TWI861166B - Smn1基因之檢測或定量方法 - Google Patents
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Abstract
本發明之目的在於提供一種用以使用乾燥濾紙血檢測及定量作為SMA之致病基因之SMN1基因之同源性缺失（homozygous deletion）的引子、以及關於使用其來特異性檢測、定量SMN1基因之方法。
本發明之藉由即時PCR檢測乾燥濾紙血中之SMN1基因之方法包括下述（A）～（D）之步驟。
（A）於PCR反應用管中添加上述乾燥濾紙血之步驟
（B）於PCR反應用管中添加PCR試劑之步驟，PCR試劑至少包含設計成對SMN2基因之反應未達SMN1基因之1%的引子、聚合酶、dNTP、及嵌入劑或者螢光標記探針
（C）於添加有PCR試劑及上述乾燥濾紙血之管內進行PCR反應之步驟
（D）經時地光學檢測藉由PCR反應擴增之SMN1基因中之標的核酸的步驟
Description
本發明係關於一種用以使用自乾燥濾紙血獲得之一定尺寸之沖裁片，直接藉由即時PCR特異性地檢測及定量沖裁片所含之SMN1基因的方法及該方法中使用之引子。
脊髓性肌肉萎縮症（Spinal Muscular Atrophy；SMA）係以由脊髓之前角細胞之變性所導致的肌肉萎縮及進行性肌肉無力為特徵之下位運動神經元病，被指定為難治性疾病。SMA根據症狀出現之年齡或其程度分為4種類型。其中，出生後6個月左右前發病之I型有時亦稱為新生兒期，容易耽誤診斷，並且症狀容易變得嚴重，I型SMA患者之90%以上或於2歲前死亡，或需要終身佩戴人工呼吸器。又，I型之患病率較高，出生2萬人中約1人患病，已知越早開始治療則越可期待治療效果，繼原發性免疫缺乏之後，要求進行新生兒篩檢。已知I型SMA患者之95%係由於維持運動神經之功能之作用的SMN1（survival of motor neuron 1）基因之同源性缺失（homozygous deletion）而導致，因此篩選對象之基因係SMN1基因。然而，代替該基因作用之SMN2基因之外顯子7之第6號之鹼基自SMN1基因之C變為T，因此成為於剪接時產生外顯子7跳讀（skipping）之因子序列，故較佳為將該單核苷酸多型性作為特異性標的。因此，作為特異性地測定單核苷酸多型性之方法，經常嘗試藉由設計對偶基因特異性引子來確保特異性，但根據作為對象之單核苷酸多型性周邊之鹼基序列，有時難以確保完全之特異性之情況亦不少見。又，於新生兒篩查用途之SMN1基因測定系統開發中，成為測定對象之檢體係自乾燥濾紙血切出之紙片，因此，對於血液自紙片之溶出性、妨礙物質之溶出性等，需要進行各種研究。
於非專利文獻1中，於內含子7而非外顯子7之2處SMN2基因之單核苷酸多型性內，設計針對第110號之螢光標記LNA（Locked Nucleic Acid）探針，特異性地阻礙SMN2基因之擴增，藉此確保SMN1基因之特異性。
於非專利文獻2中，報告有一種使用設計成夾著外顯子7之第6號之鹼基的引子，進行PCR反應，利用熔離曲線分析（Melting curve assay）方法測定擴增產物的方法。該方法不僅產生SMN1基因之擴增產物，而且亦產生SMN2基因之擴增產物，因此，由於熔離曲線重疊故難以進行觀察，不適於篩檢。
於非專利文獻3中，報告有一種方法，其使用設計成夾著外顯子7之第6號之鹼基的引子，進行第一PCR反應，取其反應液之一部分，進而使用於引子之正中間配置有分別與SMN1基因及SMN2基因互補之鹼基的較短之引子，進行第二PCR反應，藉由電泳確認其擴增產物。該方法係第一反應中引子之特異性不充分之情形時使用之方法，即，使用Nested-PCR原理之方法。該方法之一大缺點在於在第一PCR反應後打開蓋，將導致由於擴增產物飛散而對環境造成污染之風險增大。進而，擴增產物之檢測係藉由電泳確認擴增產物之帶，因此，就測定效率之方面而言，亦不適合作為篩檢。
於非專利文獻4中，報告有一種方法，其使用設計成夾著外顯子7之第6位的引子及與外顯子7之第6位互補之螢光色素修飾探針，進行即時PCR反應，定量SMN1基因。於該方法中，亦同時生成源自SMN2基因之擴增產物，因此於SMN2基因之CNV（Copy Number Variation，複製數變異）較高之情形時，有無法確保探針之特異性之擔憂。
於非專利文獻5及6中，設計了與本發明類似之引子使用，但均使用經純化之DNA作為檢體，因此就測定效率之方面而言，作為篩檢仍然不適合。
先前技術文獻
非專利文獻
非專利文獻1：Clinical Chemistry, 61: 2, 412-419, 2015
非專利文獻2：Clinical Chemistry, 58:6, 1033-1039, 2012
非專利文獻3：Kobe J. Med. Sci., 63:2, E37-40, 2017
非專利文獻4：Genet Med, 8:7, 428-437, 2006
非專利文獻5：Neurogenetics 8, 271-278, 2007
非專利文獻6：Am. J. Hum. Genet. 70, 358-368, 2002
[發明所欲解決之課題]
本發明之目的在於提供一種用以使用乾燥濾紙血檢測及定量作為SMA之致病基因之SMN1基因之同源性缺失的引子、以及關於使用其來特異性檢測、定量SMN1基因之方法。
[解決課題之技術手段]
關於SMA，迄今為止被視為不治之症，但近年來進行治療藥之開發，開始臨床現場之治療，期待QOL之提高。尤其關於I型，症狀容易變嚴重，故期望於儘可能早之階段開始治療。根據此種要求，期望能夠應用於新生兒篩查之對SMN1基因具有較高特異性、通用且迅速之檢測、定量系統。
於本發明中，發現一種SMN1基因檢測及定量方法，從而完成了本發明，該SMN1基因檢測及定量方法係於使用乾燥濾紙血，直接藉由即時PCR檢測SMN1基因之方法中，設計對SMN1基因特異性較高，且對SMN2基因之反應極其低於對SMN1基因之反應的引子，藉由使用該引子，能夠檢定SMN1基因有無缺失。
即，本發明具有以下之構成。
＜1＞
一種藉由即時PCR檢測乾燥濾紙血中之SMN1基因之方法，上述檢測方法包括下述（A）～（D）之步驟。
（A）於PCR反應用管中添加上述乾燥濾紙血之步驟
（B）於PCR反應用管中添加PCR試劑之步驟，PCR試劑至少包含設計成對SMN2基因之反應未達SMN1基因之1%的引子、聚合酶、dNTP、及嵌入劑或者螢光標記探針
（C）於添加有PCR試劑及上述乾燥濾紙血之管內進行PCR反應之步驟
（D）經時地光學檢測藉由PCR反應擴增之SMN1基因中之標的核酸的步驟
＜2＞
如＜1＞中記載之檢測方法，其中，設計成對SMN2基因之反應未達SMN1基因之1%的引子為選自由以下（1）之正向引子（forward primer）及（2）之反向引子（reverse primer）所組成之群中之1種以上之引子。
（1）由序列編號1～9之任一鹼基序列所構成之正向引子
（2）由序列編號16～21之任一鹼基序列所構成之反向引子
＜3＞
如＜1＞或＜2＞中記載之檢測方法，其中，乾燥濾紙血為直徑1.2 mm～2.0 mm之圓形沖裁片或包含相對於總反應溶液量為0.95 v/v%～6.6 v/v%之全血的沖裁片。
＜4＞
一種引子，用以特異性地檢測SMN1基因，且為選自由以下（1）之正向引子及（2）之反向引子所組成之群中之1種以上之引子。
（1）由序列編號1～9之任一鹼基序列所構成之正向引子
（2）由序列編號16～21之任一鹼基序列所構成之反向引子
＜5＞
一種減弱藉由即時PCR檢測乾燥濾紙血中之SMN1基因之方法中的對SMN2基因之反應性之方法，上述方法使用選自由以下（1）之正向引子及
（2）之反向引子所組成之群中之1種以上之引子。
（1）由序列編號1～9之任一鹼基序列所構成之正向引子
（2）由序列編號16～21之任一鹼基序列所構成之反向引子
[發明之效果]
根據本發明，能夠提供一種於使用乾燥濾紙血之即時PCR中，擴增SMN1基因之特定區域且難以擴增SMN2基因之反應性較低的引子。又，能夠提供一種藉由使用本引子，利用即時PCR特異性地檢測或定量乾燥濾紙血中之SMN1基因之方法。
因此，可提供一種能夠用於症狀容易變得嚴重故期望於較早之階段開始治療之新生兒篩查的SMN1基因之迅速檢測、定量系統。
（SMN1基因特異性引子）
本發明之SMN1基因特異性引子係設計成特異性地擴增SMN1基因且難以擴增SMN2基因的引子。即，係設計成對SMN2基因之反應性未達對SMN1基因之反應性之1%的引子。上述反應性以如下方式進行判定。於「將SMN1基因與SMN2基因之每1反應之複製數相同時之Cq值相同設為反應性100%」時，SMN2基因之每1反應之複製數較SMN1基因多10倍時之Cq值相同時之反應性成為10%，進而，多100倍時之Cq值相同時的反應性成為1%。此時，若SMN1基因之Cq值較小，則可判定為反應性未達1%。再者，於下述實施例中，於各引子與各擴增延伸溫度之組合條件下，於自SMN1基因100 copy/反應之Cq值減去SMN2基因10,000 copy/反應之Cq值的情形時之ΔCq值未達-0.1未達之情形時，判定為未達1%。
進而亦發現於使用本發明之引子進行PCR反應之情形時，於使用乾燥濾紙血作為檢體時，對SMN2基因之反應性進一步減弱。
本發明之SMN1基因特異性正向引子具體而言可列舉由序列編號1～9之任一鹼基序列所構成的引子。該等正向引子設計成其3'末端包含SMN1基因之外顯子7之第6號之C。而且，於較該第6號之C靠5'側連續具有22～30個鹼基之鏈長。較佳為連續之鹼基與SMN1基因所對應之鹼基序列完全一致，但於不妨礙標的核酸之擴增之範圍內，即便1個或數個鹼基錯配亦包含於本發明之引子之範圍。
本發明之SMN1基因特異性反向引子可列舉由序列編號16～21之任一鹼基序列所構成之引子。該等反向引子設計成於反向引子之3'末端包含其3'末端與SMN1基因之外顯子7之第6位互補之序列，具有20～25個鹼基之鏈長。較佳為連續之鹼基與SMN1基因所對應之互補鏈完全一致，但於不妨礙標的核酸之擴增之範圍內，即便1個或數個鹼基錯配亦包含於本發明之引子之範圍。
本發明之引子使用上述SMN1基因特異性正向引子與SMN1基因特異性反向引子之任一者即可，成套使用之反向引子及正向引子於進行即時PCR之情形時，考慮到必須將螢光標記探針設計於夾在兩個引子間之部分，理想為相距20 bp以上。
與上述本發明之SMN1基因特異性正向引子成套使用之反向引子可為本發明之SMN1基因特異性反向引子，又，亦可為在上述相距20 bp以上之條件下包含與和外顯子7或內含子7之一部分區域相同之鹼基序列互補之序列的引子。
又，與上述本發明之SMN1基因特異性反向引子成套使用之正向引子可為上述本發明之SMN1基因特異性正向引子，又，亦可為包含與內含子6之一部分區域相同之鹼基序列的引子。
若使用上述本發明之SMN1基因特異性正向引子或SMN1基因特異性反向引子進行PCR，則包含SMN1基因之外顯子7之第6位之C之序列的核酸被擴增。另一方面，由於SMN2基因所對應之核酸即外顯子7之第6位為T，故而本發明之SMN1基因特異性正向引子以及SMN1基因特異性反向引子之3'末端均不對應，因此難以引起藉由聚合酶之擴增反應。又，於使用乾燥濾紙血作為檢體之情形時，更難發生SMN2基因之擴增反應，因此能夠檢測SMN1基因之特異性。
如此，於使用本發明之SMN1基因特異性正向引子或SMN1基因特異性反向引子之至少1種進行PCR時，藉由使用乾燥濾紙血作為檢體，可進一步發揮效果。即，可特異性地擴增SMN1基因之外顯子7之相應區域，且幾乎不擴增SMN2基因之相應區域，因此，可特異性地檢測或定量SMN1基因。經擴增之核酸能夠藉由電泳或即時PCR等進行定性、定量。
藉由下述實施例證實了於使用本發明之SMN1基因特異性正向引子或SMN1基因特異性反向引子進行PCR之情形時，對SMN2基因之反應性未達對SMN1基因之反應性之1%。
（PCR/即時PCR）
即時PCR法通常意指於PCR中經時監控擴增產物之生成過程之方法。於本發明中，藉由即時PCR進行檢測意指藉由光學手段檢測PCR反應後擴增之SMN1基因之標的核酸（以下，簡稱為擴增產物）。再者，擴增產物之檢測例如可於PCR反應結束時或結束後進行，亦可與PCR反應步驟並行。於並行時，擴增產物之檢測例如可經時進行。經時檢測（監控）例如可連續，亦可不連續（斷續）。
PCR反應中之各步驟之溫度變化例如使用溫控循環機等自動進行控制即可。藉由PCR反應生成之擴增產物，例如可藉由檢測自上述擴增產物產生之螢光強度而進行檢測。作為螢光檢測，並無特別限制，有先前公知之嵌入劑法、TaqMan（註冊商標）探針法、雜交法、循環探針法等。
螢光強度之檢測例如可藉由螢光光度計進行。又，通常使用具備PCR反應單元（例如溫控循環機）及光學系統單元（例如螢光光度計）兩者之裝置。作為具體例，可列舉：市售之SMartCycler（商品名，塔卡拉生物公司製造）、LightCycler（商品名，Roche Diagnostics公司製造）、ABI PRISM7000（商品名，Applied Biosystems公司製造）等。
（標的核酸之定量方法）
本發明之SMN1基因之定量方法係「生成與試樣中之SMN1基因之標的核酸互補之擴增產物，藉由光學手段檢測上述擴增產物而定量上述擴增產物」的方法。藉由計數上述擴增產物成為特定量之PCR循環數，可定量試樣中所含之標的核酸。又，亦可如下述實施例，根據自標準品算出之Cq值之校準曲線，換算出試樣中之全血1 mL之複製數來進行定量。
（PCR試劑）
本發明中使用之PCR試劑至少包含引子之套組、聚合酶、各種dNTP（去氧核苷三磷酸）、嵌入劑或者螢光標記探針。又，典型而言，該試劑亦包含緩衝液。作為緩衝液，只要為具有抑制生物體液中存在之正電荷物質（某種蛋白質等）或負電荷物質（某種糖、色素等）等阻礙DNA擴增反應之物質之作用之功能的緩衝液則並無特別限定。作為市售者，例如可列舉Ampdirect、Ampdirect plus（均為島津製作所（股）製造）等。本發明中使用之PCR試劑之添加至反應用管的量為20～50 μL。
（試樣/乾燥濾紙血）
本發明中使用之試樣較佳為被稱為乾燥濾紙血之使濾紙（Filter paper）含有血液後使其乾燥而獲得的濾紙中之血液。乾燥濾紙血係藉由開孔沖裁工具製成沖孔形狀之紙片（沖裁片）而獲取。作為乾燥濾紙血，例如使用新生兒大規模篩查等自新生兒之足跟採血之濾紙血、同時作為選擇性篩查而採血之濾紙血等，但並不限定於該等。自乾燥濾紙血切出之沖裁片之大小必須將所含的血液之量設為適當範圍，因此理想為一定尺寸之沖裁片。作為一定尺寸之沖裁片，理想為直徑1.2～2.0 mm之圓形沖裁片，更理想為1.5 mm～1.8 mm之圓形沖裁片。又，作為沖裁片所含之全血量，理想為相對於PCR總反應溶液量為0.95 v/v%～6.6 v/v%，更理想為1.4 v/v%～5.2 v/v%。再者，上述全血量表示為根據實測值（將全血30 uL添加至切取沖裁片之前之濾紙並進行了乾燥時製成的圓形血液部分之直徑為9.5 mm）算出將直徑1.2～2.0 mm之圓形沖裁片、直徑1.5 mm～1.8 mm之沖裁片添加至20～50 μL之PCR反應溶液並使血液溶解時之比率所獲得的值。
（PCR反應用管）
本發明中使用之管為PCR反應用管，只要為濾紙血之沖裁片可順利地插入，可利用蓋進行密閉之構造即可。又，較佳為管上部之開口部為圓形（例如，內徑2.5 mm～10 mm左右）且底部較上部之開口部窄的形狀，較佳為倒圓錐形等。
上述管之容量只要為「添加PCR反應試劑，即便由於因PCR反應所導致之溫度變化亦可充分收容反應溶液」之容量即可，較佳為0.1 mL～0.3 mL容量，進而較佳為0.15 mL～0.25 mL容量，最佳為0.2 mL容量。
本發明中使用之PCR反應用管較佳為96個管相連之PCR反應用96孔管或8個管相連之8連管，作為市售品，可使用以96孔PCR板、PCR 8連管等名稱銷售者。作為市售品，可列舉：LightCycler（註冊商標）480 Multiwell Plate 96（Roche公司）、96孔PCR板、Flat Top, Low Profile, Natural, Polypropylene, UltraFlux（Scientific Specialties, Inc.公司）、Eppendorf PCR板96、無裙部（skirtless）,150 μL,無色（Eppendorf公司）、PCR板96well SimPlate 0.1 ml Natural（BM機器公司）、LightCycler 8-Tube Strips（Roche公司）等。
該等反應用管之材質理想為反應溶液之污染較少，又具有即便因由PCR反應之溫度變化所導致之內部壓力變動而形狀亦不產生變化的剛性，例如可列舉聚丙烯製。
（套組）
本發明之套組係用以藉由即時PCR特異性地檢測SMN1基因之套組，只要包含選自由以下（1）之正向引子及（2）之反向引子所組成之群中之1種以上之引子即可。
（1）由序列編號1～9之任一鹼基序列所構成之正向引子
（2）由序列編號16～21之任一鹼基序列所構成之反向引子
除上述以外，可包含與各引子配套使用之反向引子或正向引子。又，亦可包含探針、其他PCR、即時PCR中使用之試劑或容器。
實施例
以下，藉由實施例詳細地說明本發明，但本發明並不限定於以下之實施例。
本實施例係比較設計之引子對SMN1基因及SMN2基因序列之反應性的例子。
[實施例1]使用了SMN1基因特異性正向引子之SMN1基因定量系統
（a）試驗材料
（a-1）SMN1基因擴增用正向引子
使用委託Sigma-Aldrich公司合成之SMN1基因擴增用之正向引子（表1；序列編號1～9）及共通反向引子（表1；序列編號10）。
[表1]
表1：本發明之SMN1基因特異性正向引子及共用反向引子
（a-2）質體
作為PCR反應之模板，使用委託Eurofins公司合成之將以下所示之SMN1基因及SMN2基因之包含外顯子7之部分序列組入至載體而成之質體。下述序列編號11之劃底線部表示SMN1基因之外顯子7之序列（54 bp），其上游表示內含子6之部分序列，下游表示內含子7之部分序列。序列編號12之劃底線部分表示SMN2基因之外顯子7之序列（54 bp），其上游表示內含子6之部分序列，下游表示內含子7之部分序列。
SMN1基因之外顯子7之第6位為C，SMN2基因之外顯子7之第6位為T。
包含外顯子7之SMN1基因部分序列（序列編號11）
包含外顯子7之SMN2基因部分序列（序列編號12）
（b）PCR試劑
以下表示PCR試劑之組成。
1×（最終濃度）PCR緩衝液（Ampdirect Plus；島津製作所公司）
0.2 μM（最終濃度）SMN1基因用正向引子（序列編號1～9）
0.2 μM（最終濃度）共通反向引子（序列編號10）
0.025 U/μL（最終濃度）BIOTAQ HSDNA聚合酶
0.5×（最終濃度）EvaGreen
（c）質體稀釋系列
SMN1基因質體（最終濃度）100,000 copy/反應、10,000 copy/反應、1,000 copy/反應、100 copy/反應
SMN2基因質體（最終濃度）100,000 copy/反應、10,000 copy/反應
（d）PCR反應之條件
（i）95℃：15分鐘
（ii）95℃：15秒，61～65℃：80秒（45個循環）
（iii）37℃：5分鐘
（e）利用嵌入劑之即時PCR測定
（e-1）測定方法
按照以下之順序進行測定。
（i）將PCR試劑及質體以成為上述最終濃度之方式進行混合，準備分注了其40 μL之PCR管。
（ii）使用溫控循環機裝置（CFX96；Bio-Rad公司），進行即時PCR測定，算出各質體濃度之Cq值。
（e-2）測定結果
將結果示於表2。於各引子與各擴增延伸溫度之組合條件中，對SMN2基因之反應未達SMN1基因之1%之組合、即自SMN1基因100 copy/反應之Cq值減去SMN2基因10,000 copy/反應之Cq值的情形時之ΔCq值滿足未達-0.1之組合有11種，能夠應用正向引子之序列編號1～9。
[表2]
| 表2：使用有本發明之SMN1基因特異性正向引子之即時PCR測定結果 | |||||||||||||||
| 擴增延伸溫度 | 61℃ | 63℃ | 65℃ | ||||||||||||
| 正向引子 | ASP25 | ASP24 | ASP23 | ASP22 | ASP28 | ASP27 | ASP26 | ASP25 | ASP24 | ASP23 | ASP30 | ASP29 | ASP28 | ASP27 | ASP26 |
| SMN1 1×105 copy | 23.7 | 23.9 | 24.1 | 25.4 | 24.0 | 24.1 | 24.2 | 24.2 | 24.2 | 25.5 | 24.0 | 24.0 | 24.1 | 24.2 | 25.1 |
| SMN1 1×104 copy | 27.2 | 27.3 | 27.5 | 28.8 | 27.3 | 27.3 | 27.4 | 27.4 | 27.6 | 28.8 | 27.4 | 27.3 | 27.3 | 27.4 | 28.3 |
| SMN1 1×103 copy | 30.5 | 30.6 | 30.7 | 32.1 | 30.7 | 30.7 | 30.7 | 30.7 | 31.0 | 32.1 | 31.0 | 30.6 | 30.6 | 30.6 | 31.6 |
| SMN1 1 × 10 2 copy | 34.2 | 33.7 | 34.3 | 36.0 | 33.9 | 34.3 | 34.0 | 34.2 | 34.0 | 35.4 | 34.0 | 33.6 | 34.2 | 33.9 | 34.9 |
| SMN2 1×105 copy | 30.0 | 30.6 | 32.8 | 34.1 | 28.9 | 30.3 | 32.5 | 32.6 | 32.8 | 34.3 | 31.7 | 31.8 | 32.5 | 33.0 | 33.7 |
| SMN2 1 ×10 4 copy | 33.3 | 33.7 | 36.0 | 37.3 | 32.2 | 33.6 | 35.5 | 35.9 | 36.7 | 37.9 | 34.8 | 35.2 | 35.9 | 35.8 | 37.3 |
| ΔCq值※ | 0.8 | 0.0 | -1.7 | -1.3 | 1.7 | 0.7 | -1.5 | -1.7 | -2.7 | -2.5 | -0.8 | -1.6 | -1.7 | -1.9 | -2.4 |
| ※SMN1 1×102 copy Cq值－SMN2 1×104 copy Cq值 |
[實施例2]使用了SMN1基因特異性反向引子之SMN1基因定量系統
（f）試驗材料
（f-1）SMN1基因擴增用反向引子
使用委託Sigma-Aldrich公司合成之SMN1基因擴增用反向引子（表3；序列編號14～22）及共通正向引子（表3；序列編號13）。
[表3]
表3：本發明之SMN基因特異性反向引子及共通正向引子
（f-2）質體
使用與上述（a-2）相同之質體。
（g）PCR試劑
以下表示PCR試劑之組成。
1×（最終濃度）PCR緩衝液（AMpdirect Plus；島津製作所公司）
0.2 μM（最終濃度）共用正向引子（序列編號13）
0.2 μM（最終濃度）SMN1基因用反向引子（序列編號14～22）
0.025 U/μL（最終濃度）BIOTAQ HSDNA聚合酶
0.5×（最終濃度）EvaGreen
（h）質體稀釋系列
使用與上述（c）相同之質體稀釋系列。
（i）PCR反應之條件
於與上述（d）相同之條件下實施。
（j）利用嵌入劑之即時PCR測定
（j-1）測定方法
按照以下之順序進行測定。
（i）將PCR試劑及質體以成為上述最終濃度之方式進行混合，準備分注其40 μL之PCR管。
（ii）使用溫控循環機裝置（CFX96；Bio-Rad公司），進行即時PCR測定，算出各質體濃度之Cq值。
（j-2）測定結果
將結果示於表4。於各引子與各擴增延伸溫度之組合條件中，對SMN2基因之反應未達SMN1基因之1%之組合、即自SMN1基因100 copy/反應之Cq值減去SMN2基因10,000 copy/反應之Cq值之情形時之ΔCq值未達-0.1的組合有8種，能夠應用反向引子之序列編號16～21。
[表4]
| 表4：使用本發明之反向引子之即時PCR測定結果 | ||||||||||||
| 擴增延伸溫度 | 61℃ | 63℃ | 65℃ | |||||||||
| 反向引子 | RASP22 | RASP21 | RASP20 | RASP19 | RASP24 | RASP23 | RASP22 | RASP21 | RASP27 | RASP26 | RASP25 | RASP24 |
| SMN1 1×105 copy | 23.4 | 23.5 | 26.7 | 0.0 | 23.0 | 23.8 | 24.2 | 25.8 | 23.4 | 23.4 | 23.6 | 24.8 |
| SMN1 1×104 copy | 26.8 | 27.0 | 30.4 | 0.0 | 26.3 | 27.2 | 27.8 | 29.2 | 26.8 | 26.8 | 27.0 | 28.1 |
| SMN1 1×103 copy | 30.0 | 30.2 | 34.0 | 0.0 | 29.9 | 30.7 | 31.2 | 32.8 | 30.4 | 30.3 | 30.5 | 31.7 |
| SMN1 1 × 102 copy | 33.3 | 33.5 | 37.4 | 0.0 | 33.5 | 33.9 | 34.5 | 36.1 | 33.6 | 33.5 | 33.8 | 34.8 |
| SMN2 1×105 copy | 30.4 | 31.3 | 36.2 | 0.0 | 29.5 | 32.1 | 32.8 | 34.7 | 26.9 | 29.4 | 31.5 | 33.3 |
| SMN2 1 × 104 copy | 33.5 | 35.0 | 39.6 | 0.0 | 33.3 | 35.2 | 36.6 | 38.5 | 30.5 | 33.1 | 35.1 | 37.2 |
| ΔCq值※ | -0.2 | -1.5 | -2.2 | 0.0 | 0.2 | -1.3 | -2.1 | -2.4 | 3.1 | 0.4 | -1.4 | -2.4 |
| ※SMN1 1×102 copy Cq值－SMN2 1×104 copy Cq值 |
[實施例3]共存有乾燥濾紙血沖裁片之SMN1基因定量系統之SMN2交叉擴增反應之驗證
（a）試驗材料
（a-1）SMN1基因擴增用引子
作為SMN1擴增用引子，使用委託Sigma-Aldrich公司合成下述引子者。
SMN1用特異性正向引子：上述表1之序列編號6
SMN1用共通反向引子：上述表1之序列編號10
（a-2）SMN1檢測探針
作為用以確認SMN1之PCR擴增之探針，使用委託PRIMETECH公司合成而製成施加有螢光標記之下述檢測探針。
SMN1用檢測探針
5'-(Quasar670)-GGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGΑ-(BHQ3)-3'（鹼基序列部分為序列編號23）
（b）PCR試劑
以下表示PCR試劑之組成。
PCR緩衝液（Ampdirect Plus；島津製作所公司）
0.2 μM（最終濃度）SMN1用特異性正向引子
0.2 μM（最終濃度）SMN1用共通反向引子
0.1 μM（最終濃度）SMN1用檢測探針
0.025 U/μL BIOTAQ HSDNA聚合酶
（c）含校準曲線用標準品之PCR試劑
於上述（b）之PCR試劑中添加組入有SMN1部分序列（序列編號11）之質體，製備含以下標準品（稀釋系列；STD1～4）之PCR試劑。括弧內表示各基因之每一次PCR反應之複製數。本試劑於溶液狀態下使用，而不含於乾燥濾紙血。
STD1（SMN1 100,000 copy/反應）、STD2（SMN1 10,000 copy/反應）、STD3（SMN1 1000 copy/反應）、STD4（SMN1 100 copy/反應）
（d）SMN2交叉試驗用PCR試劑
於上述（b）之PCR試劑中以成為50,000 copy/反應之方式添加組入有SMN2的部分序列（序列編號12）之質體，製備SMN2交叉試驗用PCR試劑。
（e）不含DNA之乾燥濾紙血
使去除了白血球之人紅血球組分與人血漿（EDTA）以6：4之比率混合而成的血液滲入40 μL至採血用濾紙（Advantec公司），直接進行乾燥，將其作為不含DNA之乾燥濾紙血。即，本乾燥濾紙血不含SMN1與SMN2。
（f）PCR反應之條件
（i）95℃：15分鐘
（ii）95℃：15秒，63℃：60秒（40個循環）
（iii）37℃：5分鐘
（g）即時PCR測定
（g-1）測定方法
按照以下之順序進行測定。
（i）自不含DNA之乾燥濾紙血使用穿孔機採集直徑1.5 mm之圓形沖裁片。作為研究對象，自採血用濾紙（Advantec公司）採集相同大小之沖裁片（空沖裁片）。
（ii）於PCR反應用管（Roche公司製造：LightCycler8-TubeStrips，聚丙烯製）中分別投入上述沖裁片。
（iii）於上述PCR反應用管中分別添加40 μL SMN2交叉試驗用PCR試劑後，蓋上蓋（與上述管成為套組者）進行密閉。
（iv）含校準曲線用標準品之PCR試劑亦準備分別分注40 μL至管者（再者，管不含沖裁片）。
（v）使用溫控循環機裝置（LightCycler96；Roche公司），進行SMN1之即時PCR測定以及對SMN2之交叉反應的驗證。
（f-2）測定結果
（i）將含校準曲線用標準品之PCR試劑之擴增反應曲線示於圖1。
確認到良好地擴增直至SMN1 100 copy/反應。
（ii）將SMN2交叉試驗用PCR試劑之擴增反應曲線之25～40個循環的部分示於圖2。
有趣的是，確認到若使不含DNA之乾燥濾紙血之沖裁片共存，則與使空沖裁片（不含血液之沖裁片）共存之情形（圖中實線）相比較，擴增之上升以Cq值計延遲1左右（圖中虛線）。於該條件下，對SMN2之交叉反應若換算成複製數則約降低50%。即，可知於本發明中，於使用乾燥濾紙血作為檢體之情形時，以對SMN2基因之反應性未達對SMN1基因之反應性之1%之方式設計的引子對SMN2基因之反應性減弱。即，發現於使用本發明之引子進行PCR反應之情形時，藉由使乾燥濾紙血之沖裁片存在於該反應系統中，從而對SMN2基因之交叉反應進一步降低。
因此，根據本發明，於新生兒之篩檢中，會降低SMN1同型缺損即SMA患者之漏診風險（假陰性）。
再者，對於SMN1亦與上述同樣地進行試驗，結果未確認到由乾燥濾紙血所引起之擴增抑制（結果未圖示）。因此，可知上述由乾燥濾紙血共存所引起之擴增上升延遲之現象係SMN2基因之擴增反應中特有之現象。因此，本案發明之藉由即時PCR檢測乾燥濾紙血中之SMN1基因之方法亦可謂藉由使用特定引子減弱對SMN2基因之反應性之方法。
[產業上之可利用性]
根據本發明，能夠提供一種藉由使用本發明之特定之引子，利用即時PCR特異性地檢測或定量乾燥濾紙血中之SMN1基因之方法。因此，能夠提供一種能夠應用於症狀容易變得嚴重而期望於較早階段開始治療之新生兒篩查的SMN1基因之迅速檢測、定量系統。
無
[圖1]表示含有校準曲線用SMN1標準品之PCR試劑之擴增反應曲線。
[圖2]表示SMN2交叉試驗用PCR試劑之擴增反應曲線中之25～40個循環的部分。
<110> 積水醫療股份有限公司(SEKISUI MEDICAL CO.,LTD.)
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<160> 23
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<210> 1
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<212> DNA
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<223> 探針
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Claims (2)
- 一種藉由即時PCR檢測乾燥濾紙血中之SMN1基因之方法，上述檢測方法包括下述(A)~(D)之步驟：(A)於PCR反應用管中添加上述乾燥濾紙血之步驟；(B)於PCR反應用管中添加PCR試劑之步驟，PCR試劑至少包含選自由以下(1)之正向引子(forward primer)及(2)之反向引子(reverse primer)所組成之群中之1種以上之引子、聚合酶、dNTP、及嵌入劑或者螢光標記探針；(C)於添加有PCR試劑及上述乾燥濾紙血之管內進行PCR反應之步驟；(D)經時地光學檢測藉由PCR反應擴增之SMN1基因中之標的核酸的步驟；(1)由序列編號1~9之任一鹼基序列所構成之正向引子；(2)由序列編號16~21之任一鹼基序列所構成之反向引子。
- 如請求項1之檢測方法，其中，乾燥濾紙血為直徑1.2mm~2.0mm之圓形沖裁片或包含相對於總反應溶液量為0.95v/v%~6.6v/v%之全血的沖裁片。
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