該等序列號(SEQ ID NO：)之序列中的任何變異均不在CDR內。

所選抗TMEFF2抗體之VH域之胺基酸序列的比對係顯示於圖1中，且所選抗TMEFF2抗體之VL域之胺基酸序列的比對係顯示於圖2中。VH及VL鏈係以各列開始處之其SEQ ID NO：識別。VH及/或VL中的可能取代位點係抗體之間不同的殘基位置。例如，可在SEQ ID NO：25、27、87、及89之VH中之殘基位置14、20、54、56、59、76、82、84、93、107(編號係基於SEQ ID NO 25)處進行取代。同樣地，可在SEQ ID NO：28、30、88、及90之VL中之殘基位置1、95、及107處進行取代。可進行的例示性取代係保守胺基酸取代，或用存在於各抗TMEFF2抗體中對應殘基位置之胺基酸殘基取代。

兩個序列間之同一性百分比係該等序列所共有之相同位置數目的函數(即同一性%=相同位置數目/總位置數目×100)，並且將需要被引入以最佳比對這兩個序列之缺口(gap)數目及各缺口長度納入考慮。

兩個胺基酸序列之間的同一性百分比可以使用已被併入ALIGN程式(版本2.0)中的E.Meyers及W.Miller的演算法(Comput Appl Biosci 4：11-17(1988))來判定，其使用PAM120權重殘基表(weight residue table)，缺口長度罰分(gap length penalty)為12且缺口罰分(gap penalty)為4。此外，兩個胺基酸序列之間的同一性百分比可以使用已併入GCG套裝軟體(可在www.Gcg.com取得)之GAP程式中的Needleman及Wunsch(J Mol Biol 48：444-453(1970))演算法來判定，其使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，且缺口權重(gap weight)為16、14、12、10、8、6、或4且長度權重(length weight)為1、2、3、4、5、或6。

具有保守修飾的抗體

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含：包含HCDR1、HCDR2、及HCDR3序列的VH；及包含LCDR1、LCDR2、及LCDR3序列的VL，其中該等CDR序列中之一或多者包含基於本文所述抗體(例如顯示於表5至表12中的抗體)之指定胺基酸序列或其保守修飾，且其中該等抗體保留親本抗體的所欲功能性質。

在一些實施例中，具有保守修飾之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段以約0.4×10^-9M或更低的平衡解離常數(K_D)結合至TMEFF2之近膜區，其中K_D係在室溫下以pH 4.5至5.0於乙酸鹽緩衝液中使用表面電漿共振來測量。

在一些實施例中，具有保守修飾之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段以介於約0.1×10^-10M與約0.4×10^-9M之間的K_D結合至TMEFF2之近膜區。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3、及其保守修飾。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：SEQ ID NO：11、13、16、19、21、及23之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3、及其保守修飾。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20、及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3、及其保守修飾。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3、及其保守修飾。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3、及其保守修飾。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL、及其保守修飾。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL、及其保守修飾。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL、及其保守修飾。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL、及其保守修飾。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL、及其保守修飾。

本發明亦提供一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL、及其保守修飾。

「保守修飾(conservative modification)」係指不會顯著影響或改變含有胺基酸修飾之抗體之結合特性的胺基酸修飾。保守修飾包括胺基酸取代、添加(addition)及缺失(deletion)。保守胺基酸取代為胺基酸被具有相似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。具有相似側鏈之胺基酸殘基的家族已有明確界定，且包括具有以下者之胺基酸：酸性側鏈(如天冬胺酸、麩胺酸)、鹼性側鏈(如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、非極性側鏈(如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、不帶電極性側鏈(如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸)、芳族側鏈(如苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸、酪胺酸)、脂族側鏈(如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸)、醯胺(如天冬醯胺酸、麩醯胺酸)、β分支側鏈(如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)、及含硫側鏈(半胱胺酸、甲硫胺酸)。此外，多肽中的任何天然殘基亦可經丙胺酸取代，如先前已針對丙胺酸掃描式突變誘發(alanine scanning mutagenesis)所描述者(MacLennan等人，(1988)Acta Physiol Scand Suppl 643：55-67；Sasaki等人，(1988)Adv Biophys 35：1-24)。本發明對於抗體的胺基酸取代可藉由例如PCR突變誘發的已知方法進行(美國專利第4,683,195號)。替代地，可產生變異體庫，例如使用隨機(NNK)或非隨機密碼子(例如DVK密碼子)，其編碼11種胺基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp)。所得抗體變異體可使用本文中所述之檢定來測試其特性。

免疫偶聯物(immunoconjugate)

「免疫偶聯物(immunoconjugate)」係指偶聯至一或多個異源分子的本發明之抗體。

本發明亦提供一種免疫偶聯物，其包含偶聯至異源分子的本發明之經單離之抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，異源分子係可偵測標記。

偶聯至可偵測標記之本發明之經單離之抗體或其抗原結合片段可用於評估各種樣本上的TMEFF2表現。可偵測標記包括在偶聯至本發明之經單離之抗體或其抗原結合片段時使得該抗體或其抗原結合片段可經由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、或化學手段來偵測的組合物。

例示性可偵測標記包括放射性同位素、磁珠、金屬珠、膠態粒子、螢光染料、電子緻密試劑、酶(例如，如通常用於ELISA中)、生物素、長葉毛地黃配質(digoxigenin)、半抗原、發光分子、化學發光分子、螢光染劑、螢光團、螢光淬熄劑、有色分子、放射性同位素、閃爍劑(scintillate)、卵白素、鏈黴親和素、蛋白A、蛋白G、抗體或其片段、多組胺酸、Ni²⁺、Flag標籤、myc標籤、重金屬、酶、鹼性磷酸酶、過氧化酶、螢光素酶、電子供體/受體、吖啶酯(acridinium ester)、及比色基質。

可偵測標記可自發地發射信號，諸如在可偵測標記為放射性同位素時。在其他情況下，可偵測標記在經外部場刺激後發射信號。

例示性放射性同位素可係_γ發射性、鄂惹發射性(Auger-emitting)、β發射性、α發射性、或正電子發射性放射性同位素。例示性放射性同位素包括³H、¹¹C、¹³C、¹⁵N、¹⁸F、¹⁹F、⁵⁵Co、⁵⁷Co、⁶⁰Co、⁶¹Cu、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Ga、⁷²As、⁷⁵Br、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁹⁰Sr、^94mTc、^99mTc、¹¹⁵In、¹²³1、¹²⁴1、¹²⁵I、¹³¹1、²¹¹At、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁶Ra、²²⁵Ac、及²²⁷Ac。

例示性金屬原子為原子序大於20之金屬，諸如鈣原子、鈧原子、鈦原子、釩原子、鉻原子、錳原子、鐵原子、鈷原子、鎳原子、銅原子、鋅原子、鎵原子、鍺原子、砷原子、硒原子、溴原子、氪原子、銣原子、鍶原子、釔原子、鋯原子、鈮原子、鉬原子、鎝原子、釕原子、銠原子、鈀原子、銀原子、鎘原子、銦原子、錫原子、銻原子、碲原子、碘原子、氙原子、銫原子、鋇原子、鑭原子、鉿原子、鉭原子、鎢原子、錸原子、鋨原子、銥原子、鉑原子、金原子、汞原子、鉈原子、鉛原子、鉍原子、鍅原子、鐳原子、錒原子、鈰原子、鐠原子、釹原子、鉕原子、釤原子、銪原子、釓原子、鋱原子、鏑原子、鈥原子、鉺原子、銩原子、鐿原子、鎦原子、釷原子、鏷原子、鈾原子、錼原子、鈽原子、鋂原子、鋦原子、鉳原子、鉲原子、鑀原子、鐨原子、鍆原子、鍩原子、或鐒原子。

合適染料包括任何市售可得之染料，諸如例如5(6)-羧基螢光素、IRDye 680RD順丁烯二醯亞胺或IRDye 800CW、釕聚吡啶基染料、及類似者。

合適螢光團係螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyante,FITC)、螢光素胺基硫脲(fluorescein thiosemicarbazide)、玫瑰紅(rhodamine)、德克薩斯紅(Texas Red)、CyDye(例如，Cy3、Cy5、Cy5.5)、Alexa Fluor(例如，Alexa488、Alexa555、Alexa594；Alexa647)、近紅外(NIR)(700至900nm)螢光染料、及羰花青(carbocyanine)及胺基苯乙烯基染料。

偶聯至可偵測標記的本發明之經單離之抗體或其抗原結合片段可用於作為顯像劑。

可使用已知方法將本發明之經單離之抗體或其抗原結合片段偶聯至可偵測標記。

在一些實施例中，可偵測標記與螯合劑錯合。

在一些實施例中，可偵測標記係經由連接子偶聯至本發明之抗體或其抗原結合片段。

可使用已知方法將可偵測標記直接或間接地連接至本發明之抗體或其抗原結合片段。合適連接子為所屬技術領域中已知的，且包括例如輔基、非酚連接子(N-琥珀醯亞胺基苯甲酸酯；十二硼酸酯之衍生物)、大環及非環狀螯合劑兩者之螯合部分，諸如1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10,四乙酸(DOTA)之衍生物、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)之衍生物、S-2-(4-異硫氰基苄基)-1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)之衍生物、及1,4,8,11-四氮雜環十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)之衍生物、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫烷鹽(IT)、亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二亞胺二甲酯鹽酸鹽(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(諸如雙琥珀醯亞胺辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)、及其他螯合部分。合適肽連接子為熟知的。

雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該抗體結合至TMEFF2之近膜區。雖然不欲受到任何特定理論束縛，但雙特異性抗體對於TMEFF2之近膜區的結合可更有效率地對T細胞介導之腫瘤細胞殺滅進行介導。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該抗體與參考抗體競爭結合至TMEFF2之近膜區，該參考抗體包含：SEQ ID NO：25之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：28之輕鏈可變區(VL)、SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL、SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL、SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL、SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL、或SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。

在一些實施例中，經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段以約0.4×10^-9M或更低的解離常數(K_D)結合TMEFF2之近膜區，其中K_D係在室溫下以pH 4.5至5.0於乙酸鹽緩衝液中使用表面電漿共振來測量。

在一些實施例中，經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段以介於約0.1×10^-10M與約0.4×10^-9M之間的K_D結合TMEFF2之近膜區。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該第一結構域包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3：分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及22；分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21、及23；分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20、及24；o分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20、及22；或分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該第二結構域包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3：分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64、及65；或分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該第一結構域包含：SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL；SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL；SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL；SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL；SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL；或SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該第二結構域包含：SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；或SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL。

在一些實施例中，該第二結構域包含SEQ ID NO：59之VH及SEQ ID NO：111之VL。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：32之第一重鏈(HC1)、SEQ ID NO：35之第一輕鏈(LC1)、SEQ ID NO：76之第二重鏈(HC2)、及SEQ ID NO：77之第二輕鏈(LC2)。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21、及23之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：36之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20、及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：34之HC1、SEQ ID NO：37之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：38之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：91之第一重鏈(HC1)、SEQ ID NO：92之第一輕鏈(LC1)、SEQ ID NO：76之第二重鏈(HC2)、及SEQ ID NO：77之第二輕鏈(LC2)。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：93之第一重鏈(HC1)、SEQ ID NO：94之第一輕鏈(LC1)、SEQ ID NO：76之第二重鏈(HC2)、及SEQ ID NO：77之第二輕鏈(LC2)。

經工程改造及經修飾抗體

本發明之抗體或其抗原結合片段可進一步經工程改造以產生當相較於親本抗體時具有相似或改變性質之經修飾抗體。在本發明之抗體中，VH、VL、VH及VL、恆定區、重鏈架構、輕鏈架構、或六個CDR之任一者或全部可經工程改造。

本發明之抗體可藉由CDR移植來工程化。可將本發明之抗體的一或多個CDR序列移植至不同的架構序列。CDR移植可使用本文所述之方法及習知方法進行。

可使用之架構序列可自包括生殖系抗體基因序列的公共DNA資料庫或公開之參考文獻獲得。例如，生殖系DNA及人類重鏈及輕鏈可變域基因所編碼之蛋白質序列可見於IMGT®(the international ImMunoGeneTics information system® www.Imgt.org)。可用於置換本發明之抗體中現有架構序列的架構序列可為在VH或VL之整個長度上或在FR1、FR2、FR3、及FR4之長度上與親本可變域顯示最高同一性百分比(%)的架構序列。此外，可基於VH及VL、CDR1及CDR2長度或相同的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1及HCDR2正則結構(canonical structure)進一步選擇合適的架構。可使用已知方法來選擇合適的架構，諸如美國專利第8,748,356號中描述的人類架構調適或美國專利第7,709,226號中描述的超人源化(superhumanization)。

親本抗體及經工程改造之抗體的架構序列可經進一步修飾，例如藉由回復突變(backmutation)以恢復及/或改善所產生之抗體與抗原的結合，如例如美國專利第6,180,370號中所述。親本抗體或經工程改造之抗體的架構序列可進一步藉由突變架構區內(或替代地一或多個CDR區內)的一或多個殘基來修飾，以移除T細胞表位，從而降低抗體的潛在免疫原性(immunogenicity)。此方法亦稱為「去免疫化(deimmunization)」且係進一步詳細描述於美國專利公開號US20070014796中。

本發明之抗體之CDR殘基可經突變以調節該等抗體對TMEFF2及/或CD3的親和力。

本發明之抗體之CDR殘基可經突變以最小化轉譯後修飾的風險。用於脫胺(NS)、酸催化水解(DP)、異構化(DS)、或氧化(W)的推定模體(putative motif)的胺基酸殘基可被任何天然存在的胺基酸取代以誘變(mutagenize)該等模體，並且可使用本文所述之方法測試所生成之抗體的功能性及穩定性。

經修飾以改善穩定性、選擇性、交叉反應性、親和力、免疫原性(immunogenicity)、或其他所欲生物或生物物理性質的本發明之抗體係在本發明之範疇內。抗體穩定性會受多種因素影響，包括(1)影響抗體固有穩定性之個別域的核心堆積(core packing)、(2)對HC及LC配對具有影響的蛋白質/蛋白質界面相互作用、(3)極性及帶電荷殘基之埋藏、(4)極性及帶電荷殘基之H鏈結網絡；及(5)在其他分子內及分子間力中之表面電荷及極性殘基分布(Worn等人，(2001)J Mol Biol 305：989-1010)。可能使結構不穩定的殘基可基於該抗體之晶體結構或者在某些情況下可藉由分子模擬來識別出來，並且殘基對於抗體穩定性之效應可藉由產生並評估在所識別之殘基中含有突變之變異體來測試。提高抗體穩定性的其中一個方式係提升熱轉移中點(thermal transition midpoint,T_m)，如由微差掃描熱量法(DSC)所測得者。通常，蛋白質之T_m與其穩定性相關，且與其對於在溶液中之展開(unfolding)及變性的易感性及取決於蛋白質展開之傾向的降解過程反相關(Remmele等人，(2000)Biopharm 13：36-46)。多個研究已發現配方物理穩定性(以DSC測得為熱穩定性)之排序(ranking)與以其他方法測得之物理穩定性間有關聯性(Gupta等人，(2003)AAPS PharmSci 5E8；Zhang等人，(2004)J Pharm Sci 93：3076-89；Maa等人，(1996)Int J Pharm 140：155-68；Bedu-Addo等人，(2004)Pharm Res 21：1353-61；Remmele等人，(1997)Pharm Res 15：200-8)。配方研究顯示Fab之T_m具有對於一相應mAb之長期物理穩定性的涵示。

可藉由血流中的內源性循環羧肽酶從注射的抗體中除去C-末端離胺酸(CTL)(Cai et al.,(2011)Biotechnol Bioeng 108：404-412)。在製造期間，藉由控制胞外Zn²⁺、EDTA或EDTA-Fe³⁺的濃度可將CTL移除控制在小於最大水準，如美國專利公開號US20140273092。抗體中之CTL含量可使用已知方法測量。

可對本發明之抗體進行Fc取代以調節抗體效應功能及/或藥物動力學性質。在傳統的免疫功能中，抗體-抗原複合物與免疫系統細胞的交互作用導致廣泛的反應，範圍從效應功能(例如抗體依賴性細胞毒性、肥大細胞去顆粒(mast cell degranulation)、及吞噬作用)至免疫調節信號(例如調節淋巴球增殖及抗體分泌)。所有這些交互作用係透過抗體或免疫複合物的Fc結構域與細胞上的特化細胞表面受體的結合來起始。抗體及免疫複合物所觸發之細胞反應的多樣性起因於Fc受體的異質性：Fc_γRI(CD64)、Fc_γRIIa(CD32A)、及Fc_γRIII(CD16)係活化性Fc_γ受體(即，免疫系統增強)，而Fc_γRIIb(CD32B)係抑制性Fc_γ受體(即，免疫系統減弱)。與FcRn受體的結合會調節抗體半衰期。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體在Fc區中包含至少一個取代。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體在Fc區中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、或十五個取代。

Fc位置可經取代，以調節抗體半衰期。可進行來增加抗體半衰期的例示性單個或組合取代係M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A及T307A/E380A/N434A取代。可進行來減少抗體半衰期的例示性單個或組合取代係H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A及H435R取代。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體在Fc區中包含至少一個取代，該取代係選自由M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A、T307A/E380A/N434A、H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、 M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及H435R所組成之群組。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體在Fc區中包含至少一個取代，其減少該抗體與活化性Fc_γ受體(Fc_γR)的結合且/或降低Fc效應功能(諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP))。

可經取代以減少抗體與活化性Fc_γR的結合並隨後降低效應功能之Fc位置係下列之取代：IgG1上的L234A/L235A、IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4上的F234A/L235A、IgG4上的S228P/F234A/L235A、所有Ig同型上的N297A、IgG2上的V234A/G237A、IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1上的S267E/L328F、IgG1上的L234F/L235E/D265A、IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S、及IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。

可在IgG4抗體中進行習知的S228P取代以增強IgG4的穩定性。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含S228P取代，其中殘基編號係根據EU索引。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含F234A、L235A、或F234A/L235A取代，其中殘基編號係根據EU索引。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含S228P、F234A、及L235A取代，其中殘基編號係根據EU索引。

產生同源抗體、具有保守修飾的抗體、以及工程及修飾抗體的方法

當與親本抗體相比時具有改變的胺基酸序列的本發明之抗體可使用標準選殖及表現技術產生。例如，可執行定點誘變或PCR介導的誘變以引入(多個)突變，且對抗體結合或其他所關注性質的影響可使用熟知方法及本文在實例中所述之方法來評估。

抗體同型及同種異型

本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體可係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係IgG1同型。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係IgG2同型。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係IgG3同型。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係屬於IgG4同型。

治療性抗體的免疫原性與輸注反應(infusion reaction)的風險增加及治療反應的持續時間減少相關聯(Baert等人，(2003)N Engl J Med 348：602-08)。治療性抗體在宿主中誘導免疫反應的程度可部分地由該抗體之同種異型決定(Stickler et al.,(2011)Genes及Immunity 12：213-21)。抗體同種異型與抗體恆定區序列中特定位置處的胺基酸序列變異相關。表2顯示所選之IgG1、IgG2、及IgG4同種異型。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係G2m(n)同種異型。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係G2m(n-)同種異型。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係G2m(n)/(n-)同種異型。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係nG4m(a)同種異型。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係G1m(17)同種異型。

在一些實施例中，本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係G1m(17,1)同種異型。

抗遺傳型抗體(anti-idiotypic antibody)

本發明亦提供一種抗遺傳型抗體，其特異性結合至本發明之抗TMEFF2抗體或雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體。

本發明亦提供一種抗遺傳型抗體，其特異性結合至本發明之抗TMEFF2抗體，該抗TMEFF2抗體包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL。

本發明亦提供一種抗遺傳型抗體，其特異性結合至本發明之抗TMEFF2抗體，該抗TMEFF2抗體包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL。

本發明亦提供一種抗遺傳型抗體，其特異性結合至本發明之抗TMEFF2抗體，該抗TMEFF2抗體包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL。

本發明亦提供一種抗遺傳型抗體，其特異性結合至本發明之抗TMEFF2抗體，該抗TMEFF2抗體包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL。

本發明亦提供一種抗遺傳型抗體，其特異性結合至本發明之抗TMEFF2抗體，該抗TMEFF2抗體包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL。

本發明亦提供一種抗遺傳型抗體，其特異性結合至本發明之抗TMEFF2抗體，該抗TMEFF2抗體包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。

抗遺傳型(Id)抗體係識別抗體之抗原決定位(例如互補位(paratope)或CDR)的抗體。Id抗體可為抗原阻斷或非阻斷的。抗原阻斷Id可用於偵測樣本中的游離抗體(例如本文中所述之本發明之抗TMEFF2抗體)。非阻斷Id可用於檢測樣本中的總抗體(游離的、部分結合抗原的、或完全結合抗原的)。Id抗體可藉由以正在製備抗Id的抗體免疫動物來製備。

抗遺傳型抗體也可用作為「免疫原(immunogen)」，以在另一動物誘導免疫反應，產生所謂的抗-抗遺傳型抗體(anti-anti-Id antibody)。抗-抗遺傳型的表位可與誘導該抗遺傳型的原始mAb之表位相同。因此，藉由使用抗mAb的遺傳型決定子之抗體，可以識別表現具相同專一性之抗體的其它殖株。抗Id抗體可藉由任何合適的技術來變化(從而產生抗Id抗體變異體)及/或衍生化，諸如本文別處所述之技術。

本發明之單特異性抗體的產生

在一些實施例中，抗TMEFF2抗體係人類的。

在一些實施例中，抗TMEFF2抗體係人源化的。

可使用各種技術產生本發明之單特異性抗體。例如，Kohler and Milstein,Nature 256：495,1975之融合瘤法可用來產生單株抗體。在該融合瘤法中，將小鼠或其他宿主動物(諸如倉鼠、大鼠、或猴)用人類、黑猩猩、或獼猴TMEFF2或TMEFF2之片段(諸如TMEFF2之近膜區)來免疫化，接著使用標準方法將來自經免疫化動物之脾細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。對於從單一免疫化融合瘤細胞而來的集落進行篩選以生產具有所欲性質的抗體，該等所欲性質諸如結合特異性、交叉反應性或缺乏交叉反應性、及抗原親和性。

各種宿主動物皆可用來生產本發明之抗TMEFF2抗體。例如，Balb/c小鼠可用來產生小鼠抗人類TMEFF2抗體。Balb/c小鼠及其他非人類動物中所製造之抗體可使用各種技術來人化以產生更近似人類的序列。

例示性人源化技術(包括人類受體架構選擇)為已知，且包括CDR移植(美國專利第5,225,539號)、SDR移植(美國專利第6,818,749號)、表面重塑(Resurfacing)(Padlan,(1991)Mol Immunol 28：489-499)、特異性決定殘基表面重塑(Specificity Determining Residues Resurfacing)(美國專利公開號2010/0261620)、人類架構調適(美國專利第8,748,356號)、或超人源化(美國專利第7,709,226號)。在這些方法中，親本抗體的CDR被轉移到人類架構上，該人類架構可基於彼等與親本架構的整體同源性、基於CDR長度的相似性、或正則結構(canonical structure)同一性、或其組合來選擇。

可將人源化抗體進一步最佳化以改善其對所欲抗原的選擇性或親和力，此係由諸如在國際專利公開號WO1090/007861及WO1992/22653中所述之技術藉由併入經修改之架構支撐殘基以保存結合親和力(回復突變(backmutation))，或藉由在例如任何CDR引入變異以改善抗體之親和力。

在其基因體中帶有人體免疫球蛋白(Ig)基因位點之基因轉殖動物(諸如，小鼠、大鼠、或雞)可用於產生針對目標蛋白之人類抗體，且係描述於例如美國專利第6,150,584號、國際專利公開號WO99/45962、國際專利公開號WO2002/066630、WO2002/43478、WO2002/043478、及WO1990/04036、Lonberg et al(1994)Nature 368：856-9；Green et al(1994)Nature Genet.7：13-21；Green & Jakobovits(1998)Exp.Med.188：483-95；Lonberg and Huszar(1995)Int Rev Immunol 13：65-93；Bruggemann et al.,(1991)Eur J Immunol 21：1323-1326；Fishwild et al.,(1996)Nat Biotechnol 14：845-851；Mendez et al.,(1997)Nat Genet 15：146- 156；Green(1999)J Immunol Methods 231：11-23；Yang et al.,(1999)Cancer Res 59：1236-1243；Brüggemann and Taussig(1997)Curr Opin Biotechnol 8：455-458。可將此等動物中之內源性免疫球蛋白基因位點破壞或刪除，且可使用同源或非同源重組、使用轉染色體(transchromosome)、或使用袖珍基因(minigene)將至少一個完整或部分人類免疫球蛋白基因位點插入該動物基因體中。可使諸如Regeneron(www.Regeneron.com)、Harbour Antibodies(www.Harbourantibodies.com)、Open Monoclonal Technology,Inc.(OMT)(www.Omtinc.net)、KyMab(www.Kymab.com)、Trianni(www.Trianni.com)、及Ablexis(www.Ablexis.com)之公司使用如上所述的技術來提供針對所選擇抗原的人類抗體。

人類抗體可選自噬菌體展示庫，其中該噬菌體經工程改造以表現人類免疫球蛋白或其部分，諸如Fab、單鏈抗體(scFv)、或未配對或配對抗體可變區(Knappik et al.,(2000)J Mol Biol 296：57-86；Krebs et al.,(2001)J Immunol Meth 254：67-84；Vaughan et al.,(1996)Nature Biotechnology 14：309-314；Sheets et al.,(1998)PITAS(USA)95：6157-6162；Hoogenboom and Winter(1991)J Mol Biol 227：381；Marks et al.,(1991)J Mol Biol 222：581)。本發明之抗體可例如從噬菌體展示庫(表現抗體重鏈及輕鏈可變區)單離為具有噬菌體pIX外殼蛋白的融合蛋白，如在Shi et al.,(2010)J Mol Biol 397：385-96及國際專利申請案公開號WO09/085462中所述。該等庫可篩選出結合至人類及/或食蟹獼猴TMEFF2或CD3的噬菌體，且可進一步將所獲得之陽性殖株表徵，將Fab從殖株溶解物(lysate)單離出來，並表現為全長IgG。此類用於單離人類抗體的噬菌體展示方法係在例如下列中被描述：美國專利第5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,427,908、5,580,717、5,969,108、6,172,197、5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915及6,593,081號。

免疫性抗原(immunogenic antigen)之製備及單株抗體生產可使用任何合適技術來執行，諸如重組蛋白質生產。免疫性抗原可以經純化的蛋白質或包括全細胞或細胞或組織抽出物的蛋白質混合物之形式向動物投予，或者抗原可由編碼該抗原或其部分的核酸於動物體內重新地(de novo)形成。

本發明之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體的產生

可藉由將本文中經單離之TMEFF2結合VH/VL域與任何CD3結合VH/VL域(包括本文中所述者及公開可得者)組合，來產生本發明之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體。可使用的例示性CD3結合VH/VL域係如本文中所述的抗體CD3B219及CD3B376之CD3結合VH/VL域。可使用的例示性TMEFF2結合VH/VL域係抗體TMEB675、TMEB570、TMEB674、TMEB565、TMEB762、及TMEB757之TMEFF2結合VH/VL域。對所產生的雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體，測試其對於TMEFF2及CD3的結合、及其所欲功能特徵，諸如T細胞介導之TMEFF2表現細胞(例如，LNCaP)殺滅。

本發明之雙特異性抗體可例如使用兩個單特異性二價抗體之間的Fab臂交換(或半分子交換)來產生，其藉由於各半分子中之重鏈CH3界面引入取代以利於兩個具有不同特異性之抗體半分子的異二聚體在體外無細胞環境中或者使用共表現形成。該Fab臂交換反應係雙硫鍵異構化反應及CH3域之解離-締合的結果。親本單特異性抗體的鉸鏈區中的重鏈雙硫鍵被還原。其中一個親本單特異性抗體所生成之游離半胱胺酸與第二親本單特異性抗體分子的半胱胺酸殘基形成重鏈間雙硫鍵，同時該等親本抗體的CH3域藉由解離-締合而釋出及重新形成。該等Fab臂之CH3域可經工程改造以利於異二聚化而非同二聚化。所得產物係具有兩個Fab臂或半分子之雙特異性抗體，該等Fab臂或半分子各自結合不同表位，即TMEFF2上的表位及CD3上的表位。例如，本發明之雙特異性抗體可使用DuoBody®技術產生，該DuoBody®技術係描述於國際專利公開號WO2011/131746。一個重鏈中的突變F405L及另一個重鏈中的突變K409R可用於IgG1抗體的情況。至於IgG2抗體，可使用野生型IgG2及具有F405L和R409K取代的IgG2抗體。至於IgG4抗體，可使用野生型IgG4及具有F405L和R409K取代的IgG4抗體。為了產生雙特異性抗體，將第一單特異性二價抗體與第二單特異性二價抗體工程改造以在Fc區中具有前述突變，將該等抗體在足以允許鉸鏈區中的半胱胺酸經歷雙硫鍵異構化的還原條件下一起培養；從而藉由Fab臂交換來產生該雙特異性抗體。培養條件可最佳地被回復為非還原性(non-reducing)。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol,DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸、及β-巰基乙醇。舉例而言，可使用在至少20℃之溫度且有至少25mM之2-MEA存在下或於至少0.5mM之二硫蘇糖醇存在且在5至8之pH下(例如在7.0之pH下或在7.4之pH下)培養至少90min。

在一些實施例中，雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係IgG1同型，且當相較於SEQ ID NO：84之野生型IgG1時，該抗體在第一重鏈(HC1)中包含F405L取代，並在第二重鏈(HC2)中包含K409R取代。

在一些實施例中，該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係IgG4同型，且當相較於SEQ ID NO：85之野生型IgG4時，該抗體在HC2中包含F405L/R409K取代。

在一些實施例中，該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體係IgG4同型，且當相較於SEQ ID NO：85之野生型IgG4時，該抗體在HC1中包含S228P、F234A、及L235A取代，並在HC2中包含S228P、F234A、L235A、F405L、及R409K取代。

SEQ ID NO：84野生型IgG1

SEQ ID NO：85野生型IgG4

SEQ ID NO 103：IgG1 F405L

SEQ ID NO：109：IgG1 K409R

SEQ ID NO：104 IgG4 F405L/R409K

雙特異性抗體也可使用諸如下列的設計來產生：鈕扣結構(Knob-in-Hole)(Genentech)、CrossMAb(Roche)及靜電吸引(electrostatically-matched)(Chugai,Amgen,NovoNordisk,Oncomed)、LUZ-Y (Genentech)、鏈交換結構域體(Strand Exchange Engineered Domain body,SEEDbody)(EMD Serono)、及Biclonic(Merus)。

在「鈕扣結構(knob-in-hole)」策略(請參見例如國際公開號WO 2006/028936)中，在人類IgG中形成CH3域界面之所選胺基酸可在影響CH3域交互作用的位置處突變，以促進異二聚體形成。將具有小側鏈之胺基酸(孔)引入特異性結合第一抗原之抗體的重鏈中，並將具有大側鏈之胺基酸(鈕)引入特異性結合第二抗原之抗體的重鏈中。在共表現這兩個抗體之後，具有「孔」之重鏈與具有「鈕」之重鏈優先交互作用而導致異二聚體形成。形成鈕和孔之例示性CH3取代對係(表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置)：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S及T366W/T366S_L368A_Y407V。

CrossMAb技術除了利用「鈕扣結構」策略來促進Fab臂交換之外，亦利用一個半臂中的CH1/CL域交換，以確保所得雙特異性抗體有正確的輕鏈配對(參見例如美國專利第8,242,247號)。

可使用其他的交換(cross-over)策略，藉由在雙特異性抗體中的一個或兩個臂中的重鏈和輕鏈之間或在重鏈內交換可變或恆定結構域(或兩者)來產生本發明之全長雙特異性抗體。此等交換包括例如VH-CH1與VL-CL、VH與VL、CH3與CL、及CH3與CH1，如國際專利公開號WO2009/080254、2009/080251、WO2009/018386、及WO2009/080252中所述。

可使用其他策略，諸如使用靜電相互作用促進重鏈異二聚化，其取代一個CH3表面之帶正電荷殘基及第二CH3表面之帶負電荷殘基，如在美國專利公開號US2010/0015133；美國專利公開號US2009/0182127；美國專利公開號US2010/028637、或美國專利公開號US2011/0123532中所述。在其他策略中，異二聚化可藉由下列取代來促進(表現為第一重鏈之第一CH3域中的經修飾位置/第二重鏈之第二CH3域中的經修飾位置)：L351Y_F405A_Y407V/T394W、 T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L331Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如在美國專利公開號US2012/0149876或美國專利公開號US2013/0195849中所述。

SEEDbody技術可用於產生本發明之雙特異性抗體。SEEDbody在其恆定域中挑選經IgA殘基取代的IgG殘基以促進異二聚化，如在美國專利第US20070287170號中所述。

一般會使用標準方法在DNA水平對諸如抗體之恆定域的分子進行突變。

多核苷酸、載體及宿主細胞

本發明亦提供經單離之多核苷酸，其編碼本發明之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段。本發明亦提供經單離之多核苷酸，其編碼本發明之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段。該等能夠編碼本文中所提供之可變域區段的單離多核苷酸可被包括於相同(或不同)之載體上以生產抗體或抗原結合片段。多核苷酸可係互補去氧核酸(cDNA)，且可係針對合適宿主中之表現經最佳化的密碼子(codon)。密碼子最佳化為廣為人知之技術。

在一些實施例中，本文中所述之多核苷酸(及彼等所編碼之肽)包括前導序列(leader sequence)。可採用所屬技術領域中所習知的任何前導序列。前導序列可包括限制位(restriction site)或轉譯起始位(translation start site)。

本發明亦提供一種經單離之多核苷酸，其編碼本發明之抗體之VH、本發明之抗體之VL、本發明之抗體之重鏈、或本發明之抗體之輕鏈。

本發明亦提供一種經單離之多核苷酸，其編碼SEQ ID NO：25、26、27、87、或89之VH。

本發明亦提供一種經單離之多核苷酸，其編碼SEQ ID NO：28、29、30、31、88、或90之VL。

本發明亦提供一種經單離之多核苷酸，其編碼本發明之抗TMEFF2/抗CD3抗體之HC1、LC1、HC2、或LC2。

本發明亦提供一種經單離之多核苷酸，其編碼SEQ ID NO：32、33、34、91、或93之HC1。

本發明亦提供一種經單離之多核苷酸，其編碼SEQ ID NO：35、36、37、38、92、或94之LC1。

本發明亦提供一種經單離之多核苷酸，其編碼SEQ ID NO：76或78之HC2。

本發明亦提供一種經單離之多核苷酸，其編碼SEQ ID NO：77或79之LC2。

本發明亦提供一種經單離之多核苷酸，其包含SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、95、96、97、98、99、100、101、或102之多核苷酸序列。

本發明亦提供一種經單離之多核苷酸，其包含SEQ ID NO：105、106、80、81、107、108、82、及83之多核苷酸序列。

編碼本發明之抗體之VH或VL或其抗原結合片段、或本發明之抗體之重鏈及輕鏈的多核苷酸序列可係可操作地連接至一或多個調節元件(諸如啟動子或增強子)，以允許該核苷酸序列在所意欲之宿主細胞中表現。多核苷酸可為cDNA。

本發明亦提供一種載體，其包含本發明之多核苷酸。此類載體可係質體載體、病毒載體、用於桿狀病毒表現之載體、基於轉位子(transposon)之載體、或者任何其他適用於以任何手段將本發明之合成多核苷酸引入至一給定生物或遺傳背景中的載體。例如，將編碼本發明之抗體之輕鏈及/或重鏈可變區的多核苷酸(可選地連接至恆定區)插入表現載體中。可將輕鏈及/或重鏈選殖於相同或不同的表現載體中。編碼免疫球蛋白鏈的DNA段可係可操作地連接至(一或多個)表現載體的控制序列，以確保免疫球蛋白多肽的表現。此等控制序列包括訊息序列、啟動子(例如天然關聯或異源性啟動子)、增強子元件、及轉錄終止序列，並且經選擇以與選擇用來表現抗體之宿主細胞相容。一旦已將載體併入適當的宿主中，即將宿主維持在合適條件下以高度表現由所併入之多核苷酸編碼的蛋白質

本說明書之範疇內的重組表現載體包括編碼至少一種可操作地連接至合適調節元件之重組蛋白質(諸如抗體之VH、VL、HC、或LC)的合成性或cDNA衍生性核酸片段。此類調節元件可包括轉錄啟動子、編碼合適mRNA核糖體結合位之序列、及控制轉錄和轉譯之終止的序列。表現載體(尤其是哺乳動物表現載體)亦可包括一或多種非轉錄元件，諸如複製起源、連接至待表現基因之合適啟動子及增強子、其他5'或3'側翼(flanking)非轉錄序列、5'或3'非轉譯序列(諸如必要的核糖體結合位)、多腺核苷酸化位點、剪切供體及受體位點、或轉錄終止序列。亦可納入賦予在宿主中複製之能力的複製起源。

在用來轉形脊椎動物細胞之表現載體中的轉錄及轉譯控制序列可由病毒來源提供。例示性載體可如以下文獻所述建構：Okayama and Berg,3 Mol.Cell.Biol.280(1983)。

在一些實施例中，抗體編碼序列或抗原結合片段編碼序列係置於強大組成性啟動子的控制之下，諸如下列基因的啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸、及其他。此外，許多病毒啟動子在真核細胞中組成性地發揮作用，並且適合搭配所述實施例使用。此等病毒啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、SV40之早期及晚期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、莫洛尼白血病病毒(Maloney leukemia virus)之長末端重複(LTR)、人類免疫不全病毒(HIV)、艾巴二氏病毒(EBV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、及其他反轉錄病毒、和單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus)之胸苷激酶啟動子。在一個實施例中，抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段編碼序列係置於誘導性啟動子的控制之下，諸如金屬硫蛋白啟動子、四環素誘導性啟動子、多西環素(doxycycline)誘導性啟動子、含有一或多種干擾素刺激反應元件(interferon-stimulated response element,ISRE)之啟動子，諸如蛋白質激酶R 2',5'-寡腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1、及類似者。

本文中所述之載體可含有一或多個內部核糖體進入位點(IRES)。將IRES序列納入融合載體中可有利於增強一些蛋白質之表現。在一些實施例中，載體系統將包括一或多個多腺核苷酸化位點(例如SV40)，其可在任何前述核酸序列之上游或下游。載體組分可相鄰地連接，或者以提供用於表現基因產物之最佳間隔的方式來排列(即藉由在ORF之間引入「間隔子(spacer)」核苷酸)，或者以其他方式放置。調節元件(諸如IRES模體)亦可經排列以提供用於表現之最佳間隔。

該等載體可包含選擇標記，其為所屬技術領域中所廣為周知。選擇標記包括正向及負向選擇標記，例如抗生素抗藥性基因(例如新黴素抗藥性基因、潮黴素(hygromycin)抗藥性基因、康黴素(kanamycin)抗藥性基因、四環素抗藥性基因、青黴素抗藥性基因)、麩醯胺酸合成酶基因、HSV-TK、用於更苷洛韋(ganciclovir)選擇之HSV-TK衍生物、或用於6-甲基嘌呤選擇之細菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(Gadi et al.,7 Gene Ther.1738-1743(2000))。編碼選擇標記或選殖位點之核酸序列可在編碼所關注多肽或選殖位點之核酸序列的上游或下游。

可使用的例示性載體係細菌的：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、及pRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。真核的：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL(Pharmacia)、pEE6.4(Lonza)及pEE12.4(Lonza)。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：25之VH及/或SEQ ID NO：28之VL的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：39之多核苷酸及/或SEQ ID NO：42之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：26之VH及/或SEQ ID NO：29之VL的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：40之多核苷酸及/或SEQ ID NO：43之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：27之VH及/或SEQ ID NO：30之VL的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：41之多核苷酸及/或SEQ ID NO：44之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：26之VH及/或SEQ ID NO：31之VL的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：40之多核苷酸及/或SEQ ID NO：45之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：87之VH及/或SEQ ID NO：88之VL的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：95之多核苷酸及/或SEQ ID NO：96之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：89之VH及/或SEQ ID NO：90之VL的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：99之多核苷酸及/或SEQ ID NO：100之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：66之VH及/或SEQ ID NO：67之VL的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：105之多核苷酸及/或SEQ ID NO：106之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：74之VH及/或SEQ ID NO：75之VL的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：107之多核苷酸及/或SEQ ID NO：108之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：32之HC及/或SEQ ID NO：35之LC的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：46之多核苷酸及/或SEQ ID NO：49之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：33之HC及/或SEQ ID NO：36之LC的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：47之多核苷酸及/或SEQ ID NO：50之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：34之HC及/或SEQ ID NO：37之LC的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：48之多核苷酸及/或SEQ ID NO：51之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：33之HC及/或SEQ ID NO：38之LC的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：47之多核苷酸及/或SEQ ID NO：52之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：91之VH及/或SEQ ID NO：92之VL的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：97之多核苷酸及/或SEQ ID NO：98之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：93之VH及/或SEQ ID NO：94之VL的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：101之多核苷酸及/或SEQ ID NO：102之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：76之HC及/或SEQ ID NO：77之LC的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：80之多核苷酸及/或SEQ ID NO：81之多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含編碼SEQ ID NO：78之HC及/或SEQ ID NO：79之LC的多核苷酸。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO：82之多核苷酸及/或SEQ ID NO：83之多核苷酸。

本文中所述之載體可用來以編碼所述抗體或抗原結合片段之基因轉形各種細胞。例如，載體可用來產生抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段生產細胞。因此，本發明亦提供一種宿主細胞，其包含本發明之一或多個載體。

用於將外來基因引入細胞中之技術係已知的，且可用於建構本發明之重組細胞。

「宿主細胞(host cell)」係指經引入載體的細胞。應瞭解到，用語宿主細胞不只意欲指特定對象細胞，亦意欲指此細胞之後裔，並且亦意欲指從該特定對象細胞產生之穩定細胞株。由於某些修飾可能會因為突變或環境影響而發生於後代中，使得後裔可能與親本細胞不同，但仍包括於如本文中所使用之用語「宿主細胞」的範疇內。

此類宿主細胞可為真核細胞、原核細胞、植物細胞或古菌(archeal)細胞。大腸桿菌(Escherichia coli)、桿菌(諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis)、及其他腸桿菌(enterobacteriaceae)(諸如沙門桿菌(Salmonella)、鋸桿菌(Serratia)))、及各式假單胞菌(Pseudomonas)菌種皆為原核宿主細胞之實例。其他微生物(諸如酵母菌)對於表現亦為有用者。酵母菌(Saccharomyces)(例如釀酒酵母菌(S.cerevisiae))及畢赤酵母菌(Pichia)皆為合適酵母菌宿主細胞之實例。例示性真核細胞可以是哺乳動物、昆蟲、鳥類或其它動物來源。哺乳動物真核細胞包括永生化細胞系(immortalized cell line)如融合瘤或骨髓瘤細胞系，諸如SP2/0(American Type Culture Collection(ATCC),Manassas,VA,CRL-1581)、NS0(European Collection of Cell Cultures(ECACC),Salisbury,Wiltshire,UK,ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL-1646)及Ag653(ATCC CRL-1580)鼠類細胞系。例示性人類骨髓瘤細胞系為U266(ATTC CRL-TIB-196)。其他有用之細胞系包括衍生自中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,CHO)細胞者，諸如CHOK1SV(Lonza Biologics,Walkersville,MD)、Potelligent® CHOK2SV(Lonza)、CHO-K1(ATCC CRL-61)或DG44。

經本文中所述之表現載體轉形的細胞可針對本文中所述之抗體或抗原結合片段的重組表現來選擇或篩選。重組陽性細胞經擴增並針對展現所欲表型之次殖株(subclone)進行篩選，所欲表型諸如高表現水平、增強之生長性質、或產出例如由於蛋白質修飾或經修改之轉譯後修飾而具有所欲生化特徵之蛋白質的能力。這些表型可能是因為給定次殖株之固有性質或因為突變。突變可透過使用化學品、UV波長光、輻射、病毒、插入型致突變原、抑制DNA不匹配修復、或此等方法之組合而受影響。

本發明亦提供一種生產本發明之抗體的方法，其包含在使該抗體表現之條件下培養本發明之宿主細胞，並且回收由該宿主細胞所生產之抗體。製造抗體及純化抗體之方法在所屬技術領域中係廣為人知者。一旦(以化學或重組方式)經合成，整個抗體、其等之二聚體、個別輕鏈及/或重鏈、或其他抗體片段(諸如VH及/或VL)可依據標準程序來純化，包括硫酸銨沉澱、親和管柱、管柱層析、高效液相層析(HPLC)純化、凝膠電泳、及類似者(一般資訊請參見Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))。標的物抗體可為實質上純，例如至少約80%至85%純、至少約85%至90%純、至少約90%至95%純、或至少約98%至99%純、或更純，例如除標的物抗體外不含汙染物(諸如細胞碎屑、巨分子等)。

可使用標準分子生物方法將本發明之多核苷酸序列併入載體中。宿主細胞轉形、培養、抗體表現及純化皆使用廣為人知的方法來進行。

本發明亦提供一種生產本發明之抗TMEFF2抗體之方法，其包含：將編碼該抗體之VH的第一多核苷酸及編碼該抗體之VL的第二多核苷酸併入一表現載體中；以該表現載體轉形一宿主細胞；在培養基中在該VL及該VH係經表現且形成該抗體之條件下培養該宿主細胞；及從該宿主細胞或培養基中回收抗體。

醫藥組成物/投予

本發明亦提供一種醫藥組成物，其包含本發明之抗體及醫藥上可接受之載劑。關於治療用途，本發明之抗體可被製備成醫藥組成物，其在醫藥上可接受之載劑中含有有效量的抗體作為活性成分。「載劑」係指與本發明之抗體一起投予的稀釋劑、佐劑、賦形劑、或媒劑。此等媒劑可為液體如水及油，包括來自石油、動物、蔬菜或合成來源者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及類似者。舉例而言，可使用0.4%鹽水及0.3%甘胺酸。這些溶液係無菌且通常不含顆粒物質。彼等可藉由習用、習知的滅菌技術(如過濾)來滅菌。該等組成物可含有如用以接近生理條件所需之醫藥上可接受的輔助物質，諸如pH調整及緩衝劑、穩定、增稠、潤滑、及著色劑等。在此類醫藥配方中本發明之抗體之濃度可能會有所不同，從以重量計小於約0.5%、常達以重量計至少約1%至多達15或20%，且可主要基於所需劑量、流體體積、黏度等，根據所選擇之投予模式來選擇。合適的媒劑及配方(包含其他的人類蛋白質，例如人類血清白蛋白)例如係描述於例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092中，請特別參見pp.958-989。

本發明之抗體的投予模式可係任何合適之途徑，諸如腸胃外(parenteral)投予，例如皮內、肌內、腹膜內(intraperitoneal)、靜脈內或皮下、經黏膜(口腔、鼻內、陰道內、直腸)、或所屬技術領域中具有通常知識者所理解以及在所屬技術領域中已知之其他手段。

本發明之抗體亦可預防性地投予，以降低發展疾病(諸如癌症)的風險。

因此，用於肌內注射之本發明醫藥組成物可經製備而含有1ml無菌緩衝水、及介於約1ng至約100mg/kg(例如約50ng至約30mg/kg，或更佳的是約5mg至約25mg/kg)之間的本發明抗體。

使用抗TMEFF2抗體及雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之方法

本發明亦提供一種治療有需要之對象的TMEFF2陽性癌症之方法，其包含向該對象投予治療有效量的雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，以治療該TMEFF2陽性癌症。

本發明亦提供一種治療有需要之對象的TMEFF2陽性癌症之方法，其包含向該對象投予治療有效量的抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，以治療該TMEFF2陽性癌症。

多個基因已被牽涉到前列腺癌的發展。涉及前列腺癌之發展及進展而因此成為用於新抗前列腺癌療法的具前景的目標之其中一種蛋白質係具有EGF樣域及兩個濾泡抑素樣域之跨膜蛋白(TMEFF2)。TMEFF2係由下列所組成之I型跨膜蛋白：兩個濾泡抑素樣(FS)域、EGF樣域、跨膜(TM)域、及短胞質尾。在下列兩個器官中偵測到最高的TMEFF2蛋白表現：腦及前列腺(Liang et al.2000；Horie et al.2000)。亦於前列腺癌細胞系及臨床樣本中發現提升的TMEFF2表現(Glynne-Jones et al.2001；Gery et al.2002；Afar et al.2004)，其指示TMEFF2在前列腺癌進展中扮演重要角色。Tmeff2基因之表現係受到雄性激素受體控制。多數雄性激素依賴性癌症患者展現高的TMEFF2 mRNA水平。

因此，抗TMEFF2抗體或許有可能變成用於前列腺癌診斷、預後、或治療的重要工具。

「癌症(cancer)」意在包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉移組織或惡性轉化的細胞、組織或器官，不論組織病理學類型或侵襲階段。例示性TMEFF陽性癌症包括前列腺癌。

在一些實施例中，前列腺癌係腺癌。

在一些實施例中，前列腺癌係轉移性前列腺癌。在一些實施例中，前列腺癌已轉移至直腸、淋巴結、或骨骼、或其任何組合。

在一些實施例中，前列腺癌係復發性或難治性前列腺癌。

在一些實施例中，前列腺癌係去勢抗性前列腺癌。

在一些實施例中，前列腺癌對雄性激素剝奪療法具敏感性。

在一些實施例中，前列腺癌對雄性激素剝奪療法不具敏感性。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於療法。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2前列腺癌。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於製造用於治療TMEFF2陽性癌症之藥劑。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症，諸如前列腺癌，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中：該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：32之第一重鏈(HC1)、SEQ ID NO：35之第一輕鏈(LC1)、SEQ ID NO：76之第二重鏈(HC2)、及SEQ ID NO：77之第二輕鏈(LC2)。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症，諸如前列腺癌，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中：該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：32之HC1、SEQ ID NO：35之LC1、SEQ ID NO：78之HC2、及SEQ ID NO：79之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症，諸如前列腺癌，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中：該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21、及23之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：36之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症，諸如前列腺癌，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中：該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21、及23之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：36之LC1、SEQ ID NO：78之HC2、及SEQ ID NO：79之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症，諸如前列腺癌，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中：該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20、及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：34之HC1、SEQ ID NO：37之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症，諸如前列腺癌，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中：該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20、及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：34之HC1、SEQ ID NO：37之LC1、SEQ ID NO：78之HC2、及SEQ ID NO：79之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症，諸如前列腺癌，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中：該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：38之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症，諸如前列腺癌，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中：該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20、及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：38之LC1、SEQ ID NO：78之HC2、及SEQ ID NO：79之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症，諸如前列腺癌，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中：該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、 63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：91之HC1、SEQ ID NO：92之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症，諸如前列腺癌，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中：該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：91之HC1、SEQ ID NO：92之LC1、SEQ ID NO：78之HC2、及SEQ ID NO：79之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症，諸如前列腺癌，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中：該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及 LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64、及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：93之HC1、SEQ ID NO：94之LC1、SEQ ID NO：76之HC2、及SEQ ID NO：77之LC2。

本發明亦提供一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其用於治療TMEFF2陽性癌症，諸如前列腺癌，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中：該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20、及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72、及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3；該第一結構域包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：93之HC1、SEQ ID NO：94之LC1、SEQ ID NO：78之HC2、及SEQ ID NO：79之LC2。

本發明之抗體可與第二治療劑組合投予。

在一些實施例中，第二治療劑係手術、化療、雄性激素剝奪療法、或輻射、或其任何組合。

套組

本發明亦提供一種套組，其包含本發明之抗TMEFF2抗體或抗雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體。套組可用於治療用途或作為診斷套組。套組可用於偵測樣本中TMEFF2、CD3、或TMEFF2及CD3的存在。

在一些實施例中，套組包含本發明之抗體及用於偵測該抗體之試劑。該套組可包括一或多種其他元件，包括：使用說明書；其他試劑，例如標記、治療劑、或用於將抗體與標記或治療劑或放射防護組合物螯合(或偶合)的試劑；用於製備投予用抗體的裝置或其他材料；醫藥上可接受的載劑；及用於投予至對象的裝置或其他材料。

在一些實施例中，該套組包含在容器中的本發明之抗體及使用該套組的說明書。

在一些實施例中，該套組中的抗體被標記。

本發明亦提供一種包含抗TMEFF2抗體之套組，該抗體包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL。

本發明亦提供一種包含抗TMEFF2抗體之套組，該抗體包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL。

本發明亦提供一種包含抗TMEFF2抗體之套組，該抗體包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL。

本發明亦提供一種包含抗TMEFF2抗體之套組，該抗體包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL。

本發明亦提供一種包含抗TMEFF2抗體之套組，該抗體包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL。

本發明亦提供一種包含抗TMEFF2抗體之套組，該抗體包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。

本發明亦提供一種包含雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之套組，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL。

本發明亦提供一種包含雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之套組，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL。

本發明亦提供一種包含雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之套組，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL。

本發明亦提供一種包含雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之套組，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL。

本發明亦提供一種包含雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之套組，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL。

本發明亦提供一種包含雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之套組，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL。

本發明亦提供一種包含雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之套組，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL。

本發明亦提供一種包含雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之套組，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL。

本發明亦提供一種包含雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之套組，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL。

本發明亦提供一種包含雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之套組，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL。

本發明亦提供一種包含雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之套組，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL。

本發明亦提供一種包含雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體之套組，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL。

偵測TMEFF2或CD3之方法

本發明亦提供一種在樣本中偵測TMEFF2之方法，其包含：獲得該樣本；使該樣本與本發明之抗TMEFF2抗體接觸；及偵測該樣本中結合至TMEFF2的抗體。

本發明亦提供一種在樣本中偵測TMEFF2及CD3之方法，其包含：獲得該樣本；使該樣本與本發明之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體接觸，該抗體包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域；及偵測該樣本中結合至TMEFF2及CD3的抗體。

在一些實施例中，樣本可衍生自尿液、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘤細胞、非為組織相關聯之細胞(即游離細胞)、組織(例如手術切除之腫瘤組織、活檢切片(包括細針穿刺))、組織標本、及類似者。

可使用已知方法偵測本文中所述之本發明之結合至TMEFF2、或TMEFF2及CD3的抗體。例示性方法包括使用螢光或化學發光標記或放射性標記直接標記該抗體，或將本發明之抗體附接至易於偵測的部分，諸如生物素、酶、或表位標籤。例示性標記及部分係釕、111In-DOTA、111In-二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及β-半乳糖苷酶、多組胺酸(HIS標籤)、吖啶染料、花青(cyanine)染料、螢光酮(fluorone)染料、

(oxazin)染料、啡啶染料、玫瑰紅染料、及Alexafluor®染料。

本發明之抗體可在各種檢定中使用以偵測樣本中的TMEFF2、或TMEFF2及CD3。例示性檢定係西方墨點分析、放射免疫檢定、表面電漿共振、免疫沉澱法、平衡透析、免疫擴散法、電致化學發光(ECL)免疫檢定、免疫組織化學法、螢光活化細胞分選(FACS)或ELISA檢定。

本發明現將參照下面特定、非限制性實例予以說明。

實例1：抗原產生

基於UniProt登錄號Q9UIK5序列，生產人類胞外域(ECD)TMEFF2。ECD建構體經設計而在C端處具有6X His標籤及Avi標籤序列(建構體TMEW1；SEQ ID NO：6)。含有FS2及EGF域(胺基酸151至320)之建構體經設計為具有6X His標籤及Avi標籤序列之人類血清白蛋白(HSA)融合(建構體TMEW7；SEQ ID NO：7)。含有TMEFF2近膜域(殘基230至320)之建構體經設計而具有6xHis標籤(建構體TMEW19；SEQ ID NO：8)或經融合至具有His標籤之大鼠IgG1 Fc(建構體TMEW20；SEQ ID NO：9)。TMEFF2之殘基230至320含有EGF域，該EGF域涵蓋TMEFF2之殘基261至301。根據製造商規程，使用Expifectamine，使人類TMEFF2 ECD表現建構體暫時轉染至HEK293衍生細胞中，即Expi293(Gibco/Thermo Fisher Scientific)。在收獲前，將細胞在迴轉式振盪器上用8% CO₂於37℃下培養5天。藉由離心移除表現細胞，並自培養基純化具有His標籤的可溶TMEFF2蛋白，其係藉由使用固定化金屬親和層析(使用Ni Sepharose 6快速流動樹脂(GE Healthcare))，接著以pH 7.2的達爾伯克磷酸鹽鹽水緩衝液(1x DPBS)進行Superdex 200製備粒徑篩析層析(SEC)(GE Healthcare)。所產生抗原之胺基酸序列係顯示於表3中。

實例2. 抗TMEFF2抗體的產生 使用表現人類免疫球蛋白基因位點的基因轉殖大鼠(OmniRat®)產生抗體

OmniRat®含有嵌合人類/大鼠IgH基因位點(包含22個人類V_H、所有呈天然組態的人類D及J_H區段，該等區段係連接至大鼠C_H基因位點)再加上完整的人類IgL基因位點(12個Vκ連接到Jκ-Cκ，且16個Vλ連接到Jλ-Cλ)。(請參見例如Osborn,et al.(2013)J Immunol 190(4)：1481-1490)。因此，該等大鼠展現減少表現的大鼠免疫球蛋白，且所引入的人類重鏈及輕鏈轉殖基因回應於免疫化會經歷類型轉換(class switching)及體細胞突變，以產生具有完整人類可變區之高親和力嵌合人類/大鼠IgG單株抗體。OmniRat®的製備及使用、及此類大鼠所攜帶的基因體修飾係描述於WO14/093908中。

OmniRat係用人類TMEFF2建構體FS2-EGF-Tev-HSA(C34S)-His-Avi標籤(TMEW7,SEQ ID NO：7)進行免疫化，並用建構體spTMEFF2(230-320)G3S-大鼠IgG1Fc(TMEW20,SEQ ID NO：9)加以促進。經過89天免疫化方案之後，收獲來自大鼠的淋巴結，並將其用來產生融合瘤，且藉由ELISA及/或SPARCL(空間鄰近性分析物試劑捕捉發光，Spatial Proximity Analyte Reagent Capture Luminescence)針對結合至TMEFF2-FL-ECD-His-Avi標籤(TMEW1)蛋白的情形來篩選融合瘤上清液。選擇數種上清液以用於結合至TMEFF ECD、FS2-EGF、或僅EGF域之TMEFF2的二級ELISA及SPARCL篩選。基於篩選結果，對數種融合瘤殖株進行定序、使其表現、並進行功能性表徵。

自噬菌體展示庫產生抗體

如Shi等人(J Mol Biol 397：385-96,2010)及WO2009/085462中所述，自兩組重新的pIX噬菌體展示庫中，使用標準方法來選擇TMEFF2結合Fab。簡而言之，兩組稱為V3.0及V5.0之庫係藉由多樣化(diversifying)人類支架(scaffold)而產生，其中生殖系VH基因IGHV1-69*01、IGHV3-23*01、及IGHV5-51*01係與人類IGHJ-4袖珍基因經由H3環來重組(IGHJ-6袖珍基因亦用於V5.0)，而人類生殖系VLκ基因O12(IGKV1-39*01)、L6(IGKV3-11*01)、A27(IGKV3-20*01)、及B3(IGKV4-1*01)係與IGKJ-1袖珍基因重組以組裝出完整的VH及VL域。在重鏈及輕鏈可變區中，選擇常與蛋白質及肽抗原接觸的H1、H2、L1、L2及L3環周圍的位置以用於多樣化。限制所選位置處的序列多樣性至出現在各別IGHV或IGLV之IGHV或IGLV生殖系基因家族中的各位置處之殘基。利用V3.0庫中長度為7至14個胺基酸及V5.0庫中長度為6至19個胺基酸的短型至中型合成環，在H3環處產生多樣性。H3處之胺基酸分布係設計為模仿在人類抗體中所觀察到的胺基酸變異。用來產生庫之支架係依據其等之人類VH及VL生殖系基因來源來命名。對V3.0及V5.0組兩者，將三種重鏈庫之各者與四種生殖系輕鏈或生殖系輕鏈庫組合以為各組庫產生12種獨特VH：VL組合，其係用於選擇實驗。

V區選殖

依照製造商的規程，使用RNeasy 96套組(Qiagen)，將來自噬菌體之融合瘤細胞溶解物的總RNA純化。將所得RNA藉由使用DropSense定量，並儲存於-80℃下或用於cDNA合成，該cDNA合成係使用RT-PCR之Invitrogen SuperScript III First-Strand合成系統(Invitrogen)進行。第一股cDNA合成係分別使用黏合至重鏈、κ鏈、及λ鏈之恆定區的基因特異性引子來進行。將包含至多3μg的純化RNA、基因特異性引子、dNTP混合物、反應緩衝液、25mM MgCl₂、DTT、RNaseOUT^TM(40U/μl,Invitrogen)、及SuperScript^TM III RT(200U/μl，Invitrogen目錄號18080-051)的RT-PCR反應混合物，在50℃下培養50分鐘，並在85℃下培養5分鐘。將所得單股cDNA儲存在-20℃下，或直接用於PCR擴增。使用Platinum Pfx聚合酶(Invitrogen)來進行PCR反應。使用最佳化的PCR條件，藉由分別黏合至前導序列、及重鏈、κ鏈、及λ鏈之恆定區的順向及逆向引子，擴增V區片段。將所得PCR片段定序，使所回收V區之胺基酸序列進行密碼子最佳化並選殖進入基於pUnder的表現載體，該表現載體攜帶具有S228P、F234A、及L235A突變的IgG4恆定區(IgG4PAA同型)。

Expi293的小量轉染及純化

選殖自免疫化活動或噬菌體展示識別的所選抗體，並將其表現為IgG1PAA，且經由小的2ml量來純化。將Expi293^TM細胞(ThermoFisher Scientific)以1.25×10⁵至2.25×10⁵個存活細胞/mL密度接種於Expi293^TM表現培養基中，且在37℃、7% CO₂的條件下培養於125mL至2L搖瓶中。當密度達到對數相生長而為3×10⁶至5×10⁶個存活細胞/mL，且存活率為98%至99%時，使細胞進行次培養。

在轉染當天，判定存活細胞密度及存活率百分比。依照製造商的轉染規程(ThermoFisher公開號MAN0007814)，以3×10⁶個存活細胞/mL的密度轉染細胞。在轉染後第6天，以850xG離心15分鐘來收獲培養物，然後進行純化。使用mAb Select Sure樹脂(GE Healthcare)自澄清上清液純化抗體，並將其透析至PBS中。使用DropSense儀器(Trinean)對濾液進行A280測量，以判定蛋白質濃度。

實例3. 抗TMEFF2抗體的表徵 抗TMEFF2抗體以高親和力結合TMEFF2

使用Proteon(TMEB674、TMEB675、TMEB 565、及TMEB570)或Biacore SPR(TMEB762及TMEB757)，來評估所選IgG4PAA抗TMEFF2抗體對TMEFF2 ECD(TMEW1：TMEFF2-FL ECD-His-Avi標籤)及/或近膜區(TMEW19：spTMEFF2(230-320)G3S-H6)的結合。結合所選抗體之動力學參數係顯示於表4中。抗TMEFF2抗體經發現，以皮莫耳(picomolar)親和力結合TMEFF2 ECD及TMEFF2近膜區兩者。

ProteOn SPR

以ProteOn SPR(Bio-Rad)測量抗TMEFF2mAb對於人類TMEFF2之ECD及近膜區的結合。將純化mAb(稀釋至1μg/ml的最終濃度於PBST中)用於作為檢定中的配體，並透過Fc捕捉固定化至山羊抗人類(Goat Anti-Human,GAH)IgG Fc。至於GAH IgG Fc的胺偶合，將EDC(40mM)與NHS(10mM)之1：1混合物緊接在進行注射之前進行混合以活化晶片表面，並在垂直方位上進行注射。接著，使於乙酸鹽緩衝液(pH 5.0)中的GAH-Fc(為30μg/ml)抗體在垂直方位上以30μl/min流過表面達300秒。隨後，在相同方位上注射1M乙醇胺(pH 8.5)以將表面中的任何剩餘反應性羧基去活化。該等抗體係以1μg/ml的濃度用於固定化。使該等抗體以水平方向流過表面。使經3倍連續稀釋成5種濃度(最高濃度範圍為100至600nM)的人類TMEFF2 ECD或近膜區作為分析物在垂直方位上流動而結合至所捕捉分子。亦將緩衝液樣本以垂直方向注射於第6個通道中，以監測基線信號中的任何漂移。在100μL/min的流速下，分別在3分鐘及30(或15)分鐘內監測所有濃度之締合及解離相。使用0.8%磷酸的18秒脈衝以移除結合抗原，來使結合表面再生，以用於下一個交互作用循環。藉由自回應數據減去二組參考數據來處理原始數據：1)減去間點信號以校正在抗原與空晶片表面之間的非特異性交互作用；2)空通道信號(其中僅PBST流過晶片)以校正非特異性基線漂移。

Biacore 8K SPR

以Biacore 8K SPR測量抗TMEFF2 mAb對於人類TMEFF2 ECD的結合。檢定的形式是要使用高密度抗人類Fc表面來捕捉mAb，然後使用單循環動力學方法來進行人類TMEFF2濃度滴定的注射。在CM5感測器晶片(GE)的流動槽1及2上，將山羊抗人類Fc IgG(Jackson Immunoresearch，目錄號109-005-098)經由胺偶合(為30μg/mL於10mM乙酸鹽緩衝液中，pH 4.5)直接固定化，其中HBSP(GE)緩衝液的流速為30μL/min。在流動槽2上，以0.5μg/ml(~200-300RU)，於抗人類Fc IgG表面上捕捉mAb。隨後，將運作緩衝液改變為HBSP+100ug/ml BSA。使用單循環動力學方法，將在30nM濃度下經3倍連續稀釋的TMEFF2 ECD由低至高濃度注射。在最後或最高濃度注射後30分鐘監測釋放速率，然後使用0.8%磷酸(Bio-Rad)使表面再生。亦完成一次緩衝液空白運作，其捕捉相同mAb，並使用與樣本運作相同的條件。藉由自回應數據減去二組參考數據來處理原始數據：1)自樣本流動槽2減去參考流動槽1；及2)自實驗運作減去緩衝液空白運作。各mAb在所有濃度下的經處理數據係整體擬合於1：1簡單朗繆耳(Langmuir)結合模型以擷取動力學(kon,koff)及親和力(KD)常數之評估值。

抗TMEFF2抗體的熱穩定性

藉由DSC(微差掃描熱量法)，TMEB675顯示低於平常熱穩定性曲線，其中起始展開Tm=52℃且第一熱轉移(Tm1)=60.4℃。更為密切的TMEB675序列檢查(參見實例4)顯示，體細胞超突變(SHM)存在於重鏈及輕鏈的架構區內。使數種經重新工程改造的變異體進行次選殖、表現、純化、以及DSC的曲線分析。所得mAb TMEB762及TMEFB757分別顯示所欲熱穩定性曲線(分別為Tm1=69.4℃及Tm1=69.7℃)。相較於TMEB675，TMEB762在重鏈中具有下列胺基酸修飾：R14P、P20L、及H81Q，而TMEFB757在重鏈中具有下列胺基酸修飾：R14P及P20L。相較於TMEB675，TMEB762在輕鏈中具有下列胺基酸修飾：A1D及A91P，而TMEFB757在輕鏈中具有A91P修飾。殘基編號係根據Kabat。TMEB675、TMEB762對於TMEFF2 ECD的結合之動力學參數係顯示於表4中。

實例4. 抗TMEFF2抗體的結構表徵

使用標準技術獲得抗體的cDNA序列及胺基酸轉譯。在判定多肽序列後，使用用於放大表現的標準方法對編碼可變區或全長抗體的一些抗體cDNA進行密碼子最佳化。

表5顯示所選抗TMEFF2抗體之HCDR1胺基酸序列及HCDR2胺基酸序列。

表6顯示所選抗TMEFF2抗體之HCDR3胺基酸序列。

表7顯示所選抗TMEFF2抗體之LCDR1胺基酸序列及LCDR2胺基酸序列。

表8顯示所選抗TMEFF2抗體之LCDR3胺基酸序列。

表9顯示所選抗TMEFF2抗體之VH胺基酸序列及VL胺基酸序列。

表10顯示所選抗TMEFF2抗體之重鏈及輕鏈之SEQ ID NO：。

表11顯示所選抗TMEFF2抗體之重鏈胺基酸序列。

表12顯示所選抗TMEFF2抗體的輕鏈胺基酸序列。

表13顯示編碼各種抗TMEFF2抗體鏈之多核苷酸之SEQ ID NO：。

SEQ ID NO：39(TMEB675 VH cDNA)

SEQ ID NO：40(TMEB570,TMEB565 VH cDNA)

SEQ ID NO：41(TMEB674 VH cDNA)

SEQ ID NO：42(TMEB675 VL cDNA)

SEQ ID NO：43(TMEB570 VL cDNA)

SEQ ID NO：44(TMEB674 VL cDNA)

SEQ ID NO：45(TMEB565 VL cDNA)

SEQ ID NO：46(TMEB675 HC cDNA)

SEQ ID NO：47(TMEB570,TMEB565 HC cDNA)

SEQ ID NO：48(TMEB674 HC cDNA)

SEQ ID NO：49(TMEB675 LC cDNA)

SEQ ID NO：50(TMEB570 LC cDNA)

SEQ ID NO：51(TMEB674 LC cDNA)

SEQ ID NO：52(TMEB565 LC cDNA)

SEQ ID NO：95(TMEB762 VH cDNA)

SEQ ID NO：96(TMEB762 VL cDNA)

SEQ ID NO：97(TMEB762 HC cDNA)

SEQ ID NO：98(TMEB762 LC cDNA)

SEQ ID NO：99(TMEB757 VH cDNA)

SEQ ID NO：100(TMEB757 VL cDNA)

SEQ ID NO：101(TMEB757 HC cDNA)

SEQ ID NO：102(TMEB757 LC cDNA)

用於所選抗TMEFF2抗體之架構係顯示於表14中。

SEQ ID NO：53(VH3_3-23架構)

SEQ ID NO：54(VH1_1-69架構)

SEQ ID NO：55(VKI_L11架構)

SEQ ID NO：56(VKIII_A27架構)

實例5. 抗TMEFF2抗體的表位作圖

使用H/D交換進行TMEB570及TMEB675的表位作圖。在此等檢定中，使用TMEW1(SEQ ID NO：6)作為TMEFF2的來源。

將在130μL對照緩衝液(50mM磷酸鹽、100mM氯化鈉，在pH 7.4下)中的10μg TMEW1變性，其係藉由添加130μL的4M鹽酸胍、0.85M TCEP緩衝液(最終pH係2.5)，以及將該混合物在10℃下培養3min。接著，使用內部包裝的胃蛋白酶/蛋白酶XIII(w/w,1：1)管柱(2.1×30mm)，使混合物經受管柱上(on column)胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化。使用UPLC-MS系統來分析所得肽，該UPLC-MS系統包含Waters Acquity UPLC連同Q ExactiveTM Hybrid Quadrupole-Orbitrap質譜儀(Thermo)。將肽在50×1mm C8管柱上用16.5min自2至34%溶劑B(0.2%於乙腈中之甲酸)之梯度分離。溶劑A係0.2%於水中之甲酸。將注射閥及胃蛋白酶/蛋白酶XIII管柱以及其相關連接管，保持在維持於10℃的冷卻箱內。第二切換閥、C8管柱、以及其相關連接不鏽鋼管係在維持於-6℃的另一個冷卻循環箱內。透過用Mascot針對TMEW1序列搜索MS/MS數據來進行肽識別。前驅物及產物離子的質量公差分別為7ppm及0.02Da。

將10μL的TMEW1(5μg)、或10μL的TMEW1及TMEB570或TMEB675之混合物(5μg：15μg)，與120μL氧化氘標記緩衝液(50mM磷酸鈉、100mM氯化鈉，在pH 7.4下)在10℃下培養0s、30s、360s、3600s、或14400s。以二重複執行各時間點的氫/氘(H/D)交換。藉由添加130μL的4M鹽酸胍、0.85M TCEP緩衝液(最終pH係2.5)，來淬熄氫/氘交換。然後，將被淬熄終止反應的樣本如上述進行管柱上(on column)胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化及LC-MS分析。在只有MS模式(MS only mode)中記錄質譜。

使用HDX WorkBench(用於分析H/D交換MS數據的軟體)處理原始MS數據(Pascal等人，J.Am.Soc.Mass Spectrom.2012,23(9),1512-1521)。使用氘化肽與其天然形式(t0)之間的平均質量差計算氘水平。約97%至99%的蛋白質可定位至特定之肽。氘增長曲線(deuterium buildup curve)顯示肽在交換時間內斜率的顯著差異。

TMEB570表位：TMEW1在殘基235至249(殘基編號根據SEQ ID NO：2)處顯示氘攝取些許減少，例如在近膜區內的殘基HGKCEHSINMQEPSC(SEQ ID NO：57)於結合至TMEB570後受到保護而免於H/D交換。

TMEB675表位：TMEW1在殘基252至268(殘基編號根據SEQ ID NO：2)處顯示氘攝取些許減少，例如在近膜區內的殘基DAGYTGQHCEKKDYSVL(SEQ ID NO：58)於結合至TMEB675後受到保護而免於H/D/交換。

因此，TMEB570 TMEFF2表位殘基涵蓋HGKCEHSINMQEPSC(SEQ ID NO：57)，而TMEB675表位殘基涵蓋DAGYTGQHCEKKDYSVL(SEQ ID NO：58)。兩種抗體皆在近膜區內結合TMEFF2。

實例6. 抗CD3抗體的產生

抗CD3抗體CD3B219已描述於US9850310中。

藉由免疫OmniRats(OMT^TM)來產生額外抗CD3抗體。針對結合至人類及食蟹獼猴CD3⁺ T淋巴球對所獲得融合瘤上清液進行篩選，將殖株單離並定序，而且在一些情況下進一步工程改造。抗CD3抗體係經選殖為各種同型，包括具有S228P、F234A、及L235A突變之效應緘默IgG4，或成為具有L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、及 P331S突變之IgG1。所產生的兩種抗CD3抗體係經命名為CD3B376及CD3B450。

經混合(crossing with)抗原特異性目標臂後，以流動式細胞測量術判定CD3B376及CD3B450在體外對人類T細胞的親和力。對人類T細胞進行初步研究，以判定抗CD3示蹤劑分子(KdT)的飽和結合常數。接著，在利用滴定濃度的測試mAb之競爭結合檢定中，使用固定濃度的示蹤劑([T])。使用測試分子的IC₅₀(達成50%抑制的濃度)值來判定結合親和力(K_d)，其使用下式：K_d=IC50/(1+([T]/K_dT))。利用五名人類供體來判定示蹤劑的飽和結合常數(K_dT)，該示蹤劑係市售可得的AlexaFluor488 SP34-2抗CD3(BioScience #557705)(數據未顯示)。

判定示蹤劑的飽和結合常數(K _dT)

方法：將人類泛T細胞冷凍儲存於氮槽中，直到使用為止。將T細胞解凍，用PBS清洗，再懸浮於FACS染色緩衝液中，計數(並記下存活率)，並以0.5×10⁶個細胞/mL再懸浮。以每1×10⁶個細胞1μL，添加Far Red Live/Dead染料(Life Technologies,AKA Invitrogen # L34974)(50μL的DMSO至小瓶中)；並各自將FcR阻斷劑(Miltenyi Biotec #130-059-901)(每0.5×10⁶個細胞1mL的1：20稀釋液)添加至細胞10分鐘。將細胞以50,000個細胞/孔進行接種及清洗。在4℃下，將增加濃度的AlexaFluor488 SP-34抗CD3添加至T細胞2小時。接著，將細胞清洗以移除未結合抗體，固定15分鐘，清洗，且再懸浮於含有1mM EDTA的FACS染色緩衝液中。

使用iQue Intellicyte流動式細胞儀測量結合。針對T細胞群進行細胞分類，隨後依細胞單態(singlet)進行分類，接著依活細胞(FL4)進行分類。判定各孔染色的幾何平均值(FL1)。

所取得的平均螢光強度值係依據抗體分子濃度之變動加以作圖，並在單位點結合分析(總結合)中使用Prism軟體來分析。軟體會計算描述抗體分子與受體(人類泛T細胞上的CD3)結合(依照質量作用定律)之對應的K_d值。該式係如下：Y=(B_max×X)/(K_d+X)；其中：Bmax係最大結合；K_d係達到最大半結合的所需配體濃度。

結果：針對各供體導出K_d值，並獲得平均值。人類T細胞的飽和結合常數(K_dT)係經導出為5.6±1.0nM(n=4)且用於先前提及之式以判定K_d結合親和力。

藉由競爭檢定判定抗CD3 mAb的結合親和力

使用CD3B376及CD3B450來執行競爭結合研究。使用人類泛T細胞來判定mAb的結合親和力。所使用的示蹤劑係市售可得的AlexaFluor488 SP-34抗CD3(BioScience #557705)，而示蹤劑的飽和結合常數係描述於上文。

將T細胞冷凍儲存於氮槽中，直到使用為止。將T細胞解凍，用PBS清洗，再懸浮於FACS染色緩衝液中，計數(並記下存活率)，並以0.5×10⁶個細胞/mL再懸浮。以每1×10⁶個細胞1μL，添加Far Red Live/Dead染料(Life Technologies,AKA Invitrogen # L34974)(50μL的DMSO至小瓶中)；並各自將FcR阻斷劑(Miltenyi Biotec #130-059-901)(每0.5×10^6個細胞1mL的1：20稀釋液)添加至細胞10分鐘。將細胞以50,000個細胞/孔進行接種及清洗。

將mAb(及同型對照)從開始濃度1000或200μg/mL(2X)起進行1：2的連續稀釋，並將固定濃度的示蹤劑(5μg/mL；2X)混合在一起以給出1X濃度。因此，最終(1X)濃度的示蹤劑係2.5μg/mL=16.6nM.。將混合物在4℃下添加至T細胞2小時。將細胞清洗以移除未結合抗體，固定15分鐘，清洗，且再懸浮於含有1mM EDTA的FACS染色緩衝液中。

使用iQue Intellicyte流動式細胞儀測量結合。針對T細胞群進行細胞分類，隨後依細胞單態(singlet)進行分類，接著依活細胞(FL4)進行分類。判定各孔染色的幾何平均值(FL1)。所取得的平均螢光強度值係依據對數抗體分子濃度(轉換為nM)之變動加以作圖，並在導出EC50/IC50值(以nM計)的S形劑量-反應(可變斜率)中使用Prism軟體來分析。使用下式導出結合親和力(K_d)：K_d=IC50/(1+([T]/K_dT))。其中：K_d係競爭者的親和力(未標記分子)；測試化合物的IC50係以nM計；[T]係示蹤劑的濃度(16.6nM)；K_dT係藉由飽和結合判定的示蹤劑K_d(人類的是5.6nM)。

在二價與單價兩者形式中，CD3B376結合位較CD3B450的緊密。

CD3B219、CD3B376、及CD3B450的CDR、VH、及VL胺基酸序列係顯示於表16中。

SEQ ID NO：76 CD3B219 HC；(IgG4 S228P、F234A、L235A、F405L、及R409K)

SEQ ID NO：77 CD3B219 LC

SEQ ID NO：78 CD3B376 HC(IgG4 S228P、F234A、L235A、F405L、及R409K)

SEQ ID NO：79 CD3B376 LC

表17顯示編碼抗CD3抗體鏈之多核苷酸之SEQ ID NO：

SEQ ID NO：105 CD3B219 VH cDNA

SEQ ID NO：106 CD3B219 VL cDNA

SEQ ID NO：80 CD3B219 HC cDNA

SEQ ID NO：81 CD3B219 LC cDNA

SEQ ID NO：107 CD3B376 VH cDNA

SEQ ID NO：108 CD3B376 VL cDNA

SEQ ID NO：82 CD3B376 HC cDNA

SEQ ID NO：83 CD3B376 LC cDNA

實例7. 雙特異性TMEFF2xCD3抗體的產生

將所選單特異性抗TMEFF2及抗CD3抗體表現為IgG4/κ。對抗CD3抗體進行F405L及R409K取代(EU編號)，而抗TMEFF2抗體具有野生型IgG4。除了位置405及409取代外，IgG4 mAb係經工程改造以具有S228P、F234A、及L235A取代。

該等單特異性抗體係使用標準方法利用Protein A管柱(HiTrap MabSelect SuRe管柱)表現並純化。在沖提之後，將儲集物透析至D-PBS,pH 7.2。

雙特異性TMEFF2xCD3抗體係藉由在體外(in vitro)Fab臂交換中組合單特異性TMEFF2 mAb及單特異性CD3 mAb而產生，其描述於國際專利公開號WO2011/131746。簡言之，將約1至20mg/ml之1：1莫耳比的各抗體在PBS(pH 7至7.4)及75mM 2-巰基乙醇胺(2-mercaptoethanolamine,2-MEA)中混合在一起並在25至37℃下培養2至6h，接著使用標準方法經由透析、滲濾(diafiltration)、切向流過濾、及/或旋轉細胞過濾來移除2-MEA。

在該體外Fab臂交換後，使用疏水性交互作用層析(hydrophobic interaction chromatography)利用標準方法將該等雙特異性抗體進一步純化以使殘留的親本抗TMEFF2及抗CD3抗體減到最少。

表18及表19顯示所產生的雙特異性抗體。

實例8. 雙特異性TMEFF2×CD3抗體的表徵 以分析性超高速離心(Analytical Ultra Centrifugation,AUC)進行的純度分析

分析性超高速離心(AUC)允許判定溶液中巨分子的大小、形狀、聚集狀態、及可逆交互作用。沉降速率(Sedimentation velocity,SV)係一種AUC技術，其允許在離心機旋轉時向樣本架(槽)之外半徑移動的巨分子濃度梯度。如此能夠判定沉降係數，其係分子之大小及形狀的因子，且對各分子來說是獨特的。Beckman Optima AUC儀器係用於此目的。將樣本載入離心槽，該等離心槽裝備有1.2cm Beckman主件(centerpiece)(額定50K rpm)及石英窗。組裝該等槽，並將其轉矩設為130lb。將離心槽放置於An-50(8孔)或An-60(4孔)轉子中，並放置於AUC腔室內。在起始運作前至少一小時期間(其中轉子係在腔室中)，將AUC的溫度平衡至20.5℃。mAb樣本以40K rpm執行運作，其中掃描計數(250 回掃描)、掃描收集頻率(90秒)、數據解析(10μM)、280nm波長。使用直接邊界擬合軟體SEDANAL來分析數據。測量雙特異性抗體TMCB150及其親本mAb的純度。如符合可接受標準以暫時表現研究材料用於進一步生物物理表徵的AUC所判定，TMCB150顯示97.1%單體、2.8%二聚體單體、及無聚集。TMEB762顯示95.5%單體、4.5%二聚體、及無聚集，而CD3B376顯示97.7%單體及2.2%二聚體且無聚集。至少兩步驟純化的分子具>5%的聚集水平，可能對生物活性、溶解度、穩定性、及儲存壽命有顯著影響。

依DSC的抗TMEFF2/CD3雙特異性構形穩定性

藉由DSC(微差掃描熱量法)判定TMCB150熱展開，該DSC顯示起始展開Tm=52.6℃，第一熱轉移(Tm1)為61.8℃，第二熱轉移(Tm2)為67.6℃，且第三熱轉移(Tm3)為75.5℃。基於如DSC過去所評估的親本抗體(抗TMEFF2，即TMEB762；及抗CD3，即CD3B376)熱轉移曲線，TMCB150的Tm1對應於CD3B376 FAB展開轉移，且TMCB150的Tm3對應於TMEB762 Fab展開轉移。

血清穩定性

發展出血清穩定性檢定以評估用於對人類血清組分的非特異性或偏離目標結合之前導候選物的性質。此可預測不良藥物動力學及生物分布性質。使用基於螢光之層析方法，在緩衝液及人類血清兩者中評估TMCB150的結合及穩定性。將雙特異性抗體用Alexa Fluor 488偶聯物(根據製造商說明書之Invitrogen套組)標記，在4℃及37℃下培養於Hepes緩衝液及人類血清(Sigma，目錄號H4522)2天，接著以SEC-HPLC(藉由使用Agilent HPLC系統，其裝備有螢光偵測器)分析。自各峰曲線下面積之積分，計算聚集百分比。TMCB150顯示在時間為零時於Hepes緩衝液中的2.4%聚集，以及分別在攝氏4°及37°下兩天後的2.0%及1.3%聚集。在人類血清中，TMCB150顯示在時間為零時的1,7%聚集，以及在攝氏4°及37°兩者下兩天後的1.1%聚集。

非特異性結合

以生物感測器技術(Biacore 8K)，判定前導分子對於不相關表面的非特異性結合。使抗體通過經不相關蛋白質塗佈之SPR表面。如果抗體展示對此等不相關表面的顯著結合，則預測其在體內具有不良性質並展現製造上的挑戰。以1μM的最終濃度測試前導分子。不相關表面包括帶負電荷蛋白質(大豆胰蛋白酶抑制劑)、帶正電荷蛋白質(溶菌酶及β-防禦素)、疏水性(Rh-整合素a4b7)、人類IgG、黏性蛋白(Rh-CD19)。在此實驗中使用適當的對照組。使前導流過兩個表面，一個係空白，而另一個具有直接固定化的分子。藉由自測試表面RU減去空白RU，來判定反應單位(RU)水平。TMCB150及親本mAb的RU給定於下表中。反應單位

100，即預測關於非特異性結合至帶電荷/疏水性/IgG表面的高風險，其會在製造期間產生挑戰並表示具不良PK性質。抗體皆未顯示非特異性結合至不相關表面(預測關於製造及在體內行為的低至無風險)。

高濃度穩定性

許多單株抗體係以高濃度(

100mg/ml)調配，來減少注射體積以促進皮下投予。此外、在純化程序期間，所有單株抗體皆暴露於短暫高濃度(

50mg/ml)。因此，對此等分子來說，高濃度穩定性係重要品質屬性。使用具有30kDa MWCO膜的離心超過濾裝置，來執行濃縮。最初將5.1至5.3mg的各蛋白質稀釋至相同開始濃度，並以15分鐘間隔在4000xg下離心。在各15分鐘離心步驟結束時，將濃縮器自離心機移除，並記錄剩餘樣本體積的視覺評估值。以SoloVPE儀器測量濃度。將濃縮樣本在4C與40C下培養2週，並以定時間隔抽取等分試樣以藉由分析性SEC檢查其完整性。TMCB150及親本mAb(CD3B376及TMEB762)正常濃縮。TMCB150的最終濃度係99.4mg/mL，且親本mAb的最終濃度係52.2mg/mL (TMEB762)及52.6mg/mL(CD3B376)。濃度在4C與40C下2週維持相同，意味著分子具有良好固有性質，而不具聚集或吸附至微量離心管(eppendorf tube)的可能性。如自SEC峰積分所測量，物種%(A：聚集；M：單體；F：片段)提供於下表中。在高濃度下，分子在40C下儲存2週後係完整且具有之4%至5%聚集及

0.3%片段，其預測良好的儲存壽命。

以動力學排除檢定(kinetic exclusion assay,KinExA)進行抗TMEFF2/CD3雙特異性抗體的親和力判定

使用KinExA 3200儀器(Sapidyne Instruments,Inc.)來測量雙特異性mAb TMCB150及其二價TMEFF2親本TMEB762 mAb對於人類TMEFF2胞外域(ECD)的溶液平衡親和力(K_D)。製備連續稀釋的人類TMEFF2胞外域(ECD)，連同固定濃度的抗TMEFF2 mAb(於10mM HEPES、150mM NaCL、0.05%界面活性劑P20、pH 7.4、0.1% BSA、及0.02% NaN3中)。將反應混合物在RT下培養，直到結合交互作用達到平衡為止。使用KinExA軟體模擬來判定培養的持續時間。在由雙丙烯醯胺/吖內酯(azlactone)共聚物所組成的預活化珠粒(Pierce Biotechnology,Inc.)上進行胺偶合，以進行TMEFF2-ECD的直接共價固定化，來製備珠粒。經過培養之後，使樣本在KinExA儀器上運作，以評估混合物中的游離抗體，其藉由使該混合物通過經TMEFF2修飾的珠粒，及使用螢光標記二級抗體來偵測所捕捉的抗體。使用KinExA Pro軟體，以1：1結合模型擬合數據。

抗TMEFF2/CD3雙特異性抗體對N端CD3ε肽的結合親和力測量

使用Biacore 8K(GE Healthcare)及抗人類Fc生物感測器表面來執行SPR，以測量動力學速率常數。將抗人類免疫球蛋白抗體共價偶合至CM4感測器晶片(GE Healthcare)之表面。在抗人類免疫球蛋白感測器晶片上捕捉所關注的抗體，接著注射以各種濃度於HEPES緩衝液中的N端CD3ε肽，該HEPES緩衝液含有0.05%界面活性劑P20(Tween^TM 20)及100ug/mL BSA。表面係以在100μL/min下30μL的0.8%磷酸進行2次脈衝注射來再生。所報告之數據為含有所捕獲抗體之流動槽與不含所捕獲抗體之參考槽之間的SPR信號差。儀器對於信號的額外貢獻係藉由從已扣除參考之信號再減去來自空白注射之數據而除去。數據係藉由使用Biaevaluation軟體(Biacore,Inc.)利用1：1結合模型在所有濃度下擬合締合及解離相(整體擬合)來分析。以平均值+95% CI(信賴區間)來報告數據，其係藉由95% CI之t值*標準偏差/重複數之平方根計算出。

實例9. 雙特異性TMEFF2xCD3抗體在T細胞介導之前列腺癌細胞殺滅方面係有效的。 體外T細胞介導之前列腺癌細胞殺滅。

針對抗體介導T細胞介導之前列腺癌細胞殺滅的能力評估所選雙特異性TMEFF2xCD3抗體。

使用凋亡蛋白酶細胞毒性檢定來測量T細胞介導TMEFF2xCD3雙特異性抗體殺滅，該凋亡蛋白酶細胞毒性檢定經由活性凋亡蛋白酶3/7裂解螢光基質以間接測量細胞殺滅。因基質裂解而產生螢光DNA染料，其具有限制於細胞核的螢光。在整個檢定過程中，使用能夠在相同座標處精確將(多個)孔成像的電動10X物鏡，以在各孔中進行重複的螢光測量。基於所界定的大小限制，並/或透過二級標記使用，來識別目標細胞群。

藉由自正常健康供體的負向選擇，來單離分離冷凍泛CD3⁺ T細胞(Biological Specialty Corporation,Colmar,PA)。將表現TMEFF2(LNCaP-AR)的前列腺癌細胞，培養於具有10% HI FBS+補充物的RPMI 1640(Life Technologies)中。依照製造商指引，將T細胞及目標細胞以3：1的效應物與目標之比組合於無酚紅RPMI+10% FBS及補充物(Life Technologies)中，其不具有選擇試劑，並將0.6uL的NucView凋亡蛋白酶試劑(Essen Bioscience)添加至各mL的細胞。將總體積0.1mL的細胞添加至透明96孔平底板(BD Falcon)的適當孔中。以在無酚紅RPMI中2X最終濃度製備TMEFF2xCD3雙特異性抗體(如上文指示來製備)，並將0.1mL的化合物添加至各孔中。在室溫下培養30分鐘以將在孔邊緣處的細胞聚集降到最低之後，將盤板轉移至保持37℃、5% CO₂的Zoom Incucyte儀器(Essen Bioscience)。

依照製造商指引，為各測試細胞系設計在Incucyte上的處理定義。每六個小時進行測量，直到觀察到凋亡蛋白酶信號趨於穩定，且接著自含有最高濃度(多種)測試化合物的(多個)孔中的最大信號連續三或更多次降低。

在檢定完成後，使用適當的處理定義分析各盤。原始螢光數據係自Incucyte Zoom軟體匯出，且貼到GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)。藉由在GraphPad中計算各孔的曲線下面積(the area under the curve,AUC)，來判定凋亡蛋白酶3/7活性。AUC值係依據Log10nM化合物之變動加以作圖。依照非線性迴歸分析(4參數擬合(4parameter fit)、最小普通平方(least ordinary squares))，來報告各劑量曲線之EC50，單位為奈莫耳濃度(nanomolar,nM)。各檢定含有最少三個生物性重複，而且各細胞系係使用來自五名健康供體的T細胞來測試。使用非線性迴歸模型，以非臨床統計進一步分析數據。

圖3顯示LNCaP細胞隨時間的殺滅情形，如藉由所選雙特異性TMEFF2xCD3抗體之增加的凋亡蛋白酶3/7活性所測量。

雙特異性TMEFF2xCD3抗體在體內前列腺癌腫瘤模型中係有效的

在雄性NSG小鼠中的離體LnCaP前列腺癌模型中，測試所選雙特異性抗體。為了本研究，在第0天，以0.2mL/隻動物將於50% Cultrex中10⁶個LnCaP細胞藉由皮下注射投予至右腹脇部中。當腫瘤達到約~100至150mm³的體積時，將動物隨機分配，並在第15天於腹膜內注射20⁶個T細胞/隻小鼠。每組中有十隻動物。在經過T細胞注射後1至3天，開始以抗體進行治療。抗體每週經腹膜內投予兩次。在給藥之前，所有動物接受IVIG+Fc阻斷。每週評估腫瘤體積及體重兩次，直到腫瘤達到~1200mm³。治療組係顯示於表24中。使用CD3x空抗體作為此等檢定中的陰性對照組，其具有CD3B219 CD3結合臂及空臂(結合HIV gp120)。

表25顯示在腫瘤植入後各組於第38天的腫瘤生長抑制百分比。

圖4顯示在腫瘤植入後平均腫瘤體積隨時間減少。圖5A顯示用0.5mg/kg TMCB93治療的各小鼠的平均腫瘤體積減少。圖5B顯示用0.5mg/kg TMCB132治療的各小鼠的平均腫瘤體積減少。

亦以經20e6個T細胞人源化的雄性NOD.Cg-Prkdc^scid I12rg^tm1wjl/SzJ(NSG)小鼠中所建立LNCaP異種移植物，評估TMEB762xCD3B376(TMCB150)的療效。在腫瘤植入後第13天，將動物依平均腫瘤體積隨機分成各組10隻動物。在5週期間，每週兩次進行0.5、0.1、及0.05mg/kg下TMEB762xCD3B376的IP給藥、或0.5mg/kg下空xCD3B376抗體對照組的IP給藥。在腫瘤植入後第35天，當每組仍有至少八隻動物時，計算以腫瘤體積判定的腫瘤生長抑制(TGI%)。相較於空xCD3對照組，0.5及0.1mg/kg(但不是0.05mg/kg)下的TMEB762xCD3B376觀察到統計上顯著的腫瘤生長抑制(圖6)。相較於經空zCD3處理的對照組，0.5、0.1、及0.05mg/kg下的TMEB762xCDB376分別誘發110%、88%、及25%的腫瘤生長抑制。在0.5及0.1mg/kg下的TMEB762xCDB376治療分別導致七次及三次完全反應。每週兩次用卡尺(caliper)測量皮下的LNCaP腫瘤，並以平均腫瘤體積(mm³)±SEM(每組剩餘

8隻小鼠)呈現結果。

回應於TMCB132投予的T細胞活化

藉由流動式細胞測量術來測量LnCaP前列腺癌細胞中的T細胞活化，其特別是藉由在經過TMCB132治療後72小時，於6名個別正常健康供體(9642,9672,9762,9772,9832,9852)中，評估CD3+/CD8+ T細胞的CD25陽性率(圖7)。回應於在LnCaP前列腺癌細胞上的TMCB132投予，而觀察到經以3：1效應物：目標比添加的CD3+泛T細胞活化。

TMCB132在體外的T細胞介導之細胞毒性。

使用T細胞介導之細胞毒性檢定來評估TMCB132在體外的細胞毒性潛力，其係在Incucyte平台上使用現場縮時攝影(live-time lapse imaging)。以3：1的(效應物：目標)效應物：目標比(E：T比)，在來自健康供體的經單離之泛人類CD3+ T細胞存在下，於TMEFF2陽性細胞系LnCaP中測試TMCB132。藉由測量活性凋亡蛋白酶-3/7在96小時期間內的螢光信號，監測細胞凋亡所致細胞死亡。TMCB132促進存活LnCaP細胞隨時間增加的劑量依賴性減少。凋亡蛋白酶-3/7活性或螢光信號的劑量依賴性增加，指示LnCaP細胞在T細胞存在下的細胞死亡(圖8)。數據顯示TMCB132有效誘導T細胞介導之LnCaP腫瘤細胞死亡。

TMCB132在T細胞人源化小鼠中所建立SC人類前列腺異種移植物中的療效。

亦以經20e⁶個T細胞人源化的雄性NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG,The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)小鼠中所建立皮下(SC)人類前列腺LNCaP異種移植物，評估TMCB132的抗腫瘤療效。NSG雄性。在腫瘤植入後第13天，將動物依平均腫瘤體積隨機分成各組10隻動物。在4週期間，每週兩次進行0.5、0.1、及0.05mg/kg下之TMCB132的IP給藥、或0.5mg/kg下空xCD3B219抗體對照組的IP給藥。在腫瘤植入後第45天，當每組仍有至少七隻動物時，計算以腫瘤體積判定的腫瘤生長抑制(TGI%)。相較於空xCD3對照組，0.5及0.1mg/kg以及0.05mg/kg下的TMCB132觀察到統計上顯著的腫瘤生長抑制(圖9，p

0.0001)。相較於經空xCD3處理的對照組，0.5、0.1、及0.05mg/kg下的TMCB132分別誘發102%、109%、及47%的腫瘤生長抑制。在0.5、0.1、及0.05mg/kg下的TMCB132治療分別導致三次、二次、及一次完全反應。

<110> 美商健生生物科技公司(JANSSEN BIOTECH,INC.)

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<213> 人工序列

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<223> 人工序列說明：合成多肽

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<223> 人工序列說明：合成肽

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<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 52

<210> 53

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 53

<210> 54

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 54

<210> 55

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 55

<210> 56

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 56

<210> 57

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 57

<210> 58

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 58

<210> 59

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 59

<210> 60

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 60

<210> 61

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 61

<210> 62

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 62

<210> 63

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 63

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 64

<210> 65

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 65

<210> 66

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 66

<210> 67

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 67

<210> 68

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 68

<210> 69

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 69

<210> 70

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 70

<210> 71

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 71

<210> 72

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 72

<210> 73

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 73

<210> 74

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 74

<210> 75

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 75

<210> 76

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 76

<210> 77

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 77

<210> 78

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 78

<210> 79

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 79

<210> 80

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 80

<210> 81

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 81

<210> 82

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 82

<210> 83

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 83

<210> 84

<211> 330

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 未知者說明：野生型IgG1序列

<400> 84

<210> 85

<211> 327

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 未知者說明：野生型IgG4序列

<400> 85

<210> 86

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成肽

<400> 86

<210> 87

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 87

<210> 88

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 88

<210> 89

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 89

<210> 90

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 90

<210> 91

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 91

<210> 92

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 92

<210> 93

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 93

<210> 94

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 94

<210> 95

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 95

<210> 96

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 96

<210> 97

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 97

<210> 98

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 98

<210> 99

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 99

<210> 100

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 100

<210> 101

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 101

<210> 102

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 102

<210> 103

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 103

<210> 104

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 104

<210> 105

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 105

<210> 106

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 106

<210> 107

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 107

<210> 108

<211> 329

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多核苷酸

<400> 108

<210> 109

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 109

<210> 110

<211> 91

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 110

<210> 111

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成多肽

<400> 111

<210> 112

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列說明：合成6xHis標籤

<400> 112

Claims

一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其結合至TMEFF2之SEQ ID NO：110之近膜區(membrane proximal region)；其中該經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段包含下列之重鏈互補決定區1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3、輕鏈互補決定區1(LCDR1)、LCDR2及LCDR3：a)分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及22；b)分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21及23；c)分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20及24；d)分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20及22；或e)分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及86。
如請求項1所述之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與參考抗體競爭結合至TMEFF2之該近膜區，該參考抗體包含：a)SEQ ID NO：25之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：28之輕鏈可變區(VL)；或b)SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL；c)SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL；d)SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL；e)SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL；或f)SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。
如請求項1或2所述之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段在殘基HGKCEHSINMQEPSC(SEQ ID NO：57)或DAGYTGQHCEKKDYSVL(SEQ ID NO：58)內結合至TMEFF2之該近膜區。
如請求項1所述之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約0.4×10^-9M或更低的平衡解離常數(K_D)結合至TMEFF2之該近膜區，其中該K_D係在室溫下以pH 4.5至5.0於乙酸鹽緩衝液中使用表面電漿共振來測量。
如請求項4所述之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以介於約0.1×10^-10M與約0.4×10^-9M之間的該K_D結合至TMEFF2之該近膜區。
如請求項5所述之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含衍生自VH3_3-23(SEQ ID NO：53)或VH1_1-69(SEQ ID NO：54)之重鏈可變區(VH)架構。
如請求項6所述之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含衍生自VKI_L11(SEQ ID NO：55)或VKIIII_A27(SEQ ID NO：56)的輕鏈可變區(VL)架構。
如請求項7所述之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含衍生自下列之VH架構及VL架構：a)分別為SEQ ID NO：53之VH3_3-23及SEQ ID NO：55之VKI_L11；b)分別為SEQ ID NO：54之VH1_1-69及SEQ ID NO：56之VKIII_A27；或c)分別為SEQ ID NO：54之VH1_1-69及SEQ ID NO：55之VKI_L11。
如請求項1所述之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含：a)SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL；b)SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL；c)SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL；d)SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL；e)SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL；或f)SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。
如請求項9所述之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
如請求項10所述之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其包含：a)SEQ ID NO：32之重鏈(HC)及SEQ ID NO：35之輕鏈(LC)；b)SEQ ID NO：33之HC及SEQ ID NO：36之LC； c)SEQ ID NO：34之HC及SEQ ID NO：37之LC；d)SEQ ID NO：33之HC及SEQ ID NO：38之LC；e)SEQ ID NO：91之HC及SEQ ID NO：92之LC；或f)SEQ ID NO：93之HC及SEQ ID NO：94之LC。
一種經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其係選自下列所構成之群組：i)該經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，包含a)分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL；及/或c)SEQ ID NO：32之HC及SEQ ID NO：35之LC；ii)該經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，包含：a)分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21及23之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL；及/或c)SEQ ID NO：33之HC及SEQ ID NO：36之LC；iii)該經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，包含：a)分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL；及/或c)SEQ ID NO：34之HC及SEQ ID NO：37之LC；iv)該經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，包含：a)分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL；及/或c)SEQ ID NO：33之HC及SEQ ID NO：38之LC；v)該經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，包含：a)分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL；及/或 c)SEQ ID NO：91之HC及SEQ ID NO：92之LC；及vi)該經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，包含：a)分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL；及/或c)SEQ ID NO：93之HC及SEQ ID NO：94之LC。
如請求項1所述之經單離之抗TMEFF2抗體，其中該抗體係多特異性抗體。
如請求項13所述之經單離之抗TMEFF2抗體，其中該抗體係雙特異性抗體。
如請求項13所述之經單離之抗TMEFF2抗體，其中該抗體結合CD3，可選地CD3ε。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至15中任一項所述之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。
如請求項1所述之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段，其偶聯至一或多個異源分子。
一種經單離之多核苷酸，其a)編碼如請求項12所述之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段；b)編碼SEQ ID NO：25、26、27、87或89之抗TMEFF2抗體VH、及/或SEQ ID NO：28、29、30、31、88或90之VL；c)包含SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、95、96、97、98、99、100、101或102之多核苷酸序列。
一種載體，其包含如請求項18所述之多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項19所述之載體。
一種生產如請求項12所述之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段的方法，其包含在使該抗體表現之條件下培養如請求項20所述之宿主細胞；及回收由該宿主細胞生產之該抗體。
一種治療有效量的如請求項1至15中任一項所述之經單離之抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段、或如請求項16所述之醫藥組成物之用途，其用於製備治療有需要之對象的TMEFF2陽性癌症之藥劑。
如請求項22所述之用途，其中該TMEFF2陽性癌症係前列腺癌。
如請求項23所述之用途，其中該前列腺癌係復發性、難治性、惡性或去勢抗性前列腺癌、或其任何組合。
如請求項22至24中任一項所述之用途，其中該抗TMEFF2抗體或其抗原結合片段係與第二治療劑組合投予。
如請求項25所述之用途，其中該第二治療劑係手術、化療、雄性激素剝奪療法、或輻射、或其任何組合。
一種套組，其包含如請求項12所述之抗體。
一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中該第一結構域包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3：a)分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及22；b)分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21及23；c)分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20及24；d)分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20及22；或e)分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及86；以及該第二結構域包含下列之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3：a)分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65；或b)分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72及73。
如請求項28所述之經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體結合至TMEFF2之SEQ ID NO：110之該近膜區。
如請求項28或29所述之經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體與參考抗體競爭結合至TMEFF2之該近膜區，該參考抗體包含： a)SEQ ID NO：25之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：28之輕鏈可變區(VL)；或b)SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL；c)SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL；d)SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL；e)SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL；或f)SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。
如請求項28所述之經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體在殘基HGKCEHSINMQEPSC(SEQ ID NO：57)或DAGYTGQHCEKKDYSVL(SEQ ID NO：58)內結合至TMEFF2之該近膜區。
如請求項28所述之經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體以約0.4×10^-9M或更低的解離常數(K_D)結合至TMEFF2之該近膜區，其中該K_D係在室溫下以pH 4.5至5.0於乙酸鹽緩衝液中使用表面電漿共振來測量。
如請求項32所述之經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體以介於約0.1×10^-10M與約0.4×10^-9M之間的該K_D結合至人類TMEFF2之該近膜區。
如請求項28所述之經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該第一結構域包含：a)SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL；b)SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL；c)SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL；d)SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VLe)SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL；或f)SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL。
如請求項28所述之經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該第二結構域包含：a)SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；或b)SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL。
一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中a)該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)該第一結構域包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或c)該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：32之第一重鏈(HC1)、SEQ ID NO：35之第一輕鏈(LC1)、SEQ ID NO：76之第二重鏈(HC2)及SEQ ID NO：77之第二輕鏈(LC2)。
一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中a)該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)該第一結構域包含SEQ ID NO：25之VH及SEQ ID NO：28之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或c)該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：32之HC1、SEQ ID NO：35之LC1、SEQ ID NO：78之HC2及SEQ ID NO：79之LC2。
一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，其中a)該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21及23之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或c)該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：36之LC1、SEQ ID NO：76之HC2及SEQ ID NO：77之LC2。
一種經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含結合TMEFF2之第一結構域及結合CD3之第二結構域，係選自下列所構成之群組：i)該經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中a)該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、19、21及23之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：29之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或c)該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：36之LC1、SEQ ID NO：78之HC2及SEQ ID NO：79之LC2；ii)該經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中a)該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3； b)該第一結構域包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或c)該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：34之HC1、SEQ ID NO：37之LC1、SEQ ID NO：76之HC2及SEQ ID NO：77之LC2；iii)該經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中a)該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、14、17、18、20及24之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)該第一結構域包含SEQ ID NO：27之VH及SEQ ID NO：30之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或c)該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：34之HC1、SEQ ID NO：37之LC1、SEQ ID NO：78之HC2及SEQ ID NO：79之LC2；iv)該經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中a)該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或c)該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：38之LC1、SEQ ID NO：76之HC2及SEQ ID NO：77之LC2； v)該經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中a)該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：11、13、16、18、20及22之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)該第一結構域包含SEQ ID NO：26之VH及SEQ ID NO：31之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或c)該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：33之HC1、SEQ ID NO：38之LC1、SEQ ID NO：78之HC2及SEQ ID NO：79之LC2；vi)該經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中a)該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)該第一結構域包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或c)該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：91之HC1、SEQ ID NO：92之LC1、SEQ ID NO：76之HC2及SEQ ID NO：77之LC2；vii)該經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中a)該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3； b)該第一結構域包含SEQ ID NO：87之VH及SEQ ID NO：88之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或c)該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：91之HC1、SEQ ID NO：92之LC1、SEQ ID NO：78之HC2及SEQ ID NO：79之LC2；viii)該經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中a)該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：60、61、62、63、64及65之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)該第一結構域包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：66之VH及SEQ ID NO：67之VL；及/或c)該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：93之HC1、SEQ ID NO：94之LC1、SEQ ID NO：76之HC2及SEQ ID NO：77之LC2；及ix)該經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中a)該第一結構域包含分別為SEQ ID NO：10、12、15、18、20及86之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該第二結構域包含分別為SEQ ID NO：68、69、70、71、72及73之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)該第一結構域包含SEQ ID NO：89之VH及SEQ ID NO：90之VL，且該第二結構域包含SEQ ID NO：74之VH及SEQ ID NO：75之VL；及/或c)該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：93之HC1、SEQ ID NO：94之LC1、SEQ ID NO：78之HC2及SEQ ID NO：79之LC2。
如請求項28所述之經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。
如請求項28所述之經單離之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，其中a)該抗體包含在該HC1中、在該HC2中、或在該HC1及該HC2中之位置234處之丙胺酸、位置235處之丙胺酸、或位置234處之丙胺酸及位置235處之丙胺酸，其中殘基編號係根據EU索引；b)該抗體包含在該HC1中及在該HC2中之位置228處之脯胺酸，其中殘基編號係根據EU索引；或c)該抗體包含在該HC1中之位置405處之苯丙胺酸及位置409處之精胺酸及在該HC2中之位置405處之白胺酸及位置409處之離胺酸。
一種醫藥組成物，其包含如請求項28至41中任一項所述之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。
一種多核苷酸，其a)編碼如請求項36至39中任一項所述之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，或b)包含SEQ ID NO：39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、80、81、82、83、95、96、97、98、99、100、101及102之多核苷酸序列。
一種載體，其包含如請求項43所述之多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項44所述之載體。
一種生產雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段之方法，其包含在使該抗體表現之條件下培養如請求項45所述之宿主細胞；及回收並純化由該宿主細胞生產之該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段。
一種生產如請求項36至39中任一項中所述之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段之方法，其包含：a)將單特異性二價TMEFF2抗體及單特異性二價CD3抗體以約1：1莫耳比之混合物組合，該單特異性二價TMEFF2抗體具有兩個相同的HC1及兩個相同的LC1，該單特異性二價CD3抗體具有兩個相同的HC2及兩個相同的LC2；b)將還原劑引入該混合物中；c)將該混合物培養約九十分鐘至約六小時；d)移除該還原劑；及e)純化該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段，該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段包含該HC1、該LC1、該HC2及該LC2。
如請求項47所述之方法，其中該還原劑係2-巰基乙醇胺(2-MEA)。
如請求項48所述之方法，其中該2-MEA以約25mM至約75mM的濃度存在。
如請求項47至49中任一項之方法，其中該培養步驟係在約25℃至約37℃之溫度下執行。
一種治療有效量的如請求項36至41中任一項所述之雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段、或如請求項42所述之醫藥組成物之用途，其用於製備治療有需要之對象的TMEFF2陽性癌症之藥劑。
如請求項51所述之用途，其中該TMEFF2陽性癌症係前列腺癌。
如請求項52所述之用途，其中該前列腺癌係復發性、難治性、惡性或去勢抗性前列腺癌、或其任何組合。
如請求項51至53中任一項所述之用途，其中該雙特異性抗TMEFF2/抗CD3抗體或其抗原結合片段係與第二治療劑組合投予。
如請求項54所述之用途，其中該第二治療劑係手術、化療、雄性激素剝奪療法、或輻射、或其任何組合。
一種套組，其包含如請求項36至39中任一項所述之抗體。