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TWI862543B - 在腹膜透析患者中快速診斷腹膜炎之技術 - Google Patents

在腹膜透析患者中快速診斷腹膜炎之技術 Download PDF

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TWI862543B
TWI862543B TW109102865A TW109102865A TWI862543B TW I862543 B TWI862543 B TW I862543B TW 109102865 A TW109102865 A TW 109102865A TW 109102865 A TW109102865 A TW 109102865A TW I862543 B TWI862543 B TW I862543B
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Abstract

係描述一種用於診斷個體之感染如腹膜炎的試驗。該試驗包括一結合分子，例如與來自個體樣本中的發炎標誌物特異性結合的抗體，以及一第二結合分子，其可與指示樣本中病原體的標誌物結合。用於診斷個體的腹膜炎，該病原體將為至少一種細菌及/或真菌。通常，該試驗將整合至一側向流動裝置中，並可包括一結合分子，其與指示特定病原體物種存在的抗原特異性地結合。所述試驗可進一步包括過濾器、富集抗原和緩衝液。亦描述在腹膜透析患者個體中診斷和治療腹膜炎的方法，該方法包括利用本文所述的試驗或試驗套組分析該個體的腹膜透析流出物。

Description

在腹膜透析患者中快速診斷腹膜炎之技術
相關申請案之交互參考
本申請案依據35 U.S.C. §119(e)申明補充於2019年1月31日提申的美國臨時專利申請案第62/799,430號的權益，其內容經由引用合併於此。 發明領域
本申請案係相關於一種醫療裝置，特別相關於一種用於在腹膜透析患者中診斷和治療腹膜炎的診斷系統、設備和相關方法。
發明背景
腹膜炎是全球腹膜透析(“PD”)患者發病和死亡的主要原因。根據國際腹膜透析協會(“ISPD”)指南，只要存在以下至少兩種情況，就可以診斷為腹膜炎：(1)與腹膜炎一致的臨床特徵，例如腹痛及/或渾濁的透析流出液(“CDE”)；(2)透析流出液中白血球計數(“WBC”)大於100/μL或大於0.1 x 10 9/L(在至少兩個小時的停留時間之後)，其中超過50%的WBC是多形核(“PMN”)；以及(3)腹膜透析流出液(“PDE”)培養物呈陽性。
然而，實際上，當患者在臨床上出現腹膜炎症狀時，通常需要臨床醫生花費數小時至五天來獲得白血球計數和腹膜透析流出物的細胞培養結果。即使有感染，培養物陰性率也大約為10%。目前需要一種快速、可靠的確認感染的方法，以防止由於治療延遲而導致患者惡化。
一旦做出感染診斷(不知道具體的致病因子)，腎臟科醫生通常立即開始經驗性抗生素治療。此類療法通常包括投予至少兩種不同的廣譜抗生素，這些抗生素共同覆蓋大多數革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，以及一種抗真菌劑，以預防繼發性真菌性腹膜炎，直到可獲得致病因子和藥物敏感性試驗為止。
然而，已知廣譜抗生素的長期使用，係與發展出抗藥性細菌的風險和隨後的真菌感染的風險增加有關。因此，需要一種早期、快速且與培養無關的方法來辨識出感染的致病因子（causative agent）、支持處方的合適抗生素，並減少其中一些未預期的併發症。
目前，沒有一種簡單的裝置可用於家庭腹膜透析患者或提供給透析診所的臨床醫生來確認感染的存在，以及辨識出假設的致病因子或致病因子類別。
一項來自Mologic Ltd.(英國)的產品，可在腹膜透析流出物中偵測某些發炎標誌物(inflammatory marker)，例如IL-6和MMP8，以警告腹膜透析患者有發炎現象，並鼓勵進一步檢查。然而，該產品並未特異性地識別出感染的致病因子，這將有助於例如開立抗生素。此外，在某些沒有感染的情況下也可能會存在發炎，例如由化學刺激物、腹膜的機械性損傷或其他情況引起的發炎。在這種情況下，僅有發炎狀態並不能為臨床醫生提供足夠的信息，以對於治療做出及時而具體的決定。
WO2018/060708描述一種化學性偵測白血球的方法(例如，使用氧化還原指示劑)，且任擇地同時區分腹膜透析流出物中的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。然而，所描述的方法並非特異於感染的致病因子，且需要至少兩個小時，更常為12小時或更長的培養時間。該方法的另一個限制為，它可能無法區分出革蘭氏陰性菌感染或同時有革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌之感染。
其他裝置可用於決定體液中細菌的革蘭氏狀態，然而它們無法同時偵測發炎，及/或它們無法指示已知可能與腹膜炎有關的特定細菌種類。
腹膜透析流出物的濁度檢查是腎臟研究所(“RRI”)和liberDi.  Ronco C, Dell’Aquila R, Rodighiero MP (eds): “Peritoneal Dialysis: A Clinical Update,” Contrib. Nephrol., Basel, Karger, 2006, vol. 150, pp 187–194，使用的另一種技術。原理是根據濁度評估WBC計數為基礎來預測腹膜炎。然而，除了白血球高位準外，還有很多原因可以改變腹膜透析流出物中的濁度位準。此外，基於濁度的WBC測試的靈敏度，可能不足以用於許多連續性非臥床腹膜透析(“CAPD”)患者。
來自DxNow的另一項技術是一種可攜式生物成像系統，其具有基於微流體的消耗品，用於預測腹膜炎。原理是使用WBC特異性抗體捕捉腹膜透析流出物中的WBC，然後進行計數。該技術旨在在短時間內提供準確的WBC計數，然而，它並未提供有關致病因子的任何信息，且該裝置複雜且相對昂貴。
其他平台是基於PCR或其他基於核酸的擴增/偵測方法。儘管它們可能很敏感，但它們通常需要笨重且昂貴的設備、專門人員訓練以及較長的靜置時間(2小時以上)，因此在許多需要幾分鐘或短於1小時之內進行決定的即時醫療應用中，可能並不實用，特別是用於家庭或遠端診所。
因此，儘管長期需要快速、早期偵測PD患者腹膜炎的發炎狀況和特定的革蘭氏/微生物狀態，但目前尚未找到合適的解決方案。
從使用者的角度來看，所描述的系統可用於進行具有簡單樣本預處理的單一測試。
發明概要
描述一種用於診斷個體之感染的試驗，該試驗包括一第一結合分子，其可與自個體取得的樣本中的發炎標誌物特異性結合，以及一第二結合分子，其可與指示該病原體存在的標誌物結合。該第一結合分子和第二結合分子可存在於一測試裝置或測試條上。
亦描述一種試驗套組，其包括特異性結合至一指示腹膜發炎反應的抗原之結合分子；一特異性結合至指示革蘭氏陽性細菌存在的抗原之結合分子；一特異性結合至指示革蘭氏陰性細菌存在的抗原之結合分子。此試驗套組可更包括一特異性結合至指示真菌存在的抗原之結合分子。該試驗套組可更包括一第二結合分子或能夠與所示結合分子結合的分子。該第二結合分子可共軛至一報導子或指示劑，例如螢光報導子或其他可顯色報導子、奈米顆粒、反應性顆粒如酵素，或其他報導子或指示劑。該結合分子和第二結合分子可為如抗體。
通常，指示腹膜發炎反應的抗原為嗜中性白血球明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin) (“NGAL”)、介白素1(“IL-1”)、介白素6(“IL-6”)、介白素8(“IL 8”)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、降鈣素及/或C-反應蛋白(“CRP”)。脂磷壁酸(lipoteichoic acid) (“LTA”)為指示革蘭氏陽性細菌存在的抗原。脂多醣(“LPS”)為指示革蘭氏陰性細菌存在的抗原。β-葡聚醣為指示真菌存在的抗原。
用於診斷個體的腹膜炎，該病原體通常是至少一種細菌及/或真菌。
在某些實施例中，該試驗/試驗套組將包括一特異性結合至指示特定病原體物種存在的抗原之結合分子。為了與腹膜透析流出物一起使用，該特定的病原體通常為金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、假單胞菌( Pseudomonas sp.)、表皮葡萄球菌( Staphylococcus epidermidis)、溶血性葡萄球菌( Staphylococcus haemolyticus)、念珠菌屬( Candida sp.)、大腸桿菌( Escherichia coli)、抗萬古黴素腸球菌屬(vancomycin-resistant enterococci)，及其組合。
通常，該試驗將整合至一側向流動裝置中，該側向流動裝置將幾乎立即產生結果，例如在分鐘級別內。通常，該側向流動裝置包含一或多個跑道(panel)，以偵測一或多種抗原。
在一實施例中，可將複數個側向流動裝置整合在一起，以偵測多種抗原。包含一或多個行列(panel)的每一側向流動裝置，可共享單一樣本容器。
在另一實施例中，該複數個側向流動裝置可維持於同一殼體中，但經由使用個別行列各自偵測抗原。
在另一實施例中，可以多重形式構建單一側向流動裝置，以使用單一行列(panel)來偵測多種抗原。
所述的試驗/試驗套組可更包括用於從PDE過濾(例如，過濾器)、濃縮(例如，離心)、裂解細胞及/或富集抗原的工具。
可藉由濃縮PDE來增強敏感性，特別是對於革蘭氏陽性和革蘭氏陰性抗原/標誌物。在某些實施例中，使用注射器而不是離心方式來過濾和濃縮PDE。
所描述的試驗/試驗套組可更包括一可特異性地從試驗套組中沖提出抗原的緩衝液。緩衝液組成物可經選擇，以選擇性地穩定抗原及/或抗原-抗體複合物、維持pH值、維持或破壞抗原-抗體複合物的結構或結合。
進一步描述在腹膜透析患者個體中診斷腹膜炎的方法，其包括利用本文所述的試驗或試驗套組來分析該個體的腹膜透析流出物。
在某些實施例中，在腹膜透析患者個體中診斷腹膜炎的方法，包括在該個體的腹膜透析流出物(“PDE”)中偵測指示腹膜中出現發炎反應的抗原；在PDE中偵測(例如利用適當的結合分子)指示革蘭氏陽性細菌存在的抗原；且在PDE中偵測(例如利用適當的結合分子)指示革蘭氏陰性細菌存在的抗原。較佳為，在不到一個小時的時間內提供結果。
在某些實施例中，該方法更包括在腹膜透析流出物中偵測(例如，利用適當的結合分子)指示真菌存在的抗原。
在某些實施例中，該方法更包括在偵測抗原之前過濾、濃縮及/或富集該腹膜透析流出物。在某些實施例中，富集可藉由例如將50 ml PDE置於錐形管中，隨後將該PDE樣本離心，並以如裂解緩衝液、萃取緩衝液和中和緩衝液處理。亦可使用超過濾(“UF”)膜(例如，截留分子量29,000)來富集PDE樣本中的抗原。在另一實施例中，使用注射器使PDE通過/推過UF膜，而非使用離心機。
此類診斷方法可用於治療個體的腹膜炎，首先診斷該個體為患有腹膜炎，然後根據診斷結果投予該個體適當的抗生素，以治療腹膜炎。
在一尤佳實施例中，係揭示一種利用側向流動測定技術及/或乾式化學測試技術的紙類裝置，以自患者PDE中，同時偵測污染微生物的細胞壁成分及/或表面抗原，及/或發炎生物標誌物的存在。在一些實施例中，當患者在診所中出現渾濁的腹膜透析流出物及/或腹膜炎的其他症狀時，側向流動技術及/或乾式化學測試技術可用於快速協助臨床醫生診斷腹膜透析患者之感染。在某些實施例中，該偵測係基於側向流動測試(也稱為側向流動免疫層析試驗)，其為一種簡單的以紙類為基礎的裝置，用於偵測液體樣本中目標分析物的存在，而無需特殊訓練與昂貴的儀器。該裝置有助於確定一或多種污染微生物，因而例如可迅速開立出適當的抗生素療法。
該裝置及其使用方法可協助臨床醫生(以及患者和護理人員)快速確定腹膜透析患者中是否存在感染，並有助於提供治療，因而改善腹膜透析相關之腹膜炎的管理。因此，一目標為在認為病原體入侵患者後，可立即快速且同時偵測從患者宿主免疫系統及/或病原體釋放的多種分子標誌物的存在。
較佳實施例之詳細說明
如本文所用，“結合分子”，例如抗體(單株或多株)或其抗原結合片段、適體(aptamer)、親和體(affimer，胜肽適體)、受器結合結構域，或人為設計的錨蛋白重複蛋白(DARPins)，是與抗原特異性結合的分子。術語“抗原結合片段”是指完整結合分子(例如抗體)的一部分。抗體片段的範例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、CDR、抗原結合位點、重鏈或輕鏈可變區、雙抗體、三抗體單鏈抗體分子(“scFv”)和多特異性抗體，其由至少兩種完整抗體或其片段或胜肽或多肽(其包含至少一足以使抗原結合至該胜肽或多肽等的免疫球蛋白片段)形成。一抗原結合片段可包含胜肽或多肽，其包含至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250個連續胺基酸殘基的抗體胺基酸序列。該抗原結合片段可合成產生或經由完整免疫球蛋白的酵素性或化學性裂解而產生，或者它們可藉由重組DNA技術進行基因工程改造。該生產方法是本領域公知的，並且描述於例如 Antibodies: A Laboratory Manual, edited by: E. Harlow and D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York。抗體或其抗原結合片段具有一或多個結合位點。若存在大於一個結合位點，則該結合位點可彼此相同或不同。如本文所用，術語“特異性結合”或“特異性辨識”是指抗體與其結合夥伴(例如抗原)的交互作用，即該交互作用取決於特定胺基酸序列或結構的存在，例如結合夥伴上的抗原決定簇或表位。換言之，即使當該結合夥伴存在於有其他分子或生物體的混合物中，該抗體也會優先結合或辨識出其結合夥伴。該結合可經由共價或非共價交互作用或兩者的組合來介導。又換言之，術語“特異性結合”或“特異性辨識”是指該抗體與某一抗原決定簇或表位具有特異性免疫反應，而與其他抗原決定簇或表位不具有免疫反應性。特異性或免疫特異性結合至抗原的抗體可能以較低的親和力與其他胜肽或多肽結合，如藉由放射免疫試驗(“RIA”)、酶聯免疫吸附試驗(“ELISA”)、BIACORE或其他已知的技術上已知之試驗測定。特異性結合至某一抗原的抗體或其片段，可與攜帶相同表位的相關抗原發生交叉反應。較佳地，特異性結合至某一抗原的抗體或其片段不與其他抗原產生交叉反應。 分析物/相關特異性結合分子：
在某些實施例中，該裝置被配置成在一個裝置中偵測一、二或多種發炎標誌物，例如嗜中性白血球明膠酶相關的脂蛋白(“NGAL”)和介白素6(“IL-6”)，以及一、二、三更多個細胞壁成分，例如脂蛋白酸(“LTA”)、脂多醣(“LPS”)和β-葡聚醣。
NGAL(嗜中性白血球明膠酶相關的脂質運載蛋白、脂質運載蛋白2、鐵氧磷蛋白或嗜中性白血球脂質運載蛋白)為一25 kDa醣基化的單鏈單體，並為結合和運輸小型親脂性分子的脂質運轉蛋白家族的成員。NGAL由活化的嗜中性白血球以及腎小管上皮細胞、心肌細胞、子宮、前列腺、唾腺和其他組織釋放，並可在血清和尿液二者中發現。NGAL可形成二聚體，形成一45 kDa的雙硫鍵聯結同型二聚體，少量的高級寡聚體，以及一與基質金屬蛋白酶9 (“MMP-9”，明膠酶B)形成的135 kDa異型二聚體。NGAL參與先天免疫。該同型二聚體形式由嗜中性白血球特異地釋放，該嗜中性白血球在病原體入侵後立即滲入腹膜，而該單體和異型二聚體更常由腎小管細胞和其他指示的組織釋放，回應例如急性腎損傷。在腹膜炎過程中，腹膜透析流出物中NGAL的位準與嗜中性白血球的數量有良好相關性，即使在沒有任何臨床症狀出現之前，NGAL的位準也可以用來預測感染。經由側向流動試驗，腹膜透析流出液樣本中NGAL的偵測似乎比MMP8具有更高的靈敏度。
特異性結合至NGAL的抗體可容易地商購獲得。例如，山羊IgG多株抗體可得自ThermoFisher Scientific，目錄號PA5-18382。抗NGAL抗體(ab63929，NGAL的兔多株抗體)得自Abcam (Cambridge，MA，US)。
介白素6由間皮細胞表現和分泌，間皮細胞作為腹膜宿主防禦系統的第一層。一旦病原體入侵，間皮細胞就會上調IL-6的表現，因此在腹膜透析流出物中可偵測到更高位準的IL-6。腹膜炎發作前、腹膜炎期間甚至腹膜炎後排出的PDE中，IL-6位準會迅速升高。
特異性結合至IL-6的抗體可容易地商購獲得。例如，單株抗體MAB2061-SP、MAB2061-100和MAB2061-500 (R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN, US)為人類IL-6抗體，其可在直接ELISA中結合至人類IL-6，但無法與小鼠、大鼠或豬的重組IL-6呈交叉反應。抗IL-6抗體(ab6672，IL-6的兔多株抗體)可得自Abcam (Cambridge，MA，US)。
然而，由於腹膜透析液可能引起的持續刺激，通常在腹膜透析患者中都會偵測到IL-6(即使沒有感染)。因此，較佳在裝置中調整IL-6偵測極限的閾值，以更可靠地指示感染的存在。在這方面，IL-6可能不是最佳的標誌物，或者可能與其他發炎標誌物組合使用會更佳。
在某些實施例中，IL-6被不同的發炎標誌物替代，例如前降鈣素或C反應蛋白(“CRP”)。這兩種發炎標誌物都可用於預測腹膜炎。
其他發炎標誌物包括TNFα、纖維蛋白原、MPO、HAS、fMLP、A1AT、TIMP2、TIMP1、sICAM、MMP 9、HNE、胱抑素C、IL-1b、IL-8、鈣衛蛋白、RBP4、MMP 8、MMP 2、鎖鏈素(desmosine)和SPD。
對抗TNFα的單株抗體包括英夫利昔單抗(REMICADE TM)、阿達木單抗(HUMIRA TM)、塞妥珠單抗聚乙二醇化(CIMZIA TM)和戈利木單抗(SIMPONI TM)。
特異性結合至纖維蛋白原的抗體可容易地商購獲得。例如，抗纖維蛋白原抗體(ab189490，對抗纖維蛋白原的兔單株抗體)可得自abcam(Cambridge，MA，US)。多株綿羊抗人類纖維蛋白原抗體可得自R＆D Systems，目錄號AF4786。此抗體藉由直接ELISA和西方印跡法偵測人類血纖維蛋白原。
特異性結合至前降鈣素的抗體可容易地商購獲得。例如，抗前降鈣素抗體(ab166963，前降鈣素之羊多株抗體)可得自Abcam (Cambridge，MA，US)。小鼠前降鈣素單株抗體(27A3)可得自ThermoFisher Scientific，目錄號MA1-20887。MA1-20887可偵測人類樣本中的前降鈣素，已成功用於ELISA和西方印跡法。MA1-20887免疫原是純化的全長天然人類降鈣素的內部片段。
特異性結合至C反應蛋白(“CRP”)的抗體可容易地自商業上獲得。例如，抗C反應蛋白抗體(ab31156，對抗人類CRP的兔多株抗體)可得自Abcam(Cambridge，MA，US)。小鼠CRP單株抗體(P4D7)可得自Invitrogen Antibodies/ThermoFisher Scientific，目錄號MIC0501。
因此，腹膜透析流出物中NGAL和IL-6位準的增加，同時顯示先天免疫的活化和腹膜中產生宿主防禦現象二者，在腹膜炎開始時啟動。
在某些描述的實施例中，該裝置亦可僅使用革蘭氏陽性發炎標誌物，以額外技術。例如，在某些實施例中，將濁度偵測技術(例如，RRI的濁度偵測技術)和一結合分子(其可與指示病原體存在的標誌物結合)組合使用，可避免使用結合分子作為發炎標誌物。
因此，在某些實施例中，描述一種在腹膜透析患者個體中治療腹膜炎的方法，該方法包含：首先決定腹膜透析流出物中是否存在濁度、分析該個體的腹膜透析流出物以確定感染性微生物的種類(例如，革蘭氏(+)、革蘭氏(-)及/或真菌感染)、之後向該個體投予適當的抗生素，以治療腹膜炎。
在某些實施例中，濁度偵測技術可和一結合分子(其可與指示病原體存在的標誌物結合)，以及一與發炎標誌物結合之結合分子組合使用。此種指示物之組合可為患者或臨床醫生提供額外的好處，尤其是在感染的早期診斷和感染的特定因子的早期鑑定。
肽聚醣是細菌細胞壁的關鍵成分，因此可作為細菌感染的可靠標誌物，用於與發炎及/或感染的其他原因區分開。
脂磷壁酸(“LTA”)是革蘭氏陽性細菌包膜的磷酸甘油表面聚合物成分。LTA經由其醣脂錨定在膜上，並帶有一延伸到細胞壁肽聚醣層中的多醣鏈。在革蘭氏陽性細菌生長期間，LTA會自動釋放到培養基中。LTA作為一種免疫活化劑，其特性與革蘭氏陰性細菌的脂多醣(LPS)非常相似。LTA結合至CD14並主要經類鐸(Toll-like)受器2觸發活化。儘管LTA被內化並運輸到高基氏體，但回應LTA的細胞活化發生在細胞表面。
特異性結合至LTA的抗體可容易地商購獲得。例如，小鼠單株抗體可得自ThermoFisher Scientific，目錄號MA1-40134。MA1-40134偵測革蘭氏陽性細菌樣本中的LTA，並已成功用於西方印跡、ELISA、流式細胞術、免疫螢光和免疫組織化學(冷凍)應用。另一種小鼠單株抗體(IgG3)可得自Genway Biotech, Inc. (San Diego, CA, US)，商品目錄號GWB-9E3242。其他小鼠單株LTA抗體可得自LifeSpan Biosciences, Inc. (Seattle, WA, US)，目錄號LS-C102921、LS-C102920、LS-C202488和LS-C757317。
LPS是革蘭氏陰性細菌的細胞壁成分。特異性結合至LPS的抗體可容易地商購獲得。例如，兔多株抗體製劑可得自Cloud-Clone Corp.，商品號PAB526Ge01，其具有在免疫組織化學染色和西方印跡法中辨識出LPS的能力。脂多醣(LPS)小鼠單株抗體可得自Biomatik (Cambridge，Ontario，CA)，目錄號CAU29364。
β-葡聚醣是真菌的細胞壁成分。特異性結合至β-葡聚醣的抗體可容易地商購獲得。亦請參見美國專利7,893,219，Cassone等人(2011年2月22日)，其內容經由引用合併於此。
LTA、LPS和β-葡聚醣分別是革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和真菌的細胞壁成分。患者腹膜透析流出物中存在此種細胞壁成分，既能指示感染正在發生，亦能指示致病因子(causative agent)的特定類型。
在某些實施例中，可偵測其他特異性抗原以指示腹膜透析流出物中特定病原體(例如細菌)種類的存在。通常，這些特定的病原體選自由金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、假單胞菌( Pseudomonas sp.)、表皮葡萄球菌( Staphylococcus epidermidis)、溶血性葡萄球菌( Staphylococcus haemolyticus)、抗萬古黴素腸球菌屬(vancomycin-resistant enterococci)、念珠菌屬( Candida sp.)、大腸桿菌( Escherichia coli)，及其混合物組成之群組。
例如，溶葡萄球菌素(lysostaphin)可用於偵測金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)，而外毒素A可用於偵測假單胞菌屬( Pseudomonasspec.)。單株和多株抗溶葡萄球菌素抗體可分別購自Antibody Research Corporation (St. Peters, MO, US)，商品名分別為SKU 111145和SKU 111135。兔產生的多株抗假單胞菌外毒素A之抗體可得自Sigma-Aldrich/Millipore SiGMa，其MDL編號為MFCD00162779。同樣的，金黃葡萄球菌( Staph. aureus)-特異性肽聚醣可特別用於偵測PDE中的金黃葡萄球菌( Staph. aureus)。單株抗體可得自QED Biosciences, Inc. (San Diego, CA, US)，目錄號15702、15703和15704；可得自Meridian Life Science, Inc. (Memphis, TN, US)，目錄號C55570M，並可得自Abcam, Inc. (Cambridge, MA, US)，商品名ab37644。這些抗體可辨識金黃葡萄球菌( Staph. aureus)的肽聚醣、蛋白A-陰性金黃葡萄球菌( Staph. aureus)，以及表皮葡萄球菌( Staph. Epidermidis) 。治療處方：
用於治療腹膜炎的單一試劑抗生素包括厄他培南(ertapenem，INVANZ TM)、頭孢西丁(cefoxitin)、多立培南(doripenem，DORIBAX TM)、亞胺培南/西司他丁(imipenem/cilastatin，PRIMAXIN TM)、厄他培南(ertapenem)、亞胺培南/西司他丁(imipenem/cilastatin)、美羅培南(meropenem ，MERREM TM)、莫西沙星(moxifloxacin，AVELOX TM)、哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam，ZOSYN TM)、替卡西林/克拉維酸鹽(ticarcillin/clavulanate)、哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam)、替卡西林/克拉維酸鹽(ticarcillin/clavulanate ，TIMENTIN TM)和替加環素(tigecycline，TYGACIL TM)。
組合治療的抗生素包括頭孢吡肟(cefepime，MAXIPIME TM)、頭孢噻肟(cefotaxime，CLAFORAN TM)、頭孢他啶(ceftazidime，FORTAZ TM)或頭孢曲松(ceftriaxone，ROCEPHIN TM)，係與甲硝唑(metronidazole，FLAGYL TM)一同使用。或頭孢唑林(cefazolin)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢曲松(ceftriaxone)、環丙沙星(ciprofloxacin，CIPRO TM)、左氧氟沙星(levofloxacin，LEVAQUIN TM)，係與甲硝唑(metronidazole)一同使用。或頭孢吡肟(cefepime)、頭孢他啶(ceftazidime)、環丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)，係與甲硝唑(metronidazole)一同使用。或慶大黴素(gentamicin)或妥布黴素(tobramycin)，係與克林黴素(clindamycin，CLEOCINTM)或甲硝唑(metronidazole)(含或不含胺芐青黴素)一同使用。此類抗生素通常按照每一已建立的流程投予。
在治療腹膜炎中，含有亞胺培南(imipenem)、哌拉西林(piperacillin)/他唑巴坦(tazobactam)，以及一胺基糖苷類和甲硝唑(metronidazole)組合物的處方通常是有效的。
假單胞菌屬( Pseudomonassp.)的抗生素治療通常涉及一或多種以下抗生素的投予：頭孢他啶(ceftazidime)、環丙沙星(ciprofloxacin)或左氧氟沙星(levofloxacin)、慶大黴素(gentamicin)、頭孢吡肟(cefepime)、胺曲南(aztreonam)、碳青黴烯(carbapenems)、替卡西林(ticarcillin)及/或脲基青黴素(ureido penicillins)。
抗青黴素酶的青黴素(氟氯西林(flucloxacillin)、雙氯西林(dicloxacillin))是用於治療甲氧西林(methicillin)-易感性金黃葡萄球菌( S. aureus，“MSSA”)嚴重感染的抗生素，然而第一代頭孢菌素(頭孢唑林(cefazolin)、頭孢菌素(cephalothin)和頭孢胺芐(cephalexin))、克林黴素(clindamycin)、林可黴素(lincomycin)和紅黴素(erythromycin)係用於較不嚴重的MSSA感染或青黴素超敏感患者。所有嚴重的MRSA感染均應使用非經腸胃之萬古黴素(vancomycin)或替考拉寧(teicoplanin)治療。MRSA的醫院菌株通常具有多重抗藥性(“mrMRSA”)；mrMRSA菌株可以兩種口服抗菌藥(例如利福平(rifampicin)和夫西地酸(fusidic acid))組合治療。林可醯胺(Lincosamides)(克林黴素(clindamycin)、林可黴素(lincomycin))，或科曲唑(cotrimoxazole)可用於治療較不嚴重的MRSA感染。抗生素如利奈唑胺(linezolid)和奎奴普丁(quinupristin)/達福普汀(dalfopristin)具有抗葡萄球菌活性。 側向流動裝置：
側向流動試驗(“LFA”)(也稱為側向流動測試(“LFT”)、側向流動裝置(“LFD”)、側向流動免疫試驗(“LFIA”)、側向流動免疫層析試驗、“浸入棒”、測試筆、快速/快速測試或測試條)，是一種易於使用的診斷裝置，用於確認目標分析物的存在與否，例如人類或動物中的病原體或生物標誌物。
側向流動試驗通常具有一控制線以確認測試工作正常，以及一或多條目標或測試線。它們旨在結合直觀的使用者流程，並只需進行最少的訓練即可操作。它們可以定性、目視讀取或定量，當與讀取器技術如ADxLR5 ®結合使用時。
側向流動測試被廣泛用於人體健康中的即時檢驗。可由醫療保健專業人員或患者，在各種環境包括實驗室、診所或家庭中進行。
可將側向流動試驗開發為以浸入棒形式或以容置卡匣形式使用。浸入棒和容置測試將以類似的方式工作，具體取決於產業、樣本矩陣和市場需求。
儘管“競爭性試驗”可在本文中採用(例如，藉由利用如離心的富集方法以增加偵測的靈敏度)，但通常較佳使用夾層(或“非競爭性”)試驗。在非競爭性免疫試驗形式中，陽性測試通常以在測試線位置出現彩色線來表示。非競爭性免疫分析形式非常適合具有複數個抗原位點的大分子量分析物。一般而言，與競爭形式相較，非競爭性免疫試驗具有較低的偵測極限(增強的分析靈敏度)。通常，與競爭性試驗形式之奈克/mL(十億分之一)相較，非競爭性免疫試驗可偵測到皮克/mL(兆分之一)的數量級。
側向動裝置通常利用免疫試驗技術，其使用硝化纖維素膜、彩色乳膠奈米顆粒(或標記物(label)如磁珠或彩色苯乙烯球)和抗體，用於快速分析(請見如圖1)。
當將來自腹膜透析流出物的樣本加至該側向流動裝置時，樣本會沿著測試裝置流動，穿過該共軛物墊進入硝化纖維素膜，然後到達吸收墊上以吸收過量的樣本。
樣本墊作為吸收過程的第一階段，且在某些情況下包含一過濾器以確保樣本的精確和受控流動。儲存共軛標記物和抗體的共軛物墊則會接收樣本。若存在標靶，則固定的共軛抗體和標記物會與該標靶結合，並持續沿測試移動。
當樣本沿著裝置移動時，位於硝化纖維素膜上的結合試劑會在測試線上與標靶結合。形成彩色線，且線的密度根據存在的標靶量而變化。一些標靶可能需要定量以決定標靶濃度，例如使用讀取儀。
多重側向流動試驗、相關方法和裝置係揭示於U.S. 20050250141A1，Lambert等人(2005年11月10日)，該文獻的內容經由引用併入本文，該試驗能夠同時偵測多種分析物。亦請參見美國專利號6,924,153 B1，Boehringer等人提申(2005年8月2日)、美國專利號8,128,871 B2，Petruno等人提申(2012年3月6日)，以及美國專利號7,785,899 B2，Saul等人提申(2005年2月18日)，每一者之內容均經由引用併入本文，描述用於偵測多種分析物的各種側向流動測試套組。
與側向流動裝置一起使用的共軛標記物包括：膠體金、纖維素奈米珠、螢光乳膠、順磁性顆粒、上轉換(up-converting)螢光物質和各種螢光標記物。
在某些實施例中，若例如在側向流試驗中抗體的特異性不足，則藉由乾式化學偵測細胞壁成分。乾式化學係基於對細胞壁成分的特異性辨識，例如藉由酵素。
此外，可使用更複雜的系統來獲取定量數據而非定性數據。例如，可將免疫螢光技術與讀取儀一起用於測量腹膜透析流出物中標誌物的量，以藉由將獲得的數值與預設的臨界值進行比較，來向患者和臨床醫生提供更多信息。
每一生物標誌物或細胞壁成分的偵測較佳在單一通道中進行，儘管所有偵測藉由使用同一腹膜透析流出物樣本而同時進行。這樣的設計可防止生物標誌物或細胞壁成分之間的交叉反應。
較佳於每一通道加入腹膜透析流出物樣本。然而，替代地，可將一個以上的通道彼此連接，以避免重複加入膜透析流出物樣本。因此，係描述一種用於在透析流出物中，特別是在腹膜透析流出物中測試腹膜炎的即時裝置和試驗，提供優於常規試驗的若干優點，並增進腹膜炎的管理。該裝置和方法不昂貴、快速，且病人或臨床醫生易於使用，僅須一些訓練。亦描述一種用於此種測試的裝置和方法，其將迅速允許辨識出腹膜炎或其他感染的特定微生物、減少確認腹膜炎診斷所需的時間、加速最佳治療處方的早期決定(例如，特定的抗生素治療或混合療法)，並有可能完全取代培養測試和醫院實驗室，因為其測試敏感性和特異性均等同於實驗室方法。
一個特別的優點是，所揭示的裝置和試驗在單一、不昂貴且易於使用的裝置中，將發炎標誌物測試和特異性感染物測試結合在一起。與先前技術相較，該裝置和試驗為患者和臨床醫生提供有關感染和適當腹膜炎管理的實質上更多的信息。例如，僅查看發炎狀態的測試僅依賴於非特異性感染標誌物。即使該測試對一或多種發炎標誌物呈陽性反應(單獨)，臨床醫生也無法獲得有關要開立何種特定治療(例如特定類型的抗生素)的重要信息。所揭示的試驗加入發炎標誌物之因子特異性測試(例如革蘭氏狀態、特定細菌、真菌等)，大幅提高病原體相關性腹膜炎診斷的可靠性，同時降低執行最適當療法所需的時間。此外，所揭示的試驗和裝置的PDE樣本，在被施加到裝置之前不一定需要預處理或任何特殊處理，因此患者可立即在家中進行完整測試。因此，臨床醫生毋需針對普遍確認的腹膜炎而開出例如經驗性、廣譜抗生素，而是可以快速開出最適合治療已知革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌感染的靶向抗生素。該組合裝置比兩種裝置或多種試驗更便宜、更易於使用和解讀，且在大多數情況下，可在不到10分鐘的時間內讀取結果。
以此種方式，患者可藉由例如投予最適合其感染的抗生素而更快地治療。在某些情況下，在家中的患者可依此測試自己的PDE、辨識出特異性陽性結果並報告給臨床醫生，並被指示立即開始標靶療程。即使還沒有其他典型的感染跡象(例如，疼痛、發燒、渾濁狀流出物)，也可以啟動這種療法。此外，例如，PD患者的腹膜炎嚴重程度和持續時間可降低，因而使他們停留於PD的時間更長，而無需採用更具侵入形式的透析，例如血液透析。亦降低不合適的抗生素(即經驗性、廣譜抗生素，其中需要進行更具標靶性的治療)的使用，因此降低人群中抗生素抗藥菌的發生率。
在某些實施例中可拍攝測試結果的照片，該照片被傳送給健康護理從業者。在某些實施例中，手機“app”可用於分析結果，並向患者提供例如“請致電您的醫療保健提供者”或“腹膜炎確認”的註釋。在某些實施例中，這可進一步包括對分析物的圖片進行分析，使用如國際專利號：PCT/EP2017/000803，公開於2018年1月11日，描述的技術，其內容通過引用併入本文。
圖1至圖5和圖7說明本發明的側向流動裝置的各種實施例。在所示案例中，該裝置配置為可於單一測試中偵測NGAL、LTA，β-葡聚醣、LPS和IL-6。
如圖1所示，一定體積的分析物(例如，PDE)被置入測試條的孔洞部分。PDE從孔洞開始流動(例如，藉由毛細作用)，沿著測試條向下流動，並與測試條上結合的適當標記抗體共軛物交互作用。將具有與標記抗體相同特異性的其他抗體固定在試紙上(固相)。若PDE中存在適當的抗原(例如NGAL、LTA、β-葡聚醣、LPS或IL-6)，它將與標記的抗體結合，並在固相抗體存在的條帶部分形成夾層複合物，且該夾層複合物將為可偵測的。更描繪一條控制線，以確保POCT正常進行。過量的試劑會通過測試條的末端。
圖2和圖3代表本發明(和圖1)的側向流動裝置的各種設置，包括四個樣本孔和四個大致平行且相鄰的通道，其被配置為偵測LTA、LPS、NGAL和IL-6。此實施例的優點是佔用相對較小的空間，同時需要施加四個相對較小體積的PDE樣本來利用所有四個通道。如圖2和3所示，該控制線在孔洞之遠端，而測試線在孔洞之近端。
圖4和圖5表示本發明的側向流動裝置的另一構造，其包括單一、中心樣本孔和從中心孔輻射開的四個通道，同樣配置為偵測LTA、LPS、NGAL和IL-6。此實施例的優點是患者或臨床醫生僅需施加一個PDE樣本。
根據某些實施例，圖2和圖4亦指示一種橫向流動裝置的可能尺寸(以毫米為單位)以及這種尺寸的範圍。例如，圖2中描繪的設備可具有寬度38 mm (範圍為30~60 mm，公差為-1~+1)、高度70 mm (範圍為55~100 mm，公差為-1~+1)、指示距離60 mm (範圍為50~80 mm，公差為-1~+1)，以及指示通道寬度4 mm (範圍為2.5~8 mm，公差為-1~+1)。圖4描繪的裝置可具有高度與寬度90 mm(範圍為70~120 mm，公差為-1~+1)、指示距離60 mm (範圍為50~80 mm，公差為-1~+1)，以及指示通道寬度具範圍為2.5~8 mm，公差為-1~+1。
圖7顯示一V形構造(例如，FRESENIUS TM商標)，將樣本施加到每一V形的中心。之後樣本沿著複數個通道側向或縱向流至測試線，在該處適當與結合試劑會與樣本中可能存在的抗原結合。
較佳在相同時間點(例如15-30分鐘後)讀取所有分析物的結果。或者，可連續讀取結果。
所描述的樣本為腹膜透析流出物。在一實施例中，腹膜透析流出物在排出後直接使用，以偵測一或多種感染標誌物。在一較佳實施例中，腹膜透析流出物首先經濃縮及/或過濾，之後將其用於偵測一或多種感染標誌物。
裝置形狀沒有限制，只要各個通道可維持即可。
儘管側向流免疫試驗為較佳，然而其他技術例如定量免疫螢光、乾式化學等亦可於此採用。
方法：在某些實施例中，患者在診所呈現出渾濁的腹膜透析流出物及/或其他感染症狀之後，執行者可在WBC計數和培養樣本送件之前快速使用該裝置。然後，執行者可解讀該結果，並向腎臟科醫生或主管提供測試結果、症狀、病史等，以及可能的抗生素處方。
此外，該裝置可由患者在家中使用。患者應立即將結果告知臨床醫生，並按照建議的治療說明進行操作，例如口服抗生素，或將抗生素直接添加到新鮮的透析液中以進行下一次交換。例如，這可能發生在診所工作時間以外，或用於住在偏遠地區的患者，而無需在執行必要的治療處方之前等待就診。
此外，該裝置可由臨床醫生或患者使用，以決定所開立的治療是否有效。
在實施例中，該裝置係使用作為整合護理管理流程的一部分。在某些實施例中，由該裝置決定的結果係由一或多個可攜式電子裝置(例如，智慧型手機app、電腦、平板電腦等)處理，並可與數位設備相連。之後結果可基於雲端或網絡的通信路徑整合至遠端的臨床醫生、實驗室或其他衛生專業人員，以進行進一步的評估和指導。然後，此遠端專業人員可指導患者或現場專業人員採取適當的臨床行動，例如指導立即投予適當的抗生素或其他療法、指導患者就診或指示適當的護理。在某些實施例中，遠端專業人員可根據適當處方，發送電子代碼打開如患者家裡的藥品保險箱。
在其他實施例中，係揭示利用所描述的裝置及/或方法之一或多個臨床流程(即，“決策樹”)。此種流程可為“測試結果驅動法”(圖8)，例如，回應於如濁度之類的可觀察感染指標而啟動，或者可為“症狀驅動法”(圖9)，例如由患者症狀(例如疼痛或發燒)而啟動。
圖8的“測試結果驅動法”適用於在每次治療中自動捕捉濁度，或患者在透析治療後人工進行濁度測試的情況。如圖8所示，若濁度為正(“濁度+”20)，則進行本文所述的即時測試(Point of Care Test，“POCT”)。
若POCT為正(“POCT+”22)，則分析POCT的結果以決定感染的病因，並進行適當的追蹤。例如，若感染的病因學尚無定論24，則要求患者尋求臨床評估26。若確定感染病因是革蘭氏陽性細菌(“Gram +”)，則為患者開立適當的抗生素28 (或其他可接受的治療)。若確定感染病因是革蘭氏陰性細菌(“Gram -”)，則為患者開立適當的抗生素30(或其他可接受的治療)。
若POCT為負(“POCT-”32)，則“無進一步動作”34可能需針對患者進行。然而，對於該圖的”POCT-”圖文框下的 “無進一步動作*”字段，係假設如即時測試條的特異性足以排除腹膜炎(例如細菌和真菌二者)。因此，在濁度為正20而POCT為負32的情況下，決策樹表示“無進一步動作”，但也可以根據所使用的特定POCT進行“尋求臨床評估”。例如，若POCT僅辨識出細菌性腹膜炎，而無其他原因的腹膜炎(例如真菌性腹膜炎)，則患者仍應進行臨床評估以確定渾濁的病因(未顯示)。類似的情況發生在濁度為負值(或不確定) 36但症狀陽性38的情況下，即使POCT為負40，其中決策樹指出“無進一步行動*”42，仍應考慮細菌性腹膜炎以外的其他病因，並可能需要臨床評估。
在圖8中，當濁度為負值或不確定36、症狀為正38、POCT為正44時，則治療與之前相同。例如，若感染病因學尚無定論46，則要求患者尋求臨床評估48。若確定感染的病因是革蘭氏陽性細菌(“Gram +”)，則為患者開立適當的抗生素50 (或其他可接受的治療)。若確定感染的病因是革蘭氏陰性細菌(“Gram -”)，則為患者開立適當的抗生素52(或其他可接受的治療)。
在圖8中，若濁度為負值或不確定36且症狀為負54，則通常不需要採取進一步措施56。
圖9的“由症狀驅動法”可用於例如，當沒有自動捕捉濁度時，或者當患者在進行他或她的治療後並未進行濁度測試時。在這種情況下，當症狀為陰性58時，則無需採取進一步措施60。然而，當症狀為陽性62，濁度測試結果為陰性64時，則需要進行進一步的臨床評估66。
如圖9所示，當症狀為陽性62且濁度測試為陽性或未進行68，較佳進行POCT。
在圖9中，若POCT為負70，則可能需要無進一步動作72。然而，同樣的，對於決策樹圖文框”POCT-”70下的“無進一步行動*”圖文框72，再次假設POCT條的特異性足以排除腹膜炎的所有病因。與圖8的測試結果驅動法一樣，在圖9中的“症狀驅動法”決策樹中，在症狀正62且濁度呈陽性(或無法取得)而POCT負72的情況下，建議並非“無進一步行動”，而是“尋求臨床評估”(未顯示)，以排除例如真菌病因。
在圖9中，當濁度為正或無法取得68且POCT為正74時，該治療為測試結果驅動法。例如，若感染的病因尚無定論76，則要求患者尋求臨床評估78。若確定感染的病因是革蘭氏陽性細菌(“Gram +”)，則為患者開立適當的抗生素80(或其他可接受的治療方法)。若確定感染的病因是革蘭氏陰性細菌(“Gram -”)，則為患者開立適當的抗生素82(或其他可接受的治療方法)。
同樣地，在症狀驅動法中，當症狀為正值而濁度為負值時，仍然可有益地利用POCT來幫助患者(未顯示)。若POCT結果為陽性，則可使用相同的後續治療。若POCT為陰性，則使用“尋求臨床評估”。
在決策樹的替代實施例中，可完全刪去濁度作為必需的測試，且實施POCT測試的決定可完全由症狀的存在或不存在來驅動。此可能為，例如，在濁度數據尚無定論或不可靠的情況下，或者在臨床醫生或患者希望加快POCT測試的情況下，例如當患者具有特定類型或類型組的腹膜炎感染病史，且主要目的是迅速縮小最可能的感染原因範圍。
在各種方法中，若將POCT設置為偵測例如真菌感染的存在(未顯示)，且此測試呈陽性，則可開立適當的抗真菌劑及/或療法。
此種流程的優點在於可遠端執行，例如由患者在家中或在遠端診所中進行，且可利用即時測試裝置來快速辨識感染的致病因子，並快速地建立適當的治療(例如，特定抗生素)。在其他情況下，這些流程可在診所中進行，而執行人員幾乎不需要額外的培訓，然而與傳統流程相較，仍可減少進行適當治療的時間。
藉由以下說明性範例進一步描述本發明。 範例I 圖1-3的試驗是將以下抗體成分加入紙系(例如硝化纖維素)LFD中製成的：
結合分子 供應商  產品號 參考文獻
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抗-NGAL R&D Systems 614 McKinley Place NE Minneapolis, MN 55413 MAB17571 (捕捉)  
  R&D Systems 614 McKinley Place NE Minneapolis, MN 55413 BAF1757 (偵測) J. Neurosci.2016; 36(20):5608-22
  Abcam 1 Kendall Square, Suite B2304 Cambridge, MA 02139-1517 ab220126 (對)  
抗-LPS Meridian Bioscience 3471 River Hills Drive Cincinnati, OH 45244 C55308M  
抗-LTA Meridian Bioscience 3471 River Hills Drive Cincinnati, OH 45244 C65380M ٭  
  Meridian Bioscience 3471 River Hills Drive Cincinnati, OH 45244 C65813M ٭  
抗-金黃色葡萄球菌( Staph. Aureus)(肽聚醣) Abcam 1 Kendall Square, Suite B2304 Cambridge, MA 02139-1517 ab37644  
  QED Bioscience, Inc. 10919 Technology Pl # C, San Diego, CA 92127 15704  
  Meridian Life Science, Inc. 5171 Wilfong Road Memphis, TN 38134   C55570M (偵測)  
  Invitrogen, Inc. Waltham, MA MA1-10708 和 MA1-10709 (對)  
抗體列表：捕捉抗體、偵測抗體(與金結合之BSA)、抗-生物素金抗體。
將三滴PDE樣本置於圖1所示裝置中每一孔的樣本接收位置，流體流入每一通道，並藉由擴散至整個硝化纖維素紙而移動到含有捕捉(即一抗)抗體的捕捉區，之後從那裡繼續流到具有偵測視窗之包含一或多個偵測(即二級)抗體之偵測區。結果可以目測或使用光學讀取儀、移動設備或類似設備讀取，以決定PDE樣本是否對一或多種感染及/或發炎標誌物呈陽性反應。 範例II
流程-在透析診所或家中的快速PD相關性腹膜炎診斷(依照圖6的流程圖)。
背景：當PD患者顯示出腹膜炎的任一徵兆(例如，渾濁狀PDE、腹痛及/或發燒)時，他或她將盡快去透析診所或就醫。在透析診所就診後，護士或其他醫療照護專業人員會將PD流出物排入引流袋，並收集樣本進行常規測試，例如細胞計數、革蘭氏染色和培養。此外，PD患者可在去透析診所或就醫之前使用所揭示的試驗和裝置來收集和測試樣本。之後，可對同一PDE樣本進行快速測試，在進行常規測試之前 (例如細胞培養、革蘭氏染色、細胞計數等)。
1. 流程 1.1 裝置與試劑1.  PPE (“個人保護裝備”) 2.  測試套組包含： o   具有預附針頭之無菌50 mL注射器 o   具有預附針頭之無菌10 mL注射器 o   兩個透明的校準滴管 o   無菌50 mL錐形管，頂部預先裝有過濾器 o   無菌50 mL錐形管 o   裝有10 mL沖提緩衝液的小瓶 o   測試裝置 1.2 流程1.    保持手部衛生並戴上PPE。 2.    使用清潔劑清潔工作表面。 3.    拆開測試套件的包裝並收集要使用的材料。 4.    按照診所的標準操作程序將PDE排入引流袋並貼上標籤。 5.    使用無菌注射器經由引流袋上的注射口抽取45 mL PDE樣本。 6.    丟棄針頭。 7.    將注射器連接到預先裝有50 mL錐形管的圓形過濾器(Ø 50 mm)上。 8.    將45 mL PDE樣本經由過濾器推入錐形管。 9.    取出測試裝置並將其放在平坦、乾淨的工作表面上。 10.   拆卸過濾器，然後將其組裝到另一個50 mL無菌錐形管中。 11.   轉移5毫升在步驟8中收集的PDE樣本，並將5滴(~ 0.25 mL)分配到範例I的測試裝置上的第一個樣本容器中。 12.   等待15分鐘，藉由檢查兩行的顏色來讀取結果。 13.   在等待時間內，使用另一個注射器收集小瓶中的所有沖提緩衝液。 14.   丟棄針頭 15.   將注射器連接到過濾器(其在步驟10組裝到另一個錐形管中)上。 16.   將沖提緩衝液通過過濾器推入該錐形管。 17.   轉移5毫升在步驟16中收集的PDE樣本，並將5滴(~ 0.25 mL)分配到測試裝置上的第二個樣本容器中。 18.   再等待10-15分鐘以讀取結果。 將引流袋送到實驗室進行其他測試。 範例III 以UF膜進行富集
將25 ml的PDE放入離心用的容器中，其藉由截留分子量為29,000的超濾(“UF”)膜分離為上腔室和下腔室。將容器加蓋，放入離心機中並轉動(x 4000g)。PDE通過UF膜過濾，並從上腔室推到下腔室，形成富集的PDE。
將幾滴經富集的PDE置入範例I裝置之IL-6/NGAL盤的樣本口，並決定任一反應。
將UF膜與沖提緩衝液混合，並將幾滴置於實施例I裝置之LPS/LTA盤的樣本口，並決定任一反應。 範例IV 偵測PDE樣本中發炎和革蘭氏狀態的標誌物
共收集87個PDE樣本，包括9例腹膜炎、78例非腹膜炎。經由JiuQiang生化NGAL測試和SIEMENS化學發光IL-6測試，決定每一樣本的NGAL和IL-6參考位準。
圖2和3的裝置係用於分析該樣本。該試驗具有4個測試條，分別對應於NGAL、IL-6、LTA和LPS。NGAL和IL-6使用作為腹膜炎的發炎指標。LTA係使用作為革蘭氏陽性細菌感染的指標。LPS使用作為革蘭氏陰性細菌感染的指標，每一相關的測試條均搭配有以下試劑： NGAL: a)對照線：山東ShuoJing山羊抗小鼠抗體 b)測試線：南京GenScript NGAL抗體(4C10A7) c)共軛物：南京GenScript NGAL抗體(5A9D12) d)硝化纖維素膜：Millipore HF13502S18 e)NGAL的偵測極限最佳化至80 ng/ml。 IL-6 a)    對照線：山東ShuoJing山羊抗小鼠抗體 b)    測試線：Novoprotein (DA012) c)    共軛物：Novoprotein (DA011) d)    硝化纖維素膜：Millipore HF13502S18 e)    IL-6測試的偵測極限最佳化為200 pg/ml和300 pg/ml LTA a)    對照線：山東ShuoJing山羊抗小鼠抗體 b)    測試線：鏈黴親和素Hangzhou KuaiGe技術(20190307-1) c)    共軛物：Biorbyt (orb23891) d)    生物素化：Biorbyt (orb23822) e)    硝化纖維素膜：Millipore HF13502S18 LPS a)    對照線： HangZhou LongJi biotech (lot 181114) b)    測試線： Thermo Fisher PA1-73178 c)    共軛物： Thermo Fisher PA1-28903 d)    硝化纖維素膜： Millipore HF13502S18
測試結果目視讀取，若對照線是陽性而測試線是陰性，則結果為陰性；若對照線和測試線皆為陽性，則結果為陽性。請見圖1-3。
所有87個PDE樣本皆以圖1裝置測試，進行NGAL測試和IL-6測試。78個非腹膜炎樣本進行LTA和LPS測試。下表顯示結果。 表A – 腹膜透析流出物之NGAL、IL-6、LTA與LPS特異性
NGAL IL-6 200 NGAL+IL-6 200 LTA LPS
測試數目 78 78 78 78 18
陰性結果 56 66 70 75 18
特異性 56/78 66/78 70/78 75/78 18/18
71.8% 84.6% 89.7% 96.6% 100%
表B – PDE中NGAL與IL-6之敏感度
  NGAL IL-6 200 NGAL/IL-6 200
測試數目   9 9 9
陽性結果   9 9 9
敏感度   9/9 9/9 9/9
  100.0% 100.0% 100.0%
可以看出，組合NGAL 80 ng/ml和IL-6 200 pg/ml的組合指示劑，在腹膜炎偵測中對這些標誌物表現出最佳的敏感度和特異性。在相同的實驗中，LTA的特異性為96.6%，LPS的特異性為100%。
所述PDE樣本之LTA和LPS的敏感性係使用加標(spiked)細菌之腹膜透析樣本和陰性腹膜透析樣本進行比較。使用三種通常與腹膜炎相關的革蘭氏陽性細菌：金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) (CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌( S taphylococcus epidermidis)(ATCC 12228)和β溶血性鏈球菌(beta hemolytic Streptococcus) (CMCC(B)32210)。選擇兩種通常與腹膜炎相關的革蘭氏陰性細菌：大腸桿菌( E. coli) O157：H7(ATCC35150)和銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 27853)。在平盤培養基上培養細菌。將其富集後，菌落從平盤培養基移至磷酸鹽緩衝液中。細菌濃度使用McIntosh濁度決定。將每一種濃縮細菌溶液加到10個單獨的PDE中。就金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌( S taphylococcus epidermidis)和β溶血性鏈球菌(beta hemolytic Streptococcus)而言，將細菌稀釋至1 x 10 7CFU/ml。將大腸桿菌O157：H7稀釋至5×10 6CFU/ml。將銅綠假單胞菌( P. aeruginosa)稀釋至1×10 9CFU/ml。總共產生50個加標(spiked)的腹膜炎樣本。30種PDE係“加標(spiked)”革蘭氏陽性細菌。20種PDE係“加標(spiked)”革蘭氏陰性細菌。每一樣本都經過LTA測試和LPS測試。下表摘錄測試結果： 表C –加標革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的PD樣本中LTA和LPS的偵測極限
革蘭氏 細菌 CFU/ml LTA LPS
      陰性 陽性 陰性 陽性
陽性 金黃色葡萄球菌( S. aureus) 1*10 7 0/10 10/10 10/10 0/10
表皮葡萄球菌( S. epidermidis) 1*10 7 0/10 10/10 10/10 0/10
β溶血性鏈球菌(beta hemolytic Streptococcus) 1*10 7 0/10 10/10 10/10 0/10
陰性 大腸桿菌( E. coli)O157:H7 5*10 6 10/10 0/10 0/10 10/10
銅綠假單胞菌( P. aeruginosa) 1*10 9 10/10 0/10 0/10 10/10
LTA對革蘭氏陽性細菌的敏感性為30/30＝100%。LPS對革蘭氏陰性菌的敏感性為20/20=100%。在革蘭氏陽性菌和LPS測試之間或革蘭氏陰性菌和LTA測試之間未發現交叉反應。 範例V
另外收集19個非腹膜炎PDE樣本，並測試其NGAL、IL-6、LTA和LPS特異性，如範例IV中所述，使用Magpix對NGAL和IL-6進行定量。表D顯示結果： 表D-腹膜透析流出液中NGAL、IL-6、LTA和LPS的特異性
  NGAL IL-6 200 NGAL/IL-6 200 LTA LPS
測試數目 19 19 19 19 19
陰性結果 18 19 19 19 19
特異性 18/19 19/19 19/19 19/19 19/19
94.7% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0%
NGAL80 ng/ml和IL-6 200 pg/ml的組合對正常患者的19個PDE呈現100%特異性。LTA和LPS測試對於19個PDE亦呈現100%特異性。 範例VI – 合併之敏感度與特異性
彙集範例V和範例IV的結果，以衍生出表E、F和G所示的複合敏感性和特異性。 表E – 合併之特異性
NGAL IL-6 200 NGAL/IL-6 200 LTA LPS
測試數目 97 97 97 97 37
陰性結果 74 85 89 94 37
特異性 74/97 85/97 89/97 94/97 37/37
76.3% 87.6% 91.8% 96.9% 100.0%
表F – 合併之敏感度
NGAL IL-6 200 NGAL/IL-6 200
測試數目 9 9 9
陽性結果 9 9 9
敏感度 9/9 9/9 9/9
100.0% 100.0% 100.0%
表G – 陽性和陰性PDE樣本二者之總一致結果
NGAL IL-6 200 NGAL/IL-6 200
測試數目 106 106 106
一致數目 83 94 98
總一致量 83/106 94/106 98/106
78.3% 88.7% 92.5%
該試驗顯示出偵測PDE樣本中腹膜炎的良好能力，特異性為91.8%，敏感度為100%。該試驗亦指出感染的病原體特定類型。可偵測到與腹膜炎相關的最常見細菌病原體，並將其區分為革蘭氏陰性或革蘭氏陽性。 範例VII 特異性偵測與治療
如上所述的試驗/試驗套組(如圖1至圖5所示)經修飾，以包括一結合分子，其特異性結合至指示特定病原體種類存在之抗原，在此範例中，該病原體為金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)，係藉由將標準試驗中使用之一抗體(即LTA、LPS、NGAL、IL-6或β-葡聚醣)，替換為特異於金黃色葡萄球菌的抗體(例如，來自Abcam的ab37644、來自QED Bioscience，Inc.的目錄號15704，或來自Meridian Life Science，Inc.的C55570M)。當確定該個體患有由金黃色葡萄球菌( S. aureus)引起的腹膜炎時，就診斷結果對該個體投予適當的抗生素療法(例如考特莫唑(cotrimoxazole))，以治療腹膜炎。 範例VIII
如圖1與2中所述的試驗/試驗套組[具有四個平行泳道]進行修飾，以包括一可特異性結合至金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)的肽聚醣抗原之抗體 (來自Invitrogen，Inc.的MA1-10708和MA1-10709)，而非LTA-特異性抗體。 “非腹膜炎”PDE樣本(PDE 83-88)(n = 6)、加標(spiked)不同濃度金黃色葡萄球菌( S. aureus)的PDE樣本(n = 6)，和已知對金黃色葡萄球菌( S. aureus)呈培養物陽性的腹膜炎陽性PDE樣本(n = 1)，係使用所述之修飾試驗進行分析。結果顯示在下表中。
Figure 109102865-A0305-02-0034-1
可以看出，所有“非腹膜炎”樣本的金黃色葡萄球菌(S aureus)測試均為陰性(100%特異性)。在加標樣本中偵測出對金黃色葡萄球菌(S aureus)特異的肽聚醣(偵測極限為1 x 106CFU/ml)，在金黃色葡萄球菌(S aureus)陽性培養PDE樣本中亦同。
範例IX
如圖8所示，決策樹/流程係由濁度測試啟動，其可由患者/執行人員啟動(例如使用目視檢查或手機掃描透析袋)，也可使用與透析袋或輸液管整合的一或多個感測器進行監控。適用於本發明之濁度法的範例可見於PCT公開號WO2018/007013，於2017年7月7日提申，標題為“用於偵測腹膜炎症狀的方法和智慧手機”，其內容經由引用併入本文參考資料中。即使在沒有症狀的情況下，也可以啟動此決策樹，因而可比目前常規實施情況更早地偵測到感染。若濁度為正20，則將PD流出物的樣本施加至所揭示的裝置中，以評估革蘭氏狀態。可以根據革蘭氏+或革蘭氏-結果快速啟動適當的抗生素治療，或者，若革蘭氏狀態尚無定論，則可由臨床醫生指導患者進行進一步評估。若POCT測試為負32但濁度測試為陽性，則可指示患者不採取進一步措施(假設沒有症狀)，或尋求進一步的臨床評估34(例如，取決於POCT偵測的寬度，例如真菌感染)。
類似於此決策樹的方式，若濁度是負的或未定論36，則出現症狀38將決定是否應該配置POCT裝置。 範例X 由症狀驅動的患者決策樹
如圖9所示，該決策樹主要是由症狀驅動的，並可在例如不自動捕捉濁度或患者在治療後不進行例行濁度測試的情況下使用。
在此方法中，出現一或多種感染症狀62將指示要進行濁度測試。若濁度為正或無法獲得68，則將指示患者使用該POCT裝置。若POCT裝置報告存在革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌，則可立即實施適當的抗生素治療80、82。若出現症狀62，但無濁度64，則可指示患者進行臨床評估66。然而，此流程的一個優勢是，具有濁度68的有症狀患者能夠快速確定可能的感染原因(革蘭氏陽性或革蘭氏陰性，或甚至特定的細菌、真菌或其他感染原)，甚至在向臨床醫生報告之前，可更快地確定適當的治療方法。
在此方法中，在無症狀58的情況下，將指示患者不採取進一步動作60。然而，在患者正在經歷一或多個症狀62的所有情況下，POCT裝置可能會建議患者確定是否存在有特定的感染原因。
所有引用的參考文獻完整內容經由引用特別併入本發明中。此外，當數量、濃度或其他數值或參數係以範圍、較佳範圍或較佳範圍之上限和較佳範圍之下限列表提供時，這應理解為具體揭示由任何一對範圍上限或較佳值，以及範圍下限或較佳值形成的所有範圍，無論是否單獨公開範圍。
經由考慮本說明書和本文揭示的發明實施例，本發明的其他實施例對於本領域技術人員將是顯而易見的。本說明書和範例旨在僅為示範性，本發明的真正範圍和精神由所附申請專利範圍及其等效範圍指示。
20:濁度+ 22:POCT+ 24:革蘭氏無定論 26:尋求臨床評估 28:投予抗生素 30:投予抗生素 32:POCT- 34:無進一步動作* 36:濁度-或無定論 38:症狀+ 40:POCT- 42:無進一步動作* 44:POCT+ 46:革蘭氏無定論 48:尋求臨床評估 50:投予抗生素 52:投予抗生素 54:症狀- 56:無進一步動作 58:症狀- 60:無進一步動作 62:症狀+ 64:濁度- 66:尋求臨床評估 68:濁度+或無法獲得 70:POCT- 72:無進一步動作* 74:POCT+ 76:革蘭氏無定論 78:尋求臨床評估 80:投予抗生素 82:投予抗生素
圖1至5與7說明本文所述之側向流動裝置之各實施例。 圖6為本發明一方法之流程圖。 圖8為“測試結果驅動法”之流程圖。 圖9為“症狀驅動法”之流程圖。

Claims (26)

  1. 一種用於診斷個體中感染之試驗套組，該試驗套組包含：至少一會與一發炎標誌物(inflammatory marker)特異性地結合之結合分子，該發炎標誌物係在採自該個體之腹膜透析液的一樣本中，至少一會特異性地直接或間接結合至該發炎標誌物或該至少一會與該發炎標誌物特異性地結合之結合分子的具有標記物(label)之結合分子，至少一會與一指示該樣本中一病原體存在的標誌物結合之結合分子，以及至少一會特異性地直接或間接結合至該指示該樣本中該病原體存在的標誌物或該至少一會與該指示該病原體存在的標誌物特異性地結合之結合分子的具有標記物之結合分子。
  2. 如請求項1之試驗套組，其中該等結合分子已整合至一側向流動裝置中。
  3. 如請求項1之試驗套組，其中該病原體係選自於由下列所組成之群組：細菌、真菌及其任一組合。
  4. 如請求項3之試驗套組，其中該細菌為革蘭氏陽性菌。
  5. 如請求項3之試驗套組，其中該細菌為革蘭氏陰性菌。
  6. 一種試驗套組，包含：一會與一指示個體腹膜中發炎反應發作的抗原特異性地結合之結合分子；一會與一指示革蘭氏陽性細菌存在的抗原特異性地結合之結合分子，該抗原包括病原體之一細胞壁成分或溶葡萄球菌素；以及一會與一指示革蘭氏陰性細菌存在的抗原特異性地結合之結合分子，該抗原包括病原體之一細胞壁成分或外毒素。
  7. 如請求項6之試驗套組，更包含：一會與一指示真菌存在的抗原特異性地結合之結合分子。
  8. 如請求項6或7之試驗套組，其中該指示腹膜中發炎反應的抗原係選自於由下列所組成之群組：嗜中性白血球明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)(“NGAL”)、介白素1(“IL-1”)、介白素6(“IL-6”)、介白素8(“IL-8”)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、前降鈣素及C-反應蛋白(“CRP”)。
  9. 如請求項6或7之試驗套組，其中該指示革蘭氏陽性細菌存在的抗原為脂磷壁酸(lipoteichoic acid)(“LTA”)。
  10. 如請求項6或7之試驗套組，其中該指示革蘭氏陰性細菌存在的抗原為脂多醣(“LPS”)。
  11. 如請求項7之試驗套組，其中該指示真菌存在的抗原為β-葡聚醣。
  12. 如請求項6、7或11之試驗套組，更包含：一會與一指示腹膜透析流出物中特定病原體物種存在的抗原特異性結合之結合分子。
  13. 如請求項12之試驗套組，其中該特定病原體係選自於由下列所組成之群組：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、抗甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)、凝固酶陰性葡萄球菌屬(Coagulase-negative staphylococcal species)如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)等、鏈球菌屬(Streptococcus sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、克雷伯菌屬(Klebsiella sp.)、大腸桿菌(Escherichia coli)、念珠菌屬(Candida sp.)、麴菌屬(Aspergillus spec.)、抗萬古黴素腸球菌屬(vancomycin-resistant enterococci)及其混合物。
  14. 如請求項6、7或11之試驗套組，更包含：用於自腹膜透析流出物中過濾、濃縮及/或富集(enrich)抗原之裝置。
  15. 如請求項6、7或11之試驗套組，更包含：一緩衝液，其可自該試驗套組中特異性地沖提出抗原。
  16. 一種體外診斷腹膜透析患者個體中腹膜炎之方法，該方法包含：診斷該個體為患有腹膜炎，包含利用如請求項1-15中任一項之試驗套組分析該個體的腹膜透析流出物。
  17. 一種決定一用於治療腹膜透析患者個體中腹膜炎之適當的抗生素之方法，該方法包含：體外診斷該個體為患有腹膜炎，包含利用如請求項1-15中任一項之試驗套組分析該個體的腹膜透析流出物，以及之後就該診斷來決定擬被投予至該個體之適當的抗生素以治療腹膜炎。
  18. 一種體外診斷腹膜透析患者個體中腹膜炎之方法，該方法包含：在該個體之腹膜透析流出物中偵測一指示該個體腹膜中已有發炎反應發作之抗原；在該腹膜透析流出物中偵測一指示革蘭氏陽性細菌存在之抗原，該抗原包括病原體之一細胞壁成分或溶葡萄球菌素；以及在該腹膜透析流出物中偵測一指示革蘭氏陰性細菌存在之抗原，該抗原包括病原體之一細胞壁成分或外毒素。
  19. 如請求項18之方法，更包含：在該腹膜透析流出物中偵測一指示真菌存在之抗原。
  20. 如請求項18或19之方法，其中選自於由下列所組成之群組的抗原係用於決定該個體是否在腹膜中已有發炎反應發作：嗜中性白血球明膠酶相關脂質運載蛋白(“NGAL”)、介白素1(“IL-1”)、介白素6(“IL-6”)、介白素8 (“IL-8”)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、前降鈣素、C-反應蛋白(“CRP”)及其任一組合。
  21. 如請求項18或19之方法，其中該指示革蘭氏陽性細菌存在之抗原為脂磷壁酸(“LTA”)。
  22. 如請求項18或19之方法，其中該指示革蘭氏陰性細菌存在之抗原為脂多醣(“LPS”)。
  23. 如請求項19之方法，其中該指示真菌存在之抗原為β-葡聚醣。
  24. 如請求項18、19或23之方法，更包含：在該腹膜透析流出物中偵測一指示該腹膜透析流出物中特定病原體物種存在之抗原。
  25. 如請求項24之方法，其中該特定病原體係選自於由下列所組成之群組：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、念珠菌屬(Candida sp.)、抗萬古黴素腸球菌屬(vancomycin-resistant enterococci)及其任一組合。
  26. 如請求項18、19或23之方法，更包含：在偵測該(等)抗原之前，將該腹膜透析流出物過濾、濃縮及/或富集。
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