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TWI862945B - Ｂ族ｄｎａ聚合酶變體以及包含其的試劑套組 - Google Patents

Ｂ族ｄｎａ聚合酶變體以及包含其的試劑套組 Download PDF

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TWI862945B
TWI862945B TW111124518A TW111124518A TWI862945B TW I862945 B TWI862945 B TW I862945B TW 111124518 A TW111124518 A TW 111124518A TW 111124518 A TW111124518 A TW 111124518A TW I862945 B TWI862945 B TW I862945B
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呈堯 陳
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呈堯 陳
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Abstract

本發明所請係一種B族DNA聚合酶變體，其可提升核苷酸類似物的摻入效果，以利於多核苷酸的合成以及相關核酸模板的定序。更具體而言，利用該B族DNA聚合酶變體搭配一通常之核酸模板以及可逆染料終止子核苷酸下，得以有效進行DNA合成式定序法(sequencing-by-synthesis method)，以準確地測定該核酸模板之序列。

Description

B族DNA聚合酶變體以及包含其的試劑套組
本發明係關於一種聚合酶變體以及包含其的試劑套組，具體而言係關於用於核酸合成式定序的B族DNA聚合酶變體及包含該變體的試劑套組；然而本發明並不以此為限。
次世代定序(Next-generation sequencing, NGS)技術徹底改變現代生物和生物醫學研究。這項創新技術的核心源自於DNA聚合酶，因為該聚合酶會催化生化反應，以獲取模板序列的資訊。DNA合成定序(Sequencing by synthesis, SBS)技術是廣泛採用NGS平台當中的一種，屬於獨特的聚合酶依賴性方法，它的連續性定序反應會同時產生一股新合成的DNA鏈。
通常SBS法的步驟包括：摻入(incorporation)帶有螢光報導子(reporter)的核苷酸類似物；利用螢光發射來識別所摻入的該核苷酸；然後切割該螢光團，再重新啟動聚合酶反應來逐步定序。不同於傳統的桑格定序法，SBS法會在單一反應中產生不同大小、帶有螢光標記的DNA片段，因此需要先以電泳分離DNA後，再進行螢光檢測。該SBS法比桑格雙去氧定序法更為穩健，因為定序用的個別DNA片段或團簇係固定在高密度陣列上。藉此便無須先行分離DNA，而可直接檢測每個DNA片段或團簇發出的SBS螢光信號。再者，SBS法只要使用大量並行的微陣列晶片，即可輕鬆擴大檢測規模，提高整體定序規模並大幅降低DNA的定序成本。
然而，SBS法中所用的核苷酸會進行變異修飾。這些核苷酸類似物可能是在去氧核糖的3'-羥基(3'-OH)位置帶有大型化學保護基，或可能是在核鹼基(nucleobase)上帶有龐大螢光分子。天然存在的核酸聚合酶對於這些在核苷酸上帶有大型化學基團的修飾體對耐受性不佳。核酸聚合酶的活性位點袋狀結構原先即呈現適當幾何結構，藉以容納帶有正常3'-OH官能基和核鹼基之正確、相符的典型核苷酸。若以大型化學官能基，諸如2',3'-二去氧核苷酸(ddNTP)和3'-O-疊氮甲基-dNTP，分別消除或取代核苷酸上的3'-OH官能基時，則會顯著改變核酸聚合酶活性位點袋狀結構內的核苷酸構型，並降低核苷酸的結合親和力和核酸聚合酶的整體DNA合成效率。類似情況下，核苷酸上的核鹼基或5'-三磷酸官能基若帶有任何修飾體時，皆會破壞核苷酸與核酸聚合酶活性位點殘基之間的交互作用，並導致聚合酶無法將這些已修飾核苷酸妥善運用在其催化的核酸合成上。
鑑此，為了因應快速變化的DNA聚合酶關聯定序技術，需要不斷地創造一系列的核苷酸修飾體；因此，針對不斷變化的DNA定序化學尋找、設計或開發相容的酶顯得至關重要，例如美國專利第US11104888B2號即揭露一種古菌9°N DNA聚合酶(一種B家族聚合酶(Pol))，並發現其適用於摻入可逆的染料終止子核苷酸。
由於經修飾核苷酸類似物的多樣化特性，天然的核酸聚合酶無法輕易利用這些核苷酸類似物來作為模板導引核酸合成的受質。據此，經量身訂制的核酸聚合酶係發揮該些非典型核苷酸的效用，並使其得以應用於各種核酸合成式定序反應中的先決條件。
本案發明人發現了B族DNA聚合酶之胺基酸序列中的新位置/區域，該些位置/區域在增強所述聚合酶對修飾核苷酸的的基質親和力中扮演關鍵的角色，並可用以提高DNA合成式定序中的摻入核苷酸之效率。
具體而言，本發明一方面提供一種B族DNA聚合酶變體，其包含：一Exo I模體、一Exo II模體、一Exo III模體、一A模體、一B模體以及一C模體，分別對應於一共通序列(SEQ ID NO：1)之位置349至364、位置450至476、位置590至608、位置706至730、位置843至855及位置940至956；至少一胺基酸取代，位於選自於由該Exo I模體、該Exo II模體以及該Exo III模體所組成群組中之一模體中的一位置；以及至少一胺基酸取代，位於選自於由該A模體、該B模體以及C模體所組成群組中之一模體中的一位置。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係由一野生型B族DNA聚合酶修飾而成，該野生型B族DNA聚合酶包含選自於由SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17所組成群組之一胺基酸序列。
根據本發明之一實施例，該野生型B族DNA聚合酶係一嗜高溫菌( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶(Tgo)、一嗜高溫菌( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶(Kod1)、一嗜高溫菌屬(菌株9°N-7) DNA聚合酶(9°N)、一激烈火球菌( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶(Pfu)、一嗜高溫菌( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶(Vent)、一海沼甲烷球菌( Methanococcus maripaludis) DNA聚合酶(Mma)、一甲烷八疊球菌屬( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶(Mac)、一人類DNA聚合酶δ催化p125次單元(hPOLD)、一釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) DNA聚合酶δ催化次單元(ScePOLD)、一冰島熱棒菌( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶(Pis)、一硫磺礦硫化葉菌( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶(Sso)、一綠膿桿菌DNA聚合酶II (Pae)、一大腸桿菌DNA聚合酶II (Eco)、一噬菌體(腸桿菌噬菌體[ Escherichiaphage]) RB69 DNA聚合酶(RB69)、一噬菌體(腸桿菌噬菌體) T4 DNA聚合酶(T4)或一噬菌體(芽孢桿菌噬菌體[ Bacillusphage]) Phi29 DNA聚合酶(Phi29)。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體中：對應於SEQ ID NO：1位置354之胺基酸係除D以外的任何胺基酸；對應於SEQ ID NO：1位置355之胺基酸係除I以外的任何胺基酸；對應於SEQ ID NO：1位置356之胺基酸係除E以外的任何胺基酸；對應於SEQ ID NO：1位置715之胺基酸係除L以外的任何胺基酸；對應於SEQ ID NO：1位置716之胺基酸係除Y以外的任何胺基酸；以及對應於SEQ ID NO：1位置717之胺基酸係除P以外的任何胺基酸。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體中：對應於SEQ ID NO：1位置354之胺基酸係除D以外的任何胺基酸；對應於SEQ ID NO：1位置355之胺基酸係除I以外的任何胺基酸；對應於SEQ ID NO：1位置356之胺基酸係除E以外的任何胺基酸；對應於SEQ ID NO：1位置715之胺基酸係除L以外的任何胺基酸；對應於SEQ ID NO：1位置716之胺基酸係除Y以外的任何胺基酸；對應於SEQ ID NO：1位置717之胺基酸係除P以外的任何胺基酸；以及對應於SEQ ID NO：1位置854之胺基酸係除A以外的任意胺基酸。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：3之一嗜高溫菌(Thermococcus kodakarensis)DNA聚合酶(Kod1)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：3的D141係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：3的E143係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：3的L408係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：3的Y409係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：3的P410係由A、C、F、G、S或T所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：4之一嗜高溫菌屬(菌株9°N-7)DNA聚合酶(9°N)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：4的D141係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：4的E143係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：4的L408係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：4的Y409係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：4的P410係由A、C、F、G、S或T所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：5之一激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Pfu)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：5的D141係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：5的E143係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：5的L409係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：5的Y410係由A、C、 D、F、G、H或I所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：5的P411係由A、C、F、G、S或T所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：6之一嗜高溫菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(Vent)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：6的D141係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：6的E143係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：6的L411係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：6的Y412係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：6的P413係由A、C、F、G、S或T所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：8之一甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina acetivorans)DNA聚合酶(Mac)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：8的D198係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：8的E200係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：8的L485係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：8的Y486係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：8的P487係由A、C、F、G、S或T所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：11之一冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)DNA聚合酶(Pis)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：11的D171係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：11的E173係由A所取代； 對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：11的M426係由A、F、I、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：11的Y427係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：11的P428係由A、C、F、G、S或T所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：12之一硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)DNA聚合酶(Sso)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：12的D231係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：12的E233係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：12的L518係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：12的Y519係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：12的P520係由A、C、F、G、S或T所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：3之一嗜高溫菌(Thermococcus kodakarensis)DNA聚合酶(Kod1)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：3的D141係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：3的E143係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：3的L408係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：3的Y409係由A、C、D、F、G、H或I所取代；對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：3的P410係由A、C、F、G、S或T所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置854之SEQ ID NO：3的A485係由C、D、E、F或L所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：4之一嗜高溫菌屬(菌株9°N-7)DNA聚合酶(9°N)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：4的D141係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：4的E143係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：4的L408係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：4的Y409係由A、C、D、F、G、H或I所取代；對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：4的P410係由A、C、F、G、S或T所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置854之SEQ ID NO：4的A485係由C、D、E、F或L所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：5之一激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Pfu)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：5的D141係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：5的E143係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：5的L409係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：5的Y410係由A、C、D、F、G、H或I所取代；對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：5的P411係由A、C、F、G、S或T所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置854之SEQ ID NO：5的A486係由C、D、E、F或L所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：6之一嗜高溫菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(Vent)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：6的D141係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：6的E143係由A所取代； 對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：6的L411係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：6的Y412係由A、C、D、F、G、H或I所取代；對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：6的P413係由A、C、F、G、S或T所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置854之SEQ ID NO：6的A488係由C、D、E、F或L所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：8之一甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina acetivorans)DNA聚合酶(Mac)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：8的D198係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：8的E200係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：8的L485係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：8的Y486係由A、C、D、F、G、H或I所取代；對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：8的P487係由A、C、F、G、S或T所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置854之SEQ ID NO：8的A565係由C、D、E、F或L所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：11之一冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)DNA聚合酶(Pis)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：11的D171係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：11的E173係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：11的M426係由A、F、I、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：11的Y427係由A、C、D、F、G、H或I所取代；對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：11的 P428係由A、C、F、G、S或T所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置854之SEQ ID NO：11的A508係由C、D、E、F或L所取代。
根據本發明之一實施例，該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：12之一硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)DNA聚合酶(Sso)，且其中：對應於SEQ ID NO：1位置354之SEQ ID NO：12的D231係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356之SEQ ID NO：12的E233係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715之SEQ ID NO：12的L518係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之SEQ ID NO：12的Y519係由A、C、D、F、G、H或I所取代；對應於SEQ ID NO：1位置717之SEQ ID NO：12的P520係由A、C、F、G、S或T所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置854之SEQ ID NO：12的A601係由C、D、E、F或L所取代。
本發明另一方面提供一種用於合成式定序反應之試劑套組，包括：如上所述之B族DNA聚合酶變體；一引子；以及複數核苷酸類似物，其係用以於適當條件下摻入該引子，從而確定與摻入引子中的核苷酸類似物互補的核酸鹼基。
據此，本發明係有關於一種特定的B族DNA聚合酶變體，其得以提升核苷酸類似物的摻入效果，以利於多核苷酸的合成和核酸模板的定序。更具體而言，利用該B族DNA聚合酶變體搭配一正常核酸模板和可逆染料終止子核苷酸下，可以有效進行DNA合成式定序法，並準確地測定該核酸模板的序列。
為使本發明上述及其他目的、特徵、優點及實施例更加明顯易懂，因此針對圖式說明如下：
圖1係一通常之SBS法的示意圖。
圖2係本發明之各種野生型B族DNA聚合酶(PolB)及其共通序列的胺基酸序列比對示意圖。
圖3繪示本發明之帶有可移除3'保護基部分之染料標記核苷酸類似物的共同結構。
圖4繪示3'-O-N3-dNTP的結構。
圖5A至5D分別繪示N3-dATP-連結子-Atto532、N3-dCTP-連結子-Atto700、N3-dGTP-連結子-Cy5和N3-dTTP-連結子-ROX的結構。
圖6呈現實施例4所述反應之結果。
圖7呈現實施例6所述反應之結果。
圖8呈現實施例7所述反應之結果。
圖9呈現實施例8所述反應之結果。
圖10呈現實施例9所述反應之結果。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2021年9月29日申請之美國臨時專利申請案第US63/249,813號的優先權，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
序列表
本申請案係與電子格式之序列表一併申請。該序列表名稱為P222285TW-序列表.TXT，建立於2022年10月12日，且大小為252kb。該序列表中的相關資訊係以全文引用之方式併入本文中。
術語
本說明書中所使用的術語廣泛涵蓋於本發明的範圍內，且每個術語的具體背景與其在相關領域的一般含義相同。在本說明書中，說明本發明時所使用的具體術語，將於下文或本說明書的其他處說明，以幫助業界人士理解本發明的相關說明。在相同上下文中，同一術語具有相同的範圍和含義。此外，由於表達同一事物的方式不止一種；因此，本說明書中所討論的術語可以用替代術語和同義詞替換，而且在本說明書中無論是否指定或討論某一術語，皆不表示任何特殊含義。本說明書雖然提供一些術語的同義詞，但是使用一或多個同義詞並不表示排除其他同義詞的使用。
如本說明書中使用情況，除上下文另有明確說明外，「一」和「該」也可解釋為複數。再者，說明為便於閱讀可能附有標題和副標題，但這些標題並不影響本發明的範圍。
如本說明書中所使用的「胺基酸」係指可摻入肽、多肽或蛋白質中的任何單體單元。如本說明書中所使用的術語「胺基酸」包括以下二十種天然或基因編碼的α-胺基酸：丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天門冬醯胺酸(Asn或N)、天門冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(CyS或C)、麩醯胺酸(Gln或Q)、麩胺酸(Glu或E)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異白胺酸(Ile或I)、白胺酸(Leu或L)、離胺酸(Lys或K)、甲硫胺酸(Met或M)、苯丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲 胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)和纈胺酸(Val或V)。當未清楚定義「X」殘基情況下，這些胺基酸係應定義為「任一種胺基酸」。
如本說明書中所使用的術語「核酸」或「多核苷酸」係指可與核糖核酸(RNA)或去氧核糖核酸(DNA)聚合物或其類似物相符合的聚合物。這包括諸如RNA和DNA等的核苷酸聚合物，以及其合成形式、修飾(如化學或生物化學修飾體)形式，以及混合聚合物(如包括RNA和DNA次單元)。示例修飾包括甲基化、以類似物取代一或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾，例如產生不帶電荷鍵聯(如甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺甲酸酯等)、懸垂部分(如多肽)、插層(如，吖啶、補骨脂素等)、螯合劑、烷基化劑和已修飾鍵聯(如α變旋異構核酸等)。除此之外亦包括會模擬多核苷酸經由氫鍵和其他化學交互作用來鍵結指定序列之能力的合成分子。雖然核酸的合成形式可包含其他鍵聯(如Nielsen等人所述的肽核酸(Science 254：1497-1500,1991))，不過通常情況下的核苷酸單體均經由磷酸二酯鍵鍵聯。核酸可以是或包括如染色體或染色體片段、載體(如表現載體)、表現匣、裸DNA或RNA聚合物、聚合酶鏈鎖反應(PCR)的產物、寡核苷酸、探針和引子。核酸可以是單鏈、雙鏈或三鏈，不限於任何特定長度。除另有說明外，特定的核酸序列除了明確指定的序列外，還可任意包含或編碼互補序列。
如本說明書中所使用的術語「DNA合成(式)定序(SBS)」係指一種聚合酶依賴性的次世代定序(NGS)法。如圖1所示，SBS法主要包括以下流程：(i)摻入帶有標記(如螢光報導子)的核苷酸類似物；標記的核苷酸可任意包括一種可逆的終止特性，一旦將核苷酸添加到引子中，該特性就會終止更進一步的引子延伸；(ii)利用該標記(如螢光發射)來識別所摻入的核苷酸；(iii)切割該標記(如螢 光團和/或終止子)，再重新啟動聚合酶反應來逐步定序。一些SBS實施例包括檢測在核苷酸摻入延伸產物時所釋放的質子。例如根據所釋放質子檢測的定序法可使用Ion Torrent(位在美國康乃狄克州吉爾福德的生物科技子公司)販售的電子檢測器和相關技術，或美國專利申請案第2009/0026082 Al；2009/0127589 Al；2010/0137143 Al或2010/0282617 Al中所述的定序法和系統，上述每一個申請案的內容均納入本專利說明書以供參考。
如本說明書中所使用的術語「模板」是包含期望或未知目標核苷酸序列的多核苷酸或多核苷酸模擬物。在一些情況下，術語「目標序列」、「模板多核苷酸」、「目標核酸」、「目標多核苷酸」、「核酸模板」、「序列模板」及其變體可互換使用。具體而言，術語「模板」是指一股核酸，係用以供模板依賴性或模板導引性的核酸聚合酶進行複製，從核苷酸或核苷酸類似物合成一互補拷貝。在習知定義中，位在核酸雙股螺旋中的模板股係描繪形容成「底」股。同樣地，非模板股係經常描繪形容成「頂」股。「模板」股也可稱為「有義」或「正」股，非模板股則稱為「反義」或「負」股。
如本說明書中所使用的術語「引子」是指一段短的單股寡核苷酸、多核苷酸或已修飾核酸類似物，核酸聚合酶將引子當作延長核酸鏈的起始子。
如本說明書中所使用的術語「核苷酸摻入」、「類似物摻入」、「摻入核苷酸」和「摻入類似物」係熟悉該項技術領域人士已知，且係用於說明核酸合成的流程或反應。因此，如本說明書中所使用的術語「摻入」已知是靈活指在核酸引子的3'-羥基末端添加一或多個核苷酸或任何特定的核酸前驅物。舉例來說，如去氧鳥苷三磷酸(dGTP)的核苷三磷酸就是DNA聚合酶在DNA 合成時所需的一種受質或前驅物。一旦dGTP係摻入到延長DNA股中，就會變成新合成DNA的去氧鳥苷一磷酸(dGMP)部分。換言之，當dGTP核苷酸轉化成DNA的dGMP部分時，熟悉該項技術領域人士會形容dGTP係摻入DNA中。
如本說明書中所使用的術語「核苷酸類似物」係為熟悉該項技術領域人士所知，用來說明屬於典型核苷酸結構模擬物的化學已修飾核苷酸或人工核苷酸。這些核苷酸類似物可以作為核酸聚合酶合成核酸的受質。核苷酸類似物可具有核苷酸的一或多個已改變組成(如磷酸骨架、戊糖和核鹼基)，這些已改變組成不僅會改變核苷酸的結構和配置，並影響它們與其他核鹼基和核酸聚合酶的交互作用。舉例來說，核苷酸類似物如具有一已改變核鹼基時，可以讓DNA或RNA具有可供選擇的鹼基配對和鹼基堆疊的特性。再舉例來說，在鹼基處進行修飾的話，則可產生例如肌苷、甲基-5-去氧胞苷、去氧尿苷、二甲胺基-5-去氧尿苷、二胺基-2,6-嘌呤或溴-5-去氧尿苷及其他允許雜交的類似物等各種核苷。在其他示例實施態樣中，這些修飾可發生於核醣的部位(例如以類似物替代去氧核醣)和/或磷酸官能基層級(例如硼酸鹽、烷基膦酸鹽或硫代磷酸鹽衍生物)。核苷酸類似物單體的磷酸官能基係可選自於單磷酸、二磷酸、三磷酸、四磷酸、五磷酸和六磷酸。其他核苷酸類似物案例還包括具有可移除保護基部分的核苷酸。可移除保護基部分的案例包括但不限於3'-O-保護基部分、鹼基保護基部分及其組合。3'-O-保護基部分的案例包括但不限於O-N3、O-疊氮甲基、O-胺基、O-烯丙基、O-苯氧基乙醯基、O-甲氧基乙醯基、O-乙醯基、O-(p-甲苯)磺酸鹽、O-磷酸鹽、O-硝酸鹽、O-[4-甲氧基]-四氫噻喃基、O-四氫噻喃基、O-[5-甲基]-四氫呋喃基、O-[2-甲基，4-甲氧基]-四氫吡喃基、O-[5-甲基]-四氫吡喃基、O-四氫噻吩基、O-2-硝基芐基、O-甲基和O-醯基。鹼基保護基部分的案例可以 是可逆染料終止子。可逆染料終止子的案例包括但不限於：Illumina MiSeq的可逆染料終止子、Illumina HiSeq的可逆染料終止子、Illumina Genome Analyzer IIX的可逆染料終止子、Helicos Biosciences Heliscope的可逆染料終止子以及LaserGen Lightning Terminator的可逆染料終止子。
如本說明書中所使用的「B族DNA聚合酶(PolB)」是指所有生命域和眾多DNA病毒中最常見的模板依賴性核酸聚合酶或複製酶。天然PolB與大多數核酸聚合酶一樣，其需要雙股引子模板DNA且引子末端處帶有游離3'-羥基(3'-OH)官能基、所有四種核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)及催化用二價陽離子(Mg2+或Mn2+等)，前述陽離子用於催化核苷酸轉移酶反應來將核苷酸添加到引子的3'-OH末端。PolB酶，如細菌Pol II和古菌B家族DNA聚合酶，是複製型和修復型聚合酶，它們本質上包含一催化聚合酶域及3'→5'核酸外切域或校對域，用於在核酸複製過程中，從不斷增長的引子股中移除摻入錯誤的核苷酸。術語「3'→5'核酸外切域」係指聚合酶的胺基酸序列區域，其區域可以從引子或多核苷酸鏈的3'末端發揮核酸降解活性。同等的術語「催化聚合酶域」也是指聚合酶的胺基酸序列區域，其區域可發揮催化DNA/RNA聚合酶活性，而將核苷酸添加到引子或多核苷酸鏈的3'-末端。
目前已知的PolB催化聚合酶域皆類似於人類右手的形狀，其中關鍵功能區域分別界定為手指、手掌和拇指子域。其中最保守的手掌子域包含催化用的必需殘基；在源自不同生命和DNA病毒界的各種B族DNA聚合酶之間的蛋白質序列比對中顯示，PolB聚合酶由於具有基本外切核酸酶和聚合酶功能，因此一般帶有六個半保守或保守的模體(I-VI)。前三個序列模體(Exo I、Exo II、 Exo III)位於3'→5'核酸外切域，而另三個模體(分別稱為A、B及C模體)則位於聚合酶域(1999年Hopfner等人發表於Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96,3600-3605)。
在本發明的DNA聚合酶上下文中所使用的術語「突變體」係指一種通常為重組的多肽，其包含的一或多個胺基酸取代相對於對應的功能性DNA聚合酶。
在DNA聚合酶變體上下文中所使用的「對應於另一序列」(如區域、片段、核苷酸或胺基酸位置等)之基準係建立於核苷酸或胺基酸位置編號的編號慣例，然後按照最大化序列一致性百分比來進行序列比對。胺基酸「對應於特定序列的位置X」，是指針對多肽中的胺基酸與特定序列的等效胺基酸比對後結果。通常如本說明書所述，可使用BLAST等比對演算法來確定胺基酸對應於聚合酶的位置。因為並非所有既定「對應區域」內的位置都必須一樣，故對應區域內的不匹配位置也可視為「對應位置」；故，如本說明書中所提及「與特定DNA聚合酶的胺基酸位置X對應的胺基酸位置」係指根據比對而在其他DNA聚合酶以及結構同源物和家族中的等效位置。
如本說明書中所使用的術語「半保守」係指在不同來源之不同PolB的同源位置上，其聚合酶片段具有特性相似的胺基酸殘基或相同的胺基酸殘基。術語「保守」則是指在不同來源之不同PolB的同源位置上，其聚合酶片段具有相同的胺基酸殘基。
如本說明書中所使用的術語「SEQ ID NO：1共通序列」係指包含跨物種B族DNA聚合酶之保守胺基酸的參考序列。SEQ ID NO：1共通序列是一組虛擬序列，其產生方式是通過比對以下16種野生型B族DNA聚合酶獲得保守胺基酸：嗜高溫菌(Thermococcus gorgonarius)DNA聚合酶(Tgo)、嗜高溫菌 (Thermococcus kodakarensis)DNA聚合酶(Kod1)、嗜高溫菌屬(Thermococcus sp.)(菌株9°N-7)DNA聚合酶(9°N)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Pfu)、嗜高溫菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(Vent)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)DNA聚合酶(Mma)、甲烷八叠球菌屬(Methanosarcina acetivorans)DNA聚合酶(Mac)、人類DNA聚合酶δ催化p125次單元(hPOLD)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DNA聚合酶δ催化次單元(ScePOLD)、冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)DNA聚合酶(Pis)、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)DNA聚合酶(Sso)、綠膿桿菌DNA聚合酶II(Pae)、大腸桿菌DNA聚合酶II(Eco)、噬菌體(腸桿菌噬菌體[Escherichia phage])RB69 DNA聚合酶(RB69)、噬菌體(腸桿菌噬菌體)T4 DNA聚合酶(T4)和噬菌體(芽孢桿菌噬菌體[Bacillus phage])Phi29 DNA聚合酶(Phi29)。Exo I模體、Exo II模體、Exo III模體、A模體、B模體及C模體的位置係由本發明人使用本發明SEQ ID NO：1共通序列所定義；因此，應注意本發明中所定義的模體位置並不完全等同於先前技術中所述位置。
目的
一般而言，SBS法中納入考慮並最終採用的DNA聚合酶應具有以下特性：(i)該聚合酶必須是DNA依賴性DNA聚合酶；換言之，該聚合酶需要具備一複製用的DNA模板。(ii)該聚合酶應迅速摻入核苷酸；DNA聚合酶的核苷酸摻入速率較高時，則可更有效催化DNA合成。(iii)該聚合酶必須保有高複製正確性，盡量減少系統誤差；換言之，該聚合酶應能夠準確讀取DNA模板序列資訊，然後忠實依照DNA模板摻入正確、匹配的核苷酸。(iv)該聚合酶應具有長的、內生性、且可複製的連續合成能力(processivity)。如本說明書中所用，DNA聚合酶 連續合成能力係以在使用引子/模板(P/T)DNA形成複合物期間所摻入的dNTP或核苷酸類似物數量定義。(v)該聚合酶應以單體型態發揮作用，使其更容易被生產並進行再修飾(Chen,C.Y.2014年發表的DNA聚合酶驅動DNA合成定序技術：過去與現在一文，刊載於Front.Microbiol.5：305.doi：10.3389/fmicb.2014.00305)。
因此，本發明其中一目的旨在提供基於上述原理的B族DNA聚合酶(PolB)變體，使該PolB變體在合成多核苷酸並針對相關核酸模板定序時可提高核苷酸類似物的摻入效率。這些PolB變體可以在一核酸模板和核苷酸類似物存在下，令上述的酶催化核酸合成和定序可以有效進行。更具體言之，這些PolB變體在搭配一正常核酸模板及可逆染料終止子核苷酸下，得有效進行上述酶催化核酸合成和定序，以精準確認該相關核酸模板的序列。舉例來說，PolB變體可依賴一正常未修飾的核酸模板，將已修飾核苷酸類似物導引合成並摻入到引子的3'-末端；而用以摻入之核苷酸帶有可區別的螢光報導子，可用以確定該核酸模板的DNA序列資訊。
本發明人發現PolB變體具有廣泛的受質特異性，這點意味著經修改之PolB變體不僅可利用天然存在的核苷酸，還可利用各種已修飾核苷酸，以進行模板依賴性核酸合成。因此，在確定核酸序列的DNA合成定序法中，這些PolB變體可提高核苷酸摻入效率。
B族DNA聚合酶變體
因此，本發明所提供一聚合酶變體，當係以SEQ ID NO：1共通序列的胺基酸序列為基礎描述該聚合酶變體。比較SEQ ID NO：1共通序列可知，該聚合酶變體在一或多個殘基處出現取代突變現象，且取代突變可發生在與該序列相同的位置或功能等效的位置。本案所屬技術領域具有通常知識者很容易能理解本說明書所述之聚合酶變體並不是天然存在的。因此，本說明書所述的 該聚合酶變體係以SEQ ID NO：1共通序列為基礎，進而再包括一或多個殘基處的取代突變。在一實施例中，取代突變是發生在與SEQ ID NO：1共通序列的胺基酸功能等效的位置。「功能等效」是指該聚合酶變體在SEQ ID NO：1共通序列的胺基酸位置發生胺基酸取代，而前述胺基酸取代在共通序列和聚合酶變體兩者上均具有相同功能作用。
通常而言，兩個或更多不同聚合酶中的功能等效取代突變係發生在該些聚合酶胺基酸序列中的同源胺基酸位置。因此，無論是否知悉一個既定突變胺基酸的特定功能，只要該突變屬於「位置等效」或「同源」時，即可歸類為「功能等效」。在序列比對和/或分子建模的基礎上，可識別兩個或更多不同聚合酶的胺基酸序列中功能等效和位置等效的胺基酸殘基位置。例如，圖2所呈現的就是利用16個野生型B族DNA聚合酶的胺基酸序列比對來識別位置等效和/或功能等效的殘基。因此，Tgo、Kod1、9°N、Pfu和Vent DNA聚合酶的示例殘基141和Mac DNA聚合酶的示例殘基198即屬於功能上和位置上等效。同理，Tgo、Kod1、9°N、Pfu和Vent DNA聚合酶的示例殘基143和Mac聚合酶的典型殘基200即屬於功能上和位置上等效。本案所屬技術領域具有通常知識者亦能識別其他DNA聚合酶中功能等效的殘基。
根據本發明的一些實施例得知，本發明之B族DNA聚合酶變體包括：分別對應於SEQ ID NO：1共通序列的位置349至364、位置450至476、位置590至608、位置706至730、位置843至855以及位置940至956的Exo I模體、Exo II模體、Exo III模體、A模體、B模體和C模體；位於選自由Exo I模體、Exo II模體和Exo III模體所組成群組之一模體內位置的至少一胺基酸取代(一或多個胺基酸取代，或胺基酸取代之組合)；以及位於選自由A模體、B 模體和C模體所組成群組之一模體內位置的至少一胺基酸取代(一或多個胺基酸取代，或胺基酸取代之組合)。
根據本發明的一些實施例，該B族DNA聚合酶變體係由野生型B族DNA聚合酶修飾而成，其胺基酸序列係選自於由SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17所組成的群組，分別源自野生型B家族DNA聚合酶包括嗜高溫菌(Thermococcus gorgonarius)DNA聚合酶(Thermococcus sp.)(Tgo)、嗜高溫菌(Thermococcus kodakarensis)DNA聚合酶(Kod1)、嗜高溫菌屬(菌株9°N-7)DNA聚合酶(9°N)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Pfu)、嗜高溫菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(Vent)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)DNA聚合酶(Mma)、甲烷八叠球菌屬(Methanosarcina acetivorans)DNA聚合酶(Mac)、人類DNA聚合酶δ催化p125次單元(hPOLD)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DNA聚合酶δ催化次單元(ScePOLD)、冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)DNA聚合酶(Pis)、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)DNA聚合酶(Sso)、綠膿桿菌DNA聚合酶II(Pae)、大腸桿菌DNA聚合酶II(Eco)、噬菌體(腸桿菌噬菌體)RB69 DNA聚合酶(RB69)、噬菌體(腸桿菌噬菌體)T4 DNA聚合酶(T4)或噬菌體(芽孢桿菌噬菌體)Phi29 DNA聚合酶(Phi29)。
根據本發明的一些實施例，對應於SEQ ID NO：1位置354的胺基酸是除D以外的任何胺基酸；舉例來說，該胺基酸係可由N、Q、S、T、Y、A、C、G、I、L、M、F、P、W、V、R、H、K或E所取代。對應於SEQ ID NO：1位置355的胺基酸是除I以外的任何胺基酸；舉例來說，該胺基酸係可由N、Q、S、T、Y、A、C、G、L、M、F、P、W、R、H、K、D或E所取代。對應 於SEQ ID NO：1位置356的胺基酸是除E以外的任何胺基酸；舉例來說，該胺基酸係可由N、Q、S、T、Y、A、C、G、I、L、M、F、P、W、V、R、H、K或D所取代。對應於SEQ ID NO：1位置715的胺基酸是除L或M以外的任何胺基酸；舉例來說，該胺基酸係可由N、Q、S、T、Y、A、C、G、I、F、P、W、V、R、H、K、D或E所取代。對應於SEQ ID NO：1位置716的胺基酸是除Y以外的任何胺基酸；例如，舉例來說，該胺基酸係可由N、Q、S、T、A、C、G、I、L、M、F、P、W、V、R、H、K、D或E所取代。對應於SEQ ID NO：1位置717的胺基酸是除P以外的任何胺基酸；舉例來說，該胺基酸係可由N、Q、S、T、Y、A、C、G、I、L、M、F、W、V、R、H、K、D或E所取代。在本發明一較佳實施例中，對應於SEQ ID NO：1位置854的胺基酸是除A以外的任意胺基酸；舉例來說，該胺基酸係可由N、Q、S、T、Y、C、G、I、L、M、F、P、W、V、R、H、K、D或E所取代。
根據本發明的一些實施例，B族DNA聚合酶變體源自具有SEQ ID NO：3野生型胺基酸序列的嗜高溫菌(Thermococcus kodakarensis)DNA聚合酶(Kod1)；其中：對應於SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：3 E141係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：3 E143係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：3 L408係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代，較佳情況為A、Q或Y，更佳情況為Y；對應於SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：3 Y409係由A、C、D、F、G、H或I所取代，較佳情況為A；對應於SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：3 P410係由A、C、F、G、S或T所取代，較佳情況為F或G，更佳情況為G。在特定實施例中， 對應於SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：3 A485係由C、D、E、F或L所取代，較佳情況為E或L，更佳情況為L。
根據本發明的一些實施例，B族DNA聚合酶變體源自具有SEQ ID NO：4野生型胺基酸序列的嗜高溫菌屬(Thermococcus sp.)(菌株9°N-7)DNA聚合酶(9°N)；其中：對應於SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：4 D141係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：4 E143係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：4 L408係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代，較佳情況為A、Q或Y，更佳情況為Y；對應於SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：4 Y409係由A、C、D、F、G、H或I所取代，較佳情況為A；對應於SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：4 P410係由A、C、F、G或S或T所取代，較佳情況為F或G，更佳情況為G。在特定實施例中，對應於SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：4 A485係由C、D、E、F或L所取代，較佳情況為E或L，更佳情況為L。
根據本發明的一些實施例，B族DNA聚合酶變體源自具有SEQ ID NO：5野生型胺基酸序列的激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶(Pfu)；其中：對應於SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：5 D141係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：5 E143係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：5 L409係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代，較佳情況為A、Q或Y，更佳情況為Y；對應於SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：5 Y410係由A、C、D、F、G、H或I所取代，較佳情況為A；對應於SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：5 P411係由A、C、F、G、S或T所取代，較佳情況為F或G，更佳情況為G。在特定實施例中，對應於 SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：5 A486係由C、D、E、F或L所取代，較佳情況為E或L，更佳情況為L。
根據本發明的一些實施例，B族DNA聚合酶變體源自具有SEQ ID NO：6野生型胺基酸序列的嗜高溫菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶(Vent)；其中：對應於SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：6 D141係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：6 E143係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：6 L411係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代，較佳情況為A、Q或Y，更佳情況為Y；對應於SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：6 Y412係由A、C、D、F、G、H或I所取代，較佳情況為A；對應於SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：6 P413係由A、C、F、G、S或T所取代，較佳情況為F或G，更佳情況為G。在特定實施例中，對應於SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：6 A488係由C、D、E、F或L所取代，較佳情況為E或L，更佳情況為L。
根據本發明的一些實施例，B族DNA聚合酶變體源自具有SEQ ID NO：8野生型胺基酸序列的甲烷八叠球菌屬(Methanosarcina acetivorans)DNA聚合酶(Mac)；其中：對應於SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：8 D198係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：8 E200係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：8 L485係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代，較佳情況為A、Q或Y，更佳情況為Y；對應於SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：8 Y486係由A、C、D、F、G、H或I所取代，較佳情況為A；對應於SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：8 P487係由A、C、F、G、S或T所取代，較佳情況為F或G，更佳情況為G。在特定實施例中， 對應於SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：8 A565係由C、D、E、F或L所取代，較佳情況為E或L，更佳情況為L。
根據本發明的一些實施例，B族DNA聚合酶變體源自具有SEQ ID NO：11野生型胺基酸序列的冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)DNA聚合酶(Pis)；其中：對應於SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：11 D171係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：11 E173係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：11 M426係由A、F、I、Q、S、H或Y所取代，較佳情況為A、Q或Y，更佳情況為Y；對應於SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：11 Y427係由A、C、D、F、G、H或I所取代，較佳情況為A；對應於SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：11 P428係由A、C、F、G、S或T所取代，較佳情況為F或G，更佳情況為G。在特定實施例中，對應於SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：11 A508係由C、D、E、F或L所取代，較佳情況為E或L，更佳情況為L。
根據本發明的一些實施例，B族DNA聚合酶變體源自具有SEQ ID NO：12野生型胺基酸序列的硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)DNA聚合酶(Sso)；其中：對應於SEQ ID NO：1位置354的SEQ ID NO：12 D231係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置356的SEQ ID NO：12 E233係由A所取代；對應於SEQ ID NO：1位置715的SEQ ID NO：12 L518係由A、F、I、M、Q、S、H或Y所取代，較佳情況為A、Q或Y，更佳情況為Y；對應於SEQ ID NO：1位置716的SEQ ID NO：12 Y519係由A、C、D、F、G、H或I所取代，較佳情況為A；對應於SEQ ID NO：1位置717的SEQ ID NO：12 P520係由A、C、F、G、S或T所取代，較佳情況為F或G，更佳情況為G。在特定實施例中， 對應於SEQ ID NO：1位置854的SEQ ID NO：12 A601係由C、D、E、F或L所取代，較佳情況為E或L，更佳情況為L。
誘發聚合酶突變
在本說明書中可任意使用各種類型的誘發突變之技術，例如利用修改聚合酶來產生本發明的變體，或使用隨機或半隨機突變法。一般可取得的誘發突變程序均係可用於製備聚合酶變體，其包括可任意就一或多種關注活性來選擇突變核酸和多肽。可使用的程序包括但不限於：位點導引位點誘變、隨機位點誘發突變、體外或體內同源重組(活體外DNA分子演化技術和組合重疊PCR)、使用含有尿嘧啶的模板進行誘變、寡核苷酸導引誘變、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、使用有缺口的雙股DNA誘變、位點錯配修復、使用修復功能缺陷的宿主菌株誘變、限制性選擇和限制性純化、缺失誘變、利用全基因合成誘變、簡併式PCR、雙股斷裂修復，以及本案所屬技術領域具有通常知識者所知的眾多其他方法。
編碼DNA聚合酶變體的核酸
本發明之一些實施例進一步揭露編碼DNA聚合酶變體的核酸。一特定胺基酸係可以由多個密碼子編碼，特定轉譯系統(如原核或真核細胞)經常表現出密碼子偏差，也就是不同生物在為相同胺基酸編碼的數個同義密碼子中通常會偏好其中之一。因此，本說明書提出的核酸為任意「已優化密碼子」，這意指該核酸合成時所包括的密碼子是用來表達聚合酶的特定轉譯系統所偏愛的密碼子。舉例而言，欲在細菌(甚至特定細菌菌株)中表達聚合酶時，合成核酸時可包括該細菌細胞基因組中最常見的密碼子，以有效表達聚合酶。當希望在真核細胞中表達聚合酶時也可採用類似策略，例如該核酸可包括該真核細胞所偏愛的密碼子。
本說明書所述的核酸分子亦可有利地包括在一合適表達載體中，以表達在合適宿主中由此編碼的聚合酶蛋白。將克隆DNA摻入合適的表達載體，以進行該細胞後續轉化，還有已轉化細胞的後續選擇，這一整套程序乃是熟悉該項技術領域人士眾所周知的。這種表達載體包括一載體，其核酸根據本說明書所述實施例可操作連接到如啟動子區域的調控序列，藉此能夠影響該DNA片段的表達。這樣的載體係可轉化到合適的宿主細胞中，以提供根據本說明書所述實施例的B族DNA聚合酶變體表達。
核酸分子可編碼成熟蛋白質或具有前序列(prosequence)的蛋白質，後者是先編碼前蛋白質上的前導序列、然後再由宿主細胞切割形成成熟蛋白質。該載體可以是質體、病毒或噬菌體等載體，其具有複製起點和表達該核苷酸的任一啟動子以及該啟動子的任一調節物。該載體可包含一或多個選擇性標記，例如抗生素抗性基因。 包含 B 族 DNA 聚合酶變體的組合物
本發明一方面亦提供包含本說明書所述之B族DNA聚合酶變體的組合物。該組合物除B族DNA聚合酶變體以外，還可再包括其他組成。舉例來說，該組合物可包括緩衝液、核苷酸溶液或其組合。核苷酸溶液可包括已標記、合成、已修飾或其組合的核苷酸。根據本發明之一實施例，本發明之組合物包括目標核酸，例如目標核酸之文庫(library)。 執行 SBS 反應用的試劑 套 組
本發明一方面更提供一種用於合成式定序反應用的試劑套組，其包括：至少一本發明之B族DNA聚合酶變體、引子、多核苷酸模板和適於摻入該引子的核苷酸類似物，藉此確認與引子末端的摻入核苷酸互補的模板核鹼基。該試劑套組也可任意包括其他試劑，諸如該B家族DNA聚合酶變體和該核苷酸溶液所需的緩衝液和溶液等等。通常該試劑套組還包括已組裝或已包裝之組成的使用說明書。
根據本發明之一些實施例，核苷酸溶液包括已標記核苷酸。根據本發明之特定實施例，該核苷酸係為合成核苷酸。根據本發明之特定實施例，該核苷酸是化學修飾核苷酸。在特定實施例中，已修飾核苷酸的醣結構3'羥基處具有一經修改的化學官能基，使得該取代基的尺寸大於天然存在的3'羥基。在特定實施例中，該已修飾核苷酸包括已修飾核苷酸或核苷分子，其包括嘌呤或嘧啶鹼基和核糖或去氧核糖部分，其中該部分具有共價連接的可移除3'-保護基。在特定實施例中，該已修飾核苷酸係經螢光標記處理，以便於直接偵測。在特定實施例中，該已修飾核苷酸包括核苷酸或核苷，其鹼基通過可切割連結子而連接至可偵測標記上。在特定實施例中，該可偵測標記包括螢光標記。 使用方法
本發明進一步提供一種將核苷酸類似物摻入DNA的方法，其包括容許以下組成的交互作用：(i)上述實施例提及的B族DNA聚合酶變體，(ii)DNA模板；(iii)核苷酸溶液。根據本發明之特定實施例，該DNA模板包含位在玻璃或矽晶片上的一簇狀陣列。因此，可執行多重並聯進行的核酸合成及定序，以確定各種核酸的序列。這種PolB變體驅動並採陣列基礎的合成式定序法可提高DNA定序的總處理量，並壓低DNA定序的總體成本。
根據本發明之一些實施例，本說明書所述的該PolB變體可用於將共價連接酶、抗體、化學官能基(諸如核苷酸之鹼基、磷酸鹽部分或戊醣上的生物素、去硫生物素或螢光團)之核苷酸共軛物或類似物，以模板依賴性合成方式分別摻入引子或核酸起始子的3'-末端。
在核酸合成過程中利用PolB變體將這些核苷酸共軛物或類似物摻入核酸時，同時會以序列依賴性方式在新合成核酸上新增期望的組成，例如酶、抗體或化學官能基。用於標記或產生核酸探針和共軛物的常用組成為該領域熟知者，其包括但不限於核苷酸類似物、已修飾連結子(諸如生物素、硫醇、疊氮基或胺基)、螢光團、酶和抗體。
另一方面，根據本發明之實施例，合成核苷酸之鹼基、磷酸鹽部分或戊醣可藉由已修飾連結子，與酶、抗體、化學官能基或螢光團進行共價或非共價連接，即可完成核酸的後合成修飾；據此期望的組成便可與特定鹼基共價或非共價結合，並附加至新合成的多核苷酸3'-末端。該鹼基特定共軛物係可作為報導子以確定核酸模板的序列。
此外在一些實施例中，本說明書所述之PolB變體可在合成式定序法中，用以摻入3'-修飾可逆染料終止子(RDT)核苷酸，其中該核苷酸醣部分的3'-羥基官能基(3'-OH)上帶有可切割的化學取代基，且該核苷酸鹼基帶有可移除且具備不同螢光光譜特性的螢光團分子。由PolB變體進行的模板導引合成和個別RDT-核苷酸摻入可用於分別指示A、T、C或G鹼基的螢光讀數，以確定相關核酸模板的序列。 實施例
在本節中，將透過以下實施例來詳細說明本發明的內容。這些案例僅作為說明之用，而本案所屬技術領域具有通常知識者得以容易知悉各種修改例和變化例。因此，下面將詳細說明本發明的各種實施例，然而本發明並不限於本說明書中列出的各種實施例。 實施例 1
各種B族DNA聚合酶的蛋白質序列比對，以及共通序列和變體的確認
圖2顯示16種野生型B族DNA聚合酶(PolB)的胺基酸序列比對結果，經比對之共通序列的結果列在該圖底部(SEQ ID NO：1)。進行比對的16種野生型B族DNA聚合酶為嗜高溫菌( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶(Tgo，SEQ ID NO：2)、嗜高溫菌( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶(Kod1，SEQ ID NO：3)、嗜高溫菌屬( Thermococcus sp.)(菌株9°N-7) DNA聚合酶(9°N，SEQ ID NO：4)、激烈火球菌( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶(Pfu，SEQ ID NO：5)、嗜高溫菌( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶(Vent，SEQ ID NO：6)、海沼甲烷球菌( Methanococcus maripaludis) DNA聚合酶(Mma，SEQ ID NO：7)、甲烷八叠球菌屬( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶(Mac，SEQ ID NO：8)、人類DNA聚合酶δ催化p125次單元(hPOLD，SEQ ID NO：9)、釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) DNA聚合酶δ催化次單元(ScePOLD，SEQ ID NO：10)、冰島熱棒菌( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶(Pis，SEQ ID NO：11)、硫磺礦硫化葉菌( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶(Sso，SEQ ID NO：12)、綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)DNA聚合酶II (Pae，SEQ ID NO：13)、大腸桿菌( Escherichia. Coli)DNA聚合酶II (Eco，SEQ ID NO：14)、噬菌體RB69 DNA聚合酶(RB69，SEQ ID NO：15)、噬菌體T4 DNA聚合酶(T4，SEQ ID NO：16)和噬菌體Phi29 DNA聚合酶(Phi29，SEQ ID NO：17)。
如圖2(包含圖2-1至2-34)所示，野生型PolB的有不同區域為高度保守，而其他區域則變異較大。除了本說明書具體確定和討論的突變以外，熟悉本技術領域者將可立即辨識並理解，在不改變或基本上不改變該突變酶的聚合酶活性下，亦可以在野生型PolB的變異區域內進行突變。同樣地，在不改變或基本上不改變該突變酶的聚合酶活性下，也可在PolB保守殘基/位置進行保守突變。與其他功能相關的酶或同源物進行比較結構分析為基礎的酶工程，是分子生物學領域中常見且有用的技術，熟悉該項技術人士能夠藉此合理預測一既定突變對酶催化活性的影響。本案所屬技術領域具有通常知識者使用胺基酸的結構數據和已知物理性質，即可在不改變或基本上不改變酶的基本內在特徵下，針對如本發明所包含的DNA聚合酶等進行酶突變作用。
此外，分別對應於SEQ ID NO：1共通序列之位置349至364、位置450至476、位置590至608、位置706至730、位置843至855以及位置940至956的Exo I模體、Exo II模體、Exo III模體、A模體、B模體和C模體係如圖2所示的標記。更具體來說，本發明中的聚合酶變體係在對應於該些模體內的一或多個殘基處發生取代突變。 實施例 2
創造B族DNA聚合酶變體
根據本說明書所揭露之選擇性PolB保守和半保守區域中保守/共通胺基酸的特性，採用基因合成法和誘變技術創造示例的PolB變體。舉例來說，採用本案所屬技術領域具有通常知識者熟知的位點導引誘變法，分別改變示例野生型PolB之保守Exo I模體、Exo II模體、Exo III模體、A模體、B模體和C模體區域中的胺基酸殘基。
在一些實施例中，獲得DNA聚合酶變體的程序一般分成三個步驟：第1步：DNA聚合酶及其外切核酸酶缺陷(Exo-)突變體的基因合成，第2步：在期望區域內構建DNA聚合酶變體，第3步：DNA聚合酶及其變體的表達和純化。該程序中使用的技術係本案所屬技術領域具有通常知識者所周知，以下將更詳細說明。
在第1步中，野生型無內含子DNA聚合酶編碼用的密碼子優化基因片段係由基龍米克斯生物科技股份有限公司(台灣新北市)所合成。3'到5'外切核酸酶缺陷DNA聚合酶(稱為Exo-)亦由同一供應商所提供。本說明書中所使用的「Exo-」係指該野生型PolB發生組合突變，分別在對應於SEQ ID NO：1的D354位置由丙胺酸殘基取代(D354A)，並在對應於SEQ ID NO：1的E356位置亦由丙胺酸殘基取代(E356A)。
在第2步中，將野生型以及3'至5'外切核酸酶缺陷DNA聚合酶基因透過NdeI和NotI位點分別置入pET28b載體中，並以DNA定序確認重組質體的序列。執行位點導引誘變以利於PolB蛋白質架構上的期望模體區域產生聚合酶變體。簡言之，使用New England Biolabs (美國麻薩諸塞州Ipswich)販售的Q5位點導引誘變試劑套組，搭配重組質體來進行位點導引誘變PCR，以導入胺基酸取代。首先採用1%瓊脂糖凝膠分析產物來確認擴增子尺寸，然後在37°C下使用DpnI來處理剩餘的PCR反應混合物一小時。在70°C下再讓該混合物培養10分鐘，使DpnI功能滅活。接續利用Qiagen公司的QIAquick PCR純化試劑套組(美國麻薩諸塞州Whatman)純化DpnI處理後的PCR反應混合物，並使用T4 PNK和T4 DNA連接酶混合物來處理純化後的DNA片段，再把重新環化的PCR擴增DNA轉換回大腸桿菌細胞內。稍後使用Qiagen公司的質體迷你試劑套組(美國麻薩諸塞州Whatman)將質體DNA從大腸桿菌細胞中萃取出來。接著DNA定序來確認期望模體區域內的聚合酶變體誘變序列。
在第3步中，將包含帶著特定聚合酶變體基因之質體DNA的大腸桿菌Acella細胞，置放在37°C下內含0.5%葡萄糖和50 μg/ml羧芐青黴素的2公升LB培養基中生長。當密度600奈米(OD 600nm)下的細胞密度吸收值約達0.6~0.8左右時，加入1mM的異丙基-β-D-1-硫代半乳哌喃糖苷(IPTG)來誘導蛋白質表達。在37°C下讓細胞再生長4小時，然後在4°C下以7,000×g離心10分鐘來收集產物。使用含有1mM鹽酸苯甲脒的緩衝液A [50 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 7.5)、300 mM氯化鈉、0.5 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1 mM二硫蘇糖醇(DTT)、5%(體積百分比)甘油]，讓細胞沉澱物進行再懸浮處理。將細胞溶液與50毫克溶菌酶在冰上培養1小時，再進行超音波處理，即可完成細胞裂解。在4°C下以18,000 x g離心25分鐘，即可取得澄清的細胞裂解物。在70°C下讓澄清粗細胞萃取物培養30分鐘，然後在4°C下冷卻。在4°C下以18,000 x g離心25分鐘，即可取得更澄清的熱處理細胞萃取物。離心後，以不含氯化鈉的緩衝液A來稀釋上方澄清液，然後再上樣到ÄKTA純化層析系統(Cytiva Life Sciences，美國麻薩諸塞州Marlborough)先在緩衝液A中預平衡的HiTrap Heparin管柱(Cytiva Life Sciences，美國麻薩諸塞州Marlborough)。以緩衝液B [50 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.0)、1 M氯化鈉、0.5 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1 mM二硫蘇糖醇(DTT)、5%(體積百分比)甘油]，搭配線性100 mM至1 M氯化鈉梯度方式來沖提該蛋白質。接著使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來分析管柱餾分。在4°C下讓含有期望蛋白質的餾分在儲存緩衝液[50 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 7.5)、250 mM氯化鈉、0.5 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1 mM二硫蘇糖醇(DTT)、5%(體積百分比)甘油]內進行隔夜的匯合透析。使用Amicon過濾器單元(分子量截斷值為50,000)來濃縮含有目標蛋白質的透析蛋白質餾分匯合液。將濃縮蛋白質匯合液等分並儲存在-20°C下。依照如上所述相同程序來純化每種突變聚合酶變體。接著使用牛血清白蛋白當作標準液，透過使用Bio-Rad蛋白質定量試劑套組(美國加州Hercules)進行Bradford反應(1976年Bradford提出)，以確定最後的蛋白質濃度。 實施例 3
模板依賴性DNA合成測定
本說明書所提供的PolB變體適用於DNA合成定序(SBS)測試上。為進一步評估PolB變體的活性(摻入核苷酸類似物)，故本說明書中所使用的是已修飾核苷酸和雙股引子/模板(P/T)-DNA。
在實施例3中，該已修飾核苷酸是具有一可移除保護基部分的核苷酸類似物(圖3)；更具體而言，該可移除保護基部分是3'-O-疊氮甲基。更具體而言，該已修飾核苷酸是包括3'-O-疊氮甲基-dATP、3'-O-疊氮甲基-dCTP、3'-O-疊氮甲基-dGTP、3'-O-疊氮甲基-dTTP的3'-O-疊氮甲基-dNTP (如圖4所示)。再者，該已修飾核苷酸係與各種形式的染料連接，諸如N 3-dATP-連結子-Atto532(圖5A)、N 3-dCTP-連結子-Atto700(圖5B)、N 3-dGTP-連結子-Cy5(圖5C)和N 3-dTTP-連結子-ROX(圖5D)。
在實施例3中，以下合成寡核苷酸係作為一雙股引子和模板(P/T)-DNA使用，以確定PolB變體的模板依賴性DNA合成活性：
Cy5-38-單體單元引子
5'-GCTTGCACAAGTTCGTTCAATGATACGGCGACCACCGA-3' (SEQ ID NO：18)；
該寡核苷酸係在5'端以螢光花氰5 (Cy5)染料標記。對應於45-單體單元模板：
5'-CGTTCCNTCGGTGGTCGCCGTATCATTGAACGAACTTGTGCAAGC-3' (SEQ ID NO：19)；其中字母「N」代表A、T、C或G。
FAM-38-單體單元引子：
5'-GCTTGCACAAGTTCGTTCAATGATACGGCGACCACCGA-3' (SEQ ID NO：20)
FAM-19-單體單元引子：
5'-GCTTGCACAGGGCCTCGAC-3' (SEQ ID NO：21) 實施例 4
外切核酸酶缺陷PolB變體在摻入該3'-修飾核苷酸上的活性
在本實施例中，將外切核酸酶缺陷PolB變體(Kod1、Pfu、Vent、Mac、Sso)在摻入3'修飾核苷酸上的活性，與Pol812相關活性進行比較；更具體來說，該3'-修飾核苷酸是3'-O-疊氮甲基核苷酸。參考聚合酶則採用稱為Pol812的商業聚合酶，其為9°N聚合酶的一變體。
過程中，在含有100 mM氯化鈉的1 x TE緩衝液[10 mM 三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.0)和1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)]內，讓莫耳比1：1.5下的FAM-19-單體單元引子與互補29-單體單元DNA模板進行黏著反應，形成雙股引子-模板(P/T)DNA。DNA黏著反應係在Bio-Rad熱循環反應器(美國加州Hercules)內進行，首先將樣品混合物加熱至98°C達3分鐘，然後將其逐漸冷卻(5°C/30秒)至4°C。
在含有50 nM雙股P/T-DNA受質和200 nM聚合酶、溶於ThermoPol緩衝液[20 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.8)、10 mM硫酸銨、10 mM氯化鉀、2 mM硫酸鎂和0.1% TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)]的10微升反應混合物中進行模板依賴性DNA合成測定。添加10 μM的3'-O-疊氮甲基-dATP，即可啟動DNA合成反應。讓反應混合物在55°C下進行培養。利用添加等體積(10微升)的2份(2x)淬熄溶液[95%去離子甲醯胺和25 mM乙二胺四乙酸(EDTA)]，即可在2分鐘培養後終止該反應。讓樣品混合物在95°C下變性10分鐘，然後再用含有8M尿素的20%聚丙烯醯胺凝膠電泳(Urea-PAGE)分析。接著將該凝膠放在Amersham Typhoon雷射掃描儀(Cytiva Life Sciences，美國麻薩諸塞州Marlborough)進行成像，即可觀察該DNA合成反應產物。
上述反應的結果如圖6所示。在圖6中，「S」代表「雙股P/T-DNA受質」，可以從樣品向上移動的程度推斷出核苷酸摻入的活性。因此，結果呈現具有外切核酸酶缺陷的PolB，其在核苷酸摻入活性上的表現均無法與Pol812結果相提並論。有鑑於此，可得出結論，外切核酸酶缺陷並不足以賦予PolB酶在摻入3'-O-疊氮甲基-dNTP所需的活性。 實施例 5
示例性PolB變體在摻入3'-修飾核苷酸上的活性
在本案例中，外切核酸酶缺陷PolB (Kod1、Pfu、Vent、Mac、Sso和9°N)變體係進一步在不同區域內替換不同的胺基酸，然後再評估其摻入3'-O-疊氮甲基-dATP的活性。評估該摻入效果所採用的程序，與上述章節內者相同。
對應於具有不同胺基酸取代形式之PolB變體的活性效能結果如表1所示。在表1中，「+」代表「雙股P/T-DNA受質經延伸帶有一個鹼基」；「+/-」代表「低於10%的雙股P/T-DNA受質帶有延伸」；「-」代表「並無核苷酸摻入的雙股P/T-DNA受質」。根據表1可推斷出，外切核酸酶缺陷型PolB變體唯有搭配額外的胺基酸取代時(位於A模體中或同時在A模體及B模體中)，才能摻入3'-O-疊氮甲基-dATP。此外，根據表1中的M04得知，當PolB變體在A模體區域出現如同Pol812的取代情形時，無法摻入3'-O-疊氮甲基-dATP；然而，該PolB變體帶有L485Y+Y486A+P487G之胺基酸取代時，其得以表現3'-O-疊氮甲基-dNTP摻入活性。
表1
野生型 變體編號 胺基酸取代 活性
Pfu P01 Exo - -
P02 Exo -+L409Y+Y410A+P411G +
P03 Exo -+L409Y+Y410A+P411G+A486L +
Kod1 K01 Exo - -
K02 Exo -+L408Y+Y409A+P410G +
K03 Exo -+L408Y+Y409A+P410G+A485L +
Vent V01 Exo - -
V02 Exo -+L411Y+Y412A+P413G +
V03 Exo -+L411Y+Y412A+P413G+A488L +
V04 Exo -+L411Y+Y412A+P413P+A488L +
Mac M01 Exo - -
M02 Exo -+L485Y+Y486A+P487G +
M03 Exo -+ L485A+Y486A+P487I+A565L +
M04 Exo -+ L485A+Y486A+P487I -
Sso S01 Exo - -
S02 Exo -+L518Y+Y519A+P520G +
S03 Exo -+L518Y+Y519A+P520G+A601L +
S04 Exo -+L518A+Y519A+P520I+A601L +
9°N N01 Exo -+M129A+C223S -
Pol812 Exo -+L408A+Y409A+P410I+A485V +M129A+C223S +
N02 Exo -+L408Y+Y409A+P410G+A485V +M129A+C223S +
Pis I01 Exo -+M426Y+Y427A+P428G+A508L +
I02 Exo -+M426Y+Y427A+P428P+A508L +
實施例 6
示例性PolB變體在摻入已修飾核苷酸上的效率和正確性
於此將比較示例性PolB變體相較於Pol812在摻入3'-O-疊氮甲基核苷酸上的效率和正確性。本說明書中以變體V03 (帶有Exo -+ L411Y + Y412A + P413G + A488L的Vent)和M03 (帶有Exo -+ L485Y + Y486A + P487G + A565L的Mac)等作為示例性PolB變體之代表進行評估。
實驗過程中，在含有100 mM氯化鈉的1 x TE緩衝液[10 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.0)和1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)]內，讓莫耳比1：1.5下的FAM-19-單體單元引子與互補29-單體單元DNA模板進行黏著反應，形成雙股引子-模板(P/T) DNA。DNA黏著反應係在Bio-Rad熱循環反應器(美國加州Hercules)內進行，首先將樣品混合物加熱至98°C達3分鐘，然後將其逐漸冷卻(5°C/30秒)至4°C。
在含有50 nM雙股P/T-DNA受質和200 nM聚合酶、溶於ThermoPol緩衝液[20mM三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.8)、10mM硫酸銨、10mM氯化鉀、2mM硫酸鎂和0.1% TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)] 的10微升反應混合物中進行模板依賴性DNA合成測定。添加10 μM的3'-O-疊氮甲基-dATP，即可啟動DNA合成反應。讓反應混合物在55°C下進行培養。利用添加等體積(10微升)的2份淬熄溶液[95%甲醯胺和25 mM乙二胺四乙酸(EDTA)]，即可分別在0.5、1、2和5分鐘培養後終止該反應。讓樣品混合物在95°C下變性10分鐘，然後再用含有8M尿素的20%聚丙烯醯胺凝膠電泳(Urea-PAGE)分析。接著將該凝膠放在Amersham Typhoon雷射掃描儀(Cytiva Life Sciences，美國麻薩諸塞州Marlborough)進行成像，即可觀察該DNA合成反應產物。
上述反應的結果如圖7所示。在圖7中，「S」代表「雙股P/T-DNA受質」，可以從樣品向上移動的程度推斷出摻入的活性。因此，結果表示V03和M03在摻入3'-O-疊氮甲基-dATP之效率和正確性上的表現，與Pol812結果相當。分別使用3'-O-疊氮甲基-dTTP、3'-O-疊氮甲基-dCTP和3'-O-疊氮甲基-dGTP所獲得的其他數據(未示於圖中)，則與上述結果一致。有鑑於此，可推斷A模體和/或B模體中特定胺基酸取代經組合後，可使PolB變體在摻入該3'-O-N 3核苷酸上的效率和正確性雙雙提升。 實施例 7
示例性PolB變體在摻入可逆染料終止子核苷酸上的活性
在本實施中比較示例性PolB變體與Pol812在摻入可逆染料終止核苷酸(Cy5-N 3-dGTP)上的活性。本說明書中以外切核酸酶缺陷PolB變體(帶有Exo -的Kod1、帶有Exo -的Pfu、帶有Exo -的Vent)、變體P03(帶有Exo -+ L409Y + Y410A + P411G + A486L的Pfu)、變體K03(帶有Exo -+ L408Y + Y409A + P410G + A485L的Kod1)、變體V04(帶有Exo -+ L411Y + Y412A + P413P + A488L的Vent)和變體V03(帶有Exo -+ L411Y + Y412A + P413G + A488L的Vent)等作為示例性PolB變體之代表進行評估。
實驗中，在含有100 mM氯化鈉的1xTE緩衝液[10 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.0)和1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)]內，讓莫耳比1：1.5下的FAM-38-單體單元引子與互補45-單體單元DNA模板進行黏著反應，形成雙股引子-模板(P/T)DNA。DNA黏著反應係在Bio-Rad熱循環反應器(美國加州Hercules)內進行，首先將樣品混合物加熱至98°C達3分鐘，然後將其逐漸冷卻(5°C/30秒)至4°C。
在含有50 nM雙股P/T-DNA受質和200 nM聚合酶、溶於ThermoPol緩衝液[20 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.8)、10 mM硫酸銨、10 mM氯化鉀、2 mM硫酸鎂和0.1% TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)] 的10微升反應混合物中進行模板依賴性DNA合成測定。通過添加10 μM的Cy5-N 3-dGTP，即可啟動DNA合成反應。讓反應混合物在55°C下進行培養。利用添加等體積(10微升)的2份淬熄溶液[95% 甲醯胺和25 mM乙二胺四乙酸(EDTA)]，即可在5分鐘培養後終止該反應。樣品混合物在95°C下變性10分鐘，然後再用含有8M尿素的20%聚丙烯醯胺凝膠電泳(Urea-PAGE)分析。接著將該凝膠放在Amersham Typhoon雷射掃描儀(Cytiva Life Sciences，美國麻薩諸塞州Marlborough)進行成像，即可觀察該DNA合成反應產物。
上述反應的結果如圖8所示。在圖8中，「C」代表「對照組(Pol812)」；「S」代表「雙股P/T-DNA受質」，「1」代表「帶有Exo -的Pfu」；「2」代表「帶有Exo -的Kod1」；「3」代表「帶有Exo -的Vent」；「4」代表「P03」；「5」代表「K03」；「6」代表「V04」；「7」代表「V03」。圖8的結果顯示，外切核酸酶缺陷PolB變體(帶有Exo -的Kod1、帶有Exo -的Pfu、帶有Exo -的Vent)在活性上的表現均無法與Pol812結果相提並論，而具有組合胺基酸取代的變體所表現出的優異效能則與Pol812結果相當。有鑑於此，可推斷A模體和/或B模體中特定胺基酸取代經組合後，可令PolB變體在摻入可逆染料終止子核苷酸(Cy5-N 3-dGTP)的活性上有所提升。 實施例 8
示例性PolB變體在摻入可逆染料終止子核苷酸上的活性
在本實施例中，進一步比較其他示例性PolB變體與Pol812在摻入另一種可逆染料終止子核苷酸(Cy5-N 3-dGTP)上的活性。本說明書中以變體I01(帶有Exo -+ M426Y + Y427A + P428G + A508L的Pis)和變體I02(帶有Exo -+ M426Y + Y427A + P428P + A508L的Pis)等作為示例性PolB變體之代表進行評估。
實驗中，在含有100 mM氯化鈉的1 x TE緩衝液[10 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.0)和1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)]內，讓莫耳比1：1.5下的FAM-38-單體單元引子搭配與其互補的45-單體單元DNA模板進行黏著反應，形成雙股引子-模板(P/T)DNA。該DNA黏著反應係在Bio-Rad熱循環反應器(美國加州Hercules)內進行，首先將樣品混合物加熱至98°C達3分鐘，然後將其逐漸冷卻(5°C/30秒)至4°C。
在含有50 nM雙股P/T-DNA受質和200 nM聚合酶、溶於ThermoPol緩衝液[20 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.8)、10 mM硫酸銨、10mM氯化鉀、2 mM硫酸鎂和0.1% TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)] 的10微升反應混合物中進行模板依賴性DNA合成測定。通過添加10 μM的Cy5-N 3-dGTP，即可啟動DNA合成反應。讓反應混合物在55°C下進行培養。利用添加等體積(10微升)的2份淬熄溶液[95%甲醯胺和25 mM乙二胺四乙酸(EDTA)]，即可在5分鐘培養後終止該反應。樣品混合物在95°C下變性10分鐘，然後再用含有8M尿素的20%聚丙烯醯胺凝膠電泳(Urea-PAGE)分析。接著將該凝膠放在Amersham Typhoon雷射掃描儀(Cytiva Life Sciences，美國麻薩諸塞州Marlborough)進行成像，即可觀察該DNA合成反應產物。
上述反應的結果如圖9所示。在圖9中，「S」代表「雙股P/T-DNA受質」，「1」代表「Pol812」；「2」代表「I01」；「3」代表「I02」。圖9的結果顯示，搭配位於A模體和B模體之胺基酸取代的變體可發揮相當於Pol812的活性，I02的活性甚至會優於Pol812。有鑑於此，可推斷A模體和/或B模體中特定胺基酸取代經組合後，可令PolB變體在摻入可逆染料終止子(Cy5-N 3-dGTP)的活性獲得改善。 實施例 9
示例性PolB變體在摻入可逆染料終止子核苷酸上的活性
在本實施例中，以各種示例性PolB變體在摻入可逆染料終止子核苷酸(N 3-dNTP-連結子-染料)上的活性進行評估。本說明書檢測的示例性PolB變體之代表如下：
變體1：Pol812(菌株9°N)；
變體2：帶有Exo -+L408Y+Y409A+P410G+A485V的9°N；
變體3：帶有Exo -+L408Y+Y409A+P410G+A485L的9°N，；
變體4：帶有Exo -+L411Y+Y412A+P413G+A488L的Vent；
變體5：帶有Exo -+L411Y+Y412A+P413G+A488L+K480M的Vent；
變體6：帶有Exo -+L409Y+Y410A+P411G+A486L的Pfu；
變體7：帶有Exo -+L409Y+Y410A+P411G+A486L+I478M的Pfu；
上述PolB變體係利用N 3-dTTP-連結子-ROX(其結構如圖5D所示)、N 3-dCTP-連結子-Atto700(其結構如圖5B所示)進行檢測。
在實驗流程中，在含有100 mM氯化鈉的1 x TE緩衝液[10 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.0)和1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)]內，讓莫耳比1：1.5下的FAM-38-單體單元引子/Cy5-38-單體單元引子與互補的45-單體單元DNA模板進行黏著反應，形成雙股引子-模板(P/T)DNA。DNA黏著反應係在Bio-Rad熱循環反應器(美國加州Hercules)內進行，首先將樣品混合物加熱至98°C達3分鐘，然後將其逐漸冷卻(5°C/30秒)至4°C。
在含有50 nM雙股P/T-DNA受質和200 nM聚合酶、溶於ThermoPol緩衝液[20 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl) (pH 8.8)、10 mM硫酸銨、10 mM氯化鉀、2 mM硫酸鎂和0.1% TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)] 的10微升反應混合物中進行模板依賴性DNA合成測定。通過添加10 μM的N 3-dTTP-連結子-ROX/N 3-dCTP-連結子-Atto700，即可啟動DNA合成反應。讓反應混合物在55°C下進行培養。利用添加等體積(10微升)的2份淬熄溶液[95%甲醯胺和25 mM乙二胺四乙酸(EDTA)]，即可在5分鐘培養後終止該反應。樣品混合物在95°C下變性10分鐘，然後再用含有8M尿素的20%聚丙烯醯胺凝膠電泳(Urea-PAGE)分析。接著將該凝膠放在Amersham Typhoon雷射掃描儀(Cytiva Life Sciences，美國麻薩諸塞州Marlborough)進行成像，即可觀察該DNA合成反應產物。
上述反應的結果如圖10所示。在圖10中，「S」代表「雙股P/T-DNA受質」，「1」到「7」代表「變體1」到「變體7」。圖10的結果顯示，源自9°N菌株之PolB變體帶有「YAG」胺基酸取代且在A模體中具有A485取代，然而但並未帶有M129A及C223S取代時，其在摻入N 3-dNTP-連結子-染料上所展現的活性與在A模體中帶有「AAI」取代並搭配A485、M129A和C223S取代的Pol812所展現之結果相當。此外，圖10的結果顯示，在A模體及B模體中特定胺基酸取代經組合後，得以令源自於不同菌株的PolB變體在摻入N 3-dTTP-連結子-ROX或N 3-dCTP-連結子-Atto700的活性上雙雙獲得提升。又，使用FAM-38-單體單元引子/N 3-dGTP-連結子-Cy5以及Cy5-38-單體單元引子/N 3-dATP-連結子-Atto532獲得的其他數據(未示於圖中)均與上述結果一致。
綜上所述，本說明書提供的B族DNA聚合酶變體可以提升核苷酸類似物的掺入效果，以利於多核苷酸的合成和相關核酸模板的定序。本發明具體實施例已經揭露，但並非旨在限制本發明。本案所屬技術領域具有通常知識者均能夠理解，在未偏離本發明原理和精神的情況下，可以做出各種變更例和修飾例，因此本發明的保護範圍應當以隨附的專利申請範圍中所限定的範圍為基礎。
無
為使本發明上述及其他目的、特徵、優點及實施例更加明顯易懂，因此針對圖式說明如下：
圖1係一通常之SBS法的示意圖。
圖2係本發明之各種野生型B族DNA聚合酶(PolB)及其共通序列的胺基酸序列比對示意圖。
圖3繪示本發明之帶有可移除3'保護基部分之染料標記核苷酸類似物的共同結構。
圖4繪示3'-O-N 3-dNTP的結構。
圖5A至5D分別繪示N 3-dATP-連結子-Atto532、N 3-dCTP-連結子-Atto700、N 3-dGTP-連結子-Cy5和N 3-dTTP-連結子-ROX的結構。
圖6呈現實施例4所述反應之結果。
圖7呈現實施例6所述反應之結果。
圖8呈現實施例7所述反應之結果。
圖9呈現實施例8所述反應之結果。
圖10呈現實施例9所述反應之結果。
無。
<110> 陳呈堯；CHEN,CHENG-YAO
<120> B族DNA聚合酶變體以及包含其的試劑套組
<130> P222285TW
<140> TW 111124518
<141> 2022-06-30
<150> US63/249,813
<151> 2021-09-29
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共通序列
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(1360)
<400> 1
Figure 111124518-A0305-02-0047-1
Figure 111124518-A0305-02-0048-2
Figure 111124518-A0305-02-0049-3
Figure 111124518-A0305-02-0050-4
Figure 111124518-A0305-02-0051-5
Figure 111124518-A0305-02-0052-6
Figure 111124518-A0305-02-0053-7
Figure 111124518-A0305-02-0054-8
<210> 2
<211> 773
<212> PRT
<213> 嗜高溫菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(773)
<400> 2
Figure 111124518-A0305-02-0054-9
Figure 111124518-A0305-02-0055-10
Figure 111124518-A0305-02-0056-11
Figure 111124518-A0305-02-0057-12
Figure 111124518-A0305-02-0058-13
<210> 3
<211> 774
<212> PRT
<213> 嗜高溫菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(774)
<400> 3
Figure 111124518-A0305-02-0059-14
Figure 111124518-A0305-02-0060-15
Figure 111124518-A0305-02-0061-16
Figure 111124518-A0305-02-0062-17
<210> 4
<211> 775
<212> PRT
<213> 嗜高溫菌9°N-7
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(775)
<400> 4
Figure 111124518-A0305-02-0063-18
Figure 111124518-A0305-02-0064-19
Figure 111124518-A0305-02-0065-20
Figure 111124518-A0305-02-0066-21
Figure 111124518-A0305-02-0067-22
<210> 5
<211> 775
<212> PRT
<213> 激烈火球菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(775)
<400> 5
Figure 111124518-A0305-02-0067-23
Figure 111124518-A0305-02-0068-24
Figure 111124518-A0305-02-0069-25
Figure 111124518-A0305-02-0070-26
Figure 111124518-A0305-02-0071-27
<210> 6
<211> 774
<212> PRT
<213> 嗜高溫菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(774)
<400> 6
Figure 111124518-A0305-02-0071-28
Figure 111124518-A0305-02-0072-29
Figure 111124518-A0305-02-0073-30
Figure 111124518-A0305-02-0074-31
Figure 111124518-A0305-02-0075-32
<210> 7
<211> 784
<212> PRT
<213> 海沼甲烷球菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(784)
<400> 7
Figure 111124518-A0305-02-0075-33
Figure 111124518-A0305-02-0076-34
Figure 111124518-A0305-02-0077-35
Figure 111124518-A0305-02-0078-36
Figure 111124518-A0305-02-0079-37
<210> 8
<211> 937
<212> PRT
<213> 甲烷八疊球菌屬
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(937)
<400> 8
Figure 111124518-A0305-02-0079-38
Figure 111124518-A0305-02-0080-39
Figure 111124518-A0305-02-0081-40
Figure 111124518-A0305-02-0082-41
Figure 111124518-A0305-02-0083-42
Figure 111124518-A0305-02-0084-43
<210> 9
<211> 1107
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(1107)
<400> 9
Figure 111124518-A0305-02-0084-44
Figure 111124518-A0305-02-0085-45
Figure 111124518-A0305-02-0086-46
Figure 111124518-A0305-02-0087-47
Figure 111124518-A0305-02-0088-48
Figure 111124518-A0305-02-0089-49
Figure 111124518-A0305-02-0090-50
<210> 10
<211> 1097
<212> PRT
<213> 釀酒酵母
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(1097)
<400> 10
Figure 111124518-A0305-02-0090-51
Figure 111124518-A0305-02-0091-52
Figure 111124518-A0305-02-0092-53
Figure 111124518-A0305-02-0093-54
Figure 111124518-A0305-02-0094-55
Figure 111124518-A0305-02-0095-56
Figure 111124518-A0305-02-0096-57
<210> 11
<211> 785
<212> PRT
<213> 冰島熱棒菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(785)
<400> 11
Figure 111124518-A0305-02-0096-58
Figure 111124518-A0305-02-0097-59
Figure 111124518-A0305-02-0098-60
Figure 111124518-A0305-02-0099-61
Figure 111124518-A0305-02-0100-62
<210> 12
<211> 882
<212> PRT
<213> 硫磺礦硫化葉菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(882)
<400> 12
Figure 111124518-A0305-02-0100-63
Figure 111124518-A0305-02-0101-64
Figure 111124518-A0305-02-0102-65
Figure 111124518-A0305-02-0103-66
Figure 111124518-A0305-02-0104-67
Figure 111124518-A0305-02-0105-68
<210> 13
<211> 787
<212> PRT
<213> 綠膿桿菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(787)
<400> 13
Figure 111124518-A0305-02-0105-69
Figure 111124518-A0305-02-0106-70
Figure 111124518-A0305-02-0107-71
Figure 111124518-A0305-02-0108-72
Figure 111124518-A0305-02-0109-73
<210> 14
<211> 783
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(783)
<400> 14
Figure 111124518-A0305-02-0109-74
Figure 111124518-A0305-02-0110-75
Figure 111124518-A0305-02-0111-76
Figure 111124518-A0305-02-0112-77
Figure 111124518-A0305-02-0113-78
<210> 15
<211> 903
<212> PRT
<213> 腸桿菌噬菌體RB69
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(903)
<400> 15
Figure 111124518-A0305-02-0113-79
Figure 111124518-A0305-02-0114-80
Figure 111124518-A0305-02-0115-81
Figure 111124518-A0305-02-0116-82
Figure 111124518-A0305-02-0117-83
Figure 111124518-A0305-02-0118-84
<210> 16
<211> 898
<212> PRT
<213> 腸桿菌噬菌體T4
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(898)
<400> 16
Figure 111124518-A0305-02-0118-85
Figure 111124518-A0305-02-0119-86
Figure 111124518-A0305-02-0120-87
Figure 111124518-A0305-02-0121-88
Figure 111124518-A0305-02-0122-89
Figure 111124518-A0305-02-0123-90
<210> 17
<211> 575
<212> PRT
<213> 芽孢桿菌噬菌體phi-29
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(575)
<400> 17
Figure 111124518-A0305-02-0123-91
Figure 111124518-A0305-02-0124-92
Figure 111124518-A0305-02-0125-93
Figure 111124518-A0305-02-0126-94
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cy5-38-單體單元引子
<220>
<221> 引子
<222> (1)..(38)
<400> 18
Figure 111124518-A0305-02-0126-95
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 45-單體單元模板
<220>
<221> 模板
<222> (1)..(45)
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n為a,c,g，或t
<400> 19
Figure 111124518-A0305-02-0126-96
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAM-38-單體單元引子
<220>
<221> 引子
<222> (1)..(38)
<400> 20
Figure 111124518-A0305-02-0127-97
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAM-19-單體單元引子
<220>
<221> 引子
<222> (1)..(19)
<400> 21
Figure 111124518-A0305-02-0127-98

Claims (18)

  1. 一種B族DNA聚合酶變體，其係由一野生型B族DNA聚合酶修飾而成，該野生型B族DNA聚合酶係選自於由SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17所組成群組之一胺基酸序列，其中SEQ ID NO：2、3或4的位置408的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：5的位置409的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：6的位置411的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：7的位置417的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：8的位置485的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：9的位置606的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：10的位置612的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：11的位置426的該胺基酸M係由F、I、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：12的位置518的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：13的位置425的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：14的位置423的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：15的位置415的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：16的位置412的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代；SEQ ID NO：17的位置253的該胺基酸L係由F、I、M、Q、S、H或Y所取代。
  2. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係由一野生型B族DNA聚合酶修飾而成，該野生型B族DNA聚合酶包含選自於由SEQ ID NO：3、4、5、6、8、11和12所組成群組之一胺基酸序列。
  3. 如請求項2所述之B族DNA聚合酶變體，其中該野生型B族DNA聚合酶係一嗜高溫菌(Thermococcus gorgonarius)DNA聚合酶Tgo、一嗜高溫菌(Thermococcus kodakarensis)DNA聚合酶Kod1、一嗜高溫菌屬菌株9°N-7之DNA聚合酶9°N、一激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶Pfu、一嗜高溫菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶Vent、一海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)DNA聚合酶Mma、一甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina acetivorans)DNA聚合酶Mac、一人類DNA聚合酶δ催化p125次單元hPOLD、一釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DNA聚合酶δ催化次單元ScePOLD、一冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)DNA聚合酶Pis、一硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)DNA聚合酶Sso、一綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)DNA聚合酶II Pae、一大腸桿菌(Escherichia.coli)DNA聚合酶II Eco、一腸桿菌噬菌體RB69 DNA聚合酶、一腸桿菌噬菌體T4 DNA聚合酶或一芽孢桿菌噬菌體Phi29 DNA聚合酶。
  4. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：3之一嗜高溫菌(Thermococcus kodakarensis)DNA聚合酶Kod1，且其中：SEQ ID NO：3的D141係由A所取代；SEQ ID NO：3的E143係由A所取代；SEQ ID NO：3的Y409係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及SEQ ID NO：3的P410係由A、C、F、G、S或T所取代。
  5. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：4之一嗜高溫菌屬菌株9°N-7之DNA聚合酶9°N，且其中：SEQ ID NO：4的D141係由A所取代；SEQ ID NO：4的E143係由A所取代；SEQ ID NO：4的Y409係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及SEQ ID NO：4的P410係由A、C、F、G、S或T所取代。
  6. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：5之一激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶Pfu，且其中：SEQ ID NO：5的D141係由A所取代；SEQ ID NO：5的E143係由A所取代；SEQ ID NO：5的Y410係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及SEQ ID NO：5的P411係由A、C、F、G、S或T所取代。
  7. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：6之一嗜高溫菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶Vent，且其中：SEQ ID NO：6的D141係由A所取代；SEQ ID NO：6的E143係由A所取代；SEQ ID NO：6的Y412係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及SEQ ID NO：6的P413係由A、C、F、G、S或T所取代。
  8. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：8之一甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina acetivorans)DNA聚合酶Mac，且其中：SEQ ID NO：8的D198係由A所取代；SEQ ID NO：8的E200係由A所取代；SEQ ID NO：8的Y486係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及SEQ ID NO：8的P487係由A、C、F、G、S或T所取代。
  9. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：11之一冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)DNA聚合酶Pis，且其中：SEQ ID NO：11的D171係由A所取代；SEQ ID NO：11的E173係由A所取代；SEQ ID NO：11的Y427係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及SEQ ID NO：11的P428係由A、C、F、G、S或T所取代。
  10. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：12之一硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)DNA聚合酶Sso，且其中：SEQ ID NO：12的D231係由A所取代；SEQ ID NO：12的E233係由A所取代；SEQ ID NO：12的Y519係由A、C、D、F、G、H或I所取代；以及SEQ ID NO：12的P520係由A、C、F、G、S或T所取代。
  11. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：3之一嗜高溫菌(Thermococcus kodakarensis)DNA聚合酶Kod1，且其中：SEQ ID NO：3的D141係由A所取代；SEQ ID NO：3的E143係由A所取代；SEQ ID NO：3的Y409係由A、C、D、F、G、H或I所取代；SEQ ID NO：3的P410係由A、C、F、G、S或T所取代；以及SEQ ID NO：3的A485係由C、D、E、F或L所取代。
  12. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：4之一嗜高溫菌屬菌株9°N-7之DNA聚合酶9°N，且其中：SEQ ID NO：4的D141係由A所取代；SEQ ID NO：4的E143係由A所取代；SEQ ID NO：4的Y409係由A、C、D、F、G、H或I所取代；SEQ ID NO：4的P410係由A、C、F、G、S或T所取代；以及SEQ ID NO：4的A485係由C、D、E、F或L所取代。
  13. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：5之一激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶Pfu，且其中：SEQ ID NO：5的D141係由A所取代；SEQ ID NO：5的E143係由A所取代；SEQ ID NO：5的Y410係由A、C、D、F、G、H或I所取代； SEQ ID NO：5的P411係由A、C、F、G、S或T所取代；以及SEQ ID NO：5的A486係由C、D、E、F或L所取代。
  14. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：6之一嗜高溫菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶Vent，且其中：SEQ ID NO：6的D141係由A所取代；SEQ ID NO：6的E143係由A所取代；SEQ ID NO：6的Y412係由A、C、D、F、G、H或I所取代；SEQ ID NO：6的P413係由A、C、F、G、S或T所取代；以及SEQ ID NO：6的A488係由C、D、E、F或L所取代。
  15. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：8之一甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina acetivorans)DNA聚合酶Mac，且其中：SEQ ID NO：8的D198係由A所取代；SEQ ID NO：8的E200係由A所取代；SEQ ID NO：8的Y486係由A、C、D、F、G、H或I所取代；SEQ ID NO：8的P487係由A、C、F、G、S或T所取代；以及SEQ ID NO：8的A565係由C、D、E、F或L所取代。
  16. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：11之一冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)DNA聚合酶Pis，且其中：SEQ ID NO：11的D171係由A所取代； SEQ ID NO：11的E173係由A所取代；SEQ ID NO：11的Y427係由A、C、D、F、G、H或I所取代；SEQ ID NO：11的P428係由A、C、F、G、S或T所取代；以及SEQ ID NO：11的A508係由C、D、E、F或L所取代。
  17. 如請求項1所述之B族DNA聚合酶變體，其中該B族DNA聚合酶變體係源自包含一野生型胺基酸序列SEQ ID NO：12之一硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)DNA聚合酶Sso，且其中：SEQ ID NO：12的D231係由A所取代；SEQ ID NO：12的E233係由A所取代；SEQ ID NO：12的Y519係由A、C、D、F、G、H或I所取代；SEQ ID NO：12的P520係由A、C、F、G、S或T所取代；以及SEQ ID NO：12的A601係由C、D、E、F或L所取代。
  18. 一種用於合成式定序反應之試劑套組，包括：如請求項1至17任一項所述之B族DNA聚合酶變體；一引子；以及複數核苷酸類似物，其係用以於適當條件下摻入該引子。
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