TWI864215B - 處理紀錄載玻片及將其用於鬆散細胞之方法 - Google Patents
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Abstract
本申請案係關於處理紀錄載玻片及將其用於鬆散細胞之方法。一種單至多區域載玻片，其中各區域均含有一至四個對照目標物，且均適合以特殊染劑、免疫組織化學 (IHC) 或細胞化學 (CC) 檢測法或其他方法加以處理。各區域可由疏水性障壁加以包圍以形成井孔。此載玻片具有適合捕捉鬆散細胞及細胞碎片之黏著劑被覆層。
Description
本申請案係關於處理紀錄載玻片及將其用於鬆散細胞之方法。
目前已有多種以疏水性障壁包圍出樣本井孔(well)之載玻片。其中某些載玻片係開發及製造為具有多個井孔，例如100個井孔。然而，該等載玻片均不包含對照目標物，故無法為用以處理樣本之一次及二次染色試劑進行定量量測。
一種判定抗體試劑濃度之方法係有關於判定稀釋樣本對280nm波長輻射之吸光率。隨後產生之分析報告則載明封裝小瓶內之濃度，通常在0.8與1.2mg/ml之間。然而，該吸光率量測值係假設所有抗體蛋白質均完全未受損傷。倘若鉸鏈區出現某種程度之斷裂，但抗原結合區(Fab區)及可結晶區(Fc區)依然存在，則量測值仍將維持不變。使用小瓶內之抗體時，須先使抗體溫度上升至25℃，然後才抽出適當用量。若載玻片無須進一步處理，則將小瓶送回4℃之儲藏區。所有蛋白質均會隨年齡增長而逐漸崩壞，最初為鉸鏈區斷裂。為解決活抗體之此一衰變問題，實驗室作業準則係直接將購入滿六個月
之小瓶報廢。此一作法係假定上述劣化之嚴重程度不足以影響已染色之組織切片。然而，只要將小瓶整夜放置在儲藏區外，便有可能嚴重折損活抗體之壽命。考量抗體之費用，實驗室往往忽略上述瑕疵，但又希望取得最佳結果。唯有在使用已知細胞對照組之情況下，才能對比看出早期衰敗。
本申請案某些實施例中之載玻片在各樣本井孔中設置對照目標物以解決上述問題。對照目標物之作用係為所施用之初級抗體之功能濃度定量。
針對使用鬆散細胞之載玻片，目前並無處理作業品質對照物(PQC)之共存式解決方案。鬆散細胞之應用包括子宮頸抹片、血液抹片，以及在多種應用中所使用之多井孔/多病人載玻片。多病人載玻片大多用於處理大量之子宮頸抹片。
若欲從所施用之漿液中捕捉鬆散細胞，可給予沉積物足夠之時間，靜待細胞下沉至載玻片表面。本發明之載玻片包含黏著劑被覆層，其可以共價方式捕捉沉澱之細胞。在某些實施例中，單層黏著劑上另設有保形黏著劑以確保細胞與黏著劑間較高之結合密度。此種保形黏著劑載玻片之一實例為Erie Gold Plus。但在某些情況下，品質良好之胺基矽烷載玻片黏著劑便足以提供所需之捕捉效果。
在載玻片上製造樣本井孔之方式之一，係以疏水性塗料(例如環氧樹脂或胺甲酸乙酯)印製圖案。多種可供使用之印刷法包括網板印刷法、移印
法、噴墨法及滾珠法。有數家廠商製造此種載玻片。印刷過程之一重點為：不以加熱方式促使塗料固化，因為黏著劑之疏水性通常會因加熱而降低。
在某些應用中則無法使用疏水性障壁。例如，在血液抹片之塗抹過程中，往往會使不同類型之血液細胞分別到達抹痕之特定區域。而形成抹痕之方式通常係以另一載玻片之邊緣拖拉樣本液滴。拖拉之速度以及該另一載玻片之角度為血液黏性之函數。可在載玻片上設置PQC目標物作為基標，藉以告知使用者應將病人之樣本施用於何處。
單一樣本之載玻片可使用或不使用疏水性障壁。傳統形式之血液抹片及子宮頸抹片在製作時未必需要使用疏水性障壁環。自動化之子宮頸抹片機可將病人樣本處理成細胞密度受控之漿液或過濾圓盤上之一濕潤層。該漿液係施用於疏水性障壁環內，靜待其沉澱，然後將多餘液體移除。此種載玻片之一實例係尚未上市之Veracell子宮頸抹片用載玻片。上述過濾圓盤上之濕潤層係轉印至一載玻片，故不需使用具有圍堵功能之障壁環。此種載玻片之一實例為ThinPrep載玻片。
本申請案之某些實施例包含可在無疏水性障壁之載玻片上作基標使用之處理紀錄載玻片(PRS)對照目標物。作基標使用時，對照目標物承載點係位於作業區(一標稱尺寸為1.5cmx1.5cm之區域)之四個角落。一般而言，未使用疏水性障壁之載玻片一次僅能處理一份病人生物材料樣本。對照目標物可沿著該1.5cmx1.5cm區域之邊緣設置。雖然圖1A包括一尺寸為1.5cmx1.5cm之區域，但具有本技術領域一般技術之人士當知不同尺寸之區域仍在本揭露內容
之範圍內。
包含疏水性障壁環以圍堵樣本之載玻片鮮少具有超過十個井孔，且各井孔均包含一圍堵區。樣本係施用於井孔中央，直到井孔內所填裝之樣本量接近井孔之外溢容量為止。細胞掉落處往往遠離井孔邊緣，因此，在載體緩衝液蒸發後，細胞將堆疊在中央；若以加熱方式加速蒸發，則細胞堆疊在中央之現象將更為明顯。對照目標物可分散在井孔作業區周緣四個相互等距之位置。在免疫組織化學(IHC)應用中，抗體蛋白質與染色試劑結合後之沉澱速度大於最高濃度往往出現在沉積物邊緣之細胞。因此，細胞漿液通常不會沉積在目標物所在位置。對照目標物則有充足之時間可以捕捉染色試劑。在任何一種染色作業中，生物材料一旦變濕，通常皆可在染色完成前保持濕潤狀態。
染色作業僅限支援兩種初級抗體，其限制條件為：其中一種抗體係源於小鼠，另一種抗體則以兔為宿主。在使用單一初級抗體之構型中，對照目標物將捕捉以小鼠或兔為宿主之抗體。對照目標物有多種構型選項：-包含四個圓點(承載點)之密度梯度系列：適用於單一初級抗體(源於小鼠或兔)；-包含兩個圓點(承載點)之密度梯度系列：可設置一對供小鼠抗體使用之承載點，以及一對供兔抗體使用之承載點；-四個獨立目標物承載點：分別供小鼠抗體、兔抗體、小鼠二級抗體及兔二級抗體使用；或-上述構型之任一組合。
本申請案之某些實施例係針對一種載玻片，其包含檢測區及對照區，該檢測區可用於固持包含鬆散細胞之樣本，該對照區則可用於：在免疫組織化學或細胞化學檢測作業中顯示中間步驟之錯誤與執行成效之度量結果，並為定性或定量判定被染色之鬆散細胞之抗原密度與顏色密度或該被染色之鬆散細胞上或內之顏色密度而分別提供參照；其中：該檢測區包含至少一個區域；該對照區係位於該檢測區之該至少一個區域周圍；且該對照區包含至少一個可提供參照之對照目標物。
在至少一個實施例中，該載玻片尚包含可與部分(moieties)結合之黏著劑被覆層，其中該黏著劑被覆層包含至少一種從下列各項組成之群中所選出之端基：-ROH、-R(C=O)OH、-RNH2、-R(C=O)NH2及-RNH3。
在至少一個實施例中，該檢測區之該至少一個井孔為圓形、正方形或矩形。
在至少一個實施例中，該對照區係位於該檢測區之該區域之角落。
在至少一個實施例中，該對照區係位於該檢測區之該區域內。
在至少一個實施例中，該對照區係位於該檢測區之該區域外。
在至少一個實施例中，該對照區包含至少一個對照圓點或包含對照圓點之陣列。
在至少一個實施例中，該對照目標物之組成係用於捕捉以小鼠、兔，或小鼠加兔為宿主之初級抗體；以小鼠、兔，或小鼠加兔為宿主之二級抗體；或蘇木素-伊紅染劑。
在至少一個實施例中，該初級抗體係由附著於載體蛋白質或附著於包括諸如乳膠等材料之珠粒之蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或FcyRI部位結合胜肽所捕捉，且該初級抗體被捕捉之部位為其FcyRI部位。
在至少一個實施例中，該蘇木素-伊紅染劑係由附著於包括諸如乳膠等材料之胺被覆珠粒之化學目標物所捕捉。
在至少一個實施例中，一對主要目標物包含兩種不同濃度，其中一濃度為100%，另一濃度介於30%與70%之間。
在至少一個實施例中，該載玻片尚包含一層黏著劑。
在至少一個實施例中，該黏著劑為胺基矽烷。
在至少一個實施例中，該對照區係由部分或完整之疏水性障壁加以包圍。
在至少一個實施例中，該檢測區之該至少一個井孔包含該樣本。
在至少一個實施例中，該載玻片尚包含疏水性材料被覆層。
在至少一個實施例中，該疏水性材料為環氧樹脂或胺甲酸乙酯。
在至少一個實施例中，該對照目標物包含主要目標物、初級抗體、次要目標物、二級抗體、成像參考物、二維(2D)成像參考目標物、三維(3D)成像參考目標物，或目標物陣列。
在至少一個實施例中，次要目標物可為兩種不同濃度，其中一濃度為100%，另一濃度介於30%與70%之間。
在至少一個實施例中，成像參考物圓點(承載點)包含下列至少其中之一：-黑色參考目標物，其包含碳粉；-白色參考目標物，其中該白色參考目標物包含金屬氧化物或金屬硫酸鹽；或-透明目標物，其中該透明目標物包含不與任何免疫組織化學、免疫化學或細胞化學試劑產生反應之非反應性蛋白質。
在至少一個實施例中，該成像參考物圓點(承載點)包含：-以酐為基礎之環氧樹脂，其係用於該白色參考目標物或該黑色參考目標物；及-馬科動物之蛋白質，其係用於該透明目標物。
本申請案之某些實施例係針對一種利用上述載玻片檢測細胞之方法，該方法包含下列步驟：將該包含鬆散細胞之樣本置於該檢測區；將對照目標物置於該對照區；將該等鬆散細胞及該對照目標物染色，其中所述染色包含：將至少一種主要目標物施用於該載玻片之該對照區，將至少一種與部分(moiety)接合之主要目標物施用於該載玻片之該對照區，或將至少一種與部分(moiety)接合之次要目標物施用於該載玻片之該對照區；及將可產生顏色之染色試劑施用於該檢測區及該對照區；
評估所述染色之品質，其中所述評估包含評估該等鬆散細胞及該對照目標物之染色結果；及定性判定該等鬆散細胞之狀態。
在至少一個實施例中，該至少一個對照目標物可用於捕捉以小鼠、兔，或小鼠加兔為宿主之初級抗體；以小鼠、兔，或小鼠加兔為宿主之二級抗體；或蘇木素-伊紅染劑。
在至少一個實施例中，該初級抗體係由附著於載體蛋白質或附著於活性珠粒之蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或FcyRI部位結合胜肽所捕捉，且該初級抗體被捕捉之部位為其FcyRI部位。
在至少一個實施例中，該蘇木素-伊紅染劑係由附著於活性珠粒之化學目標物所捕捉。
102:對照目標物，主要目標物陣列，對照區
1021~1024:主要目標物陣列
圖1A係至少一個實施例中之載玻片之俯視圖，其中該載玻片具有一個疏水性障壁環且含有對照目標物。
圖1B係至少一個實施例中之載玻片之局部俯視圖，其中該載玻片具有一個疏水性障壁環且含有對照目標物。
圖2係至少一個實施例中之載玻片之俯視圖，其中該載玻片具有多個疏水性障壁環，且各疏水性障壁環內均含有對照目標物。
圖3A係至少一個實施例中之子宮頸抹片檢查用載玻片之俯視圖，其中該載玻片具有適用於p16INK4a及Ki-67初級抗體之對照目標物。
圖3B係至少一個實施例中適用於p16INK4a及Ki-67初級抗體之對照目標物之俯視圖。
圖4係至少一個實施例中與ThinPrep相容之子宮頸抹片用載玻片之俯視圖，其中該載玻片支援適用於子宮頸抹片染色之PQC目標物。
以下所揭露之內容提供多種實施本案標的物不同特徵之實施例或範例。為簡化本揭露內容，以下將描述各元件及其配置方式之特定實施例。當然，該等實施例僅供例示之用，並不具有限制性。例如，在下文中，將第一特徵形成於第二特徵上或上方可包括該第一與第二特徵直接接觸之實施例，亦可包括該第一與第二特徵可能因為其間尚有其他特徵而未直接接觸之實施例。此外，本揭露內容可能會在不同實施例中重複使用相同之參考標號及/或字母，而重複使用之目的僅為求簡明，並不代表不同實施例及/或構型間之關聯性。
此外，免疫組織化學法及其他免疫化學法所使用之試劑(例如酶溶液及過氧化酶顯色劑)在工作溫度或室溫下之穩定度欠佳，因而必須反覆製備。再者，導致錯誤結果之非專一性抗體結合現象仍待解決。
主要目標物：
在某些實施例中，對照目標物102包括一或多個用以測試初級抗體試劑之主要目標物。
在本文中，「主要目標物」一詞係指一包含反應性與非反應性物質之組合物，其中該反應性及非反應性物質僅透過初級抗體多個FcyR1部位中之一個而專一結合於該初級抗體。在本文中，「主要蛋白質」一詞係指可結合於初級抗體FcyRI部位之蛋白質。在本文中，「主要虛設蛋白質」一詞係指不會與初級抗體或二級抗體產生反應之蛋白質。在本文中，「最大目標物密度」一詞係指相鄰蛋白質之最大單層密度。在本文中，「代用抗原」一詞係指一蛋白質其並非IHC或免疫細胞化學(ICC)分析法中所用初級抗體(源於小鼠或兔)之目標，但卻結合於該初級抗體且僅透過該初級抗體中兩個FcyRI區中之一個而結合於該初級抗體。在本文中，「小鼠抗體專用代用抗原」一詞係指僅與源於小鼠之初級抗體之FcyRI產生特定反應之蛋白質或抗原。在本文中，「兔抗體專用代用抗原」一詞係指僅與源於兔之初級抗體之FcyR1產生特定反應之胜肽或蛋白質。
胎盤哺乳類蛋白質之重量介於50與65kDa之間。初級抗體之免疫球蛋白G(IgG)係由兩個Fab區和一個Fc區構成，通常以Y字形之模型表示。其中Fc區係透過鉸鏈區連結至兩個Fab區。所有未接合之抗體均透過為宿主接種拮抗抗原胜肽之方式，在哺乳類宿主(大多為小鼠或兔)之體內培養。宿主產生抗體以抵抗入侵之拮抗抗原胜肽，而產生抗體之方式係將具有結合性之胺基酸序列組裝於抗體中可捕捉對應抗原之Fab區之N端旁。抗體之Fc區必為哺乳類宿主之Fc區。宿主抗體之Fc區大多具有三個可供二級抗體結合之結合位置，其結合親和
力由高至低分別為：FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)及FcyRIII(CD16)。
主要虛設蛋白質係選用不會與小鼠、兔、山羊、牛及綿羊產生反應之蛋白質，因為上述動物之蛋白質通常會與二級抗體結合。在某些實施例中，主要虛設蛋白質係取自任一種馬科動物：馬、驢、斑馬、貘或犀牛。牛血清白蛋白(BSA)並非合適之虛設蛋白質，因為BSA與組織或大部分載玻片黏著化學物共價結合時必定生熱，且結合之過程耗時甚久。牛、綿羊與山羊之蛋白質亦非合適之虛設蛋白質，因為在某些情況下，上述蛋白質有可能與小鼠或兔之蛋白質混淆，端視初級抗體之專一性而定。
主要蛋白質係宿主之抗小鼠抗體或宿主之抗兔抗體。宿主限於山羊或任一種馬科動物。
以胜肽為基礎之主要蛋白質亦可由會與小鼠或兔之FcyRI產生反應且C端之半胱胺酸殘基係共價結合於載體蛋白質(例如鑰孔笠貝血氰蛋白(KLH)次單元)之胜肽構成。KLH次單元之自由胺位點係以Sulfo-SMCC活化，進而以接合(conjugation)之方式結合於該種胜肽之半胱胺酸殘基。未活化之KLH次單元本身即足以構成主要虛設蛋白質。
以全蛋白狀態存在之KLH重約8000kDa。在全蛋白狀態下，KLH之pH值或溫度並不穩定，此不穩定性有可能使該蛋白質分解為下列次單元：KLH1(重量為390kDa)及KLH2(重量為350kDa)。上述任一次單元以Sulfo-SMCC活化後，均可作為具有半胱胺酸殘基之胜肽(該殘基通常位於胜肽之C端)之載體蛋白質。
請參閱圖1A及圖1B，在某些實施例中，主要目標物係排列成主要目標物陣列1021-1024。在某些實施例中，主要目標物陣列102係主要目標物之密度梯度陣列。在某些實施例中，陣列中之各目標物具有相同之最大目標物密度(蛋白質/表面積)。然而，主要蛋白質與主要虛設蛋白質之比例係以漸進方式變化，以確保一寬廣濃度範圍內之初級抗體稀釋物可藉此辨別。一般而言，以兩種主要代用抗原目標物進行檢測即可將濃度對應至檢測轉移曲線。在某些實施例中，主要目標物之密度梯度陣列包括複數個主要目標物承載點，其中一陣列係源於小鼠之目標物，另一陣列係源於兔之目標物。
在某些實施例中，主要目標物之密度係以線性方式遞增或遞減，例如100%、80%、60%、40%，依此類推。在某些實施例中，主要目標物之密度係以對數方式遞增或遞減，例如100%、33%、10%、3%，依此類推。
在某些實施例中，主要目標物密度梯度陣列中具有最大主要目標物密度之承載點，其主要目標物之密度可導致該主要目標物無法在染色過程中使該承載點達到飽和。
在某些實施例中，通用之代用抗原為蛋白質A或蛋白質G。蛋白質A會結合於胎盤哺乳類之FcyRI部位以及Fab區內之部分區域。蛋白質G僅會結合於大部分胎盤哺乳類之FcyRI部位。
在某些實施例中，代用抗原僅對小鼠或兔具有專一性。為具有此專一性，代用抗原可由抗小鼠及抗兔蛋白構成，或由載體蛋白質上之抗小鼠及抗兔胜肽構成，或由抗小鼠及抗兔VHH蛋白區構成。
在某些實施例中，虛設代用抗原包括來自山羊以外之馬科或有蹄胎盤哺乳類動物之抗體。馬科包括諸如馬、驢、貘、犀牛、騾等動物。馬科動物之演化與基因明顯不同於其他動物，故可降低非專一性染色之發生率。山羊被排除在外係因二次染色作業之定序過程中經常使用抗山羊蛋白質，而抗山羊蛋白質會結合於任何未反應之山羊主要部位。
雖然染色作業中所用代用抗原與初級抗體間之交互作用不同於真實抗原與初級抗體間之交互作用，但代用抗原目標物可用於評估初級抗體之效力。初級抗體均附有以mg/ml為單位之濃度分析報告。然而，此分析報告並未指出可代表完整免疫球蛋白G(IgG)之百分比。由於代用抗原在目標物中之密度濃度為已知，所用初級抗體濃度之捕集量可據此求出。利用外插法即可求出共存組織切片之抗原密度。找尋組織中抗原密度之可能性受限於初級抗體(單株或多株)與二級抗體之累積置換量，以及二次染色作業之酶放大率。所用初級抗體之濃度取決於組織種類，且必須具有一定之裕度。在此係假設初級抗體會在其置換限度內，結合於所有可供結合之抗原部位。
在某些實施例中，主要目標物之密度梯度陣列係一通用代用抗原之承載點陣列。在某些實施例中，該陣列中之承載點包括遞增或遞減之代用抗原密度。在某些實施例中，代用抗原係與一或多種虛設蛋白質(例如虛設代用抗體)混合，且代用抗原濃度之遞增或遞減係在最大目標物密度不變之條件下，透過改變代用抗原與虛設蛋白質之比例而達成。
在某些實施例中，對照區102包括至少兩個代用抗原目標物陣列。
在某些實施例中，對照區102包括第一代用抗原目標物陣列及第二代用抗原目標物陣列，該兩陣列分別包括抗小鼠抗體及抗兔抗體，且均與一虛設代用抗原混合，以便在最大目標物密度不變之條件下形成所需之反應密度。
因此，根據上述實施例，代用抗原主要目標物可在IHC或ICC步驟中搭配使用透過次要目標物所獲得之酶放大率與抗原修復因子，從而評估初級抗體之濃度。
2D/3D目標物：
在某些實施例中，對照目標物(例如主要目標物、次要目標物或抗原修復目標物)包括2D目標物。
在本文中，「2D目標物」一詞係指沉積於載玻片2D平面上之胜肽、蛋白質、抗原、抗體或任何其他對照目標物物質。
2D目標物之沉積作業較易實施，故製造成本較低。因此，若有成本考量，以使用2D目標物為較佳選擇。
在某些實施例中，對照目標物(例如主要目標物、次要目標物或抗原修復目標物)包括3D目標物。
在本文中，「3D目標物」一詞係指胜肽、蛋白質、抗原、抗體或任何其他對照目標物物質至少其中之一係施用於一支撐結構上，致使所產生之複合物位於載玻片上之3D空間內。
在一或多個實施例中，建構3D目標物之方式係於載玻片上形成一3D支架，然後將對照目標物物質沉積於該支架上。在某些實施例中，該3D支架
為多醣團簇。該多醣與胜肽或蛋白質表面之羥基或胺基形成共價鍵，從而將蛋白質連結成一體，並將目標物固定於載玻片之黏著層。在某些實施例中，對照目標物係透過甲醛固定之方式固定在3D支架上，因此，該目標物同時具有2D與3D組份。
在一或多個實施例中，3D目標物係由與主要或次要目標物物質共價結合之次微米珠粒建構而成，然後再以甲醛固定之方式固定該主要或次要目標物物質，使其可抵擋正常之抗原修復作業。以此方式沉積而成之目標物同時包括2D與3D組份。
相較於2D目標物，3D目標物之表現更加類似染色樣本。IHC或ICC之染色樣本(例如組織切片與細胞)具有高度。樣本高度通常介於4微米與10微米之間。染色作業中作為目標之抗原部位可位於組織切片外露表面結構上之任一位置。因此，樣本中之抗原部位可於切片之頂面、底面或組織側壁上之任一位置呈現平面狀，其中樣本側壁上之抗原所能沉澱之色素原著色劑之量明顯多於2D目標物所能沉澱之量。同時存在之2D組份與3D組份形成一階狀位差，此位差可應用於其他2D目標物以形成虛擬3D陣列。本案發明人經實驗發現，當任一3D目標物之尺寸介於80nm與0.5μm之間時，其染色之顏色深度與組織切片無異。尺寸大於0.6μm之珠粒以透射光照射時會產生過大之光學損失，導致珠粒在未染色之情況下呈現暗色。但若以反射光進行照射則無此問題。
此外，3,3'-二胺基聯苯胺(DAB；其為染色作業之一常用試劑)會在相對短之時間內老化，因而產生顏色與顏色濃度之變化。本發明人發現，以
DAB染色之3D目標物，其顏色與顏色濃度之變化與樣本類似。
特殊染劑：
在某些實施例中，對照目標物包括特殊染劑。
在某些實施例中，該特殊染劑包括艾爾遜藍、苯胺藍-橙黃G溶液、阿贊(Azan)染劑、比爾肖夫斯基(Bielschowsky)銀染劑、布朗與布倫(Brown & Brenn)-格蘭氏染劑、甲苯酚紫、DAB、馮塔納-馬頌(Fontana-Masson)染劑、高登-斯威特(Gordon-Sweet)銀染劑、葛羅考特(Grocott)六亞甲四胺銀染劑、霍爾(Hall)膽紅素染劑、瓊斯(Jones)六亞甲四胺銀染劑、Luxol固藍、Luxol固藍-甲苯酚紫、黏液胭脂紅(梅爾法)、慕勒-莫瑞(Muller-Mowry)膠態鐵、橙黃G、核固紅、過碘酸-希夫-澱粉酶(PAS-D)染劑、過碘酸-希夫(PAS)染劑、磷鎢酸、蘇木素、天狼星紅染劑、酸化甲苯胺藍、Gomori單一步驟三色染劑、馬頌三色染劑、維多利亞藍、馮庫薩(Von Kossa)染劑、維格特(Weigert)間苯二酚品紅、維格特鐵蘇木素、紀尼兩氏染劑或上列各項之組合。
市售次微米乳膠珠粒之直徑介於200nm與5μm之間，且表面具有外露之胺部位。如第2018/228576號世界智慧財產權組織專利申請案所述，該案之所有化學目標物均具有可與乳膠珠粒上之胺基結合之羥基端基。雖然反應較慢，但透過穩定搖晃，反應仍可在24小時內完成。
成像參考目標物：
在某些實施例中，對照區102尚包括成像參考目標物。在某些實施例中，該成像參考目標物包括一或多個黑色目標物、一或多個白色目標物，或透
明目標物。
為含有已染色生物材料之顯微鏡載玻片進行數位成像之方法已不斷演進，期能針對被染色之物質進行預先篩選，甚至做出完整之診斷判讀。在某些實施例中，載玻片染色作業完成後即進行載玻片之成像作業，而在成像過程中，光照度或曝光度均可調整，以免數位影像在黑/白邊界處被壓縮。其基本假設為：該黑、白色目標物可代表染色訊號所能達到之極限強度。然而，在實施此方法時，由於黑色目標物遠黑於組織切片所能產生之染色效果，白色目標物亦遠白於組織切片所能產生之染色效果，數位尺度將受到壓縮。
在某些實施例中，疏水性障壁之外側或內側設有兩個成像參考對照目標物(當該等成像參考對照目標物係設於疏水性障壁之內側時，並非位於樣本井孔內)。該等成像參考對照目標物代表以透射光及反射光成像時之黑、白色參考物。
環氧樹脂塗料固有之閃亮特性使其可提供高度之一次表面反射，故可在反射光之照射下充作目鏡視野內之白色參考物。使用透射光時，相同之黑色圓點將阻礙光線透射，因而成為透射光照射下之黑色參考物。透明圓點可作為透射光照射下之白色參考物；以反射光照射時則充作黑色參考物。為簡化疏水性障壁之製造過程，障壁之材料係採用黑色環氧樹脂塗料，其具有可成為前述另一
成像參考物之額外小井孔。
以透射光成像並無法正確呈現組織上之抗原密度。之所以如此，係因組織在染色後並非所有抗原部位均位於同一平面上之單一片體。組織之抗原部位可能位於其厚度中之任一位置。二次染色作業中之著色劑粒子將持續沉澱，直到該等粒子覆蓋酶位點並阻斷後續沉澱為止。倘若一抗原部位位於組織切片之側壁，則酶位點將永遠無法被覆蓋，致使沉澱之結果過度表現抗原之存在。使用透射光時，已沉澱之著色劑因厚度增加而產生「暗區」。反之，反射光僅「看見」成堆著色劑之頂面，故可更準確呈現抗原密度。
在某些實施例中，白色目標物之顏色接近純白。由於純白色不易取得，某些實施例中白色目標物之顏色與純白色相差5%~10%。與純白色相差不到5%之白色不易製造，而與純白色之差距大於10%之顏色若作為染色訊號強度對照組可能不夠準確。
在某些實施例中，白色目標物包括白色顏料。在某些實施例中，該白色顏料係金屬氧化物或金屬硫酸鹽顏料，且除非任其曝露在強光下，否則可維持穩定。在某些實施例中，該白色顏料包括氧化鋁、氧化鈦或硫酸鋇。在某些實施例中，該金屬氧化物或金屬硫酸鹽係呈現珠粒之形態。
在某些實施例中，黑色目標物包括黑色顏料。在某些實施例中，該黑色顏料包括以碳為基礎之顏料。在某些實施例中，該黑色顏料包括碳粉。在某些實施例中，該碳粉之直徑小於2微米。
在某些實施例中，成像參考目標物之配方完全不含界面活性劑，
以免所用之墨水/塗料與載玻片所可能接受之各種染劑及試劑產生反應。
在某些實施例中，成像參考目標物係以打印器印製於載玻片上。在其他實施例中，成像參考目標物係以注射器印製，因為注射器可控制目標物之沉積尺寸。
使用成像參考目標物有助於數位分析之最佳化，因為數位化之整個範圍已由載玻片所定義之黑/白色(而非純黑與純白色參考物)加以界定。數位分析有助於以內插法判定對照目標物之顏色，進而更精準判定染色樣本中之抗原量。使用成像參考目標物亦有助於數位分析之校正，以便提供對照目標物反應量之量測參考點。
沉積對照目標物之方法：
本說明書中之某些實施例係針對一種用以在處理紀錄載玻片上沉積對照目標物之方法。在某些實施例中，該載玻片及該等對照目標物與前文所說明者相同或類似。
在某些實施例中，該用以沉積對照目標物之方法包括將主要對照目標物或次要對照目標物沉積於載玻片上。
在某些實施例中，沉積主要對照目標物或次要對照目標物包括：以預定之濃度製備該對照目標物之溶液；固定該對照目標物；以及將該溶液印製於載玻片上。
在某些實施例中，製備該對照目標物之溶液包括：製備一包括該對照目標物與一多醣之溶液，其中該多醣係作為蛋白質與載玻片黏著劑間之連
結劑。
在某些實施例中，固定該對照目標物包括：以甲醛固定該對照目標物。甲醛可使該對照目標物產生交聯反應，從而使該對照目標物得以承受正常之抗原修復作業。
在某些實施例中，該對照目標物已交聯化。組織內之蛋白質係結合於組織內會防止蛋白質擴散與變性之其他部分。溶液中之對照目標物包括鬆散之蛋白質，因此對熱與酸鹼度較為敏感，容易在載玻片上擴散及變性，尤其在IHC或ICC分析法之抗原修復(AR)作業中更是如此。
真菌生長抑制劑可採用硫柳汞(Thimerosal)或吡啶-2-磺酸鈉鹽之環保替代物，例如Krovin 500。
在某些實施例中，主要目標物係以下列方式製備：
-製備一組主要蛋白質主稀釋物，各主稀釋物之體積為1ml，濃度為45μg/ml。詳言之，驢抗小鼠蛋白、驢抗兔蛋白及驢免疫球蛋白G(IgG)(H&L)均視需要而分別以蒸餾水(dH2O)稀釋，使其濃度為45μg/ml。上述蛋白質在購得時之濃度大多介於1與10mg/ml之間。添加10μl真菌生長抑制劑。真菌生長抑制劑可採用硫柳汞或吡啶-2-磺酸鈉鹽之環保替代物，例如Krovin 500。
-在40~60℃之溫度下，各主稀釋物分別以10μl、濃度為0.2%之甲醛固定1~4小時。
-添加30μl、濃度為0.45%之直鏈澱粉作為線性聚合物(添加有真菌生長抑制劑)，混合30分鐘。
-添加20μl之0.1M碳酸氫銨以淬滅任何未反應之甲醛。
-以所得之蛋白質主溶液製備驢抗小鼠及驢抗兔蛋白目標物混合物，使各目標物均含有700μl之蛋白質主溶液。
在某些實施例中，次要目標物係以下列方式製備：
-製備一組次要蛋白質主稀釋物，各主稀釋物之體積為1ml，濃度為45μg/ml。詳言之，小鼠、兔與驢免疫球蛋白G(IgG)(H&L)均視需要而分別以蒸餾水(dH2O)稀釋，使其濃度為45μg/ml。上述蛋白質在購得時之濃度大多介於10與60mg/ml之間。添加10μl之真菌生長抑制劑。
-在40~50℃之溫度下，各主稀釋物分別以10μl、濃度為0.2%之甲醛固定1~4小時。
-添加30μl、濃度為0.45%之直鏈澱粉作為線性聚合物(添加有真菌生長抑制劑)，混合30分鐘。
-添加20μl之0.1M碳酸氫銨以淬滅任何未反應之甲醛。
-以所得之蛋白質主溶液製備驢抗小鼠及驢抗兔蛋白目標物混合物，使各目標物均含有700μl之蛋白質主溶液。
在某些實施例中，以上述方式製備之主要或次要目標物或成像參考目標物係以下列方式經由單一印製循環而印製於載玻片上：
-將目標物溶液印製在被覆有黏著劑之顯微鏡載玻片上。
-以60℃之溫度風乾，直到水份完全蒸發為止，然後靜置冷卻。
-將石蠟-溶劑混合物噴塗於印製完成之目標物陣列上。
-使石蠟回流以密封目標物陣列並去除溶劑，從而使石蠟恢復其硬化之固體狀態。
實施例：
以下實施例係用於說明而非限制本揭露內容之範圍。雖然下列實施例屬於可能之應用實例之常見類型，但亦可改用熟習此項技術之人士所熟知之其他程序。實施例中所使用之材料均可於市面購得。
實施例1. 具有整合式處理作業品管功能之P16INK4a及Ki-67樣本載玻片：
目前已有可支援P16INK4a及Ki-67染色之多井孔測試載玻片，但該等多井孔測試載玻片不具有任何對照物，因此，其染色結果係假設AR作業符合作業準則，且初級抗體試劑之功能具有一致性，亦即可在不同載玻片上發揮一致之效能，或不同批號之抗體具有一致之效能。
圖2繪示十井孔載玻片之一實例，其中各井孔內皆含有四個對照目標物。各井孔內之四個對照目標物係成對設置，每對適用於一種初級抗體：其中一對適用於以小鼠為宿主之抗體，另一對則適用於以兔為宿主之抗體。每對對照目標物皆由一個100% 2D/3D目標物及一個50% 2D/3D目標物所組成。該等目標物之功用在於確認已施用初級抗體，且初級抗體之濃度足以使井孔內具有相配抗原部位之細胞正確染色。
此外，疏水性障壁之外側或內側設有兩個成像參考對照目標物(當該等成像參考對照目標物係設於疏水性障壁之內側時，並非位於樣本井孔內)。該等成像參考對照目標物代表以透射光及反射光成像時之黑、白色參考物。
環氧樹脂塗料固有之閃亮特性使其可提供高度之一次表面反射，故可在反射光之照射下充作目鏡視野內之白色參考物。使用透射光時，相同之黑色圓點將阻礙光線透射，因而成為透射光照射下之黑色參考物。透明圓點可作為透射光照射下之白色參考物；以反射光照射時則充作黑色參考物。為簡化疏水性障壁之製造過程，障壁之材料係採用黑色環氧樹脂塗料，其具有可成為前述另一成像參考物之額外小井孔。
目標物之所以設置於病人樣本區周圍，係因實驗室大多設法減少試劑之用量，且通常未徹底執行正確處理樣本所需使用之方法。將目標物設置於四個角落即可輕易確認染色材料在整個處理過程中之用量足以覆蓋病人樣本。
實施例2. 具有整合式處理作業品質對照物且可用於製作傳統手動操作式子宮頸抹片之載玻片：
用以製作手動操作式子宮頸抹片之載玻片已在世界各地例行性生產。由於病人樣本未接受前置處理，抹痕中包括黏液及其他細胞碎片。如第2018/228576號世界智慧財產權組織專利申請案所述(在此以引用之方式將該案內容併入本文)，吾人的確可利用具有已知特性之化學目標物測知染色試劑之性能。為達此目的，須在製造載玻片時將多種額外之PQC目標物施用於塗有黏著劑之空白載玻片上。該等PQC目標物可數位成像，成像結果則顯示染色試劑之剩餘使用壽命。
實施例3. 具有整合式處理作業品質對照物之ThinPrep子宮頸抹片
用載玻片：
ThinPrep係當前最主要之自動化子宮頸抹片處理系統。該自動化系統可從小瓶中取出病人樣本之一部分，並濾除黏液以及在某種程度上去除任何紅血球或其他細胞碎片。濾淨之樣本以接觸印相法沉積在塗有黏著劑之載玻片上。此載玻片具有四個基標，其大致位於一矩形之四個角落，而此矩形則位於樣本沉積區外。若以Cytyc樣本製備系統處理樣本，則該等基標之獨特形狀可在染色結果數位成像後用以辨別載玻片之來源。ThinPrep技術之不足之處在於其載玻片未設有處理作業品質對照物，故無法在執行所需之處理作業時實施染色試劑之確效。PQC可對成像系統提供處理作業瑕疵及試劑劣化狀況等原本無從取得之資訊。標準之子宮頸抹片染色試劑(分三個步驟施用之五種染劑)包括三種具有已知漂移及劣化特性之試劑：蘇木精、伊紅及磷鎢酸。吾人的確可利用具有已知特性之化學目標物測知染色試劑之性能。為達此目的，須在製造ThinPrep載玻片時將多種額外之PQC目標物施用於載玻片上。而如此一來，成像系統便可取得必要之PQC資訊，進而提供有關染色試劑性能之回饋，並為染色顏色之正規化(亦即使染色顏色以適當方式偏移)提供基礎，以免影響診斷之判定標準。
以上說明已概述多種實施例之特徵，以利熟習此項技術之人士進一步瞭解本揭露內容之態樣。熟習此項技術之人士當知，其可以本揭露內容為基礎，輕易設計出或修改其他方法及/或結構以實現與本文所述實施例相同之目的及/或優點。熟習此項技術之人士亦應瞭解，上述等效構造並未脫離本揭
露內容之範圍，且該等人士可在不脫離本揭露內容之精神與範圍之情況下，以多種方式改變、替換及修改本文所揭露之細節。
102:對照目標物，主要目標物陣列，對照區
Claims (18)
- 一種載玻片，包含：檢測區，其可用於固持包含鬆散細胞之樣本，其中該檢測區包含至少一個區域；及對照區，其位於該至少一個區域周圍，其中該對照區包含至少一個對照目標物，且該對照區可用於：在免疫組織化學或細胞化學檢測作業中顯示中間步驟之錯誤與執行成效之度量結果，並為定性或定量判定被染色之該鬆散細胞之抗原密度與顏色密度或被染色之該鬆散細胞上或內之顏色密度而分別提供參照，其中該檢測區之該至少一個區域係由疏水性障壁加以包圍以形成井孔。
- 如請求項1所述之載玻片，更包含可與部分結合之黏著劑被覆層，其中該黏著劑被覆層包含至少一種從下列各項組成之群中所選出之端基：-ROH、-R(C=O)OH、-RNH2、-R(C=O)NH2及-RNH3。
- 如請求項1所述之載玻片，其中該檢測區之該井孔為圓形、正方形或矩形。
- 如請求項1所述之載玻片，其中該對照區係位於該檢測區之該至少一個區域之角落。
- 如請求項1所述之載玻片，其中該對照區係位於該檢測區之該井孔內。
- 如請求項1所述之載玻片，其中該對照區係位於該檢測區之該至少一個區域外。
- 如請求項1所述之載玻片，其中該對照區包含至少一個對照圓點或包含對照條。
- 如請求項1所述之載玻片，其中該對照區係由部分或完整之該疏水性障壁加以包圍。
- 如請求項1所述之載玻片，其中該檢測區之該至少一個區域包含該樣本。
- 如請求項1所述之載玻片，更包含疏水性材料被覆層，其中該疏水性材料為環氧樹脂或胺甲酸乙酯。
- 如請求項1所述之載玻片，其中該至少一個對照目標物包含主要目標物、初級抗體、次要目標物、二級抗體、成像參考物、二維成像參考目標物、三維成像參考目標物，或目標物陣列。
- 如請求項1所述之載玻片，其中該至少一個對照目標物可用於捕捉以小鼠、兔，或小鼠加兔為宿主之初級抗體；以小鼠、兔，或小鼠加兔為宿主之二級抗體；或蘇木素-伊紅染劑。
- 如請求項12所述之載玻片，其中該初級抗體係由附著於載體蛋白質或附著於活性珠粒之蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或FcyRI部位結合胜肽所捕捉，且該初級抗體被捕捉之部位為該初級抗體之FcyRI部位。
- 如請求項12所述之載玻片，其中該蘇木素-伊紅染劑係由附著於活性珠粒之化學目標物所捕捉。
- 如請求項11所述之載玻片，其中一對所述初級抗體包含兩種不同濃度，其中第一濃度為100%，第二濃度介於30%與70%之間。
- 一種利用如請求項1所述之載玻片檢測細胞之方法，該方法包含下列步驟：將包含該鬆散細胞之該樣本置於該檢測區；將該至少一個對照目標物置於該對照區； 將該鬆散細胞及該至少一個對照目標物染色，其中所述染色包含：將至少一種主要目標物施用於該載玻片之該對照區，將至少一種與部分接合之該主要目標物施用於該載玻片之該對照區，或將至少一種與該部分接合之次要目標物施用於該載玻片之該對照區；及將可產生顏色之染色試劑施用於該檢測區及該對照區；評估所述染色之品質，其中所述評估包含評估該鬆散細胞及該至少一個對照目標物之染色結果；及定性判定該鬆散細胞之狀態，其中該至少一個對照目標物可用於捕捉以小鼠、兔，或小鼠加兔為宿主之初級抗體；以小鼠、兔，或小鼠加兔為宿主之二級抗體；或蘇木素-伊紅染劑。
- 如請求項16所述之方法，其中該初級抗體係由附著於載體蛋白質或附著於活性珠粒之蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或FcyRI部位結合胜肽所捕捉，且該初級抗體被捕捉之部位為該初級抗體之FcyRI部位。
- 如請求項16所述之方法，其中該蘇木素-伊紅染劑係由附著於活性珠粒之化學目標物所捕捉。
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