TWI865391B - 循環腫瘤細胞之擴增方法及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種循環腫瘤細胞的擴增方法及其應用，該擴增方法包含：提供一腫瘤細胞；將該腫瘤細胞置於超低附著多孔盤中進行離心，使細胞聚集成3D球狀結構；施予一基質膠包覆該3D球狀結構；以及以一無血清擴增培養液進行懸浮培養，其中該無血清擴增培養液包含纖維母細胞生長因子3及麩醯胺酸。
Description
本發明關於一種腫瘤細胞之擴增方法，特別係關於應用於循環腫瘤細胞之檢測的腫瘤細胞擴增技術。
循環腫瘤細胞(Circulation Tumor Cell，CTC)泛指從原位腫瘤脫離並進入周圍血液循環或淋巴系統中的腫瘤細胞，其係癌症轉移(metastasis)的潛在源頭。循環腫瘤細胞的檢測和分析對於癌症早期評估、轉移風險評估、及術後效果評估等方面具有重要價值，其檢測僅須透過血液樣本，屬於無侵入性的檢測方式，並可針對正在治療中的癌症患者進行即時監測，可作為療效及監控腫瘤是否轉移的良好指標，尤其是術後有些病人已經轉移至組織深處，無法取得腫瘤組織切片，以至於檢測血液中之循環腫瘤細胞深具臨床應用性。
然而，循環腫瘤細胞在血液中的比例極少，大約10
8至10
9的血液細胞中只有一顆，使得循環腫瘤細胞的檢測通常需要使用高靈敏度和高精確度的技術，以識別及分離極少量的循環腫瘤細胞，現行分析及篩選循環腫瘤細胞係透過微流體系統、流式細胞儀、磁珠分選系統，其價格高昂而難以廣為運用。因此為了解決上述臨床痛點，簡單、成本低廉且能有效擴增循環腫瘤細胞的技術係本領域亟待解決的重要議題。
發明內容旨在提供本發明的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本發明的完整概述，且其用意並非在指出本發明具體實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容的唯一目的在於對本發明揭示的某些概念提供簡化的說明，以利理解後文所述的實施方式。
於一方面，本發明提供一種腫瘤細胞的擴增方法，其包含：
提供一腫瘤細胞；
將該腫瘤細胞置於超低附著多孔盤中進行離心，使細胞聚集成3D球狀結構；
施予一基質膠(Matrigel)包覆該3D球狀結構；以及
以一無血清擴增培養液進行懸浮培養，其中該無血清擴增培養液包含纖維母細胞生長因子3 (Fibroblast Growth Factor 3，FGF-3)及麩醯胺酸(glutamine，Gln)。
於某些具體實施例中，其中該培養係在1至3% (v/v)氧氣濃度之低氧環境中進行。
於某些具體實施例中，其中該離心的轉速為700至900 x
g，離心的時間為6至10分鐘。
於某些具體實施例中，其中該纖維母細胞生長因子3的濃度為8至12 ng/ml。
於某些具體實施例中，其中該麩醯胺酸的濃度為1至3 mM。
於某些具體實施例中，其中該腫瘤細胞係為肺癌腫瘤細胞、乳癌腫瘤細胞、及/或大腸癌腫瘤細胞。
於另一方面，本發明提供一種循環腫瘤細胞的檢測方法，其包含：
提供一周邊血；
將該周邊血進行密度梯度離心，以分離出一周邊血單核細胞樣本；
將該周邊血單核細胞樣本進行遷移能力篩選，以獲得一目標細胞樣本；
將該目標細胞樣本置於超低附著多孔盤中進行離心，使細胞聚集成3D球狀結構；
施予一基質膠包覆該3D球狀結構；
以一無血清擴增培養液進行懸浮培養，其中該無血清擴增培養液包含纖維母細胞生長因子3及麩醯胺酸；以及
分析循環腫瘤細胞之細胞擴增數量，以判斷該周邊血中是否含有循環腫瘤細胞。
其中，本發明所述循環腫瘤細胞的檢測方法係將本發明所述腫瘤細胞的擴增方法應用於該目標細胞樣本的培養，後續藉由觀察擴增情形，做為該周邊血中是否含有循環腫瘤細胞的判斷依據。
於某些具體實施例中，其中該血液樣本來自於一受試者。
於某些具體實施例中，其中該篩選係以8 μm之通孔小室(transwell)及基質膠模擬細胞外間質(extracellular matrix，ECM)，以篩選出具遷移能力之循環腫瘤細胞。
於某些具體實施例中，其中該培養係在1至3% (v/v)氧氣濃度之低氧環境中進行。
本發明所提供之循環腫瘤細胞的檢測方法，經由通孔小室及基質膠的設計，篩選血液細胞樣本中具有遷移能力之循環腫瘤細胞。由於循環腫瘤細胞在血液中的比例極少，因此藉此所篩選出之循環腫瘤細胞數目相當稀少。而本發明所述腫瘤細胞擴增方法可有效擴增數量稀少之腫瘤細胞，藉由離心將細胞聚集成3D球狀，再以基質膠模擬細胞外間質包圍的環境，並在低氧及3D類腫瘤微環境下以特別設計之無血清擴增培養液進行懸浮培養，最終達到有效擴增循環腫瘤細胞的數量，後續再藉由檢測循環腫瘤細胞的擴增情形，作為癌症檢測的依據，更可進行進一步的循環腫瘤細胞分析，達到精準醫療之目的。
本發明所述擴增方法不需透過微流體系統或磁珠分選系統，不僅大幅降低循環腫瘤細胞檢測的難度及成本，更在沒有分選系統的情形下讓循環腫瘤細胞有效擴增至純度90%以上，對於癌症檢測、臨床醫療及精準醫療上的發展具有極高的價值。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
循環腫瘤細胞在血液中的含量相當稀少，大約10
8至10
9的血液細胞中僅有一顆，以至於檢測門檻較高，現行分析及檢測循環腫瘤細胞需經過微流體系統、流式細胞儀、磁珠分選系統，其成本高昂且操作複雜，因而難以廣為運用。
有鑑於此，本發明首先提供一種腫瘤細胞的擴增方法，請參閱圖1，本發明所述腫瘤細胞的擴增方法包含步驟11~步驟14。
步驟11：提供一腫瘤細胞。其中該腫瘤細胞包含但不限於肺癌腫瘤細胞、乳癌腫瘤細胞、大腸癌腫瘤細胞、上皮細胞癌腫瘤細胞、肺腺癌腫瘤細胞、腹膜癌腫瘤細胞、肝癌腫瘤細胞、胃腸癌腫瘤細胞、胰臟癌腫瘤細胞、子宮頸癌腫瘤細胞、卵巢癌腫瘤細胞、膀胱癌腫瘤細胞、腎癌腫瘤細胞、前列腺癌腫瘤細胞或甲狀腺癌腫瘤細胞。
步驟12：將該腫瘤細胞置於超低附著多孔盤中進行離心，使細胞聚集成3D球狀結構。其中該離心的轉速為700至900 x
g，例如700 x
g、710 x
g、720 x
g、730 x
g、740 x
g、750 x
g、760 x
g、770 x
g、780 x
g、790 x
g、800 x
g、810 x
g、820 x
g、830 x
g、840 x
g、850 x
g、860 x
g、870 x
g、880 x
g、890 x
g或900 x
g。其中該離心的時間為6至10分鐘，例如6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘或10分鐘。
步驟13：施予一基質膠包覆該3D球狀結構。其中該基質膠係用於模擬細胞外間質包覆細胞的環境。
步驟14：以一無血清擴增培養液進行懸浮培養，其中該無血清擴增培養液包含纖維母細胞生長因子3 (FGF-3)及麩醯胺酸(glutamine)。其中該纖維母細胞生長因子3的濃度為8至12 ng/ml，例如8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、11 ng/ml、12 ng/ml。其中該麩醯胺酸的濃度為1至3 mM，例如1 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2 mM、2.1 mM、2.2 mM、2.3 mM、2.4 mM、2.5 mM、2.6mM、2.7 mM、2.8 mM、2.9 mM或3 mM。
於某些具體實施例中，其中該培養係在1至3% (v/v)氧氣濃度之低氧環境中進行，例如1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%或3%。
於某些具體實施例中，本發明所述腫瘤細胞的擴增方法，於擴增培養時，每7天更換一次無血清擴增培養液，並於懸浮培養18天後，可改為貼附培養。
於另一方面，本發明提供一種循環腫瘤細胞的檢測方法，請參閱圖2，本發明之循環腫瘤細胞的檢測方法包含步驟21~步驟27。
步驟21：提供一周邊血。其中該周邊血來自於一受試者，其中該受試者為欲檢測血液中循環腫瘤細胞之個體。於某些具體實施例中，該周邊血可為其他血液樣本。
步驟22：將該周邊血進行密度梯度離心，以分離出一周邊血單核細胞樣本。於某些具體實施例中，該密度梯度離心係透過Ficoll-Paque密度梯度分離試劑進行離心，以分離出周邊血單核細胞，其中該周邊血單核細胞可能含有數量相當稀少之循環腫瘤細胞。
步驟23：將該周邊血單核細胞樣本進行遷移能力篩選，以獲得一目標細胞樣本。於某些具體實施例中，其中該篩選係以8 μm之通孔小室(transwell)及基質膠模擬細胞外間質(ECM)，以篩選出得以穿透該模擬細胞外間質的具遷移能力之循環腫瘤細胞，此步驟會同時篩選掉樣本中的免疫細胞。於某些具體實施例中，其中該目標細胞樣本可能含有循環腫瘤細胞。
步驟24：將該目標細胞樣本置於超低附著多孔盤中進行離心，使細胞聚集成3D球狀結構。其中該離心的轉速為700至900 x
g，例如700 x
g、710 x
g、720 x
g、730 x
g、740 x
g、750 x
g、760 x
g、770 x
g、780 x
g、790 x
g、800 x
g、810 x
g、820 x
g、830 x
g、840 x
g、850 x
g、860 x
g、870 x
g、880 x
g、890 x
g或900 x
g。其中該離心的時間為6至10分鐘，例如6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘或10分鐘。
步驟25：施予一基質膠包覆該3D球狀結構。其中該基質膠係用於模擬細胞外間質包覆細胞的環境。
步驟26：以一無血清擴增培養液進行懸浮培養，其中該無血清擴增培養液包含纖維母細胞生長因子3 (FGF-3)及麩醯胺酸(glutamine)。其中該纖維母細胞生長因子3的濃度為8至12 ng/ml，例如8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、11 ng/ml或12 ng/ml。其中該麩醯胺酸的濃度為1至3 mM，例如1 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2 mM、2.1 mM、2.2 mM、2.3 mM、2.4 mM、2.5 mM、2.6mM、2.7 mM、2.8 mM、2.9 mM或3 mM。其中該培養能有效擴增該目標樣本中的循環腫瘤細胞。於某些具體實施例中，培養天數為7至21天，例如7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天。於某些具體實施例中，其中該培養係在1至3% (v/v)氧氣濃度之低氧環境中進行，例如1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%或3%。
步驟27：分析循環腫瘤細胞之細胞數量，以判斷該周邊血中是否含有循環腫瘤細胞。若欲檢測的周邊血中含有循環腫瘤細胞，則可觀測到循環腫瘤細胞之數量明顯增長，反之，若欲檢測的周邊血中未含有循環腫瘤細胞，則無法觀測到循環腫瘤細胞。於某些具體實施例中，循環腫瘤細胞之細胞擴增情形可反映受試者血液中之循環腫瘤細胞含量，可做為癌症評估、轉移風險評估、及術後效果評估之依據，後續亦可將擴增之循環腫瘤細胞進一步分析癌症種類及治療方法等，達到精準醫療之效果。
其中，步驟24至步驟26係將本發明所述腫瘤細胞的擴增方法，應用於本發明所述循環腫瘤細胞的檢測方法中，具體而言，係將篩選過後之該目標細胞樣本進行腫瘤細胞的擴增，後續藉由觀察擴增情形，做為該周邊血中是否含有循環腫瘤細胞的判斷依據，亦可評估癌症轉移的風險。
應當理解的是，前述一般描述和下面的詳細描述都是示例性和說明性的，但並非用以限制本發明所請之權利。本發明的一個或多個實施例的某些細節闡述於以下說明中。從以下代表性實施例的非窮舉的列表中，亦從所附的權利要求中，本發明的其它特徵或優點將是顯而易見的。
除非下文另有定義，否則本文所用之所有科學及技術術語具有與本發明所屬領域中的技術人員所通常理解相同的含義。對本文所用技術的引用目的在於指示本領域中通常理解的技術，包括對那些技術的變體或等效物或後來開發的替代技術，這對於本領域技術人員來說是顯而易見的。
應注意的是，如本文中所使用，單數形式術語「一個」、「一種」及「該」除非明確地限於一個指示物，否則包括複數個指示物。除非上下文另外明確指出，否則術語「或」與術語「和/或」可互換使用。
本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」一詞實質上代表所述之數值或範圍位於5%以內，較佳為於3%以內，以及更佳者為於1%以內。於文中所提供之數字化的量為近似值，意旨若術語「約」、「大約」或「近乎」沒有被使用時亦可被推得。
如本文中所使用，詞彙「包含」是開放式的，表示此類實施例可包含額外的元素。反之，詞彙「由…組成」是封閉式的，表示此類實施例不包含額外的元素（痕量雜質除外）。詞彙「基本上由…組成」是部分封閉式的，表示此類實施例還可包含非實質改變此類實施例的基本特徵之元素。
除非本文另有定義，否則用以與本文結合的科學與技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。一般而言，本文所描述之用以連結以下技術的命名法，以及生物化學、酵素學、分子及細胞生物學、微生物學、免疫學、遺傳學與蛋白質及核酸化學及雜合反應的技術皆為本領域已知且經常使用者。除非另有說明，本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行，且被描述於在本說明書中被引用且討論的各種一般及更具體的參考文獻中。
如本文所使用，術語「擴增」是指任何將細胞數目、或是純度增加的過程。如本文所使用，術語「擴增培養液」泛指用於本發明所述擴增過程的細胞培養物質，包含但不限於基礎培養基、非必需胺基酸、半乳糖神經醯胺、羥乙基哌嗪乙硫磺酸、丙酮酸鈉、2-巰基乙醇、胎牛血清、盤尼西林/鏈黴素、或營養物等中任一項或多項物質之培養液。如本文所使用，術語「無血清擴增培養液」泛指不含動物血清的擴增培養液。
如本文所用，術語「遷移能力」係指細胞具有穿透細胞外間質或細胞層之能力，具有遷移能力的細胞包含但不限於腫瘤細胞。如本文所用，術語「遷移能力篩選」泛指依據細胞是否具有穿透細胞外間質或細胞層之能力進行篩選，以篩選出具有遷移能力之細胞。
如本文所用，術語「周邊血單核細胞」(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)泛指不包括骨髓的血液中任何擁有圓形細胞核的細胞，包含但不限於淋巴細胞(如，T細胞、B細胞和NK細胞等)、單核細胞、嗜酸性白血球、嗜中性白血球、嗜鹼性白血球，以及樹突細胞，不包含紅血球與血小板。其中，癌症患者之原位腫瘤細胞若穿過細胞外間質進入血液循環，成為循環腫瘤細胞，則上述患者之周邊血單核細胞包含循環腫瘤細胞。
如本文所用，術語「受試者」係指一動物，更具體而言係指非人類哺乳動物以及人類有機體。非人類動物受試者還可包括動物的生產前形式，例如胚胎或胎兒。非人類動物的非限制性實例包括：馬、牛、駱駝、山羊、綿羊、狗、貓、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、兔、倉鼠、天竺鼠、豬。於某些具體實施例中，該受試者為一人類。人類受試者還可包括胎兒。
如本文所使用，術語「磁珠分離系統」係指應用奈米級超順磁珠與特定細胞表面抗原的高度特異性抗體結合來分離所需特定細胞的分離系統。
本發明進一步透過以下的實施例闡釋，其不應以任何方式被解釋為進一步的限縮。本申請案中引用的所有引用文件(包括參考文獻、核准的專利、公開的專利申請，以及一同在申請中的專利申請案)的整體內容，在此透過引用的方式明確地併入本案中。
實施例
1.
肺癌腫瘤細胞的擴增
本實施例透過本發明所述腫瘤細胞的擴增方法，將肺癌腫瘤細胞(PC9 lung cancer cell，RRID編號：CVCL_B260)進行擴增培養，以證實本發明所述腫瘤細胞的擴增方法對於肺癌腫瘤細胞的擴增效果。
材料與方法
本實施例將腫瘤細胞分成3組不同的培養條件，分別為對照組、高氧環境組、及低氧環境組，其中對照組於21% (v/v)氧氣濃度環境下使用常規無血清培養液(未添加纖維母細胞生長因子3及麩醯胺酸)進行培養；高氧環境組於21% (v/v)氧氣濃度環境下使用無血清擴增培養液(有添加纖維母細胞生長因子3及麩醯胺酸)進行培養；低氧環境組於2% (v/v)氧氣濃度環境下使用無血清擴增培養液(有添加纖維母細胞生長因子3及麩醯胺酸)進行培養。本實施例所述之無血清擴增培養液係RPMI 1640培養液(Gibco公司，產品編號：11875093，美國)添加10 ng/ml 的纖維母細胞生長因子3 (FGF-3)、2 mM 的麩醯胺酸(glutamine)及1%的盤尼西林/鏈黴素(Penicillin/Streptomycin，Gibco公司，產品編號：15140122，美國)，而本實施例所述之常規無血清培養液係RPMI 1640培養基添加1%的盤尼西林/鏈黴素。其中，各組別皆進行三重複(n=3)，並使用學生氏
t檢驗(Student's
t-test)統計實驗數據中各組別之間的差異。統計顯著性之符號*及#分別代表，相較於對照組，高氧環境組與低氧環境組的
p＜ 0.05，而**及##分別代表，相較於對照組，高氧環境組與低氧環境組的
p＜ 0.01。
將腫瘤細胞以每孔(well) 50 個之細胞數目置於超低附著圓底96孔盤中(Ultra-low attachment round bottom 96-well plate)，以轉速800 x
g進行離心8分鐘，使細胞聚集成3D球狀結構，再加入50 uL的基質膠(Matrigel)包覆3D球狀的細胞團，依據組別設計以無血清擴增培養液或常規無血清培養液進行懸浮培養18天，後續將細胞由超低附著圓底96孔盤中移至平底96孔細胞培養盤進行貼附培養至第21天，每7天更換一次培養液，並於擴增第1、7、14及21天計算肺癌腫瘤細胞的數量。其中，低氧環境組於第0、11、18及20天於顯微鏡下觀察腫瘤細胞擴增情形。
結果
請參閱圖3A，低氧環境組於顯微鏡下可觀察到肺癌腫瘤細胞數目經培養後有明顯逐漸擴增之趨勢，請參閱圖3B，低氧環境組及高氧環境組與對照組相比之下，其細胞數目於擴增培養第7天及第14天皆有顯著的上升，請參閱圖3C，低氧環境組經過21天的培養，從50個肺癌腫瘤細胞擴增至約3 x 10
7個肺癌腫瘤細胞，與高氧環境組或對照組相較之下，具有顯著之擴增效果。由實驗結果可知，本發明所述無血清擴增培養液能有效擴增肺癌腫瘤細胞，且於低氧環境下進行培養具有更顯著之擴增效果，證實本發明所述腫瘤細胞的擴增方法具有擴增腫瘤細胞的功效。
實施例
2.
乳癌腫瘤細胞的擴增
本實施例透過本發明所述腫瘤細胞的擴增方法，將乳癌腫瘤細胞(MDA-MB-231 breast cancer cell，ATCC編號：CRM-HTB-26)進行擴增培養，以證實本發明所述腫瘤細胞的擴增方法對於乳癌腫瘤細胞的擴增效果。
本實施例中，實驗設計及材料方法同實施例1所述。
結果
請參閱圖4A，低氧環境組及高氧環境組與對照組相比之下，其細胞數目於擴增培養第14天及第21天皆有顯著的上升，請參閱圖4B，低氧環境組經過21天的培養，從50個乳癌腫瘤細胞擴增至約3.5 x 10
7個乳癌腫瘤細胞，與高氧環境組或對照組相較之下，具有顯著之擴增效果，另外，高氧環境組與對照組相較之下，雖亦具有顯著之擴增效果，但擴增效果遠不及低氧環境組。由實驗結果可知，本發明所述無血清擴增培養液能有效擴增乳癌腫瘤細胞，且於低氧環境下進行培養能產生更顯著之擴增效果，證實本發明所述腫瘤細胞的擴增方法具有擴增腫瘤細胞的功效。
實施例
3.
大腸癌腫瘤細胞的擴增
本實施例透過本發明所述腫瘤細胞的擴增方法，將大腸癌腫瘤細胞(DLD-1 colorectal cancer cell，ATCC編號：CCL-221)進行擴增培養，以證實本發明所述腫瘤細胞的擴增方法對於大腸癌腫瘤細胞的擴增效果。
本實施例中，實驗設計及材料方法同實施例1所述。
結果
請參閱圖5A，低氧環境組及高氧環境組與對照組相比之下，其細胞數目於擴增培養第14天及第21天皆有顯著的上升，請參閱圖5B，低氧環境組經過21天的培養，從50個大腸癌腫瘤細胞擴增至約6 x 10
7個大腸癌腫瘤細胞，與高氧環境組或對照組相較之下，具有顯著之擴增效果，另外，高氧環境組與對照組相較之下，雖亦具有顯著之擴增效果，但擴增效果遠不及低氧環境組。由實驗結果可知，本發明所述無血清擴增培養液能有效擴增大腸癌腫瘤細胞，且於低氧環境下進行培養能產生更顯著之擴增效果，證實本發明所述腫瘤細胞的擴增方法具有擴增腫瘤細胞的功效。
實施例
4.
循環腫瘤細胞的擴增及檢測
本實施例透過本發明所述循環腫瘤細胞的檢測方法，將含有循環腫瘤細胞的周邊血樣本進行擴增培養，以證實本發明所述循環腫瘤細胞的檢測方法能有效擴增周邊血中之循環腫瘤細胞，並做為檢測之依據。
材料與方法
本實施例使用非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer)患者之周邊血樣本進行測試，其中該樣本於每8 mL周邊血中含有約10顆的循環腫瘤細胞。首先，將8 mL之患者周邊血透過Ficoll-Paque密度梯度分離試劑進行離心，以分離出周邊血單核細胞樣本，其中該周邊血單核細胞樣本含有約10顆的循環腫瘤細胞。將50 uL的基質膠加入8 μm之通孔小室(transwell)以模擬細胞外間質(extracellular matrix，ECM)，再將該周邊血單核細胞樣本加入上層小室(upper chamber)中，其中具有遷移能力之細胞會穿透模擬的細胞外間質到達下層小室(lower chamber)，以此篩選出具遷移能力之細胞，並且由於免疫細胞無法穿透模擬的細胞外間質到達下層小室，因此該篩選亦可有效的移除免疫細胞，防止免疫細胞影響循環腫瘤細胞的後續生長。於篩選後，收集下層小室中的細胞樣本，轉移至超低附著圓底96孔盤中(Ultra-low attachment round bottom 96-well plate)，以轉速800 x
g進行離心8分鐘，使細胞聚集成3D球狀結構。加入50 uL的基質膠包覆該3D球狀結構的細胞團，以模擬細胞外間質包覆細胞的環境。
將上述細胞樣本分為對照組及實驗組，其中對照組於2% (v/v)氧氣濃度之低氧環境下，以無血清培養液進行懸浮培養21天，而實驗組於2% (v/v)氧氣濃度之低氧環境下，以無血清擴增培養液(含FGF-3及glutamine)進行懸浮培養21天，各組每7天更換一次培養液，並於擴增第1、7、14及21天以流式細胞儀分析循環腫瘤細胞的占比，並計算循環腫瘤細胞的數量。其中，統計顯著性之符號*代表
p＜0.05，**代表
p＜0.01，***代表
p＜0.001。
本實施例中之流式細胞儀分析，係取細胞液樣本添加流式染色緩衝劑(FACS staining buffer)。針對循環腫瘤細胞的分析，係以Alexa Fluor
®488標記之抗CD326抗體(Anti-Hu CD326 Alexa Fluor
®488，購自EXBIO公司，商品編號：A4-582-T100)及藻紅素(phycoerythrin，PE)標記之抗細胞角蛋白抗體(Anti-Cytokeratins PE，購自EXBIO公司，商品編號：1P-108-C100)進行辨別及分析。上述螢光標記物皆避光培養30分鐘後，以流式細胞儀(BD FACS AriaIII，BD Biosciences公司，美國)進行液流收取，依照其螢光訊號在分析軟體透過繪圖區與框選獲取與分析，計算細胞液中表達之細胞數，再藉此計算出其佔總細胞樣本之比例等數據結果。
結果
請參閱圖6，細胞樣本於擴增培養第1天，其循環腫瘤細胞數目約占總細胞樣本中的0.63%，經過培養後，實驗組在第7天、14天及21天之循環腫瘤細胞占總細胞樣本中的比例分別提升至14.78%、56.99%及93.27%，相較之下，對照組在第7天、14天及21天之循環腫瘤細胞占總細胞樣本中的比例分別為0.58%、1.51%及1.84%，請參閱圖7A，實驗組在第7天、14天及21天之循環腫瘤細胞占比有明顯上升的趨勢，且顯著高於對照組，請參閱圖7B，實驗組在第7天、14天及21天之循環腫瘤細胞數目有明顯上升，尤其於第21天之循環腫瘤細胞數目擴增至約1.4 x 10
7個，且顯著高於對照組。實驗結果表明，本發明所述擴增技術能將周邊血單核細胞樣本中的極少量循環腫瘤細胞進行有效擴增，由起初約10個循環腫瘤細胞經過21天的培養能擴增至約10
7個，擴增效果達百萬倍，並且不需分選系統即可讓循環腫瘤細胞的純度達90%以上，擴增後能輕易辨別原始樣本中是否含有循環腫瘤細胞，成為循環腫瘤細胞檢測的依據，且擴增後之循環腫瘤細胞更可進一步進行後續分析。
在本發明所述循環腫瘤細胞的檢測方法中，若受試者之周邊血不含有循環腫瘤細胞，在經過本發明所述擴增培養後，則不會觀察到循環腫瘤細胞的擴增，反之，若受試者之周邊血含有循環腫瘤細胞，就算數量相當稀少，在經過本發明所述擴增培養後，依然會觀察到循環腫瘤細胞的大量擴增，以此可作為檢測周邊血中是否含有循環腫瘤細胞的依據，其結果相當直觀、靈敏，且不需透過微流體系統或磁珠分選系統，大幅降低循環腫瘤細胞檢測的難度及成本，後續更可將擴增之循環腫瘤細胞進一步進行分析，對於臨床檢測及精準醫療領域具有相當大的價值。
本發明透過上述之實施例揭露如上，僅是本發明部分較佳的實施例選擇，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此一技術領域具有通常知識者，在瞭解本發明前述的技術特徵及實施例，並在不脫離本發明之精神和範圍內所做的均等變化或潤飾，仍屬本發明涵蓋之範圍，而本發明之專利保護範圍須視本說明書所附之請求項所界定者為準。
11-14:步驟
21-27:步驟
圖1係為本發明之腫瘤細胞的擴增方法流程圖。
圖2係為本發明之循環腫瘤細胞的檢測方法流程圖。
圖3A係為本發明實施例1之肺癌腫瘤細胞擴增實驗之低氧環境組，於第0、11、18及20天的顯微影像圖。圖3B係為本發明實施例1之肺癌腫瘤細胞擴增實驗，於第1、7、14及21天的細胞數目折線圖。圖3C係為本發明實施例1之肺癌腫瘤細胞進行擴增培養第21天時的細胞數目結果圖。
圖4A係為本發明實施例2之乳癌腫瘤細胞擴增實驗，於第1、7、14及21天的細胞數目折線圖。圖4B係為本發明實施例2之乳癌腫瘤細胞進行擴增培養第21天時的細胞數目結果圖。
圖5A係為本發明實施例3之大腸癌腫瘤細胞擴增實驗，於第1、7、14及21天的細胞數目折線圖。圖5B係為本發明實施例3之大腸癌腫瘤細胞進行擴增培養第21天時的細胞數目結果圖。
圖6係為本發明實施例4於擴增培養第1、7、14及21天的流式細胞儀分析結果圖。
圖7A係為本發明實施例4於擴增培養第1、7、14及21天的循環腫瘤細胞占比折線圖。圖7B係為本發明實施例4於擴增培養第1、7、14及21天的循環腫瘤細胞數目折線圖。
Claims (8)
- 一種腫瘤細胞的擴增方法，其包含：提供一腫瘤細胞；將該腫瘤細胞置於超低附著多孔盤中進行離心，使細胞聚集成3D球狀結構；施予一基質膠包覆該3D球狀結構；以及以一無血清擴增培養液進行懸浮培養，其中該無血清擴增培養液包含RPMI 1640培養液、8至12ng/ml的纖維母細胞生長因子3(Fibroblast Growth Factor 3)及1至3mM的麩醯胺酸(glutamine)。
- 如請求項1所述之腫瘤細胞的擴增方法，其中該培養係在1至3%(v/v)氧氣濃度之低氧環境中進行。
- 如請求項1所述之腫瘤細胞的擴增方法，其中該離心的轉速為700至900xg，離心的時間為6至10分鐘。
- 如請求項1所述之腫瘤細胞的擴增方法，其中該腫瘤細胞係為肺癌腫瘤細胞、乳癌腫瘤細胞或大腸癌腫瘤細胞。
- 一種循環腫瘤細胞的檢測方法，其包含：提供一周邊血；將該周邊血進行密度梯度離心，以分離出一周邊血單核細胞樣本；將該周邊血單核細胞樣本進行遷移能力篩選，以獲得一目標細胞樣本；將該目標細胞樣本置於超低附著多孔盤中進行離心，使細胞聚集成3D球狀結構；施予一基質膠包覆該3D球狀結構； 以一無血清擴增培養液進行懸浮培養，其中該無血清擴增培養液包含RPMI 1640培養液、8至12ng/ml的纖維母細胞生長因子3及1至3mM的麩醯胺酸；以及分析循環腫瘤細胞之細胞數量，以判斷該周邊血中是否含有循環腫瘤細胞。
- 如請求項5所述之循環腫瘤細胞的檢測方法，其中該周邊血來自於一受試者。
- 如請求項5所述之循環腫瘤細胞的檢測方法，其中該篩選係以8μm之通孔小室(transwell)及基質膠模擬細胞外間質(extracellular matrix)，以篩選出具遷移能力之循環腫瘤細胞。
- 如請求項5所述之循環腫瘤細胞的檢測方法，其中該培養係在1至3%(v/v)氧氣濃度之低氧環境中進行。
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2024
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150329829A1 (en) * | 2012-11-26 | 2015-11-19 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for culture of human and mouse prostate organoids and uses thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 網路文獻 ATCC, "Animal Cell Culture Guide", /atcc.org, March 28 2021 https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide * |
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